KR20220088004A

KR20220088004A - 가교 처리된 히알루론산 조성물의 가교율 측정방법

Info

Publication number: KR20220088004A
Application number: KR1020200178601A
Authority: KR
Inventors: 강종성; 조종운; 김승호; 김상혁; 이신구
Original assignee: 충남대학교산학협력단; (주)제테마
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-06-27
Also published as: KR102527095B1

Abstract

본 발명은 히알루론산(HA)를 주성분으로 하는 가교 필러(dermal filler) 제품 중에서 가교 처리된 히알루론산 조성물 중 히알루론산과 가교제 간의 가교율을 고성능 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS) 및 고성능 액체크로마토그래프(HPLC) 분석법을 사용하여 간편하게 측정할 수 있는 방법에 관한 것으로, 히알루론산(HA)이 주성분인 필러 제품에 대한 과학적인 품질관리를 가능하게 할 수 있다.

Description

가교 처리된 히알루론산 조성물의 가교율 측정방법{Method for measuring the crosslink rate in the compositon including crosslinked hyaluronic acid}

본 발명은 히알루론산(HA)를 주성분으로 하는 가교 필러(dermal filler) 제품 중에서 가교 처리된 히알루론산 조성물 중 히알루론산과 가교제 간의 가교율을 고성능 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS) 및 고성능 액체크로마토그래프(HPLC) 분석법을 사용하여 간편하게 측정할 수 있는 방법에 관한 것이다.

필러(Dermal Filler)는 외과적 수술 없이 최소 침습적 시술(minimally invasive non-surgical procedure)로 얕은 주름부터 깊은 주름을 보완하고 팔자주름, 눈가주름, 빰, 이마, 볼, 턱 등에 볼륨을 넣어주는 성형시술의 핵심제품이다. 특히, 최근 인체 내에 존재하는 히알루론산을 이용하여 가교결합을 통해 개발된 교차결합 히알루론산 필러는 필러시장의 90%를 차지할 만큼 대중적인 인기를 끌고 있다.

히알루론산 필러는 성형수술 대비 소비자에게 수술 위험 부담이 적은 장점과 함께, 임상학적 안전성, 저렴한 가격, 간편한 시술, 즉각적인 효과로 인하여 안면 미용 시장의 폭발적 성장을 견인하고 있는 소재로, 소비자들로부터 히알루론산 필러의 시술 거부감이 없어 중장년층은 물론 최근 사회초년생에까지 히알루론산 필러의 시장이 급격히 확대되고 있어, 많은 회사에서 제품이 출시되고 있다. 하지만, 시장진입를 위한 업체 간의 가격경쟁 심화 및 기술력 차이에 의해 히알루론산 필러의 제품 간의 품질차이가 현저히 존재하게 되고, 이로 인한 부작용 사례가 빈번해짐에 따라 소비자들은 가격보다는 안전한 필러에 대한 선호도가 증가되고 있다.

이러한 필러를 제조하는 회사는 전 세계적으로 약 700 여개, 국내에는 약 20 여개가 있는 것으로 파악되고 있다. 이 중 히알루론산 필러는 거의 대부분이 교차결합(Cross-link)의 형태를 취하고 있으며, 제조회사들마다 필러의 핵심기술인 히알루론산 교차결합 기술을 보유하고 있다. 필러의 교차결합 기술은 제품의 안전성 및 성능(이하 “점탄성”이라 함.)에 직접적인 영향을 미치고, 교차결합 비율 및 입자의 크기 등에 의해 점탄성을 조절하므로, 핵심기술자들만이 이를 공유하고 있을 정도로 보안에도 아주 신중히 관리하고 있다.

교차결합은 제조사마다 다양한 가교제를 사용하며, 고유한 방식의 교차결합 과정을 거치게 된다. 현재 시판되는 히알루론산 필러 제품들의 대부분이 가교제로 1,4-부탄디올디글리시딜에테르(1,4-Butanediol diglycidyl ether, BDDE)를 사용하고 있으며, BDDE의 LD₅₀은 1,130mg/kg(경피, Rabbit)으로 다른 가교제인 디비닐 설폰(divinylsulfone)의 LD₅₀(14mg/kg, 경피, Rabbit)에 비해 약 80배 가량 독성이 낮은 것으로 알려져 있다.

하지만, 이마저도 다량 함유되게 되면, 체내 면역반응에 의한 부작용을 일으킬 가능성이 높은 것으로 알려져 있다. 특히, 시장에서는 허가된 적응증과 투여량보다 더 넓은 부위에 더 많은 필러를 투여함에 따라 BDDE에 의한 독성우려를 항상 가지고 있다.

국내에 등록된 히알루론산 가교관련 특허를 보면 가교제 함량이 적고 우수한 점탄성을 나타내는 히알루론산 겔 제조방법(대한민국 등록 특허 10-1239037), 저분자 및 고분자 히알루론산과 천연물인 유근피의 다당체 추출물을 활용한 노화방지용 조성물(대한민국 등록특허 10-1449687), 고밀도 망상구조로 가교된 히알루론산 및 그의 제조방법(대한민국 공개 특허 10-2015-0029578), 약물을 담지한 생체적합성 히알루론산 가교물 하이드로겔, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 방법(대한민국 등록특허 10-1818705), 우수한 점탄성, 낮은 주사 압출력 및 열과 분해효소에 대한 안정성이 높아 윤활작용과 완충(쿠셔닝) 작용을 통한 우수한 연골 보호효과를 나타내는 히알루론산-가교 마이크로 입자를 제조하는 방법(대한민국 등록특허 10-1728012), 저가교율 초고밀도 히알루론산 가교체로 구성된 마이크로 입자의 제조방법(대한민국 공개특허 10-2018-0064715), 하나 이상의 다관능성 가교제가 가교된 히알루론산 생성물에 대한 효율적인 제조 방법(대한민국 공개특허 10-2016-0025026), 변형도가 이당류 1000 유닛 당 가교제 1 내지 40 유닛인, 석출된, 성형된 가교 히알루론산 생성물을 제조하는 방법(대한민국 등록특허 10-2048395), 가교된 히알루론산 주로 HA와 가교제를 안전하고 효율적으로 가교시켜서 제조하는 방법 등이 등록되어 있을 뿐 HA와 가교제 간의 교차결합율(cross-linking rate)을 정확하고 효율적으로 측정할 수 있는 방법 등을 등록되어 있지 않다.

한편, 히알루론산과 가교제 간의 교차결합율(cross-link rate)을 측정하는 방법에 대해 지금까지 보고된 사례는 다음과 같다. 히알루론산(hyaluronic acid, 이하 HA)과 BDDE 사이의 가교율 측정을 위해 질량분석기가 장착된 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MS) 및 ¹H-NMR을 활용하여 BDDE-modified HA 하이드로겔(세 개의 가교 파라미터 즉, total modification, t-MOD; cross-link modification, c-MOD; pendent modification, p-MOD 등)에 대한 가교율을 측정하는 방법을 보고하였다(Yang 등, Carbohydrate Polymers 131, 233-239, 2015).

또한, 효소 가수분해 방법을 통해 얻어진 부분적 HA 분해물인 올리고당(oligosaccharide)이 분자 크기 의존적인 특성을 활용하여 겔여과 크로마토그래피( GPC)와 NMR과 MS 분석기기로 분석하는 방법이 보고된 바 있다(Wemde 등. Carbohydrate Polymers, http://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2015.09.112, 2015). Kablik 등은 HA 하이드로겔에서 가교율의 정도에 따라 하드로겔의 점탄성이 달라지는 특징을 이용하여 HA의 농도를 측정하기 위한 방법을 제시하였다(Kablik 등, Dermatologic Surgery, 35, 302-312 DOI: 10.1111/j.1524-4725.2008.01046.x, 2009). Fidalgo 등은 LC-MS를 활용하여 가압살균된 BDDE가 가교된 HA 하이드로겔에서 0.1% NaOH 수용액 첨가 시 부산물이 검출되었다고 보고하였는데, 새로 발견된 부산물은 독성은 거의 없는 것으로 확인되나 HA-BDDE의 가교율에 대한 품질평가 시 꼭 확인이 필요하다고 주장하였다(Fidalgo 등, Medical Devices: Evidence and Research 11, 367-376, 2018).

그러나, 현재까지 알려진 필러(HA)의 교차결합율(cross-link rate)을 측정하는 방법은 시료 전처리 방법 등이 복잡하거나, 재현성이 낮은 점 등의 문제점이 발견되어 실제적으로 산업체에서 그대로 적용하기에는 적당하지 않은 문제가 있다.

한국등록특허 제10-1239037호, 가교 히알루론산 겔의 제조방법, 2013년 02월 25일, 등록. 한국등록특허 제10-1449687호, 저분자 및 고분자 히알루론산과 유근피로부터 분리된 다당체 추출물을 함유하는 노화방지용 조성물, 2014년 10월 02일, 등록. 한국공개특허 제10-2015-0029578호, 고밀도 망상구조로 가교된 히알루론산 및 그의 제조방법, 2015년 03월 18일, 공개. 한국등록특허 제10-1818705, 약물이 충전된 히알루론산 가교물 하이드로겔 및 이의 이용, 2018년 01월 09일, 등록. 한국등록특허 제10-1728012호, 히알루론산-가교 마이크로 입자의 제조방법, 2017년 04월 12일, 등록. 한국공개특허 제10-2018-0064715호, 저가교율 초고밀도 히알루론산 가교체로 구성된 마이크로 입자 및 이의 제조방법, 2018년 06월 15일, 공개. 한국공개특허 제10-2016-0025026호, 가교된 히알루론산 생성물의 제조방법, 2016년 03월 07일, 공개. 한국공개특허 제10-2048395호, 성형된 가교 히알루론산 생성물의 제조 방법, 2019년 11월 19일, 등록.

Fidalgo, J. et al., Detection of a new reaction by-product in BDDE cross-linked autoclaved hyaluronic acid hydrogels by LC-MS analysis, Medical Devices: Evidence and Research 11, 367-376, 2018 Kablik, J. et al., Comparative physical properties of hyaluronic acid Dermal Fillers, Dermatologic Surgery, 35, 302-312 DOI: 10.1111/j.1524-4725.2008.01046.x, 2009 Wende, F. J et al., Determination of substitution positions in hyaluronic acid hydrogelsusing NMR and MS based methods, Carbohydrate Polymers , http://dx.doi.org/10.1016/j.carbpol.2015.09.112, 2015 Yang et al., Determination of modification degree in BDDE-modified hyaluronic acid hydrogel by SEC/MS, Carbohydrate Polymers 131, 233-239, 2015

본 발명의 목적은 가교 필러 제품의 히알루론산(HA)와 가교제 간의 교차결합(Cross-link)율을 효과적으로 측정하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 가교 필러 제품의 HA-가교제의 가교 결합율을 측정하기 위해 가수분해 효소인 히알루로니다아제(Hyaluronidase, HAase)를 이용하여 가수분해를 시키고 가수분해된 올리고당-가교제 가수분해물을 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS) 및 고성능 액체크로마토그래프(HPLC)를 활용하여 신속하고 효율적으로 측정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은

(1단계) 시료 내 히알루론산(HA)의 농도가 최종 0.1~0.8 중량% 가 되도록 시료를 pH 5~7 완충용액으로 희석하는 단계;

(2단계) 상기 1 단계의 시료에 히알루론산 가수분해효소를 40 ~ 400U/mL이 되도록 첨가하는 단계;

(3단계) 상기 2단계의 히알루론산 가수분해효소가 첨가된 시료를 37~50 ℃에서 48 ~ 120시간 동안 가수분해하여 가수분해물을 제조하는 단계;

(4단계) 상기 3단계의 시료 가수분해물을 고성능 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)를 이용하여 비가교결합(linear HA) 및 가교결합(cross-linked HA)된 성분 피크를 동정하는 단계; 및

(5단계) 상기 4단계의 분석결과를 하기 수식 1에 적용하여 시료의 가교결합율을 측정하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산-가교제 간의 가교결합율 측정 방법이며, [수식 1]은,

총 변형도(가교결합율; t-MOD, %) =

(단, 여기서, A_HA는 가교되지 않은(비가교결합) 시료 가수분해물의 총 피크면적, A_HA-X-HA는 교차결합(cross-link)으로 가교된 시료 가수분해물의 총 피크면적, A_HA-X는 펜던트(pendent)로 가교된 시료 가수분해물의 총 피크면적이다)이다.

또한, 본 발명의 상기 가교결합율은 하기 수식 2 및 수식 3에 의한 교차결합 변형도 및 펜던트 변형도로 표현되는 것을 특징으로 하는 히알루론산-가교제 간의 가교결합율 측정 방법을 제공한다.

[수식 2]

교차결합 변형도(c-MOD, %) =

(단, 여기서, A_HA는 가교되지 않은(비가교결합) 시료 가수분해물의 총 피크면적, A_HA-X-HA는 교차결합(cross-link)으로 가교된 시료 가수분해물의 총 피크면적, A_HA-X는 펜던트(pendent)로 가교된 시료 가수분해물의 총 피크면적이다)

[수식 3]

펜던트 변형도(p-MOD, %) = t-MOD(%) - c-MOD(%)

도 1에서 보는 바와 같이, 상기 히알루론산(HA)는 β-D-글루쿠론산(β-D-glucuronic acid, GlcA)과 β-D-에세틸글루코사아민(β-D-N-acetylglucosamine, GlcNAc)를 (1 → 4) 결합과 (1 → 3) 당화 결합을 기본구조로 반복되는 이당의 중합체로서 20 ~ 20,000 kDa을 갖는 이당의 고분자 중합체이다.

한편, 히알루로니다아제(Hyaluronidase, HAase)는 미생물인 스트렙토마이세스 히알루로티쿠스(Streptomyces hyalurolyticus)로부터 분리추출한 히알루로네이트 가수분해 효소(hyaluronate lyase, EC 4.2.2.1)로서 히알루론산 고분자와 같은 고분자 당을 강력하게 가수분해하는 상용효소이다.

이러한 히알루론산(HA) 그 자체는 물에 잘 녹지 않는 성질로 인해 산업적으로 사용하기 어려운점이 있다. 그래서, HA의 수용성을 높이기 위해 가교제를 첨가는데 알칼리 조건에서 가교제 첨가시 3가지 형태의 HA-가교제 가교결합 형태가 나타나게 된다. 도 2에서 보는 바와 같이, HA-가교제(본 발명의 일실시예에서는 BDDE를 사용함)의 형태는 가교제(BDDE) 한쪽 부분에만 결합되어 있는 펜던트 변형(pendent modification, p-MOD), 가교제 양쪽 끝에 결합되어 있는 교차연결 변형(cross-link modification, c-MOD), 그리고 이들 펜던트 변형과 교차연결 변형 이 모두를 합한 것이 총 변형도(total modification, t-MOD)이며, 가교율은 이 총 변형도의 결과 값을 나타내는 것이다.

상기 HA-가교제 측정 시 필러 제품의 HA 농도를 0.1% 내지 0.8% 중량비로 조정하여 완충용액에서 buffer pH 5 내지 7 범위에서 (바람직하게는 pH 5) 희석하여 50 내지 300 유닛(바람직하게는 100 유닛)로 희석된 가수분해 효소인 히알루로니다아제(HAase) 10 내지 320 μL(바람직하게는 160 μL)를 첨가하여 40 ~ 400 U/mL이 되도록 첨가한 후, 37 내지 50 ℃(바람직하게는 50℃)의 수욕 상에서 48 내지 120시간 동안 가수분해하여 HA-가교제의 가교율을 측정할 수 있다. 상기 히알루로니다아제의 농도는 바람직하게는 100 ~ 320 U/mL, 더욱 바람직하게는 150 ~ 320 U/mL 이다.

상기 완충용액은 인산나트륨(sodium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 초산암모늄(ammonium acetate) 및 개미산암모늄(ammonium formate)으로 구성된 군으로부터 선택된 1일 수 있다.

상기 가교 히알루론산(HA)와 가교제 간의 가교 결합율를 측정할 수 있는 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether), 에틸렌글리콜 디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜 에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르 (polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리콜폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene)), 펜타에리스리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether), 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether), 디비닐술폰(divinyl sulfone), 에피클로로히드린(epichlorohydrin), 에피브로모히드린(epibromohydrin) 및 이들의 조합으로 구성된 군 등으로 필러 제품과 가교할 수 있는 가교제로서 고성능 액체크로마토그래피법 및 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석할 수 있는 모든 가교제이다.

상기 히알루론산은 관절염 치료용 삽입물, 주름살 치료용 삽입물, 성형용 필러 및 약물 전달체로 구성된 군에서 선택되는 1일 수 있다.

본 발명은 히알루론산(HA)을 기본 원료로 하는 필러 제품에서 첨가된 가교제와 히알루론산 간의 가교 결합율을 고성능 액체크로마토그래피법과 액체크로마토그래프질량분석기법을 이용하여 효율적으로 측정할 수 있는 방법으로 가교 필러(HA)　제품에 대한 과학적인 품질관리가 가능해짐으로써 관련 산업의 국제경쟁력 제고에 크게 기여가 가능하다.

도 1은 가교 필러(HA) 제품의 주성분인 히알루론산(HA)의 이당 반복구조이다.
도 2는 히알루론산과 가교제인 BDDE를 알칼리 조건하에서 반응을 시켰을 때의 도출되는 HA-BDDE 결합형태를 도식화한 것이다.
도 3은 실시예1의 가수분해효소 농도(159.0 U/mL) 하에서 가수분해된 HA에 대해 분석한 HPLC 크로마토그램이다.
도 4는 실시예2의 가수분해효소 농도(9.1 U//mL μL) 하에서 가수분해된 HA의 HPLC 크로마토그램 패턴이다.
도 5는 실시예3의 가수분해효소 농도(79.0 U/mL) 하에서 가수분해된 HA의 HPLC 크로마토그램 패턴이다.
도 6은 실시예4의 가수분해효소 농도(319.0 U/mL) 하에서 가수분해된 HA의 HPLC 크로마토그램 패턴이다.
도 7은 실시예5의 가수분해효소량(159.0 U/mL)을 첨가한 후 가수분해시간(24 h)에 따른 HPLC 크로마토그램 패턴이다.
도 8은 실시예6의 가수분해효소량(159.0 U/mL)을 첨가한 후 가수분해시간(72 h)에 따른 HPLC 크로마토그램 패턴이다.
도 9는 실시예7의 가수분해효소량(159.0 U/mL)을 첨가한 후 가수분해시간(120 h)에 따른 HPLC 크로마토그램 패턴이다.
도 10은 실시예8의 가수분해된 HA ID와 가교 필러제품에 대한 HPLC 크로마토그램 패턴이다.
도 11은 실시예8의 가수분해된 가교 필러(HA) 시료에 대해 LC-MS로 분석한 토탈 이온 크로마토그램(TIC)이다.
도 12는 실시예1에 대한 비교예1의 HPLC 크로마토그램 비교 결과이다.
도 13은 실시예8에 대한 비교예2의 HPLC 크로마토그램 비교 결과이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. HPLC 분석용 HA 표준시료(HA ID) 및 검액 제조>

먼저, 가교결합을 하지 않은 HA(리니어 HA, linear HA) 가루 0.4 g을 취하여 100 mM 아세트산 나트륨 완충 용액(sodium acetate buffer, pH 5.0) 100 mL에 용해시켜서 0.4% 중량비를 갖는 표준원액을 조제하였다. 조제된 HA 표준원액 100 μL를 취하고 히알루로니디아제(HAase)량을 99.5 U/mL이 되도록 첨가한 후 50 ℃ 수욕 상에서 3시간 동안 가수분해하였다. 그런 후 다시 히알루로니디아제(HAase)을 첨가하여 99.8 U/mL이 되도록 추가로 첨가하고 90분 동안 50 ℃ 수욕 상에서 추가 가수분해하였다. 가수분해가 완료된 표준액은 95 ℃ 수욕 상에서 10분 동안 열처리하여 효소(HAase)를 불활성화시켜서 HA ID(표준시료)를 제조하였다.

한편, 가교 필러 제품 중 HA-BDDE 가교결합율을 측정하기 위해 제품 시료 1 g (HA로서 약 2.4% 중량비)을 취하여 100 mM 아세트산 나트륨 완충용액(sodium acetate buffer, pH 5.0) 5 mL를 첨가하여 HA로서 0.4% 중량비가 되도록 희석하였다. 희석된 시액 50 μL를 취한 후 히알루로니디아제(HAase)양을 159.0 U/mL이 되도록 첨가한 후 50 ℃ 수욕 상에서 96시간 동안 가수분해하였다. 가수분해가 끝난 검액은 -20 ℃ 냉동고에서 사용 전까지 보관하였다.

전처리된 시료는 주입기(auto-sampler)를 사용하여 50 μL 주입하여 HPLC로 검출파장 UV 232 nm에서 분석하였다.

구체적인 HPLC 분석조건은 하기 표 1과 같다.

분석기기	시마즈 LC-20A 시스템
칼럼	음이온 교환수지(4.6 mm (ID) x 250 mm, CarboPac PA100, 써모 피셔 사이언티픽)
이동상	(A) 물, (B) 400 mM 인산나트륨 완충용액(pH 5.8)
검출파장	UV 232 nm
기울기 용출 조건	시간(분)	B%
	0	0
	70	100
	71	0
	80	0
유속	0.8 mL/분
주입량	50 μL
칼럼 온도	실온

상기 표 1과 같은 조건으로 시료를 전처리한 후 HPLC 분석결과, HA ID, 리니어 HA, 그리고 가교 필러 제품에서 HA의 가수분해 패턴은 도 3과 같이 나타났다.

도 3에서 보는 바와 같이, HA 표준시료(HA ID)는 4당 중합체(tetramer), 6당 중합체(hexamer), 8당 중합체(octamer), 10당 중합체(decamer) 및 12당 중합체(dodecamer)를 순차적으로 나타내었으며, 리니어 HA 및 가교 필러 제품에서는 HA ID의 성분피크 패턴과 비교하여 4당 중합체(tetramer) 및 6당 중합체(hexamer)에 해당하는 머무름시간(retention time, Rt) 부근에서 매우 큰 성분 피크를 나타내었다.

또한, HA ID의 4당~12당 중합체의 머무름시간에 해당하는 가교 필러 제품 중 히알루론산 가수분해물의 크로마토그램을 분석하여 보면, 6당 중합체 주변으로 펜던트 변형, 교차결합 변형된 가수분해물의 성분 피크를 관찰할 수 있었다.

< 실시예 2. HPLC 분석용 HA 검액에 대한 가수분해효소의 용량에 따른 가수분해 패턴 비교 1>

가교처리된 히알루론산 조성물의 최적 가수분해 조건을 확립하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 검액(리니어 HA, 가교 필러 제품 시료)에 대해 가수분해 효소인 히알루로니디아제(HAase)양을 9.1 U/mL이 되게 첨가한 후 HA의 가수분해 시켰다. 이때 나머지 시료 전처리 조건은 실시예1과 동일한 방법으로 처리하였다.

전처리된 시료는 실시예1과 동일한 HPLC 분석조건으로 분석하여 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이, HA ID, 리니어 HA, 그리고 가교 필러 제품에서 HA의 가수분해 패턴이 실시예1과 유사한 분해패턴을 보였으나, 적은 효소 첨가량으로 인해 HA-BDDE 가교 결합율이 실시예 1보다 상대적으로 낮게 계산되었다(표 5 참조). 이는 첨가된 HAase의 양이 적어서 가교 필러 제품에 대한 가수분해가 충분히 이루어지지 않은 것으로 판단된다.

< 실시예 3. HPLC 분석용 HA　 검액에 대한 가수분해효소의 용량에 따른 가수분해패턴 비교 2>

검액(리니어 HA, 필러 제품 시료(S500))에 대해 가수분해 효소인 히알루로니디아제(HAase)양을 79.0 U/mL이 되도록 첨가한 후 HA의 가수분해 패턴을 비교하였다. 이때 나머지 조건은 실시예1과 동일한 방법으로 시료를 전처리하였다.

전처리된 시료는 실시예1과 동일한 HPLC 분석조건으로 분석하여 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, 가교 필러 제품에서 HA의 가수분해 패턴이 실시예 1과 유사한 분해 패턴을 보였으나, 적은 효소 첨가량으로 인해 HA-BDDE 가교 결합율이 실시예2와 마찬가지로 실시예 1보다 상대적으로 낮게 나타났다. 이는 실시예2와 마찬가지로 HAase에 의한 HA의 가수분해가 충분히 이루어지지 않았기 때문으로 판단된다.

< 실시예 4. HPLC 분석용 HA 검액에 대한 가수분해효소의 용량에 따른 가수분해패턴 비교 3>

검액(리니어 HA, 가교 필러 제품 시료)에 대해 가수분해 효소인 히알루로니디아제(HAase)을 첨가하여 319.0 U/mL이 되도록 조정한 후 HA의 가수분해 패턴을 비교 검토하고자 하였다. 이때 나머지 조건은 실시예1과 동일한 방법으로 시료를 전처리하였다.

전처리된 시료는 실시예1과 동일한 HPLC 분석조건으로 분석하여 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보는 바와 같이, HA ID, 리니어 HA, 그리고 가교 필러 제품에서 HA의 가수분해 패턴이 실시예 1과 유사한 분해패턴을 보였다. HA-BDDE 가교 결합율 측정결과 실시예 1의 결과와 거의 유사하였다. 이는 실시예 1보다 더 많이 가수분해 효소를 첨가하여도 더 이상 HA의 가수분해가 되지 않음을 알 수 있었다. 따라서, 필러(HA)에 대한 최적의 HAase 첨가량은 155.2 U/mL임을 보여주었다.

< 실시예 5. HPLC 분석용 HA 검액에 대한 가수분해시간에 따른 HA 가수분해패턴 비교 1>

검액(리니어 HA, 가교 필러 제품)에 대해 가수분해 효소인 히알루로니디아제(HAase)양을 159.0 U/mL이 되도록 첨가한 후 HA의 가수분해 시간을 24시간 동안 가수분해시켰다. 분해패턴을 비교 검토하고자 하였다. 이때 나머지 조건은 실시예 1과 동일한 방법으로 시료를 전처리하였다.

전처리된 시료는 실시예1과 동일한 HPLC 분석조건으로 분석하여 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보는 바와 같이, HA ID, 리니어 HA, 그리고 가교 필러 제품에서 HA의 가수분해 패턴이 실시예 1과 유사한 분해패턴을 보였으나 필러 제품에서 HA-BDDE 가교결합율은 실시예 1보다 상대적으로 낮게 나타났다. 이는 HA를 가수분해시키는데 24시간은 충분하지 않음을 보여준다.

< 실시예 6. HPLC 분석용 HA 검액에 대한 가수분해시간에 따른 HA 가수분해패턴 비교 2>

검액(리니어 HA, 가교 필러 제품)에 대해 가수분해 효소인 히알루로니디아제(HAase)양을 159.0 U/mL이 되도록 첨가한 후 HA의 가수분해 시간을 72시간 동안 가수분해시켜서 가교된 HA의 분해 패턴을 비교 검토하고자 하였다. 이때 나머지 조건은 실시예1과 동일한 방법으로 시료를 전처리하였다.

상기와 같이 전처리된 시료는 실시예 1과 동일한 HPLC 분석조건으로 분석하였다. 도 8에서 보는 바와 같이, HA ID, 리니어 HA, 그리고 가교 필러 제품에서 HA의 가수분해 패턴이 실시예 1과 유사한 분해패턴을 보였으나 필러 제품에서 HA-BDDE 가교결합율은 실시예 5와 마찬가지로 실시예 1보다 상대적으로 낮게 나타났다. 이는 가교된 HA를 가수분해하는데 72시간은 충분하지 않음을 보여준다.

<실시예 7. HPLC 분석용 HA 검액에 대한 가수분해시간에 따른 HA 가수분해패턴 비교 3>

검액(리니어 HA, 가교 필러 제품)에 대해 가수분해 효소인 히알루로니디아제(HAase)양을 159 U/mL이 되도록 첨가한 후 HA의 가수분해 시간을 120시간 동안 가수분해시킨 후, 분해 패턴을 비교 검토하고자 하였다. 이때 나머지 조건은 실시예 1과 동일한 방법으로 시료를 전처리하였다.

상기와 같이 전처리된 시료는 실시예1과 동일한 HPLC 분석조건으로 분석하였다. 도 9에서 보는 바와 같이, HA ID, 리니어 HA, 그리고 가교 필러 제품에서 HA의 가수분해 패턴이 실시예 1과 유사한 분해패턴을 보였으나 필러 제품에서 HA-BDDE 가교결합율은 실시예 1의 결과 값이 거의 유사하였다. 이는 실시예 1보다 길게 가수분해시간을 주어도 더 이상 HA 가수분해가 일어나지 않음을 보여준다.

< 실시예 8. LC-MS를 이용한 HA 올리고당 및 HA- BDDE 복합체에 대한 동정 >

검액(HA ID, 리니어 HA, 가교 필러 제품)에 대해 가수분해 효소인 히알루로니디아제(HAase)의 용량을 159.0 U/mL이 되도록 첨가한 후 실시예1과 동일하게 시료를 전처리하여 다음과 같이 LC-MS 분석조건에 따라 분석하였다. 구체적인 HPLC 분석조건은 하기 표 2와 같다.

분석기기	다파장 검출기가 탑재된 시마즈 LCMS-8040 시스템
칼럼	Hypercarb (4 mm (ID) x 250 mm, 써모 피셔 사이언티픽)
이동상	(A) 400 mM 초산암모늄 완충 용액(pH 5.8), (B) 아세토니트릴
검출기	1. 다파장검출기(PDAD) - UV 232 nm 2. 질량검출기(MSD) - 100 ～ 2000 amu
기울기 용출 조건	시간(분)	B%
	0	0
	70	80
	71	95
	80	95
	80.01	0
	95	0
유속	1.0 mL/분
칼럼 온도	60 ℃
주입량	50 μL
인터페이스	ESI positive / negative
인터페이스 전압	3.0 / -3.0 kV
드라잉 가스 플로우	15 L/분
네불라이징 가스 플로우	3 L/분
DL 온도	250 ℃
히트 블록 온도	400 ℃

실시예 1과 같은 조건으로 시료를 전처리한 후 HPLC 분석결과를 도 10에, LC-MS TIC(total ion chromatogram) 패턴 분석결과를 도 11에 나타내었다. 상기 도 10 및 11에서 보는 바와 같이, HA ID의 경우, 머무름시간 약 15분에서 25분 부근에서 가수 분해된 올리고당의 성분 피크들이 검출되었다. 즉, 검출된 올리고당은 4당 중합체(tetramer), 6당 중합체(hexamer), 8당 중합체(octamer), 10당 중합체(decamer) 그리고 12당 중합체(dodecamer) 등이 확인되었다. 그리고, 리니어 HA와 가교 필러 제품에서는 머무름시간 약 15분, 18분 부근에서 4당 중합체와 6당 중합체에 해당하는 성분 피크가 검출되었으며, 머무름시간 16 ~ 17분, 24 ~ 26분 부근에서 HA-BDDE 복합체에 해당하는 성분피크들이 검출되었다.

상기와 같이 LC-MS로 동정된 HA 올리고당 및 HA-BDDE 복합체의 구조분석에 대한 요약 내용은 표 3과 같다.

순번	머무름시간 (분)	분자식 (분자량)	MS¹		동정결과
순번	머무름시간 (분)	분자식 (분자량)	양이온 (positive, m/z)	음이온 (negative, m/z)	동정결과
1	15.50	C₂₈H₄₂N₂O₂₂ (758)	[M+H]⁺ 759 [M+Na]⁺ 781 [M+K]⁺ 797	[M-H]^- 757	4당 중합체 (tetramer)
2	18.05	C₄₂H₆₃N₃O₃₃ (1137)	[M-H₂O+H]⁺ 1120 [M+H]⁺ 1138 [M+NH₄]⁺ 1155 [M+Na]⁺ 1160 [M+K]⁺ 1176	[M-H]^- 1136	6당 중합체 (hexamer)
3	19.21	C₅₆H₈₄N₄O₄₄ (1516)	[1/2M+Na+H]⁺ 782 [M+H]⁺ 1517 [M+NH₄]⁺ 1534 [M+Na+H]⁺ 1540 [M+K]⁺ 1555		8당 중합체 (octamer)
2a	19.23	C₅₂H₈₃N₃O₃₈ (1357)	[M+H]⁺ 1358 [M+NH₄]⁺ 1375 [M+Na]⁺ 1380		6당 복합중합체 (펜던트 1) (hexamer-pendent complex 1)
4	20.32	C₇₀H₁₀₅N₅O₅₅ (1895)	[1/2M+Na]⁺ 971 [M+NH₄]⁺ 1913		10당 중합체 (decamer)
5	20.95	C₈₄H₁₂₆N₆O₆₆ (2275)	[1/2M+H]⁺ 1138 [1/2M+NH₄+H]⁺ 1156		12당 중합체 (dodecamer)
2b	24.20	C₆₆H₁₀₄N₄O₄₉ (1736)	[M+NH₄]⁺ 1754		6당 복합중합체 (교차결합) (hexamer-crosslink complex)
2c	24.62	C₅₂H₈₃N₃O₃₈ (1357)	[M+NH₄]⁺ 1375		6당 복합중합체 (펜던트 2) (hexamer-pendent complex 2)
2d	25.23	C₅₂H₈₃N₃O₃₈ (1357)	[M+NH₄]⁺ 1375		6당 복합중합체 (펜던트 3) (hexamer-pendent complex 3)
2e	25.45	C₅₂H₈₃N₃NaO₃₈ ⁺ (1380)	[M+Na]⁺ 1380		6당 복합중합체 (펜던트) (hexamer-pendent complex Na salt)

< 비교예 1. LC-MS 분석을 위한 HPLC 분석조건 비교 1>

실시예 1과 같이 분석된 부분 가수분해된 HA 및 HA-BDDE 복합체에 대해 LC-MS로 분자량을 측정하고자 실시예1의 이동상으로 사용하였던 무기염인 0.4M 인산나트륨(sodium phosphate) 완충용액(pH 5.8) 대신 0.4M 초산암모늄ammonium acetate 완충용액(pH 5.8)을 음이온 이온교환 수지 칼럼에 적용하고 분석 결과를 도 12에 나타내었다. 이때의 나머지 조건은 실시예1과 동일하게 적용하였다.

도 12에서 보는 바와 같이, 실시예1의 결과와 달리 음이온 이온교환 수지에서 유기염인 0.4M 초산암모늄 완충용액(pH 5.8)로는 HA 및 HA-BDDE 복합체가 잘 분리되지 않는 것을 확인하였다.

< 비교예 2. LC-MS 분석을 위한 HPLC 분석조건 비교 2>

실시예 1과 같이 분석된 부분 가수분해된 HA 및 HA-BDDE 복합체에 대해 LC-MS로 분자량을 측정하고자 Wemde 등의 LC-MS 분석조건을 검토하였다. 이때의 HPLC 분석 조건은 표 4와 같다.

분석기기	시마즈 LC-20A 시스템(다파장검출기 탑재)
칼럼	하이퍼카브(150 x 4.6 mm (ID), 5 μm, Hypercarb, 써모 피셔 사이언티픽)
이동상	(A) 0.1% 트리플로오르아세트산(TFA) 함유 물 (B) 0.1% 트리프로오르아세트산(TFA) 함유 아세토니트릴
검출파장	UV 235 nm
기울기 용출 조건	시간(분)	B%
	0	20
	70	40
	71	20
	80	20
유속	1.0 mL/분
주입량	50 μL
칼럼 온도	60 ℃

상기 조건을 실시예 8의 결과와 비교한 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에서 보는 바와 같이, 비교예 2의 결과는 실시예 8의 조건보다 상대적으로 검출감도와 성분피크의 분리도와 선택성이 매우 떨어져서 HA 올리고당과 HA-BDDE 복합체를 분석하기에는 매우 부적합함을 알 수 있다.

지금까지 각각의 실시예와 비교예의 분석조건에 따라 필러(HA) 제품 중 HA-BDDE 가교율(cross-link rate) 비교 분석하였다.

분석에 필요한 계산 공식은 다음과 같다.

[수식 1] 총 변형도(t-MOD, %) =

[수식 2] 교차결합 변형도(c-MOD, %) =

[수식 3] 펜던트 변형도(p-MOD, %) = t-MOD(%) - c-MOD(%)

여기서, A_HA는 가교되지 않은 HA 올리고당의 총 피크면적, A_HA-X-HA는 교차결합(cross-link)으로 가교된 HA-BDDE HA 올리고당의 총 피크면적, A_HA-X는 펜던트(pendent)로 가교된 HA 올리고당의 총 피크면적, X는 가교제인 BDDE이다.

상기 계산식에 따라 실시예와 비교예의 시료전처리 및 분석조건에 따라 필러 제품 중 HA-BDDE 가교율 측정 결과는 표 5와 같다.

	가교율(%)			비고
	p-MOD (%RSD)	c-MOD (%RSD)	t-MOD (%RSD)	비고
실시예1	9.74±0.43 (0.04)	1.21±0.20 (0.17)	10.95±0.49 (0.04)
실시예2	9.01±0.45 (0.05)	0.76±0.16 (0.21)	9.77±0.62 (0.06)
실시예3	9.24±0.56 (0.06)	1.01±0.23 (0.23)	10.25±0.60 (0.06)
실시예4	9.75±0.55 (0.06)	1.22±0.21 (0.17)	10.97±0.45 (0.04)
실시예5	8.87±0.43 (0.05)	0.80±0.18 (0.23)	9.67±0.65 (0.07)
실시예6	9.05±0.43 (0.05)	0.97±0.23 (0.24)	10.02±0.56 (0.06)
실시예7	9.76±0.67 (0.07)	1.20±0.21 (0.18)	10.96±0.76 (0.07)
비교예1	-	-	-	타겟 물질인 HA와 HA-BDDE의 복합체의 미분리에 따른 가교율 측정불가
비교예2	-	-	-	타겟 물질인 HA와 HA-BDDE의 복합체의 미분리에 따른 가교율 측정불가

Claims

(1단계) 시료 내 히알루론산(HA)의 농도가 최종 0.1~0.8 중량% 가 되도록 시료를 pH 5~7 완충용액으로 희석하는 단계;
(2단계) 상기 1 단계의 시료에 히알루론산 가수분해효소를 40~400 U/mL이 되도록 첨가하는 단계;
(3단계) 상기 2단계의 히알루론산 가수분해효소가 첨가된 시료를 37~50 ℃에서 48 ~ 120시간 동안 가수분해하여 가수분해물을 제조하는 단계;
(4단계) 상기 3단계의 시료 가수분해물을 고성능 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)를 이용하여 비가교결합 및 가교결합된 성분피크를 동정하는 단계; 및
(5단계) 상기 4단계의 분석결과를 하기 수식 1에 적용하여 시료의 가교결합율을 측정하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 히알루론산-가교제 간의 가교결합율 측정 방법.
[수식 1]
총 변형도(가교결합율; t-MOD, %) =

(단, 여기서, A_HA는 가교되지 않은(비가교결합) 시료 가수분해물의 총 피크면적, A_HA-X-HA는 교차결합(cross-link)으로 가교된 시료 가수분해물의 총 피크면적, A_HA-X는 펜던트(pendent)로 가교된 시료 가수분해물의 총 피크면적이다)
제1항에 있어서,
상기 가교결합율은 하기 수식 2 및 수식 3에 의한 교차결합 변형도 및 펜던트 변형도로 표현되는 것을 특징으로 하는 히알루론산-가교제 간의 가교결합율 측정 방법.
[수식 2]
교차결합 변형도(c-MOD, %) =

(단, 여기서, A_HA는 가교되지 않은(비가교결합) 시료 가수분해물의 총 피크면적, A_HA-X-HA는 교차결합(cross-link)으로 가교된 시료 가수분해물의 총 피크면적, A_HA-X는 펜던트(pendent)로 가교된 시료 가수분해물의 총 피크면적이다)
[수식 3]
펜던트 변형도(p-MOD, %) = t-MOD(%) - c-MOD(%)
제1항에 있어서,
상기 히알루론산(HA)은 20 ~ 20,000 kDa을 갖는 이당의 고분자 중합체인 것을 특징으로 하는 히알루론산-가교제 간의 가교결합율 측정 방법.
제1항에 있어서,
상기 히알루론산은 관절염 치료용 삽입물, 주름살 치료용 삽입물, 성형용 필러 및 약물 전달체로 구성된 군에서 선택되는 1인 것을 특징으로 하는 히알루론산-가교제 간의 가교결합율 측정 방법.
제1항에 있어서,
상기 가교제는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether; BDDE), 에틸렌글리콜 디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜 에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르 (polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리콜폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리스리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether), 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether), 디비닐술폰(divinyl sulfone), 에피클로로히드린(epichlorohydrin), 에피브로모히드린(epibromohydrin) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1인 것을 특징으로 하는 히알루론산-가교제 간의 가교결합율 측정 방법.
제1항에 있어서,
상기 1단계의 완충용액은 인산나트륨(sodium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate), 초산암모늄(ammonium acetate) 및 개미산암모늄(ammonium formate)으로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상인 것을 특징으로 하는 히알루론산-가교제 간의 가교결합율 측정 방법.