KR20160015197A

KR20160015197A - 세포-비함유 합성 효소적 경로를 이용한 당의 전기로의 완전 산화

Info

Publication number: KR20160015197A
Application number: KR1020157028353A
Authority: KR
Inventors: 이 헹 퍼시벌 장; 지구앙 주
Original assignee: 이 헹 퍼시벌 장; 지구앙 주
Priority date: 2013-06-05
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2016-02-12
Also published as: JP2019033759A; US10897057B2; US20160028101A1; EP3005461B8; EP3005461A4; JP2016524800A; WO2014197702A1; KR101981370B1; US20190020049A1; EP3005461B1; CA2914504A1; CA2914504C; CN104471771A; CN104471771B; US10128522B2; EP3005461A1; DK3005461T3

Abstract

본 발명은 생체전기 (bioelectricity)의 분야에 속한다. 본 발명은 당에 저장된 화학적 에너지를 유용한 전기로 전환시킬 수 있는 에너지 생성 시스템, 방법, 및 장치를 제공한다.

Description

세포-비함유 합성 효소적 경로를 이용한 당의 전기로의 완전 산화{COMPLETE OXIDATION OF SUGARS TO ELECTRICITY BY USING CELL-FREE SYNTHETIC ENZYMATIC PATHWAYS}

[관련 출원에 대한 상호참조]

본 출원은 2013년 6월 5일자로 출원된 미국 가출원 제61/831,346호의 이익을 주장하며, 그의 내용은 완전히 본 명세서에 참고로서 포함된다.

본 발명은 생체전기 (bioelectricity)의 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 다양한 재생가능한 당에 저장된 화학적 에너지를 유용한 전기로 전환시킬 수 있는 에너지 발생 시스템, 방법, 및 장치를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 효소적 연료 전지를 사용하여 6탄당 및 5탄당으로부터의 화학적 에너지를 전기로 전환하기 위한 신규한 합성 효소적 경로, 및 공학적 및/또는 새로 발견된 기능을 갖는 몇몇 주요 효소들에 관한 것이다.

배터리는 전기 저장 장치이다. 재충전 가능한 배터리가 현재 이용 가능하다. 그러나 이러한 재충전 가능한 배터리의 에너지 저장 밀도는 수소 또는 액체 연료의 에너지 저장 밀도보다 훨씬 더 낮다 (도 1, 패널 A 및 B). 더 높은 에너지 저장 밀도, 이들의 전체 수명에 걸쳐서 더 적은 비용, 감소된 환경적 영향, 및 증가한 안전성을 갖는 더 우수한 재충전 가능한 배터리에 대한 명백한 필요성이 존재한다 (도 1, 패널 C).

효소적 연료 전지 (EFCs)는 연료 내 화학적 에너지를 전기로 전환하기 위해 효소를 이용하는 생물학적 연료 전지의 유형이다. EFCs는, 이들이: 1) 화학적 배터리보다 대략 10-100배 더 높은 에너지 저장 밀도를 가지며; 2) 생분해성 및 중금속과 값비싼 희금속의 제거로 인해 더욱 환경 친화적이기 때문에, 대개는 배터리보다 더 우수하다. EFCs (도 2, 패널 B)는 직접 메탄올 연료 전지 (directed methanol fuel cells, DMFCs) (도 2, 패널 A)와 몇 가지 공통점을 갖는다. 그러나, DMFCs와는 달리, 효소적 연료 전지는 양극 (애노드, anode)촉매로서 값비싼 백금을 필요로 하지 않고, 이들은 효소의 고 선택성으로 인해 나피온 막을 사용하지 않을 수 있다. 또한, EFCs에 사용된 당은 DMFCs에서의 메탄올에 비해 비용이 덜 들고, 비-독성이며, 난연성이며, 이때 당 용액의 에너지 밀도는 1M 메탄올 용액의 에너지 밀도보다 더 높다. 효소적 연료 전지는 일반적으로 효소-로딩된 (효소-개질된) 양극 (애노드, anode)및 효소-로딩된 (효소-개질된) 음극 (캐소드, cathode)으로 이루어진다 (도 2, 패널 B).

EFCs에서, 연료가 양극에서 산화될 때 전자가 발생된다. 그 후에 전자는 외부 로딩 (external load)을 통해 양극 (애노드)으로부터 음극 (캐소드)으로 흘러간다. 양성자가 양극 반응에서 (전자와 함께) 동시에 생성되고 고분자 분리막 (polymer separator)을 통과해 음극 (캐소드)으로 이동하여 전자 흐름을 보상한다. EFCs가 가진 가장 큰 난제 중 하나는 전기발생(electricity generation)을 위해 저비용으로 가장 풍부한 당으로부터 대부분 또는 모든 화학적 에너지의 추출이다. 공기 중 연소에 의해 열 에너지원으로서, 또는 살아있는 유기체 (예컨대, 미생물, 동물)에서 산화환원 효소에 의해 발생된 NAD(P)H를 통해 ATP의 생산을 위한 화학적 에너지원으로서 당을 이용하는 방법을 제외하고는, 당의 모든 에너지를 이용하는 방법은 지금까지 개발되지 않았다. 당의 화학적 에너지의 대부분을 직접적으로 전기 (전자) 에너지로서 효과적으로 활용할 수 있는 방법이 없다.

일 실시양태에서, 본 발명은 폴리포스페이트 또는 ATP 또는 포스페이트와 반응되는 6탄당 단량체 또는 올리고헥소스 또는 폴리헥소스로부터의 하나 이상의 6탄당과의 화학적 반응으로부터 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 생성하는 단계로서, 여기서: (i) 폴리포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 폴리포스페이트-글루코스 포스포트랜스퍼라제의 존재하에서 수행되고; 또는 (ii) ATP를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 헥소키나제의 존재하에서 수행되고, 여기서 ATP는 폴리포스페이트 키나제의 존재하에서 ADP와 폴리포스페이트의 반응에 의해 생성되며; (iii) 유리 포스페이트가 사용되는 경우, 상기 화학적 반응이 글루칸 포스포릴라제 (예컨대, 전분 포스포릴라제, 말토스 포스포릴라제, 수크로스 포스포릴라제, 셀로비오스 포스포릴라제, 셀로덱스트린 포스포릴라제) 및 포스포글루코뮤타제의 존재하에서 수행되고; 상기 G6P와 6PG를 NAD⁺ 또는 그의 유사체 (산화된 형태로는 생체모사체 (biomimics)로 불림)와 수중에서 반응시켜 NADH 또는 그의 환원된 생체모사체를 수득하는 단계; 및 상기 NADH 또는 그의 환원된 생체모사체를 양극 위 그의 표면에서 산화시켜 전자를 발생하는 단계를 포함하는 헥소스 당으로부터 전자를 생성하는 방법을 제공한다. 일 실시양태에서, 리불로스 5-포스페이트의 산물은 비-산화적 펜토스 포스페이트 경로, 해당과정 및 글루코스신생합성 (gluconeogenesis)의 하이브리드 경로를 통해 G6P로 전환된다.

다른 실시양태에서, 상기 방법은 NAD를 대체하기 위해 NAD 생체모방체 (biomimetics) (도 7. 화합물 A-E)를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 NAD 생체모사체를 이용할 수 있는 조작된 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제 및 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 당으로서 글루코스를 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 글루코스는 폴리포스페이트 글루코키나제 또는 헥소키나제를 통해 글루코스 6-포스페이트로 전환된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은: (i) 글루코스 (자일로스) 이소머라제를 이용한 프럭토스의 글루코스로의 전환; 또는 (ii) 소르비톨 디히드로게나제 및 알데히드 리덕타제를 이용한 프럭토스의 글루코스로의 전환으로부터 글루코스를 생성하는 것을 추가로 포함한다.

다른 실시양태에서, 상기 방법은: (i) 만노스 이소머라제를 이용하여 만노스를 프럭토스로 전환한 다음, 일 실시양태에서 상기 프럭토스-이용 경로로 진입하고; (ii) 폴리포스페이트-글루코스 만노스 포스포트랜스퍼라제 및 포스포만노스 이소머라제를 이용하여 만노스를 프럭토스 6-포스페이트 (F6P)로 전환하고, 일 실시양태에서, 상기 산물 F6P는 변형된 펜토스 포스페이트 경로로 진입하고; 또는 (iii) 폴리포스페이트 키나제, 헥소키나제, 및 포스포만노스 이소머라제를 이용하여 만노스를 프럭토스-6-포스페이트로 전환한 다음, 일 실시양태에서, 상기 산물 F6P는 변형된 펜토스 포스페이트 경로로 진입함으로써 프럭토스 또는 프럭토스 6-포스페이트를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 당으로서 전분 또는 말토덱스트린을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 G6P 생성을 위해 포스페이트 및 포스포글루코뮤타제 및 전분 또는 말토덱스트린 포스포릴라제를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은: 폴리포스페이트 또는 ATP 또는 포스페이트와 반응되는 6탄당 단량체 또는 올리고헥소스 또는 폴리헥소스로부터의 하나 이상의 6탄당과의 반응으로부터 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 생성할 수 있고, 상기 G6P를 NAD⁺ 또는 그의 유사체와 수중에서 반응시켜 NADH 또는 그의 유사체 (생체모방체)를 수득할 수 있는 용액으로서, 여기서: (i) 폴리포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 폴리포스페이트-글루코스 포스포트랜스퍼라제의 존재하에서 수행되고; 또는 (ii) ATP를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 헥소키나제의 존재하에서 수행되고, 여기서 ATP는 폴리포스페이트 키나제의 존재하에서 ADP와 폴리포스페이트를 반응시켜 생성되고; (iii) 유리 포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 글루칸 포스포릴라제 및 포스포글루코뮤타제의 존재하에서 수행되는 것인 용액; 효소-개질된 양극; 효소-개질된 또는 표준 백금 참조 음극; 및 전해질을 포함하는 당 배터리를 제공하고, 상기 효소-개질된 양극 또는 양극은 합성 경로에서 6탄당 및 일부 효소를 포함하는 용액과 접촉하고 상기 음극 및 효소-개질된 양극 둘 모두는 전해질과 접촉한다.

일부 실시양태에서, 전해질은 (Mg⁺⁺, Mn⁺⁺)와 같은 금속 이온, NAD⁺ 또는 NADH 또는 그의 생체모사체, 및 티아민 피로포스페이트를 함유하는 pH-조절 완충액 (예컨대, HEPES)으로 제조된다. 일부 실시양태에서, 상기 배터리는 전자를 발생하기 위해 양극 위 그의 표면에서 NADH 또는 그의 생체모방체의 산화를 가능케 하도록 작동 가능하게 구성된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은: 폴리포스페이트 또는 ATP 또는 포스페이트와 반응되는 6탄당 단량체 또는 올리고헥소스 또는 폴리헥소스로부터의 하나 이상의 6탄당의 화학적 반응으로부터 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 생성할 수 있고, 상기 G6P를 NAD⁺ 및 산화된 생체모방체와 수중에서 반응시켜 NADH 및 환원된 생체모방체를 수득할 수 있는 용액을 포함하는 연료로서, 여기서: (i) 폴리포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 폴리포스페이트-글루코스 포스포트랜스퍼라제의 존재하에서 수행되고; 또는 (ii) ATP를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 헥소키나제의 존재하에서 수행되고, 상기 ATP가 폴리포스페이트 키나제의 존재하에서 ADP와 폴리포스페이트를 반응시켜 생성되고; (iii) 유리 포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 글루칸 포스포릴라제 및 포스포글루코뮤타제의 존재하에서 수행되는 것인 연료; NADH 및 그의 생체모사체를 양극에서 산화시켜 전자를 생성하고, 전자를, 예컨대 외부 회로를 통해 음극으로 전자를 전달하도록 작동 가능하게 구성된 연료 전지를 포함하는 에너지 생성 시스템을 제공한다. 일 실시양태에서, 음극 위의 촉매는 양성자 및 산소를 물로 전환시킨다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 펜토스 당으로부터 전자를 생성하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은: 폴리포스페이트 또는 ATP와 반응되는 5탄당 단량체의 화학적 반응으로부터 자일룰로스 5-포스페이트 (X6P)를 생성하는 단계로서, 여기서: (i) 폴리포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 자일로스 이소머라제 및 폴리포스페이트 자일룰로키나제의 존재하에서 수행되고; 또는 (ii) ATP를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 자일로스 이소머라제 및 ATP-기반 자일룰로키나제의 존재하에서 수행되고, 여기서 상기 ATP는 폴리포스페이트:AMP 포스포트랜스퍼라제 및 폴리포스페이트-비의존성 아데닐레이트 키나제의 조합의 존재하에서 ADP와 폴리포스페이트를 반응시켜 생성된 것인, 단계; G6P의 생성을 위해 펜토스 포스페이트 경로를 진입하는 단계; 상기 G6P를 NAD⁺ 및 산화된 생체모사체와 수중에서 반응시켜 NADH 및 환원된 생체모사체를 수득하는 단계; 상기 NADH 및 환원된 생체모사체를 양극 위 그의 표면에서 산화시켜 전자를 생성하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 당 배터리를 제공하는데, 이는: 폴리포스페이트 또는 ATP와 반응되는 5탄당 단량체로부터 자일룰로스 5-포스페이트를 생성할 수 있고, 비-산화적 펜토스 포스페이트 경로를 통해 글루코스 6-포스페이트를 생산하며, 상기 G6P가 NAD⁺ 또는 그의 유사체와 수중에서 반응하여 NADH 또는 그의 유사체 (생체모방체)를 수득하기 위한 용액으로서, 여기서: a. 폴리포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응은 폴리포스페이트-자일룰로스 키나제의 존재하에서 수행되고; 또는 b. ATP를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응은 자일룰로키나제의 존재하에서 수행되고, 여기서 상기 ATP는 폴리포스페이트 키나제의 존재하에서 ADP와 폴리포스페이트를 반응시켜 생성된 것인, 용액; 효소-개질된 양극 또는 양극; 효소 개질된 또는 표준 백금 참조 음극; 및 전해질을 포함하고, 여기서 상기 효소-개질된 양극 또는 양극은 합성 경로에서 5탄당 및 일부 효소를 포함하는 상기 용액과 접촉하고 상기 음극 및 효소-개질된 양극 둘 모두는 상기 전해질과 접촉한다.

일부 실시양태에서, 전해질은 (Mg⁺⁺ 또는 Mn⁺⁺)과 같은 금속 이온, NAD⁺ 또는 NADH 또는 그의 생체모사체, 및 티아민 피로포스페이트를 함유하는 pH-조절 완충액 (예컨대, HEPES)으로 구성된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 에너지 생성 시스템을 제공하는데, 이는: 폴리포스페이트 또는 ATP와 반응되는 5탄당 단량체로부터 자일룰로스 5-포스페이트를 생성하고, 비-산화적 펜토스 포스페이트 경로를 통해 G6P를 생산하며, 상기 G6P를 NAD⁺ 및 그의 생체모방체와 수중에서 반응시켜 NADH 및 환원된 생체모사체를 수득하기 위한 용액을 포함하는 연료로서, 여기서: (i) 폴리포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 폴리포스페이트-자일룰로키나제의 존재하에서 수행되고; 또는 (ii) ATP를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 자일룰로키나제의 존재하에서 수행되고, 여기서 상기 ATP는 폴리포스페이트 키나제의 존재하에서 ADP와 폴리포스페이트를 반응시켜 생성되는 것인, 연료; 양극에서 NADH 및 그의 생체모사체를 산화시켜 전자를 생성하고 상기 전자를 음극에 전달하도록 작동 가능하게 구성된 연료 전지; 음극으로부터 상기 전자를 전기로 전환하기 위한 발전기를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 당으로부터 전자를 생성하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은: 당으로부터 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 생성하는 단계; 및 상기 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 산화시켜 양극에서 전자를 생성하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체는 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 리불로스 5-포스페이트 3-에피머라제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 알돌라제, 프럭토스 1,6-비스포스파타제, 및 포스포글루코스 이소머라제를 포함하는 그룹의 효소를 사용하여 생성된다.

일부 실시양태에서, 상기 방법은 당으로 헥소스 또는 펜토스 당을 포함한다.

상기 방법의 일 실시양태에서, 상기 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체는 다이아포라제에 의해 산화된다. 상기 방법의 다른 실시양태에서, NADH 또는 이의 환원된 생체모사체는 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상의 존재하에서 산화된다. 일부 실시양태에서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상은 양극 표면에 고정된다. 다른 실시양태에서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상은 양극 구획 내에 유리된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 당 배터리를 제공하는데, 이는: 당, 효소, 및 전해질을 포함하는 용액; 양극; 및 음극을 포함하고, 여기서 상기 양극 및 음극은 상기 용액과 접촉하고; 상기 전해질은 금속 이온, NAD⁺ 또는 NADH 또는 이의 생체모사체, 및 티아민 피로포스페이트를 함유하는 pH-조절 완충액을 포함하고, 상기 효소는 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 리불로스 5-포스페이트 3-에피머라제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 알돌라제, 프럭토스 1,6-비스포스파타제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 NADH 또는 이의 생체모사체를 산화시킬 수 있는 효소를 포함한다.

일부 실시양태에서, 당 배터리는 당으로 헥소스 또는 펜토스 당을 포함한다. 상기 당 배터리중 일부 실시양태에서, NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 산화시킬 수 있는 효소는 다이아포라제이다.

일부 실시양태에서, 당 배터리는 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상은 양극 표면에 고정된다. 다른 실시양태에서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상은 양극 구획 내에 유리된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 발전용 시스템을 제공하는데, 이는: 당, 효소, 및 전해질을 포함하는 용액; 양극 및 음극을 포함하는 연료 전지; 및 발전기를 포함하고, 여기서 상기 용액과 발전기는 상기 연료 전지와 접촉하고; 상기 전해질은 금속 이온, NAD⁺ 또는 NADH 또는 이의 생체모사체, 및 티아민 피로포스페이트를 함유하는 pH-조절 완충액을 포함하고; 및 상기 효소는 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 리불로스 5-포스페이트 3-에피머라제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 알돌라제, 프럭토스 1,6-비스포스파타제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 NADH 또는 이의 생체모사체를 산화시킬 수 있는 효소를 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 시스템은 당으로 헥소스 또는 펜토스 당 또는 이의 혼합물을 포함한다. 상기 시스템의 일부 실시양태에서, NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 산화시킬 수 있는 효소는 다이아포라제이다.

일부 실시양태에서, 상기 시스템은 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상은 양극 표면 위에 고정된다. 다른 실시양태에서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체중 하나 이상은 양극 구획 내에 유리된다.

본 발명은 당에 저장된 화학적 에너지를 전기로 전환하기 위한 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 효소적 연료 전지를 사용하여 6탄당 및 5탄당으로부터의 화학적 에너지를 전기로 전환하기 위한 합성 (인위적) 효소적 경로를 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 당 배터리는 화학적 에너지를 전기로 전환하기 위해 사용된다. 본 발명의 많은 이점 중 하나는 본원에 기술된 당 배터리가 현재 효소적 연료 전지 및 재충전 가능한 배터리보다 약 10배 이상 더 높을 수 있는 에너지 밀도를 갖는다는 점이다. 본 발명의 당 배터리의 다른 이점에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 저비용 공급원료의 사용, 온건한 반응 조건 및 저비용 촉매 (예컨대, 효소), 높은 에너지 저장 밀도, 낮은 안정성 우려 (예컨대, 폭발 및 가연성 모두 없음), 모든 재료 및 촉매의 풍부한 공급, 신속한 보충 (refilling), 제로 탄소 방출, 환경 친화적, 및 매우 다양한 적용에 있어서의 유용성이 포함된다.

본 발명의 또 다른 이점은, 낮은 에너지 저장 밀도가 문제가 되는 일차 및 이차 배터리와는 달리, 본원에 기술된 연료 전지가 훨씬 더 높은 밀도를 갖는다는 점이다. 효소적 연료 전지는 화학적 화합물에 저장된 화학적 에너지를 전기로 전환하기 위해 효소를 이용할 수 있는 연료 전지의 유형이다. 6탄당 단량체 (예컨대, 글루코스, 프럭토스, 만노스) 및 이의 유도체 (예컨대, 말토스, 셀로덱스트린, 수크로스, 락토스, 셀로비오스, 셀로덱스트린, 셀룰로스, 전분) 및 자일로스 및 그의 유도체 (예컨대, 헤미셀룰로스, 자일란)는 가장 풍부한 탄수화물이고 따라서 훌륭한 에너지원이다. 본 발명은 다수의 효소 캐스케이드에 의해 매개되는 부분 또는 완전 산화를 통해 이러한 6탄당 및 5탄당을 전기로 전환할 수 있는 다수의 신규한 비-자연적 합성 효소적 경로를 제공한다. 상기 당 배터리는 높은 에너지 저장 밀도를 갖고, 생분해 가능하고 신속히 보충할 수 있으며, 낮은 폭발 위험성을 가지고 있기 때문에, 이들은 대부분의 일차 배터리, 이차 배터리 및 직접 메탄올 연료 전지를 성공적으로 대체할 수 있다.

당 배터리를 위한 바람직한 연료에는 단당류 (예컨대, 글루코스, 만노스, 프럭토스, 및 갈락토스), 올리고당 (예컨대, 말토스, 말토덱스트린, 수크로스, 셀로비오스, 셀로덱스트린, 락토스), 및 다당류 (예컨대, 셀룰로스, 전분, 및 글리코겐), D-자일로스, L-아라비노스, 헤미셀룰로스, 자일란, 및 이들의 임의의 조합으로부터의 6탄당이 포함된다. 그 결과물은 전기이다. 본 발명의 실시양태에 따른 예시적 당 배터리의 전형적인 개요를 도 3 및 도 4에 나타낸다. 본 발명은 효소적 연료 전지를 사용하여 6탄당에 저장된 화학적 에너지를 전기로 전환할 수 있는 몇몇 신규한 캐스케이드 효소적 경로를 제공한다.

전분은 자연계에서 가장 광범위하게 사용되는 에너지 저장 화합물이다. 전분의 이화작용은 그의 단량체 글루코스와는 달리 살아있는 세포에서 화학적 에너지의 느리고 거의 일정한 방출을 허용한다. 부분적으로 가수분해된 전분 단편인, 말토덱스트린은 글루코스보다 11% 더 높은 에너지 밀도를 가지고 있기 때문에, 말토덱스트린은 EFCs에서 글루코스보다 우수한 연료이다. 글루코스가 그의 효소적 가수분해의 주된 산물이고, 저비용 선형 말토덱스트린이 셀룰로스로부터 제조될 수 있기 때문에 말토덱스트린은 또한 비용이 덜 든다. 동등한 중량의 말토덱스트린은 글루코스보다 훨씬 낮은 삼투압을 갖는다. 더욱이, 이는 폐쇄형 EFCs에서 더욱 안정한 발전을 위해 서서히 대사되는 글루코스 1-포스페이트를 제공할 수 있다. 말토덱스트린은 EFCs용 연료로서 사용되어 왔지만, 본 발명 이전까지는 글루코스 단위당 단지 2개의 전자가 생성될 수 있었다.

경로

본 발명의 경로는 특정 당의 저장된 에너지를 유용한 전기로 전환하기 위한 특정 효소를 포함한다. 당 연료의 완전한 이용은 NAD⁺ 또는 이의 생체모방체 유사체 (또는 생체모사체)의 존재하에서 G6P (글루코스 6-포스페이트)를 산화시킴으로써 가능하다. 본 발명의 실시양태의 이점은 직접적으로 G6P 및 X5P (자일룰로스 5-포스페이트)가 아닌, 출발 물질로 당을 이용할 수 있는 능력을 포함한다. 이는 G6P 및 X5P의 저비용 공급원을 제공한다. 상기 출발 물질 (예컨대, 연료로서 당)은, 이전에는 달성되지 않았지만, NAD⁺ 또는 이의 생체모사체의 NADH 또는 이의 생체모사체로의 완전 전환과 결부된 해당과정 및 글루코스신생합성 경로로부터의 효소와 함께 변형된 펜토스 포스페이트 경로를 이용함으로써 효율적으로 사용된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 당 배터리를 위한 효소적 경로의 신규한 조합을 제공한다. 이들 실시양태에서, 상기 신규한 합성 효소적 경로는 본원에서 모듈로 언급되는 3개 부분을 포함한다. 모듈 1은 임의의 6탄당으로부터 저비용 글루코스 6-포스페이트를 생성한다. 모듈 2는 NADH 또는 이의 생체모사체가 해당과정 및 글루코스신생합성 경로로부터의 효소와 함께 변형된 펜토스 포스페이트 경로로부터 생성되게 한다 (G6P + 7 H₂O + 12 NAD⁺ → 12 NADH + 12 H⁺ + 6 CO₂). 모듈 3은 환원된 NADH 또는 이의 생체모사체가 전자 생성을 위해 양극의 표면 위에서 산화되게 한다. 도 3 및 하기 표 1은 이러한 개요를 증명한다.

[표 1]

변형된 펜토스 포스페이트 경로

일 실시양태에서, 모듈 1은 하기에 나타난 바와 같은 단일 경로를 포함한다. 다른 실시양태에서, 모듈 1은 효소적 연료 전지에서 경로들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명은 포스페이트 공여자로서 폴리포스페이트를 사용하여 값비싼 ATP의 소모 없이 임의의 단량체 헥소스로부터 G6P를 생성할 수 있고, 그의 재생이 수반되는 경로를 제공한다.

경로 1

일 실시양태에서, 경로는 경로 1로서 제공된다. 경로 1은 글루코스로 개시하는데, 이는 올리고당 및 다당류의 간단한 가수분해 또는 인산화에 의해 생성될 수 있다. G6P는 폴리포스페이트-글루코키나제 (PPGK, EC 2.7.1.6, 폴리포스페이트-글루코스 포스포트랜스퍼라제)에 의해 "글루코스 + (P_i)_n → G6P + (P_i)_n-1"로서, 또는 헥소키나제 (HK, EC2.7.1.1)에 의해 "글루코스 + ATP → G6P + ADP"로서 생성될 수 있는데, 여기서 ATP는 폴리포스페이트 키나제 (PPK, EC 2.7.4.1)에 의해 또는 폴리포스페이트:AMP 포스포트랜스퍼라제 (PPT, EC 2.7.4.B2) 및 폴리포스페이트-비의존성 아데닐레이트 키나제 (ADK, EC 2.7.4.3)의 조합에 의해 ADP + (P_i)_n → ATP + (P_i)_n-1로서 폴리포스페이트를 소모하면서 생성될 수 있다. G6P의 완전 산화 후, 유리 포스페이트는 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 폴리포스페이트를 생산하기 위해 재생될 수 있다.

경로 2

다른 실시양태에서, 경로는 경로 2로서 제공된다. 경로 2는 프럭토스로 개시한다. 프럭토스는 글루코스 (자일로스) 이소머라제 (EC 5.3.1.5)에 의해 글루코스로 전환될 수 있고, 그 후에 글루코스는 상기 경로 (경로 1)을 통해 처리된다. 다른 실시양태에서, 글루코스는 공역 (coupled) 효소 소르비톨 디히드로게나제 (EC 1.1.1.14) 및 알데히드 리덕타제 (EC 1.1.1.21)에 의해 생성될 수도 있다.

경로 3

다른 실시양태에서, 경로는 경로 3으로서 제공된다. 경로 3은 만노스로 개시한다. 일 실시양태에서, 만노스는 만노스 이소머라제 (EC 5.3.1.7)에 의해 프럭토스로 전환될 수 있고, 그 후에 프럭토스는 경로 2를 통해 처리된다. 다른 실시양태에서, 만노스는 2종의 효소 (폴리포스페이트-글루코스 만노스 포스포트랜스퍼라제, EC 2.7.1.63 및 포스포만노스 이소머라제, EC 5.3.1.8)에 의해 프럭토스 6-포스페이트로 전환될 수 있고, 그 후에 프럭토스 6-포스페이트는 해당과정 및 글루코스신생합성 경로로부터의 효소와 함께 변형된 펜토스 포스페이트 경로 (변형된 PPP)를 통해 처리된다. 다른 실시양태에서, 프럭토스 6-포스페이트는 3종의 효소 -- 폴리포스페이트 키나제 (EC 2.7.4.1), 헥소키나제 (EC 2.7.1.1) 및 포스포만노스 이소머라제 (EC 5.3.1.8)를 사용하여 성생되고, 그 결과 만노스 + (P_i)_n → 프럭토스 6-포스페이트 +(P_i)_n-1의 전체 반응을 야기한다.

경로 4

다른 실시양태에서, 경로는 경로 4로서 제공된다. 경로 4는 갈락토스로 개시한다. 5종의 효소는 함께 하기의 전체 반응으로 갈락토스를 글루코스 6-포스페이트로 전환한다: 갈락토스 + (P_i)_n → 글루코스 6-포스페이트 + (P_i)_n-1. 이들 5종의 효소는 폴리포스페이트 키나제 (EC 2.7.4.1), 갈락토키나제 (EC 2.7.16), UDP-글루코스-헥소스-1-포스페이트 유리디닐트랜스퍼라제 (EC 2.7.7.12), UDP-갈락토스-4-에피머라제 (EC 5.1.3.2), 및 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2)이다.

폴리포스페이트 재생은 화학적 및/또는 생물학적 접근법에 의해 수행될 수 있다. 유리 포스페이트 이온은, 이로 제한되는 것은 아니지만, Mg₃(PO4)₂ 및 Ca₃(PO4)₂를 비롯한 불용성 염을 형성함으로써 침전될 수 있다. 폴리포스페이트는 농축 H₂SO₄를 첨가하고 이어서 가열에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 마이크로루나투스 포스포보루스 (Microlunatus phosphovorus)는 글루코스-제한된 조건하에서 유리 포스페이트를 흡수하고 세포 내에 폴리포스페이트를 축적한다.

본 발명은 폴리포스페이트 및 그의 재생을 이용함으로써 값비싼 ATP의 소모 없이, 그리고 각각의 포스포릴라제를 이용함으로써 기질 인산화 없이 올리고당으로부터 G6P를 생성할 수 있는 경로를 제공한다.

경로 5

다른 실시양태에서, 경로는 경로 5로서 제공된다. 경로 5는 말토덱스트린으로 개시한다. DP (중합도) = n을 갖는 말토덱스트린은 말토덱스트린 포스포릴라제 (EC 2.4.1.1) 및 말토스 포스포릴라제 (EC 2.4.1.8)에 의해 (n-1) 글루코스-1-포스페이트 및 글루코스로 전환될 수 있다. 글루코스 1-포스페이트는 포스포글루코뮤타제 (EC 5.4.2.2)에 이이서 해당과정 및 글루코스신생합성 경로로부터의 효소를 이용한 PPP에 의해 생산되고, 글루코스는 경로 1을 통해 처리된다.

경로 6

다른 실시양태에서, 경로는 경로 6으로서 제공된다. 경로 6은 수크로스로 개시한다. 수크로스는 수크로스 포스포릴라제 (EC2.4.1.7)에 의해 글루코스 1-포스페이트 및 프럭토스로 전환될 수 있다. 프럭토스 및 글루코스 1-포스페이트는 각각 경로 2를 통해서 그리고 포스포글루코뮤타제 (EC　5.4.2.2)에 의해 처리될 수 있다.

경로 7

다른 실시양태에서, 경로는 경로 7로서 제공된다. 경로 7은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 셀로비오스 및 셀로덱스트린을 비롯한 수용성 셀로덱스트린으로 개시한다. DP = n을 갖는 셀로덱스트린은 셀로비오스 포스포릴라제 (EC 2.4.1.20) 및 셀로덱스트린 포스포릴라제 (EC　2.4.1.49)에 의해 (n-1) 글루코스 1-포스페이트 및 글루코스로 전환될 수 있다. 나머지 경로는 경로 5와 동일할 수 있다.

본 발명은 또한 가수분해 후 올리고당 또는 다당류로부터 단량체 헥소스를 생성할 수 있는 다양한 예시적인 경로를 제공하고, 이는 그 후에 경로 1-7에 의해 처리된다.

경로 8

다른 실시양태에서, 경로는 경로 8로서 제공된다. 경로 8은 수크로스로 개시한다. 수크로스는 수크라제 (EC 3.2.1.10)에 의해 글루코스 및 프럭토스로 가수분해될 수 있다. 상기 산물은 각각 경로 1 및 2로 진입할 수 있다.

경로 9

다른 실시양태에서, 경로는 경로 9로서 제공된다. 경로 9는 락토스로 개시한다. 일 실시양태에서, 락토스는 락타제 (EC 3.2.1.23)에 의해 글루코스 및 갈락토스로 가수분해될 수 있다. 다른 실시양태에서, 락토스는 락토스 포스포릴라제에 의해 갈락토스 1-포스페이트 및 글루코스로 인산화될 수 있다. 상기 산물은 경로 1 및 4로 진입할 수 있다.

경로 10

다른 실시양태에서, 경로는 경로 10으로서 제공된다. 경로 10은 전분, 글리코겐, 말토스 또는 말토덱스트린으로 개시한다. 상기 전분 또는 글리코겐은 알파-아밀라제 (EC　3.2.1.1) 및 기타 전분 가수분해 효소, 예컨대 이소아밀라제 (EC3.2.1.68), 풀루라나제 (EC3.2.1.41)를 이용하여 말토덱스트린 및 말토스로 부분적으로 가수분해될 수 있다. 전분, 말토스 또는 말토덱스트린은 글루코아밀라제 (EC 3.2.1.3), 알파-아밀라제 (EC　3.2.1.1), 및 기타 전분 가수분해 효소에 의해 글루코스로 가수분해될 수 있다. 글루코스는 경로 1로 진입할 수 있다.

경로 11

다른 실시양태에서, 경로는 경로 11로서 제공된다. 경로 11은 불용성 셀룰로스 또는 전처리 바이오매스로 개시한다. 상기 불용성 셀룰로스 또는 전처리 바이오매스는 개별적인 엔도글루카나제 (EC 3.2.1.4) 및/또는 셀로비오히드롤라제 (EC 3.2.1.74) 또는 이들의 조합에 의해 수용성 셀로덱스트린으로 가수분해될 수 있다. 상기 가용성 셀로덱스트린 및 글루코스의 산물은 경로 1 및 7로 진입할 수 있다.

본 발명은 다당류 (전분, 셀룰로스, 또는 글리코겐)로부터 글루코스 1-포스페이트를 생성할 수 있고 이들의 개별적인 글루칸 포스포릴라제 및 부속 효소에 의해 인산화될 수 있는 경로를 제공한다.

경로 12

다른 실시양태에서, 경로는 경로 12로서 제공된다. 경로 12는 DP = n을 갖는 선형 전분 (아밀로스) 또는 이들의 짧은 단편으로 개시한다. (n-1) 글루코스 1-포스페이트 및 글루코스는 전분 포스포릴라제 (EC 2.4.1.1) 및 말토스 포스포릴라제 (EC 2.4.18)에 의해 전분 및 유리 포스페이트로부터 생성될 수 있다. 포스포글루코뮤타제에 의해 글루코스 1-포스페이트의 글루코스 6-포스페이트로의 전환 후, G6P는 전기발생을 위해 PPP로 진입한다.

경로 13

다른 실시양태에서, 경로는 경로 13으로서 제공된다. 경로 13은 분지형 전분 (아밀로펙틴) 또는 글리코겐으로 개시한다. 상기 선형 사슬 내 대부분의 글루코스 단위는 전분 또는 글리코겐 포스포릴라제 (EC 2.4.1.1)에 의해 글루코스 1-포스페이트를 생성하기 위해 제거될 수 있다. 분지점의 말단에서, 전분 탈분지 (debranching) 효소 또는 풀루라나제 (EC 3.2.1.41)가 추가의 전환을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 소수 산물인, 글루코스는 경로 1을 통해 G6P를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 자일룰로스 5-포스페이트를 생성하기 위해 자일로스 및 ATP 또는 폴리포스페이트를 이용하는 경로를 제공하는데, 이는 펜토스 포스페이트 경로와, 해당과정 및 글루코스신생합성 내 효소를 통해 G6P로 전환될 것이다. 그 후에 G6P는 경로 1을 통해 NADH 또는 이의 생체모사체를 생성하기 위해 소모된다.

경로 14

다른 실시양태에서, 경로는 경로 14로서 제공된다. 경로 14는 자일로스로 개시한다. 자일로스는 자일로스 이소머라제 (XI, EC 5.3.1.5)에 의해 자일룰로스로 전환되고, 그 후에 ATP를 이용하여 자일룰로키나제 (XK, EC 2.7.1.17)에 의해 자일룰로스 5-포스페이트로 전환된다. ATP는 폴리포스페이트 키나제 (PPK, EC 2.7.4.1) 또는 폴리포스페이트:AMP 포스포트랜스퍼라제 (PPT, EC 2.7.4.B2) 및 폴리포스페이트-비의존성 아데닐레이트 키나제 (ADK, EC 2.7.4.3)의 조합에 의해 ADP + (P_i)_n → ATP + (P_i)_n- ₁으로 재생될 수 있다. 산물 자일룰로스 5-포스페이트는 비-산화적 펜토스 포스페이트 경로를 통해 G6P로 전환될 수 있다. 그 후에 G6P는 경로 1을 통해 NADH 또는 이의 생체모사체를 생성하기 위해 소모된다.

경로 15

다른 실시양태에서, 경로는 경로 15로서 제공된다. 경로 15는 자일로스로 개시한다. 자일로스는 자일로스 이소머라제 (XI, EC 5.3.1.5)에 의해 자일룰로스로 전환되고, 그 후에 폴리포스페이트를 이용하는 폴리포스페이트 자일룰로키나제 (PPXK, EC NA)에 의해 자일룰로스 5-포스페이트로 전환된다. 상기 산물 자일룰로스 5-포스페이트는 비-산화적 펜토스 포스페이트 경로를 통해 G6P로 전환될 수 있다. 그 후에 G6P는 경로 1을 통해 NADH 또는 이의 생체모사체를 생성하기 위해 소모된다.

자일룰로키나제는 ATP의 도움으로 자일룰로스를 자일룰로스-5-포스페이트로 전환시키는 것을 담당하는 효소이다. 본 발명자들은 야생형 T. 마리티마 (T. maritima) 자일룰로키나제가 포스페이트 공여자로서 ATP가 아닌 폴리포스페이트를 이용함으로써 뒤섞인 (promiscuous) 활성을 가짐을 발견하였다. 그 결과, 경로 15는 직접적으로 작동할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 합성 경로는 4개의 기능적 모듈로 구성된다: 알파-글루칸 포스포릴라제 및 포스포글루코뮤타제에 의해 매개되는 말토덱스트린으로부터 글루코스 6-포스페이트 (G6P) 생성 (방정식 1); 2종의 NAD-의존성 G6PDH 및 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제 (6PGDH)에 의해 매개되는 G6P로부터 2 NADH 생성 (방정식 2); NADH 당 2개의 전자를 생성하는 DI를 통해 VK₃로의 NADH 전기-산화 (방정식 3); 및 펜토스 포스페이트, 해당과정, 및 글루코스신생합성 경로의 효소를 포함하는 하이브리드 경로를 통해 1 몰의 리불로스 5-포스페이트로부터 5/6 몰의 G6P 재생 (방정식 4). 방정식 1-4의 조합을 위한 전체 양극 반응은 결과적으로 대략 방정식 5가 된다. 명백하게, 말토덱스트린으로부터의 각각의 글루코스 단위는 이 드 노보 (de novo) 경로 (방정식 5)를 통해 양극에서 24개 전자를 생성할 수 있다.

(C₆H₁₀O₅)_n + P_i → G6P + (C₆H₁₀O₅)_n- ₁ [1]

G6P + H₂O + 2NAD⁺ → 리불로스-5-포스페이트 + CO₂ + 2NADH + 2H⁺ [2]

NADH + H⁺ → 2H⁺+ 2e^- [3]

6 리불로스-5-포스페이트 + H₂O → 5 G6P + 포스페이트 [4]

C₆H₁₀O₅ + 7H₂O → 24e^-+ 6CO₂ + 24H⁺ (양극 구획) [5]

상기 경로는 2개의 NAD-의존성 G6PDH 및 6PGDH를 사용하여 동화작용에 사용되는 펜토스 포스페이트 경로에서의 천연 NADP-의존성 효소와는 다른 NADH를 생성한다. 상기 경로는, EFCs에서 매우 값비싸고 불안정한, ATP 또는 CoA의 어느 것도 요구하지 않는다. 더욱이, 포스페이트 이온은 일정한 pH 및 이온 농도를 유지하기 위해 재순환될 수 있다. 이러한 순환 경로 디자인은 EFCs에서 전형적으로 사용되는 선형 경로와는 다르다.

효소

일부 실시양태에서, 효소는 겔 포착, 물리적 흡착, 화학적 공유 결합, 및 나노입자 및 나노튜브를 이용한 고정화를 비롯한, 다양한 방법을 이용하여 고정된다. 이들 방법은, 느린 반응 속도에 대한 우려 없이 이들의 안정성을 증강시키기 위해 상업적으로 이용가능한 중온성 효소를 고정시킴으로써 재생가능한 신호를 달성하는데 집중하는 바이오센서로부터 유래하였다.

그러나, 고체 전극의 표면 위에 고정된 효소는 효소 불활성화 및 대량의 용액으로부터 고정화 효소로의 불량한 연료 전달로 인해 일반적으로 훨씬 더 낮은 활성 (예컨대, 1%)을 나타낸다. 일정한 고-전력 EFCs를 달성하기 위하여, 본 발명자들은 효소의 고정화 없이 EFCs에서 전자 전달을 매개하기 위한 대안적인 전략을 고려하였다. 본 발명자들의 전략은 전극의 표면 위에 전자 매개체 (즉, 비타민 K₃ (VK₃))를 고정시킴으로써 효소 활성을 유지하고 대량 전달을 용이하게 한다 (도 13, 패널 C).

EFCs를 위한 2개의 전형적인 효소 고정화 접근법은 4차 테트라부틸암모늄 브로마이드 (TBAB)-개질된 나피온 내 고분자 매트릭스 포착과 탄소 나노튜브 (CNTs) 상에서의 공유 결합이다 (CNTs) (도 13, 패널 A 및 B).

효소의 안정성은 호열효소 (thermoenzyme)의 사용에 의해 해결될 수 있다. 호열효소는 E. coli에서 생산되어 3종의 방법에 의해 정제될 수 있다: 열 침전, His-태그/니켈 하전된 수지, 및 셀룰로스 흡착제 위에 셀룰로스-결합 모듈 태그된 단백질의 흡착 (도 16 및 표 2). 호열성 생물 (thermophile)로부터 분리된 상대적으로 비-안정성 호열효소, 예컨대 PGI, aGP, 및 PGM은 극호열성 생물 (hyperthermophiles) 유래의 효소 또는 단백질 공학 (즉, 합리적 고안, 유도 진화 또는 방법들의 조합)에 의해 생성된 조작된 돌연변이 효소로 대체될 수 있다.

비-고정화 효소의 반감기 수명은 소 혈청 알부민 및 0.1% 트리톤 X-100을 첨가함으로써 증가될 수 있다 (도 22, 패널 B).

전자 매개체

일부 실시양태에서, 전자 매개체는 양극의 표면 위에 고정된다.

특정 실시양태에서, 상기 전자 매개체는 비타민 K₃이다.

일부 실시양태에서, 전자 매개체는 양극의 표면 위에 고정되지 않는다. 다른 실시양태에서, 전자 매개체는 양극 구획 내에 유리된다.

특정 실시양태에서, 상기 전자 매개체는 벤질 비올로겐이다.

당 배터리 또는 당 EFCs

일부 실시양태에서, EFC는 큐벳 (cuvette)-기반 EFC이다 (도 20). 조합된 전극 재료, 플라스틱 큐벳, 및 막 전극 어셈블리의 무게가 전체 장치 무게의 대략 20%에 해당하기 때문이다. 이러한 생체배터리 (biobatteries)는, 이들이 더 나은 에너지 밀도 및 더 약한 환경적 영향을 가지기 때문에 환경 친화적인 일회용 일차 배터리로서 간주될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 큐벳-기반 EFCs의 적층 (stack)은 디지털 시계 및 LED 광을 작동시킬 수 있다 (도 20).

일부 실시양태에서, 유일한 가스 산물 (CO₂)이 양극 구획으로부터 쉽게 방출되고 비-고정화 효소가 EFCs로부터 씻겨 나가지 않기 때문에, 비-고정화 효소 캐스케이드를 구비한 생체배터리는 당 용액의 첨가에 의해 보충될 수 있다. 다른 실시양태에서, EFCs는 기질 및 효소 혼합물의 첨가에 의해 보충될 수 있다.

대안적인 용도:

본 발명은 세포-비함유 생물촉매에서 여분의 환원된 NADH 또는 이의 등가물 (생체모사체)을 제거하고 보조인자의 균형을 맞추기 위해 사용될 수 있다.

이들 도면은 본 발명의 일부 실시양태의 특정 측면을 설명하는 것으로, 발명을 제한하거나 정의하는 것으로 사용되어서는 안 된다.
도 1은 에너지 밀도 비교를 나타낸다. 패널 A는 다양한 연료 및 베터리의 에너지 저장 밀도의 비교를 나타내는 그래프이다. 패널 B는 수소 저장 기술의 에너지 저장 밀도의 비교를 나타내는 그래프이다. 패널 C는 재충전 가능한 배터리의 에너지 저장 밀도의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 2는 직접 메탄올 연료 전지 (DMFC)와 당에 의해 연료가 공급된 효소적 연료 전지 (EFC)의 비교를 나타낸다. 패널 A는 전형적인 DMFC의 개략도이다. 패널 B는 합성 효소적 경로를 통해 당 (CH₂O)을 완전히 산화시킬 수 있는 전형적인 EFC의 개략도이다.
도 3은 전분 또는 글루코스로부터 생성되는 G-6-P로부터 6탄당을 완전히 산화시킬 수 있는 2개의 합성 경로를 포함하는 당 배터리의 작동을 보여주는 개략도이다.
도 4는 전분 또는 글루코스 이외의 6탄당, 예컨대 셀룰로스, 셀로덱스트린, 셀로비오스, 수크로스, 말토스, 락토스, 락토스, 만노스, 또는 프럭토스로부터 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 생성할 수 있는 당 배터리의 작동을 보여주는 개략도이다.
도 5는 ATP 또는 폴리포스페이트를 사용하여 자일로스로부터 자일룰로스 5-포스페이트 (X5P)를 생성할 수 있는 당 배터리의 작동을 보여주는 개략도이다.
도 6은 저비용 폴리포스페이트를 사용하여 ATP를 재생할 수 있는 보조 경로를 나타내는 개략도이다.
도 7은 NADH 및 그의 생체모사체 (NMN 및 NR) 및 BCP 및 그의 유사체 대체물 (생체모사체)의 구조를 보여주는 개략도이다.
도 8은 예시적인 효소적 연료 전지의 개략도이다 (패널 A, 시험되는 연료 전지; 패널 B, 양극 위의 효소 및 매개체).
도 9 - 패널 A는 G6PDH; G6PDH 및 6PGDH; 및 전체 경로를 이용하는 당 배터리의 전력 밀도 대 전류 밀도를 보여주는 그래프이다. 패널 B는 완전 산화에 대한 전류 생성 곡선 대 시간과 패러데이 효율 곡선 (Faraday efficiency curve)을 나타내는 그래프이다.
도 10은 당-전력을 갖춘 (sugar-powered) EFC (패널 A-E)의 전력 출력의 최적화 및 실온에서 150 Ω의 외부 로딩에서 말토덱스트린에 의해 가동된 13개-효소 EFC (패널 F)의 전력 및 전류의 지속적 출력의 프로파일을 보여주는 그래프를 포함한다. 패널 A, 각각의 탄소 종이 위에 CNT 로딩; 패널 B, 탄소 종이의 개수; 패널 C, 효소 로딩; 패널 D, 온도; 및 패널 E, 주사 속도.
도 11 - 패널 A는 지오바실러스 스테아로써모필러스 (Geobacillus stearothermophilus) 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제 (GsG6PDH) 상동성 구조이다. 패널 B는 GsG6PDH 내 NAD-결합 부위를 나타낸다.
도 12는 주요 아미노산 돌연변이화를 이용한 천연 보조인자 및 생체모방체 보조인자 (생체모사체)에 작동하는 조작된 GsG6PDH를 위한 경로를 나타낸다.
도 13 - 패널 A는 (1) 테트라부틸암모늄 브로마이드 (TBAB)-개질된 나피온 고분자 포착 고정화에 의해 고정된 효소, (2) 공유 결합된 탄소 나노튜브 (CNT) 고정화에 의해 고정된 효소, 및 (3) 비-고정화 효소를 이용한 전극의 개요를 나타낸다. 패널 B는 상기 3종의 전극에 대한 전압 대 전류 밀도의 프로파일을 보여주는 그래프이다. 패널 C는 전력 대 전류 밀도에 대한 프로파일을 나타낸다.
도 14는 말토덱스트린의 완전 산화를 위한 효소 연료 전지의 작동을 보여주닌 개략도이다. EFC 내 효소는 다음과 같다: #1 αGP, α-글루칸 포스포릴라제; #2 PGM, 포스포글루코뮤타제; #3 G6PDH, 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제; #4 6PGDH, 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제; #5 RPI, 리보스 5-포스페이트 이소머라제; #6 Ru5PE, 리불로스 5-포스페이트 3-에피머라제; #7 TK, 트랜스케톨라제; # 8 TAL, 트랜스알돌라제; #9 TIM, 트리오스 포스페이트 이소머라제; #10 ALD, 알돌라제; #11 FBP, 프럭토스 1,6-비스포스파타제; #12 PGI, 포스포글루코스 이소머라제; 및 #13 DI, 다이아포라제. 상기 주요 대사산물은 글루코스 1-포스페이트 (G1P), 글루코스 6-포스페이트 (G6P), 6-포스포글루코네이트 (6PG), 및 리불로스 5-포스페이트 (Ru5P)이다. P_i는 무기 포스페이트를 지칭하고 VK₃은 비타민 K₃을 지칭한다.
도 15는 베터리 및 효소적 연료 전지 간의 에너지 밀도의 비교를 보여주는 그래프이다.
도 16은 정제된 효소의 SDS-PAGE 분석이다. 레인 1: αGP, α-글루칸 포스포릴라제; 레인 2: PGM, 포스포글루코뮤타제; 레인 3: G6PDH, 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제; 레인 4: 6PGDH, 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제; 레인 5: RPI, 리보스 5-포스페이트 이소머라제; 레인 6: Ru5PE, 리불로스 5-포스페이트 3-에피머라제; 레인 7: TK, 트랜스케톨라제; 레인 8: TAL, 트랜스알돌라제; 레인 9: TIM, 트리오스 포스페이트 이소머라제; 레인 10: ALD, 알돌라제; 레인 11: FBP, 프럭토스 1,6-비스포스파타제; 레인 12: PGI, 포스포글루코스 이소머라제; 및 DI, 다이아포라제.
도 17은 EFC 세트의 설계 (패널 A) 및 사진 (패널 B)을 나타낸다.
도 18은 시간의 경과에 따른 전하 및 NADH의 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 19는 말토덱스트린의 존재 또는 부재 하의 전류 생성 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 20은 그의 전면도 (패널 A)를 보여주는 큐벳-기반 EFC와, 디지털 시계 (패널 B) 및 LED (패널 C)를 가동시키도록 연속하여 연결된 2개의 EFCs의 사진이다.
도 21은 비-고정화 EFC에 대한 당 보충의 효과를 보여주는 그래프이다. 초기 말토덱스트린 농도는 0.01 mM이었다. 시점 1 및 2에서, 동량의 신선한 기질이 EFC 내로 첨가되었다.
도 22 - 패널 A는 전체 경로 EFC (모든 13개 효소 보유)의 열안정성 및 보충가능성 (refillability)을 보여주는 그래프이다. 전류 생성 곡선은 실온에서 0.1 mM 말토덱스트린에 대해 작동하는 13개-효소 EFC의 것이다. 시점 1 (대략 210시간)에서, 새로운 효소 혼합물 및 1 mM 말토덱스트린을 기질이 대략 200시간째에 거의 완전히 소모되었을 경우에 첨가하였다. 시점 2에서, 새로운 VK₃-함유 양극을 노후 양극을 대체하기 위해 사용하였다. 패널 B는 1 g/LBSA 및 0.1% (wt/v) 트리톤 X-100의 첨가에 의해 EFC에서 비-고정화 효소의 안정성의 증대를 보여주는 그래프이다.

실시예

재료 및 방법

화학물질

말토덱스트린 (4.0-7.0 당량의 덱스트로스, 즉, 19의 측정된 중합도), 비타민 K₃ (VK₃), 니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 (NAD, 산화형 (NAD⁺) 및 환원형 (NADH) 모두 포함), 폴리-L-라이신 (PLL, MW ~70-150 kDa), 디티오트레이톨　(DTT), 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카르보다이이미드 히드로클로라이드 (EDC), 및 N-히드록시석시니미드 (NHS)를 비롯한 모든 화학물질은 시약 등급 또는 그 이상이었고, 달리 지시되지 않는 한, 시그마-알드리치사 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 또는 피셔 사이언티픽사 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)로부터 구매하였다. 제한 효소, T4 리가제, 및 퓨젼 (Phusion) DNA 중합효소는 뉴잉글랜드 바이오랩스사 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)로부터 구매하였다. 올리고뉴클레오티드를 인테그레이티드 DNA 테크놀러지사 (Integrated DNA Technologies, Coraville, IA, USA) 또는 피셔 사이언티픽사에 의해 합성하였다. 양극에 사용된 탄소 종이 (AvCarb MGL200)는 퓨얼 셀 어스사 (Fuel Cell Earth, Stoneham, MA, USA)로부터 구매하였다. 나피온 212 막 및 0.5 mg cm^-2 Pt로 개질된 탄소 천 (cloth) 음극으로 이루어진 막 전극 어셈블리 (Membrane electrode assemblies, MEAs)는 퓨얼 셀 스토어사 (Fuel Cell Store, San Diego, CA, USA)로부터 구매하였다. < 8 nm의 외경과 10-30 μm의 길이를 갖는 COOH-관능화 (functionalized) 다중-벽 탄소 나노튜브 (CNTs)는 치프튜브스.컴 사(CheapTubes.com, Brattleboro, VA, USA)로부터 구매하였다. 효소 정제에 사용된 재생된 무정형 셀룰로스는, 다른 곳에 기술된 바와 같이 그의 용해 및 재생을 통해 아비셀 (Avicel) PH105 (FMC, Philadelphia, PA, USA)로부터 제조하였다. 대장균 (Escherichia coli) Top10을 DNA 조작을 위한 숙주 세포로 사용하였고 대장균 BL21 Star (DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 재조합 단백질 발현을 위한 숙주 세포로 사용하였다. 100 mg L^-1 암피실린 또는 50 mg L^-1 카나마이신의 어느 하나를 포함하는 루리아-베르타니 (Luria-Bertani, LB) 배지를 대장균 세포 성장 및 재조합 단백질 발현을 위해 사용하였다 .

재조합 효소의 생산 및 정제

단백질 발현 플라스미드를 보유하는 대장균 BL21 Star (DE3) 균주를 100 mg L^-1 암피실린 또는 50 mg L^-1 카나마이신의 어느 하나를 포함하는 250 mL의 LB 배지가 담긴 1-L 엘렌메이어 (Erlenmeyer) 플라스크에서 인큐베이션하였다. 600 nm에서 세포 배양액의 흡광도가 0.6-0.8에 도달할 때까지 세포를 250 rpm으로 회전 교반하면서 37℃에서 성장시켰다. 18℃ 밤새 인큐베이션 동안 100 μM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 첨가함으로써 단백질 발현을 유도하였다. 상기 세포를 4℃에서 원심분리하여 회수하고 0.3 M NaCl 함유 20 mM HEPES (pH 7.5)로 1회 세척하였다. 상기 세포 펠렛을 동일한 완충액에 재현탁하고 초음파 처리 (Fisher Scientific Sonic Dismembrator Model 500; 5-s 펄스 간헐적, 50% 진폭에서 총 300초)로 용해시켰다. 원심분리 후, 상층액 중의 표적 단백질을 정제하였다.

표 2에 나타낸 3가지 접근법이 다양한 재조합 단백질을 정제하기 위해 사용되었다. His-태그된 단백질을 프로피니티 (Profinity) IMAC Ni-하전된 수지 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 의해 정제하였다. 셀룰로스-결합 모듈 (CBM) 및 자가-절단 인테인 (self-cleavage intein)을 함유하는 융합 단백질을 거대 표면적 재생된 무정형 셀룰로스 상에서 고-친화성 흡착을 통해 정제하였다. RPI, Ru5PE, TIM, 및 ALD를 정제하기 위하여 80℃에서 20분간의 열 침전을 사용하였다. 재조합 단백질의 순도를 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 조사하였다 (도 16).

[표 2]

재조합 호열성 효소의 정보

효소 활성 측정

클로스트리디움 써모셀룸 (Clostridium thermocellum) 알파-글루칸 포스포릴라제 (αGP) 활성을 23℃에서 5분간 1 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 30 mM 말토덱스트린, 및 10 mM 소디움 포스페이트를 함유하는 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.5) 중에서 분석하였다. HClO₄를 첨가하여 반응을 중지시킨 후 이어서 KOH를 이용해 중화시켰다. 글루코스 1-포스페이트 (G1P)를 포스포글루코뮤타제 (PGM)가 보충된 글루코스 헥소키나제/G6PDH 분석 키트 (Pointe Scientific, Canton, MI, USA)를 사용하여 측정하였다.

C. 써모셀룸 포스포글루코뮤타제 (PGM) 활성을 23℃에서 5분간 5 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 및 5 mM G1P를 함유하는 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.5) 중에서 측정하였다. 글루코스 6-포스페이트 (G6P) 산물을 헥소키나제/G6PDH 분석 키트를 사용하여 결정하였다.

지오바실러스 스테아로써모필러스 ( Geobacillus stearothermophilus) 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제 (G6PDH) 활성을 23℃에서 100 mM NaCl, 2 mM G6P, 2 mM NAD⁺, 5 mM MgCl₂, 및 0.5 mM MnCl₂을 함유하는 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.5) 중에서 분석하였다. NADH의 형성으로 인한 흡광도의 증가를 340 nm에서 측정하였다.

모렐라 써모아세티카 ( Morella thermoacetica) 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제 (6PGDH) 활성을 23℃에서 5분간 2 mM 6-포스포글루코네이트, 2 mM NAD⁺, 5 mM MgCl₂, 및 0.5 mM MnCl₂를 함유하는 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.5) 중에서 측정하였다.

써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) 리보스-5-포스페이트 이소머라제 (RPI) 활성을 변형된 디쉐 시스테인-카르바졸 (Dische's cysteine-carbazole) 방법을 이용하여 분석하였다.

T. 마리티마 리불로스-5-포스페이트 에피머라제 (Ru5PE) 활성을 이전에 기술된 바와 같이 D-리불로스 5-포스페이트의 기질 상에서 결정하였다.

써머스 써모필러스 ( Thermus thermophilus) 트랜스케톨라제 (TK) 활성을 0.8 mM D-자일룰로스 5-포스페이트, 0.8 mM D-리보스 5-포스페이트, 5 mM MgCl₂, 0.5 mM 티아민 피로포스페이트, 0.15 mM NADH, 60 U mL^-1의 TIM 및, 20 U mL^-1의 글리세롤 3-포스페이트 디히드로게나제를 함유하는 50 mM Tris/HCl (pH 7.5) 완충액 중에서 측정하였다. 23℃에서 TK를 첨가하여 반응을 개시하였다. D-글리세르알데히드 3-포스페이트 산물을 340 nm에서 5분간 측정된 NADH의 소모를 통해 정량하였다.

T. 마리티마 트랜스알돌라제 (TAL) 활성을 이전에 문헌 [Huang et al., A thermostable recombinant transaldolase with high activity over a broad pH range. Appl . Microbiol . Biotechnol . 93: 2403-2410 (2012)]에 보고된 바와 같이 분석하였다.

T. 써모필러스 트리오스포스페이트 이소머라제 (TIM) 활성을 5 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 0.5 mg mL^-1 BSA, 20 U mL^-1의 글리세롤 3-포스페이트 디히드로게나제, 및 0.25 mM NADH를 함유하는 50 mM Tris/HCl (pH 7.5) 중에서 결정하였다.

T. 써모필러스 프럭토스 1,6-비스포스페이트 알돌라제 (ALD)를 기질로 하고 1.9 mM 프럭토스 1,6-비포스페이트를 이용하여 23℃에서 50 mM Tris/HCl 완충액 (pH 7.5) 중에서 분석하였다. 상기 글리세르알데히드 3-포스페이트 산물을 340 nm에서 0.15 mM NADH, 60 U mL^-1의 TIM, 및 20 U mL^-1의 글리세롤 3-포스페이트 디히드로게나제를 이용하여 정량하였다.

T. 마리티마 프럭토스 1,6-비스포스파타제 (FBP) 활성을 포스페이트의 방출을 기준으로 결정하였다.

C. 써모셀룸 포스포글루코스 이소머라제 (PGI) 활성을 23℃에서 10 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 및 5 mM 프럭토스 6-포스페이트를 함유하는 100 mM HEPES (pH 7.5) 중에서 분석하였다. 3분 후, HClO₄를 첨가하여 반응을 중지시키고 KOH를 이용해 중화시켰다. G6P 산물을 37℃에서 헥소키나제/G6PDH 분석 키트를 이용해 분석하였다.

G. 스테아로써모필러스 다이아포라제 (DI) 활성을 23℃에서 0.16 mM NADH 및 0.1 mM 디클로로페놀린도페놀 (DCPIP)을 함유하는 10 mM 포스페이트 완충 식염 용액 중에서 분석하였다. DCPIP의 소모로 인한 600 nm에서의 흡광도 감소를 분광계로 측정하였다.

탄소 종이 전극 위에 고정된 G6PDH 및 DI의 활성을 유리 효소에 대한 것과 동일한 조건 하에서 분석하였다. 상기 전극을 23℃에서 기질 용액에 침지시킴으로써 반응을 개시하였다. 상기 전극을 반응으로부터 제거한 후, 반응 용액 중 흡광도의 변화를 G6PDH 및 DI 분석에 대해 기술한 바와 같이 측정하였다.

양극 제조

공기-호흡형 (air-breathing) 효소적 연료 전지 장치를 도 17에 나타내었다. 양극 구획의 반응 용적은 15 mL이었다. 전해질을 반시간 동안 초순수 질소로 흘려 보내 (flushing) 탈산소화시켰다. 전해질을 600 rpm에서 자석 막대를 사용하여 혼합하였다. 양극과 그의 표면이 0.5 mg cm^-2 Pt으로 코딩되어 있는 음극을 분리하기 위해 나피온 212 막을 사용하였다. 양극 구획은 상기 양극 구획을 밀봉하기 위한 고무 스토퍼가 구비된 유리 전해질 용기였다.

2개의 효소 고정화 방법이 고정된 효소를 구비한 양극을 제조하기 위해 사용되었다.

방법 1은 4차 암모늄 브로마이드 염 개질된 나피온 내로의 효소 포착에 기반한다. 1 mL의 5% 나피온 1100 EW 현탁액 (Ion Power, Inc., New Castle, DE, USA)과 함께 39 mg의 테트라부틸암모늄 브로마이드 (TBAB)를 첨가하여 주조 용액 혼합물을 제조하였다. 밤새 건조 후, 혼합물을 3.5 mL의 18 MΩ 탈이온수로 세척하고 1 mL의 이소프로판올에 재-현탁하였다. 효소 용액 혼합물은 1 유닛의 G6PDH, 40 유닛의 DI, 1 mM NAD⁺, 및 0.29 M VK₃으로 이루어졌다. 탄소 종이 양극을 100 μL의 주조 용액 및 100 μL의 효소 용액의 혼합물로 피복하고 실온에서 건조시켰다.

방법 2는 효소와 탄소 나노튜브 (CNTs) 사이의 공유 결합 연결에 기반한다. 10 μL 부피의 2% wt/v PLL 용액을 탄소 종이를 코팅하는데 사용하고, 이어서 20 μL의 25 mM EDC를 첨가하였다. 한편, 2.5% wt/v COOH-관능화 CNTs를 50% 에탄올 용액에 현탁하고 30분간 초음파 처리하였다. 그 후에 탄소 종이를 40 μL의 CNT-함유 용액으로 처리하고 실온에서 건조시켰다. 또 다른 10 μL의 400 mM EDC 및 10 μL의 100 mM NHS를 그 후에 첨가하고, 이어서 1 유닛의 G6PDH, 40 유닛의 DI, 1 mM NAD⁺, 및 10 μL의 0.29 M VK₃ 아세테이트 용액을 첨가하였다.

고정화 효소를 갖는 2가지 유형의 양극을 사용 전에 4℃ 에서 2 mM NAD⁺ 및 100 mM NaNO₃을 함유하는 100 mM HEPES 완충액 중에 보관하였다.

비-고정화 효소 양극의 제조를 위하여, 1 또는 3 mg의 CNTs를 문헌 [Zhu et al., Deep oxidation of glucose in enzymatic fuel cells through a synthetic enzymatic pathway containing a cascade of two thermostable, dehydrogenases, Biosens. Bioelectron . 36: 110-115 (2012)]에 앞서 기술된 바와 같이 폴리-L-라이신 (PLL, MW ~70-150 kDa)을 사용하여 퓨얼 셀 어스사의 1 cm² 탄소 종이 (AvCarb MGL200)의 표면에 첨가하였다. 아세톤에 용해된 0.29 M 비타민 K₃의 10 또는 30 μL 용액을 후드 밑에서 건조 CNT-함유 양극 위에 증착하였다. 2시간의 아세톤 증발 후, 수-불용성 비타민 K₃을 물리적 흡착을 통해 양극 위에 증착하였다.

EFCs의 전기화학적 특성

모든 전기화학적 검사는 PC에 인터페이스로 연결된 1000B 멀티-포텐시오스탯 (Multi-Potentiostat) (CH Instruments Inc., Austin, TX, USA)을 사용하여 수행되었다. 양극에서 일어난 반응이 속도-제한 단계였고 MEAs에서 Pt에 의해 매개된 양성자의 산화는 속도-제한이 아니었기 때문에, 전류 및 전력 출력과 관련된 실험 데이터를 1 cm²의 양극 면적에 대해 정상화하였다. 개방 회로 전위 및 선형 주사 전압법 (linear sweep voltammetry)의 측정을 1 mV s^-1의 주사 속도로 수행하였다.

고정화 및 비-고정화 효소 EFCs로부터의 전력 생성의 비교를 위하여 (도 13), 전해질은 10 mM G6P, 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.5), 2 mM NAD⁺, 10 mM MgCl₂, 및 0.5 mM MnCl₂을 포함하였다. 1 유닛의 G6PDH 및 40 유닛의 DI를 상기 전극 위에 고정시키거나 상기 전해질 내에 용해시켰다.

말토덱스트린이 기질로 사용되는 경우 (도 9), 전해질은 실온에서 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.5), 비-고정화 효소, 0.1 mM 말토덱스트린, 4 mM NAD⁺, 4 mM 소디움 포스페이트, 10 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 5 mM DTT, 및 0.5 mM 티아민 피로포스페이트를 포함하였다.

제1-디히드로게나제 EFC는 처음 3개 효소 (즉, 알파-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 및 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제)에 더하여 DI를 포함하였다. 제2-디히드로게나제 EFC는 처음 4개 효소 (즉, 알파-글루칸 포스포릴라제, 포스포글루코뮤타제, 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제, 및 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제)에 더하여 DI를 포함하였다. 말토덱스트린의 완전 산화를 위해 사용된 EFC는 모든 13개 효소를 포함하였다. 효소 로딩 조건은 표 2에 나타내었다.

말토덱스트린 (0.1 mM)의 완전 산화를 10 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 4 mM NAD⁺, 4 mM 소디움 포스페이트, 5 mM DTT, 및 0.5 mM 티아민 피로포스페이트를 함유하는 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.5) 중에서 측정하였다 (도 9, 패널 B 및 도 19). 미생물 오염을 방지하기 위하여, 50 mg L^-1 카나마이신, 40 mg L^-1 테트라사이클린, 40 mg L^-1 사이클로헥사마이드, 및 0.5 g L^-1 소디움 아자이드를 첨가하였다. 효소 혼합물의 안정성을 개선하기 위하여, 1 g L^-1 소 혈청 알부민 및 0.1% 트리톤 X-100을 첨가하였다. 효소 로딩 조건은 표 2에 나타내었다. 최대 전류 밀도를 달성하기 위하여 0 V에서 전류법 (Amperometry)을 수행하였다. 0.1 mM 말토덱스트린의 용액 (즉, ~1.9 mM 글루코스)을 첨가하기 전에, 거의 제로 전류가 수득될 때까지 0.2 mM G6P를 이용한 EFC를 2일간 운영하였다. 말토덱스트린의 완전 산화는 실온에서 대략 1주일 소요되었고 잔여 말토덱스트린을 SA-20 전분 분석 키트 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 정량하였다. 패러데이 효율은 하기에 따라 계산하였다:

F _MD _-전류 = C _전채 /Δc _글루코스 _단위 ×V×24×F

여기서 F _MD _-전류 는 페러데이 효율이고, C _전채 는 생성된 전체 전하 (C)이고, Δc _글루코스 _단위 = c _초기 - c _잔여 (M)이고, V는 반응 용적 (L)이고, 24는 소모된 글루코스 단위 당 24개 전자를 나타내고, F는 패러데이 상수이다. 말토덱스트린 부재 하의 대조군 실험이 또한 수행되었다 (도 19).

EFCs의 전력 밀도를 더욱 증가시키기 위하여, 20 mM G6P, 10 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 8 mM NAD⁺, 4 mM 소디움 포스페이트, 0.5 mM 티아민 피로포스페이트, 및 G6PDH를 함유하는 100 mM HEPES (pH 7.5) 완충액 중에서 몇몇 인자를 최적화하였다 (도 10, 패널 A-E). 모든 실험을 하기 순서로 수행하였다: CNT 로딩 (전극 당 1, 3 또는 5 mg), 수개의 전극 시트를 함께 쌓아 올림 (1, 3 또는 6개), 효소 로딩 (1, 10, 또는 30 유닛) 및 반응 온도 (23, 50, 또는 65℃).

양극으로서 하나의 1 cm² 탄소 종이 위에 CNTs 로딩의 효과를 하기 조건 하에서 측정하였다: 20 mM G6P, 1 U의 G6PDH, 80 U의 DI, 100 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 8 mM NAD⁺, 4 mM 소디움 포스페이트, 0.5 mM 티아민 피로포스페이트, 1개 전극, 전극 당 1 mg, 3 mg, 또는 5 mg CNTs 및 23℃. 3 mg CNTs가 증착된 1 cm² 탄소 종이로 제조된 다수의 적층형 (stacked) 양극의 효과를 하기 조건 하에서 측정하였다: 20 mM G6P, 1 U의 G6PDH, 80 U의 DI, 100 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 8 mM NAD⁺, 4 mM 소디움 포스페이트, 0.5 mM 티아민 피로포스페이트, 1, 3, 또는 6 전극 및 23℃. 이들 각각이 3 mg CNTs를 함유하는, 6개 전극의 적층 (stack)을 포함하는 EFC 내 1 내지 30 U의 G6PDH 로딩의 효과를 하기 조건 하에서 측정하였다: 20 mM G6P, 1, 10, 또는 30 U의 G6PDH, 80 U의 DI, 100 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 8 mM NAD⁺, 4 mM 소디움 포스페이트, 0.5 mM 티아민 피로포스페이트 및 23℃. 이들 각각이 3 mg CNTs를 함유하는, 6개 전극의 적층을 포함하는 EFC에서 23, 50, 또는 65℃ 반응 온도의 효과를 하기 조건 하에서 측정하였다: 20 mM G6P, 30 U의 G6PDH, 80 U의 DI, 100 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 8 mM NAD⁺, 4 mM 소디움 포스페이트, 및 0.5 mM 티아민 피로포스페이트. 도 10의 패널 B-D에서, 3 mg CNTs가 증착된 6개의 1 cm² 탄소 종이를 양극으로서 함께 적층하였다. 도 10의 삽입 그림, 패널 A 및 B는 줌-인 (zoom-in) 프로파일을 나타낸다.

주사 속도의 효과를 또한 완충액 중에서 측정하였다 (도 10E).

디지털 시계 또는 LED 광의 전원을 켤 수 있는 "큐벳-유사" EFC의 능력을 입증하기 위하여 (도 20), 상기 큐벳의 측면에서 2개의 윈도 (window)를 개방하였다. 각각의 윈도를 그의 나피온 측면이 규벳의 내부와 면하는 MEA에 붙였다. 효소 부재의 변형된 양극을 상기 큐벳 내부에 담갔다. 3 mL의 반응 용액은 실온에서 40 U의 DI, 4 U의 G6PDH 및 6PGDH, 100 mM G6P, 100 mM HEPES (pH 7.5), 4 mM NAD⁺, 10 mM MgCl₂, 및 0.5 mM MnCl₂를 포함하였다.

비-고정화 효소 EFC에 대한 당-보충 실험 (도 21)을 0.01 mM의 초기 말토덱스트린 농도에서 수행하였다. EFC 내 당이 완전히 소모되었을 때 (즉, 전류 출력이 제로에 근접하였을 때), 0.01 mM의 최종 농도를 달성하기 위하여 농축된 말토덱스트린 농도를 첨가하였다. 상기 말토덱스트린 용액을 2회 보충하였다.

노후된 EFC에 대한 예비적 진단 실험 (도 22, 패널 A)을 대략 200시간의 운영 후 전류 밀도가 거의 제로로 되돌아갔을 때 수행하였다. 신선한 기질 (0.1 mM 말토덱스트린)을 동일한 로딩으로 13개 효소와 함께 첨가하였다. 수 시간 후, VK₃으로 증착된 새롭게 제조된 탄소 전극을 시험에 사용하였다.

고정화 및 비-고정화 효소 시스템의 안정성을 비교하기 위하여 (도 22, 패널 B), 개방 회로 전위 및 선형 주사 전압법을 2 mM G6P, 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.5), 2 mM NAD⁺, 10 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂를 함유하는 전해질을 이용하여 실온에서 수행하였다. 전극 위에 고정되거나 저장 용액 중에 유리된 1 유닛의 G6PDH 및 40 유닛의 DI를 첨가하였다. 1회의 시험 후, 고정화 효소 전극을 꺼내어 4℃에서 G6P 부재의 반응 완충액 중에 보관하였다. 비-고정화 효소의 경우, 모든 G6P가 소모되었을 때 상기 효소를 함유하는 반응 용액을 4℃에서 보관하였다. 또 다른 세트의 비-고정화 효소 반응에서, 유리 효소의 안정성을 증가시키기 위하여 1 g/L의 소 혈청 알부민 및 0.1% v/v 트리톤 X-100을 보충하였다.

최선의 EFC 조건은 100 mM HEPES 완충액 (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 0.5 mM MnCl₂, 4 mM NAD⁺, 0.5 mM 티아민 피로포스페이트, 5 mM DTT, 15% (wt/v) 말토덱스트린, 기질로서 40 mM 소디움 포스페이트, 및 30 유닛의 #1-#4 효소, 10 유닛의 #5-#12 효소, 80 유닛의 DI의 효소 로딩 조건, 50 mg L^-1 카나마이신, 40 mg L^-1 테트라사이클린, 40 mg L^-1 사이클로헥사마이드, 및 0.5 g L^-1 소디움 아자이드였다. 장기간 비-파괴적 작동을 위하여, 150 Ω의 외부 저항을 적용하였다. 전력 밀도를 23℃에서 60시간 동안 측정하였다 (도 10, 패널 F).

결과

비-고정화 및 고정화 효소의 비교

비-고정화 효소를 구비한 EFCs를 고정화 효소를 구비한 2개의 EFCs와 비교하기 위하여, 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제 (G6PDH) 및 다이아포라제 (DI)의 등량을 글루코스-6-포스페이트 연료에 대한 EFCs의 분극 및 전력 출력을 시험하기 위해 사용하였다 (도 13, 패널 A). 상기 실험을 하기 조건 하에서 수행하였다: 실온에서 2 mM NAD⁺, 10 mM Mg² ⁺, 및 0.5 mM Mn² ⁺를 함유하는 100 mM HEPES (pH 7.5) 완충액 중에서 1 U G6PDH, 40 U DI, 10 mM G6P.

비-고정화 EFCs를 위한 대량 수송 영역이 공유 결합-기반 EFCs에 비해 더 높은 전류 밀도에서 야기되었는데 (도 13, 패널 B), 이는 비-고정화 효소에 대한 증강된 대량 수송의 영향을 제안하는 것이다.

비-고정화 G6PDH에 근거한 EFC는, 공유 결합 방법의 것에 비해 3배 더 높은, 0.13 mW cm^-2의 가장 높은 전력 밀도를 나타내었다. TBAB-개질된 나피온 고분자 포착 방법에 근거한 EFC는 0.0013 mW cm^-2의 가장 낮은 최대 전력 밀도를 가지고 있는데, 이는 공유 결합 방법에 대한 밀도의 단지 4%였다. 나피온 고분자 포착 및 공유 결합에 의해 고정된 G6PDH는 각각 그의 비-고정화 활성의 0.2% 및 6%를 보유하였다. 나피온 고분자 포착 및 공유 결합에 의해 고정된 DI는 각각 그의 비-고정화 활성의 0.4% 및 7.5%를 보유하였다 (표 3). 효소 활성에 대한 이러한 데이터는 효소 고정으로 인해 급격한 활성 손실이 야기되었음을 명백히 제안한다. 전력 밀도 데이터는 EFCs에서 고-전력 출력을 달성하기 위하여 비-고정화 효소(들)의 가능성을 입증하는 것이다.

[표 3]

고정화 효소와 비-고정화 효소의 잔여 활성 비교

말토덱스트린의 완전 산화

각각의 글루코스 단위로부터 최대 전자 전위 (즉, 글루코스 당 24개)를 방출하기 위하여, 본 발명자들은 13개 효소를 함유하는 비-천연 효소적 경로를 고안하였다 (도 14). 이 합성 경로는 4개의 기능적 모듈로 이루어진다: 알파-글루칸 포스포릴라제 및 포스포글루코뮤타제에 의해 매개되는 말토덱스트린으로부터 글루코스-6-포스페이트 (G6P) 생성 (방정식 1); 2개의 NAD-의존성 G6PDH 및 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제 (6PGDH)에 의해 매개되는 G6P로부터 생성되는 2 NADH (방정식 2); NADH 당 2개의 전자를 생성하는 비-고정 DI로부터 고정 VK₃으로의 NADH 전자-산화 (방정식 3); 및 펜토스 포스페이트, 해당과정, 및 글루코스신생합성 경로 내 효소들로 이루어진 하이브리드 경로를 통한 1 몰의 리불로스 5-포스페이트로부터 5/6 몰의 G6P 재생 (방정식 4). 방정식 1-4의 조합을 위한 전체 양극 반응은 결과적으로 대략 방정식 5가 된다. 명백하게, 말토덱스트린으로부터의 각각의 글루코스 단위는 이 드 노보 경로 (방정식 5)를 통해 양극 위에서 24개의 전자를 생성할 수 있다.

(C₆H₁₀O₅)_n + P_i → G6P + (C₆H₁₀O₅)_n-1 [1]

G6P + H₂O + 2NAD⁺ → 리불로스 5-포스페이트 + CO₂ + 2NADH + 2H⁺ [2]

NADH + H⁺ → 2H⁺+ 2e^- [3]

6 리불로스 5-포스페이트 + H₂O → 5 G6P + 포스페이트 [4]

C₆H₁₀O₅ + 7H₂O → 24e^-+ 6CO₂ + 24H⁺ (양극 구획) [5]

상기 경로는 2개의 NAD-의존성 G6PDH 및 6PGDH를 사용하여 펜토스 포스페이트 경로에서 천연의 NADP-의존성 효소와는 다른 NADH를 생성한다. 상기 경로는 매우 비싸고 EFCs에서 불안정한, ATP 또는 CoA의 어느 하나도 요구하지 않는다. 더욱이, 포스페이트 이온은 재순환되어 일정한 pH 및 이온 농도를 유지한다. 이 순환 경로 고안은 EFCs에서 전형적으로 사용되는 선형 경로와는 다른 것이다.

말토덱스트린 연료 (즉, 2 mM 글루코스 단위)로부터의 전력 밀도를 1개 디히드로게나제 (즉, G6PDH), 2개 디히드로게나제 (즉, G6PDH 및 6PGDH), 또는 전체 경로를 사용한 3개의 EFCs에 대해 비교하였다 (도 9A). 개방 회로 전위는 3개의 EFCs에 대해 유사하였다 (~0.7 V). G6PDH만이 사용되었을 경우, EFC는 0.011 mW cm^-2의 최대 전력 밀도를 나타내었다. 두 번째 디히드로게나제 (6PGDH)가 첨가되었을 경우, 최대 전력 밀도는 두 배, 즉 0.024 mW cm^-2로 증가하였다. 8개의 추가적인 효소를 첨가하여 전체 경로를 재구성하였을 경우 (도 14), 최대 전력 밀도는 0.026 mW cm^-2로 약간 증가하였다. 대응하는 최대 전류 밀도는 2개의 디히드로게나제에 근거한 시스템의 전류 밀도보다 35% 더 높았다 (도 9A).

말토덱스트린의 글루코스 단위의 완전 산화를 정량적으로 확인하기 위하여, 본 발명자들은 공기-호흡형 EFC에서 다이아포라제 및 비타민 K₃을 통한 NADH로부터 전자로의 페러데이 효율을 측정하였다 (도 18). 탈산소화된 전해질의 초기 조성물은 0.4 U의 DI, 100 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 및 0.5 mM MnCl₂를 포함하였다. 시간의 경과에 따른 전류 생성을 모니터링하기 위하여 전류식 (amperometric) 측정을 수행하였다. 먼저, 소량 (0.2 mM)의 NADH를 첨가하여 반응을 개시하였다. NADH가 모두 소모되었을 때, 반응 시스템은 평행 상태를 달성하였다. 두 번째로, 또 다른 2 mM NADH를 첨가하였을 때, 전류는 시간의 경과에 따라 증가하기 시작하였다. 시료를 이따금 주사기를 사용하여 회수하였고 잔여 NADH 농도를 UV 분광광도계로 측정하였다. NADH의 전자-효소적 산화의 패러데이 효율을 하기와 같이 계산하였다:

F _NADH _-전류 = ΔC/(Δc×V×2×F)

여기서 F _NADH _-전류 는 NADH의 전자-효소적 산화의 패러데이 효율이고, ΔC는 총 전하 증가 (C)의 기울기이고, Δc는 NADH 농도 감소 (M)의 기울기이고, V는 반응 용적 (L)이고, 2는 소모된 NADH 당 생성된 2개의 전자를 나타내고, F는 패러데이 상수이다.

양극 구획에 대한 무산소 조건 하에서, EFC의 패러데이 효율은 97.6 ± 3.0%였는데 (도 18), 이는 NADH의 전자-효소적 산화가 매우 효율적임을 제안하는 것이다. 나아가, 양극 구획으로부터 산소의 제거는 높은 페러데이 효율을 달성하고 NADH의 비-선택적 산화를 방지하는데 필수적이었다.

실온에서 13개의 효소 및 낮은 농도의 말토덱스트린을 함유하는 15-mL EFC에서 (도 9B), 전류 밀도는 24시간째에 0.12 mA cm^-2의 피크 값으로 증가하였고 그 후에 기질 소모로 인해 서서히 감소하였다. 150시간 이상 후에, 전류 출력은 거의 제로로 감소하였다. 생성된 누적 전하는 글루코스 단위의 소모에 근거하여 생성된 이론적 전하 (즉, 53.0 C, 1몰의 글루코스 단위는 이론적으로 24×96,485 C를 생성할 수 있음)과 비교하여 48.9 C였다. 이 결과는 1몰의 글루코스가 22.2몰의 전자를 생성하는 92.3%의 누적 패러데이 효율을 제안한다.

음성 대조군 (즉, 기질 부재의 동일한 EFC)이 유의미한 전류 출력을 생성하지 못하였음이 주목되었다 (도 19). 세포-비함유 생체시스템은, 이전에 입증된 바와 같이 [Bujara et al., "Optimization of a blueprint for in vitro glycolysis by metabolic real-time analysis," Nat. Chem . Biol . 7: 271-277 (2011); Martin del Campo, J. S. et al., "High-Yield Production of Dihydrogen from Xylose by Using a Synthetic Enzyme Cascade in a Cell-Free System," Angew . Chem . Int . Ed. 52: 4587-4590 (2013)], 세포 성장 및 부산물 형성에 유기 연료를 소비하지 않기 때문에, 패러데이 효율은 글루코스 기반의 미생물 연료 전지의 것 (83%)보다 더 높았다. 본 발명의 시스템은 EFC에서 글루코스 단위당 생산된 거의 24개 전자에 대해 최초의 정량적 증거를 제공한다. 나아가, 본 발명의 데이터는 본 발명자들이 당으로부터의 화학적 에너지 전부를 전기 에너지로 전환시키고 EFC의 에너지 밀도를 10배로 증가시킬 수 있음을 제안한다.

고-에너지 밀도 고-출력 EFCs

전력 밀도는 EFCs에서 또 다른 중요한 고려대상이다. 전력 밀도를 증가시키기 위하여, 본 발명자들은 EFC 형상, 효소 로딩, 및 그 조건하에서 비-고정화 G6PDH가 G6P에 대해 작용하는 실험 조건을 비롯한, 다양한 인자들을 최적화하였다.

최적의 CNT 로딩은 탄소 종이의 cm² 당 3 mg이었다 (도 10, 패널 A). 3-D 양극으로서 함께 적층된 6개의 전극은 최대 전력 밀도를 50%, 그리고 최대 전류 밀도를 4-배 증가시켰다 (도 10, 패널 A 및 B). 셀당 1 내지 10 U으로의 효소 로딩의 증가는 최대 전력 밀도 및 최대 전류 밀도를 실온 (23℃)에서 각각 0.35 mW cm^-2 및 4.1 mA cm^-2으로 급격히 증가시켰다 (도 10, 패널 C). 50℃로 온도를 상승시키면 최대 전력 밀도는 0.8 mW cm^-2로 배가하였다(도 10, 패널 D).

15% (wt/v) 말토덱스트린을 기반으로 13개의 비-고정화 효소로 구성된 EFC는 실온에서 1 mV s^-1의 주사 속도로 0.4 mW cm^-2의 최대 전력 밀도를 생성하였다. EFC는 폐쇄형 시스템에서 60시간 동안 대략 0.32 mW cm^-2의 거의 일정한 전력 출력을 생성하였다 (도 10, 패널 F). 또한, 2개의 큐벳-기반 EFCs의 적층은 디지털 시계 및 LCD 광의 전원을 켤 수 있는데 (도 20), 이는 이러한 EFCs가 가까운 미래에 수 많은 전자 장치의 전력을 공급하기 위해 사용될 수 있음을 제안한다.

15% 말토덱스트린 용액의 글루코스 단위의 완전 산화는, 이러한 당-전력을 갖춘 EFC의 에너지 저장 밀도가 596 Ah kg^-1 만큼 높을 수 있음을 의미하고, 이는 리튬-이온 배터리 및 일차 배터리의 에너지 저장 밀도보다 10배 이상 더 높은 것이다 (도 15 및 표 4).

[표 4]

배터리 및 EFCs의 에너지 밀도 비교

* 연소 에너지 또는 더 높은 가열 값.

EFCs의 전압 (예컨대, 0.5 V)이 리튬-이온 배터리의 전압 (3.6 V)보다 훨씬 낮다고 하더라도, 15% 당-전력을 갖춘 EFC의 에너지 밀도는 최대 298 Wh kg-1에 도달할 수 있고, 이는 통상적인 재충전 가능한 배터리 (예컨대, Pd-산, NiMH, 및 리튬-이온 배터리)의 몇 배이고 통상적인 일차 배터리 (예컨대, 아연-탄소, 알칼라인, 및 Li-MnO₂ 배터리) 보다 더 높은 것이다 (도 15). 조합된 전극 재료, 플라스틱 큐벳, 및 막 전극 어셈블리의 무게가 대략 전체 장치 무게의 20%에 상응하기 때문에, 큐벳-기반 EFC (도 20)는 전체 시스템에 대해 ~238 Wh kg^-1의 에너지 저장 밀도를 갖는다. 이러한 생체배터리는 더 우수한 에너지 밀도 및 더 약한 환경적 영향을 가지기 때문에 이들은 환경 친화적인 일회용 일차 배터리로 간주될 수 있다.

이러한 합성 경로를 통한 당 생체배터리의 에너지 밀도에 있어서의 10배의 개선에 더하여, 1종의 산화환원 효소를 구비한 시스템 (도 15)에 비해, 유일한 가스 산물 (CO₂)이 양극 구획으로부터 용이하게 방출될 수 있고 비-고정화 효소가 EFCs로부터 씻겨 나가지 않기 때문에, 비-고정화 효소 캐스케이드를 구비한 생체배터리는 당 용액의 첨가에 의해 보충될 수 있다. 상기 비-고정화 효소 EFC를 2회 당 용액을 첨가함으로써 검사하였다 (도 21). 그러나, EFCs의 감소된 성능은 EFCs의 수명을 연장하는데 요구되는 더 많은 연구 및 개발을 제안하였다.

이러한 당 생체배터리는 새로운 유형의 재충전 가능한 배터리를 나타낸다. 폐쇄형 일차 및 이차 배터리에 비해 연료 전지의 가장 우수한 이점 중 하나는 이들이 지속적으로 (예컨대, 양성자 교환 막 연료 전지) 또는 간헐적으로 (예를 들어, 직접 메탄올 연료 전지 및 당 배터리) 연료 전지 장치 내로 공급될 수 있는 고-에너지 밀도 연료 (예컨대, H₂, 메탄올, 글루코스, 및 말토덱스트린)를 사용하는 개방형 시스템이라는 것이다. 연료 대 연료 전지 시스템의 중량비가 충분히 크거나 (즉, 5-10) 연료 전지가 수 차례 보충되는 경우, 연료, 연료 탱크, 및 연료 전지 시스템을 포함하는 전체 시스템의 에너지 밀도는 사용되는 연료의 이론적 에너지 밀도에 근접할 수 있다. 명백하게, 연료로서 무수 (water-free) 화학물질의 사용은 에너지 저장 밀도 측면에서 더욱 매력적이다 (도 15). 그러나, 이러한 시스템은 분리된 연료 탱크 및 복잡한 연료 공급 시스템을 요구한다.

말토덱스트린은 알코올 (예컨대, 메탄올) 또는 글루코스보다는 더 우수한 EFC 연료이다. 말토덱스트린은 합성 경로를 통해 서서히 이용되어 단시간에 걸친 피크 전력보다는 거의 일정한 전력 출력을 생성한다 (도 10F). 또한, 대부분의 효소는 억제 또는 낮은 수 활성 (water activity)으로 인해 고농도의 알코올 또는 글루코스에서는 제대로 작동할 수 없다. 예를 들어, EFCs에 사용될 수 있는 가장 높은 메탄올 농도는 대략 0.5 M로서, 이는 40.2 Wh kg^- ¹ 의 낮은 에너지 저장 밀도를 초래한다 (도 15). 유사하게, 고농도의 글루코스 (예컨대, 0.4 M)는 효소 활성을 손상시킬 수 있는 높은 삼투압 (~9.85 atm)을 유도한다. 글루코스를 CO₂로 산화시키는 6개-효소 EFC에 비해, 여러 기질을 한번에 촉매하는 1개 효소의 내재적으로 낮은, 그러나 잡다한, 활성은 매우 낮은 전력 밀도를 초래한다. 생체상품 (biocommodities), 정제 화학제품, 및 의약품의 생산을 위한 복잡한 반응을 실행하기 위해 10개 이상의 효소의 사용이 경제적으로 터무니 없는 (prohibitive) 것으로 보이지는 않는다.

당 생체배터리에 대한 가장 중요한 사안 중 하나는 이들의 수명을 연장하는 것이다. 이는 효소, 보조인자, 및 매개체의 안정성을 개선하는 것을 포함한다. 비-고정화 EFCs의 감소된 성능을 연구하기 위하여 예비적 진단 실험을 수행하였다 (도 22A). EFC에 새로운 기질 및 효소 혼합물의 첨가는 최대 전력 출력의 4분의 1을 초래하였는데, 이는 효소 불활성화가 실온에서 1주일 이상의 작동 후 감소된 전력 출력의 원인 중 하나임을 제안하는 것이다. 대부분의 EFCs에서와 같이 고정화 효소를 사용하는 대신, 본 발명자들은 (극-)호열성 미생물로부터 분리된 비-고정화 호열효소를 사용하여 효소의 수명을 연장하였다. 명백하게, 호열성 생물로부터 분리된, PGI, αGP, 및 PGM과 같은 상대적으로 비-안정성 호열효소는 극호열성 생물로부터의 효소 또는 단백질 공학 (즉, 합리적 고안, 유도 진화 또는 방법들의 조합)에 의해 생성된 조작된 돌연변이 효소로 대체될 수 있다. 또한, 비-고정화 효소의 반감기는 1 g L^-1의 소 혈청 알부민 및 0.1% 트리톤 X-100의 첨가를 통해 5.0일에서 7.7일로 증가하였는데 (도 22B), 이는 효소 혼합물의 형성이 또한 비-고정화 효소 혼합물의 수명을 연장하도록 조정될 수 있음을 제안하는 것이다. 나아가, 노후한 양극의 새로운 양극으로의 교체는 최대 전력 출력의 거의 반으로 전력 출력을 배가하는데 (도 22A), 이는 양극으로부터 흡착된 VK₃의 침출이 더 낮은 전력 출력을 초래함을 나타내는 것이다. 따라서, 양극의 표면 위에 VK₃-유사 매개체를 고정하기 위해 더 우수한 방법을 채택하는 것이 중요할 것이다.

따라서, 공기-호흡형 EFC에서 13개의 효소로 이루어진 합성 ATP- 및 CoA-부재 촉매 경로는 말토덱스트린의 글루코스 단위를 완전히 산화시켜, 글루코스 당 거의 24개의 전자를 양산하도록 구성되었다. 본 발명자들은 비-고정화 효소에 근거한 EFC가 고정화 효소의 것들보다 훨씬 더 높은 최대 전력 출력을 나타낸다는 것을 발견하였다. 이러한 당-전력을 갖춘 배터리는 고 에너지 저장 밀도 및 고 안정성을 특징으로 한다. 따라서, 이들 배터리는 휴대용 전자기기에 특히 유용할 수 있는 차세대 마이크로-전력 공급원을 나타낸다.

조작된 (Engineered) GsG6PDH

야생형 지오바실러스 스테아로써모필러스 (Geobacillus stearothermophilus) G6PDH (GsG6PDH)는 NADP보다 NAD를 선호하지만 생체모사체에는 작동하지 않는다 (도 7, 화합물 A-E). 합리적 고안 및/또는 유도 진화에 의한 단백질 공학 후, NMN (화합물 A)에 작동하는 조작된 GsG6PDH (T13G/R46G)를 생산하였다 (도 11).

상기 기술내용은 본 발명의 특정 실시양태를 제공한다. 상기 기술내용은 전적으로 예시적으로 고려되며 발명의 요지로부터 벗어나지 않는 변형이 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 본 발명은 상이하지만 본원의 교시의 이익을 갖는 통상의 기술자에게 자명한 동등한 방식으로 변형되고 실시될 수 있기 때문에, 상기에 기술된 특정 실시양태는 단지 예시적일 뿐이다.

상기에 기술된 특정 예시적인 실시양태가 변경 또는 변형될 수 있고 이러한 모든 변형이 본 발명의 범주 및 요지 내인 것으로 고려된다는 것이 자명하다. 발명의 범주 또는 요지를 벗어나지 않고 본 발명을 실시하는데 있어서 상기 기재에 대해 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있음이 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 통상의 기술자는 이러한 특징이 주어진 출원 또는 고안의 요건 및 명세서에 근거하여 단독으로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있음을 인식할 것이다.

참조

Addo, P. K., Arechederra, R. L. and Minteer, S. D. 2010. Evaluating enzyme cascades for methanol/air biofuel cells based on NAD⁺-dependent enzymes. Electroanalysis 22, 807-812.

Akers, N. L., C. M. Moore and S. D. Minteer. 2005. Development of alcohol/O2 biofuel cells using salt-extracted tetrabutylammonium bromide/Nafion membranes to immobilize dehydrogenase enzymes. Electrochim. Acta 50(12):2521-2525.

Ardao, I. and Zeng, A.-P. 2013. In silico evaluation of a complex multi-enzymatic system using one-pot and modular approaches: Application to the high-yield production of hydrogen from a synthetic metabolic pathway. Chem. Eng. Sci. 87:183-193.

Arechederra, R. and S. D. Minteer. 2008. Organelle-based biofuel cells: Immobilized mitochondria on carbon paper electrodes. Electrochimica Acta 53(23):6698-6703.

Arechederra, R. L. and Minteer, S. D. 2009. Complete oxidation of glycerol in an enzymatic biofuel cell. Fuel Cells 9:63-69.

Armand, M. and J. M. Tarascon. 2008. Building better batteries. Nature 451(7179):652-657.

Barbir, F. PEM Fuel Cells: Theory and Practice. (Academic Press, 2005).

Bond, D. R. and Lovley, D. R. 2003. Electricity Production by Geobacter sulfurreducens Attached to Electrodes. Appl. Environ. Microbiol. 69: 1548-1555.

Bujara, M., Schuemperli, M., Pellaux, R., Heinemann, M. and Panke, S. 2011. Optimization of a blueprint for in vitro glycolysis by metabolic real-time analysis. Nat. Chem. Biol. 7:271-277.

Calabrese Barton, S., Gallaway, J. and Atanassov, P. 2004. Enzymatic biofuel bells for implantable and microscale devices. Chem. Rev. 104:4867-4886.

Campbell, E., Meredith, M., Minteer, S. D. and Banta, S. 2012. Enzymatic biofuel cells utilizing a biomimetic cofactor. Chem. Commun. 48:1898-1900.

Caruana, D. J. and Howorka, S. 2010. Biosensors and biofuel cells with engineered proteins. Mol. BioSyst. 6:1548-1556.

Chakraborty, S., Sakka, M., Kimura, T. and Sakka, K. 2008. Two proteins with diaphorase activity from Clostridium thermocellum and Moorella thermoacetica. Biosci. Biotechnol. Biochem. 72:877-879.

Chaudhuri, S. K. and Lovley, D. R. 2003. Electricity generation by direct oxidation of glucose in mediatorless microbial fuel cells. Nat. Biotechnol. 21:1229-1232.

Chen, Z. et al. 2011. Three-dimensional flexible and conductive interconnected graphene networks grown by chemical vapour deposition. Nat. Mater. 10:424-428.

Chen, S. et al. 2012. Layered corrugated electrode macrostructures boost microbial bioelectrocatalysis. Energy Environ. Sci. 5:9769-9772.

Chen, Z. et al. 2013. New class of nonaqueous electrolytes for long-life and safe lithium-ion batteries. Nat. Commun. 4:1513.

Cooney, M. J., Svoboda, V., Lau, C., Martin, G. and Minteer, S. D. 2008. Enzyme catalysed biofuel cells. Energy Environ. Sci. 1:320-337.

Fish RH, Kerr JB, Lo HC; 2004. Agents for replacement of NAD+/NADH system in enzymatic reaction. US patent 6,716,596 B2. USA.

Hong, J., Wang, Y., Ye X and Zhang, Y.-H. P. 2008. Simple protein purification through affinity adsorption on regenerated amorphous cellulose followed by intein self-cleavage. J. Chromatogr. A 1194:150-154.

Huang, S. Y., Zhang, Y.-H. P. and Zhong, J. J. 2012. A thermostable recombinant transaldolase with high activity over a broad pH range. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93:2403-2410.

Johnston, W., Cooney, M. J., Liaw, B. Y., Sapra, R. and Adams, M. W. W. 2005. Design and characterization of redox enzyme electrodes: new perspectives on established techniques with application to an extremeophilic hydrogenase. Enzyme Microb. Technol. 36:540-549.

Kim, J., Jia, H. and Wang, P. 2006. Challenges in biocatalysis for enzyme-based biofuel cells. Biotechnol. Adv. 24:296-308.

Kim, Y. H., Campbell, E., Yu, J., Minteer, S. D. and Banta, S. 2013. Complete Oxidation of Methanol in Biobattery Devices Using a Hydrogel Created from Three Modified Dehydrogenases. Angew. Chem. Int. Ed. 52:1437-1440.

Krutsakorn, B. et al. 2013. In vitro production of n-butanol from glucose. Metab. Eng. 20:84-91.

Martin del Campo, J. S. et al. 2013. High-Yield Production of Dihydrogen from Xylose by Using a Synthetic Enzyme Cascade in a Cell-Free System. Angew. Chem. Int. Ed. 52:587-4590.

Minteer, S. D., B. Y. Liaw and M. J. Cooney. 2007. Enzyme-based biofuel cells. Curr. Opin. Biotechnol. 18(3):228-234.

Moehlenbrock, M. and S. Minteer. 2008. Extended lifetime biofuel cells. Chem. Soc. Rev. 37:1188-1196.

Myung, S., Wang, Y. R. and Zhang, Y.-H. P. 2010. Fructose-1,6-bisphosphatase from a hyper-thermophilic bacterium Thermotoga maritima: Characterization, metabolite stability and its implications. Proc. Biochem. 45:1882-1887.

Myung, S., Zhang, X.-Z. and Zhang, Y.-H. P. 2011. Ultra-stable phosphoglucose isomerase through immobilization of cellulose-binding module-tagged thermophilic enzyme on low-cost high-capacity cellulosic adsorbent. Biotechnol. Prog. 27:969-975.

Myung, S. and Zhang, Y.-H. P. 2013. Non-complexed four cascade enzyme mixture: simple purification and synergetic co-stabilization. PLos One 8:e61500.

Okuno H, Nagata K, Nakajima H. 1985. Purification and properties of glucose-6-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus. J. Appl. Biochem. 7:192-201.

Palmore, G. T. R., Bertschy, H., Bergens, S. H. and Whitesides, G. M. 1998. A methanol/dioxygen biofuel cell that uses NAD⁺-dependent dehydrogenases as catalysts: application of an electro-enzymatic method to regenerate nicotinamide adenine dinucleotide at low overpotentials. J. Electroanal. Chem. 443:155-161.

Rollin, J. A., Tam, W. and Zhang, Y.-H. P. 2013. New biotechnology paradigm: cell-free biosystems for biomanufacturing. Green Chem. 15:1708-1719.

Sakai, H., T. Nakagawa, H. Mita, R. Matsumoto, T. Sugiyama, H. Kumita, Y. Tokita and T. Hatazawa. 2009. A high-power glucose/oxygen biofuel cell operating under quiescent conditions. ECS Trans. 16(38):9-15.

Sakai, H., T. Nakagawa, Y. Tokita, T. Hatazawa, T. Ikeda, S. Tsujimura and K. Kano. 2009. A high-power glucose/oxygen biofuel cell operating under quiescent conditions. Energy Environ. Sci. 2:133-138.

Shimizu, Y. et al. 2001. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 19:751-755.

Sokic-Lazic, D. and S. D. Minteer. 2008. Citric acid cycle biomimic on a carbon electrode. Biosens. Bioelectron. 24(4):939-944.

Sun, F. F., Zhang, X. Z., Myung, S. and Zhang , Y.-H. P. 2012. Thermophilic Thermotoga maritima ribose-5-phosphate isomerase RpiB: Optimized heat treatment purification and basic characterization. Protein Expr. Purif. 82:302-307.

Togo, M., Takamura, A., Asai, T., Kaji, H. and Nishizawa, M. 2007. An enzyme-based microfluidic biofuel cell using vitamin K3-mediated glucose oxidation. Electrochimica Acta 52:4669-4674.

Tokita, Y., T. Nakagawa, H. Sakai, T. Sugiyama, R. Matsumoto and T. Hatazawa. 2008. Sony's Biofuel Cell. ECS Trans. 13(21):89-97.

Walcarius, A., Minteer, S., Wang, J., Lin, Y. and Merkoci, A. 2013. Nanomaterials for bio-functionalized electrodes: recent trends. J. Mat. Chem. B 1:4878-4908.

Wang, Y. and Zhang, Y.-H. P. 2010. A highly active phosphoglucomutase from Clostridium thermocellum: Cloning, purification, characterization, and enhanced thermostability. J. Appl. Microbiol. 108:39-46.

Wang, Y., Huang, W., Sathitsuksanoh, N., Zhu, Z. and Zhang, Y.-H. P. 2011. Biohydrogenation from biomass sugar mediated by in vitro synthetic enzymatic pathways. Chem. Biol. 18:72-380.

Willner, B., Katz, E. and Willner, I. 2006. Electrical contacting of redox proteins by nanotechnological means. Curr. Opin. Biotechnol. 17:589-596.

Wu, Z.-Y., Li, C., Liang, H.-W., Chen, J.-F. and Yu, S.-H. 2013. Ultralight, Flexible, and Fire-Resistant Carbon Nanofiber Aerogels from Bacterial Cellulose. Angew. Chem. Int. Ed. 52:2925-2929.

Xu, S. and Minteer, S. D. 2011. Enzymatic Biofuel Cell for Oxidation of Glucose to CO₂. ACS Catal. 1:91-94.

You, C., Myung, S. and Zhang, Y.-H. P. 2012. Facilitated substrate channeling in a self-assembled trifunctional enzyme complex. Angew. Chem. Int. Ed. 51:8787-8790.

You, C. et al. 2013. Enzymatic transformation of nonfood biomass to starch. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 110:7182-7187.

Ye, X. et al. 2012. Synthetic metabolic engineering-a novel, simple technology for designing a chimeric metabolic pathway. Microb. Cell Fact. 11:120.

Zaks, A. and Klibanov, A. M. 1988. The effect of water on enzyme action in organic media. J. Biol. Chem. 263:8017-8021.

Zebda, A. et al. 2011. Mediatorless high-power glucose biofuel cells based on compressed carbon nanotube-enzyme electrodes. Nat. Commun. 2:370.

Zhang, Y.-H. P., Cui, J., Lynd, L. R. and Kuang, L. R. 2006. A transition from cellulose swelling to cellulose dissolution by o-phosphoric acid: evidence from enzymatic hydrolysis and supramolecular structure. Biomacromolecules 7, 644-648.

Zhang, Y.-H. P. 2009. A sweet out-of-the-box solution to the hydrogen economy: is the sugar-powered car science fiction? Energy Environ. Sci. 2:272-282.

Zhang, Y.-H. P. 2010. Production of biocommodities and bioelectricity by cell-free synthetic enzymatic pathway biotransformations: Challenges and opportunities. Biotechnol. Bioeng. 105:663-677.

Zhao, X., Jia, H., Kim, J. and Wang, P. 2009. Kinetic limitations of a bioelectrochemical electrode using carbon nanotube-attached glucose oxidase for biofuel cells. Biotechnol. Bioeng. 104:1068-1074.

Zhu Z, Wang Y, Minteer S, Zhang Y-HP. 2011. Maltodextrin-powered enzymatic fuel cell through a non-natural enzymatic pathway. J. Power Sources 196:7505-7509.

Zhu ZG, Sun F, Zhang X, Zhang Y-HP. 2012. Deep oxidation of glucose in enzymatic fuel cells through a synthetic enzymatic pathway containing a cascade of two thermostable dehydrogenases. Biosens. Bioelectron. 36:110-115.

Claims

헥소스 당(hexose sugars)과 폴리포스페이트, ATP 또는 유리 포스페이트의 화학적 반응에 의해 글루코스 6-포스페이트 (G6P) 및 6-포스포글루코네이트 (6PG)를 생성하는 단계로서, 여기서:
(i) 폴리포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 폴리포스페이트-글루코스 포스포트랜스퍼라제의 존재하에서 폴리포스페이트와 헥소스 당 사이에서 수행되고;
(ii) ATP를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 헥소키나제의 존재하에서 ATP와 헥소스 당 사이에서 수행되고, 여기서 ATP는 폴리포스페이트 키나제의 존재하에서 ADP와 폴리포스페이트를 반응시켜 재생되고; 또는
(iii) 유리 포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 글루칸 포스포릴라제 및 포스포글루코뮤타제의 존재하에서 유리 포스페이트와 헥소스 당 사이에서 수행되는 것인 단계;
상기 G6P와 6PG를 NAD⁺ 또는 이의 산화된 생체모사체 (biomimic)을 수중에서 반응시켜 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 수득하는 단계; 및
상기 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 양극 (anode)표면에서 산화시켜 상기 양극에서 전자를 생성시키는 단계를 포함하는, 헥소스 당으로부터 전자를 생성하는 방법.
제1항에 있어서, 펜토스 포스페이트 경로, 해당과정 및 글루코스신생합성 (gluconeogenesis)의 하이브리드 경로를 통해 리불로스 5-포스페이트로부터 G6P를 재생하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, G6P 및 6PG가 NAD⁺를 이용하는 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제 및 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제의 존재하에서 NAD⁺와 반응하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, G6P 및 6PG가 NAD⁺ 생체모사체를 이용하는 조작된 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제 및 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제의 존재하에서 산화된 NAD⁺ 생체모사체와 반응하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 헥소스 당이 글루코스 또는 프럭토스인 것인, 방법.
제5항에 있어서, 글루코스가:
(i) 글루코스 (자일로스) 이소머라제를 사용하여 프럭토스를 글루코스로 전환하거나; 또는
(ii) 소르비톨 디히드로게나제 및 알데히드 리덕타제를 사용하여 프럭토스를 글루코스로 전환함으로써 생성되는 것인, 방법.
제5항에 있어서, 프럭토스가:
(i) 만노스 이소머라제를 사용하여 만노스를 프럭토스로 전환하거나;
(ii) 폴리포스페이트-글루코스 만노스 포스포트랜스퍼라제 및 포스포만노스 이소머라제를 사용하여 만노스를 프럭토스 6-포스페이트 (F6P)으로 전환한 다음, 포스포글루코스 이소머라제에 의해 F6P를 G6P로 전환하거나; 또는
(iii) 폴리포스페이트 키나제, 헥소키나제, 및 포스포만노스 이소머라제를 사용하여 만노스를 프럭토스 6-포스페이트 (F6P)로 전환한 다음, 포스포글루코스 이소머라제에 의해 F6P를 G6P로 전환함으로써 생성되는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 헥소스 당이 전분 또는 말토덱스트린인 것인, 방법.
제8항에 있어서, G6P가 전분 또는 말토덱스트린 포스포릴라제 및 포스포글루코뮤타제에 의해 포스페이트 및 전분 또는 말토덱스트린으로부터 생성된 것인, 방법.
헥소스 당 및 효소를 포함하는 용액으로서, 상기 용액은 헥소스 당 및 폴리포스페이트, ATP 또는 유리 포스페이트로부터 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 생성하고, 상기 G6P를 NAD⁺ 또는 이의 산화된 생체모사체를 수중에서 반응시켜 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 수득할 수 있고: 여기서
(i) 폴리포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 폴리포스페이트-글루코스 포스포트랜스퍼라제의 존재하에서 폴리포스페이트와 헥소스 당 사이에서 수행되고;
(ii) ATP를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 헥소키나제의 존재하에서 ATP와 헥소스 당 사이에서 수행되고, 여기서 ATP는 폴리포스페이트 키나제의 존재하에서 ADP와 폴리포스페이트를 반응시켜 재생되고; 또는
(iii) 유리 포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 글루칸 포스포릴라제 및 포스포글루코뮤타제의 존재하에서 유리 포스페이트와 헥소스 당 사이에서 수행되는 것인, 용액;
임의로 효소-개질된 양극;
효소 개질된 또는 표준 백금 참조 음극 (cathode); 및
전해질을 포함하는 당 배터리 (sugar battery)이며,
여기서 상기 임의로 효소-개질된 양극이 상기 용액과 접촉하고, 상기 효소 개질된 또는 표준 백금 참조 음극과 임의로 효소-개질된 양극 둘 모두가 전해질과 접촉하며,
상기 전해질이 금속 이온, NAD⁺ 또는 NADH 또는 이의 생체모사체, 및 티아민 피로포스페이트를 함유하는 pH-조절 완충액을 포함하는 것인, 당 배터리.
제10항에 있어서, 전지가 양극에서 전자를 생성하기 위해 양극의 표면 위에서 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체의 산화를 허용하도록 작동가능하게 구성되는 것인, 당 배터리.
6탄당 (6-carbon sugar) 단량체, 또는 올리고헥소스 또는 폴리헥소스로부터의 하나 이상의 6탄당을 폴리포스페이트, ATP 또는 유리 포스페이트와 반응시켜 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 생성하고, NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 수득하기 위해 NAD^- 또는 이의 산화된 생체모사체와 수중에서 반응시키기 위한 용액으로서, 여기서:
(i) 폴리포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 폴리포스페이트-글루코스 포스포트랜스퍼라제의 존재하에서 폴리포스페이트와 헥소스 당 사이에서 수행되고;
(ii) ATP를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 헥소키나제의 존재하에서 ATP와 헥소스 당 사이에서 수행되고, 여기서 ATP는 폴리포스페이트 키나제의 존재하에서 ADP와 폴리포스페이트를 반응시켜 재생되고; 또는
(iii) 유리 포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 글루칸 포스포릴라제 및 포스포글루코뮤타제의 존재하에서 유리 포스페이트와 헥소스 당 사이에서 수행되는 것인, 용액; 및
전자를 생성하기 위해 양극에서 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 산화시키고 음극에 양성자를 전달하도록 작동가능하게 구성된 연료 전지를 포함하는, 발전용 시스템.
제12항에 있어서, 음극에서 양성자 및 산소를 물로 전환하기 위한 촉매를 상기 음극 상에 추가로 포함하는, 시스템.
펜토스 당으로부터 전자를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은:
폴리포스페이트 또는 ATP와 펜토스 당의 화학적 반응으로부터 자일룰로스 5-포스페이트 (X5P)를 생성하는 단계로서, 여기서:
(i) 폴리포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 자일로스 이소머라제 및 폴리포스페이트 자일룰로키나제의 존재하에서 펜토스 당과 폴리포스페이트 사이에서 수행되고; 또는
(ii) ATP를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 자일로스 이소머라제 및 ATP-기반 자일룰로키나제의 존재하에서 펜토스 당과 ATP 사이에서 수행되고, 상기 ATP가 폴리포스페이트 키나제 또는 폴리포스페이트:AMP 포스포트랜스퍼라제와 폴리포스페이트-비의존성 아데닐레이트 키나제의 조합의 존재하에서 ADP를 폴리포스페이트와 반응시킴으로써 생성되는 것인 단계;
상기 X5P를 펜토스 포스페이트 경로로 진입시켜 G6P를 생성하는 단계;
상기 G6P를 NAD⁺ 또는 이의 산화된 생체모사체와 수중에서 반응시켜 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 수득하는 단계; 및
상기 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 양극 표면 위에서 산화시켜 상기 양극에서 전자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
5탄당 및 효소를 포함하는 용액으로서, 상기 용액은 5탄당 및 폴리포스페이트 또는 ATP로부터 자일룰로스 5-포스페이트를 생성하고, 비-산화적 펜토스 포스페이트 경로를 통해 자일룰로스 5-포스페이트로부터 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 생성하며, 상기 G6P를 NAD⁺ 또는 이의 산화된 생체모사체와 수중에서 반응시켜 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 수득할 수 있고, 여기서:
a. 폴리포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 폴리포스페이트-자일로스 키나제의 존재하에서 폴리포스페이트와 5탄당 사이에서 수행되고; 또는
b. ATP를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 자일룰로키나제의 존재하에서 ATP와 5탄당 사이에서 수행되고, 상기 ATP는 폴리포스페이트 키나제의 존재하에서 ADP와 폴리포스페이트를 반응시켜 생성된 것인, 용액;
임의로 효소-개질된 양극;
효소 개질된 또는 표준 백금 참조 음극; 및
전해질을 포함하는 당 배터리로서,
여기서 상기 임의로 효소-개질된 양극이 상기 용액과 접촉하고, 상기 효소 개질된 또는 표준 백금 참조 음극과 임의로 효소-개질된 양극 둘 모두가 전해질과 접촉하며,
상기 전해질이 금속 이온, NAD⁺ 또는 NADH 또는 이의 생체모사체, 및 티아민 피로포스페이트를 함유하는 pH-조절 완충액을 포함하는 것인, 당 배터리.
5탄당 및 폴리포스페이트 또는 ATP로부터 자일룰로스 5-포스페이트를 생성하고, 비-산화적 펜토스 포스페이트 경로를 통해 자일룰로스 5-포스페이트로부터 글루코스 6-포스페이트 (G6P)를 생성하며, 상기 G6P를 NAD⁺ 또는 이의 산화된 생체모사체와 수중에서 반응시켜 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 수득하기 위한 용액으로서, 여기서:
(i) 폴리포스페이트를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 폴리포스페이트-자일룰로키나제의 존재하에서 폴리포스페이트와 5탄당 사이에서 수행되고; 또는
(ii) ATP를 사용하는 경우, 상기 화학적 반응이 자일룰로키나제의 존재하에서 ATP와 5탄당 사이에서 수행되고, 여기서 ATP는 폴리포스페이트 키나제의 존재하에서 ADP와 폴리포스페이트를 반응시킴으로써 생성된 것인, 용액;
전자를 생성하기 위해 양극에서 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 산화시키고 음극에 양성자를 전달하도록 작동가능하게 구성된 연료 전지, 및
양성자 및 산소를 물로 전환하기 위한 음극 촉매를 포함하는, 발전용 시스템.
제10항 또는 제15항에 있어서, pH-조절 완충액이 HEPES 완충액인 것인, 당 배터리.
제10항 또는 제15항에 있어서, 금속 이온이 Mg² ⁺ 및 Mn² ⁺로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 이온인 것인, 당 배터리.
당으로부터 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 생성하는 단계; 및
상기 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 산화시켜 양극에서 전자를 생성하는 단계를 포함하고,
여기서 상기 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체가 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 리불로스 5-포스페이트 3-에피머라제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 알돌라제, 프럭토스 1,6-비스포스파타제, 및 포스포글루코스 이소머라제를 포함하는 효소의 그룹을 사용하여 생성되는 것인, 당으로부터 전자를 생성하는 방법.
제19항에 있어서, 당이 헥소스 또는 펜토스 당인 것인, 방법.
제19항에 있어서, NADH 또는 이의 환원된 생체모사체가 다이아포라제 (diaphorase)에 의해 산화되는 것인, 방법.
제21항에 있어서, NADH 또는 이의 환원된 생체모사체가 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 (biomimetic)중 하나 이상의 존재하에서 산화되는 것인, 방법.
제22항에 있어서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상이 양극 표면 위에 고정되는 것인, 방법.
제22항에 있어서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상이 양극 구획 내에서 유리되는 것인, 방법.
당, 효소, 및 전해질을 포함하는 용액;
양극; 및
음극을 포함하는 당 배터리로서,
여기서 상기 양극 및 음극이 상기 용액과 접촉하고;
상기 전해질이 금속 이온, NAD⁺ 또는 NADH 또는 이의 생체모사체, 및 티아민 피로포스페이트를 함유하는 pH-조절 완충액을 포함하고,
상기 효소가 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 리불로스 5-포스페이트 3-에피머라제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 알돌라제, 프럭토스 1,6-비스포스파타제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 산화시킬 수 있는 효소를 포함하는 것인, 당 배터리.
제25항에 있어서, 당이 헥소스 또는 펜토스 당인 것인, 당 배터리.
제25항에 있어서, NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 산화시킬 수 있는 효소가 다이아포라제인 것인, 당 배터리.
제25항에 있어서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 당 배터리.
제28항에 있어서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상이 양극 표면 위에 고정되는 것인, 당 배터리.
제28항에 있어서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상이 양극 구획 내에서 유리되는 것인, 방법.
당, 효소, 및 전해질을 포함하는 용액;
양극 및 음극을 포함하는 연료 전지; 및
발전기를 포함하는, 발전용 시스템으로서,
여기서 상기 용액 및 발전기가 상기 연료 전지와 접촉하고;
상기 전해질이 금속 이온, NAD⁺ 또는 NADH 또는 이의 생체모사체, 및 티아민 피로포스페이트를 함유하는 pH-조절 완충액을 포함하고;
상기 효소가 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제, 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 리보스 5-포스페이트 이소머라제, 리불로스 5-포스페이트 3-에피머라제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 알돌라제, 프럭토스 1,6-비스포스파타제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 산화시킬 수 있는 효소를 포함하는 것인, 발전용 시스템.
제31항에 있어서, 당이 헥소스 또는 펜토스 당, 또는 이의 혼합물인 것인, 시스템.
제31항에 있어서, NADH 또는 이의 환원된 생체모사체를 산화시킬 수 있는 효소가 다이아포라제인 것인, 시스템.
제31항에 있어서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 시스템.
제34항에 있어서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상이 양극 표면 위에 고정되는 것인, 시스템.
제34항에 있어서, 비타민 K₃, 벤질 비올로겐, 또는 이의 생체모방체 중 하나 이상이 양극 구획 내에서 유리되는 것인, 시스템.