JPH01197502A - ハイラン製剤および動物組織からの回収方法 - Google Patents
ハイラン製剤および動物組織からの回収方法Info
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- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
この発明は、新規な化学的、物理化学的およびレオロジ
ー的性質を特徴とする化学的に修飾して改良したヒアル
ロナン製剤［ハイラン（ＨｙＩａｎ） コならびにその
製剤を得る新規な方法に関する。
ー的性質を特徴とする化学的に修飾して改良したヒアル
ロナン製剤［ハイラン（ＨｙＩａｎ） コならびにその
製剤を得る新規な方法に関する。
（ロ）従来の技術と課題
以下に時にはヒアルロン酸（ＨＡ）と呼称されるヒアル
ロナン（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）は、β−３グルコシド
結合で連結された、Ｄ−グルクロン酸とドアセチルゲル
コサミノ−２−アセトアミド−２−デスオキシ−Ｄ−グ
ルコースとの二部類の繰り返し単位を有する天然の高分
子量のグリコサミノグリカンである。
ロナン（Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ）は、β−３グルコシド
結合で連結された、Ｄ−グルクロン酸とドアセチルゲル
コサミノ−２−アセトアミド−２−デスオキシ−Ｄ−グ
ルコースとの二部類の繰り返し単位を有する天然の高分
子量のグリコサミノグリカンである。
この二部類は連結して、βｌ→４グリコシド結合によっ
て、分岐がなく架橋していない多糖類の連鎖を形成して
いる。
て、分岐がなく架橋していない多糖類の連鎖を形成して
いる。
ＨＡは、謄帯、ガラス体、滑液、雄鶏およびひな鶏のと
さが、皮膚などのような動物の組織に見出される。精製
■Ａの分子量は、その起源、単離法および分子量測定法
に左右されるが５０，０００〜８．０００．Ｇｏｏの範
囲であると文献には報告されている［バラジ、イー、エ
イ（Ｂａｌａｚｓ Ｅ、 Ａ、 ） 、 Ｆｅｄ。
さが、皮膚などのような動物の組織に見出される。精製
■Ａの分子量は、その起源、単離法および分子量測定法
に左右されるが５０，０００〜８．０００．Ｇｏｏの範
囲であると文献には報告されている［バラジ、イー、エ
イ（Ｂａｌａｚｓ Ｅ、 Ａ、 ） 、 Ｆｅｄ。
Ｐｒｏｃｅｅｄ、、 １７巻、 １０８６−１０９３頁
（１９５８年）コ。
（１９５８年）コ。
動物組織および細菌培養物からＨＡを回収し精製−する
方法が、いくつも示唆されている。これらの方法のなか
に、次のようなものがある。
方法が、いくつも示唆されている。これらの方法のなか
に、次のようなものがある。
蛋白質類の酸素による消化法：
イー、デイ−、ティ、アドキンス（Ｅ、 Ｄ、 Ｔ。
Ａｔｋｉｎｓ） 、シイ、エフ、フェルプス（Ｃ，Ｆ。
Ｐｈｅｌｐｓ）およびジエイ、ケイ、シーハン（Ｊ、
Ｋ。
Ｋ。
５ｈｅｅｈａｎ） 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、、 １
２８巻、 １２５５〜１２６３頁（１９７２年）；アー
ル、バルマ（Ｒ，Ｖａｒｏ＋ａ） 、アール、ニス、パ
ルｖ （Ｒ，Ｓ、 Ｖａｒｉａ） 、グブリュ。
２８巻、 １２５５〜１２６３頁（１９７２年）；アー
ル、バルマ（Ｒ，Ｖａｒｏ＋ａ） 、アール、ニス、パ
ルｖ （Ｒ，Ｓ、 Ｖａｒｉａ） 、グブリュ。
ニス、アルテン（１’、 Ｓ、 Ａｌｔｅｎ）およびエ
イ、エイチ、ワーディ（Ａ、 Ｈ，貰ａｒｄｉ） 、
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ。
イ、エイチ、ワーディ（Ａ、 Ｈ，貰ａｒｄｉ） 、
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ。
Ｒｅｓ、、 ３２巻、 ３８６〜３９５頁（１９７４年
）；イオン交換樹脂によって処理する方法：テイ、シイ
、ローレノト（Ｔ、 Ｃ，Ｌａｕｒｅｎｔ） 、 Ｊ。
）；イオン交換樹脂によって処理する方法：テイ、シイ
、ローレノト（Ｔ、 Ｃ，Ｌａｕｒｅｎｔ） 、 Ｊ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、、 ２１６巻、 ２５３−２７
１頁（１９５５年）；イー・アール、バーマン（Ｅ、
Ｒ，Ｂｅｒｍａｎ） 。
１頁（１９５５年）；イー・アール、バーマン（Ｅ、
Ｒ，Ｂｅｒｍａｎ） 。
Ｂｉｏｃｈｔ＋ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ、
５８巻、 １２０〜１２２頁（１９６２年）： カチオン界面活性剤による沈澱法： テイ、シイ、ローレント、エム、ライアン（Ｍ、 Ｒｙ
ａｎ）およびエイ、ビニトルスキピッチ（Ａ。
５８巻、 １２０〜１２２頁（１９６２年）： カチオン界面活性剤による沈澱法： テイ、シイ、ローレント、エム、ライアン（Ｍ、 Ｒｙ
ａｎ）およびエイ、ビニトルスキピッチ（Ａ。
Ｐｉｅｔｒｕｓｚｋｉｅｗｉｃｚ） 、 Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ＡｃＬａ。
ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ＡｃＬａ。
４２巻、 ４７６−４８５頁、 （１９６０年）三塩
化酢酸によって処理する方法： エイチ、ホフマンズ（Ｈ，Ｈｏｒｍｉｎｓ） 、オー、
シュマット（０，Ｓｃｈｍｕｔ） 、エイチ、スターク
（Ｈ。
化酢酸によって処理する方法： エイチ、ホフマンズ（Ｈ，Ｈｏｒｍｉｎｓ） 、オー、
シュマット（０，Ｓｃｈｍｕｔ） 、エイチ、スターク
（Ｈ。
５Ｌｅｒｋ）およびエイチ、クープ（Ｈ，Ｋｏｏｐ）
。
。
Ｎａｔｕｒｒｏｒｓｃｈ、 ３４ｃ巻、５０８〜５１１
頁（１９７９年）；デイ、シュマット（Ｄ、 Ｓｃｈｍ
ｕｔ）およびエイチ。
頁（１９７９年）；デイ、シュマット（Ｄ、 Ｓｃｈｍ
ｕｔ）およびエイチ。
ホフマンズ、 Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａ
ｃｔａ、 ８７３巻。
ｃｔａ、 ８７３巻。
１９２〜１９６頁（１９８１年）：
分離用密度勾配沈降法：
ビイ、ンルパナータ（Ｐ、 ５ｉｌｐａｎａｔａ） 、
ジェイ。
ジェイ。
アール、ダンストン（Ｊ、 Ｒ，Ｄｕｎｓｔｏｎｅ）お
よびエイ、シイ、オグストン（八 〇、 ０ｇ５ｔｏｎ
） 。
よびエイ、シイ、オグストン（八 〇、 ０ｇ５ｔｏｎ
） 。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ、、 １０９巻、４３−５０頁（
１９６８頁）；および 電着法： エス、ローズマン（Ｓ、 Ｒｏｓｅｍａｎ） 、デイ、
アール、ワトランＣＤ、 Ｒ，Ｗａｔｓｏｎ） 、ノエ
イ、エフ。
１９６８頁）；および 電着法： エス、ローズマン（Ｓ、 Ｒｏｓｅｍａｎ） 、デイ、
アール、ワトランＣＤ、 Ｒ，Ｗａｔｓｏｎ） 、ノエ
イ、エフ。
ダフ（Ｊ、 Ｆ、 Ｄｕ［’［’）およびグブリュ、デ
イ、ロビンラン（Ｗ、 Ｄ、 Ｒｏｂｉｎｓｏｎ） 、
Ａｎｎａｌｓ ＲｈｅｕｍａｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｓ、
ｔｓ＠、 ６７−６８頁（１９５５年）。
イ、ロビンラン（Ｗ、 Ｄ、 Ｒｏｂｉｎｓｏｎ） 、
Ａｎｎａｌｓ ＲｈｅｕｍａｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｓ、
ｔｓ＠、 ６７−６８頁（１９５５年）。
またいくつかの異なる処理法を含む方法を利用すること
ができ、例えば酵素による消化法と塩化セチルピリジニ
ウムによる沈澱法とによる方法［ジェイ、イー スコツ
ト（Ｊ、 Ｅ、 ５ｃｏｔｔ） 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
ができ、例えば酵素による消化法と塩化セチルピリジニ
ウムによる沈澱法とによる方法［ジェイ、イー スコツ
ト（Ｊ、 Ｅ、 ５ｃｏｔｔ） 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｊ、、 ６２巻、３１頁（１９５６年）］がある。
生物学上のソースからＨＡを回収する際に遭遇する主な
開運は、ＨＡととらに組織から抽出される蛋白質などの
生物学的ポリマーからポリマー（ＨＡ）を分離すること
である。原料に左右されるが、好ましくないポリマーの
量は、非常に多量で、ＨＡの量の何倍らのときがある。
開運は、ＨＡととらに組織から抽出される蛋白質などの
生物学的ポリマーからポリマー（ＨＡ）を分離すること
である。原料に左右されるが、好ましくないポリマーの
量は、非常に多量で、ＨＡの量の何倍らのときがある。
上記のｌ（Ａの回収法は、すべて実験室でのＨＡの製造
に使われるが、各方法に固有の種々の欠点があるため、
）ＩＡの大規［莫生産に利用することはほとんどできな
い。
に使われるが、各方法に固有の種々の欠点があるため、
）ＩＡの大規［莫生産に利用することはほとんどできな
い。
工業規模のＨＡの回収・精製の最新の方法は、米国特許
第４．１４１，９７３号［イー、エイ、バラズ（Ｅ。
第４．１４１，９７３号［イー、エイ、バラズ（Ｅ。
Ａ、 Ｂａ１ａｚｓ） ］に記載されている。この方法
によれば、蛋白質含量が０．５重量％より少なく、１．
２００，０００以上の分子量を宵する超純粋のＨ，Ａが
、雄鶏のとさかまたはヒトの鼾帯から水抽出法によって
得られる。蛋白質などの物質は、ｐＨ値を変えながら何
度もクロロホルムで抽出して除去される。
によれば、蛋白質含量が０．５重量％より少なく、１．
２００，０００以上の分子量を宵する超純粋のＨ，Ａが
、雄鶏のとさかまたはヒトの鼾帯から水抽出法によって
得られる。蛋白質などの物質は、ｐＨ値を変えながら何
度もクロロホルムで抽出して除去される。
水抽出物をクロロホルム抽出すると、界面層が形成され
、これには変性蛋白質などの物質が集められる。いくつ
かの物質、例えば脂肪類は、おそらくクロロホルム層に
可溶化される。またこの方法には、蛋白質分解酵素、例
えばプロナーゼによる処理が含まれる。いくつもの全く
手のこんだ処理法を組合わせることによって発熱性物質
を含有せずかつ非炎症性のＨＡ画分が得られる方法が開
発されている。この製品は、現在、登録商標ヒアロン（
Ｈｅａｌｏｎ）で、１％溶液として市販されており、こ
れが、機賊的損傷に対して組織を保護し、スペースを与
え、手術中の組織の手による処理を可能にするヒスコサ
−シェリー（Ｖｉｓｃｏｓｕｒｇｅｒｙ）に用いられて
いる［イー、エイ、バラズ、ヒアロン（Ｈｅａｌｏｎ）
、 Ｊ、 Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ、ニューヨー
ク。
、これには変性蛋白質などの物質が集められる。いくつ
かの物質、例えば脂肪類は、おそらくクロロホルム層に
可溶化される。またこの方法には、蛋白質分解酵素、例
えばプロナーゼによる処理が含まれる。いくつもの全く
手のこんだ処理法を組合わせることによって発熱性物質
を含有せずかつ非炎症性のＨＡ画分が得られる方法が開
発されている。この製品は、現在、登録商標ヒアロン（
Ｈｅａｌｏｎ）で、１％溶液として市販されており、こ
れが、機賊的損傷に対して組織を保護し、スペースを与
え、手術中の組織の手による処理を可能にするヒスコサ
−シェリー（Ｖｉｓｃｏｓｕｒｇｅｒｙ）に用いられて
いる［イー、エイ、バラズ、ヒアロン（Ｈｅａｌｏｎ）
、 Ｊ、 Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ、ニューヨー
ク。
１９８３年５〜２８頁］。
（ハ）課厘を解決するための手段
この発明は、一つのｐｌとして、親出願（米国特許願第
７１０９２９号の優先権を主張する特願昭６１−４５１
３４号）に記載の発明に加えて、ＨＡを組織から抽出す
る前に、動物組織内のＨＡをそのままその場で化学的に
修飾する新規な方法を提供するものである。
７１０９２９号の優先権を主張する特願昭６１−４５１
３４号）に記載の発明に加えて、ＨＡを組織から抽出す
る前に、動物組織内のＨＡをそのままその場で化学的に
修飾する新規な方法を提供するものである。
別の態様として、この発明は、親出願に記載の発明に加
えて化学的に修飾されたｌ（Ａを動物組織から回収およ
び精製する新規な方法を提供するものである。
えて化学的に修飾されたｌ（Ａを動物組織から回収およ
び精製する新規な方法を提供するものである。
さらに別の態様として、この発明は、新規な超純粋の、
発熱性物質を含有しない、非炎症性の化学的に修飾され
たｌ＋Ａ、すなわち、ヒアルロナンポリマー鎖に共存結
合したアルデヒドの架橋基を約０．０００２〜０．０５
重量％含有するハイラン（Ｈｙｌａｎ）を提供するもの
である。
発熱性物質を含有しない、非炎症性の化学的に修飾され
たｌ＋Ａ、すなわち、ヒアルロナンポリマー鎖に共存結
合したアルデヒドの架橋基を約０．０００２〜０．０５
重量％含有するハイラン（Ｈｙｌａｎ）を提供するもの
である。
この発明は、ＨＡを、水性媒体中で蛋白質やＨＡと反応
する物質で動物組織を処理することにより組織から抽出
する前に、その場で化学的に修飾できるという発見に基
づくものである。これらの物質にはホルムアルデヒド、
グルタルアルデヒド、グリオキサール等が含まれる。こ
のその場での化学的修飾はＨＡ高分子の最初の構造、分
子の大きさ、分子間及び分子内相互作用を、ひいては修
飾された生成物から作られた溶液のレオロジー的性質を
実質的に変えてします事が判った。それ故にこの化学的
修飾されたＨＡは新しい名称で呼ばれるのが相当である
。この発明の発明者らはこの物質を「ハイラン（Ｈｙｌ
ａｎ） Ｊと呼ぶことにした（以下）ＩＹと呼称する）
。ＨＡが動物組織から抽出される際、通常は）ＩＡと一
緒に大量の蛋白質が溶出して来る。この蛋白質の量は動
物組織の性質や抽出法のパラメータに実質上依存して変
り得る。雄鶏のとさかから）ＩＡを抽出する場合、ＨＡ
対蛋白質の重量比はｌ：０．５から１：４まで変り得る
（イー・エイ・バラスの米国特許第４，３０３，６７６
号）。結局動物組織からの純■Ａの回収における第一の
問題は蛋白質の除去である。この発明の発明者らは動物
組織の前記予備処理によって、その処理を行わない場合
よりも実質的に低い蛋白質含有のＨＡの水抽出物が得ら
れることを見出したのである。
する物質で動物組織を処理することにより組織から抽出
する前に、その場で化学的に修飾できるという発見に基
づくものである。これらの物質にはホルムアルデヒド、
グルタルアルデヒド、グリオキサール等が含まれる。こ
のその場での化学的修飾はＨＡ高分子の最初の構造、分
子の大きさ、分子間及び分子内相互作用を、ひいては修
飾された生成物から作られた溶液のレオロジー的性質を
実質的に変えてします事が判った。それ故にこの化学的
修飾されたＨＡは新しい名称で呼ばれるのが相当である
。この発明の発明者らはこの物質を「ハイラン（Ｈｙｌ
ａｎ） Ｊと呼ぶことにした（以下）ＩＹと呼称する）
。ＨＡが動物組織から抽出される際、通常は）ＩＡと一
緒に大量の蛋白質が溶出して来る。この蛋白質の量は動
物組織の性質や抽出法のパラメータに実質上依存して変
り得る。雄鶏のとさかから）ＩＡを抽出する場合、ＨＡ
対蛋白質の重量比はｌ：０．５から１：４まで変り得る
（イー・エイ・バラスの米国特許第４，３０３，６７６
号）。結局動物組織からの純■Ａの回収における第一の
問題は蛋白質の除去である。この発明の発明者らは動物
組織の前記予備処理によって、その処理を行わない場合
よりも実質的に低い蛋白質含有のＨＡの水抽出物が得ら
れることを見出したのである。
この組織の処理の間に起こる化学的な現象の正確な処は
充分に判らないので、この発明は特定の化学反応によっ
て限定されてはならない。組織中の蛋白質と処理混合物
中の試薬との間に化学反応の結果として、蛋白質は変性
され、組織中に固定され、それ故次の水抽出操作に於い
て不溶性になるものと考えられる。
充分に判らないので、この発明は特定の化学反応によっ
て限定されてはならない。組織中の蛋白質と処理混合物
中の試薬との間に化学反応の結果として、蛋白質は変性
され、組織中に固定され、それ故次の水抽出操作に於い
て不溶性になるものと考えられる。
この発明の目的のためには含水媒体中で蛋白質と反応す
るいずれの物質も用いることができる。
るいずれの物質も用いることができる。
その最も有利な物質は中ルムアルデヒドであることが判
った。その他のアルデヒド例えばグルタルアルデヒド又
はグリオキサールもこの発明の方法に使用できる。
った。その他のアルデヒド例えばグルタルアルデヒド又
はグリオキサールもこの発明の方法に使用できる。
組織の処理は試薬の水溶液中で行うことができる。しか
しこれを行った場合は「ハイラン」が水に良く溶けるた
めに実質的にロスが起こる。そのため組織の処理は水と
水混和性有機溶媒との混合物中で行うのが良い。その溶
媒は蛋白質固定化に用いる試薬と反応するものであって
はならない。
しこれを行った場合は「ハイラン」が水に良く溶けるた
めに実質的にロスが起こる。そのため組織の処理は水と
水混和性有機溶媒との混合物中で行うのが良い。その溶
媒は蛋白質固定化に用いる試薬と反応するものであって
はならない。
これらの溶媒の例としてはアセトン或いはメチルエチル
ケトンの如き低級ケトン、エタノール或いはイソプロパ
ノールの如きアルコール、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルアセトアミド、或いはジメチルスルホキシドの如き
非プロトン性溶媒などがある。このような溶媒は通常８
０〜９０重指％以上の大量の水を含んでいる組織と混合
すると水−溶媒混合物が形成される。その混合物中の水
〜溶媒の比は溶媒／組織の比を変え或いはその混合物に
水を加えることによって所望のレベルに調節できる。好
ましい水／溶媒比はＨＹが組織の処理に用いる該混合物
に溶解してはならないという意味に於いてＨＹの溶解性
によって決められる。ＢＹの溶解性は用いる溶媒の種類
、水／溶媒比、混合物中の電解質の存在及び濃度、及び
混合物のｐ旧こ依存する。
ケトンの如き低級ケトン、エタノール或いはイソプロパ
ノールの如きアルコール、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルアセトアミド、或いはジメチルスルホキシドの如き
非プロトン性溶媒などがある。このような溶媒は通常８
０〜９０重指％以上の大量の水を含んでいる組織と混合
すると水−溶媒混合物が形成される。その混合物中の水
〜溶媒の比は溶媒／組織の比を変え或いはその混合物に
水を加えることによって所望のレベルに調節できる。好
ましい水／溶媒比はＨＹが組織の処理に用いる該混合物
に溶解してはならないという意味に於いてＨＹの溶解性
によって決められる。ＢＹの溶解性は用いる溶媒の種類
、水／溶媒比、混合物中の電解質の存在及び濃度、及び
混合物のｐ旧こ依存する。
ＨＹの溶解性は混合物中に電解質を加えると実質的に減
少することがある。水−溶媒混合物に可溶で、混合物に
所望のｐＨを与えるいずれの電解質も使用できる。例え
ばアセトンを溶媒に使用した際には酢酸ナトリウムを可
溶性電解質として好都合に使うことができる。
少することがある。水−溶媒混合物に可溶で、混合物に
所望のｐＨを与えるいずれの電解質も使用できる。例え
ばアセトンを溶媒に使用した際には酢酸ナトリウムを可
溶性電解質として好都合に使うことができる。
組織処理用混合物の組成は組織の性状、使用する溶媒の
種類、電解質の種類などによって広範囲に変えることが
できる。上述の如く、組織からのＦＩＹは処理用混合物
に溶解してはならないが、処理混合物は試薬と組織高分
子物との反応を容易ならしめろため組織を膨潤させるこ
のに充分な水を含有していなければならない。この発明
の発明者らはＨＹの原料とし、て雄鶏のとさかを用いた
場合、処理混合物の組成は鶏冠からの水を考慮に入れて
下記の範囲の重量％でよいことを見出した。すなわち水
：１０〜５Ｇ、溶媒４０〜８５、電解質０〜２ｏ、試薬
０．２〜ｌＯである。所望によりいくつかの異なる溶剤
を同じ処理混合物に使用できる。この発明の発明者らは
処理混合物中にクロロホルムの如き水と不混和性の溶媒
の少量を使用するのが有利であることを見出した。前記
混合物のこのような溶媒の含有量は０．５〜１０重量％
であってもよい。
種類、電解質の種類などによって広範囲に変えることが
できる。上述の如く、組織からのＦＩＹは処理用混合物
に溶解してはならないが、処理混合物は試薬と組織高分
子物との反応を容易ならしめろため組織を膨潤させるこ
のに充分な水を含有していなければならない。この発明
の発明者らはＨＹの原料とし、て雄鶏のとさかを用いた
場合、処理混合物の組成は鶏冠からの水を考慮に入れて
下記の範囲の重量％でよいことを見出した。すなわち水
：１０〜５Ｇ、溶媒４０〜８５、電解質０〜２ｏ、試薬
０．２〜ｌＯである。所望によりいくつかの異なる溶剤
を同じ処理混合物に使用できる。この発明の発明者らは
処理混合物中にクロロホルムの如き水と不混和性の溶媒
の少量を使用するのが有利であることを見出した。前記
混合物のこのような溶媒の含有量は０．５〜１０重量％
であってもよい。
処理混合物のｐＨは試薬の性状、該混合物の組成、処理
温度及び時間によって変えろことができる。
温度及び時間によって変えろことができる。
この発明による動物組織からＢＹを回収する際、次の事
を考慮することか非常に重要である。いくつかの試薬、
例えばホルムアルデヒドはＨＡ高分子物のヒドロキシル
基と低いｐＨで反応して水不溶性の架橋したポリマーを
生成することができる。比較的高いｐ［（の媒体中で長
時間処理するとＨＹの分解を沼き、低分子量のポリマー
しか回収できないことがある。この発明にしたがってア
ルデヒド型の試薬を使う際、ＰＲは中性附近例えば４〜
１０の範囲で行うのが最も良い結果が得られることが見
出され処理混合物の組織に対する比は広い範囲内で変え
ることができる。通常下限は、組織が（雄鶏のとさかの
場合著しくかさだかであるカリ、処理混合物で少なくと
も充分に覆われねばならないということを条件にして決
められる。上限は経済的観点から選ばれる。この発明に
よる雄鶏のとさかの処理に於いては処理混合物と組織の
比は組織の乾燥重量基準で通常１０：１以上である。
を考慮することか非常に重要である。いくつかの試薬、
例えばホルムアルデヒドはＨＡ高分子物のヒドロキシル
基と低いｐＨで反応して水不溶性の架橋したポリマーを
生成することができる。比較的高いｐ［（の媒体中で長
時間処理するとＨＹの分解を沼き、低分子量のポリマー
しか回収できないことがある。この発明にしたがってア
ルデヒド型の試薬を使う際、ＰＲは中性附近例えば４〜
１０の範囲で行うのが最も良い結果が得られることが見
出され処理混合物の組織に対する比は広い範囲内で変え
ることができる。通常下限は、組織が（雄鶏のとさかの
場合著しくかさだかであるカリ、処理混合物で少なくと
も充分に覆われねばならないということを条件にして決
められる。上限は経済的観点から選ばれる。この発明に
よる雄鶏のとさかの処理に於いては処理混合物と組織の
比は組織の乾燥重量基準で通常１０：１以上である。
温度はこの発明による処理の効率に影響する。
しかし、ｌ（Ｙは高温で加水分解しやすいため、高分子
量の生成物を得るためには室温又はそれ以下で処理する
のが好ましい。
量の生成物を得るためには室温又はそれ以下で処理する
のが好ましい。
処理を完了するために必要な時間は処理混合物の組成、
組織の性状、温度など多くの因子に依存する。処理の制
限要因は組織の薄片中への試薬の拡散であろうと思われ
る。その故に組織薄片の大きさは一つの重要なパラメー
タである。この発明の発明者らは１−′３ＲＲ厚の小片
にスライスされた雄鶏のとさかの処理に於いて、処理時
間４〜２４時間の範囲にできることを見出した。
組織の性状、温度など多くの因子に依存する。処理の制
限要因は組織の薄片中への試薬の拡散であろうと思われ
る。その故に組織薄片の大きさは一つの重要なパラメー
タである。この発明の発明者らは１−′３ＲＲ厚の小片
にスライスされた雄鶏のとさかの処理に於いて、処理時
間４〜２４時間の範囲にできることを見出した。
以上の処理を経た組織は次いで溶媒又は溶媒／水混和物
で洗浄し、組織から過剰の処理混合物を除去する。組織
処理用の混合物中で使われたのと同じ溶媒を使用するの
が便利である。洗浄回数は任意であるが、１回の洗浄で
満足な結果が得られた。
で洗浄し、組織から過剰の処理混合物を除去する。組織
処理用の混合物中で使われたのと同じ溶媒を使用するの
が便利である。洗浄回数は任意であるが、１回の洗浄で
満足な結果が得られた。
次いで洗浄した組織は直接水で抽出して）ＩＹを回収す
る。抽出の効率は水／組織の比率、抽出媒体のｐＨ，温
度及び時間に依存することを見出した。
る。抽出の効率は水／組織の比率、抽出媒体のｐＨ，温
度及び時間に依存することを見出した。
又処理済組織の抽出効率は、処理済組織を最初に乾燥さ
せて処理及び洗浄工睨で使われた溶媒を除去することに
よって実質的に増加させることができることも見出され
た。組織を元の重量の１／４から１／２まで乾燥させる
と最高の結果が得られる。
せて処理及び洗浄工睨で使われた溶媒を除去することに
よって実質的に増加させることができることも見出され
た。組織を元の重量の１／４から１／２まで乾燥させる
と最高の結果が得られる。
抽出工程での水／組織の比率はいくつかの考慮を行って
選択される。先ず第一に、抽出中組織を覆うに充分な、
液相が存在すべきである。−力水の量は、次の工程での
沈澱剤の量を減らせるよう抽出液中のＨＹの濃度を出来
るだけ高く維持するために、あまり多くてはならない。
選択される。先ず第一に、抽出中組織を覆うに充分な、
液相が存在すべきである。−力水の量は、次の工程での
沈澱剤の量を減らせるよう抽出液中のＨＹの濃度を出来
るだけ高く維持するために、あまり多くてはならない。
雄鶏のとさかの場合について、水の組織に対する比率は
未処理とさかの重量基準で２〜５であるのが好ましい事
を見出した。
未処理とさかの重量基準で２〜５であるのが好ましい事
を見出した。
抽出媒体のｐＨは最終生成物の希望品質によって中性、
酸性、アルカリ性のいずれかに保つことができる。超高
分子量の生成物を得るためには抽出媒体のｐＨは６〜８
．５の範囲にすべきであることが見出された。高いｐＨ
にすれば抽出液中のＩＩＹ濃度は増大するが同時に生成
物の分子量を低下させ、かつ後に詳述する如くポリマー
の池の性質を変化させることになる。いずれにしても、
抽出工程中でｐＨを調節することによって最終生成物の
性質を希望する方向へ都合よく規制することができる。
酸性、アルカリ性のいずれかに保つことができる。超高
分子量の生成物を得るためには抽出媒体のｐＨは６〜８
．５の範囲にすべきであることが見出された。高いｐＨ
にすれば抽出液中のＩＩＹ濃度は増大するが同時に生成
物の分子量を低下させ、かつ後に詳述する如くポリマー
の池の性質を変化させることになる。いずれにしても、
抽出工程中でｐＨを調節することによって最終生成物の
性質を希望する方向へ都合よく規制することができる。
１１Ｙの高温での分解がポリマーの分子量を実質的に低
下させるので、２５℃以下の温度で処理済組織の抽出を
行うのが好ましい。
下させるので、２５℃以下の温度で処理済組織の抽出を
行うのが好ましい。
処理済組織からＨＹを最大限に抽出するのに必要な時間
は、ｐＨ，液／組織比、撹拌強度の如き他の抽出パラメ
ータによって実質的に変化する。雄鶏のとさかからの水
による抽出に於いて処理済とさかを６時間から数日間ま
での間で抽出する時に良い結果が得られることを見出し
た。
は、ｐＨ，液／組織比、撹拌強度の如き他の抽出パラメ
ータによって実質的に変化する。雄鶏のとさかからの水
による抽出に於いて処理済とさかを６時間から数日間ま
での間で抽出する時に良い結果が得られることを見出し
た。
処理済組織と抽出媒体との混合物は抽出の間撹拌するこ
とが出来るし或いは何らの撹拌ちせずに放置することも
できる。明らかに撹拌はＨＹ分子が組織から抽出液への
拡散速度を増大させる。一方激しい撹拌はＨＹの分解と
それによる分子量の低下を招来する。加うるに激しい撹
拌は組織の崩壊を招き抽出液から組織を分離するのを困
難ならしめることが明らかになった。従って抽出工程は
撹拌しないが、極めて遅いゆるやかな撹拌の下で行うの
が好ましい。
とが出来るし或いは何らの撹拌ちせずに放置することも
できる。明らかに撹拌はＨＹ分子が組織から抽出液への
拡散速度を増大させる。一方激しい撹拌はＨＹの分解と
それによる分子量の低下を招来する。加うるに激しい撹
拌は組織の崩壊を招き抽出液から組織を分離するのを困
難ならしめることが明らかになった。従って抽出工程は
撹拌しないが、極めて遅いゆるやかな撹拌の下で行うの
が好ましい。
抽出後組織は濾過、遠心分離、傾瀉等を含む各種の通常
の方法によって抽出液から分離される。
の方法によって抽出液から分離される。
最も簡単で経済的な方法は濾過であることが分かった。
出発物質として用いた組織の種類によっては二段濾過を
用いるのが好ましい場合がある。従って雄鶏のとさかの
場合、組織の大きな切片はナイロンメツシュで容易に濾
過分離でき、例えばセルロース質の緻密な濾過材で濾過
すれば抽出液の良好な精製ができる。
用いるのが好ましい場合がある。従って雄鶏のとさかの
場合、組織の大きな切片はナイロンメツシュで容易に濾
過分離でき、例えばセルロース質の緻密な濾過材で濾過
すれば抽出液の良好な精製ができる。
抽出液中のＦＩＹ濃度は抽出中のｐＨ，時間、液／組織
比、撹拌の強さといった多くの因子に依存している。こ
のＢＹ濃度は通常０．３〜３．Ｏｘｖ／ｘＱの範囲であ
るが時にはこれより高くなる。ある場合には、抽出液中
のＨＹ濃度が低いときに、第二回目の組織の抽出を行う
のが望ましいことが分かった。又第二回目の抽出液から
沈澱した生成物は通常第一回目の抽出液からのＨＹに比
して高分子量であることも判明した。これは、ＨＹの低
分子量画分は組織から抽出液に拡散し易く、第一回目の
抽出液から沈澱さ仕た生成物には、これらの低分子量画
分を多く含んでいるという事実で説明できる。
比、撹拌の強さといった多くの因子に依存している。こ
のＢＹ濃度は通常０．３〜３．Ｏｘｖ／ｘＱの範囲であ
るが時にはこれより高くなる。ある場合には、抽出液中
のＨＹ濃度が低いときに、第二回目の組織の抽出を行う
のが望ましいことが分かった。又第二回目の抽出液から
沈澱した生成物は通常第一回目の抽出液からのＨＹに比
して高分子量であることも判明した。これは、ＨＹの低
分子量画分は組織から抽出液に拡散し易く、第一回目の
抽出液から沈澱さ仕た生成物には、これらの低分子量画
分を多く含んでいるという事実で説明できる。
出来る限り高い収率を得るために二回以上の抽出を行う
ことができるが、抽出を繰返す毎に抽出液中のＨＹ濃度
は低下する。
ことができるが、抽出を繰返す毎に抽出液中のＨＹ濃度
は低下する。
ＨＹは前記濾液から公知の方法で回収できる。最も都合
の良い方法は水混和性溶媒例えばアセトン。
の良い方法は水混和性溶媒例えばアセトン。
エタノール、イソプロパノール等を加えて沈澱さす方法
である。この沈澱法は酸例えば塩酸、硫酸。
である。この沈澱法は酸例えば塩酸、硫酸。
リン酸などの存在下か或いは中性電解質例えば酢酸ナト
リウム、塩酸ナトリウム及びそれらの塩類の存在下で行
うことができる。ＨＹ及びその塩類は通常白色のｍｌ状
又は粉状の物質として沈澱する。
リウム、塩酸ナトリウム及びそれらの塩類の存在下で行
うことができる。ＨＹ及びその塩類は通常白色のｍｌ状
又は粉状の物質として沈澱する。
この沈澱物は沈澱させるのに使用したのと同じ溶媒又は
生成物を溶解しない他の溶媒混合物、例えばエーテルで
洗浄できる。洗浄済生成物は通常の手段で乾燥でき、或
いは溶媒例えばアセトン、エタノールなどの層中で貯蔵
することができる。又濾液を凍結乾燥することもできる
。
生成物を溶解しない他の溶媒混合物、例えばエーテルで
洗浄できる。洗浄済生成物は通常の手段で乾燥でき、或
いは溶媒例えばアセトン、エタノールなどの層中で貯蔵
することができる。又濾液を凍結乾燥することもできる
。
従来技術として知られＨＡ精製に用いられている工程が
本発明の方法にその範囲を限定することなく附加されて
もよいことは明らかである。例えば発熱性物質、炎症性
物質を除去するために、ＨＹは溶解せず脂肪蛋白質、糖
脂質もしくは糖脂肪蛋白質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｏｐｒｏ
ｔｅｉｎ）が可溶か或いは分離出来る良く知られた溶媒
例えばクロロホルムによる抽出法を用いることができる
。
本発明の方法にその範囲を限定することなく附加されて
もよいことは明らかである。例えば発熱性物質、炎症性
物質を除去するために、ＨＹは溶解せず脂肪蛋白質、糖
脂質もしくは糖脂肪蛋白質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｏｐｒｏ
ｔｅｉｎ）が可溶か或いは分離出来る良く知られた溶媒
例えばクロロホルムによる抽出法を用いることができる
。
この発明による方法ｊこよれば広範囲に変化した性質を
もったＨＹ生成物か得られる。後述の性質が測定された
。引用した方法は本発明によって得られた生成物を特徴
づけるのに使用された。
もったＨＹ生成物か得られる。後述の性質が測定された
。引用した方法は本発明によって得られた生成物を特徴
づけるのに使用された。
溶液中のＨＹ濃度は自動化されたカルバゾール法を用い
たヘキスロン酸検定法［イー・エイ・バラズ、ケイ・オ
ー・ベルンツエン、ジエイ、カロツサおよびデイ−エイ
・スワン（Ｅ、 Ａ、 Ｂｓ１ａｚｓ、 Ｋ。
たヘキスロン酸検定法［イー・エイ・バラズ、ケイ・オ
ー・ベルンツエン、ジエイ、カロツサおよびデイ−エイ
・スワン（Ｅ、 Ａ、 Ｂｓ１ａｚｓ、 Ｋ。
０、 Ｂｅｒｎｔｓｅｎ、 Ｊ、 Ｉ（ａｒｏｓｓａ
ａｎｄ Ｄ、 Ａ、 Ｓｗａｎｎ）、ＡｎａｌｙＬ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １２巻、 ５４７−５５１１頁（
１９６５年）］で測定した。ヘキソサミン含量は自動化
比色定蛍法［デイ・エイ・スワンおよびイー・エイーバ
ラズ（Ｄ、 Ａ、 Ｓｗａｎ ａｎｄ Ｅ、 Ａ、 Ｂ
ａ１ａｚｅ） 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
ａｎｄ Ｄ、 Ａ、 Ｓｗａｎｎ）、ＡｎａｌｙＬ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １２巻、 ５４７−５５１１頁（
１９６５年）］で測定した。ヘキソサミン含量は自動化
比色定蛍法［デイ・エイ・スワンおよびイー・エイーバ
ラズ（Ｄ、 Ａ、 Ｓｗａｎ ａｎｄ Ｅ、 Ａ、 Ｂ
ａ１ａｚｅ） 、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、、Ａｃｔａ、 １３０巻、 １１２−
１２９頁（１９６６年）］で測定した。ＨＹ溶液の蛋白
質含量はフェノール試薬法［ロウリーら（Ｌｏｖｒｙ
ｅｔ ａｌ） 、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
１２９頁（１９６６年）］で測定した。ＨＹ溶液の蛋白
質含量はフェノール試薬法［ロウリーら（Ｌｏｖｒｙ
ｅｔ ａｌ） 、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、、 １９３巻、 ２６５−２７５頁、（１９
５１年）］で測定した。 生成物中のホルムアルデヒド
含量は約０．１９の試料を１０％硫酸水溶液１ＯｘＱ中
で２時間煮沸し、次いで得られた溶液を水蒸気蒸留して
ａｌ雁のホルムアルデヒドを除去し、届出物中のホルム
アルデヒドをクロモトロブ酸を用いた比色定量法で測定
した［エム・ジエイ・ボイドおよびエム・エイ・ローガ
ン（Ｍ、 Ｊ、 Ｂｏｙｄ ａｎｄ Ｍ、 Ａ、 Ｌｏ
ｇａｎ） 、 Ｊ。
５１年）］で測定した。 生成物中のホルムアルデヒド
含量は約０．１９の試料を１０％硫酸水溶液１ＯｘＱ中
で２時間煮沸し、次いで得られた溶液を水蒸気蒸留して
ａｌ雁のホルムアルデヒドを除去し、届出物中のホルム
アルデヒドをクロモトロブ酸を用いた比色定量法で測定
した［エム・ジエイ・ボイドおよびエム・エイ・ローガ
ン（Ｍ、 Ｊ、 Ｂｏｙｄ ａｎｄ Ｍ、 Ａ、 Ｌｏ
ｇａｎ） 、 Ｊ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 １４６巻、２７９頁（１９
４２年）］。
４２年）］。
極限粘度数（極限粘度）は１ ｉｍ（ｎ／ ｎｏ−１）
／ Ｃで定義される。但しｎ及びｎｏは夫々溶液及び溶
媒の粘度であり、Ｃはｇ／ｃｃで表したＨＹの濃度であ
る。
／ Ｃで定義される。但しｎ及びｎｏは夫々溶液及び溶
媒の粘度であり、Ｃはｇ／ｃｃで表したＨＹの濃度であ
る。
測定は０．２０モル濃度食塩水溶液中でウベロード毛管
型稀薄溶液粘度計で行った。粘度平均分子量は式［ηコ
ニ０．０２２８Ｍ” ”で計算する［アール・シイ、ク
リ−ランド、ジエイ・エル・ワンプ（Ｒ，Ｃ。
型稀薄溶液粘度計で行った。粘度平均分子量は式［ηコ
ニ０．０２２８Ｍ” ”で計算する［アール・シイ、ク
リ−ランド、ジエイ・エル・ワンプ（Ｒ，Ｃ。
Ｃ１ｅｌａｎｄ ａｎｄ Ｔ、 Ｌ、 ｌｌａｎｇ）
、 Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、 ９＠。
、 Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、 ９＠。
７９９頁（１９７０年）コ。
重量平均分子量は６３２．８ｒｖ＋にセットされたヘリ
ウム−ネオンレーザ−を備えた［クロマティックス（Ｃ
ｈｒｏｍａＬｉｘ） ＫＭＸ−６ｊ装置を用い℃小角レ
ーザー光散乱法（ｌｏｗ ａｎｇｌｅ １ａｓｅｒ ｌ
ｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）により
測定される。重量平均分子量はその外？こも分升的超遠
心法によって測定される沈降常数及び拡散常数からら計
算される。
ウム−ネオンレーザ−を備えた［クロマティックス（Ｃ
ｈｒｏｍａＬｉｘ） ＫＭＸ−６ｊ装置を用い℃小角レ
ーザー光散乱法（ｌｏｗ ａｎｇｌｅ １ａｓｅｒ ｌ
ｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）により
測定される。重量平均分子量はその外？こも分升的超遠
心法によって測定される沈降常数及び拡散常数からら計
算される。
動的光散乱法は比較的高濃度のＨＹ溶液中での分子の凝
集度を測定するのに使われる。この方法によって、溶液
中の相当球皿径（ＥＳＤ）の分布が判る。
集度を測定するのに使われる。この方法によって、溶液
中の相当球皿径（ＥＳＤ）の分布が判る。
レオロジー的性質はボーリン レオメータ−システム（
Ｂｏｈｌｉｎ Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）で
測定される。同システムはコンピューター化されたレオ
メータ−であって粘度、振動、緩和の３つのモードで動
作できる。ＨＹ溶液について次のパラメータ、すなわち
広範囲の剪断速度下の粘度、並びに種々の振動周波数及
び緩和時間に於ける動的粘度、動的貯蔵弾性率及び動的
損失弾性率が測定される。
Ｂｏｈｌｉｎ Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）で
測定される。同システムはコンピューター化されたレオ
メータ−であって粘度、振動、緩和の３つのモードで動
作できる。ＨＹ溶液について次のパラメータ、すなわち
広範囲の剪断速度下の粘度、並びに種々の振動周波数及
び緩和時間に於ける動的粘度、動的貯蔵弾性率及び動的
損失弾性率が測定される。
上述の如くこの発明の生成物（ＨＹ）はＨＡとホルムア
ルデヒドの如き架橋剤とその場での化学反応の結果得ら
れた新規な高分子物である。ＩＩＹの化学分析の結果、
ホルムアルデヒド含有混合物で処理した雄鶏のとさかか
ら得られる生成物中の結合ホルムアルデヒドの含有量は
処理の各種のパラメータに依存するがＨＹポリマーの重
量基準で０．００５〜０．０２重量％の範囲内であるこ
とが明らかになった。
ルデヒドの如き架橋剤とその場での化学反応の結果得ら
れた新規な高分子物である。ＩＩＹの化学分析の結果、
ホルムアルデヒド含有混合物で処理した雄鶏のとさかか
ら得られる生成物中の結合ホルムアルデヒドの含有量は
処理の各種のパラメータに依存するがＨＹポリマーの重
量基準で０．００５〜０．０２重量％の範囲内であるこ
とが明らかになった。
生成物中の結合ホルムアルデヒドの存在は放射性同位元
素でラベルされたホルムアルデヒド（” ＣＨ，Ｏ）を
使用した処理の実験によって乙証明された（後記参考例
１２を参照）。実験の結果は本発明によって得られた生
成物が繰返し沈澱をしても、もしくはポリマー溶液の徹
底的透析（ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ ｄｉａｌｙｓｉｓ）
によっても除去し得ない結合ホルムアルデヒドを含んで
いることを示している。これは生成物のポリマー分子に
ホルムアルデヒドが、共有結合で結合していることを証
明する育力な証拠である。ホルムアルデヒドが明確にＨ
Ａと結合している否かを知るために、ＨＡを、細菌らし
くはリーチ（１ｅｅｃｈ）のヒアルロニダーゼ、特にｌ
（Ａを分解する酵素類で処理した。この処理の結果はホ
ルムアルデヒドの顕著な量がＨＹ高分子物に直接共有結
合で結合していることを示した。
素でラベルされたホルムアルデヒド（” ＣＨ，Ｏ）を
使用した処理の実験によって乙証明された（後記参考例
１２を参照）。実験の結果は本発明によって得られた生
成物が繰返し沈澱をしても、もしくはポリマー溶液の徹
底的透析（ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ ｄｉａｌｙｓｉｓ）
によっても除去し得ない結合ホルムアルデヒドを含んで
いることを示している。これは生成物のポリマー分子に
ホルムアルデヒドが、共有結合で結合していることを証
明する育力な証拠である。ホルムアルデヒドが明確にＨ
Ａと結合している否かを知るために、ＨＡを、細菌らし
くはリーチ（１ｅｅｃｈ）のヒアルロニダーゼ、特にｌ
（Ａを分解する酵素類で処理した。この処理の結果はホ
ルムアルデヒドの顕著な量がＨＹ高分子物に直接共有結
合で結合していることを示した。
この発明によって得られる生成物中の蛋白質含量は乾燥
ポリマーの重量基準で通常０．５％を越えることなく、
０．１％程度に少なくしたりさらに少なくすることかで
きる。
ポリマーの重量基準で通常０．５％を越えることなく、
０．１％程度に少なくしたりさらに少なくすることかで
きる。
ＨＡ高分子に架橋剤を共有結合的に結合させることによ
るＨＡの化学的修飾、換言すれば該ポリマーの元々の構
造の変化は、分子量や分子の大きさのごとき物理化学的
パラメータ、さらに分子間相互作用およびポリマー溶液
のレオロジー的性質に実質的に影響を与える。
るＨＡの化学的修飾、換言すれば該ポリマーの元々の構
造の変化は、分子量や分子の大きさのごとき物理化学的
パラメータ、さらに分子間相互作用およびポリマー溶液
のレオロジー的性質に実質的に影響を与える。
この発明により得られたＩ（Ｙは極めて高い分子量を有
する。従って極限粘度数は７，０ＯＯｃｃ／ｇ以上すな
わち粘度平均分子量にして約６ＸＩＯ″に達する。
する。従って極限粘度数は７，０ＯＯｃｃ／ｇ以上すな
わち粘度平均分子量にして約６ＸＩＯ″に達する。
光散乱法による重量平均分子量は１３Ｘ １０’にも達
する。この重量平均分子量と粘度平均分子量との不一致
は後述する如く極めて大きな意味をもっていることが明
らかになった。例えばｌＸｌ０’或いはそれ以下の如き
実質的に低い分子量のポリマーも所望によりこの発明の
方法によって容易に作ることができると理解されるべき
である。同様に）ＩＹを、回収および精製の任意の工程
でそのポリサッカライド鎖のグルコシド結合を切断する
ことが知られている試薬に曝露させれば、いずれの所望
の分子量のポリマーも得ることができる。上記公知の切
断剤とはヒアルロニダーゼの如き特定の酵素、フリーラ
ジカル発生系、剪断力、熱１強アルカリ。
する。この重量平均分子量と粘度平均分子量との不一致
は後述する如く極めて大きな意味をもっていることが明
らかになった。例えばｌＸｌ０’或いはそれ以下の如き
実質的に低い分子量のポリマーも所望によりこの発明の
方法によって容易に作ることができると理解されるべき
である。同様に）ＩＹを、回収および精製の任意の工程
でそのポリサッカライド鎖のグルコシド結合を切断する
ことが知られている試薬に曝露させれば、いずれの所望
の分子量のポリマーも得ることができる。上記公知の切
断剤とはヒアルロニダーゼの如き特定の酵素、フリーラ
ジカル発生系、剪断力、熱１強アルカリ。
強酸などである。
ＨＹの溶液中での部分比容積（ｐｓｖ） （ｐａｒｔｉ
ａｌｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｏｌｕＩＩｌｅ）は溶液のイ
オン強度に依存する。それは０．１５モル食塩含有の水
によるＨＹ溶液（ａ度ゼロからｏ 、 ５Ｍｇ／ ｘＱ
）のデンシトメトリイ（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）
で測定され、０．６２７ｃｃ／ｇであることが判った。
ａｌｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖｏｌｕＩＩｌｅ）は溶液のイ
オン強度に依存する。それは０．１５モル食塩含有の水
によるＨＹ溶液（ａ度ゼロからｏ 、 ５Ｍｇ／ ｘＱ
）のデンシトメトリイ（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）
で測定され、０．６２７ｃｃ／ｇであることが判った。
０．１５モル食塩水に溶解したＨＹの１％溶液の試料に
ついての相当球皿径（ＥＳＤ）の分布を第４図に示した
。そのデータによると、ＨＹは極めて高度に凝集した形
態で存在し、しかもその凝集体は安定で沈降することは
ないことは明らかである。
ついての相当球皿径（ＥＳＤ）の分布を第４図に示した
。そのデータによると、ＨＹは極めて高度に凝集した形
態で存在し、しかもその凝集体は安定で沈降することは
ないことは明らかである。
この発明により作られた典型的な超高分子量生成物のレ
オロジー的性質は第１〜３図に示しである。この生成物
は顕著な粘弾性的性質を有する溶液（０，５重量％及び
それ以上）を作ることが分かった。
オロジー的性質は第１〜３図に示しである。この生成物
は顕著な粘弾性的性質を有する溶液（０，５重量％及び
それ以上）を作ることが分かった。
下記のパラメータが該ポリマー溶液の弾性的性質を最も
良く表す。すなわち動的貯蔵弾性率（Ｇ′）、クロスオ
ーバー点（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ ｐｏｉｎｔ） （動
的貯蔵弾性率Ｇ°が動的損失弾性率Ｇ”より大きくなる
点）の周波数、位相角、緩和時間である。
良く表す。すなわち動的貯蔵弾性率（Ｇ′）、クロスオ
ーバー点（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ ｐｏｉｎｔ） （動
的貯蔵弾性率Ｇ°が動的損失弾性率Ｇ”より大きくなる
点）の周波数、位相角、緩和時間である。
ＨＹは、水もしくは電解質水溶液による極めて粘稠な溶
液を作る。溶液の粘度はポリマーの濃度、電解質含量、
温度に依存し、剪断速度によって減少する、すなわちＨ
Ｙ溶液はかなりの擬似可塑性（ｐｓｅｕｄｏｐｌａｓｔ
ｉｃｉｔｙ）をらっている。
液を作る。溶液の粘度はポリマーの濃度、電解質含量、
温度に依存し、剪断速度によって減少する、すなわちＨ
Ｙ溶液はかなりの擬似可塑性（ｐｓｅｕｄｏｐｌａｓｔ
ｉｃｉｔｙ）をらっている。
ＨＹ溶液のレオロジー的性質を考える場合、これらの性
質が他のポリマーの場合と同様に生成物の分子量に大き
く依存することを理解しておくべきである。上述の如＜
ＨＹは広範囲の分子量のらのが得られ、レオロジー的性
質もそれに従って変わる。
質が他のポリマーの場合と同様に生成物の分子量に大き
く依存することを理解しておくべきである。上述の如＜
ＨＹは広範囲の分子量のらのが得られ、レオロジー的性
質もそれに従って変わる。
かくして超高分子量生成物（極限粘度数４５００ｃｃ／
ｇ以上）については０，１５モル食塩水による！重量％
溶液の粘度は剪断速度０．０５５ｓ−’で１０００Ｐａ
、ｓ以上に達するが、一方極限粘度数が約１０００ｃｃ
／ｇのポリマーの１重ａ＝溶液は約２Ｐａ、ｓ、にすぎ
ないことが分かった。Ｉ（Ａ溶液の弾性的性質らポリマ
ーの分子量に依存することが分かった。その故に超高分
子量ＢＹの０．１５モル食塩水の１重量％溶液の動的貯
蔵弾性率Ｇ′は周波数０．０１ヘルツで約４ＱＰａであ
るが、一方極限粘度数が約１０００ｃｃ／ｇのＩＣＹ溶
液では約０．２Ｐａにすぎない。ポリマー溶液の弾性的
性質と粘性的性質との比を極めてうまく特徴づける“ク
ロスオーバー点”の周波数は、ポリマーの分子量がほぼ
１．５ｘ １．Ｏｇから８Ｘ １０”の範囲及びそれ以
上の場合、ＨＡの０．１５モル食塩水による１重量％溶
液について２５℃で通常０．０２５ヘルツ以下である。
ｇ以上）については０，１５モル食塩水による！重量％
溶液の粘度は剪断速度０．０５５ｓ−’で１０００Ｐａ
、ｓ以上に達するが、一方極限粘度数が約１０００ｃｃ
／ｇのポリマーの１重ａ＝溶液は約２Ｐａ、ｓ、にすぎ
ないことが分かった。Ｉ（Ａ溶液の弾性的性質らポリマ
ーの分子量に依存することが分かった。その故に超高分
子量ＢＹの０．１５モル食塩水の１重量％溶液の動的貯
蔵弾性率Ｇ′は周波数０．０１ヘルツで約４ＱＰａであ
るが、一方極限粘度数が約１０００ｃｃ／ｇのＩＣＹ溶
液では約０．２Ｐａにすぎない。ポリマー溶液の弾性的
性質と粘性的性質との比を極めてうまく特徴づける“ク
ロスオーバー点”の周波数は、ポリマーの分子量がほぼ
１．５ｘ １．Ｏｇから８Ｘ １０”の範囲及びそれ以
上の場合、ＨＡの０．１５モル食塩水による１重量％溶
液について２５℃で通常０．０２５ヘルツ以下である。
ＨＹ試料及び溶液の物理化学的及び粘弾性的性質を公知
の方法で得られたＨＡ生成物の同じ性質と比較して第１
表及び第４図と５図に示した。比較に用いた生成物は雄
鶏のとさかから水抽出し、次いで数回のクロロホルム抽
出を行う所謂セバク（Ｓｅｖａｇ ）法［シイ・ブリッ
クス、オオ・シェルマン、 （Ｇ、 Ｂ１１ｘ、 Ｏ
，Ｓｈｅｌｌｍａｎ）、＾ｒｋｉｖ ｆｏｒＫｅｍｉ、
Ｍｉｎｅｒａｌ Ｇｅｏｌ、） 、 １９Ａ＠、 １
頁（１９４５年）コで脱蛋白質して回収したＨＡである
。
の方法で得られたＨＡ生成物の同じ性質と比較して第１
表及び第４図と５図に示した。比較に用いた生成物は雄
鶏のとさかから水抽出し、次いで数回のクロロホルム抽
出を行う所謂セバク（Ｓｅｖａｇ ）法［シイ・ブリッ
クス、オオ・シェルマン、 （Ｇ、 Ｂ１１ｘ、 Ｏ
，Ｓｈｅｌｌｍａｎ）、＾ｒｋｉｖ ｆｏｒＫｅｍｉ、
Ｍｉｎｅｒａｌ Ｇｅｏｌ、） 、 １９Ａ＠、 １
頁（１９４５年）コで脱蛋白質して回収したＨＡである
。
第１表 ＨＹとＨＡ試料の物理化学的及びレオロジー的
データの比較 パラメータ ＨＹ
ＨＡ極限粘度数（ｃｃ／ｇ） ４
，７２９ ３．５６２粘度法分子量データ（Ｘ ｔ
ｏ’） ３．２８ ２．３０光散乱
法分子量データ（ＸＩＯつ １３．３０
２．８６沈降、拡散法分子量データＸＩＯ’（ＰＳＵ）
１３．６０ ２．１４部分比容積 （ｐａｒｔｉａｌ ５ｐｅｃｉｆｉｃ ｖｏｌｕｍｅＸ
ｃｃ／ｇ） ０．６２７ ０．５７０レオロ
ージー的性質 （０，１５モル食塩水中１重量％溶液）剪断粘度（剪断
速度０．０５５ ｓ”ＸＰａ、ｓ） ９６９
３０５動的貯蔵弾性率（Ｇ′） （周波数０．０１ヘルツ） （Ｐａ）
３９．８ １０．１クロスオ一バー点周波数（ヘル
ツ） ０．００５６ ０．０３５緩和時間（
弾性率半減） ５８ １９位相
角 （度） 周波数０．００２ヘルツ ５８．７
７６〃１０ヘルツ ８．５
１２第１表及び第４図のデータはＨＹとｌ（Ａとの
明瞭な差異を示している。先ず第一に公知の生成物では
粘度平均分子量と重量平均分子量とは殆ど同じ値である
が（重量平均分子量の方がわずかに低い）、この発明の
生成物は重量平均分子量か粘度平均分子量の約４倍と大
きい。第二に、ＨＹ溶液の部分比容積（ＰＳＶ）の値が
ＨＡと比べて大きいということは、ＨＹポリマーの方が
より大きな大きさを有することを証明している。第三に
ＨＹポリマーは溶液中で凝集してＨＡ溶液と比較して実
質的により大きい凝集体を与え、このことはＨＹ高分子
がより大きな大きさを有するだけでなく、より強い分子
間相互作用を有することを示している。最後にＩ（Ｙ溶
液は実質的に、ＨＡの同濃度溶液上り粘稠で弾力性であ
る。その大きな粘度は高い粘度平均分子量によるとして
も、測定された劇的ともいえる弾力性の増加は同じ理由
で説明するのは困難である。
データの比較 パラメータ ＨＹ
ＨＡ極限粘度数（ｃｃ／ｇ） ４
，７２９ ３．５６２粘度法分子量データ（Ｘ ｔ
ｏ’） ３．２８ ２．３０光散乱
法分子量データ（ＸＩＯつ １３．３０
２．８６沈降、拡散法分子量データＸＩＯ’（ＰＳＵ）
１３．６０ ２．１４部分比容積 （ｐａｒｔｉａｌ ５ｐｅｃｉｆｉｃ ｖｏｌｕｍｅＸ
ｃｃ／ｇ） ０．６２７ ０．５７０レオロ
ージー的性質 （０，１５モル食塩水中１重量％溶液）剪断粘度（剪断
速度０．０５５ ｓ”ＸＰａ、ｓ） ９６９
３０５動的貯蔵弾性率（Ｇ′） （周波数０．０１ヘルツ） （Ｐａ）
３９．８ １０．１クロスオ一バー点周波数（ヘル
ツ） ０．００５６ ０．０３５緩和時間（
弾性率半減） ５８ １９位相
角 （度） 周波数０．００２ヘルツ ５８．７
７６〃１０ヘルツ ８．５
１２第１表及び第４図のデータはＨＹとｌ（Ａとの
明瞭な差異を示している。先ず第一に公知の生成物では
粘度平均分子量と重量平均分子量とは殆ど同じ値である
が（重量平均分子量の方がわずかに低い）、この発明の
生成物は重量平均分子量か粘度平均分子量の約４倍と大
きい。第二に、ＨＹ溶液の部分比容積（ＰＳＶ）の値が
ＨＡと比べて大きいということは、ＨＹポリマーの方が
より大きな大きさを有することを証明している。第三に
ＨＹポリマーは溶液中で凝集してＨＡ溶液と比較して実
質的により大きい凝集体を与え、このことはＨＹ高分子
がより大きな大きさを有するだけでなく、より強い分子
間相互作用を有することを示している。最後にＩ（Ｙ溶
液は実質的に、ＨＡの同濃度溶液上り粘稠で弾力性であ
る。その大きな粘度は高い粘度平均分子量によるとして
も、測定された劇的ともいえる弾力性の増加は同じ理由
で説明するのは困難である。
これらの観察の結果、組織からの抽出に先立つ ゛て
その場でのヒアルロン酸の化学的修飾はポリマ−の化学
的組成をほんの僅かに変えるだけであるが、同時に物理
化学的パラメータ及びレオロジー的性質にいくつかの劇
的変化を与えるという結論が得られた。この変化は化学
的組成の変化が高分子構造の何らかの重要な変化に相当
する際に起こるだけである。
その場でのヒアルロン酸の化学的修飾はポリマ−の化学
的組成をほんの僅かに変えるだけであるが、同時に物理
化学的パラメータ及びレオロジー的性質にいくつかの劇
的変化を与えるという結論が得られた。この変化は化学
的組成の変化が高分子構造の何らかの重要な変化に相当
する際に起こるだけである。
溶液中のＨＡ高分子の形態は種々の方法で研究されてお
り、この問題についての文献ら多数にのぼる。これらの
研究は溶液中のポリマーａ度が比較的低い（例えば０．
１％）場合ポリマー分子は伸びたランダムコイル形態で
相互に絡み合っていることを示している。高濃度では溶
液は高分子鎖の三次元連続網状構造を含んでいると信じ
られる。ＨＡ高分子中のグルコシド結合は相当のスティ
フネスをもっていることが見出された。溶媒と溶質との
相互作用、多くのＩＩＡ製剤中に存在する少量の蛋白質
との相互作用及び連鎖内相互作用の如き各種の機構がこ
れらの現象を説明するのに提案されている［例えばエイ
・エイ・バラズ、ヒアルロン酸の物理化学、 Ｆｅｄ、
Ｐｒｏｃｅｅｄ、、１７巻、 １０８６〜１０９３頁
（１９５８年）参照コ。幾人かの著者は）ＩＡ高分子１
こ二重らせん構造を提唱し、二重らせんセグメントが１
（Ａ溶液の異常なレオロジー的性質を与える架橋結合の
役割を演することかできると示唆した［シイ・エム・デ
ィア、アール・ムアーハウス、デイ・デイ、リース、ニ
ス、アルノット、ジエイ・エム・ガスおよびエイ・エイ
、バラズ、 Ｃ，Ｍ、 Ｄｅａ、 Ｒ。
り、この問題についての文献ら多数にのぼる。これらの
研究は溶液中のポリマーａ度が比較的低い（例えば０．
１％）場合ポリマー分子は伸びたランダムコイル形態で
相互に絡み合っていることを示している。高濃度では溶
液は高分子鎖の三次元連続網状構造を含んでいると信じ
られる。ＨＡ高分子中のグルコシド結合は相当のスティ
フネスをもっていることが見出された。溶媒と溶質との
相互作用、多くのＩＩＡ製剤中に存在する少量の蛋白質
との相互作用及び連鎖内相互作用の如き各種の機構がこ
れらの現象を説明するのに提案されている［例えばエイ
・エイ・バラズ、ヒアルロン酸の物理化学、 Ｆｅｄ、
Ｐｒｏｃｅｅｄ、、１７巻、 １０８６〜１０９３頁
（１９５８年）参照コ。幾人かの著者は）ＩＡ高分子１
こ二重らせん構造を提唱し、二重らせんセグメントが１
（Ａ溶液の異常なレオロジー的性質を与える架橋結合の
役割を演することかできると示唆した［シイ・エム・デ
ィア、アール・ムアーハウス、デイ・デイ、リース、ニ
ス、アルノット、ジエイ・エム・ガスおよびエイ・エイ
、バラズ、 Ｃ，Ｍ、 Ｄｅａ、 Ｒ。
Ｍｏｏｒｈｏｕｓ、 Ｄ、 Ｄ、 Ｒｅｅｓ、Ｓ、 Ａ
ｒｎｏｔｔ、 ＪｌＭ、 Ｇｕｓｓａｎｄ Ｅ、 Ａ、
Ｂａ１ａｚｓ） 、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １７９Ｊｃ
５６０−５６２頁（１９７２年）；ニス・アルノット
、エイ・アール・ミトラおよびニス・ラグナタン（Ｓ、
ＡｒｎｏｔＬ、＾。
ｒｎｏｔｔ、 ＪｌＭ、 Ｇｕｓｓａｎｄ Ｅ、 Ａ、
Ｂａ１ａｚｓ） 、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １７９Ｊｃ
５６０−５６２頁（１９７２年）；ニス・アルノット
、エイ・アール・ミトラおよびニス・ラグナタン（Ｓ、
ＡｒｎｏｔＬ、＾。
Ｒ，Ｍｉｔｒａ ａｎｄ Ｓ、 Ｒａｇｈｕｎａｔａｎ
） 、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、。
） 、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、。
１６９巻、８６１〜８７２頁、 （１９８３年）］こ
れらの研究及び考察について考えてみて、この発明の発
明者らはこの発明による生成物（ＨＹ）は、蛋白質架橋
固定剤で組織を処理する間に導入された追加の架橋結合
を含有できるという仮説に到達した。この発明で使用す
る反応剤例えばホルムアルデヒドは種々の化学基に対し
て著しく反応性であり、その反応性はｐＨ，温度、ａ変
などの反応条件に実質的に依存する。ヒアルロン酸のヒ
ドロキシル基は前記処理条件下ではこれらの試薬と明ら
かに反応しない。何故ならば処理して得られた生成物は
常に水溶性であり、それ故かなりの架橋度のポリマーを
含んでいないからである。処理中に、ポリマーに導入さ
れる追加の架橋結合の量は多分、ポリマーを不溶化する
のには不充分な少ない量であるが、高分子間の相互作用
とそれによって起こるポリマー溶液の弾性を顕著に増加
さ仕るに充分なものである。処理剤とのかかる反応のい
くつかの候補はヒアルロン酸のアセタミド基、ＨＡ中に
少量存在し得るアセチル化されていないアミノ基、並び
に処理中に組織の細胞間マトリックス中に存在する蛋白
質のアミド基、アミノ基などの活性基である。ＨＡのア
セタミド基自身が分子間架橋を形成するということはほ
とんど考えられない。
れらの研究及び考察について考えてみて、この発明の発
明者らはこの発明による生成物（ＨＹ）は、蛋白質架橋
固定剤で組織を処理する間に導入された追加の架橋結合
を含有できるという仮説に到達した。この発明で使用す
る反応剤例えばホルムアルデヒドは種々の化学基に対し
て著しく反応性であり、その反応性はｐＨ，温度、ａ変
などの反応条件に実質的に依存する。ヒアルロン酸のヒ
ドロキシル基は前記処理条件下ではこれらの試薬と明ら
かに反応しない。何故ならば処理して得られた生成物は
常に水溶性であり、それ故かなりの架橋度のポリマーを
含んでいないからである。処理中に、ポリマーに導入さ
れる追加の架橋結合の量は多分、ポリマーを不溶化する
のには不充分な少ない量であるが、高分子間の相互作用
とそれによって起こるポリマー溶液の弾性を顕著に増加
さ仕るに充分なものである。処理剤とのかかる反応のい
くつかの候補はヒアルロン酸のアセタミド基、ＨＡ中に
少量存在し得るアセチル化されていないアミノ基、並び
に処理中に組織の細胞間マトリックス中に存在する蛋白
質のアミド基、アミノ基などの活性基である。ＨＡのア
セタミド基自身が分子間架橋を形成するということはほ
とんど考えられない。
蛋白質とホルムアルデヒドとの反応の研究に於いて［例
えばジエイ・エフ・ウォーカー（Ｊ、 Ｆ。
えばジエイ・エフ・ウォーカー（Ｊ、 Ｆ。
Ｗａｌｋｅｒ） 、ホルムアルデヒド、ラインホルト出
版社、ニューヨーク、 １９５３年、 ３１２−３１７
頁を参照］、蛋白質のアミノ基自身は架橋を形成できず
、架橋形成の可能性の最も高い反応の−っはホルムアル
デヒドとアミノ基とが反応してＮ−メチロールアミノ基
を与え、これが次いでアミド基と反応する反応であるこ
とが見出された。
版社、ニューヨーク、 １９５３年、 ３１２−３１７
頁を参照］、蛋白質のアミノ基自身は架橋を形成できず
、架橋形成の可能性の最も高い反応の−っはホルムアル
デヒドとアミノ基とが反応してＮ−メチロールアミノ基
を与え、これが次いでアミド基と反応する反応であるこ
とが見出された。
したがってＨＡ高分子中に限定された敢の架橋を導入で
きる機構として２つ考えられる。第一の機構にはホルム
アルデヒドの如き架橋剤とＨＡ中に存在する可能性の高
いアセトアミド基や遊離のアミノ基との反応が含まれる
［エイ・エイ・バラズ。
きる機構として２つ考えられる。第一の機構にはホルム
アルデヒドの如き架橋剤とＨＡ中に存在する可能性の高
いアセトアミド基や遊離のアミノ基との反応が含まれる
［エイ・エイ・バラズ。
Ｆｅｄ、 Ｐｒｏｃｅｅｄ、、 ２５頁１８１７−１８
２２頁（１９６６年）］。
２２頁（１９６６年）］。
第二の可能がある機構は、架橋反応への蛋白質又はポリ
ペプチドの関与を示唆している。文献には、蛋白質又は
ポリペプチドはｌ（Ａ分子に共有結合で結合している［
ユーコ、ミクムータカガキおよびビイ・ビイ・ツール（
Ｙｕｋｏ Ｍｉｋｕｍ−Ｔａｋａｇａｋｉａｎｄ Ｂ、
Ｐ、 Ｔｏｏｌｅ） 、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、、 ２５６巻。
ペプチドの関与を示唆している。文献には、蛋白質又は
ポリペプチドはｌ（Ａ分子に共有結合で結合している［
ユーコ、ミクムータカガキおよびビイ・ビイ・ツール（
Ｙｕｋｏ Ｍｉｋｕｍ−Ｔａｋａｇａｋｉａｎｄ Ｂ、
Ｐ、 Ｔｏｏｌｅ） 、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、、 ２５６巻。
（１６） 、 ８４６３−８４６９頁（１９８１年）］
とが、或いは別のしかたでＨＡ分子と会合することがで
きるという報告が続いている。この場合、架橋結合は、
−つのＨＡ高分子と、ひとつの蛋白質成分および別のＨ
Ａ高分子との間に形成されるが、或いは２つのＨＡ高分
子に共有結合で結合した蛋白質問に形成することができ
る。
とが、或いは別のしかたでＨＡ分子と会合することがで
きるという報告が続いている。この場合、架橋結合は、
−つのＨＡ高分子と、ひとつの蛋白質成分および別のＨ
Ａ高分子との間に形成されるが、或いは２つのＨＡ高分
子に共有結合で結合した蛋白質問に形成することができ
る。
これらの機構のいずれもこの発明を限定するとみなされ
へきてはない。この発明の生成物中に共有結合による架
橋結合を少量導入する他の機構があり得ることは理解さ
れるべきである。
へきてはない。この発明の生成物中に共有結合による架
橋結合を少量導入する他の機構があり得ることは理解さ
れるべきである。
いずれに仕上、この発明の本質的な特徴は、おそらく、
ＨＡ高分子中に少数の架橋結合を導入することによって
、）ＩＡ回収工程中に、組織内のＨＡを化学的に修飾す
ることであり、その化学的修飾の程度は、ＨＡの有利な
性質例えば水性媒体中で高粘度の溶液を与える性能、生
物的適合性などに悪影響を与えることなくポリマー溶液
の弾性的特性を実質的に増太さきるのに充分なものであ
る。
ＨＡ高分子中に少数の架橋結合を導入することによって
、）ＩＡ回収工程中に、組織内のＨＡを化学的に修飾す
ることであり、その化学的修飾の程度は、ＨＡの有利な
性質例えば水性媒体中で高粘度の溶液を与える性能、生
物的適合性などに悪影響を与えることなくポリマー溶液
の弾性的特性を実質的に増太さきるのに充分なものであ
る。
この発明により製造される化学的に修飾されたヒアルロ
ン酸すなわち）ＩＹは医学の分野や化粧品の多くの用途
、例えばビスコ外科の道具、各種の素材の生物的適合性
を改善するたのコーティング、各種医薬製剤の一成分、
肌の手入れ用製品などに利用できる。このポリマーの改
良された性質例えば増大された弾力性はＨＹの使用時に
大きな利益をもたらす。
ン酸すなわち）ＩＹは医学の分野や化粧品の多くの用途
、例えばビスコ外科の道具、各種の素材の生物的適合性
を改善するたのコーティング、各種医薬製剤の一成分、
肌の手入れ用製品などに利用できる。このポリマーの改
良された性質例えば増大された弾力性はＨＹの使用時に
大きな利益をもたらす。
又、ＨＹは、慣用的な架橋剤による架橋反応の如き化学
的修飾法を更に附加することによって得られる新規生成
物の出発物質として使用できる。この発明による化学的
に修飾されたＨＡおよびその溶液の特別な性質はいくつ
かの珍しい性質を持った上記の附加的に化学的修飾され
た生成物を得る機会を与えてくれることが判った。かく
してこの発明による生成物をアルカリ性溶液中ジビニル
スルホンで架橋することによって水不溶性のゼリー状物
質が得られることが判った。この物質は高度に膨潤した
ゲルである。このゲル中のポリマーの濃度は水或いは電
解質の如き種々の低分子量物質の水溶液であってもよい
液相の組成に依存する。生理食塩水（Ｏ，ｔＳモル食塩
水溶液）の場合、ポリマー濃度は０．１５〜０．４０重
量％にできる。この物質は第５．６および７図に示す非
常に興味あるレオロジー的性質をもっている。すなわち
全試験周波数について、複素動的弾性率（Ｇ゛）の弾性
成分は損失弾性率（Ｇ”）より大きい。同時にこの物質
は低い剪断速度下で擬似可塑物の如き挙動を示す。すな
わち粘度は剪断速度によってかなり低下する。またこの
物質は緩和時間が著しく永いという特徴を何する。この
事はこの発明により得られたＨＹの溶液の特異な構造で
あって、それが特別のレオロジー的性質をもった上記の
ゼリー状生成物を得ることを可能にしたものと確信して
いる。換言すれば、この発明の回収法で起こるＨＡの化
学的変化がＨＹの構造及び性質に影響するばかりが、そ
れから得られる生成物の性質までも影響を及ぼすのであ
る。
的修飾法を更に附加することによって得られる新規生成
物の出発物質として使用できる。この発明による化学的
に修飾されたＨＡおよびその溶液の特別な性質はいくつ
かの珍しい性質を持った上記の附加的に化学的修飾され
た生成物を得る機会を与えてくれることが判った。かく
してこの発明による生成物をアルカリ性溶液中ジビニル
スルホンで架橋することによって水不溶性のゼリー状物
質が得られることが判った。この物質は高度に膨潤した
ゲルである。このゲル中のポリマーの濃度は水或いは電
解質の如き種々の低分子量物質の水溶液であってもよい
液相の組成に依存する。生理食塩水（Ｏ，ｔＳモル食塩
水溶液）の場合、ポリマー濃度は０．１５〜０．４０重
量％にできる。この物質は第５．６および７図に示す非
常に興味あるレオロジー的性質をもっている。すなわち
全試験周波数について、複素動的弾性率（Ｇ゛）の弾性
成分は損失弾性率（Ｇ”）より大きい。同時にこの物質
は低い剪断速度下で擬似可塑物の如き挙動を示す。すな
わち粘度は剪断速度によってかなり低下する。またこの
物質は緩和時間が著しく永いという特徴を何する。この
事はこの発明により得られたＨＹの溶液の特異な構造で
あって、それが特別のレオロジー的性質をもった上記の
ゼリー状生成物を得ることを可能にしたものと確信して
いる。換言すれば、この発明の回収法で起こるＨＡの化
学的変化がＨＹの構造及び性質に影響するばかりが、そ
れから得られる生成物の性質までも影響を及ぼすのであ
る。
従って、その技術分野で知られている方法すなわちクロ
ロホルム抽出で蛋白質を除去することによって得られた
ＨＡをジビニルスルホンでの架橋の出発物質として使っ
た場合、この発明の生成物より実質的に劣るレオロジー
的性質をもつ不溶性物質が得られた。
ロホルム抽出で蛋白質を除去することによって得られた
ＨＡをジビニルスルホンでの架橋の出発物質として使っ
た場合、この発明の生成物より実質的に劣るレオロジー
的性質をもつ不溶性物質が得られた。
本発明によって得られた生成物の附加的修飾によって多
くの他の変成物質例えば強く架橋したゲル、不溶性フィ
ルム、コーティングなどが得られるということは理解さ
れるべきである。
くの他の変成物質例えば強く架橋したゲル、不溶性フィ
ルム、コーティングなどが得られるということは理解さ
れるべきである。
この発明の発明者らは、抽出媒体のｐＨがハイランの収
率に強く影響し、っまりｐＨがアルカリ性状態にむかっ
て上昇すると収率は増大するが、同時に、ハイランが分
解するために分子量の低下をまねくということを、前記
親出願においてすでに述べた。この発明の発明者らは、
抽出時の温度を、実質的に常温（すなわち２０℃）以下
、好ましくは１５℃以下、さらに好ましくは５℃以下に
保持すると、ハイランの収率を増大させることができ、
またハイランの分子量を実質的に高レベルに保つことが
できることを見出したのである。抽出時間は、所望の収
率とポリマーの分子量およびアルカリの濃度と温度によ
って、数時間から数日まで変えることができる。また発
明者らはｐｌ＋を９．５〜１４に変えることができるこ
とを見出した。
率に強く影響し、っまりｐＨがアルカリ性状態にむかっ
て上昇すると収率は増大するが、同時に、ハイランが分
解するために分子量の低下をまねくということを、前記
親出願においてすでに述べた。この発明の発明者らは、
抽出時の温度を、実質的に常温（すなわち２０℃）以下
、好ましくは１５℃以下、さらに好ましくは５℃以下に
保持すると、ハイランの収率を増大させることができ、
またハイランの分子量を実質的に高レベルに保つことが
できることを見出したのである。抽出時間は、所望の収
率とポリマーの分子量およびアルカリの濃度と温度によ
って、数時間から数日まで変えることができる。また発
明者らはｐｌ＋を９．５〜１４に変えることができるこ
とを見出した。
抽出時のアルカリ性条件は、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウムまたは
炭酸カリウムのような無機のアルカリ、または、トリエ
チルアミン、トリエタノールアミンなどのような有機の
アルカリを含む、種々のアルカリ物質を用いることによ
って作製することかできる。この発明の発明者らは、い
くつかの場合に、水酸化ナトリウムと水酸化アンモニウ
ムの混合物のようなアルカリ物質の混合物を用いるのか
好ましいことを見出した。
カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウムまたは
炭酸カリウムのような無機のアルカリ、または、トリエ
チルアミン、トリエタノールアミンなどのような有機の
アルカリを含む、種々のアルカリ物質を用いることによ
って作製することかできる。この発明の発明者らは、い
くつかの場合に、水酸化ナトリウムと水酸化アンモニウ
ムの混合物のようなアルカリ物質の混合物を用いるのか
好ましいことを見出した。
また、滅菌性かつ非炎症性で特に発熱性物質を含まない
製品が、この発明の方法を用いて容易に得られることか
見出された。この発明の発明者らは、この種の製品が、
洗浄した雄ｋｌ、＜は雌の鶏のとさか全体を、アルカリ
性溶液で比較的短時間処理すると一層容易に得られるこ
とを見出した。
製品が、この発明の方法を用いて容易に得られることか
見出された。この発明の発明者らは、この種の製品が、
洗浄した雄ｋｌ、＜は雌の鶏のとさか全体を、アルカリ
性溶液で比較的短時間処理すると一層容易に得られるこ
とを見出した。
親出願に記載したのと同様に最初に洗浄した後で、上記
の特別の工程が行われる。最高の結果が得られるのは、
無機のアルカリ、例えば水酸化ナトリウムの濃度は、Ｏ
，０５Ｍ〜４Ｍであり、好ましくはＯｏＬＭ−ＩＭ、最
も好ましくは０．１５〜０．２５Ｍの時である。
の特別の工程が行われる。最高の結果が得られるのは、
無機のアルカリ、例えば水酸化ナトリウムの濃度は、Ｏ
，０５Ｍ〜４Ｍであり、好ましくはＯｏＬＭ−ＩＭ、最
も好ましくは０．１５〜０．２５Ｍの時である。
処理時間は、アルカリの濃度によってきまり、５ｍ１ｎ
から数時間まで変えることができ、好ましいのはｌｏｍ
ｉｎ−１ｈｒである。有機および無機の塩基を含むいず
れのタイプのアルカリ物質でも、処理溶液のｐＨを１２
より高くすることができるものであれば使用できること
は理解されるべきである。また、アルカリの水溶液また
は水と水混和性の溶媒例えばアセトン、エタノール、イ
ソプロパノールなどとの混合物ら使用できる。処理され
たとさかは、水で洗うかまたは希酸溶液と水とて洗って
、アルカリを洗い落とすことができる。このようにして
処理したとさかを次に、前記親出願に記載した手順にし
たがってアルデヒド混合物で処理する。
から数時間まで変えることができ、好ましいのはｌｏｍ
ｉｎ−１ｈｒである。有機および無機の塩基を含むいず
れのタイプのアルカリ物質でも、処理溶液のｐＨを１２
より高くすることができるものであれば使用できること
は理解されるべきである。また、アルカリの水溶液また
は水と水混和性の溶媒例えばアセトン、エタノール、イ
ソプロパノールなどとの混合物ら使用できる。処理され
たとさかは、水で洗うかまたは希酸溶液と水とて洗って
、アルカリを洗い落とすことができる。このようにして
処理したとさかを次に、前記親出願に記載した手順にし
たがってアルデヒド混合物で処理する。
この発明の発明者らは、この発明によって得られたハイ
ラン製品の結合ホルムアルデヒドの含量が、前記親出願
に述べたハイランよりかなり小さい場合があることを見
出した。発明者らがいくつかの試料で検出できた最低の
レベルは、約０．０００２重徂％である。
ラン製品の結合ホルムアルデヒドの含量が、前記親出願
に述べたハイランよりかなり小さい場合があることを見
出した。発明者らがいくつかの試料で検出できた最低の
レベルは、約０．０００２重徂％である。
ハイラン生成の化学に関する情報をさらに得るために、
放射能で標識したホルムアルデヒドによる第２の実験（
実施例８）を行った。この実験は、いくつかの点で前記
親出願に記載された実験とは異なる。これら二つの実験
結果から、下記結論を得た。
放射能で標識したホルムアルデヒドによる第２の実験（
実施例８）を行った。この実験は、いくつかの点で前記
親出願に記載された実験とは異なる。これら二つの実験
結果から、下記結論を得た。
１、少量のホルムアルデヒドが、ハイラン高分子に強力
に共有結合していると考えられる。このホルムアルデヒ
ドは、沈澱法、溶媒による洗浄、乾燥もしくは透析を繰
返しても除去できない。
に共有結合していると考えられる。このホルムアルデヒ
ドは、沈澱法、溶媒による洗浄、乾燥もしくは透析を繰
返しても除去できない。
２、この結合されたホルムアルデヒドのかなりな量が、
ハイランの多糖部分をヒアルロナンおよび硫酸コンドロ
イチンを分解するヒアルロニダーゼで消化した後透析す
ることによって除去することができる。恐らくこのホル
アルデヒドは、透析可能な、ペプチド類またはペプチド
と少糖類との結合物と結合していると考えられる。この
ホルムアルデヒドのいくらかは、凍結乾燥によって除去
されるが、これはホルムアルデヒドがゆるく結合してい
ることを示している。
ハイランの多糖部分をヒアルロナンおよび硫酸コンドロ
イチンを分解するヒアルロニダーゼで消化した後透析す
ることによって除去することができる。恐らくこのホル
アルデヒドは、透析可能な、ペプチド類またはペプチド
と少糖類との結合物と結合していると考えられる。この
ホルムアルデヒドのいくらかは、凍結乾燥によって除去
されるが、これはホルムアルデヒドがゆるく結合してい
ることを示している。
３、ホルムアルデヒドとハイランの蛋白質部分との反応
の宵力な証拠がオートラジオグラフィ法で得られた。ホ
ルムアルデヒドの最も存意な取り込みが、ハイラン試料
内に常に存在し、かつハイランの電気泳動パターンにお
ける主要バンドである蛋白質バンド内に観察された。
の宵力な証拠がオートラジオグラフィ法で得られた。ホ
ルムアルデヒドの最も存意な取り込みが、ハイラン試料
内に常に存在し、かつハイランの電気泳動パターンにお
ける主要バンドである蛋白質バンド内に観察された。
この発明の他の基本的に新しい態様は、沈澱および再溶
解の工程なしでこの発明の方法の濾過段階で得られるハ
イラン溶液を直接使用することである。この方法は、通
常大量の有機溶媒をとらなう沈澱工程がなくなるので、
得られる製品は、通常製造されるハイランよりかなり安
価である。濾液中のハイランの濃度、したがって収量は
、中性ｐＨての抽出に比べてかなり高いので、アルカリ
性抽出を行う方法を用いるのが有利である。製品中の過
剰のアルカリは、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸：酢
酸、クエン酸、ｐ−アミノ安り１香酸、ステアリン酸な
どのような有機酸；またはポリアクリル酸、ポリビニル
スルホン酸のようなポリマー酸で中和できる。酸の選択
は、製品の最終用途によってきまる。このようにハイラ
ン溶液は、化粧品の製剤に使用されるときは、ポリアク
リル酸を使用するとゲルが得られるが、ステアリン酸を
用いるのは化粧品用エマルジョン（クリーム剤、ローシ
ョンなど）を製造するのに便利でり、ｐ−アミノ安息香
酸の使用することによって日焼けどめ性を有する製剤か
えられる。しかし、特定の酸を選択しても、この発明の
上記態様を特別に限定するものではない。
解の工程なしでこの発明の方法の濾過段階で得られるハ
イラン溶液を直接使用することである。この方法は、通
常大量の有機溶媒をとらなう沈澱工程がなくなるので、
得られる製品は、通常製造されるハイランよりかなり安
価である。濾液中のハイランの濃度、したがって収量は
、中性ｐＨての抽出に比べてかなり高いので、アルカリ
性抽出を行う方法を用いるのが有利である。製品中の過
剰のアルカリは、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸：酢
酸、クエン酸、ｐ−アミノ安り１香酸、ステアリン酸な
どのような有機酸；またはポリアクリル酸、ポリビニル
スルホン酸のようなポリマー酸で中和できる。酸の選択
は、製品の最終用途によってきまる。このようにハイラ
ン溶液は、化粧品の製剤に使用されるときは、ポリアク
リル酸を使用するとゲルが得られるが、ステアリン酸を
用いるのは化粧品用エマルジョン（クリーム剤、ローシ
ョンなど）を製造するのに便利でり、ｐ−アミノ安息香
酸の使用することによって日焼けどめ性を有する製剤か
えられる。しかし、特定の酸を選択しても、この発明の
上記態様を特別に限定するものではない。
（以下余白）
（ニ）実施例
この発明を下記の参考例と実施ＰＪによって説明するが
この発明を限定するものではない。
この発明を限定するものではない。
参考例１
雄鶏のとさかをセチルピリジニウムクロライドの１％水
溶液で良く洗い、次いて脱イオン水で洗って最後に冷凍
した。冷凍とさかを約１〜２酎の厚みにスイラサーで薄
切りした。アセトン１０００９．３７％ホルマリン１０
０ｇおよび酢酸ナトウリム５０ｇの混合物を作り、薄切
りとさか１０００９を加えた。とさかと処理液との混合
物（ｐＨ６，７）をゆる（撹拌しつつ約２０℃で２４時
間保持した。ナイロン網で濾過して液をとさかから分離
した。次いでこの処理済とさかをアセトン５００９で洗
浄し、最終５００ｇになるまで空気中で乾燥した。乾燥
とさかを脱イオン水２．５４と混合し、ゆるい撹拌下約
２０℃で７２時間抽出を行った。ナイロン網布で濾過し
て抽出液からとさかを分離し、抽出液は更に繊維素系濾
材［「ミクロ−メディアθＩｉｃｒｏ−ｍｅｄｉａ’
） Ｍ７０Ｊエルテルエンジニャリング社（Ｅｒｔｅｌ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ、）］で濾過した。こ
の第１抽出液中のＨＡａ度はＱ、９２ＪＩ９／Ｒ（ｌで
あった。２ｇの抽出液をアセトン４Ｑおよび酢酸ナトリ
ウム２０９と混合した。白色ｗ＆維状状沈澱得られ、こ
れを集めアセトンで洗浄し、３５℃の真空乾燥機中で乾
燥し、１．７５９の生成物を得た。
溶液で良く洗い、次いて脱イオン水で洗って最後に冷凍
した。冷凍とさかを約１〜２酎の厚みにスイラサーで薄
切りした。アセトン１０００９．３７％ホルマリン１０
０ｇおよび酢酸ナトウリム５０ｇの混合物を作り、薄切
りとさか１０００９を加えた。とさかと処理液との混合
物（ｐＨ６，７）をゆる（撹拌しつつ約２０℃で２４時
間保持した。ナイロン網で濾過して液をとさかから分離
した。次いでこの処理済とさかをアセトン５００９で洗
浄し、最終５００ｇになるまで空気中で乾燥した。乾燥
とさかを脱イオン水２．５４と混合し、ゆるい撹拌下約
２０℃で７２時間抽出を行った。ナイロン網布で濾過し
て抽出液からとさかを分離し、抽出液は更に繊維素系濾
材［「ミクロ−メディアθＩｉｃｒｏ−ｍｅｄｉａ’
） Ｍ７０Ｊエルテルエンジニャリング社（Ｅｒｔｅｌ
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ、）］で濾過した。こ
の第１抽出液中のＨＡａ度はＱ、９２ＪＩ９／Ｒ（ｌで
あった。２ｇの抽出液をアセトン４Ｑおよび酢酸ナトリ
ウム２０９と混合した。白色ｗ＆維状状沈澱得られ、こ
れを集めアセトンで洗浄し、３５℃の真空乾燥機中で乾
燥し、１．７５９の生成物を得た。
生成物のへキラサミン／ヘキスロン酸比は１±０．０５
であった。生成物中のホルムアルデヒド含量は０．０１
５０％であるとこが判った。生成物はハイランと同定さ
れた。生成物中の蛋白質含量は０．３５％で極限粘度数
は４，３２０ｃｃ／ｇであった。
であった。生成物中のホルムアルデヒド含量は０．０１
５０％であるとこが判った。生成物はハイランと同定さ
れた。生成物中の蛋白質含量は０．３５％で極限粘度数
は４，３２０ｃｃ／ｇであった。
第１抽出後のとさかを脱イオン水２．５（！と混合し常
温で４８時間抽出を行った。上述の如くとさかを抽出液
から分離した。第２抽出液中のＨＡ濃度は０．６５ｇ／
ｘ１２であった。上述の沈澱法で抽出液から回収した生
成物は１．２６９であった。この両分は又ホルムアルデ
ヒド含量０．０１４％の化学的に修飾されたヒアルロン
酸ナトリウムとして特徴づけられるものであった。その
蛋白質含量は０．２７％、極限粘度数は４，７２９ｃｃ
／９であった。σ、１５モル食塩水中の１重量％溶液の
ロオロジー的性質を測定し第【表に示した。
温で４８時間抽出を行った。上述の如くとさかを抽出液
から分離した。第２抽出液中のＨＡ濃度は０．６５ｇ／
ｘ１２であった。上述の沈澱法で抽出液から回収した生
成物は１．２６９であった。この両分は又ホルムアルデ
ヒド含量０．０１４％の化学的に修飾されたヒアルロン
酸ナトリウムとして特徴づけられるものであった。その
蛋白質含量は０．２７％、極限粘度数は４，７２９ｃｃ
／９であった。σ、１５モル食塩水中の１重量％溶液の
ロオロジー的性質を測定し第【表に示した。
このとさかの第３回目の水抽出を上と同様に行った。第
３ 抽出液中〕１（Ａａ度＋１．３３ｉ９／ｘ１２テ、
コノ抽出液から０．６０９のＨＡを回収した。蛋白質含
量は０．２０％、極限粘度数は４，８３０ｃｃ／９、ホ
ルムアルデヒド含量は０．０１１５％であった。
３ 抽出液中〕１（Ａａ度＋１．３３ｉ９／ｘ１２テ、
コノ抽出液から０．６０９のＨＡを回収した。蛋白質含
量は０．２０％、極限粘度数は４，８３０ｃｃ／９、ホ
ルムアルデヒド含量は０．０１１５％であった。
［ｋｌＦの雄鶏のとさかから化学的に修飾したＨＡナト
リウムを合計３．６１９得た。
リウムを合計３．６１９得た。
参考例２
参考例１と同様にして薄切りした雄鶏のとさか１ｋｇを
、アセトン１ｋｇとグルタルアルデヒドの４０％水溶液
１５０９との混合物に混合した。該混合物のｐｔ＋は６
．９であった。該混合物をゆるく撹拌しつつ（約１ ｒ
ｐｍ、）常温（約２０℃）で１６時間保持した。
、アセトン１ｋｇとグルタルアルデヒドの４０％水溶液
１５０９との混合物に混合した。該混合物のｐｔ＋は６
．９であった。該混合物をゆるく撹拌しつつ（約１ ｒ
ｐｍ、）常温（約２０℃）で１６時間保持した。
とさかを液から分離し、アセトンで洗浄し、元の重量の
半分になるまで風乾した。乾燥とさかを脱イオン水３Ｑ
にて約２０℃で９６時間抽出した。抽出液を参考例１と
同様にしてとさかから分離して濾過した。抽出液中のＨ
Ａ含量は１．４ｎｇ／ｙＱであった。
半分になるまで風乾した。乾燥とさかを脱イオン水３Ｑ
にて約２０℃で９６時間抽出した。抽出液を参考例１と
同様にしてとさかから分離して濾過した。抽出液中のＨ
Ａ含量は１．４ｎｇ／ｙＱであった。
実施例１と同様にしてアセトンで沈澱した生成物は蛋白
質含量が０．４２％、極限粘度数が３，７００ｃｃ１９
であった。
質含量が０．４２％、極限粘度数が３，７００ｃｃ１９
であった。
参考例３
グルタルアルデヒド溶液の代わりに同量のグリオキサー
ル４０重量％水溶液を用いた以外は参考例２と同様にし
た。抽出液中のＨＡ含量は０．９２ｍ９／ｘＱであった
。生成物の蛋白質含量は０．５％、極限粘度数は３．９
３０ｃｃ／９であった。
ル４０重量％水溶液を用いた以外は参考例２と同様にし
た。抽出液中のＨＡ含量は０．９２ｍ９／ｘＱであった
。生成物の蛋白質含量は０．５％、極限粘度数は３．９
３０ｃｃ／９であった。
参考例４
参考例１と同様にして雄鶏のとさかを洗浄し、冷凍し、
スライスし、アセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理
した。とさかを元の重量の半分になるまで乾燥した後、
０．０５モル水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨは１１以上
） ２．５Ｑで約２０℃、１２０時間抽出した。抽出液
は参考例１と同様にして分離し、濾液した。抽出液中の
ＨＡａ度は３．６ｙｔｇ／ｘ（ｌであった。アセトンと
酢酸ナトリウムとの混合物で沈澱して白色の生成物を得
、アセトンで洗浄し乾燥した。蛋白質含量０．２％、極
限粘度数１，３１０ｃｃ／９の生成物７．５９を回収し
た。
スライスし、アセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理
した。とさかを元の重量の半分になるまで乾燥した後、
０．０５モル水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨは１１以上
） ２．５Ｑで約２０℃、１２０時間抽出した。抽出液
は参考例１と同様にして分離し、濾液した。抽出液中の
ＨＡａ度は３．６ｙｔｇ／ｘ（ｌであった。アセトンと
酢酸ナトリウムとの混合物で沈澱して白色の生成物を得
、アセトンで洗浄し乾燥した。蛋白質含量０．２％、極
限粘度数１，３１０ｃｃ／９の生成物７．５９を回収し
た。
参考例５
雄鶏のとさかを洗浄、冷凍、スライスし、とさか１ｋｇ
をイソプロパノール１ｋｇ、３７％ホルマリン１００ｇ
、酢酸ナトリウム５０ｇおよびクロロホルム１００９の
混合物と混合した。処理はゆっくり撹拌しつつ約２０℃
で１６時間行った。参考例１と同様に抽出。
をイソプロパノール１ｋｇ、３７％ホルマリン１００ｇ
、酢酸ナトリウム５０ｇおよびクロロホルム１００９の
混合物と混合した。処理はゆっくり撹拌しつつ約２０℃
で１６時間行った。参考例１と同様に抽出。
沈澱を行った。抽出液中のＨＡａ度は０．６８ｕ／ｒａ
Ｑであった。生成物中の蛋白質含量は０．４６％、極限
粘度数は４，９００ｃｃ／９であった。
Ｑであった。生成物中の蛋白質含量は０．４６％、極限
粘度数は４，９００ｃｃ／９であった。
側４入ｌ
雄鶏のとさかを参考例１と同様に洗滌し、冷凍し、スラ
イスし、アセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理し、
アセトンで洗滌し、乾燥し、水で抽出した。抽出液をア
セトン２ＱとクロロホルムＩＱとの混合物と混合した。
イスし、アセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理し、
アセトンで洗滌し、乾燥し、水で抽出した。抽出液をア
セトン２ＱとクロロホルムＩＱとの混合物と混合した。
蛋白質含量００５％、極限粘度数４，４００ｃｃ／９の
白色繊維状生成物１．９ｇを得た。
白色繊維状生成物１．９ｇを得た。
参考例７
参考例１と同様にして作られた薄切りとさか１に９を、
アセトン１ｋｌＦと３７％ホルマリン５０９と酢酸ナト
リウム５０９との混合物でゆるく撹拌しつつ約２０℃で
２４時間処理した。抽出液を参考例１と同様に分離し、
濾過し、生成物を沈澱させた。蛋白質含量０４５％、極
限粘度数５．３００ｃｃ＃、結合ホルムアルデヒド含量
０．００８％の白色生成物１．６９を得た。
アセトン１ｋｌＦと３７％ホルマリン５０９と酢酸ナト
リウム５０９との混合物でゆるく撹拌しつつ約２０℃で
２４時間処理した。抽出液を参考例１と同様に分離し、
濾過し、生成物を沈澱させた。蛋白質含量０４５％、極
限粘度数５．３００ｃｃ＃、結合ホルムアルデヒド含量
０．００８％の白色生成物１．６９を得た。
参考例８
アセトン−ホルムアルデヒド処理後にとさかを元の重量
の１７３まで乾燥し、水による第１回抽出を９６時間行
う以外は参考例１と同様の操作を行った。
の１７３まで乾燥し、水による第１回抽出を９６時間行
う以外は参考例１と同様の操作を行った。
第１回抽出液中のＨＡａ度はり、０５ｍ９／ｘＱであっ
た。この抽出液からの沈澱生成物は蛋白質含量０．２５
％、極限粘度数４，９３０ｃｃ／９であった。この生成
物の０．１５モル食塩水による１重量％溶液の振動試験
では０．０２０のヘルツの周波数の「クロスオーバー点
」を有していた。
た。この抽出液からの沈澱生成物は蛋白質含量０．２５
％、極限粘度数４，９３０ｃｃ／９であった。この生成
物の０．１５モル食塩水による１重量％溶液の振動試験
では０．０２０のヘルツの周波数の「クロスオーバー点
」を有していた。
第２回抽出液中のＨＡ濃度は０．５８ｍ９／ｘＱであっ
た。この抽出液からの両分（フラクシ、ヨン）は蛋白質
台ｍ ０ 、１９ ％、極限粘度数７，３００ｃｃ／９
テアツタ。
た。この抽出液からの両分（フラクシ、ヨン）は蛋白質
台ｍ ０ 、１９ ％、極限粘度数７，３００ｃｃ／９
テアツタ。
結合ホルムアルデヒド含量は０．０１％であった。振動
試験による「クロスオーバー点」の周波数は０．００５
ヘルツであった。
試験による「クロスオーバー点」の周波数は０．００５
ヘルツであった。
一連の３回連続抽出で回収された化学的に修飾されたＨ
Ａの合計は３．５９であった。
Ａの合計は３．５９であった。
参考例９
雄鶏のとさかを洗滌し、冷凍し、スライスし、スライス
したものＩｋｇを、アセトン１ｋｇ、３７％ホルマリン
２００ｇおよびクロロホルム１００９と混合した。
したものＩｋｇを、アセトン１ｋｇ、３７％ホルマリン
２００ｇおよびクロロホルム１００９と混合した。
混合物のｐ）（は塩酸を加えて４．０に調整した。第１
回抽出液のＨＡａ度は０．５８工９／＋Ｑてあった。抽
出液から参考例１と同様にアセトン−酢酸ナトリウムで
沈澱さけて生成物を回収した。生成物の蛋白質含量は０
．１２％で極限粘度数は４．０２５ｃｃ／ｇであった。
回抽出液のＨＡａ度は０．５８工９／＋Ｑてあった。抽
出液から参考例１と同様にアセトン−酢酸ナトリウムで
沈澱さけて生成物を回収した。生成物の蛋白質含量は０
．１２％で極限粘度数は４．０２５ｃｃ／ｇであった。
生成物中の結合ホルムアルデヒド含量は０．０２％であ
った。０．１５モル食塩水による生成物１重塁％溶液の
振動試験に於ける「クロスオーバー点」周波数はｏ、ｏ
ｏａヘルツてあった。
った。０．１５モル食塩水による生成物１重塁％溶液の
振動試験に於ける「クロスオーバー点」周波数はｏ、ｏ
ｏａヘルツてあった。
参考例１０
雄鶏のとさかを洗１條、冷凍、スライスし、スライスし
たもの１ｋｇを、混合物のｐＩ（を水酸化ナトリウムで
１１．０に調整した以外は参考例１と同様にしてアセト
ン−ホルムアルデヒド混合物で処理した。とさかを参考
例１と同様に乾燥し、水で抽出した。抽出液のＨＡａ度
は０．６９３！９／３！１２であった。
たもの１ｋｇを、混合物のｐＩ（を水酸化ナトリウムで
１１．０に調整した以外は参考例１と同様にしてアセト
ン−ホルムアルデヒド混合物で処理した。とさかを参考
例１と同様に乾燥し、水で抽出した。抽出液のＨＡａ度
は０．６９３！９／３！１２であった。
アセトンの代わりにイソプロパノールを使用した以外は
参考例１と同様にして抽出液から生成物を沈澱させた。
参考例１と同様にして抽出液から生成物を沈澱させた。
蛋白質含量０．４５％、極限粘度数５．０５０ｃｃ／９
、ホルムアルデヒド含量０．０１２％の白色繊維状物質
１．３９を得た。この生成物の０．１５モル食塩水中１
重量％溶液の振動試験に於ける「クロスオーバー点」周
波数は０．０１２ヘルツであった。
、ホルムアルデヒド含量０．０１２％の白色繊維状物質
１．３９を得た。この生成物の０．１５モル食塩水中１
重量％溶液の振動試験に於ける「クロスオーバー点」周
波数は０．０１２ヘルツであった。
参考例１１
この参考例は「ハイラン」からのゼリー状物質の製造を
示す。参考例１の第２回抽出液から得た沈澱生成物０．
８８１ｉ１を０．０５規定水酸化ナトリウム水溶液２８
３ｇと混合し、混合物を室温で６０分間撹拌した。得ら
れた粘稠溶液にジビニルスルホン０２６９と０，５規定
水酸化ナトリウム水溶液ｌ、０９とを加えた。得られた
混合物を１０分間撹拌し次いで室温で５０分間放置した
。弾力性のある無色透明のゲルを得た。ゲルをＯ，Ｓｌ
！の０．１５モル食塩水中に入れ一夜放置した。次いで
高度に膨潤したゲルから過剰の液体を除去し、新しい食
塩水０，５Ｑをゲルに加え振盪機上で２４時間放置した
。膨潤した不溶性物質から過剰の液体を傾厚して除いて
ゼリー状の透明物質を得た。この生成物中のＨＡ濃度は
０．２７５重量％と測定された。この物質のしオロジー
的性質は第５．６及び７図に示した。
示す。参考例１の第２回抽出液から得た沈澱生成物０．
８８１ｉ１を０．０５規定水酸化ナトリウム水溶液２８
３ｇと混合し、混合物を室温で６０分間撹拌した。得ら
れた粘稠溶液にジビニルスルホン０２６９と０，５規定
水酸化ナトリウム水溶液ｌ、０９とを加えた。得られた
混合物を１０分間撹拌し次いで室温で５０分間放置した
。弾力性のある無色透明のゲルを得た。ゲルをＯ，Ｓｌ
！の０．１５モル食塩水中に入れ一夜放置した。次いで
高度に膨潤したゲルから過剰の液体を除去し、新しい食
塩水０，５Ｑをゲルに加え振盪機上で２４時間放置した
。膨潤した不溶性物質から過剰の液体を傾厚して除いて
ゼリー状の透明物質を得た。この生成物中のＨＡ濃度は
０．２７５重量％と測定された。この物質のしオロジー
的性質は第５．６及び７図に示した。
参考例１２ （”ＣＨ，Ｏによる雄鶏とさかの処理）放
射性同位元素で標識されたパラホルムアルデヒド（”Ｃ
Ｈ２０） ［比放射能５００ｍＣ１／９（１２ｃＮレイ
ディオケミカルズ、 １２ｃＮ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ） ］を、！規定水酸化ナトリウム水溶液０．
１１ｊ１２を加えた３７重量％ホルムアルデヒド水溶液
ｆｏｘ（ｌに５．０ｍＣ１に相当する量加えた。混合物
をきっちりと栓をした容器に入れ６０℃に加温しパラホ
ルムアルデヒドを溶解した。次いで混合物を０℃に冷却
しｌ規定の酢酸水溶液０．１ｘＱで中和した。得られた
溶液の放射能は、１０ｘ１２の「ハイドロツルア−（■
ｙｄｒｏｆ １ｏｕｒＲ） Ｊ液状シンチレーション計
数媒体（ｌｉｑｕｉｄｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃ
ｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ） （ナショナル・ダイ
アグノスチック） （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃ）中で、外部標準法に基づく効率の補正をコン
ピュータで行うサーレ・アイソキャップ３００液体シン
チレイション・カウンター（Ｓｅａｒｌｅ ｌ５ｏｃａ
ｐ ３００Ｌｉｑｕｉｄ ５ｃｉｎｔｉｌａｔｉｏｎ
Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて測定した。ホルムアルデヒド
濃度はクロモトロープ酸による比色法で測定した。得ら
れた溶液の比放射能（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉ
ｔｙ）は０．５５５ｍＣ１／ミリモルｃｔ−ｔｗｏであ
った。この標識されたホルムアルデヒド溶液をアセトン
７．５ｇ、クロロホルムＩＩ？、酢酸ナトリウム０．５
ｇと混合した。薄切りした雄鶏のとさか７．５９をこの
溶液と混合し約２０℃で１８時間処理した。とさかを液
から分離し、数回アセトンで洗滌し元の重量の１７２に
なるまで風乾した。２回反復して蒸留水１５酎をとさか
に加え約２０℃で９６時間抽出を進めた。抽出液はとさ
かから分離し濾紙［ホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎｌｌ
） Ｎｏ、 １ ］を数枚重ねて濾過した。同じ操作を
繰返してとさかの第２抽出液を得た。ＨＹは抽出液に酢
酸ナトリウムを１重量％溶液になる量と、９５％エタノ
ールを４倍量加えて白色繊維状物として沈澱した。繊維
状物を分離し、アセトンで丁寧に洗い、乾燥し再びＨＹ
ｉ度が約Ｉ Ｍ９／ｘ（ｌになるように水に再溶解した
。ＨＹをその溶液から上記と同様にして再沈澱し、再度
アセトンで徹底的に洗い乾燥した。乾燥物質を今−度蒸
留水に溶解してＨＹを０．８４ｘｇ／１ｘ（ｌ含有する
溶液を得た。この溶液の比放射能を測定した処１９４ｄ
ｐｍ／μｙ ＨＡであった。この溶液の放射能は、０．
１５モルの食塩を含みｐＨ７，５の０．０５モルリン酸
緩衝液への完全透１ｆｌ （ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ ｄ
ｉａｌｙｓｉｓ）によって１１０３ｄｐ／μ９ ＨＹに
減少した。この溶液の放射能は４モル濃度グアニジン塩
酸塩に対する完全透析によって１１０１ｄｐ／μ９ＨＹ
にまで減少した。このことは蛋白質が解離する条件下で
の溶液の処理後でもホルムアルデヒドは生成物中に残留
していることを示している。生成物について測定された
放射能並びに出発物質のホルムアルデヒド溶液の比放射
能に基づき、ＨＹに関するホルムアルデヒド含有量は約
０２重量％と算出された。放射性同位元素で標識されス
トレプトマイセスヒアルロニダーゼによる酵素的分解を
受は易いＨＹと結合したホルムアルデヒドがどれくらい
かを評価するため、ＨＹ Ｏ，８Ｒ９ＩＲＱを含みｌ
、 ２５０ｄｐｍ／ （ｌＱμｅ溶液）の放射能を持つ
別の溶液を作った。この溶’ａ−２ｊ！Ｑにストレプト
マイセス・ヒアルロニダーゼ３３ＴＲｔｌ ［マイルス
ラボラトリ−社（Ｍｉｌｅｓ ＬａｂｏｒａＬｏｒｉ
ｅｓＩｎｃ、） 、比活性度２，０ＯＯＴＲＩＪ／Ｂ
ＨＡ、蛋白質加水分解活性度が５ＸｌＯ”単位／ＴＲＵ
以下］を含んだクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５，６）
ＱＡｘ（ｌを加えた。
射性同位元素で標識されたパラホルムアルデヒド（”Ｃ
Ｈ２０） ［比放射能５００ｍＣ１／９（１２ｃＮレイ
ディオケミカルズ、 １２ｃＮ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ） ］を、！規定水酸化ナトリウム水溶液０．
１１ｊ１２を加えた３７重量％ホルムアルデヒド水溶液
ｆｏｘ（ｌに５．０ｍＣ１に相当する量加えた。混合物
をきっちりと栓をした容器に入れ６０℃に加温しパラホ
ルムアルデヒドを溶解した。次いで混合物を０℃に冷却
しｌ規定の酢酸水溶液０．１ｘＱで中和した。得られた
溶液の放射能は、１０ｘ１２の「ハイドロツルア−（■
ｙｄｒｏｆ １ｏｕｒＲ） Ｊ液状シンチレーション計
数媒体（ｌｉｑｕｉｄｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃ
ｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ） （ナショナル・ダイ
アグノスチック） （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃ）中で、外部標準法に基づく効率の補正をコン
ピュータで行うサーレ・アイソキャップ３００液体シン
チレイション・カウンター（Ｓｅａｒｌｅ ｌ５ｏｃａ
ｐ ３００Ｌｉｑｕｉｄ ５ｃｉｎｔｉｌａｔｉｏｎ
Ｃｏｕｎｔｅｒ）を用いて測定した。ホルムアルデヒド
濃度はクロモトロープ酸による比色法で測定した。得ら
れた溶液の比放射能（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉ
ｔｙ）は０．５５５ｍＣ１／ミリモルｃｔ−ｔｗｏであ
った。この標識されたホルムアルデヒド溶液をアセトン
７．５ｇ、クロロホルムＩＩ？、酢酸ナトリウム０．５
ｇと混合した。薄切りした雄鶏のとさか７．５９をこの
溶液と混合し約２０℃で１８時間処理した。とさかを液
から分離し、数回アセトンで洗滌し元の重量の１７２に
なるまで風乾した。２回反復して蒸留水１５酎をとさか
に加え約２０℃で９６時間抽出を進めた。抽出液はとさ
かから分離し濾紙［ホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎｌｌ
） Ｎｏ、 １ ］を数枚重ねて濾過した。同じ操作を
繰返してとさかの第２抽出液を得た。ＨＹは抽出液に酢
酸ナトリウムを１重量％溶液になる量と、９５％エタノ
ールを４倍量加えて白色繊維状物として沈澱した。繊維
状物を分離し、アセトンで丁寧に洗い、乾燥し再びＨＹ
ｉ度が約Ｉ Ｍ９／ｘ（ｌになるように水に再溶解した
。ＨＹをその溶液から上記と同様にして再沈澱し、再度
アセトンで徹底的に洗い乾燥した。乾燥物質を今−度蒸
留水に溶解してＨＹを０．８４ｘｇ／１ｘ（ｌ含有する
溶液を得た。この溶液の比放射能を測定した処１９４ｄ
ｐｍ／μｙ ＨＡであった。この溶液の放射能は、０．
１５モルの食塩を含みｐＨ７，５の０．０５モルリン酸
緩衝液への完全透１ｆｌ （ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ ｄ
ｉａｌｙｓｉｓ）によって１１０３ｄｐ／μ９ ＨＹに
減少した。この溶液の放射能は４モル濃度グアニジン塩
酸塩に対する完全透析によって１１０１ｄｐ／μ９ＨＹ
にまで減少した。このことは蛋白質が解離する条件下で
の溶液の処理後でもホルムアルデヒドは生成物中に残留
していることを示している。生成物について測定された
放射能並びに出発物質のホルムアルデヒド溶液の比放射
能に基づき、ＨＹに関するホルムアルデヒド含有量は約
０２重量％と算出された。放射性同位元素で標識されス
トレプトマイセスヒアルロニダーゼによる酵素的分解を
受は易いＨＹと結合したホルムアルデヒドがどれくらい
かを評価するため、ＨＹ Ｏ，８Ｒ９ＩＲＱを含みｌ
、 ２５０ｄｐｍ／ （ｌＱμｅ溶液）の放射能を持つ
別の溶液を作った。この溶’ａ−２ｊ！Ｑにストレプト
マイセス・ヒアルロニダーゼ３３ＴＲｔｌ ［マイルス
ラボラトリ−社（Ｍｉｌｅｓ ＬａｂｏｒａＬｏｒｉ
ｅｓＩｎｃ、） 、比活性度２，０ＯＯＴＲＩＪ／Ｂ
ＨＡ、蛋白質加水分解活性度が５ＸｌＯ”単位／ＴＲＵ
以下］を含んだクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５，６）
ＱＡｘ（ｌを加えた。
同じ溶液の別の２肩Ｑに酵素を含まない前記緩衝−液を
０．ｌＲＱ加えた。両方共２０時間かけて１，０００倍
量のクエン酸−りん酸緩衝液へ透析した。透析後の上記
２試料の容積は同じであった。酵素処理しなカー） タ
試１４［ＨＹ ！度カ０．７６ｍｇ＃ｔ（！テ放Ｎ能ハ
５５２ｄｐｍ／１０μＱであった。酵素処理した試料の
ＨＹａ度は検出レベル（１０μ９ｈｔＱ ）以下に減少
し、放射能は４１４ｄｐｍ／１０μＱ溶液であった。ヒ
アルロニダーゼに敏感な放射能は２０ｄｐｍ／ｕ９ Ｈ
Ｙでこれは酵素的に消化し得るＨＹに結合したホルムア
ルデヒド０．０４９重量％に相当する。生成物のそのよ
うに標識された試料をゲル パーミェーション クロマ
トグラフィーで分析した。このクロマトグラフィはグリ
セリール−ＣＰＧ３０００ （孔の大きさ２８６９±８
．３％）（エレクトロヌクレオニックス社 （Ｅｌｅｃｔｒｏｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ、 Ｉｎｃ、
）を充填した１、６Ｘ９０Ｃｍのガラスカラムを使用し
た。０．１５モル食塩を含む脱気した０、０２モルはう
酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）を溶ｍ＆ （ｅｌｕｔｉｏｎ
）に使用した。カラムの排除容積（ｅｘｃｌｕｄｅｄ
ｖｏｌｕｍｅ） （Ｖｏ）を分子ｆｆ１４Ｘｌｏ’の
ＨＹ試料で測定し、カラムの全容積（Ｖｔ）をスクロー
スで測定した。溶離は６°Ｃで１０ｚ（！／待時間流速
で行った。ＳｉＣずつの両分を集めＨＹ濃度と放射能を
分析した。放射能が気孔容積（ｙ□ｉｄ ｖｏｌｕｍｅ
）のＨＹと共に共溶離しく ｃｏｅｌｕｔｅ）及び酵素
的消化が、ＨＹとその放射能との両方を気孔容積の両分
から除去することが明らかになった。計算すると、気孔
容積のＨＹと結合した比放射能は１４．６ｄｐｍ／μ９
Ｉ（Ｙで、これはポリマー中のホルムアルデヒド００３
６重量％に対応することを示した。この数字は透析実験
で得た数値とよく一致する。
０．ｌＲＱ加えた。両方共２０時間かけて１，０００倍
量のクエン酸−りん酸緩衝液へ透析した。透析後の上記
２試料の容積は同じであった。酵素処理しなカー） タ
試１４［ＨＹ ！度カ０．７６ｍｇ＃ｔ（！テ放Ｎ能ハ
５５２ｄｐｍ／１０μＱであった。酵素処理した試料の
ＨＹａ度は検出レベル（１０μ９ｈｔＱ ）以下に減少
し、放射能は４１４ｄｐｍ／１０μＱ溶液であった。ヒ
アルロニダーゼに敏感な放射能は２０ｄｐｍ／ｕ９ Ｈ
Ｙでこれは酵素的に消化し得るＨＹに結合したホルムア
ルデヒド０．０４９重量％に相当する。生成物のそのよ
うに標識された試料をゲル パーミェーション クロマ
トグラフィーで分析した。このクロマトグラフィはグリ
セリール−ＣＰＧ３０００ （孔の大きさ２８６９±８
．３％）（エレクトロヌクレオニックス社 （Ｅｌｅｃｔｒｏｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ、 Ｉｎｃ、
）を充填した１、６Ｘ９０Ｃｍのガラスカラムを使用し
た。０．１５モル食塩を含む脱気した０、０２モルはう
酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）を溶ｍ＆ （ｅｌｕｔｉｏｎ
）に使用した。カラムの排除容積（ｅｘｃｌｕｄｅｄ
ｖｏｌｕｍｅ） （Ｖｏ）を分子ｆｆ１４Ｘｌｏ’の
ＨＹ試料で測定し、カラムの全容積（Ｖｔ）をスクロー
スで測定した。溶離は６°Ｃで１０ｚ（！／待時間流速
で行った。ＳｉＣずつの両分を集めＨＹ濃度と放射能を
分析した。放射能が気孔容積（ｙ□ｉｄ ｖｏｌｕｍｅ
）のＨＹと共に共溶離しく ｃｏｅｌｕｔｅ）及び酵素
的消化が、ＨＹとその放射能との両方を気孔容積の両分
から除去することが明らかになった。計算すると、気孔
容積のＨＹと結合した比放射能は１４．６ｄｐｍ／μ９
Ｉ（Ｙで、これはポリマー中のホルムアルデヒド００３
６重量％に対応することを示した。この数字は透析実験
で得た数値とよく一致する。
実施例１
この実施例は、超高分子量で滅菌された発熱性物質を含
有せず非炎症性ハイランが得られた例である。
有せず非炎症性ハイランが得られた例である。
ひな鶏のとさかを、まず０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶
液による１％セチルピリジニウムクロリド溶液で次に脱
イオン水で充分洗浄し、最後に１％水酸化ナトリウム水
溶液内に室温で１５分間保持した。このとさかを脱イオ
ン水で洗い凍結させた。
液による１％セチルピリジニウムクロリド溶液で次に脱
イオン水で充分洗浄し、最後に１％水酸化ナトリウム水
溶液内に室温で１５分間保持した。このとさかを脱イオ
ン水で洗い凍結させた。
凍結されたとさかをスライサーで約１〜２ス屑厚の切片
に切断した。このようにして作製したとさかＩｋｇと、
２．５Ｑのイソプロパノール、０．ＩＱのクロロホルム
、０．０７（ｌの３０％ホルマリンおよび０．０５（１
の酢酸ナトリウム５０％水溶液を含有する処理溶液とを
、ガラス容器に入れて混合し、オートクレーブで滅菌し
２００℃で４ｈｒ加熱して発熱性物質を除去した。この
実験で用いた器具はすべて、同様に滅菌と発熱性物質の
除去を行った。上記溶液によるとさかの処理は、ゆるや
かに撹拌しながら、約２０°Ｃの温度で２４ｈｒ行った
。次いで、濾過補助具をなにも使わずにブッナー漏斗で
濾過することによって、とさかから液体を分離した。次
に処理されたとさかを２Ｑのイソプロパノールで洗浄し
、前記したのと同様にして溶媒を除去し、底部にステン
レス鋼のスクリーンを取付けたガラスカラム内に入れた
。前記および以下の手順はすべて、細菌による汚染を防
止するため層流フード内で行った。
に切断した。このようにして作製したとさかＩｋｇと、
２．５Ｑのイソプロパノール、０．ＩＱのクロロホルム
、０．０７（ｌの３０％ホルマリンおよび０．０５（１
の酢酸ナトリウム５０％水溶液を含有する処理溶液とを
、ガラス容器に入れて混合し、オートクレーブで滅菌し
２００℃で４ｈｒ加熱して発熱性物質を除去した。この
実験で用いた器具はすべて、同様に滅菌と発熱性物質の
除去を行った。上記溶液によるとさかの処理は、ゆるや
かに撹拌しながら、約２０°Ｃの温度で２４ｈｒ行った
。次いで、濾過補助具をなにも使わずにブッナー漏斗で
濾過することによって、とさかから液体を分離した。次
に処理されたとさかを２Ｑのイソプロパノールで洗浄し
、前記したのと同様にして溶媒を除去し、底部にステン
レス鋼のスクリーンを取付けたガラスカラム内に入れた
。前記および以下の手順はすべて、細菌による汚染を防
止するため層流フード内で行った。
０．２ｘ肩の膜で濾過した低速の窒素流を、カラムを約
４ｈｒ通過させてとさかから、残留溶媒を除いて乾燥し
た。次いで得られたとさかを、ガラスビーカー内で、滅
菌され発熱性物質を含有しない水２．５Ｑと混合し、１
６℃を超えない温度で２４ｈｒ抽出した。
４ｈｒ通過させてとさかから、残留溶媒を除いて乾燥し
た。次いで得られたとさかを、ガラスビーカー内で、滅
菌され発熱性物質を含有しない水２．５Ｑと混合し、１
６℃を超えない温度で２４ｈｒ抽出した。
この抽出工程のｐＨは、必要なときに、水酸化ナトリウ
ム水溶液を添加して１０．５に保持した。ブッレナー漏
斗で濾過することによってとさかを抽出液から分離した
。抽出液をさらに、オートクレーブで滅菌した、セルロ
ースタイプのフィルター材“マイクロメディア” Ｍ２
Ｏ（’Ｍｉｃｒｏ−ｍｅｄｉａ″Ｍ７０）（エルテル・
エンジニアリング・カンパニイ）で濾過した。濾液中の
ハイランの濃度は０．４５ａ９／ｘＱであった。２０９
の酢酸ナトリウムを５０ｘＱの水に溶解し、上記濾液２
Ｑに添加した。ゆるやかに撹拌しながら、この濾液を、
４Ｑのイソプロパノールと混合したところ白色ｍ錐状沈
澱が形成した。上記繊維状沈澱を液体から分離し、ＩＱ
の新しいイソプロパノールで２４ｈｒ洗浄し、次に液体
から分離し、コールドトラップを備えた真空オーブンを
用いて、５０ミリトールを超えない残留圧力下、常温で
７２ｈｒ乾燥した。
ム水溶液を添加して１０．５に保持した。ブッレナー漏
斗で濾過することによってとさかを抽出液から分離した
。抽出液をさらに、オートクレーブで滅菌した、セルロ
ースタイプのフィルター材“マイクロメディア” Ｍ２
Ｏ（’Ｍｉｃｒｏ−ｍｅｄｉａ″Ｍ７０）（エルテル・
エンジニアリング・カンパニイ）で濾過した。濾液中の
ハイランの濃度は０．４５ａ９／ｘＱであった。２０９
の酢酸ナトリウムを５０ｘＱの水に溶解し、上記濾液２
Ｑに添加した。ゆるやかに撹拌しながら、この濾液を、
４Ｑのイソプロパノールと混合したところ白色ｍ錐状沈
澱が形成した。上記繊維状沈澱を液体から分離し、ＩＱ
の新しいイソプロパノールで２４ｈｒ洗浄し、次に液体
から分離し、コールドトラップを備えた真空オーブンを
用いて、５０ミリトールを超えない残留圧力下、常温で
７２ｈｒ乾燥した。
第１回の抽出後のとさかを、抽出時間が９６ｈｒである
以外同様にして第２回の抽出を行った。第２回の抽出を
行った抽出物を前記と同様に濾過した。
以外同様にして第２回の抽出を行った。第２回の抽出を
行った抽出物を前記と同様に濾過した。
得られた濾液のハイランの濃度は０．８３ｎ／ｘＱであ
った。前記したのと同様にして、繊維状生成物を第２濾
液から分離して乾燥した。各抽出操作での生成物の収率
と、下記性質：へキンサミン／ヘキスロン酸比、蛋白質
含量、結合ホルムアルデヒド含量、極限粘度数、無菌性
、発熱性物質性（ｐｙｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）およびレ
オロジー的性質とを評価した。用いた手順は、前記と同
様で、すなわち前記親出噸と同様である。ホルムアルデ
ヒド測定の感度を上げるために、手順を次のように修正
した。すなわち、繊維状生成物を、水に溶解して約１重
量％の濃度とし、凍結乾燥して泡状の軽い物質を形成さ
せ、次にこれを圧縮して非常に緻密な錠剤とした。この
錠剤を、さらに約１００ミリトールの残留圧下、８０℃
で４ｈｒ乾燥して、ホルムアルデヒド測定用の試料とし
て用いた。試料の重量は、約２９であったが、測定法の
感度が、元の方法に比べて約１０倍になった。二つの製
品の性質を第■表に示す。
った。前記したのと同様にして、繊維状生成物を第２濾
液から分離して乾燥した。各抽出操作での生成物の収率
と、下記性質：へキンサミン／ヘキスロン酸比、蛋白質
含量、結合ホルムアルデヒド含量、極限粘度数、無菌性
、発熱性物質性（ｐｙｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）およびレ
オロジー的性質とを評価した。用いた手順は、前記と同
様で、すなわち前記親出噸と同様である。ホルムアルデ
ヒド測定の感度を上げるために、手順を次のように修正
した。すなわち、繊維状生成物を、水に溶解して約１重
量％の濃度とし、凍結乾燥して泡状の軽い物質を形成さ
せ、次にこれを圧縮して非常に緻密な錠剤とした。この
錠剤を、さらに約１００ミリトールの残留圧下、８０℃
で４ｈｒ乾燥して、ホルムアルデヒド測定用の試料とし
て用いた。試料の重量は、約２９であったが、測定法の
感度が、元の方法に比べて約１０倍になった。二つの製
品の性質を第■表に示す。
（以下余白）
第■表
収量（９） ０．８９
１．６０へキソチミン／ヘキスＵンＭ
１．０２
０．９７モル比 へイランポリマーの）Ｉ白質
０．３５
０．２２含１ｉ（重量％） へイランポリ７−の結合本ルム
０．０００６
０．０００２５Ｔルデヒド含量（重量％） 極限粘度数Ｃｃｃ／９． ５，６００
６，７０００．１５Ｍ ＮａＣ（１２５℃
） ０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液 によろ１重量％溶液のレオロジー 特定の剪断速度Ｕ１４ ０．０１ｓ−’ １，３３
０ １．７８０剪断粘度（Ｐａ、ｓ）
１００ ｓ” １．３０ １
．２３剪断速度ゼｄ）る １，８８２
３．１５５剪断速度（Ｐａ、ｓ） 特定振動数Ｗする ０．０５Ｈｚ ７３．１
１００．０動的貯蔵弾性率（Ｐａ）
５．０ Ｈｚ ２Ｑ３ ２４０
．０りａス２−バー点に樹ろ
０．００９５
０．００６３振動数（Ｈｚ） 低剪断速度領域における、粘度の剪断速度に対する依存
性を第１１図に示す。
１．６０へキソチミン／ヘキスＵンＭ
１．０２
０．９７モル比 へイランポリマーの）Ｉ白質
０．３５
０．２２含１ｉ（重量％） へイランポリ７−の結合本ルム
０．０００６
０．０００２５Ｔルデヒド含量（重量％） 極限粘度数Ｃｃｃ／９． ５，６００
６，７０００．１５Ｍ ＮａＣ（１２５℃
） ０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液 によろ１重量％溶液のレオロジー 特定の剪断速度Ｕ１４ ０．０１ｓ−’ １，３３
０ １．７８０剪断粘度（Ｐａ、ｓ）
１００ ｓ” １．３０ １
．２３剪断速度ゼｄ）る １，８８２
３．１５５剪断速度（Ｐａ、ｓ） 特定振動数Ｗする ０．０５Ｈｚ ７３．１
１００．０動的貯蔵弾性率（Ｐａ）
５．０ Ｈｚ ２Ｑ３ ２４０
．０りａス２−バー点に樹ろ
０．００９５
０．００６３振動数（Ｈｚ） 低剪断速度領域における、粘度の剪断速度に対する依存
性を第１１図に示す。
生成物の“生物学的純度”を評価するために、滅菌され
た、発熱性物質を含有しない°０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ム水溶液による１重量％溶液を作製した。
た、発熱性物質を含有しない°０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ム水溶液による１重量％溶液を作製した。
溶液の無菌性をｕｓｐ （米国薬局法’） ＸＸＩ標準
法で測定したが、上記の両溶液とともに無菌であった。
法で測定したが、上記の両溶液とともに無菌であった。
発熱性物質の含量を、Ｌ Ａ Ｌ （ＬｉｍｕｌｕｓＡ
ｍｅｂｏｃｙｔａｅ Ｌｙｓａｔｅ）試験法によりＵ
Ｓ Ｐ ＸＸＩにしたがって測定し、ＥＵ（エンドトキ
シン単位）／ｘＱで示した。両溶液について、測定結果
は６ＥＵ／ＩＩＱより低かった。
ｍｅｂｏｃｙｔａｅ Ｌｙｓａｔｅ）試験法によりＵ
Ｓ Ｐ ＸＸＩにしたがって測定し、ＥＵ（エンドトキ
シン単位）／ｘＱで示した。両溶液について、測定結果
は６ＥＵ／ＩＩＱより低かった。
さらに、得られた溶液の炎症性活性を、米国特許箱４．
１４１，９７３号（１９７９年２月２７日）に記載のオ
ウル・モンキイ・アイ試験法（Ｏｗｌ Ｍｏｎ’ｋｅｙ
ＥｙｅＴｅｓｔ）を用いて試験したが、両溶液ととも
に、本質的に非炎症性であることが分かった。
１４１，９７３号（１９７９年２月２７日）に記載のオ
ウル・モンキイ・アイ試験法（Ｏｗｌ Ｍｏｎ’ｋｅｙ
ＥｙｅＴｅｓｔ）を用いて試験したが、両溶液ととも
に、本質的に非炎症性であることが分かった。
このように、親出願に比べて結合ホルムアルデヒド量が
著しく少ない、超高分子量で、滅菌され、発熱性物質を
含有しない非炎症性ハイランが得られた。
著しく少ない、超高分子量で、滅菌され、発熱性物質を
含有しない非炎症性ハイランが得られた。
Ｋ夜匠ｌ
この実施例は、高分子量のハイランを、高収量で得られ
ることを例示するものである。
ることを例示するものである。
鶏のとさかを、まず１％セチルピリジニウムクロリド水
溶液で洗浄し次に脱イオン水で洗い、最後に凍結させた
。凍結したとさかを１〜２ｕ＋厚の切片にスライスした
。スライスしたとさか５００ｇを、６００ｍ＋２のイソ
プロパノール、５ｈ＋＆の３７重量％ホルマリンおよび
２５ｇの酢酸ナトリウムの混合物中に入れ、この混合物
を２４ｈｒ、 ２５℃を超えない温度に保持した。次い
でとさかを液体から分離し、空気中で約２ｈｒ乾燥させ
た。このように乾燥したとさかを、予め約４℃に冷却し
た１、２Ｑの水酸化ナトリウム０．０４規定水溶液と混
合した。混合物のｐＨは約１２であった。抽出を、５日
間、約４〜６℃で行った。次いでとさかを抽出液から分
離し、抽出液をセルロースフィルターメディアドア０で
濾過した。この濾液のハイランの濃度は３．２ｍ９／！
ｌＱであった。１０９の酢酸アセテートを、前記濾液の
１ｉ２に溶解し、得られた溶液を２Ｑのアセトンにゆっ
くり注ぎ入れた。上記溶液から沈澱した白色の繊維状物
質を集めて新しいアセトンで洗浄し、コールドトラップ
を備えた真空オーブンを用い、常温で？２ｈｒ残留圧力
約５０ミリトール下で乾燥した。乾燥繊維物質３．０５
ｇを得た。この物質は、極限粘度数が６２００ｃｃ／９
、蛋白質含量０．５５重量％、結合ホルムアルデヒド含
１ｉ０．ｏｏ０３５重量％であり、ハイランと同定され
た。
溶液で洗浄し次に脱イオン水で洗い、最後に凍結させた
。凍結したとさかを１〜２ｕ＋厚の切片にスライスした
。スライスしたとさか５００ｇを、６００ｍ＋２のイソ
プロパノール、５ｈ＋＆の３７重量％ホルマリンおよび
２５ｇの酢酸ナトリウムの混合物中に入れ、この混合物
を２４ｈｒ、 ２５℃を超えない温度に保持した。次い
でとさかを液体から分離し、空気中で約２ｈｒ乾燥させ
た。このように乾燥したとさかを、予め約４℃に冷却し
た１、２Ｑの水酸化ナトリウム０．０４規定水溶液と混
合した。混合物のｐＨは約１２であった。抽出を、５日
間、約４〜６℃で行った。次いでとさかを抽出液から分
離し、抽出液をセルロースフィルターメディアドア０で
濾過した。この濾液のハイランの濃度は３．２ｍ９／！
ｌＱであった。１０９の酢酸アセテートを、前記濾液の
１ｉ２に溶解し、得られた溶液を２Ｑのアセトンにゆっ
くり注ぎ入れた。上記溶液から沈澱した白色の繊維状物
質を集めて新しいアセトンで洗浄し、コールドトラップ
を備えた真空オーブンを用い、常温で？２ｈｒ残留圧力
約５０ミリトール下で乾燥した。乾燥繊維物質３．０５
ｇを得た。この物質は、極限粘度数が６２００ｃｃ／９
、蛋白質含量０．５５重量％、結合ホルムアルデヒド含
１ｉ０．ｏｏ０３５重量％であり、ハイランと同定され
た。
実施例３
この実施例は、水酸化ナトリウム溶液の濃度と抽出時間
のハイランの特性に対する影響を例示するものである。
のハイランの特性に対する影響を例示するものである。
とさかの調整、処理および後処理乾燥工程を前記実施例
に記載したのと同様に行った。乾燥されたとさかを、予
め４℃に冷却した０、２規定水酸化ナトリウム水溶液１
．２Ｑに入れた。混合物のｐＨは１４より高かった。４
℃で４２ｈｒ抽出後、抽出液の約１７２を採取した。そ
のハイランの濃度は４．２ｍｇ／ｍＱであった。抽出液
を濾過し、前記実施例に記載したのと同様にしてハイラ
ンを沈澱させた。白色の繊維状物が得られ、０．１５Ｍ
塩化ナトリウム水溶液（２５℃）中での極限粘度数は３
２００ｃｃ／９および蛋白質含量は０．４重量％であっ
た。４℃で合計１４０時間抽出した後、残りの抽出液を
とさかから分離して、前記したのと同様に処理した。２
．２９の白色繊維状物が、この抽出液分から回収され、
極限粘度数が２３００ｃｃ１９で蛋白質含量が０．８５
重量％であった。
に記載したのと同様に行った。乾燥されたとさかを、予
め４℃に冷却した０、２規定水酸化ナトリウム水溶液１
．２Ｑに入れた。混合物のｐＨは１４より高かった。４
℃で４２ｈｒ抽出後、抽出液の約１７２を採取した。そ
のハイランの濃度は４．２ｍｇ／ｍＱであった。抽出液
を濾過し、前記実施例に記載したのと同様にしてハイラ
ンを沈澱させた。白色の繊維状物が得られ、０．１５Ｍ
塩化ナトリウム水溶液（２５℃）中での極限粘度数は３
２００ｃｃ／９および蛋白質含量は０．４重量％であっ
た。４℃で合計１４０時間抽出した後、残りの抽出液を
とさかから分離して、前記したのと同様に処理した。２
．２９の白色繊維状物が、この抽出液分から回収され、
極限粘度数が２３００ｃｃ１９で蛋白質含量が０．８５
重量％であった。
上記の二つの各生成物の結合ホルムアルデヒド含量は約
０００３重量％であった。
０００３重量％であった。
このように、低温での抽出であっても、抽出工程におけ
るアルカリの濃度が比較的高い場合、常温での抽出に比
べてかなり高い極限粘度数をもった生成物が得られる。
るアルカリの濃度が比較的高い場合、常温での抽出に比
べてかなり高い極限粘度数をもった生成物が得られる。
抽出時間が増すと、生成物の極限粘度数が低下する。
Ｘ嵐鯉土
この実施例は、抽出工程で、揮発性塩基を使用する例で
ある。とさかは、上記実施例に記載したのと同様にして
調整し処理した。得られたとさかを０，２５重量％アン
モニヤ水溶液の１２Ｉ２で、２５℃て９６時間抽出した
。前記実施例と同様にして、抽出液をとさかから分離し
、濾過し、沈澱させた。
ある。とさかは、上記実施例に記載したのと同様にして
調整し処理した。得られたとさかを０，２５重量％アン
モニヤ水溶液の１２Ｉ２で、２５℃て９６時間抽出した
。前記実施例と同様にして、抽出液をとさかから分離し
、濾過し、沈澱させた。
得られた繊維状物質のハイランは、極限粘度数が４５０
０ｃｃ／９で蛋白質含量が０．５５重量％であった。
０ｃｃ／９で蛋白質含量が０．５５重量％であった。
実施例５
この実施例は、抽出時の温度の、最終製品の性質に対す
る効果を例示するものである。
る効果を例示するものである。
５００ｇの雄鶏のとさかを洗浄し、前記実施例と同様に
スライスして処理した。次に得られたとさかを１７２づ
つに区分した。片方の部分を、０．２％のアンモニアを
含有する０、２規定水酸化ナトリウム水溶液６００ｚ（
を用い２５℃で９６ｈｒ抽出した。抽出液を濾過しく濾
液中のハイランの濃度はＳ、３ｘｇ／ｘ（ｌであった）
、前記と同様にして沈澱させた。生成物の極限粘度数は
１９００ｃｃ／９で蛋白質含量は１．７重量％であった
。とさかの残りの部分を予め４℃に冷却した同じ溶液６
００ｉ１２と混合し、４°Ｃて９６ｈｒ抽出を行った。
スライスして処理した。次に得られたとさかを１７２づ
つに区分した。片方の部分を、０．２％のアンモニアを
含有する０、２規定水酸化ナトリウム水溶液６００ｚ（
を用い２５℃で９６ｈｒ抽出した。抽出液を濾過しく濾
液中のハイランの濃度はＳ、３ｘｇ／ｘ（ｌであった）
、前記と同様にして沈澱させた。生成物の極限粘度数は
１９００ｃｃ／９で蛋白質含量は１．７重量％であった
。とさかの残りの部分を予め４℃に冷却した同じ溶液６
００ｉ１２と混合し、４°Ｃて９６ｈｒ抽出を行った。
濾液のハイラン濃度は４ 、５ｙｙ／ｍρで、生成物の
極限粘度数は２１００ｃｃ／９であり、蛋白質含量は０
．５２重量％であった。
極限粘度数は２１００ｃｃ／９であり、蛋白質含量は０
．５２重量％であった。
このように、抽出工程の温度が低下すると、高分子量と
低蛋白質含量になることが分かる。
低蛋白質含量になることが分かる。
実施例に
の実施ρｊは、処理済のとさかを、低濃度のアルカリ混
合物で抽出した例である。
合物で抽出した例である。
５００ｇのとさかを予め洗浄し、スライスして、実施例
２に記載したのと同じ混合物を含有するホルムアルデヒ
ドで処理した。得られたとさかを、０．２％のアンモニ
ア含有の０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を予め４℃に冷
却したちの１．２１２中に入れた。
２に記載したのと同じ混合物を含有するホルムアルデヒ
ドで処理した。得られたとさかを、０．２％のアンモニ
ア含有の０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を予め４℃に冷
却したちの１．２１２中に入れた。
抽出を、４℃で９６ｈｒ行った。
得られた抽出物を分離し濾過し、次いで生成物を前記実
施例に記載したのと同様に、沈澱させた。
施例に記載したのと同様に、沈澱させた。
抽出液のハイランの濃度は４．９ｘ９／ｘＱであった。
４．５ｇの繊維状物が得られた。生成物の極限粘度数は
３９００ｃｃ＃で蛋白質含量は０．２５重量％であった
。
３９００ｃｃ＃で蛋白質含量は０．２５重量％であった
。
とさかを上記と同様にして２回目の抽出を行った。抽出
液のハイランの濃度は４．０１９／１１２であった。
液のハイランの濃度は４．０１９／１１２であった。
３．４ｇの繊維状物を得られたが、極限粘度数は４４０
０ｃｃ／９で蛋白質含量は０．６５重量％であった。
０ｃｃ／９で蛋白質含量は０．６５重量％であった。
実施例７
この実施例は濾液からハイランを回収するために第四級
アンモニウム化合物を使った例を示す。
アンモニウム化合物を使った例を示す。
５００ｇのとさかを、前記実施例と同様に洗浄し、凍結
させ、スライスした。得られたとさかを、６００ｘＱの
イソプロパノール、５０ＲＱの３７重量％ホルマリンお
よび２５９の酢酸ナトリウムを含有する混合物で、２４
ｈｒ ４℃で処理した。処理後のとさかを液体から分
離し常温で空気中で乾燥し、次いで２５ａＱの２５％ア
ンモニヤ溶液２５ｘ（ｌを添加した１、２ｉ２の（１，
１規定水酸化ナトリウムで抽出した。抽出は４℃で４８
ｈｒ行った。抽出液をとさかから分離し、濃塩酸で中和
した。抽出液のハイラン濃度は２．８６ｖｇ／ｘＱであ
った。、濾過済の抽出液の５００２！１２を、沈澱剤と
してイソプロパノールを用いる前記実施例に記載したの
と同様にして沈澱させた。１．３５９の生成物を得たが
、極限粘度数は３９００ｃｃ／９で蛋白質含量は、０．
５重量％であった（生成物Ａ）。濾過された抽出液の別
の５００ｉ（！を、セチルビリジウムクロリド（ＣＰＣ
）の１重量％水溶液２７５ｘ１２と混合した。
させ、スライスした。得られたとさかを、６００ｘＱの
イソプロパノール、５０ＲＱの３７重量％ホルマリンお
よび２５９の酢酸ナトリウムを含有する混合物で、２４
ｈｒ ４℃で処理した。処理後のとさかを液体から分
離し常温で空気中で乾燥し、次いで２５ａＱの２５％ア
ンモニヤ溶液２５ｘ（ｌを添加した１、２ｉ２の（１，
１規定水酸化ナトリウムで抽出した。抽出は４℃で４８
ｈｒ行った。抽出液をとさかから分離し、濃塩酸で中和
した。抽出液のハイラン濃度は２．８６ｖｇ／ｘＱであ
った。、濾過済の抽出液の５００２！１２を、沈澱剤と
してイソプロパノールを用いる前記実施例に記載したの
と同様にして沈澱させた。１．３５９の生成物を得たが
、極限粘度数は３９００ｃｃ／９で蛋白質含量は、０．
５重量％であった（生成物Ａ）。濾過された抽出液の別
の５００ｉ（！を、セチルビリジウムクロリド（ＣＰＣ
）の１重量％水溶液２７５ｘ１２と混合した。
樹脂状の沈澱が形成し、上澄液を除き、５０℃の水５０
０１（２で２回洗浄し、次いで２０℃の水５００ｃｃで
１回洗浄し、最後に０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液に溶
解した。０．７ｇの酢酸ナトリウムを上記の溶液に溶解
し、次にその溶液を６０ｘ１２のイソプロパノールに、
徐々に注入した。繊維状白色の沈澱が形成され、５０ｘ
Ｑのｌ＝ｌ水−イツブロバノール混合物で２度洗浄し、
最後に５０ｊ１１２のイソプロパノールで洗い、次いで
減圧乾燥した。１．４！ｌの生成物が得られ、極限粘度
数は４０００ｃｃ／９で蛋白質含量は０．６重量％であ
った（生成物Ｂ）。生成物のＣＰＣ含量は２５ｐｐＩ１
１であった。上記２生成物の、０．１５Ｍ食塩水による
０、５重量％溶液のレオロジー特性は次のとおりであっ
た。
０１（２で２回洗浄し、次いで２０℃の水５００ｃｃで
１回洗浄し、最後に０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液に溶
解した。０．７ｇの酢酸ナトリウムを上記の溶液に溶解
し、次にその溶液を６０ｘ１２のイソプロパノールに、
徐々に注入した。繊維状白色の沈澱が形成され、５０ｘ
Ｑのｌ＝ｌ水−イツブロバノール混合物で２度洗浄し、
最後に５０ｊ１１２のイソプロパノールで洗い、次いで
減圧乾燥した。１．４！ｌの生成物が得られ、極限粘度
数は４０００ｃｃ／９で蛋白質含量は０．６重量％であ
った（生成物Ｂ）。生成物のＣＰＣ含量は２５ｐｐＩ１
１であった。上記２生成物の、０．１５Ｍ食塩水による
０、５重量％溶液のレオロジー特性は次のとおりであっ
た。
（以下余白）
レオロジーデータ 生成物Ａ
生成物Ｂ ・における剪断粘度（Ｐａ、ｓ） ゼロ剪断速度における ３７１
３１５剪断粘度（Ｐａ、ｓ） クロスオーバー点における ０．０４
０．０５振動数（Ｈｚ） このように、濾液からのハイランの回収に対してＣＰＣ
を用いることによって、イソプロパノールで沈澱させて
得た生成物と比べて本質的に同じ性質を有する生成物が
得られた。
生成物Ｂ ・における剪断粘度（Ｐａ、ｓ） ゼロ剪断速度における ３７１
３１５剪断粘度（Ｐａ、ｓ） クロスオーバー点における ０．０４
０．０５振動数（Ｈｚ） このように、濾液からのハイランの回収に対してＣＰＣ
を用いることによって、イソプロパノールで沈澱させて
得た生成物と比べて本質的に同じ性質を有する生成物が
得られた。
Ｋ乳匹影
この実施例では、放射能で標識をしたホルムアルデヒド
を用いた、追加の実験について述べる。
を用いた、追加の実験について述べる。
放射能で標識した” ＣＨ，０の水溶液（比活性５７ｍ
ｃｉ／ｍｍｏｌ） Ｃニュー・イングランド・ヌクレア
ー（！Ｊｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ） ］
を、３７重量％ホルマリン＊、ＯｘＱと、２ｍＣ１（０
，１Ｇ４ａｆ２）に相当する量で混合した。混合物の比
活性は０．１５ｍＣ１／ｍｍｏｌであった。このホルム
アルデヒド溶液を０，５９の酢酸ナトリウムを含有する
１２．５ｘＱのイソプロパノールに添加し、得られた混
合物を栓付フラスコに入れ、これにｌｈのスライスした
雄鶏のとさかを入れた。
ｃｉ／ｍｍｏｌ） Ｃニュー・イングランド・ヌクレア
ー（！Ｊｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ） ］
を、３７重量％ホルマリン＊、ＯｘＱと、２ｍＣ１（０
，１Ｇ４ａｆ２）に相当する量で混合した。混合物の比
活性は０．１５ｍＣ１／ｍｍｏｌであった。このホルム
アルデヒド溶液を０，５９の酢酸ナトリウムを含有する
１２．５ｘＱのイソプロパノールに添加し、得られた混
合物を栓付フラスコに入れ、これにｌｈのスライスした
雄鶏のとさかを入れた。
とさかの処理を常温（約２０℃）で１８時間行った。
とさかを液体から分離し、Ｌｏｐ（ｌのイソプロパノー
ルで２回洗浄し、もとの重量の１／２まで風乾した。
ルで２回洗浄し、もとの重量の１／２まで風乾した。
２５ｍＱの蒸留水をとさかに加えて、抽出を４°Ｃで４
８ｈｒ行った。この第１抽出液（ｐＨ７，０）をとさか
から分離し、ナイロン布地で濾過し、次いで４層のワッ
トマン（Ｔｈａｔｍａｎ） ＃ ｌ濾紙で濾過した。と
さかからの第２の抽出液を作製し、本質的に同じ方法で
処理した。酢酸ナトリウムを、両濾液加えて１重量％溶
液にした。濾液を２倍容量のイソプロパノールに注いで
、両濾液から白色繊維状物を沈澱させた。ハイラン繊維
状物を集め、イソプロパノールで充分洗い（３回）、常
温の真空オーブンで乾燥した。次いで水に再溶解し、ハ
イラン濃度が約ＩＱノｘ（ｌの溶液を得た。ハイラン繊
維状物を上記と同様にして再び沈澱させ、イソプロパノ
ールで洗い、真空オーブンで乾燥した。得られた乾燥繊
維状物を蒸留水に再溶解して、第１抽出液と第２抽出液
それぞれの製品として、ハイランをそれぞれ０．９８幻
／ｊｌｆ２および１，６５１９／次Ｑ含有する溶液を得
た。これらの溶液の蛋白質含量はそれぞれ５．９８μ９
／１Ｑと１２．０μ９７μＱであった。この２溶液を、
まず塩水−リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析し
、次にクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５，６）に対して
透析したが、比活性が、第１抽出液と第２抽出液の製品
としてのハイランについて、それぞれ１３３０ｄｐｍ／
ｕと２５１５ｄｐｍ／ｉｆ？であることか見出された。
８ｈｒ行った。この第１抽出液（ｐＨ７，０）をとさか
から分離し、ナイロン布地で濾過し、次いで４層のワッ
トマン（Ｔｈａｔｍａｎ） ＃ ｌ濾紙で濾過した。と
さかからの第２の抽出液を作製し、本質的に同じ方法で
処理した。酢酸ナトリウムを、両濾液加えて１重量％溶
液にした。濾液を２倍容量のイソプロパノールに注いで
、両濾液から白色繊維状物を沈澱させた。ハイラン繊維
状物を集め、イソプロパノールで充分洗い（３回）、常
温の真空オーブンで乾燥した。次いで水に再溶解し、ハ
イラン濃度が約ＩＱノｘ（ｌの溶液を得た。ハイラン繊
維状物を上記と同様にして再び沈澱させ、イソプロパノ
ールで洗い、真空オーブンで乾燥した。得られた乾燥繊
維状物を蒸留水に再溶解して、第１抽出液と第２抽出液
それぞれの製品として、ハイランをそれぞれ０．９８幻
／ｊｌｆ２および１，６５１９／次Ｑ含有する溶液を得
た。これらの溶液の蛋白質含量はそれぞれ５．９８μ９
／１Ｑと１２．０μ９７μＱであった。この２溶液を、
まず塩水−リン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析し
、次にクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５，６）に対して
透析したが、比活性が、第１抽出液と第２抽出液の製品
としてのハイランについて、それぞれ１３３０ｄｐｍ／
ｕと２５１５ｄｐｍ／ｉｆ？であることか見出された。
これは、ハイラン中の結合した透析できないホルムアル
デヒドの含量、すなわち上記２製品についてそれぞれ０
．０１２８重量％と０．０２２７重量％に相当する。蛋
白質含量に関する比活性は、それぞれ２２２ｄｐｍ／μ
９蛋白質および２１０ｄｐｍ／μ９蛋白質であった。
デヒドの含量、すなわち上記２製品についてそれぞれ０
．０１２８重量％と０．０２２７重量％に相当する。蛋
白質含量に関する比活性は、それぞれ２２２ｄｐｍ／μ
９蛋白質および２１０ｄｐｍ／μ９蛋白質であった。
この二つの溶液を、ヒアルロナンと硫酸コンドロイチン
を消化する事丸性ヒアルロニダーゼを２μ９／ＩＩ（ｌ
の酵素濃度で用い、３７°Ｃで４８ｈｒ酵素消化反４
応に付した。透析された溶液のいくつかのアリコー
トを採取して、ゲル電気泳動法とオートラジオグラフ法
で分析した。残りの試料を、酢酸−ＥＤＴ＾緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）に対して徹底的に透析した。透析された酵素
消化物のハイラン濃度は、検出可能なレベル（１０μ９
／ｘＱ ）より低く、放射能のレベルは、第１製品と第
２製品に対してそれぞれ２６０ｄｐｍ／ｒｌ（ｌと３３
０ｄｐｍ／ｌｌＩ２でありまたは元の蛋白質含量につい
て計算すると、４３ｄｐｍ／μ９蛋白質と２８ｄｐｍ／
μ９蛋白質であった。このように、この実験においては
、放射能のかなりな部分が、ハイラン高分子のヒアルロ
ナン部分を酵素分解した時、透析可能になった。
を消化する事丸性ヒアルロニダーゼを２μ９／ＩＩ（ｌ
の酵素濃度で用い、３７°Ｃで４８ｈｒ酵素消化反４
応に付した。透析された溶液のいくつかのアリコー
トを採取して、ゲル電気泳動法とオートラジオグラフ法
で分析した。残りの試料を、酢酸−ＥＤＴ＾緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）に対して徹底的に透析した。透析された酵素
消化物のハイラン濃度は、検出可能なレベル（１０μ９
／ｘＱ ）より低く、放射能のレベルは、第１製品と第
２製品に対してそれぞれ２６０ｄｐｍ／ｒｌ（ｌと３３
０ｄｐｍ／ｌｌＩ２でありまたは元の蛋白質含量につい
て計算すると、４３ｄｐｍ／μ９蛋白質と２８ｄｐｍ／
μ９蛋白質であった。このように、この実験においては
、放射能のかなりな部分が、ハイラン高分子のヒアルロ
ナン部分を酵素分解した時、透析可能になった。
透析可能な放射能量を測定するために、第１抽出液製品
によるこの実験で得られた透析可能なグリコサミノグリ
カンの一部を凍結乾燥した。放射能の約８０％（１０１
０７０ｄｐが、その物質を乾燥後除去されたことが見出
された。
によるこの実験で得られた透析可能なグリコサミノグリ
カンの一部を凍結乾燥した。放射能の約８０％（１０１
０７０ｄｐが、その物質を乾燥後除去されたことが見出
された。
ヒアルロニダーゼで消化されたハイラン試料のオートラ
ジオグラフ（第９図）が、分子量が１４．０００．２１
．０ＱＯ１２２，０００，２４，ＯＱＯおよび６６、Ｏ
ＱＱの蛋白質ゲルの放射能で標識されたバンドを示して
いる。特に分子ｆｉ６６．０００のバンドに最大の取込
みがみとめられる（バンドの強度からみて）。
ジオグラフ（第９図）が、分子量が１４．０００．２１
．０ＱＯ１２２，０００，２４，ＯＱＯおよび６６、Ｏ
ＱＱの蛋白質ゲルの放射能で標識されたバンドを示して
いる。特に分子ｆｉ６６．０００のバンドに最大の取込
みがみとめられる（バンドの強度からみて）。
６６．０００のバンドが、ハイランに見出された蛋白質
の電気泳動パターン中の主要なバンドの−っであること
か分かる（第１０図）。
の電気泳動パターン中の主要なバンドの−っであること
か分かる（第１０図）。
及４鯉り
この実施例は、ハイランのＩａ帷状状物質沈澱させるこ
となく溶液を化粧用製剤に用いた例である。
となく溶液を化粧用製剤に用いた例である。
とさかの処理、抽出および濾過を、実施例２に記載した
のと同様にして行った。濾液のハイラン濃度は、３ 、
０５ｍ？／ ｘＱであり、ハイラン濃度で計算した蛋白
質含量は０．８重量％、極限粘度数は５７００ｃｃ／ｇ
であった＠ ０．２８９の乾燥ずリアクリル酸［カーボボール９４０
（Ｃａｒｂｏｐｏｌ） 、 ビー・エフ・グツドリッ
チ社］を、ＳＯｍＱの蒸留水に撹拌しながら添加して分
散させた。
のと同様にして行った。濾液のハイラン濃度は、３ 、
０５ｍ？／ ｘＱであり、ハイラン濃度で計算した蛋白
質含量は０．８重量％、極限粘度数は５７００ｃｃ／ｇ
であった＠ ０．２８９の乾燥ずリアクリル酸［カーボボール９４０
（Ｃａｒｂｏｐｏｌ） 、 ビー・エフ・グツドリッ
チ社］を、ＳＯｍＱの蒸留水に撹拌しながら添加して分
散させた。
次いで、４ｇのグリセロール、４ｒｔｒＱの５ｆｆｉｆ
ｆｉ％のポリビニルピロリドン水溶液（分子量的３６０
．ＯＯＯ１アルドリッヒ ケミカル カンパニイ社）、
およびＬＯｘＱのポリエチレンオキシド［ボリオクス（
Ｐｏ１ｙｏｘ）、凝固剤、ユニオン カーバイド社］の
１重量％水溶液を上記の分散液に添加した。上記のハイ
ラン濾液１００ｘ１７を、上記の混合物に撹拌しながら
徐々に加え、次に混合物の全容積を、蒸留水によって２
００１１２にした。湿潤用ノλンドゲルとして利用でき
る透明なソフトゲルを得た。このゲルの最終組成は次の
とおりであった。
ｆｉ％のポリビニルピロリドン水溶液（分子量的３６０
．ＯＯＯ１アルドリッヒ ケミカル カンパニイ社）、
およびＬＯｘＱのポリエチレンオキシド［ボリオクス（
Ｐｏ１ｙｏｘ）、凝固剤、ユニオン カーバイド社］の
１重量％水溶液を上記の分散液に添加した。上記のハイ
ラン濾液１００ｘ１７を、上記の混合物に撹拌しながら
徐々に加え、次に混合物の全容積を、蒸留水によって２
００１１２にした。湿潤用ノλンドゲルとして利用でき
る透明なソフトゲルを得た。このゲルの最終組成は次の
とおりであった。
カーボボール ９４０ ０．１４重量％ポリビニ
ルピロリドン ｏ、ｔｏ 〃ポリオクス凝固剤
０．０２５ ”ハイラン ０．
１６ ”グリセロール ２．００ 〃防
腐剤 ０．３０ ”水
９７．２７５ ｙＫ敷鯉り東 この実施例は、ハイラン濾液を化粧用製剤に直接用いた
別の例である。
ルピロリドン ｏ、ｔｏ 〃ポリオクス凝固剤
０．０２５ ”ハイラン ０．
１６ ”グリセロール ２．００ 〃防
腐剤 ０．３０ ”水
９７．２７５ ｙＫ敷鯉り東 この実施例は、ハイラン濾液を化粧用製剤に直接用いた
別の例である。
１０９のステアリン酸［グー・ケム１４（Ｄａｒ−Ｃｈ
ｅｍ１４）、グーリング アンド カンパニイＣＤａｒ
ｌｉｎｇ ＆ Ｃｏ、）］を、前記実施例に記載したの
と同様にして作製したハイラン濾液５０ｘＱと混合し、
この混合物に、ランキシド５２（Ｌａｎｏｘｉｄｅ ５
２）［ＰＥＧ−４０ステアレート、ラネテックス プロ
ダクツ インコーホレーテッド（Ｌａｎａｅｔｅｘ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ、）コの０．８９を混合し、次
いで撹拌しながら約８０℃まで加温し、直ちに室温まで
冷却した。得られた混合物を、最終製剤のＡ部分を構成
する。
ｅｍ１４）、グーリング アンド カンパニイＣＤａｒ
ｌｉｎｇ ＆ Ｃｏ、）］を、前記実施例に記載したの
と同様にして作製したハイラン濾液５０ｘＱと混合し、
この混合物に、ランキシド５２（Ｌａｎｏｘｉｄｅ ５
２）［ＰＥＧ−４０ステアレート、ラネテックス プロ
ダクツ インコーホレーテッド（Ｌａｎａｅｔｅｘ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ、）コの０．８９を混合し、次
いで撹拌しながら約８０℃まで加温し、直ちに室温まで
冷却した。得られた混合物を、最終製剤のＡ部分を構成
する。
カーボボール９４０の１重量％水分散液１（１！。
ポリビニルピロリドンの５重量％水溶液２．５酎および
水酸化ナトリウム４％水溶液１４＊Ｑを混合して８部分
を作製した。
水酸化ナトリウム４％水溶液１４＊Ｑを混合して８部分
を作製した。
Ｃ部分を、下記成分を混合して作製した。
ペトロラタム ［ケセ稙−・インズ インコーホレーテ
ッド １，０９（Ｃｈｅｓｅｂｏ
ｒｏｕｇｈ−Ｐｏｎｄｓ、Ｉｎｃ）コセチルアルコール
（アルＦ ’Ｊ ？ ｋ ケミカル カンパニイ）
１．０９クロダモルＰＮＰ（Ｃｒ
ｏｄａｍｏｌ ＰＭＰ） 。 ０．５９
［クロダ インコイレーデ１ド（Ｃｒｏｄａ、Ｉｎｃ、
）コボルボ３ ［Ｖｏｌｐｏ ３Ｘクロダ インコー
ホレーテッド） 、 ０．２
５９やし油 ［アクメーへ−デステＩ カンパニー イ
ンコーｆレーテフＦ １．０９（
Ａｃｍｅ−Ｈａｒｄｅｓｔｙ Ｃｏ、、Ｉｎｃ、）］
Ｐ Ｅ Ｇ −３５０（フルドリブＥ ケミカル カン
パニイ） ＯＪ９プロピ
レングリコール （フルトリ１ヒ ケミカル カンバニ
イ） １．０９シリ コーンＦ −７５４（
ＳＷＳ シリコーンズ カンパニイ）
１．５ｙ香 料
０．２５ｆフエノニツプ（’Ｐｈｅ
ｎｏｎｉｐ） ［ニバ（Ｎｉｐａ）コ
０．３９上記３部分全体をはげしく撹拌しながら混合し
、全容量を水によって１００９にした。皮膚に塗布した
場合真珠状の外観と柔らかな感触の柔らかなりリームが
得られた。
ッド １，０９（Ｃｈｅｓｅｂｏ
ｒｏｕｇｈ−Ｐｏｎｄｓ、Ｉｎｃ）コセチルアルコール
（アルＦ ’Ｊ ？ ｋ ケミカル カンパニイ）
１．０９クロダモルＰＮＰ（Ｃｒ
ｏｄａｍｏｌ ＰＭＰ） 。 ０．５９
［クロダ インコイレーデ１ド（Ｃｒｏｄａ、Ｉｎｃ、
）コボルボ３ ［Ｖｏｌｐｏ ３Ｘクロダ インコー
ホレーテッド） 、 ０．２
５９やし油 ［アクメーへ−デステＩ カンパニー イ
ンコーｆレーテフＦ １．０９（
Ａｃｍｅ−Ｈａｒｄｅｓｔｙ Ｃｏ、、Ｉｎｃ、）］
Ｐ Ｅ Ｇ −３５０（フルドリブＥ ケミカル カン
パニイ） ＯＪ９プロピ
レングリコール （フルトリ１ヒ ケミカル カンバニ
イ） １．０９シリ コーンＦ −７５４（
ＳＷＳ シリコーンズ カンパニイ）
１．５ｙ香 料
０．２５ｆフエノニツプ（’Ｐｈｅ
ｎｏｎｉｐ） ［ニバ（Ｎｉｐａ）コ
０．３９上記３部分全体をはげしく撹拌しながら混合し
、全容量を水によって１００９にした。皮膚に塗布した
場合真珠状の外観と柔らかな感触の柔らかなりリームが
得られた。
この発明は、勿論、この発明の思想と範囲から逸膜せず
変形と改善ができる。
変形と改善ができる。
第１図はハイラン（ＨＹ）の０．１５モル濃度食塩水溶
液（１重量％）の粘度の剪断速度依存性を示すグラフ（
Ｖは粘度、Ｓは剪断応力）、第２図はＨＹの０．１５モ
ル濃度食塩水溶液（１重量％）の振動試験の結果を示す
グラフ（Ｖは粘度、Ｆは位相角（ｐｈａｓｅ ａｎｇｌ
ｅ）、Ｇ′は動的貯蔵弾性率（ｄｙｎａｍｉｃ ｓｔｏ
ｒａｇｅ ｍｏｄｕｌｉ−）、Ｇ′は損失弾性率（１ｏ
ｓｓ ｍｏｄｕｌｉ））、第３図はＨＹの０．１５モル
温度食塩水溶液（１重量％）の緩和曲線を示すグラフ、
第４図はＨＹ（極限粘度数４，３００ｃｃ／９）の０．
１５モル濃度食塩水溶液（１重量％）の相当球直径の分
布を示すグラフ、第５図はＨＡ（極ｒ＠粘度数３．５６
２ｃ’ｃ＃）の０．１５モル濃度食塩水溶液（１重量％
）の相当球直径の分布を示すグラフ、第６図は本発明に
よるゼリー状生成物の粘度対剪断速度依存性を示すグラ
フ、第７図は本発明によるゼリー状生成物の振動試験の
結果を示すグラフ（Ｖは粘度、Ｆは位相角、Ｇ′は動的
貯蔵弾性率、Ｇ′は損失弾性率）、第８図は本発明によ
るゼリー状生成物の緩和曲線を示すグラフ、第９図は、
ヒアルロニダーゼで消化されたハイランのオートラジオ
グラフを示す図、第１０図はハイラン中に見出された蛋
白質の電気泳動を示す図、第１１図はＨＹの低剪断速度
領域における粘度の剪断速度依存性を示す〆 〇− へメ哀ｇＧ Ｏ ζ； （） ’Ｑ ’
旬 唱 ５Ｎ ＼
ゝ （史 ） ℃ 寸 ０〜
ζ 当僅社乎直径バＮＭ） ＦＩＧ、４
液（１重量％）の粘度の剪断速度依存性を示すグラフ（
Ｖは粘度、Ｓは剪断応力）、第２図はＨＹの０．１５モ
ル濃度食塩水溶液（１重量％）の振動試験の結果を示す
グラフ（Ｖは粘度、Ｆは位相角（ｐｈａｓｅ ａｎｇｌ
ｅ）、Ｇ′は動的貯蔵弾性率（ｄｙｎａｍｉｃ ｓｔｏ
ｒａｇｅ ｍｏｄｕｌｉ−）、Ｇ′は損失弾性率（１ｏ
ｓｓ ｍｏｄｕｌｉ））、第３図はＨＹの０．１５モル
温度食塩水溶液（１重量％）の緩和曲線を示すグラフ、
第４図はＨＹ（極限粘度数４，３００ｃｃ／９）の０．
１５モル濃度食塩水溶液（１重量％）の相当球直径の分
布を示すグラフ、第５図はＨＡ（極ｒ＠粘度数３．５６
２ｃ’ｃ＃）の０．１５モル濃度食塩水溶液（１重量％
）の相当球直径の分布を示すグラフ、第６図は本発明に
よるゼリー状生成物の粘度対剪断速度依存性を示すグラ
フ、第７図は本発明によるゼリー状生成物の振動試験の
結果を示すグラフ（Ｖは粘度、Ｆは位相角、Ｇ′は動的
貯蔵弾性率、Ｇ′は損失弾性率）、第８図は本発明によ
るゼリー状生成物の緩和曲線を示すグラフ、第９図は、
ヒアルロニダーゼで消化されたハイランのオートラジオ
グラフを示す図、第１０図はハイラン中に見出された蛋
白質の電気泳動を示す図、第１１図はＨＹの低剪断速度
領域における粘度の剪断速度依存性を示す〆 〇− へメ哀ｇＧ Ｏ ζ； （） ’Ｑ ’
旬 唱 ５Ｎ ＼
ゝ （史 ） ℃ 寸 ０〜
ζ 当僅社乎直径バＮＭ） ＦＩＧ、４
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ヒアルロン酸を含有したままの動物組織を、
アルデヒドを含有する水性処理混合物で処理して、組織
に含有されているヒアルロン酸の化学的修飾を行い、 （ｂ）過剰の処理混合物を反応混合物から除去し、（ｃ
）前記の化学的に修飾されたヒアルロン酸の、処理され
た動物組織からの抽出を、約１６℃より低い温度で８〜
１４のアルカリ性ｐＨの水を用いて、約６時間〜数日間
にわたって、上記水と処理された組織との比率を処理さ
れる組織の重量基準で約２〜５：１で行い、 （ｄ）化学的に修飾されたヒアルロン酸を含有する抽出
液を処理された動物組織から分離し、および （ｅ）化学的に修飾されたヒアルロン酸を抽出液から回
収する ことからなる化学的に修飾されたヒアルロン酸製剤を得
る方法。 ２、温度が約５℃より低い請求項１記載の方法。 ３、アルカリ性ｐＨが、無機塩基、有機塩基またはその
混合物を用いて達成される請求項１記載の方法。 ４、塩基が無機塩基である請求項３記載の方法。 ５、無機塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウ
ムである請求項４記載の方法。 ６、塩基が有機塩基である請求項３記載の方法。 ７、有機塩基が、トリエチルアミンまたはトリエタノー
ルアミンである請求項６記載の方法。 ８、アルデヒドがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒ
ドまたはグリオキサールである請求項１記載の方法。 ９、水性処理混合物が、アルデヒドと反応しない水混和
性溶媒を含有する請求項１記載の方法。 １０、溶媒が、低級ケトン、低級アルコールまたは非プ
ロトン性溶媒である請求項９記載の方法。 １１、溶媒が、アセトン、メチルエチルケトン、エタノ
ール、イソプロパノール、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルアセトアミドまたはジメチルスルホキシドである請
求項１０記載の方法。 １２、水性処理混合物が、任意に、電解質と水不溶性有
機溶媒を含有する請求項９記載の方法。 １３、電解質が酢酸ナトリウムで、水不溶性有機溶媒が
クロロホルムである請求項１２記載の方法。 １４、処理混合物中の、水と水混和性溶媒との重量比率
が１−５：４−８．５で、水とアルデヒドとの重量比率
が１−５：０．０２−１である請求項９記載の方法。 １５、処理混合物が、水１０〜５０重量部、水混和性溶
媒４０−８５重量部、アルデヒド０．２−１０重量部、
水不溶性溶媒０．５−１０重量部、および電解質０〜２
０重量部からなる請求項１２記載の方法。 １６、処理混合物と処理すべき組織との重量比が少なく
とも１０：１であり、処理が約４〜２４時間行われる請
求項１記載の方法。 １７、動物の組織が、雄鶏、ひな鶏または雌鶏のとさか
であり、とさかは約１〜３ｍｍ厚のスライスに切断され
る請求項１記載の方法。 １８、過剰の処理混合物が、処理された組織を溶媒もし
くは溶媒と水の混合物で洗浄することによって、反応混
合物から除去される請求項１記載の方法。 １９、処理された組織を洗浄するのに用いる溶媒が、処
理混合物に使用されているのと同じ溶媒である請求項１
８記載の方法。 ２０、処理された組織が、抽出工程の前に、処理された
際の重量の約２５〜５０％まで乾燥される請求項１記載
の方法。 ２１、乾燥が、空気中または窒素中で行われる請求項２
０記載の方法。 ２２、回収を、第四アンモニウム化合物で沈澱させるこ
とによって行う請求項１記載の方法。 ２３、第四アンモニウム化合物が、セチルピリジニウム
クロリドである請求項２２記載の方法。 ２４、抽出液が、濾過、遠心分離またはデカンテーショ
ンによって、動物組織から分離される請求項１記載の方
法。 ２５、分離が濾過で行われる請求項２４記載の方法。 ２６、濾過が２工程であり、第一工程は動物組織の断片
を除くための目の広いメッシュによる大まかな濾過であ
り、第二工程はセルロース材による精密濾過である請求
項２５記載の方法。 ２７、化学的に修飾されたヒアルロン酸を、抽出液から
、溶媒で沈澱させ、次に、得られた、沈澱した化学的に
修飾されたヒアルロン酸を洗浄し乾燥することによって
回収する請求項１記載の方法。 ２８、沈澱させるために使う溶媒が、アセトン、エタノ
ールまたはイソプロパノールである請求項２７記載の方
法。 ２９、沈澱工程で、鉱酸もしくは電解質が添加される請
求項２８記載の方法。 ３０、鉱酸が塩酸、硫酸またはリン酸であり、電解質が
酢酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムである請求項２９
記載の方法。 ３１、化学的に修飾されたヒアルロン酸が抽出液から、
凍結乾燥によって取出される請求項１記載の方法。 ３２、前記の化学的に修飾されたヒアルロン酸を、アル
カリ性条件下、室温で約１時間、ジビニルスルホンで架
橋反応に付すことからなる、請求項１で得た化学的に修
飾されたヒアルロン酸を架橋する方法。 ３３、さらに、未切断状態の前記動物組織を、水性処理
混合物で処理する前に、ｐＨを１２以上にするのに充分
な量と濃度の無機のアルカリで、約５分間〜数時間洗浄
することからなる請求項１記載の方法。 ３４、無機のアルカリが、０．０５Ｍ〜４Ｍの濃度の水
酸化ナトリウムである請求項３３記載の方法。 ３５、さらに、抽出工程で用いた過剰のアルカリを酸を
添加して中和して、実質的に中性のｐＨを要する、製品
の用途に適切な製剤とすることからなる請求項１記載の
方法。 ３６、酸が無機、有機または高分子の酸である請求項３
５記載の方法。 ３７、酸が無機酸で、塩酸、硫酸またはリン酸である請
求項３６記載の方法。 ３８、酸が有機酸で、酢酸、クエン酸、ステアリン酸、
パルミチン酸、ラウリン酸またはｐ−アミノ安息香酸で
ある請求項３６記載の方法。 ３９、酸が高分子酸で、ポリアクリル酸、ポリメタクリ
ル酸、ポリビニルスルホン酸またはポリスチレンスルホ
ン酸である請求項３６記載の方法。 ４０、請求項３５の方法で得られた製剤を含有する化粧
用製剤。 ４１、請求項１の方法で製造した製品。 ４２、請求項３３の方法で製造した製品。 ４３、請求項３２の方法で製造した架橋された製品。 ４４、ヒアルロン酸ポリマーチェーンに共有結合したア
ルデヒドの架橋基が約０．０００２〜０．０５重量％存
在することを特徴とする化学的に修飾されたヒアルロン
酸製剤。 ４５、殺菌され、非炎症性で、発熱性物質が存在しない
請求項４４記載の製剤。
Applications Claiming Priority (3)
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