JPH01197502A - ハイラン製剤および動物組織からの回収方法 - Google Patents

ハイラン製剤および動物組織からの回収方法

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JPH01197502A
JPH01197502A JP63312775A JP31277588A JPH01197502A JP H01197502 A JPH01197502 A JP H01197502A JP 63312775 A JP63312775 A JP 63312775A JP 31277588 A JP31277588 A JP 31277588A JP H01197502 A JPH01197502 A JP H01197502A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (イ)産業上の利用分野 この発明は、新規な化学的、物理化学的およびレオロジ
ー的性質を特徴とする化学的に修飾して改良したヒアル
ロナン製剤[ハイラン(HyIan) コならびにその
製剤を得る新規な方法に関する。
(ロ)従来の技術と課題 以下に時にはヒアルロン酸(HA)と呼称されるヒアル
ロナン(Hyaluronan)は、β−3グルコシド
結合で連結された、D−グルクロン酸とドアセチルゲル
コサミノ−2−アセトアミド−2−デスオキシ−D−グ
ルコースとの二部類の繰り返し単位を有する天然の高分
子量のグリコサミノグリカンである。
この二部類は連結して、βl→4グリコシド結合によっ
て、分岐がなく架橋していない多糖類の連鎖を形成して
いる。
HAは、謄帯、ガラス体、滑液、雄鶏およびひな鶏のと
さが、皮膚などのような動物の組織に見出される。精製
■Aの分子量は、その起源、単離法および分子量測定法
に左右されるが50,000〜8.000.Gooの範
囲であると文献には報告されている[バラジ、イー、エ
イ(Balazs E、 A、 ) 、 Fed。
Proceed、、 17巻、 1086−1093頁
(1958年)コ。
動物組織および細菌培養物からHAを回収し精製−する
方法が、いくつも示唆されている。これらの方法のなか
に、次のようなものがある。
蛋白質類の酸素による消化法: イー、デイ−、ティ、アドキンス(E、 D、 T。
Atkins) 、シイ、エフ、フェルプス(C,F。
Phelps)およびジエイ、ケイ、シーハン(J、 
K。
5heehan) 、 Biochem、 J、、 1
28巻、 1255〜1263頁(1972年);アー
ル、バルマ(R,Varo+a) 、アール、ニス、パ
ルv (R,S、 Varia) 、グブリュ。
ニス、アルテン(1’、 S、 Alten)およびエ
イ、エイチ、ワーディ(A、 H,貰ardi) 、 
Carbohydr。
Res、、 32巻、 386〜395頁(1974年
);イオン交換樹脂によって処理する方法:テイ、シイ
、ローレノト(T、 C,Laurent) 、 J。
Biol、 Chew、、 216巻、 253−27
1頁(1955年);イー・アール、バーマン(E、 
R,Berman) 。
Biocht+m、 Biophys、 Acta、 
58巻、 120〜122頁(1962年): カチオン界面活性剤による沈澱法: テイ、シイ、ローレント、エム、ライアン(M、 Ry
an)およびエイ、ビニトルスキピッチ(A。
Pietruszkiewicz) 、 Bioche
m、 Biophys、 AcLa。
42巻、 476−485頁、  (1960年)三塩
化酢酸によって処理する方法: エイチ、ホフマンズ(H,Hormins) 、オー、
シュマット(0,Schmut) 、エイチ、スターク
(H。
5Lerk)およびエイチ、クープ(H,Koop) 
Naturrorsch、 34c巻、508〜511
頁(1979年);デイ、シュマット(D、 Schm
ut)およびエイチ。
ホフマンズ、 Biochim Biophys、 A
cta、 873巻。
192〜196頁(1981年): 分離用密度勾配沈降法: ビイ、ンルパナータ(P、 5ilpanata) 、
ジェイ。
アール、ダンストン(J、 R,Dunstone)お
よびエイ、シイ、オグストン(八 〇、 0g5ton
) 。
Biochem、 J、、 109巻、43−50頁(
1968頁);および 電着法: エス、ローズマン(S、 Roseman) 、デイ、
アール、ワトランCD、 R,Watson) 、ノエ
イ、エフ。
ダフ(J、 F、 Du[’[’)およびグブリュ、デ
イ、ロビンラン(W、 D、 Robinson) 、
Annals RheumaticDiseases、
 ts@、 67−68頁(1955年)。
またいくつかの異なる処理法を含む方法を利用すること
ができ、例えば酵素による消化法と塩化セチルピリジニ
ウムによる沈澱法とによる方法[ジェイ、イー スコツ
ト(J、 E、 5cott) 、 Biochem。
J、、 62巻、31頁(1956年)]がある。
生物学上のソースからHAを回収する際に遭遇する主な
開運は、HAととらに組織から抽出される蛋白質などの
生物学的ポリマーからポリマー(HA)を分離すること
である。原料に左右されるが、好ましくないポリマーの
量は、非常に多量で、HAの量の何倍らのときがある。
上記のl(Aの回収法は、すべて実験室でのHAの製造
に使われるが、各方法に固有の種々の欠点があるため、
)IAの大規[莫生産に利用することはほとんどできな
い。
工業規模のHAの回収・精製の最新の方法は、米国特許
第4.141,973号[イー、エイ、バラズ(E。
A、 Ba1azs) ]に記載されている。この方法
によれば、蛋白質含量が0.5重量%より少なく、1.
200,000以上の分子量を宵する超純粋のH,Aが
、雄鶏のとさかまたはヒトの鼾帯から水抽出法によって
得られる。蛋白質などの物質は、pH値を変えながら何
度もクロロホルムで抽出して除去される。
水抽出物をクロロホルム抽出すると、界面層が形成され
、これには変性蛋白質などの物質が集められる。いくつ
かの物質、例えば脂肪類は、おそらくクロロホルム層に
可溶化される。またこの方法には、蛋白質分解酵素、例
えばプロナーゼによる処理が含まれる。いくつもの全く
手のこんだ処理法を組合わせることによって発熱性物質
を含有せずかつ非炎症性のHA画分が得られる方法が開
発されている。この製品は、現在、登録商標ヒアロン(
Healon)で、1%溶液として市販されており、こ
れが、機賊的損傷に対して組織を保護し、スペースを与
え、手術中の組織の手による処理を可能にするヒスコサ
−シェリー(Viscosurgery)に用いられて
いる[イー、エイ、バラズ、ヒアロン(Healon)
 、 J、 Wiley and Son、ニューヨー
ク。
1983年5〜28頁]。
(ハ)課厘を解決するための手段 この発明は、一つのplとして、親出願(米国特許願第
710929号の優先権を主張する特願昭61−451
34号)に記載の発明に加えて、HAを組織から抽出す
る前に、動物組織内のHAをそのままその場で化学的に
修飾する新規な方法を提供するものである。
別の態様として、この発明は、親出願に記載の発明に加
えて化学的に修飾されたl(Aを動物組織から回収およ
び精製する新規な方法を提供するものである。
さらに別の態様として、この発明は、新規な超純粋の、
発熱性物質を含有しない、非炎症性の化学的に修飾され
たl+A、すなわち、ヒアルロナンポリマー鎖に共存結
合したアルデヒドの架橋基を約0.0002〜0.05
重量%含有するハイラン(Hylan)を提供するもの
である。
この発明は、HAを、水性媒体中で蛋白質やHAと反応
する物質で動物組織を処理することにより組織から抽出
する前に、その場で化学的に修飾できるという発見に基
づくものである。これらの物質にはホルムアルデヒド、
グルタルアルデヒド、グリオキサール等が含まれる。こ
のその場での化学的修飾はHA高分子の最初の構造、分
子の大きさ、分子間及び分子内相互作用を、ひいては修
飾された生成物から作られた溶液のレオロジー的性質を
実質的に変えてします事が判った。それ故にこの化学的
修飾されたHAは新しい名称で呼ばれるのが相当である
。この発明の発明者らはこの物質を「ハイラン(Hyl
an) Jと呼ぶことにした(以下)IYと呼称する)
。HAが動物組織から抽出される際、通常は)IAと一
緒に大量の蛋白質が溶出して来る。この蛋白質の量は動
物組織の性質や抽出法のパラメータに実質上依存して変
り得る。雄鶏のとさかから)IAを抽出する場合、HA
対蛋白質の重量比はl:0.5から1:4まで変り得る
(イー・エイ・バラスの米国特許第4,303,676
号)。結局動物組織からの純■Aの回収における第一の
問題は蛋白質の除去である。この発明の発明者らは動物
組織の前記予備処理によって、その処理を行わない場合
よりも実質的に低い蛋白質含有のHAの水抽出物が得ら
れることを見出したのである。
この組織の処理の間に起こる化学的な現象の正確な処は
充分に判らないので、この発明は特定の化学反応によっ
て限定されてはならない。組織中の蛋白質と処理混合物
中の試薬との間に化学反応の結果として、蛋白質は変性
され、組織中に固定され、それ故次の水抽出操作に於い
て不溶性になるものと考えられる。
この発明の目的のためには含水媒体中で蛋白質と反応す
るいずれの物質も用いることができる。
その最も有利な物質は中ルムアルデヒドであることが判
った。その他のアルデヒド例えばグルタルアルデヒド又
はグリオキサールもこの発明の方法に使用できる。
組織の処理は試薬の水溶液中で行うことができる。しか
しこれを行った場合は「ハイラン」が水に良く溶けるた
めに実質的にロスが起こる。そのため組織の処理は水と
水混和性有機溶媒との混合物中で行うのが良い。その溶
媒は蛋白質固定化に用いる試薬と反応するものであって
はならない。
これらの溶媒の例としてはアセトン或いはメチルエチル
ケトンの如き低級ケトン、エタノール或いはイソプロパ
ノールの如きアルコール、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルアセトアミド、或いはジメチルスルホキシドの如き
非プロトン性溶媒などがある。このような溶媒は通常8
0〜90重指%以上の大量の水を含んでいる組織と混合
すると水−溶媒混合物が形成される。その混合物中の水
〜溶媒の比は溶媒/組織の比を変え或いはその混合物に
水を加えることによって所望のレベルに調節できる。好
ましい水/溶媒比はHYが組織の処理に用いる該混合物
に溶解してはならないという意味に於いてHYの溶解性
によって決められる。BYの溶解性は用いる溶媒の種類
、水/溶媒比、混合物中の電解質の存在及び濃度、及び
混合物のp旧こ依存する。
HYの溶解性は混合物中に電解質を加えると実質的に減
少することがある。水−溶媒混合物に可溶で、混合物に
所望のpHを与えるいずれの電解質も使用できる。例え
ばアセトンを溶媒に使用した際には酢酸ナトリウムを可
溶性電解質として好都合に使うことができる。
組織処理用混合物の組成は組織の性状、使用する溶媒の
種類、電解質の種類などによって広範囲に変えることが
できる。上述の如く、組織からのFIYは処理用混合物
に溶解してはならないが、処理混合物は試薬と組織高分
子物との反応を容易ならしめろため組織を膨潤させるこ
のに充分な水を含有していなければならない。この発明
の発明者らはHYの原料とし、て雄鶏のとさかを用いた
場合、処理混合物の組成は鶏冠からの水を考慮に入れて
下記の範囲の重量%でよいことを見出した。すなわち水
:10〜5G、溶媒40〜85、電解質0〜2o、試薬
0.2〜lOである。所望によりいくつかの異なる溶剤
を同じ処理混合物に使用できる。この発明の発明者らは
処理混合物中にクロロホルムの如き水と不混和性の溶媒
の少量を使用するのが有利であることを見出した。前記
混合物のこのような溶媒の含有量は0.5〜10重量%
であってもよい。
処理混合物のpHは試薬の性状、該混合物の組成、処理
温度及び時間によって変えろことができる。
この発明による動物組織からBYを回収する際、次の事
を考慮することか非常に重要である。いくつかの試薬、
例えばホルムアルデヒドはHA高分子物のヒドロキシル
基と低いpHで反応して水不溶性の架橋したポリマーを
生成することができる。比較的高いp[(の媒体中で長
時間処理するとHYの分解を沼き、低分子量のポリマー
しか回収できないことがある。この発明にしたがってア
ルデヒド型の試薬を使う際、PRは中性附近例えば4〜
10の範囲で行うのが最も良い結果が得られることが見
出され処理混合物の組織に対する比は広い範囲内で変え
ることができる。通常下限は、組織が(雄鶏のとさかの
場合著しくかさだかであるカリ、処理混合物で少なくと
も充分に覆われねばならないということを条件にして決
められる。上限は経済的観点から選ばれる。この発明に
よる雄鶏のとさかの処理に於いては処理混合物と組織の
比は組織の乾燥重量基準で通常10:1以上である。
温度はこの発明による処理の効率に影響する。
しかし、l(Yは高温で加水分解しやすいため、高分子
量の生成物を得るためには室温又はそれ以下で処理する
のが好ましい。
処理を完了するために必要な時間は処理混合物の組成、
組織の性状、温度など多くの因子に依存する。処理の制
限要因は組織の薄片中への試薬の拡散であろうと思われ
る。その故に組織薄片の大きさは一つの重要なパラメー
タである。この発明の発明者らは1−′3RR厚の小片
にスライスされた雄鶏のとさかの処理に於いて、処理時
間4〜24時間の範囲にできることを見出した。
以上の処理を経た組織は次いで溶媒又は溶媒/水混和物
で洗浄し、組織から過剰の処理混合物を除去する。組織
処理用の混合物中で使われたのと同じ溶媒を使用するの
が便利である。洗浄回数は任意であるが、1回の洗浄で
満足な結果が得られた。
次いで洗浄した組織は直接水で抽出して)IYを回収す
る。抽出の効率は水/組織の比率、抽出媒体のpH,温
度及び時間に依存することを見出した。
又処理済組織の抽出効率は、処理済組織を最初に乾燥さ
せて処理及び洗浄工睨で使われた溶媒を除去することに
よって実質的に増加させることができることも見出され
た。組織を元の重量の1/4から1/2まで乾燥させる
と最高の結果が得られる。
抽出工程での水/組織の比率はいくつかの考慮を行って
選択される。先ず第一に、抽出中組織を覆うに充分な、
液相が存在すべきである。−力水の量は、次の工程での
沈澱剤の量を減らせるよう抽出液中のHYの濃度を出来
るだけ高く維持するために、あまり多くてはならない。
雄鶏のとさかの場合について、水の組織に対する比率は
未処理とさかの重量基準で2〜5であるのが好ましい事
を見出した。
抽出媒体のpHは最終生成物の希望品質によって中性、
酸性、アルカリ性のいずれかに保つことができる。超高
分子量の生成物を得るためには抽出媒体のpHは6〜8
.5の範囲にすべきであることが見出された。高いpH
にすれば抽出液中のIIY濃度は増大するが同時に生成
物の分子量を低下させ、かつ後に詳述する如くポリマー
の池の性質を変化させることになる。いずれにしても、
抽出工程中でpHを調節することによって最終生成物の
性質を希望する方向へ都合よく規制することができる。
11Yの高温での分解がポリマーの分子量を実質的に低
下させるので、25℃以下の温度で処理済組織の抽出を
行うのが好ましい。
処理済組織からHYを最大限に抽出するのに必要な時間
は、pH,液/組織比、撹拌強度の如き他の抽出パラメ
ータによって実質的に変化する。雄鶏のとさかからの水
による抽出に於いて処理済とさかを6時間から数日間ま
での間で抽出する時に良い結果が得られることを見出し
た。
処理済組織と抽出媒体との混合物は抽出の間撹拌するこ
とが出来るし或いは何らの撹拌ちせずに放置することも
できる。明らかに撹拌はHY分子が組織から抽出液への
拡散速度を増大させる。一方激しい撹拌はHYの分解と
それによる分子量の低下を招来する。加うるに激しい撹
拌は組織の崩壊を招き抽出液から組織を分離するのを困
難ならしめることが明らかになった。従って抽出工程は
撹拌しないが、極めて遅いゆるやかな撹拌の下で行うの
が好ましい。
抽出後組織は濾過、遠心分離、傾瀉等を含む各種の通常
の方法によって抽出液から分離される。
最も簡単で経済的な方法は濾過であることが分かった。
出発物質として用いた組織の種類によっては二段濾過を
用いるのが好ましい場合がある。従って雄鶏のとさかの
場合、組織の大きな切片はナイロンメツシュで容易に濾
過分離でき、例えばセルロース質の緻密な濾過材で濾過
すれば抽出液の良好な精製ができる。
抽出液中のFIY濃度は抽出中のpH,時間、液/組織
比、撹拌の強さといった多くの因子に依存している。こ
のBY濃度は通常0.3〜3.Oxv/xQの範囲であ
るが時にはこれより高くなる。ある場合には、抽出液中
のHY濃度が低いときに、第二回目の組織の抽出を行う
のが望ましいことが分かった。又第二回目の抽出液から
沈澱した生成物は通常第一回目の抽出液からのHYに比
して高分子量であることも判明した。これは、HYの低
分子量画分は組織から抽出液に拡散し易く、第一回目の
抽出液から沈澱さ仕た生成物には、これらの低分子量画
分を多く含んでいるという事実で説明できる。
出来る限り高い収率を得るために二回以上の抽出を行う
ことができるが、抽出を繰返す毎に抽出液中のHY濃度
は低下する。
HYは前記濾液から公知の方法で回収できる。最も都合
の良い方法は水混和性溶媒例えばアセトン。
エタノール、イソプロパノール等を加えて沈澱さす方法
である。この沈澱法は酸例えば塩酸、硫酸。
リン酸などの存在下か或いは中性電解質例えば酢酸ナト
リウム、塩酸ナトリウム及びそれらの塩類の存在下で行
うことができる。HY及びその塩類は通常白色のml状
又は粉状の物質として沈澱する。
この沈澱物は沈澱させるのに使用したのと同じ溶媒又は
生成物を溶解しない他の溶媒混合物、例えばエーテルで
洗浄できる。洗浄済生成物は通常の手段で乾燥でき、或
いは溶媒例えばアセトン、エタノールなどの層中で貯蔵
することができる。又濾液を凍結乾燥することもできる
従来技術として知られHA精製に用いられている工程が
本発明の方法にその範囲を限定することなく附加されて
もよいことは明らかである。例えば発熱性物質、炎症性
物質を除去するために、HYは溶解せず脂肪蛋白質、糖
脂質もしくは糖脂肪蛋白質(glycolipopro
tein)が可溶か或いは分離出来る良く知られた溶媒
例えばクロロホルムによる抽出法を用いることができる
この発明による方法jこよれば広範囲に変化した性質を
もったHY生成物か得られる。後述の性質が測定された
。引用した方法は本発明によって得られた生成物を特徴
づけるのに使用された。
溶液中のHY濃度は自動化されたカルバゾール法を用い
たヘキスロン酸検定法[イー・エイ・バラズ、ケイ・オ
ー・ベルンツエン、ジエイ、カロツサおよびデイ−エイ
・スワン(E、 A、 Bs1azs、 K。
0、 Berntsen、 J、 I(arossa 
and D、 A、 Swann)、AnalyL、 
Biochem、、 12巻、 547−5511頁(
1965年)]で測定した。ヘキソサミン含量は自動化
比色定蛍法[デイ・エイ・スワンおよびイー・エイーバ
ラズ(D、 A、 Swan and E、 A、 B
a1aze) 、 Biochem。
Biophys、、Acta、 130巻、 112−
129頁(1966年)]で測定した。HY溶液の蛋白
質含量はフェノール試薬法[ロウリーら(Lovry 
et al) 、 J、 Biol。
Chem、、 193巻、 265−275頁、(19
51年)]で測定した。 生成物中のホルムアルデヒド
含量は約0.19の試料を10%硫酸水溶液1OxQ中
で2時間煮沸し、次いで得られた溶液を水蒸気蒸留して
al雁のホルムアルデヒドを除去し、届出物中のホルム
アルデヒドをクロモトロブ酸を用いた比色定量法で測定
した[エム・ジエイ・ボイドおよびエム・エイ・ローガ
ン(M、 J、 Boyd and M、 A、 Lo
gan) 、 J。
Biol、 Chem、、 146巻、279頁(19
42年)]。
極限粘度数(極限粘度)は1 im(n/ no−1)
/ Cで定義される。但しn及びnoは夫々溶液及び溶
媒の粘度であり、Cはg/ccで表したHYの濃度であ
る。
測定は0.20モル濃度食塩水溶液中でウベロード毛管
型稀薄溶液粘度計で行った。粘度平均分子量は式[ηコ
ニ0.0228M” ”で計算する[アール・シイ、ク
リ−ランド、ジエイ・エル・ワンプ(R,C。
C1eland and T、 L、 llang) 
、 Biopolymers、 9@。
799頁(1970年)コ。
重量平均分子量は632.8rv+にセットされたヘリ
ウム−ネオンレーザ−を備えた[クロマティックス(C
hromaLix) KMX−6j装置を用い℃小角レ
ーザー光散乱法(low angle 1aser l
ight scatteringmethod)により
測定される。重量平均分子量はその外?こも分升的超遠
心法によって測定される沈降常数及び拡散常数からら計
算される。
動的光散乱法は比較的高濃度のHY溶液中での分子の凝
集度を測定するのに使われる。この方法によって、溶液
中の相当球皿径(ESD)の分布が判る。
レオロジー的性質はボーリン レオメータ−システム(
Bohlin Rheometer System)で
測定される。同システムはコンピューター化されたレオ
メータ−であって粘度、振動、緩和の3つのモードで動
作できる。HY溶液について次のパラメータ、すなわち
広範囲の剪断速度下の粘度、並びに種々の振動周波数及
び緩和時間に於ける動的粘度、動的貯蔵弾性率及び動的
損失弾性率が測定される。
上述の如くこの発明の生成物(HY)はHAとホルムア
ルデヒドの如き架橋剤とその場での化学反応の結果得ら
れた新規な高分子物である。IIYの化学分析の結果、
ホルムアルデヒド含有混合物で処理した雄鶏のとさかか
ら得られる生成物中の結合ホルムアルデヒドの含有量は
処理の各種のパラメータに依存するがHYポリマーの重
量基準で0.005〜0.02重量%の範囲内であるこ
とが明らかになった。
生成物中の結合ホルムアルデヒドの存在は放射性同位元
素でラベルされたホルムアルデヒド(” CH,O)を
使用した処理の実験によって乙証明された(後記参考例
12を参照)。実験の結果は本発明によって得られた生
成物が繰返し沈澱をしても、もしくはポリマー溶液の徹
底的透析(exhaustive dialysis)
によっても除去し得ない結合ホルムアルデヒドを含んで
いることを示している。これは生成物のポリマー分子に
ホルムアルデヒドが、共有結合で結合していることを証
明する育力な証拠である。ホルムアルデヒドが明確にH
Aと結合している否かを知るために、HAを、細菌らし
くはリーチ(1eech)のヒアルロニダーゼ、特にl
(Aを分解する酵素類で処理した。この処理の結果はホ
ルムアルデヒドの顕著な量がHY高分子物に直接共有結
合で結合していることを示した。
この発明によって得られる生成物中の蛋白質含量は乾燥
ポリマーの重量基準で通常0.5%を越えることなく、
0.1%程度に少なくしたりさらに少なくすることかで
きる。
HA高分子に架橋剤を共有結合的に結合させることによ
るHAの化学的修飾、換言すれば該ポリマーの元々の構
造の変化は、分子量や分子の大きさのごとき物理化学的
パラメータ、さらに分子間相互作用およびポリマー溶液
のレオロジー的性質に実質的に影響を与える。
この発明により得られたI(Yは極めて高い分子量を有
する。従って極限粘度数は7,0OOcc/g以上すな
わち粘度平均分子量にして約6XIO″に達する。
光散乱法による重量平均分子量は13X 10’にも達
する。この重量平均分子量と粘度平均分子量との不一致
は後述する如く極めて大きな意味をもっていることが明
らかになった。例えばlXl0’或いはそれ以下の如き
実質的に低い分子量のポリマーも所望によりこの発明の
方法によって容易に作ることができると理解されるべき
である。同様に)IYを、回収および精製の任意の工程
でそのポリサッカライド鎖のグルコシド結合を切断する
ことが知られている試薬に曝露させれば、いずれの所望
の分子量のポリマーも得ることができる。上記公知の切
断剤とはヒアルロニダーゼの如き特定の酵素、フリーラ
ジカル発生系、剪断力、熱1強アルカリ。
強酸などである。
HYの溶液中での部分比容積(psv) (parti
alspecific voluIIle)は溶液のイ
オン強度に依存する。それは0.15モル食塩含有の水
によるHY溶液(a度ゼロからo 、 5Mg/ xQ
 )のデンシトメトリイ(densitometry)
で測定され、0.627cc/gであることが判った。
0.15モル食塩水に溶解したHYの1%溶液の試料に
ついての相当球皿径(ESD)の分布を第4図に示した
。そのデータによると、HYは極めて高度に凝集した形
態で存在し、しかもその凝集体は安定で沈降することは
ないことは明らかである。
この発明により作られた典型的な超高分子量生成物のレ
オロジー的性質は第1〜3図に示しである。この生成物
は顕著な粘弾性的性質を有する溶液(0,5重量%及び
それ以上)を作ることが分かった。
下記のパラメータが該ポリマー溶液の弾性的性質を最も
良く表す。すなわち動的貯蔵弾性率(G′)、クロスオ
ーバー点(cross−over point) (動
的貯蔵弾性率G°が動的損失弾性率G”より大きくなる
点)の周波数、位相角、緩和時間である。
HYは、水もしくは電解質水溶液による極めて粘稠な溶
液を作る。溶液の粘度はポリマーの濃度、電解質含量、
温度に依存し、剪断速度によって減少する、すなわちH
Y溶液はかなりの擬似可塑性(pseudoplast
icity)をらっている。
HY溶液のレオロジー的性質を考える場合、これらの性
質が他のポリマーの場合と同様に生成物の分子量に大き
く依存することを理解しておくべきである。上述の如<
HYは広範囲の分子量のらのが得られ、レオロジー的性
質もそれに従って変わる。
かくして超高分子量生成物(極限粘度数4500cc/
g以上)については0,15モル食塩水による!重量%
溶液の粘度は剪断速度0.055s−’で1000Pa
、s以上に達するが、一方極限粘度数が約1000cc
/gのポリマーの1重a=溶液は約2Pa、s、にすぎ
ないことが分かった。I(A溶液の弾性的性質らポリマ
ーの分子量に依存することが分かった。その故に超高分
子量BYの0.15モル食塩水の1重量%溶液の動的貯
蔵弾性率G′は周波数0.01ヘルツで約4QPaであ
るが、一方極限粘度数が約1000cc/gのICY溶
液では約0.2Paにすぎない。ポリマー溶液の弾性的
性質と粘性的性質との比を極めてうまく特徴づける“ク
ロスオーバー点”の周波数は、ポリマーの分子量がほぼ
1.5x 1.Ogから8X 10”の範囲及びそれ以
上の場合、HAの0.15モル食塩水による1重量%溶
液について25℃で通常0.025ヘルツ以下である。
HY試料及び溶液の物理化学的及び粘弾性的性質を公知
の方法で得られたHA生成物の同じ性質と比較して第1
表及び第4図と5図に示した。比較に用いた生成物は雄
鶏のとさかから水抽出し、次いで数回のクロロホルム抽
出を行う所謂セバク(Sevag )法[シイ・ブリッ
クス、オオ・シェルマン、  (G、 B11x、 O
,Shellman)、^rkiv forKemi、
 Mineral Geol、) 、 19A@、 1
頁(1945年)コで脱蛋白質して回収したHAである
第1表 HYとHA試料の物理化学的及びレオロジー的
データの比較 パラメータ             HY     
 HA極限粘度数(cc/g)          4
,729   3.562粘度法分子量データ(X t
o’)        3.28   2.30光散乱
法分子量データ(XIOつ     13.30   
2.86沈降、拡散法分子量データXIO’(PSU)
   13.60   2.14部分比容積 (partial 5pecific volumeX
cc/g)    0.627   0.570レオロ
ージー的性質 (0,15モル食塩水中1重量%溶液)剪断粘度(剪断
速度0.055 s”XPa、s)   969   
 305動的貯蔵弾性率(G′) (周波数0.01ヘルツ) (Pa)        
39.8   10.1クロスオ一バー点周波数(ヘル
ツ)     0.0056  0.035緩和時間(
弾性率半減)         58    19位相
角 (度) 周波数0.002ヘルツ         58.7 
  76〃10ヘルツ           8.5 
  12第1表及び第4図のデータはHYとl(Aとの
明瞭な差異を示している。先ず第一に公知の生成物では
粘度平均分子量と重量平均分子量とは殆ど同じ値である
が(重量平均分子量の方がわずかに低い)、この発明の
生成物は重量平均分子量か粘度平均分子量の約4倍と大
きい。第二に、HY溶液の部分比容積(PSV)の値が
HAと比べて大きいということは、HYポリマーの方が
より大きな大きさを有することを証明している。第三に
HYポリマーは溶液中で凝集してHA溶液と比較して実
質的により大きい凝集体を与え、このことはHY高分子
がより大きな大きさを有するだけでなく、より強い分子
間相互作用を有することを示している。最後にI(Y溶
液は実質的に、HAの同濃度溶液上り粘稠で弾力性であ
る。その大きな粘度は高い粘度平均分子量によるとして
も、測定された劇的ともいえる弾力性の増加は同じ理由
で説明するのは困難である。
これらの観察の結果、組織からの抽出に先立つ  ゛て
その場でのヒアルロン酸の化学的修飾はポリマ−の化学
的組成をほんの僅かに変えるだけであるが、同時に物理
化学的パラメータ及びレオロジー的性質にいくつかの劇
的変化を与えるという結論が得られた。この変化は化学
的組成の変化が高分子構造の何らかの重要な変化に相当
する際に起こるだけである。
溶液中のHA高分子の形態は種々の方法で研究されてお
り、この問題についての文献ら多数にのぼる。これらの
研究は溶液中のポリマーa度が比較的低い(例えば0.
1%)場合ポリマー分子は伸びたランダムコイル形態で
相互に絡み合っていることを示している。高濃度では溶
液は高分子鎖の三次元連続網状構造を含んでいると信じ
られる。HA高分子中のグルコシド結合は相当のスティ
フネスをもっていることが見出された。溶媒と溶質との
相互作用、多くのIIA製剤中に存在する少量の蛋白質
との相互作用及び連鎖内相互作用の如き各種の機構がこ
れらの現象を説明するのに提案されている[例えばエイ
・エイ・バラズ、ヒアルロン酸の物理化学、 Fed、
 Proceed、、17巻、 1086〜1093頁
(1958年)参照コ。幾人かの著者は)IA高分子1
こ二重らせん構造を提唱し、二重らせんセグメントが1
(A溶液の異常なレオロジー的性質を与える架橋結合の
役割を演することかできると示唆した[シイ・エム・デ
ィア、アール・ムアーハウス、デイ・デイ、リース、ニ
ス、アルノット、ジエイ・エム・ガスおよびエイ・エイ
、バラズ、 C,M、 Dea、 R。
Moorhous、 D、 D、 Rees、S、 A
rnott、 JlM、 Gussand E、 A、
 Ba1azs) 、 5cience、 179Jc
 560−562頁(1972年);ニス・アルノット
、エイ・アール・ミトラおよびニス・ラグナタン(S、
 ArnotL、^。
R,Mitra and S、 Raghunatan
) 、 J、 Mo1. Biol、。
169巻、861〜872頁、  (1983年)]こ
れらの研究及び考察について考えてみて、この発明の発
明者らはこの発明による生成物(HY)は、蛋白質架橋
固定剤で組織を処理する間に導入された追加の架橋結合
を含有できるという仮説に到達した。この発明で使用す
る反応剤例えばホルムアルデヒドは種々の化学基に対し
て著しく反応性であり、その反応性はpH,温度、a変
などの反応条件に実質的に依存する。ヒアルロン酸のヒ
ドロキシル基は前記処理条件下ではこれらの試薬と明ら
かに反応しない。何故ならば処理して得られた生成物は
常に水溶性であり、それ故かなりの架橋度のポリマーを
含んでいないからである。処理中に、ポリマーに導入さ
れる追加の架橋結合の量は多分、ポリマーを不溶化する
のには不充分な少ない量であるが、高分子間の相互作用
とそれによって起こるポリマー溶液の弾性を顕著に増加
さ仕るに充分なものである。処理剤とのかかる反応のい
くつかの候補はヒアルロン酸のアセタミド基、HA中に
少量存在し得るアセチル化されていないアミノ基、並び
に処理中に組織の細胞間マトリックス中に存在する蛋白
質のアミド基、アミノ基などの活性基である。HAのア
セタミド基自身が分子間架橋を形成するということはほ
とんど考えられない。
蛋白質とホルムアルデヒドとの反応の研究に於いて[例
えばジエイ・エフ・ウォーカー(J、 F。
Walker) 、ホルムアルデヒド、ラインホルト出
版社、ニューヨーク、 1953年、 312−317
頁を参照]、蛋白質のアミノ基自身は架橋を形成できず
、架橋形成の可能性の最も高い反応の−っはホルムアル
デヒドとアミノ基とが反応してN−メチロールアミノ基
を与え、これが次いでアミド基と反応する反応であるこ
とが見出された。
したがってHA高分子中に限定された敢の架橋を導入で
きる機構として2つ考えられる。第一の機構にはホルム
アルデヒドの如き架橋剤とHA中に存在する可能性の高
いアセトアミド基や遊離のアミノ基との反応が含まれる
[エイ・エイ・バラズ。
Fed、 Proceed、、 25頁1817−18
22頁(1966年)]。
第二の可能がある機構は、架橋反応への蛋白質又はポリ
ペプチドの関与を示唆している。文献には、蛋白質又は
ポリペプチドはl(A分子に共有結合で結合している[
ユーコ、ミクムータカガキおよびビイ・ビイ・ツール(
Yuko Mikum−Takagakiand B、
 P、 Toole) 、 J、 Biol、 Che
m、、 256巻。
(16) 、 8463−8469頁(1981年)]
とが、或いは別のしかたでHA分子と会合することがで
きるという報告が続いている。この場合、架橋結合は、
−つのHA高分子と、ひとつの蛋白質成分および別のH
A高分子との間に形成されるが、或いは2つのHA高分
子に共有結合で結合した蛋白質問に形成することができ
る。
これらの機構のいずれもこの発明を限定するとみなされ
へきてはない。この発明の生成物中に共有結合による架
橋結合を少量導入する他の機構があり得ることは理解さ
れるべきである。
いずれに仕上、この発明の本質的な特徴は、おそらく、
HA高分子中に少数の架橋結合を導入することによって
、)IA回収工程中に、組織内のHAを化学的に修飾す
ることであり、その化学的修飾の程度は、HAの有利な
性質例えば水性媒体中で高粘度の溶液を与える性能、生
物的適合性などに悪影響を与えることなくポリマー溶液
の弾性的特性を実質的に増太さきるのに充分なものであ
る。
この発明により製造される化学的に修飾されたヒアルロ
ン酸すなわち)IYは医学の分野や化粧品の多くの用途
、例えばビスコ外科の道具、各種の素材の生物的適合性
を改善するたのコーティング、各種医薬製剤の一成分、
肌の手入れ用製品などに利用できる。このポリマーの改
良された性質例えば増大された弾力性はHYの使用時に
大きな利益をもたらす。
又、HYは、慣用的な架橋剤による架橋反応の如き化学
的修飾法を更に附加することによって得られる新規生成
物の出発物質として使用できる。この発明による化学的
に修飾されたHAおよびその溶液の特別な性質はいくつ
かの珍しい性質を持った上記の附加的に化学的修飾され
た生成物を得る機会を与えてくれることが判った。かく
してこの発明による生成物をアルカリ性溶液中ジビニル
スルホンで架橋することによって水不溶性のゼリー状物
質が得られることが判った。この物質は高度に膨潤した
ゲルである。このゲル中のポリマーの濃度は水或いは電
解質の如き種々の低分子量物質の水溶液であってもよい
液相の組成に依存する。生理食塩水(O,tSモル食塩
水溶液)の場合、ポリマー濃度は0.15〜0.40重
量%にできる。この物質は第5.6および7図に示す非
常に興味あるレオロジー的性質をもっている。すなわち
全試験周波数について、複素動的弾性率(G゛)の弾性
成分は損失弾性率(G”)より大きい。同時にこの物質
は低い剪断速度下で擬似可塑物の如き挙動を示す。すな
わち粘度は剪断速度によってかなり低下する。またこの
物質は緩和時間が著しく永いという特徴を何する。この
事はこの発明により得られたHYの溶液の特異な構造で
あって、それが特別のレオロジー的性質をもった上記の
ゼリー状生成物を得ることを可能にしたものと確信して
いる。換言すれば、この発明の回収法で起こるHAの化
学的変化がHYの構造及び性質に影響するばかりが、そ
れから得られる生成物の性質までも影響を及ぼすのであ
る。
従って、その技術分野で知られている方法すなわちクロ
ロホルム抽出で蛋白質を除去することによって得られた
HAをジビニルスルホンでの架橋の出発物質として使っ
た場合、この発明の生成物より実質的に劣るレオロジー
的性質をもつ不溶性物質が得られた。
本発明によって得られた生成物の附加的修飾によって多
くの他の変成物質例えば強く架橋したゲル、不溶性フィ
ルム、コーティングなどが得られるということは理解さ
れるべきである。
この発明の発明者らは、抽出媒体のpHがハイランの収
率に強く影響し、っまりpHがアルカリ性状態にむかっ
て上昇すると収率は増大するが、同時に、ハイランが分
解するために分子量の低下をまねくということを、前記
親出願においてすでに述べた。この発明の発明者らは、
抽出時の温度を、実質的に常温(すなわち20℃)以下
、好ましくは15℃以下、さらに好ましくは5℃以下に
保持すると、ハイランの収率を増大させることができ、
またハイランの分子量を実質的に高レベルに保つことが
できることを見出したのである。抽出時間は、所望の収
率とポリマーの分子量およびアルカリの濃度と温度によ
って、数時間から数日まで変えることができる。また発
明者らはpl+を9.5〜14に変えることができるこ
とを見出した。
抽出時のアルカリ性条件は、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウムまたは
炭酸カリウムのような無機のアルカリ、または、トリエ
チルアミン、トリエタノールアミンなどのような有機の
アルカリを含む、種々のアルカリ物質を用いることによ
って作製することかできる。この発明の発明者らは、い
くつかの場合に、水酸化ナトリウムと水酸化アンモニウ
ムの混合物のようなアルカリ物質の混合物を用いるのか
好ましいことを見出した。
また、滅菌性かつ非炎症性で特に発熱性物質を含まない
製品が、この発明の方法を用いて容易に得られることか
見出された。この発明の発明者らは、この種の製品が、
洗浄した雄kl、<は雌の鶏のとさか全体を、アルカリ
性溶液で比較的短時間処理すると一層容易に得られるこ
とを見出した。
親出願に記載したのと同様に最初に洗浄した後で、上記
の特別の工程が行われる。最高の結果が得られるのは、
無機のアルカリ、例えば水酸化ナトリウムの濃度は、O
,05M〜4Mであり、好ましくはOoLM−IM、最
も好ましくは0.15〜0.25Mの時である。
処理時間は、アルカリの濃度によってきまり、5m1n
から数時間まで変えることができ、好ましいのはlom
in−1hrである。有機および無機の塩基を含むいず
れのタイプのアルカリ物質でも、処理溶液のpHを12
より高くすることができるものであれば使用できること
は理解されるべきである。また、アルカリの水溶液また
は水と水混和性の溶媒例えばアセトン、エタノール、イ
ソプロパノールなどとの混合物ら使用できる。処理され
たとさかは、水で洗うかまたは希酸溶液と水とて洗って
、アルカリを洗い落とすことができる。このようにして
処理したとさかを次に、前記親出願に記載した手順にし
たがってアルデヒド混合物で処理する。
この発明の発明者らは、この発明によって得られたハイ
ラン製品の結合ホルムアルデヒドの含量が、前記親出願
に述べたハイランよりかなり小さい場合があることを見
出した。発明者らがいくつかの試料で検出できた最低の
レベルは、約0.0002重徂%である。
ハイラン生成の化学に関する情報をさらに得るために、
放射能で標識したホルムアルデヒドによる第2の実験(
実施例8)を行った。この実験は、いくつかの点で前記
親出願に記載された実験とは異なる。これら二つの実験
結果から、下記結論を得た。
1、少量のホルムアルデヒドが、ハイラン高分子に強力
に共有結合していると考えられる。このホルムアルデヒ
ドは、沈澱法、溶媒による洗浄、乾燥もしくは透析を繰
返しても除去できない。
2、この結合されたホルムアルデヒドのかなりな量が、
ハイランの多糖部分をヒアルロナンおよび硫酸コンドロ
イチンを分解するヒアルロニダーゼで消化した後透析す
ることによって除去することができる。恐らくこのホル
アルデヒドは、透析可能な、ペプチド類またはペプチド
と少糖類との結合物と結合していると考えられる。この
ホルムアルデヒドのいくらかは、凍結乾燥によって除去
されるが、これはホルムアルデヒドがゆるく結合してい
ることを示している。
3、ホルムアルデヒドとハイランの蛋白質部分との反応
の宵力な証拠がオートラジオグラフィ法で得られた。ホ
ルムアルデヒドの最も存意な取り込みが、ハイラン試料
内に常に存在し、かつハイランの電気泳動パターンにお
ける主要バンドである蛋白質バンド内に観察された。
この発明の他の基本的に新しい態様は、沈澱および再溶
解の工程なしでこの発明の方法の濾過段階で得られるハ
イラン溶液を直接使用することである。この方法は、通
常大量の有機溶媒をとらなう沈澱工程がなくなるので、
得られる製品は、通常製造されるハイランよりかなり安
価である。濾液中のハイランの濃度、したがって収量は
、中性pHての抽出に比べてかなり高いので、アルカリ
性抽出を行う方法を用いるのが有利である。製品中の過
剰のアルカリは、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸:酢
酸、クエン酸、p−アミノ安り1香酸、ステアリン酸な
どのような有機酸;またはポリアクリル酸、ポリビニル
スルホン酸のようなポリマー酸で中和できる。酸の選択
は、製品の最終用途によってきまる。このようにハイラ
ン溶液は、化粧品の製剤に使用されるときは、ポリアク
リル酸を使用するとゲルが得られるが、ステアリン酸を
用いるのは化粧品用エマルジョン(クリーム剤、ローシ
ョンなど)を製造するのに便利でり、p−アミノ安息香
酸の使用することによって日焼けどめ性を有する製剤か
えられる。しかし、特定の酸を選択しても、この発明の
上記態様を特別に限定するものではない。
(以下余白) (ニ)実施例 この発明を下記の参考例と実施PJによって説明するが
この発明を限定するものではない。
参考例1 雄鶏のとさかをセチルピリジニウムクロライドの1%水
溶液で良く洗い、次いて脱イオン水で洗って最後に冷凍
した。冷凍とさかを約1〜2酎の厚みにスイラサーで薄
切りした。アセトン10009.37%ホルマリン10
0gおよび酢酸ナトウリム50gの混合物を作り、薄切
りとさか10009を加えた。とさかと処理液との混合
物(pH6,7)をゆる(撹拌しつつ約20℃で24時
間保持した。ナイロン網で濾過して液をとさかから分離
した。次いでこの処理済とさかをアセトン5009で洗
浄し、最終500gになるまで空気中で乾燥した。乾燥
とさかを脱イオン水2.54と混合し、ゆるい撹拌下約
20℃で72時間抽出を行った。ナイロン網布で濾過し
て抽出液からとさかを分離し、抽出液は更に繊維素系濾
材[「ミクロ−メディアθIicro−media’ 
) M70Jエルテルエンジニャリング社(Ertel
 Engineering Co、)]で濾過した。こ
の第1抽出液中のHAa度はQ、92JI9/R(lで
あった。2gの抽出液をアセトン4Qおよび酢酸ナトリ
ウム209と混合した。白色w&維状状沈澱得られ、こ
れを集めアセトンで洗浄し、35℃の真空乾燥機中で乾
燥し、1.759の生成物を得た。
生成物のへキラサミン/ヘキスロン酸比は1±0.05
であった。生成物中のホルムアルデヒド含量は0.01
50%であるとこが判った。生成物はハイランと同定さ
れた。生成物中の蛋白質含量は0.35%で極限粘度数
は4,320cc/gであった。
第1抽出後のとさかを脱イオン水2.5(!と混合し常
温で48時間抽出を行った。上述の如くとさかを抽出液
から分離した。第2抽出液中のHA濃度は0.65g/
x12であった。上述の沈澱法で抽出液から回収した生
成物は1.269であった。この両分は又ホルムアルデ
ヒド含量0.014%の化学的に修飾されたヒアルロン
酸ナトリウムとして特徴づけられるものであった。その
蛋白質含量は0.27%、極限粘度数は4,729cc
/9であった。σ、15モル食塩水中の1重量%溶液の
ロオロジー的性質を測定し第【表に示した。
このとさかの第3回目の水抽出を上と同様に行った。第
3 抽出液中〕1(Aa度+1.33i9/x12テ、
コノ抽出液から0.609のHAを回収した。蛋白質含
量は0.20%、極限粘度数は4,830cc/9、ホ
ルムアルデヒド含量は0.0115%であった。
[klFの雄鶏のとさかから化学的に修飾したHAナト
リウムを合計3.619得た。
参考例2 参考例1と同様にして薄切りした雄鶏のとさか1kgを
、アセトン1kgとグルタルアルデヒドの40%水溶液
1509との混合物に混合した。該混合物のpt+は6
.9であった。該混合物をゆるく撹拌しつつ(約1 r
pm、)常温(約20℃)で16時間保持した。
とさかを液から分離し、アセトンで洗浄し、元の重量の
半分になるまで風乾した。乾燥とさかを脱イオン水3Q
にて約20℃で96時間抽出した。抽出液を参考例1と
同様にしてとさかから分離して濾過した。抽出液中のH
A含量は1.4ng/yQであった。
実施例1と同様にしてアセトンで沈澱した生成物は蛋白
質含量が0.42%、極限粘度数が3,700cc19
であった。
参考例3 グルタルアルデヒド溶液の代わりに同量のグリオキサー
ル40重量%水溶液を用いた以外は参考例2と同様にし
た。抽出液中のHA含量は0.92m9/xQであった
。生成物の蛋白質含量は0.5%、極限粘度数は3.9
30cc/9であった。
参考例4 参考例1と同様にして雄鶏のとさかを洗浄し、冷凍し、
スライスし、アセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理
した。とさかを元の重量の半分になるまで乾燥した後、
0.05モル水酸化ナトリウム水溶液(pHは11以上
) 2.5Qで約20℃、120時間抽出した。抽出液
は参考例1と同様にして分離し、濾液した。抽出液中の
HAa度は3.6ytg/x(lであった。アセトンと
酢酸ナトリウムとの混合物で沈澱して白色の生成物を得
、アセトンで洗浄し乾燥した。蛋白質含量0.2%、極
限粘度数1,310cc/9の生成物7.59を回収し
た。
参考例5 雄鶏のとさかを洗浄、冷凍、スライスし、とさか1kg
をイソプロパノール1kg、37%ホルマリン100g
、酢酸ナトリウム50gおよびクロロホルム1009の
混合物と混合した。処理はゆっくり撹拌しつつ約20℃
で16時間行った。参考例1と同様に抽出。
沈澱を行った。抽出液中のHAa度は0.68u/ra
Qであった。生成物中の蛋白質含量は0.46%、極限
粘度数は4,900cc/9であった。
側4入l 雄鶏のとさかを参考例1と同様に洗滌し、冷凍し、スラ
イスし、アセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理し、
アセトンで洗滌し、乾燥し、水で抽出した。抽出液をア
セトン2QとクロロホルムIQとの混合物と混合した。
蛋白質含量005%、極限粘度数4,400cc/9の
白色繊維状生成物1.9gを得た。
参考例7 参考例1と同様にして作られた薄切りとさか1に9を、
アセトン1klFと37%ホルマリン509と酢酸ナト
リウム509との混合物でゆるく撹拌しつつ約20℃で
24時間処理した。抽出液を参考例1と同様に分離し、
濾過し、生成物を沈澱させた。蛋白質含量045%、極
限粘度数5.300cc#、結合ホルムアルデヒド含量
0.008%の白色生成物1.69を得た。
参考例8 アセトン−ホルムアルデヒド処理後にとさかを元の重量
の173まで乾燥し、水による第1回抽出を96時間行
う以外は参考例1と同様の操作を行った。
第1回抽出液中のHAa度はり、05m9/xQであっ
た。この抽出液からの沈澱生成物は蛋白質含量0.25
%、極限粘度数4,930cc/9であった。この生成
物の0.15モル食塩水による1重量%溶液の振動試験
では0.020のヘルツの周波数の「クロスオーバー点
」を有していた。
第2回抽出液中のHA濃度は0.58m9/xQであっ
た。この抽出液からの両分(フラクシ、ヨン)は蛋白質
台m 0 、19 %、極限粘度数7,300cc/9
テアツタ。
結合ホルムアルデヒド含量は0.01%であった。振動
試験による「クロスオーバー点」の周波数は0.005
ヘルツであった。
一連の3回連続抽出で回収された化学的に修飾されたH
Aの合計は3.59であった。
参考例9 雄鶏のとさかを洗滌し、冷凍し、スライスし、スライス
したものIkgを、アセトン1kg、37%ホルマリン
200gおよびクロロホルム1009と混合した。
混合物のp)(は塩酸を加えて4.0に調整した。第1
回抽出液のHAa度は0.58工9/+Qてあった。抽
出液から参考例1と同様にアセトン−酢酸ナトリウムで
沈澱さけて生成物を回収した。生成物の蛋白質含量は0
.12%で極限粘度数は4.025cc/gであった。
生成物中の結合ホルムアルデヒド含量は0.02%であ
った。0.15モル食塩水による生成物1重塁%溶液の
振動試験に於ける「クロスオーバー点」周波数はo、o
oaヘルツてあった。
参考例10 雄鶏のとさかを洗1條、冷凍、スライスし、スライスし
たもの1kgを、混合物のpI(を水酸化ナトリウムで
11.0に調整した以外は参考例1と同様にしてアセト
ン−ホルムアルデヒド混合物で処理した。とさかを参考
例1と同様に乾燥し、水で抽出した。抽出液のHAa度
は0.693!9/3!12であった。
アセトンの代わりにイソプロパノールを使用した以外は
参考例1と同様にして抽出液から生成物を沈澱させた。
蛋白質含量0.45%、極限粘度数5.050cc/9
、ホルムアルデヒド含量0.012%の白色繊維状物質
1.39を得た。この生成物の0.15モル食塩水中1
重量%溶液の振動試験に於ける「クロスオーバー点」周
波数は0.012ヘルツであった。
参考例11 この参考例は「ハイラン」からのゼリー状物質の製造を
示す。参考例1の第2回抽出液から得た沈澱生成物0.
881i1を0.05規定水酸化ナトリウム水溶液28
3gと混合し、混合物を室温で60分間撹拌した。得ら
れた粘稠溶液にジビニルスルホン0269と0,5規定
水酸化ナトリウム水溶液l、09とを加えた。得られた
混合物を10分間撹拌し次いで室温で50分間放置した
。弾力性のある無色透明のゲルを得た。ゲルをO,Sl
!の0.15モル食塩水中に入れ一夜放置した。次いで
高度に膨潤したゲルから過剰の液体を除去し、新しい食
塩水0,5Qをゲルに加え振盪機上で24時間放置した
。膨潤した不溶性物質から過剰の液体を傾厚して除いて
ゼリー状の透明物質を得た。この生成物中のHA濃度は
0.275重量%と測定された。この物質のしオロジー
的性質は第5.6及び7図に示した。
参考例12 (”CH,Oによる雄鶏とさかの処理)放
射性同位元素で標識されたパラホルムアルデヒド(”C
H20) [比放射能500mC1/9(12cNレイ
ディオケミカルズ、 12cN Radiochemi
cals) ]を、!規定水酸化ナトリウム水溶液0.
11j12を加えた37重量%ホルムアルデヒド水溶液
fox(lに5.0mC1に相当する量加えた。混合物
をきっちりと栓をした容器に入れ60℃に加温しパラホ
ルムアルデヒドを溶解した。次いで混合物を0℃に冷却
しl規定の酢酸水溶液0.1xQで中和した。得られた
溶液の放射能は、10x12の「ハイドロツルア−(■
ydrof 1ourR) J液状シンチレーション計
数媒体(liquidscintillation c
ounting medium) (ナショナル・ダイ
アグノスチック) (National Diagno
stic)中で、外部標準法に基づく効率の補正をコン
ピュータで行うサーレ・アイソキャップ300液体シン
チレイション・カウンター(Searle l5oca
p 300Liquid 5cintilation 
Counter)を用いて測定した。ホルムアルデヒド
濃度はクロモトロープ酸による比色法で測定した。得ら
れた溶液の比放射能(specific activi
ty)は0.555mC1/ミリモルct−twoであ
った。この標識されたホルムアルデヒド溶液をアセトン
7.5g、クロロホルムII?、酢酸ナトリウム0.5
gと混合した。薄切りした雄鶏のとさか7.59をこの
溶液と混合し約20℃で18時間処理した。とさかを液
から分離し、数回アセトンで洗滌し元の重量の172に
なるまで風乾した。2回反復して蒸留水15酎をとさか
に加え約20℃で96時間抽出を進めた。抽出液はとさ
かから分離し濾紙[ホワットマン(Whatmanll
) No、 1 ]を数枚重ねて濾過した。同じ操作を
繰返してとさかの第2抽出液を得た。HYは抽出液に酢
酸ナトリウムを1重量%溶液になる量と、95%エタノ
ールを4倍量加えて白色繊維状物として沈澱した。繊維
状物を分離し、アセトンで丁寧に洗い、乾燥し再びHY
i度が約I M9/x(lになるように水に再溶解した
。HYをその溶液から上記と同様にして再沈澱し、再度
アセトンで徹底的に洗い乾燥した。乾燥物質を今−度蒸
留水に溶解してHYを0.84xg/1x(l含有する
溶液を得た。この溶液の比放射能を測定した処194d
pm/μy HAであった。この溶液の放射能は、0.
15モルの食塩を含みpH7,5の0.05モルリン酸
緩衝液への完全透1fl (exhaustive d
ialysis)によって1103dp/μ9 HYに
減少した。この溶液の放射能は4モル濃度グアニジン塩
酸塩に対する完全透析によって1101dp/μ9HY
にまで減少した。このことは蛋白質が解離する条件下で
の溶液の処理後でもホルムアルデヒドは生成物中に残留
していることを示している。生成物について測定された
放射能並びに出発物質のホルムアルデヒド溶液の比放射
能に基づき、HYに関するホルムアルデヒド含有量は約
02重量%と算出された。放射性同位元素で標識されス
トレプトマイセスヒアルロニダーゼによる酵素的分解を
受は易いHYと結合したホルムアルデヒドがどれくらい
かを評価するため、HY O,8R9IRQを含みl 
、 250dpm/ (lQμe溶液)の放射能を持つ
別の溶液を作った。この溶’a−2j!Qにストレプト
マイセス・ヒアルロニダーゼ33TRtl [マイルス
 ラボラトリ−社(Miles LaboraLori
esInc、) 、比活性度2,0OOTRIJ/B 
HA、蛋白質加水分解活性度が5XlO”単位/TRU
以下]を含んだクエン酸−リン酸緩衝液(pH5,6)
QAx(lを加えた。
同じ溶液の別の2肩Qに酵素を含まない前記緩衝−液を
0.lRQ加えた。両方共20時間かけて1,000倍
量のクエン酸−りん酸緩衝液へ透析した。透析後の上記
2試料の容積は同じであった。酵素処理しなカー) タ
試14[HY !度カ0.76mg#t(!テ放N能ハ
552dpm/10μQであった。酵素処理した試料の
HYa度は検出レベル(10μ9htQ )以下に減少
し、放射能は414dpm/10μQ溶液であった。ヒ
アルロニダーゼに敏感な放射能は20dpm/u9 H
Yでこれは酵素的に消化し得るHYに結合したホルムア
ルデヒド0.049重量%に相当する。生成物のそのよ
うに標識された試料をゲル パーミェーション クロマ
トグラフィーで分析した。このクロマトグラフィはグリ
セリール−CPG3000 (孔の大きさ2869±8
.3%)(エレクトロヌクレオニックス社 (Electronucleonics、 Inc、 
)を充填した1、6X90Cmのガラスカラムを使用し
た。0.15モル食塩を含む脱気した0、02モルはう
酸塩緩衝液(pH7,5)を溶m& (elution
)に使用した。カラムの排除容積(excluded 
volume)  (Vo)を分子ff14Xlo’の
HY試料で測定し、カラムの全容積(Vt)をスクロー
スで測定した。溶離は6°Cで10z(!/待時間流速
で行った。SiCずつの両分を集めHY濃度と放射能を
分析した。放射能が気孔容積(y□id volume
)のHYと共に共溶離しく coelute)及び酵素
的消化が、HYとその放射能との両方を気孔容積の両分
から除去することが明らかになった。計算すると、気孔
容積のHYと結合した比放射能は14.6dpm/μ9
I(Yで、これはポリマー中のホルムアルデヒド003
6重量%に対応することを示した。この数字は透析実験
で得た数値とよく一致する。
実施例1 この実施例は、超高分子量で滅菌された発熱性物質を含
有せず非炎症性ハイランが得られた例である。
ひな鶏のとさかを、まず0.15M塩化ナトリウム水溶
液による1%セチルピリジニウムクロリド溶液で次に脱
イオン水で充分洗浄し、最後に1%水酸化ナトリウム水
溶液内に室温で15分間保持した。このとさかを脱イオ
ン水で洗い凍結させた。
凍結されたとさかをスライサーで約1〜2ス屑厚の切片
に切断した。このようにして作製したとさかIkgと、
2.5Qのイソプロパノール、0.IQのクロロホルム
、0.07(lの30%ホルマリンおよび0.05(1
の酢酸ナトリウム50%水溶液を含有する処理溶液とを
、ガラス容器に入れて混合し、オートクレーブで滅菌し
200℃で4hr加熱して発熱性物質を除去した。この
実験で用いた器具はすべて、同様に滅菌と発熱性物質の
除去を行った。上記溶液によるとさかの処理は、ゆるや
かに撹拌しながら、約20°Cの温度で24hr行った
。次いで、濾過補助具をなにも使わずにブッナー漏斗で
濾過することによって、とさかから液体を分離した。次
に処理されたとさかを2Qのイソプロパノールで洗浄し
、前記したのと同様にして溶媒を除去し、底部にステン
レス鋼のスクリーンを取付けたガラスカラム内に入れた
。前記および以下の手順はすべて、細菌による汚染を防
止するため層流フード内で行った。
0.2x肩の膜で濾過した低速の窒素流を、カラムを約
4hr通過させてとさかから、残留溶媒を除いて乾燥し
た。次いで得られたとさかを、ガラスビーカー内で、滅
菌され発熱性物質を含有しない水2.5Qと混合し、1
6℃を超えない温度で24hr抽出した。
この抽出工程のpHは、必要なときに、水酸化ナトリウ
ム水溶液を添加して10.5に保持した。ブッレナー漏
斗で濾過することによってとさかを抽出液から分離した
。抽出液をさらに、オートクレーブで滅菌した、セルロ
ースタイプのフィルター材“マイクロメディア” M2
O(’Micro−media″M70)(エルテル・
エンジニアリング・カンパニイ)で濾過した。濾液中の
ハイランの濃度は0.45a9/xQであった。209
の酢酸ナトリウムを50xQの水に溶解し、上記濾液2
Qに添加した。ゆるやかに撹拌しながら、この濾液を、
4Qのイソプロパノールと混合したところ白色m錐状沈
澱が形成した。上記繊維状沈澱を液体から分離し、IQ
の新しいイソプロパノールで24hr洗浄し、次に液体
から分離し、コールドトラップを備えた真空オーブンを
用いて、50ミリトールを超えない残留圧力下、常温で
72hr乾燥した。
第1回の抽出後のとさかを、抽出時間が96hrである
以外同様にして第2回の抽出を行った。第2回の抽出を
行った抽出物を前記と同様に濾過した。
得られた濾液のハイランの濃度は0.83n/xQであ
った。前記したのと同様にして、繊維状生成物を第2濾
液から分離して乾燥した。各抽出操作での生成物の収率
と、下記性質:へキンサミン/ヘキスロン酸比、蛋白質
含量、結合ホルムアルデヒド含量、極限粘度数、無菌性
、発熱性物質性(pyrogenicity)およびレ
オロジー的性質とを評価した。用いた手順は、前記と同
様で、すなわち前記親出噸と同様である。ホルムアルデ
ヒド測定の感度を上げるために、手順を次のように修正
した。すなわち、繊維状生成物を、水に溶解して約1重
量%の濃度とし、凍結乾燥して泡状の軽い物質を形成さ
せ、次にこれを圧縮して非常に緻密な錠剤とした。この
錠剤を、さらに約100ミリトールの残留圧下、80℃
で4hr乾燥して、ホルムアルデヒド測定用の試料とし
て用いた。試料の重量は、約29であったが、測定法の
感度が、元の方法に比べて約10倍になった。二つの製
品の性質を第■表に示す。
(以下余白) 第■表 収量(9)             0.89   
     1.60へキソチミン/ヘキスUンM   
                 1.02    
             0.97モル比 へイランポリマーの)I白質            
     0.35                
0.22含1i(重量%) へイランポリ7−の結合本ルム           
      0.0006             
  0.00025Tルデヒド含量(重量%) 極限粘度数Ccc/9.        5,600 
      6,7000.15M NaC(125℃
) 0.15M塩化ナトリウム水溶液 によろ1重量%溶液のレオロジー 特定の剪断速度U14  0.01s−’  1,33
0        1.780剪断粘度(Pa、s) 
    100 s”  1.30        1
.23剪断速度ゼd)る         1,882
       3.155剪断速度(Pa、s) 特定振動数Wする    0.05Hz   73.1
        100.0動的貯蔵弾性率(Pa) 
  5.0 Hz   2Q3        240
.0りaス2−バー点に樹ろ            
      0.0095             
 0.0063振動数(Hz) 低剪断速度領域における、粘度の剪断速度に対する依存
性を第11図に示す。
生成物の“生物学的純度”を評価するために、滅菌され
た、発熱性物質を含有しない°0.15M塩化ナトリウ
ム水溶液による1重量%溶液を作製した。
溶液の無菌性をusp (米国薬局法’) XXI標準
法で測定したが、上記の両溶液とともに無菌であった。
発熱性物質の含量を、L A L (LimulusA
mebocytae Lysate)試験法によりU 
S P XXIにしたがって測定し、EU(エンドトキ
シン単位)/xQで示した。両溶液について、測定結果
は6EU/IIQより低かった。
さらに、得られた溶液の炎症性活性を、米国特許箱4.
141,973号(1979年2月27日)に記載のオ
ウル・モンキイ・アイ試験法(Owl Mon’key
 EyeTest)を用いて試験したが、両溶液ととも
に、本質的に非炎症性であることが分かった。
このように、親出願に比べて結合ホルムアルデヒド量が
著しく少ない、超高分子量で、滅菌され、発熱性物質を
含有しない非炎症性ハイランが得られた。
K夜匠l この実施例は、高分子量のハイランを、高収量で得られ
ることを例示するものである。
鶏のとさかを、まず1%セチルピリジニウムクロリド水
溶液で洗浄し次に脱イオン水で洗い、最後に凍結させた
。凍結したとさかを1〜2u+厚の切片にスライスした
。スライスしたとさか500gを、600m+2のイソ
プロパノール、5h+&の37重量%ホルマリンおよび
25gの酢酸ナトリウムの混合物中に入れ、この混合物
を24hr、 25℃を超えない温度に保持した。次い
でとさかを液体から分離し、空気中で約2hr乾燥させ
た。このように乾燥したとさかを、予め約4℃に冷却し
た1、2Qの水酸化ナトリウム0.04規定水溶液と混
合した。混合物のpHは約12であった。抽出を、5日
間、約4〜6℃で行った。次いでとさかを抽出液から分
離し、抽出液をセルロースフィルターメディアドア0で
濾過した。この濾液のハイランの濃度は3.2m9/!
lQであった。109の酢酸アセテートを、前記濾液の
1i2に溶解し、得られた溶液を2Qのアセトンにゆっ
くり注ぎ入れた。上記溶液から沈澱した白色の繊維状物
質を集めて新しいアセトンで洗浄し、コールドトラップ
を備えた真空オーブンを用い、常温で?2hr残留圧力
約50ミリトール下で乾燥した。乾燥繊維物質3.05
gを得た。この物質は、極限粘度数が6200cc/9
、蛋白質含量0.55重量%、結合ホルムアルデヒド含
1i0.oo035重量%であり、ハイランと同定され
た。
実施例3 この実施例は、水酸化ナトリウム溶液の濃度と抽出時間
のハイランの特性に対する影響を例示するものである。
とさかの調整、処理および後処理乾燥工程を前記実施例
に記載したのと同様に行った。乾燥されたとさかを、予
め4℃に冷却した0、2規定水酸化ナトリウム水溶液1
.2Qに入れた。混合物のpHは14より高かった。4
℃で42hr抽出後、抽出液の約172を採取した。そ
のハイランの濃度は4.2mg/mQであった。抽出液
を濾過し、前記実施例に記載したのと同様にしてハイラ
ンを沈澱させた。白色の繊維状物が得られ、0.15M
塩化ナトリウム水溶液(25℃)中での極限粘度数は3
200cc/9および蛋白質含量は0.4重量%であっ
た。4℃で合計140時間抽出した後、残りの抽出液を
とさかから分離して、前記したのと同様に処理した。2
.29の白色繊維状物が、この抽出液分から回収され、
極限粘度数が2300cc19で蛋白質含量が0.85
重量%であった。
上記の二つの各生成物の結合ホルムアルデヒド含量は約
0003重量%であった。
このように、低温での抽出であっても、抽出工程におけ
るアルカリの濃度が比較的高い場合、常温での抽出に比
べてかなり高い極限粘度数をもった生成物が得られる。
抽出時間が増すと、生成物の極限粘度数が低下する。
X嵐鯉土 この実施例は、抽出工程で、揮発性塩基を使用する例で
ある。とさかは、上記実施例に記載したのと同様にして
調整し処理した。得られたとさかを0,25重量%アン
モニヤ水溶液の12I2で、25℃て96時間抽出した
。前記実施例と同様にして、抽出液をとさかから分離し
、濾過し、沈澱させた。
得られた繊維状物質のハイランは、極限粘度数が450
0cc/9で蛋白質含量が0.55重量%であった。
実施例5 この実施例は、抽出時の温度の、最終製品の性質に対す
る効果を例示するものである。
500gの雄鶏のとさかを洗浄し、前記実施例と同様に
スライスして処理した。次に得られたとさかを172づ
つに区分した。片方の部分を、0.2%のアンモニアを
含有する0、2規定水酸化ナトリウム水溶液600z(
を用い25℃で96hr抽出した。抽出液を濾過しく濾
液中のハイランの濃度はS、3xg/x(lであった)
、前記と同様にして沈澱させた。生成物の極限粘度数は
1900cc/9で蛋白質含量は1.7重量%であった
。とさかの残りの部分を予め4℃に冷却した同じ溶液6
00i12と混合し、4°Cて96hr抽出を行った。
濾液のハイラン濃度は4 、5yy/mρで、生成物の
極限粘度数は2100cc/9であり、蛋白質含量は0
.52重量%であった。
このように、抽出工程の温度が低下すると、高分子量と
低蛋白質含量になることが分かる。
実施例に の実施ρjは、処理済のとさかを、低濃度のアルカリ混
合物で抽出した例である。
500gのとさかを予め洗浄し、スライスして、実施例
2に記載したのと同じ混合物を含有するホルムアルデヒ
ドで処理した。得られたとさかを、0.2%のアンモニ
ア含有の0.1M水酸化ナトリウム溶液を予め4℃に冷
却したちの1.212中に入れた。
抽出を、4℃で96hr行った。
得られた抽出物を分離し濾過し、次いで生成物を前記実
施例に記載したのと同様に、沈澱させた。
抽出液のハイランの濃度は4.9x9/xQであった。
4.5gの繊維状物が得られた。生成物の極限粘度数は
3900cc#で蛋白質含量は0.25重量%であった
とさかを上記と同様にして2回目の抽出を行った。抽出
液のハイランの濃度は4.019/112であった。
3.4gの繊維状物を得られたが、極限粘度数は440
0cc/9で蛋白質含量は0.65重量%であった。
実施例7 この実施例は濾液からハイランを回収するために第四級
アンモニウム化合物を使った例を示す。
500gのとさかを、前記実施例と同様に洗浄し、凍結
させ、スライスした。得られたとさかを、600xQの
イソプロパノール、50RQの37重量%ホルマリンお
よび259の酢酸ナトリウムを含有する混合物で、24
hr  4℃で処理した。処理後のとさかを液体から分
離し常温で空気中で乾燥し、次いで25aQの25%ア
ンモニヤ溶液25x(lを添加した1、2i2の(1,
1規定水酸化ナトリウムで抽出した。抽出は4℃で48
hr行った。抽出液をとさかから分離し、濃塩酸で中和
した。抽出液のハイラン濃度は2.86vg/xQであ
った。、濾過済の抽出液の5002!12を、沈澱剤と
してイソプロパノールを用いる前記実施例に記載したの
と同様にして沈澱させた。1.359の生成物を得たが
、極限粘度数は3900cc/9で蛋白質含量は、0.
5重量%であった(生成物A)。濾過された抽出液の別
の500i(!を、セチルビリジウムクロリド(CPC
)の1重量%水溶液275x12と混合した。
樹脂状の沈澱が形成し、上澄液を除き、50℃の水50
01(2で2回洗浄し、次いで20℃の水500ccで
1回洗浄し、最後に0.3M塩化ナトリウム水溶液に溶
解した。0.7gの酢酸ナトリウムを上記の溶液に溶解
し、次にその溶液を60x12のイソプロパノールに、
徐々に注入した。繊維状白色の沈澱が形成され、50x
Qのl=l水−イツブロバノール混合物で2度洗浄し、
最後に50j112のイソプロパノールで洗い、次いで
減圧乾燥した。1.4!lの生成物が得られ、極限粘度
数は4000cc/9で蛋白質含量は0.6重量%であ
った(生成物B)。生成物のCPC含量は25ppI1
1であった。上記2生成物の、0.15M食塩水による
0、5重量%溶液のレオロジー特性は次のとおりであっ
た。
(以下余白) レオロジーデータ        生成物A     
生成物B  ・における剪断粘度(Pa、s) ゼロ剪断速度における       371     
  315剪断粘度(Pa、s) クロスオーバー点における     0.04    
   0.05振動数(Hz) このように、濾液からのハイランの回収に対してCPC
を用いることによって、イソプロパノールで沈澱させて
得た生成物と比べて本質的に同じ性質を有する生成物が
得られた。
K乳匹影 この実施例では、放射能で標識をしたホルムアルデヒド
を用いた、追加の実験について述べる。
放射能で標識した” CH,0の水溶液(比活性57m
ci/mmol) Cニュー・イングランド・ヌクレア
ー(!Jew England Nuclear) ]
を、37重量%ホルマリン*、OxQと、2mC1(0
,1G4af2)に相当する量で混合した。混合物の比
活性は0.15mC1/mmolであった。このホルム
アルデヒド溶液を0,59の酢酸ナトリウムを含有する
12.5xQのイソプロパノールに添加し、得られた混
合物を栓付フラスコに入れ、これにlhのスライスした
雄鶏のとさかを入れた。
とさかの処理を常温(約20℃)で18時間行った。
とさかを液体から分離し、Lop(lのイソプロパノー
ルで2回洗浄し、もとの重量の1/2まで風乾した。
25mQの蒸留水をとさかに加えて、抽出を4°Cで4
8hr行った。この第1抽出液(pH7,0)をとさか
から分離し、ナイロン布地で濾過し、次いで4層のワッ
トマン(Thatman) # l濾紙で濾過した。と
さかからの第2の抽出液を作製し、本質的に同じ方法で
処理した。酢酸ナトリウムを、両濾液加えて1重量%溶
液にした。濾液を2倍容量のイソプロパノールに注いで
、両濾液から白色繊維状物を沈澱させた。ハイラン繊維
状物を集め、イソプロパノールで充分洗い(3回)、常
温の真空オーブンで乾燥した。次いで水に再溶解し、ハ
イラン濃度が約IQノx(lの溶液を得た。ハイラン繊
維状物を上記と同様にして再び沈澱させ、イソプロパノ
ールで洗い、真空オーブンで乾燥した。得られた乾燥繊
維状物を蒸留水に再溶解して、第1抽出液と第2抽出液
それぞれの製品として、ハイランをそれぞれ0.98幻
/jlf2および1,6519/次Q含有する溶液を得
た。これらの溶液の蛋白質含量はそれぞれ5.98μ9
/1Qと12.0μ97μQであった。この2溶液を、
まず塩水−リン酸緩衝液(pH7,5)に対して透析し
、次にクエン酸−リン酸緩衝液(pH5,6)に対して
透析したが、比活性が、第1抽出液と第2抽出液の製品
としてのハイランについて、それぞれ1330dpm/
uと2515dpm/if?であることか見出された。
これは、ハイラン中の結合した透析できないホルムアル
デヒドの含量、すなわち上記2製品についてそれぞれ0
.0128重量%と0.0227重量%に相当する。蛋
白質含量に関する比活性は、それぞれ222dpm/μ
9蛋白質および210dpm/μ9蛋白質であった。
この二つの溶液を、ヒアルロナンと硫酸コンドロイチン
を消化する事丸性ヒアルロニダーゼを2μ9/II(l
の酵素濃度で用い、37°Cで48hr酵素消化反4 
  応に付した。透析された溶液のいくつかのアリコー
トを採取して、ゲル電気泳動法とオートラジオグラフ法
で分析した。残りの試料を、酢酸−EDT^緩衝液(p
H6,0)に対して徹底的に透析した。透析された酵素
消化物のハイラン濃度は、検出可能なレベル(10μ9
/xQ )より低く、放射能のレベルは、第1製品と第
2製品に対してそれぞれ260dpm/rl(lと33
0dpm/llI2でありまたは元の蛋白質含量につい
て計算すると、43dpm/μ9蛋白質と28dpm/
μ9蛋白質であった。このように、この実験においては
、放射能のかなりな部分が、ハイラン高分子のヒアルロ
ナン部分を酵素分解した時、透析可能になった。
透析可能な放射能量を測定するために、第1抽出液製品
によるこの実験で得られた透析可能なグリコサミノグリ
カンの一部を凍結乾燥した。放射能の約80%(101
070dpが、その物質を乾燥後除去されたことが見出
された。
ヒアルロニダーゼで消化されたハイラン試料のオートラ
ジオグラフ(第9図)が、分子量が14.000.21
.0QO122,000,24,OQOおよび66、O
QQの蛋白質ゲルの放射能で標識されたバンドを示して
いる。特に分子fi66.000のバンドに最大の取込
みがみとめられる(バンドの強度からみて)。
66.000のバンドが、ハイランに見出された蛋白質
の電気泳動パターン中の主要なバンドの−っであること
か分かる(第10図)。
及4鯉り この実施例は、ハイランのIa帷状状物質沈澱させるこ
となく溶液を化粧用製剤に用いた例である。
とさかの処理、抽出および濾過を、実施例2に記載した
のと同様にして行った。濾液のハイラン濃度は、3 、
05m?/ xQであり、ハイラン濃度で計算した蛋白
質含量は0.8重量%、極限粘度数は5700cc/g
であった@ 0.289の乾燥ずリアクリル酸[カーボボール940
(Carbopol) 、  ビー・エフ・グツドリッ
チ社]を、SOmQの蒸留水に撹拌しながら添加して分
散させた。
次いで、4gのグリセロール、4rtrQの5ffif
fi%のポリビニルピロリドン水溶液(分子量的360
.OOO1アルドリッヒ ケミカル カンパニイ社)、
およびLOxQのポリエチレンオキシド[ボリオクス(
Po1yox)、凝固剤、ユニオン カーバイド社]の
1重量%水溶液を上記の分散液に添加した。上記のハイ
ラン濾液100x17を、上記の混合物に撹拌しながら
徐々に加え、次に混合物の全容積を、蒸留水によって2
00112にした。湿潤用ノλンドゲルとして利用でき
る透明なソフトゲルを得た。このゲルの最終組成は次の
とおりであった。
カーボボール 940    0.14重量%ポリビニ
ルピロリドン   o、to  〃ポリオクス凝固剤 
    0.025 ”ハイラン        0.
16  ”グリセロール      2.00  〃防
腐剤         0.30  ”水      
         97.275  yK敷鯉り東 この実施例は、ハイラン濾液を化粧用製剤に直接用いた
別の例である。
109のステアリン酸[グー・ケム14(Dar−Ch
em14)、グーリング アンド カンパニイCDar
ling & Co、)]を、前記実施例に記載したの
と同様にして作製したハイラン濾液50xQと混合し、
この混合物に、ランキシド52(Lanoxide 5
2)[PEG−40ステアレート、ラネテックス プロ
ダクツ インコーホレーテッド(Lanaetex P
roducts Inc、)コの0.89を混合し、次
いで撹拌しながら約80℃まで加温し、直ちに室温まで
冷却した。得られた混合物を、最終製剤のA部分を構成
する。
カーボボール940の1重量%水分散液1(1!。
ポリビニルピロリドンの5重量%水溶液2.5酎および
水酸化ナトリウム4%水溶液14*Qを混合して8部分
を作製した。
C部分を、下記成分を混合して作製した。
ペトロラタム [ケセ稙−・インズ インコーホレーテ
ッド           1,09(Chesebo
rough−Ponds、Inc)コセチルアルコール
(アルF ’J ? k  ケミカル カンパニイ) 
          1.09クロダモルPNP(Cr
odamol PMP)  。       0.59
[クロダ インコイレーデ1ド(Croda、Inc、
)コボルボ3 [Volpo  3Xクロダ インコー
ホレーテッド)  、            0.2
59やし油 [アクメーへ−デステI カンパニー イ
ンコーfレーテフF           1.09(
Acme−Hardesty  Co、、Inc、)]
P E G −350(フルドリブE ケミカル カン
パニイ)               OJ9プロピ
レングリコール (フルトリ1ヒ ケミカル カンバニ
イ)      1.09シリ コーンF −754(
SWS  シリコーンズ カンパニイ)       
   1.5y香  料              
         0.25fフエノニツプ(’Phe
nonip) [ニバ(Nipa)コ        
0.39上記3部分全体をはげしく撹拌しながら混合し
、全容量を水によって1009にした。皮膚に塗布した
場合真珠状の外観と柔らかな感触の柔らかなりリームが
得られた。
この発明は、勿論、この発明の思想と範囲から逸膜せず
変形と改善ができる。
【図面の簡単な説明】
第1図はハイラン(HY)の0.15モル濃度食塩水溶
液(1重量%)の粘度の剪断速度依存性を示すグラフ(
Vは粘度、Sは剪断応力)、第2図はHYの0.15モ
ル濃度食塩水溶液(1重量%)の振動試験の結果を示す
グラフ(Vは粘度、Fは位相角(phase angl
e)、G′は動的貯蔵弾性率(dynamic sto
rage moduli−)、G′は損失弾性率(1o
ss moduli))、第3図はHYの0.15モル
温度食塩水溶液(1重量%)の緩和曲線を示すグラフ、
第4図はHY(極限粘度数4,300cc/9)の0.
15モル濃度食塩水溶液(1重量%)の相当球直径の分
布を示すグラフ、第5図はHA(極r@粘度数3.56
2c’c#)の0.15モル濃度食塩水溶液(1重量%
)の相当球直径の分布を示すグラフ、第6図は本発明に
よるゼリー状生成物の粘度対剪断速度依存性を示すグラ
フ、第7図は本発明によるゼリー状生成物の振動試験の
結果を示すグラフ(Vは粘度、Fは位相角、G′は動的
貯蔵弾性率、G′は損失弾性率)、第8図は本発明によ
るゼリー状生成物の緩和曲線を示すグラフ、第9図は、
ヒアルロニダーゼで消化されたハイランのオートラジオ
グラフを示す図、第10図はハイラン中に見出された蛋
白質の電気泳動を示す図、第11図はHYの低剪断速度
領域における粘度の剪断速度依存性を示す〆   〇− へメ哀gG O ζ; ()       ’Q       ’      
 旬     唱      5N    \    
ゝ (史    )    ℃    寸    0〜  
   ζ 当僅社乎直径バNM) FIG、4

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、(a)ヒアルロン酸を含有したままの動物組織を、
    アルデヒドを含有する水性処理混合物で処理して、組織
    に含有されているヒアルロン酸の化学的修飾を行い、 (b)過剰の処理混合物を反応混合物から除去し、(c
    )前記の化学的に修飾されたヒアルロン酸の、処理され
    た動物組織からの抽出を、約16℃より低い温度で8〜
    14のアルカリ性pHの水を用いて、約6時間〜数日間
    にわたって、上記水と処理された組織との比率を処理さ
    れる組織の重量基準で約2〜5:1で行い、 (d)化学的に修飾されたヒアルロン酸を含有する抽出
    液を処理された動物組織から分離し、および (e)化学的に修飾されたヒアルロン酸を抽出液から回
    収する ことからなる化学的に修飾されたヒアルロン酸製剤を得
    る方法。 2、温度が約5℃より低い請求項1記載の方法。 3、アルカリ性pHが、無機塩基、有機塩基またはその
    混合物を用いて達成される請求項1記載の方法。 4、塩基が無機塩基である請求項3記載の方法。 5、無機塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
    水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウ
    ムである請求項4記載の方法。 6、塩基が有機塩基である請求項3記載の方法。 7、有機塩基が、トリエチルアミンまたはトリエタノー
    ルアミンである請求項6記載の方法。 8、アルデヒドがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒ
    ドまたはグリオキサールである請求項1記載の方法。 9、水性処理混合物が、アルデヒドと反応しない水混和
    性溶媒を含有する請求項1記載の方法。 10、溶媒が、低級ケトン、低級アルコールまたは非プ
    ロトン性溶媒である請求項9記載の方法。 11、溶媒が、アセトン、メチルエチルケトン、エタノ
    ール、イソプロパノール、ジメチルホルムアミド、ジメ
    チルアセトアミドまたはジメチルスルホキシドである請
    求項10記載の方法。 12、水性処理混合物が、任意に、電解質と水不溶性有
    機溶媒を含有する請求項9記載の方法。 13、電解質が酢酸ナトリウムで、水不溶性有機溶媒が
    クロロホルムである請求項12記載の方法。 14、処理混合物中の、水と水混和性溶媒との重量比率
    が1−5:4−8.5で、水とアルデヒドとの重量比率
    が1−5:0.02−1である請求項9記載の方法。 15、処理混合物が、水10〜50重量部、水混和性溶
    媒40−85重量部、アルデヒド0.2−10重量部、
    水不溶性溶媒0.5−10重量部、および電解質0〜2
    0重量部からなる請求項12記載の方法。 16、処理混合物と処理すべき組織との重量比が少なく
    とも10:1であり、処理が約4〜24時間行われる請
    求項1記載の方法。 17、動物の組織が、雄鶏、ひな鶏または雌鶏のとさか
    であり、とさかは約1〜3mm厚のスライスに切断され
    る請求項1記載の方法。 18、過剰の処理混合物が、処理された組織を溶媒もし
    くは溶媒と水の混合物で洗浄することによって、反応混
    合物から除去される請求項1記載の方法。 19、処理された組織を洗浄するのに用いる溶媒が、処
    理混合物に使用されているのと同じ溶媒である請求項1
    8記載の方法。 20、処理された組織が、抽出工程の前に、処理された
    際の重量の約25〜50%まで乾燥される請求項1記載
    の方法。 21、乾燥が、空気中または窒素中で行われる請求項2
    0記載の方法。 22、回収を、第四アンモニウム化合物で沈澱させるこ
    とによって行う請求項1記載の方法。 23、第四アンモニウム化合物が、セチルピリジニウム
    クロリドである請求項22記載の方法。 24、抽出液が、濾過、遠心分離またはデカンテーショ
    ンによって、動物組織から分離される請求項1記載の方
    法。 25、分離が濾過で行われる請求項24記載の方法。 26、濾過が2工程であり、第一工程は動物組織の断片
    を除くための目の広いメッシュによる大まかな濾過であ
    り、第二工程はセルロース材による精密濾過である請求
    項25記載の方法。 27、化学的に修飾されたヒアルロン酸を、抽出液から
    、溶媒で沈澱させ、次に、得られた、沈澱した化学的に
    修飾されたヒアルロン酸を洗浄し乾燥することによって
    回収する請求項1記載の方法。 28、沈澱させるために使う溶媒が、アセトン、エタノ
    ールまたはイソプロパノールである請求項27記載の方
    法。 29、沈澱工程で、鉱酸もしくは電解質が添加される請
    求項28記載の方法。 30、鉱酸が塩酸、硫酸またはリン酸であり、電解質が
    酢酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムである請求項29
    記載の方法。 31、化学的に修飾されたヒアルロン酸が抽出液から、
    凍結乾燥によって取出される請求項1記載の方法。 32、前記の化学的に修飾されたヒアルロン酸を、アル
    カリ性条件下、室温で約1時間、ジビニルスルホンで架
    橋反応に付すことからなる、請求項1で得た化学的に修
    飾されたヒアルロン酸を架橋する方法。 33、さらに、未切断状態の前記動物組織を、水性処理
    混合物で処理する前に、pHを12以上にするのに充分
    な量と濃度の無機のアルカリで、約5分間〜数時間洗浄
    することからなる請求項1記載の方法。 34、無機のアルカリが、0.05M〜4Mの濃度の水
    酸化ナトリウムである請求項33記載の方法。 35、さらに、抽出工程で用いた過剰のアルカリを酸を
    添加して中和して、実質的に中性のpHを要する、製品
    の用途に適切な製剤とすることからなる請求項1記載の
    方法。 36、酸が無機、有機または高分子の酸である請求項3
    5記載の方法。 37、酸が無機酸で、塩酸、硫酸またはリン酸である請
    求項36記載の方法。 38、酸が有機酸で、酢酸、クエン酸、ステアリン酸、
    パルミチン酸、ラウリン酸またはp−アミノ安息香酸で
    ある請求項36記載の方法。 39、酸が高分子酸で、ポリアクリル酸、ポリメタクリ
    ル酸、ポリビニルスルホン酸またはポリスチレンスルホ
    ン酸である請求項36記載の方法。 40、請求項35の方法で得られた製剤を含有する化粧
    用製剤。 41、請求項1の方法で製造した製品。 42、請求項33の方法で製造した製品。 43、請求項32の方法で製造した架橋された製品。 44、ヒアルロン酸ポリマーチェーンに共有結合したア
    ルデヒドの架橋基が約0.0002〜0.05重量%存
    在することを特徴とする化学的に修飾されたヒアルロン
    酸製剤。 45、殺菌され、非炎症性で、発熱性物質が存在しない
    請求項44記載の製剤。
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