CN104471771A - 使用无细胞合成酶促通路将糖完全氧化成电能 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物电领域。本发明提供了能够将糖中储存的化学能转化成有用的电能的能量发生系统、方法和装置。

Description

使用无细胞合成酶促通路将糖完全氧化成电能

发明背景

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年6月5日提交的美国临时申请第61/831，346号的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。

技术领域

本发明涉及生物电领域。更具体地，本发明提供了能够将多种可再生糖中储存的化学能转化成有用的电能的能量发生系统、方法和装置。在具体实施方式中，本发明涉及使用酶促燃料电池和几种具有工程改造和/或新发现功能的关键酶将来自六碳糖和五碳糖的化学能转化为电能的新型合成酶促通路。

相关技术说明

电池是电能储存装置。可充电电池是目前可用的。但是，这类可充电电池的能量储存密度比氢或液体燃料的能量储存密度低得多(图1，组图A和B)。对于具有较高能量储存密度、完整寿命循环的较低成本、减少的环境影响和增加的安全性的更好的可充电电池(图1，组图C)存在明显的需求。

酶促燃料电池(EFC)是一类生物燃料电池，其使用酶来将燃料中的化学能转化成电能。EFC优于电池，主要是由于它们：1)具有比化学电池高约10-100倍的能量储存密度；并且2)由于生物可降解性和重金属及昂贵稀有金属的排除，更具环境友好性。EFC(图2，组图B)与定向甲醇燃料电池(DMFC)具有一些共同之处(图2，组图A)。但是，与DMFC不同，酶促燃料电池并不需要昂贵的铂作为阳极催化剂，并且由于酶的高选择性，它们可不使用纳菲(nafion)膜。另外，与DMFC中的甲醇相比，EFC中使用的糖更便宜、无毒且不可燃，糖溶液的能量密度高于1M甲醇溶液的能量密度。酶促燃料电池通常由酶加载(酶修饰)的阳极和酶加载(酶修饰)的阴极组成(图2，组图B)。

在EFC中，当燃料在阳极处氧化时产生电子。然后电子从阳极通过外部负荷流向阴极。在阳极反应中同时(与电子一起)产生质子并且通过聚合物分隔器流向阴极以补偿电子流。EFC的最大挑战之一是从低成本和最丰富的糖中提取大部分或全部的化学能用于发电。除了采用糖作为热能来源通过在空气中燃烧或作为化学能来源用于通过由活生物体(如微生物、动物)内的氧化还原酶产生的NAD(P)H产生ATP的方法以外，迄今为止还没有开发出使用糖的全部能量的方法。还没有能够直接有效利用糖的大部分化学能作为电(电子)能的方法。

发明内容

在一个实施方式中，本发明提供了从己糖中产生电子的方法，包括：从来自寡聚己糖或多聚己糖的6-碳糖单体或一种或多种6碳糖与聚磷酸盐/酯或ATP或磷酸盐/酯的化学反应产生葡萄糖-6-磷酸(G6P)，其中：(i)当使用聚磷酸盐/酯时，在聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶存在下进行化学反应；或(ii)当使用ATP时，在己糖激酶存在下进行化学反应，并且其中通过在聚磷酸激酶存在下将ADP与聚磷酸酯/盐反应产生ATP；(iii)当使用游离的磷酸酯/盐时，在葡聚糖磷酸化酶(例如，淀粉磷酸化酶、麦芽糖磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、纤维二糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶)和葡萄糖磷酸变位酶存在下进行化学反应；将G6P和6PG与NAD⁺或其类似物(称为氧化形式的仿生物)在水中反应以得到NADH或还原的仿生物；和，在阳极上其表面处使NADH或还原的仿生物氧化来产生电子。在一个实施方式中，核酮糖5-磷酸的产物通过非氧化磷酸戊糖、糖酵解和糖异生的混合通路被转化为G6P。

在另一个实施方式中，该方法还包括NAD仿生物(图7，化合物A-E)来代替NAD。

在一些实施方式中，该方法还包括可使用NAD仿生物的经工程改造的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶。

在一些实施方式中，该方法还包括葡萄糖作为糖。在一个实施方式中，葡萄糖通过聚磷酸葡萄糖激酶或己糖激酶转化为葡萄糖6-磷酸。在一些实施方式中，该方法还包括由如下方式产生葡萄糖：(i)使用葡萄糖(木糖)异构酶将果糖转化为葡萄糖；或(ii)用山梨糖醇脱氢酶和醛还原酶将果糖转化为葡萄糖。

在其他实施方式中，该方法还包括通过以下方式产生果糖或果糖-6-磷酸：(i)使用甘露糖异构酶将甘露糖转化为果糖，然后，在一个实施方式中，进入上述的果糖-利用通路；(ii)使用聚磷酸-葡萄糖甘露糖磷酸转移酶和磷酸甘露糖异构酶将甘露糖转化为果糖-6-磷酸(F6P)并且，在一个实施方式中，产物F6P进入经修饰的磷酸戊糖通路；或(iii)通过使用聚磷酸激酶、己糖激酶和磷酸甘露糖异构酶将甘露糖转化为果糖-6-磷酸并且，在一个实施方式中，随后产物F6P进入经修饰的磷酸戊糖通路。

在一些实施方式中，该方法还包括淀粉或麦芽糊精作为糖。在其他实施方式中，该方法还包括磷酸酯/盐和葡萄糖磷酸变位酶和淀粉或麦芽糊精磷酸化酶用于产生G6P。

在一些实施方式中，本发明提供了一种糖电池，所述糖电池包含：能够从来自寡己糖或多聚己糖的6-碳糖单体或一种或多种6碳糖与聚磷酸酯/盐或ATP或磷酸酯/盐反应产生葡萄糖-6-磷酸(G6P)的溶液，并且该溶液用于将G6P与NAD⁺或其类似物在水中反应得到NADH或其类似物(仿生物)，其中：(i)当使用聚磷酸酯/盐时，在聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶存在下进行化学反应；或(ii)当使用ATP时，在己糖激酶存在下进行化学反应，并且其中通过在聚磷酸激酶存在下将ADP与聚磷酸酯/盐反应产生ATP；(iii)当使用游离的磷酸酯/盐时，在葡聚糖磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶存在下进行化学反应；酶修饰的阳极；酶修饰的或标准铂参考阴极；和电解质，其中酶修饰的阳极或阳极与包含六碳糖和合成通路中的一些酶的溶液接触并且阴极和酶修饰的阳极都与电解质接触。

在一些实施方式中，电解质由含有金属离子如(Mg⁺⁺、Mn⁺⁺)、NAD⁺或NADH或其仿生物和硫胺焦磷酸素的pH-控制缓冲液(例如，HEPES)组成。在一些实施方式中，电池经可操作地配置以使得NADH或其仿生物在阳极的表面上氧化产生电子。

在一些实施方式中，本发明提供了一种产生能量的系统，包括：包含能够从来自寡己糖或多聚己糖的6-碳糖单体或一种或多种6碳糖与聚磷酸酯/盐或ATP或磷酸酯/盐反应产生葡萄糖-6-磷酸(G6P)的溶液的燃料，并且其用于将G6P与NAD⁺和氧化的仿生物在水中反应得到NADH和还原的仿生物，其中：(i)当使用聚磷酸酯/盐时，在聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶存在下进行化学反应；或(ii)当使用ATP时，在己糖激酶存在下进行化学反应，并且其中通过在聚磷酸激酶存在下将ADP与聚磷酸酯/盐反应产生ATP；(iii)当使用游离的磷酸酯/盐时，在葡聚糖磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶存在下进行化学反应；燃料电池，其可操作地配置为在阳极上氧化NADH及其仿生物以产生电子并且用于通过例如外部电路向阴极递送电子。在一个实施方式中，阴极上的催化剂将质子和氧转化为水。

在一些实施方式中，本发明提供了用于从戊糖产生电子的方法，所述方法包括：从5-碳糖单体与聚磷酸酯/盐或ATP的化学反应中产生木酮糖-5-磷酸(X6P)，其中：(i)当使用聚磷酸酯/盐时，在木糖异构酶和聚磷酸木酮糖激酶存在下进行化学反应；或(ii)当使用ATP时，在木糖异构酶和ATP-基木酮糖激酶存在下进行化学反应，并且其中通过在聚磷酸激酶或聚磷酸：AMP磷酸转移酶和聚磷酸酯非依赖性腺苷酸激酶的组合存在下将ADP与聚磷酸酯/盐反应产生ATP；进入磷酸戊糖通路用于产生G6P；将G6P与NAD⁺及氧化仿生物在水中反应得到NADH及还原的仿生物；在阳极表面上使NADH及还原的仿生物氧化以产生电子。

在一些实施方式中，本发明提供了一种糖电池，所述糖电池包含：能够从5-碳糖单体与聚磷酸酯/盐或ATP反应产生木酮糖-5-磷酸的溶液，并且该溶液用于通过非氧化磷酸戊糖通路产生葡萄糖-6-磷酸并将G6P与NAD⁺或其类似物在水中反应得到NADH或其类似物(仿生物)，其中：a.当使用聚磷酸酯/盐时，在聚磷酸-木酮糖激酶存在下进行化学反应；或b.当使用ATP时，在木酮糖激酶存在下进行化学反应，并且其中通过在聚磷酸激酶存在下将ADP与聚磷酸酯/盐反应产生ATP；酶修饰的阳极或阳极；酶修饰的或标准铂参考阴极；和电解质，其中酶修饰的阳极或阳极与包含五碳糖和合成通路中的一些酶的溶液接触并且阴极和酶修饰的阳极都与电解质接触。

在一些实施方式中，电解质由含有金属离子如(Mg⁺⁺或Mn⁺⁺)、NAD⁺或NADH或其仿生物和硫胺焦磷酸素的pH-控制缓冲液(例如，HEPES)组成。

在一些实施方式中，本发明提供了产生能量的系统，包括：包含用于从5-碳糖单体与聚磷酸酯/盐或ATP的反应中产生木酮糖-5-磷酸的溶液的燃料，并且其用于通过非氧化磷酸戊糖通路产生G6P，供于使G6P与NAD⁺及其仿生物在水中反应得到NADH和还原的仿生物，其中：(i)当使用聚磷酸酯/盐时，在聚磷酸-木酮糖激酶存在下进行化学反应；或(ii)当使用ATP时，在木酮糖激酶存在下进行化学反应，并且其中通过在聚磷酸激酶存在下将ADP与聚磷酸酯/盐反应产生ATP；燃料电池，其可操作地配置为在阳极上使NADH及其仿生物氧化以产生电子并且用于向阴极递送电子；用于将来自阴极的电子转化成电能的发电机。

在一些实施方式中，本发明提供了从糖产生电子的方法，包括：从糖产生NADH或其还原的仿生物；和在阳极使NADH或其还原的仿生物氧化以产生电子，其中使用下组包含的酶产生NADH或其还原的仿生物：葡萄糖6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、核糖5-磷酸异构酶、核酮糖5-磷酸3-差向异构酶、转酮酶、转醛酶、丙糖磷酸异构酶、醛缩酶、果糖1，6-二磷酸酶和磷酸葡糖异构酶。

在一些实施方式中，该方法包括己糖或戊糖作为糖。

在该方法的一个实施方式中，NADH或其还原的仿生物被心肌黄酶氧化。在该方法的另一个实施方式中，在维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种存在下，NADH或其还原的仿生物被氧化。在一些实施方式中，维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种固定在阳极表面上。在其他实施方式中，维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种在阳极室内游离。

在一些实施方式中，本发明提供了糖电池，包括：包含糖、酶和电解质的溶液；阳极；和阴极，其中阳极和阴极与该溶液接触；其中电解质包含含有金属离子、NAD⁺或NADH或其仿生物、以及硫胺焦磷酸素的pH-控制缓冲液，并且其中酶包括葡萄糖6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、核糖5-磷酸异构酶、核酮糖5-磷酸3-差向异构酶、转酮酶、转醛酶、丙糖磷酸异构酶、醛缩酶、果糖1，6-二磷酸酶和磷酸葡糖异构酶，和能够氧化NADH或其仿生物的酶。

在一些实施方式中，糖电池包括己糖或戊糖作为糖。在糖电池的一些实施方式中，能够使NADH或其还原仿生物氧化的酶是心肌黄酶。

在一些实施方式中，糖电池还包含维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种。在一些实施方式中，维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种固定在阳极表面上。在其他实施方式中，维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种在阳极室内游离。

在一些实施方式中，本发明提供了发电系统，包括：包含糖、酶和电解质的溶液；包括阳极和阴极的燃料电池；和发电机，其中溶液和发电机与燃料电池接触；其中电解质包含含有金属离子、NAD⁺或NADH或其仿生物、以及硫胺焦磷酸素的pH-控制缓冲液；并且其中酶包括葡萄糖6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、核糖5-磷酸异构酶、核酮糖5-磷酸3-差向异构酶、转酮酶、转醛酶、丙糖磷酸异构酶、醛缩酶、果糖1，6-二磷酸酶和磷酸葡糖异构酶，和能够氧化NADH或其仿生物的酶。

在一些实施方式中，该系统包括己糖或戊糖或其混合物作为糖。在该系统的一些实施方式中，能够使NADH或其还原仿生物氧化的酶是心肌黄酶。

在一些实施方式中，该系统还包含维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种。在一些实施方式中，维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种固定在阳极表面上。在其他实施方式中，维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种在阳极室内游离。

附图简要说明

这些附图显示了本发明的某些实施方式的某些方面，并且不应该用于限制或限定本发明。

图1显示了能量密度比较。组图A显示各种燃料和电池的能量储存密度的比较。组图B显示氢储存技术的能量储存密度的比较。组图C显示可充电电池的能量储存密度的比较。

图2显示定向甲醇燃料电池(DMFC)和由糖供为燃料的酶促燃料电池(EFC)的比较。组图A是典型DMFC的示意图。组图B是通过合成酶促通路能使糖(CH₂O)完全氧化的典型EFC的示意图。

图3是显示含有能使来自从淀粉或葡萄糖产生的G-6-P的六碳糖完全氧化的两条合成通路的糖电池的操作示意图。

图4是显示能够从除了淀粉或葡萄糖以外的六碳糖，如纤维素、纤维糊精、纤维二糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳糖、甘露糖或果糖产生葡萄糖6-磷酸(G6P)的糖电池的操作示意图。

图5是显示能够通过使用ATP或聚磷酸酯/盐从木糖产生木酮糖5-磷酸(X5P)的糖电池的操作示意图。

图6是显示可通过使用便宜的聚磷酸酯/盐再生ATP的补偿通路的示意图。

图7是显示NADH及其仿生物(NMN和NR)以及BCP及其类似替代物(仿生物)的结构的示意图。

图8是示例性酶促燃料电池的示意图(组图A，测试的燃料电池；组图B，阳极上的酶和介体)。

图9-组图A显示使用G6PDH；G6PDH和6PGDH；以及完整通路的糖电池的功率密度对比电流密度。组图B是显示产生的电流对时间以及完全氧化的法拉第(Faraday)效率曲线的图。

图10包括显示对于由糖-驱动的EFC的功率输出的优化(组图A-E)和在室温下150Ω的外部负荷下，由麦芽糊精驱动的13-酶EFC的功率和电流的连续输出(组图F)的概况的图。组图A，在各碳纸上加载CNT；组图B，碳纸的数目；组图C，酶加载；组图D，温度；和组图E，扫描速率。

图11-组图A是嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)葡萄糖6-磷酸脱氢酶(GsG6PDH)同源结构。组图B显示GsG6PDH中的NAD-结合位点。

图12显示了经工程改造的GsG6PDH对天然辅助因子和具有关键氨基酸突变的仿生辅助因子(仿生物)起作用的通路。

图13-组图A显示了含有(1)通过四丁基溴化铵(TBAB)-修饰的纳菲聚合物包埋的固定化固定的酶，(2)通过共价结合的碳纳米管(CNT)固定化固定的酶，和(3)非固定的酶的电极的示意图。组图B是显示这三种电极的电压对比电流密度概况的图。组图C显示了功率对比电流密度的概况。

图14是显示供于麦芽糊精完全氧化的酶促燃料电池的操作示意图。EFC中的酶是：#1 αGP，α-葡聚糖磷酸化酶；#2 PGM，葡萄糖磷酸变位酶；#3 G6PDH，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；#4 6PGDH，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；#5 RPI，核糖5-磷酸异构酶；#6 Ru5PE，核酮糖5-磷酸3-差向异构酶；#7 TK，转酮酶；#8 TAL，转醛酶；#9 TIM，丙糖磷酸异构酶；#10 ALD，醛缩酶；#11 FBP，果糖1，6-二磷酸酶；#12 PGI，磷酸葡糖异构酶；和#13 DI，心肌黄酶。关键代谢物是葡萄糖1-磷酸(G1P)、葡萄糖6-磷酸(G6P)、6-磷酸葡糖酸(6PG)和核酮糖5-磷酸(Ru5P)。P_i表示无机磷酸并且VK₃表示维生素K₃。

图15显示电池和酶促燃料电池之间能量密度的比较。

图16是纯化的酶的SDS-PAGE分析。泳道1：αGP，α-葡聚糖磷酸化酶；泳道2：PGM，葡萄糖磷酸变位酶；泳道3：G6PDH，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；泳道4：6PGDH，6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶；泳道5：RPI，核糖5-磷酸异构酶；泳道6：Ru5PE，核酮糖5-磷酸3-差向异构酶；泳道7：TK，转酮酶；泳道8：TAL，转醛酶；泳道9：TIM，丙糖磷酸异构酶；泳道10：ALD，醛缩酶；泳道11：FBP，果糖1，6-二磷酸酶；泳道12：PGI，磷酸葡糖异构酶；和DI，心肌黄酶。

图17显示EFC设置的方案(组图A)和照片(组图B)。

图18是显示电荷和NADH消耗随着之间变化的概况的图。

图19是显示用或不用麦芽糊精的电流产生的概况。

图20是基于样品池的EFC的照片，显示其前视图(组图A)和两个串联连接以启动数字时钟(组图B)和LED(组图C)的EFC。

图21是显示糖重新填充对非固定EFC的影响。初始的麦芽糊精浓度是0.01mM。在第1点和第2点，向EFC中加入相同量的新鲜底物。

图22-组图A是显示完整通路EFC(含有全部13种酶)的热稳定性和再填充能力的图。电流生成曲线是在室温下在0.1mM麦芽糊精上作用的13-酶EFC的。在第1点(大约210小时)，加入新的酶混合物和1mM麦芽糊精，其中底物在约200小时左右时几乎完全被消耗。在第2点，使用新的含VK₃的阳极来代替旧的阳极。组图B是显示通过加入1g/LBSA和0.1％(wt/v)曲通X-100增强在EFC中非固定的酶的稳定性的图。

发明详述

本发明提供了一种用于将糖中储存的化学能转化为电能的方法。在某些实施方式中，本发明提供了使用酶促燃料电池将六碳糖和五碳糖中的化学能转化成电能的合成(人工)酶促通路。在本发明的优选实施方式中，使用糖电池来将化学能转化为电能。本发明的许多优势之一在于本文所述的糖电池的能量密度可比现有的酶促燃料电池和可充电电池的能量密度高约10-倍。本发明的糖电池的其他优势包括，但不限于，采用便宜的原料、温和的反应条件和便宜的催化剂(例如，酶)、高能量储存密度、低的安全性问题(例如，爆炸或可燃性)、所有材料和催化剂的丰富供应、快速再填充、零碳排放、环境友好以及可用于多种应用中。

本发明的另一个优势在于，与具有低能量储存密度的原电池和二次电池不同，本文所述的燃料电池具有高得多的密度。酶促燃料电池是一类能够使用酶来将化合物中储存的化学能转化为电能的燃料电池。六碳糖单体(例如，葡萄糖、果糖、甘露糖)及其衍生物(例如，麦芽糖、纤维糊精、蔗糖、乳糖、纤维二糖、纤维素、淀粉)和木糖及其衍生物(例如，半纤维素、木聚糖)是最丰富的糖类，并且因此是重要的能源。本发明提供了几种新型非天然合成酶促通路，其能够通过酶的多个级联介导的部分或完全氧化将这些六碳糖和五碳糖转化为电能。因为糖电池具有高能量储存密度，是生物可降解以及可快速填充的，并且具有低的爆炸风险，所以它们可成功取代大多数的原电池、二次电池和定向甲醇燃料电池。

糖电池的优选燃料包括来自单糖(例如，葡萄糖、甘露糖、果糖和半乳糖)、寡糖(例如，麦芽糖、麦芽糊精、蔗糖、纤维二糖、纤维糊精、乳糖)和多糖(例如，纤维素、淀粉和糖原)的六碳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、半纤维素、木聚糖及其任何组合。输出是电能。按照本发明的实施方式的示例性糖电池的一般示意图示于图3和图4。本发明提供了几种新的级联酶促通路，其能够使用酶促燃料电池将六碳糖中储存的化学能转化为电能。

淀粉是自然中最广泛使用的能量储存化合物。与其单体葡萄糖不同，淀粉的代谢使得在活的细胞中发生化学能的缓慢且接近恒定的释放。麦芽糊精，一种部分水解的淀粉片段，在EFC中是比葡萄糖更优越的燃料，因为麦芽糊精的能量密度比葡萄糖高11％。麦芽糊精也较便宜，因为葡萄糖是其酶促水解的主要产物，并且可以从纤维素制得便宜的线性麦芽糊精。等重量的麦芽糊精的渗透压远低于葡萄糖。此外，其可以提供缓慢代谢的葡萄糖1-磷酸用于在封闭EFC中稳定发电。麦芽糊精已经用作EFC的燃料，但是在本发明之前每个葡萄糖单元仅可产生2个电子。

通路

本发明的通路包括用于将特定糖储存的能量转化为有用的电能的具体酶。可能通过在NAD⁺或其仿生类似物(或仿生物)存在下氧化G6P(葡萄糖6-磷酸)来完全利用糖燃料。本发明的实施方式的优势包括使用糖作为起始材料而不是直接使用G6P和X5P(木酮糖5-磷酸)的能力。这提供了G6P和X5P的便宜来源。通过修饰的磷酸戊糖通路和来自与NAD⁺或其仿生物完全转化成NADH或其仿生物的偶联的糖酵解和糖异生通路的酶一起高效地使用起始材料(例如，作为燃料的糖)，这在之前是未曾实现的。

在一些实施方式中，本发明提供了用于糖电池的酶促通路的新型组合。在这些实施方式中，新型合成酶促通路含有3个部分，在本文中称为模块。模块1从任何六碳糖产生便宜的葡萄糖6-磷酸。模块2允许NADH或其仿生物从修饰的磷酸戊糖通路与来自糖酵解和糖异生通路的酶产生(G6P+7H₂O+12NAD⁺→12NADH+12H⁺+6CO₂)。模块3使得还原的NADH或其仿生物在阳极的表面上被氧化来产生电子。图3和下表1显示了这样的方案。

表1-修饰的磷酸戊糖通路

在一个实施方式中，模块I含有如下所示的单一通路。在另一个实施方式中，在酶促燃料电池中，模块I可含有通路组合。本发明提供了可通过使用聚磷酸酯/盐作为磷酸酯/供体从任何单体己糖产生G6P而不耗费昂贵的ATP，之后使其再生的通路。

通路1

在一个实施方式中，提供如通路1的通路。通路1从葡萄糖开始，可通过寡糖和多糖的简单水解或磷酸解来产生葡萄糖。可通过聚磷酸-葡萄糖激酶(PPGK，EC 2.7.1.6，聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶)以“葡萄糖+(P_i)_n→G6P+(P_i)_n-1”或通过己糖激酶(HK，EC2.7.1.1)以“葡萄糖+ATP→G6P+ADP”来产生G6P，其中可以通过聚磷酸激酶(PPK，EC 2.7.4.1)或聚磷酸：AMP磷酸转移酶(PPT，EC 2.7.4.B2)与聚磷酸酯-非依赖性腺苷酸激酶(ADK，EC2.7.4.3)的组合以消耗聚磷酸酯/盐以“DP+(P_i)_n→ATP+(P_i)_n-1”产生ATP。在G6P完全氧化后，游离的磷酸酯/盐可以通过化学或生物方式再生以产生聚磷酸酯/盐。

通路2

在另一个实施方式中，提供如通路2的通路。通路2从果糖开始。果糖可以通过葡萄糖(木糖)异构酶(EC 5.3.1.5)被转化成葡萄糖，并且然后葡萄糖通过上述的通路(通路1)被加工。在另一个实施方式中，可通过偶联的酶梨糖醇脱氢酶(EC 1.1.1.14)和醛还原酶(EC 1.1.1.21)产生葡萄糖。

通路3

在另一个实施方式中，提供如通路3的通路。通路3从甘露糖开始。在一个实施方式中，可以通过甘露糖异构酶(EC 5.3.1.7)将甘露糖转化为果糖，然后通过通路2加工果糖。在另一个实施方式中，可通过两种酶(聚磷酸-葡萄糖甘露糖磷酸转移酶，EC 2.7.1.63和磷酸甘露糖异构酶，EC 5.3.1.8)将甘露糖转化为果糖6-磷酸，然后通过修饰的磷酸戊糖通路(修饰的PPP)和来自糖酵解和糖异生通路的酶一起加工果糖6-磷酸。在另一个实施方式中，通过使用三种酶——聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1)、己糖激酶(EC 2.7.1.1)和磷酸甘露醇异构酶(EC 5.3.1.8)产生果糖6-磷酸，得到甘露糖+(P_i)_n→果糖6-磷酸+(P_i)_n-1的总反应。

通路4

在另一个实施方式中，提供如通路4的通路。通路4从半乳糖开始。五种酶一起将半乳糖转化为葡萄糖6-磷酸，总反应为：半乳糖+(P_i)_n→葡萄糖6-磷酸+(P_i)_n-1。这五种酶是聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1)、半乳糖激酶(EC 2.7.16)、UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(EC 2.7.7.12)、UDP-半乳糖-4-差向异构酶(EC 5.1.3.2)和葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)。

可通过化学和/或生物方法进行聚磷酸酯/盐的再生。可通过形成不溶性盐(包括，但不限于Mg₃(PO4)₂和Ca₃(PO4)₂)来使得游离的磷酸根离子沉淀。可通过加入浓H₂SO₄，之后加热来制备聚磷酸酯/盐。或者，积磷小月菌(Microlunatus phosphovorus)摄入游离的磷酸酯/盐并且在限制葡萄糖的条件下在胞内积累聚磷酸酯/盐。

本发明提供了可通过使用聚磷酸酯/盐从寡糖产生G6P而不消耗昂贵的ATP的通路以及通过使用相应的磷酸化酶的聚磷酸酯/盐的再生和底物磷酸化。

通路5

在另一个实施方式中，提供如通路5的通路。通路5从麦芽糊精开始。DP(聚合度)＝n的麦芽糊精可通过麦芽糊精磷酸化酶(EC 2.4.1.1)和麦芽糖磷酸化酶(EC 2.4.1.8)转化为(n-1)葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖。通过葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)，之后用PPP和来自糖酵解和糖异生通路的酶产生葡萄糖1-磷酸，并且通过通路1来加工葡萄糖。

通路6

在另一个实施方式中，提供如通路6的通路。通路6从蔗糖开始。蔗糖可通过蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)转化为葡萄糖1-磷酸和果糖。可以分别通过通路2和葡萄糖磷酸变位酶(EC 5.4.2.2)加工果糖和葡萄糖1-磷酸。

通路7

在另一个实施方式中，提供如通路7的通路。通路7从水溶性纤维糊精(包括但不限于，纤维二糖和纤维糊精)开始。DP(聚合度)＝n的纤维糊精可通过纤维二糖磷酸化酶(EC 2.4.1.20)和纤维糊精磷酸化酶(EC 2.4.1.49)转化为(n-1)葡萄糖1-磷酸和葡萄糖。剩余的通路与通路5相同。

本发明提供了可从水解后的寡糖或多糖产生单体己糖的各种示例性通路，其然后通过通路1-7加工。

通路8

在另一个实施方式中，提供如通路8的通路。通路8从蔗糖开始。蔗糖可通过蔗糖酶(EC 3.2.1.10)水解成葡萄糖和果糖。产物可分别进入通路1和通路2。

通路9

在另一个实施方式中，提供如通路9的通路。通路9从乳糖开始。在一个实施方式中，乳糖可以通过乳糖酶(EC 3.2.1.23)水解成葡萄糖和半乳糖。在另一个实施方式中，乳糖可通过乳糖磷酸化酶磷酸化为半乳糖1-磷酸和葡萄糖。产物可进入通路1和通路4。

通路10

在另一个实施方式中，提供如通路10的通路。通路10从淀粉、糖原、麦芽糖或麦芽糊精开始。淀粉或糖原可通过使用α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)和其他淀粉水解酶，如异淀粉酶(EC 3.2.1.68)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)部分水解成麦芽糊精和麦芽糖。淀粉、麦芽糖或麦芽糊精可通过葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)、α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)和其他淀粉水解酶水解成葡萄糖。葡萄糖可进入通路1。

通路11

在另一个实施方式中，提供如通路11的通路。通路11从不溶性纤维或预处理的生物质开始。不溶性纤维素或预处理的生物质可通过单独的内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)和/或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.74)或其组合水解成可溶性纤维糊精。可溶性纤维糊精和葡萄糖的产物可进入通路1和通路7。

本发明提供了可从多糖(淀粉、纤维素或糖原)产生葡萄糖1-磷酸并且可通过它们相应的葡聚糖磷酸化酶和辅助酶磷酸化的通路。

通路12

在另一个实施方式中，提供如通路12的通路。通路12从DP＝n的线性淀粉(直链淀粉)或其短片段开始。可通过淀粉磷酸化酶(EC 2.4.1.1)和麦芽糖磷酸化酶(EC 2.4.18)从淀粉和游离的磷酸酯/盐产生(n-1)葡萄糖1-磷酸和葡萄糖。在通过葡萄糖磷酸变位酶将葡萄糖1-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸之后，G6P进入PPP用于发电。

通路13

在另一个实施方式中，提供如通路13的通路。通路13从支链淀粉(胶淀粉)或糖原开始。可通过淀粉或糖原磷酸化酶(EC 2.4.1.1)去除直链中的大多数葡萄糖单元来产生葡萄糖1-磷酸。在分支点的末端，可以使用淀粉脱枝酶或支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)来强化进一步的转化。可使用次要产物葡萄糖通过通路1产生G6P。

本发明提供了采用木糖和ATP或聚磷酸酯/盐来产生木酮糖5-磷酸的通路，其可以通过磷酸戊糖通路以及糖酵解和糖异生中的酶转化为G6P。然后通过通路1消耗G6P产生NADH或其仿生物。

通路14

在另一个实施方式中，提供如通路14的通路。通路14从木糖开始。木糖通过木糖异构酶(XI，EC 5.3.1.5)转化为木酮糖，然后使用ATP通过木酮糖激酶(XK，EC 2.7.1.17)转化为木酮糖5-磷酸。ATP可通过聚磷酸激酶(PPK，EC 2.7.4.1)或聚磷酸：AMP磷酸转移酶(PPT，EC 2.7.4.B2)与聚磷酸酯-非依赖性腺苷酸激酶(ADK，EC 2.7.4.3)的组合以ADP+(P_i)_n→ATP+(P_i)_n-1来再生。产物木酮糖5-磷酸可通过非氧化磷酸戊糖通路转化为G6P。然后通过通路1消耗G6P产生NADH或其仿生物。

通路15

在另一个实施方式中，提供如通路15的通路。通路15从木糖开始。木糖通过木糖异构酶(XI，EC 5.3.1.5)转化为木酮糖，并且然后使用聚磷酸酯/盐通过聚磷酸木酮糖激酶(PPXK，EC NA)转化为木酮糖5-磷酸。产物木酮糖5-磷酸可通过非氧化磷酸戊糖通路转化为G6P。然后通过通路1消耗G6P产生NADH或其仿生物。

木酮糖激酶是一种在ATP的帮助下将木酮糖转化为木酮糖-5-磷酸的酶。我们发现野生型海栖热袍菌(T.maritima)木酮糖激酶具有采用聚磷酸酯/盐而不是ATP作为磷酸供体的混杂活性。因此，通路15可直接发挥作用。

在一些实施方式中，合成通路由四个功能模块组成：由α-葡聚糖磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶介导的从麦芽糊精产生葡萄糖6-磷酸(G6P)(方程式1)；由2个NAD-依赖性G6PDH和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(6PGDH)介导的从G6P产生2个NADH(方程式2)；通过DI至VK₃的NADH的电氧化，每个NADH产生2个电子(方程式3)；和通过包含磷酸戊糖、糖酵解和糖异生通路中的酶的混合通路从1摩尔的核酮糖5-磷酸再生5/6摩尔G6P(方程式4)。方程式1-4的组合的总阳极反应大致得到方程式5。很明显，来自麦芽糊精的各葡萄糖单元通过该从头开始的通路在阳极上产生24个电子(方程式5)。

(C₆H₁₀O₅)_n+P_i→G6P+(C₆H₁₀O₅)_n-1         [1]

G6P+H₂O+2NAD⁺→核酮糖-5-磷酸+CO₂+2NADH+2H⁺[2]

NADH+H⁺→2H⁺+2e^-                [3]

6核酮糖-5-磷酸+H₂O→5G6P+磷酸        [4]

C₆H₁₀O₅+7H₂O→24e^-+6CO₂+24H⁺(阳极室)   [5]

与用于合成代谢的磷酸戊糖通路中天然NADP-依赖性酶不同，该通路使用2个NAD-依赖性G6PDH和6PGDH来产生NADH。上述的通路并不需要ATP或CoA，其非常昂贵并且在EFC中不稳定。此外，可再循环磷酸根离子来维持恒定的pH和离子浓度。这种循环通路设计与通常在EFC中常用的线性通路不同。

酶

在一些实施方式中，使用多种方法固定酶，包括凝胶包埋、物理吸附、化学共价连接和利用纳米颗粒和纳米管的固定。这些源自生物传感器的方法集中于通过固定市售可得的中温酶以增强它们的稳定性以获得可再生的信号而无需担心缓慢的反应速率。

然而，在固体电极表面上固定的酶通常由于酶失活和燃料从原料溶液向固定的酶的弱转移而展现出低得多的活性(例如，1％)。为了获得恒定的高功率EFC，我们考虑在不需要固定酶的情况下介导电子在EFC中转移的替代性策略。我们的策略保持了酶活性并且通过在电极的表面上固定电子介体(即维生素K₃(VK₃))来促进传质(图13，组图C)。

EFC的两种典型酶固定方法是在四丁基溴化季铵(TBAB)-修饰的纳菲膜中的聚合物基质包埋和碳纳米管(CNT)上的共价结合(图13，组图A和B)。

通过使用热酶来落实酶的稳定性。可在大肠杆菌中产生热酶并且通过三种方法纯化：热沉淀、His-标签/镍填充树脂，和在纤维素吸附剂上的纤维素结合模块标记的蛋白质的吸附(图16和表2)。可用来自超嗜热菌的酶或通过蛋白质工程(例如，合理设计、定向进化或方法的组合)生成的经工程改造的突变体酶替换从嗜热菌中分离的较不稳定热酶，如PGI、αGP和RMG。

可通过加入牛血清白蛋白和0.1％曲通X-100来延长非固定的酶的半衰期(图22，组图B)。

电子介体

在一些实施方式中，电子介体被固定在阳极的表面上。

在具体实施方式中，电子介体是维生素K₃。

在一些实施方式中，电子介体未被固定在阳极的表面上。在其他实施方式中，电子介体在阳极室中游离。

在具体实施方式中，电子介体是苄基紫精。

糖电池或糖EFC

在一些实施方式中，EFC是基于样品池的EFC(图20)。因为合并的电极材料，塑料样品池和膜电极组件的重量占整个装置重量的约20％。这类生物电池可被认为是环境友好的一次性原电池，因为它们具有更好的能量密度和较少的环境影响。在一些实施方式中，2个基于样品池的EFC的堆叠可驱动数字时钟和LED灯(图20)。

在一些实施方式中，可通过加入糖溶液来再填充装配了非固定的酶级联的生物电池，因为唯一的气体产物(CO₂)可容易地从阳极室释放并且非固定的酶不会被洗出EFC。在其他实施方式中，通过加入底物和酶混合物来再填充EFC。

其他应用：

本发明可用于在无细胞生物催化中去除额外的还原的NADH或其等价物(仿生物)并且使辅助因子平衡。

实施例

材料与方法

化学品

除非另外说明，所有的化学品，包括麦芽糊精(4.0-7.0的麦芽糖当量，即19的测量聚合度)、维生素K₃(VK₃)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，包括氧化形式(NAD⁺)和还原形式(NADH))、聚-L-赖氨酸(PLL，MW约70-150kDa)、二硫苏糖醇(DTT)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)是试剂级或更高级，并且购自西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯市)或费舍尔科学公司(Fisher Scientific)(美国宾西法尼亚州匹兹堡)。限制性酶、T4连接酶和Phusion DNA聚合酶购自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)(美国马萨诸塞州伊普斯维奇)。寡核苷酸由集成DNA技术公司(IntegratedDNA Technologies)(美国爱荷华州克拉威尔)或费舍尔科学公司合成。在阳极中使用的碳纸(AvCarb MGL200)购自燃料电池大地公司(Fuel Cell Earth)(美国马萨诸塞州斯托纳姆)。由纳菲212膜和用0.5mg cm^-2Pt修饰的碳包衣阴极组成的膜电极组件(MEA)购自燃料电池店(Fuel Cell Store)(美国加利福尼亚州圣迭戈)。具有＜8nm的外径和10-30μm长度的COOH-官能化的多壁碳纳米管(CNT)购自CheapTubes.com(美国弗吉尼亚州伯瑞特波罗)。由Avicel PH105(美国宾夕法尼亚州费城的FMC公司)通过其溶解和再生来制备在酶纯化中使用的再生无定形纤维素。大肠杆菌Top10被用作DNA操作的宿主细胞并且大肠杆菌BL21Star(DE3)(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)被用作重组蛋白表达的宿主细胞。包含100mg L^-1氨苄青霉素或50mg L^-1卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用于大肠杆菌细胞生长和重组蛋白表达。

重组酶的产生和纯化

在装有250mL含100mg L^-1氨苄青霉素或50mg L^-1卡那霉素的LB培养基的1-L锥形瓶中孵育包含蛋白质表达质粒的大肠杆菌BL21Star(DE3)菌株。细胞在37℃，250rpm的回转振荡下生长，直至细胞培养物在600nm下的吸光度达到0.6-0.8。通过加入100μM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在18℃过夜孵育来诱导蛋白质表达。通过在4℃离心来收获细胞并且用含0.3M NaCl的20mM HEPES(pH 7.5)洗涤一次。细胞团块在相同的缓冲液中重悬并且通过超声(费舍尔科学公司超声波破碎仪型号500；5-s脉冲开启和管壁，在50％振幅下总共300s)裂解。在离心后，纯化上清液中的目标蛋白质。

使用(表2)所示的3种方法来纯化各种重组蛋白。通过Profinity IMAC Ni-填充树脂(美国加利福尼亚州赫尔克里斯的伯乐公司(Bio-Rad))纯化带His-标签的蛋白质。通过在大表面积再生的无定形纤维素上的高亲和力吸附来纯化含有纤维素结合模块(CBM)和自切割内含肽的融合蛋白。利用80℃下热沉淀20分钟来纯化RPI、Ru5PE、TIM和ALD。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来检验重组蛋白的纯度(图16)。

表2-重组嗜热酶的信息

酶活性的检测

检测在23℃下放置5分钟的含有1mM MgCl₂、5mM DTT、30mM麦芽糊精和10mM磷酸钠的100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)中的热纤梭菌(Clostridium thermocellum)α-葡聚糖磷酸化酶(αGP)活性。通过加入HClO₄来停止反应，随后用KOH中和。使用由葡萄糖磷酸变位酶(PGM)补充的葡萄糖己糖激酶/G6PDH试验试剂盒(美国密歇根州卡顿(Canton)的泊因特科学公司(Pointe Scientific))来检测葡萄糖1-磷酸(G1P)。

检测在23℃下放置5分钟的含有5mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂和5mMG1P的100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)中的热纤梭菌(C.thermocellum)葡萄糖磷酸变位酶(PGM)活性。使用己糖激酶/G6PDH试验试剂盒来测定葡萄糖6-磷酸(G6P)产物。

在23℃下，检测含有100mM NaCl、2mM G6P、2mM NAD⁺、5mM MgCl₂和0.5mM MnCl₂的100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)中的嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)葡萄糖6-磷酸脱氢酶(GsG6PDH)的活性。在340nm处测量到由于NADH形成而增加的吸光度。

检测23℃下放置5分钟的含有2mM 6-磷酸葡萄糖酸、2mM NAD⁺、5mMMgCl₂和0.5mM MnCl₂的100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)中的热醋穆尔氏菌(Morella thermoacetica)6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)的活性。

使用改良的Dische半胱氨酸-咔唑法测试海栖热袍菌(Thermotogamaritima)核糖5-磷酸异构酶(RPI)的活性。

如之前所述，在D-核酮糖5-磷酸的底物上测定海栖热袍菌核酮糖5-磷酸差向异构酶(Ru5PE)的活性。

检测含有0.8mM D-木酮糖5-磷酸、0.8mM D-核糖5-磷酸、5mM MgCl₂、0.5mM硫胺焦磷酸素、0.15mM NADH、60U mL^-1的TIM和20U mL^-1的甘油3-磷酸脱氢酶的50mM Tris/HCl(pH 7.5)缓冲液中的嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)转酮酶(TK)的活性。反应从在23℃下加入TK开始。通过在340nm处测量NADH消耗5分钟来定量D-甘油醛-3-磷酸产物。

根据之前在Huang等，A thermostable recombinant transaldolase with highactivity over a broad pH range(一种在宽pH范围内具有高活性的热稳定性重组转醛酶).Appl.Microbiol.Biotechnol.93：2403-2410(2012)中的报道检测海栖热袍菌(T.maritima)转醛酶(TAL)的活性。

在含有5mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂、0.5mg mL^-1BSA、20U mL^-1的甘油3-磷酸脱氢酶和0.25mM NADH的50mM Tris/HCl(pH 7.5)中测定嗜热栖热菌(T.thermophilus)丙糖磷酸异构酶(TIM)的活性。

检测23℃下的含有作为底物的果糖1，6-二磷酸的50mM Tris/HCl缓冲液(pH 7.5)中的嗜热栖热菌(T.thermophilus)果糖1，6-二磷酸缩醛酶(ALD)。用0.15mM NADH、60U mL^-1的TIM和20U mL^-1的甘油3磷酸脱氢酶在340nm处定量甘油醛3-磷酸产物。

基于磷酸酯/盐的释放测定海栖热袍菌(T.maritima)果糖1，6-二磷酸酶(FBP)的活性。

检测23℃下的含有10mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂和5mM果糖6-磷酸的100mM HEPES(pH 7.5)中的热纤梭菌(C.thermocellum)磷酸葡糖异构酶(PGI)活性。在3分钟之后，通过加入HClO₄停止反应并用KOH中和。在37℃下用己糖激酶/G6PDH试验试剂盒来分析G6P产物。

检测23℃下的含有0.16mM NADH和0.1mM二氢酚吲哚酚(DCPIP)的10mM磷酸盐缓冲的盐水溶液中的嗜热脂肪地芽孢杆菌(G.stearothermophilus)心肌黄酶(DI)的活性。由于DCPIP的消耗，使用分光仪测量时在600nm处的吸光度下降。

在与游离酶相同的条件下，检测碳纸电极上固定的G6PDH和DI的活性。通过在23℃下将电极浸入底物溶液开始反应。在从反应中移出电极之后，如关于G6PDH和DI试验所述来检测反应溶液中吸光度的变化。

阳极制备

图17中显示了透气的酶促燃料电池设备。阳极室的反应体积为15mL。通过用超纯的氮气冲洗半个小时来使电解质脱氧。使用磁力搅拌棒以600rpm混合电解质。使用纳菲212膜来分隔阳极和阴极，其表面被0.5mg cm^-2Pt覆盖。阳极室是配置有用于密封阳极室的橡皮塞的玻璃电解质容器。

使用两种酶固定方法来制备配有固定的酶的阳极。

方法1基于酶在中溴化季铵盐修饰的纳菲中的包埋。通过加入39mg的四丁基溴化铵(TBAB)和1mL的5％纳菲1100EW悬液(美国特拉华州纽卡斯尔的离子动力公司(Ion Power，Inc.))来制备浇铸溶液混合物。在干燥过夜之后，混合物用3.5mL的18MΩ去离子水洗涤并在1mL的异丙醇中重悬。酶溶液混合物由1单位的G6PDH、40单位的DI、1mM NAD⁺和0.29M VK₃组成。由100μL浇铸溶液和100μL酶溶液的混合物覆盖碳纸阳极并且在室温下干燥。

方法2基于酶与碳纳米管(CNT)之间的共价键连接。使用10μL体积的2％wt/v PLL溶液来被覆碳纸，之后加入20μL的25mM EDC。同时，在50％乙醇溶液中悬浮2.5％wt/v COOH-官能化的CNT并且超声处理30分钟。然后用40μL含CNT的溶液处理碳纸并在室温下干燥。然后加入另外10μL的400mM EDC和10μL的100mM NHS，之后加入1单位的G6PDH、40单位的DI、1mM NAD⁺和10μL的0.29M VK₃丙酮溶液。

在使用之前，在4℃下在含2mM NAD⁺和100mM NaNO₃的100mMHEPES缓冲液中储存两种类型带固定的酶的阳极。

对于非固定酶的阳极的制备，如Zhu等，Deep oxidation of glucose inenzymatic fuel cells through a synthetic enzymatic pathway containing a cascade oftwo thermostable dehydrogenases(通过含有两种热稳定的脱氢酶的级联的合成酶促通路在酶促燃料电池中深度氧化葡萄糖)，Biosens.Bioelectron.36：110-115(2012)之前所述，使用聚-L-赖氨酸(PLL，MW约70-150kDa)向1cm²的购自燃料电池大地公司的碳纸(AvCarb MGL200)添加1或3mg的CNT。在通风橱下，10或30μL溶于丙酮的0.29M维生素K₃的溶液在干燥的含CNT电极上沉积。在2小时的丙酮蒸发之后，水不溶性维生素K₃通过物理吸附沉积在阳极上。

EFC的电化学特征

使用与PC连接的1000B多重恒压器(美国德克萨斯州奥斯丁的CH仪器公司(CH Instruments Inc.))进行所有的电化学测试。有关电流和功率输出的实验数据就1cm²的阳极面积标准化，因为在阳极处发生的反应是限速步骤而在MEA中由Pt介导的质子的氧化是非限速的。以1mV s^-1的扫描速率进行开路电势和线性扫描伏安法测量。

为了比较从固定和非固定酶的EFC中产生的功率(图13)，电解质包含10mM G6P、100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)、2mM NAD⁺、10mM MgCl₂和0.5mM MnCl₂。1单位的G6PDH和40单位的DI固定在电极上或溶解在电解质中。

当麦芽糊精用作底物时(图9)，在室温下电解质含有100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)、非固定的酶、0.1mM麦芽糊精、4mMNAD⁺、4mM磷酸钠、10mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂、5mM DTT和0.5mM硫胺焦磷酸素。

一种脱氢酶的EFC含有前三种酶(即，α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶和葡萄糖6-磷酸脱氢酶)加上DI。两种脱氢酶的EFC含有前四种酶(即，α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶)加上DI。用于完全氧化麦芽糊精的EFC含有全部13种酶。酶加载条件示于表2。

检测含有10mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂、4mMNAD⁺、4mM磷酸钠、5mMDTT和0.5mM硫胺焦磷酸素的100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)中的麦芽糊精(0.1mM)的完全氧化(图9，组图B和图19)。为了防止微生物污染，加入50mg L^-1卡那霉素、40mg L^-1四环素、40mg L^-1环己酰亚胺和0.5g L^-1叠氮化钠。为了改善酶混合物的稳定性，加入1g L^-1牛血清白蛋白和0.1％曲通X-100。酶加载条件示于表2。在0V下进行电流分析法以实现最大电流密度。在加入0.1mM麦芽糊精(即，约1.9mM葡萄糖)的溶液之前，使含0.2mM G6P的EFC运行2天直至得到接近0电流。在室温下，麦芽糊精的完全氧化需要大约一周，并且使用SA-20淀粉试验试剂盒(美国密苏里州圣路易斯市的西格玛-艾尔德里奇公司)对剩余的麦芽糊精进行定量。按照下式计算法拉第效率

F_MD-电流＝C_总/(Δc_{葡萄糖单元}×V×24×F)

其中F_MD-电流是法拉第效率，C_总是产生的总电荷(C)，Δc_{葡萄糖单元}＝c_起始-c_剩余(M)，V是反应体积(L)，24表示每个消耗的葡萄糖单元产生24个电子，并且F是法拉第常数。也进行不含麦芽糊精的对照实验(图19)。

为了进一步增加EFC的功率密度，在含20mM G6P、10mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂、8mM NAD⁺、4mM磷酸钠、0.5mM硫胺焦磷酸素和G6PDH的100mM HEPES(pH 7.5)中优化了几个因素(图10，组图A-E)。所有的实验按照以下的顺序进行：CNT加载(每个电极1、3或5mg)、堆积在一起的电极片数目(1、3或6)、酶加载(1、10或30单位)和反应温度(23、50或65℃)。

在以下条件下检测CNT加载对1cm²碳纸(作为阳极)的影响：20mM G6P，1U的G6PDH，80U的DI，100mM HEPES(pH 7.5)，10mM MgCl₂，0.5mMMnCl₂，8mM NAD⁺，4mM磷酸钠，0.5mM硫胺焦磷酸素，1个电极，每个电极1mg、3mg或5mg CNT，并且在23℃下。在以下条件下测量层叠的由3mg CNT沉积的1cm²碳纸制备的阳极的数目的影响：20mM G6P，1U的G6PDH，80U的DI，100mM HEPES(pH 7.5)，10mM MgCl₂，0.5mM MnCl₂，8mM NAD⁺，4mM磷酸钠，0.5mM硫胺焦磷酸素，1、3或6个电极，以及23℃。在以下条件下检测含6个堆叠电极(各含3mg CNT)的EFC中1-30U的G6PDH加载的影响：20mM G6P，1、10或30U的G6PDH，80U的DI，100mM HEPES(pH 7.5)，10mM MgCl₂，0.5mM MnCl₂，8mMNAD⁺，4mM磷酸钠，0.5mM硫胺焦磷酸素，并且在23℃下。在以下条件下检测含6个堆叠的电极(各含3mg CNT)的EFC中于23、50或65℃下的反应温度的影响：20mM G6P，30U的G6PDH，80U的DI，100mM HEPES(pH 7.5)，10mMMgCl₂，0.5mM MnCl₂，8mM NAD⁺，4mM磷酸钠和0.5mM硫胺焦磷酸素。在图10，组图B-D中，6个用3mg CNT沉积的1cm²碳纸堆叠在一起作为阳极。在图10中的小图中，组图A和B代表放大概况。

也在缓冲液中检测扫描速率的影响(图10E)。

为了证明“样品池-样”EFC能够驱动数字时钟或LED灯的能力(图20)，在样品池的侧面打开两个窗口。用MEA粘贴每个窗口，其纳菲膜一侧朝向样品池内。在样品池内部浸渍不含酶的经修饰的阳极。在室温下，3mL的反应溶液含有40U的DI、4U的G6PDH和6PGDH、100mM G6P、100mM HEPES(pH 7.5)、4mM NAD⁺、10mM MgCl₂和0.5mM MnCl₂。

在0.01mM的起始麦芽糊精浓度下进行非固定酶EFC的糖再填充实验(图21)。当在EFC中的糖被完全消耗掉时(即，电流输出接近0)，加入浓缩的麦芽糊精浓度以达到0.01mM的终浓度。麦芽糊精溶液再填充两次。

在约200小时的运行时间之后(当电流密度回到接近0时)进行老化的EFC的初步诊断实验(图22，组图A)。加入新鲜的底物(0.1mM麦芽糊精)加上相同加载量的13种酶。在几小时之后，使用新制备的VK₃沉积的碳电极来测试。

为了比较固定和非固定的酶系统的稳定性(图22，组图B)，在室温下用含2mM G6P、100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)、2mM NAD⁺、10mM MgCl₂、0.5mM MnCl₂的电解质来进行开路电势和线性扫描伏安法。加入在电极上固定或在母液中游离的1单位的G6PDH和40单位的DI。在一轮测试后，取出固定酶的电极并储存在4℃的不含G6P的反应缓冲液中。对于非固定的酶，当全部G6P被消耗掉时，含有酶的反应溶液储存在4℃下。在另一组非固定的酶反应中，补充1g/L的牛血清白蛋白和0.1％v/v曲通X-100来增加游离的酶的稳定性。

最佳的EFC条件是100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)，10mM MgCl₂，0.5mM MnCl₂，4mM NAD⁺，0.5mM硫胺焦磷酸素，5mM DTT，15％(wt/v)麦芽糊精，40mM磷酸钠作为底物，且酶加载条件为30单位的#1-#4酶，10单位的#5-#12酶，80单位的DI，50mg L^-1卡那霉素，40mg L^-1四环素，40mg L^-1环己酰亚胺和0.5g L^-1叠氮化钠。为了长期非破坏性运行，施加150Ω的外部电阻。在23℃下持续60小时测量功率密度(图10，组图F)。

结果

非固定和固定的酶的比较

为了比较配置有非固定的酶的EFC与两个配置有固定的酶的EFC，使用等量的葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G6PDH)和心肌黄酶(DI)来测试葡萄糖-6-磷酸燃料的EFC的极化和功率输出(图13，组图A)。用以下条件进行实验：室温下，含2mM NAD⁺、10mM Mg²⁺和0.5mM Mn²⁺的100mM HEPES(pH 7.5)缓冲液中的1U G6PDH，40U DI，10mM G6P。

与基于共价结合的EFC相比(图13，组图B)，非固定EFC的传质区域出现在较高电流密度处，表明非固定的酶的传质增强的影响。

基于非固定的G6PDH的EFC展示出0.13mW cm^-2的最高功率密度，是共价结合方法的最高功率密度的3倍。基于TBAB-修饰的纳菲膜聚合物包埋法的EFC的最大功率密度最低为0.0013mW cm^-2，其仅仅是共价结合法的功率密度的4％。由纳菲膜聚合物包埋和共价结合固定的G6PDH分别保留了其非固定活性的0.2％和6％。由纳菲膜聚合物包埋和共价结合固定的DI分别保留了其非固定活性的0.4％和7.5％(表3)。这些酶活性的数据清楚地表明由于酶固定而出现的显著活性损失。功率密度数据验证了使用非固定的酶来实现EFC中高功率输出的可行性。

表3.固定的酶的剩余活性与非固定的酶的剩余活性的比较

麦芽糊精的完全氧化

为了从各葡萄糖单元中释放最大的电子电势(即，每个葡萄糖24个)，我们设计了含有13种酶的非天然酶促通路(图14)。该合成通路由四个功能模块组成：由α-葡聚糖磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶介导从麦芽糊精产生葡萄糖6-磷酸(G6P)(方程式1)；由2个NAD-依赖性G6PDH和6-磷酸葡糖酸脱氢酶(6PGDH)介导从G6P产生2个NADH(方程式2)；通过非固定的DI至固定的VK₃的NADH电氧化，每个NADH产生2个电子(方程式3)；和通过包含磷酸戊糖、糖酵解和糖异生通路中的酶的混合通路从1摩尔的核酮糖5-磷酸再生5/6摩尔的G6P(方程式4)。方程式1-4的组合的总体阳极反应大致得到方程式5。很明显，每个来自麦芽糊精的葡萄糖单元通过该从头开始的通路在阳极上产生24个电子(方程式5)。

(C₆H₁₀O₅)_n+P_i→G6P+(C₆H₁₀O₅)_n-1          [1]

G6P+H₂O+2NAD⁺→核酮糖5-磷酸+CO₂+2NADH+2H⁺ [2]

NADH+H⁺→2H⁺+2e^-            [3]

6核酮糖5-磷酸+H₂O→5G6P+磷酸      [4]

C₆H₁₀O₅+7H₂O→24e^-+6CO₂+24H⁺(阳极室)   [5]

与磷酸戊糖通路中的天然NADP-依赖性酶不同，该通路使用2个NAD-依赖性G6PDH和6PGDH来产生NADH。上述的通路并不需要ATP或CoA，其非常昂贵并且在EFC中不稳定。此外，可再循环磷酸根离子来维持恒定的pH和离子浓度。这种循环通路设计与通常在EFC中使用的线性通路不同。

比较使用一种脱氢酶(即G6PDH)、两种脱氢酶(即，G6PDH和6PGDH)或完整通路的3种EFC的来自麦芽糊精燃料(即，2mM葡萄糖单元)的功率密度(图9A)。3种EFC的开路电势相似(约0.7V)。当仅使用G6PDH时，EFC展示出0.011mW cm^-2的最大功率密度。当加入第二种脱氢酶(6PGDH)时，最大功率密度增加至2倍，至0.024mW cm^-2。当加入8种额外的酶来重建完整通路时(图14)，最大功率密度略微增加至0.026mW cm^-2。相应的最大电流密度比基于2种脱氢酶的系统的电流密度高35％(图9A)。

为了定量验证麦芽糊精的葡萄糖单元的完全氧化，我们检测了在透气EFC中通过心肌黄酶和维生素K₃从NADH至电子的法拉第效率(图18)。经脱氧的电解质的初始组成含有0.4U的DI、100mM HEPES(pH 7.5)、10mM MgCl₂和0.5mM MnCl₂。进行电流分析法以监测随着时间产生的电流。首先，加入小量(0.2mM)的NADH来启动反应。当NADH被全部消耗掉时，反应系统达到平衡状态。其次，当加入另一个2mM NADH时，电流开始随着时间增加。通过使用注射器一次又一次抽出样品并且通过紫外分光光度计测量残留的NADH浓度。如下计算NADH的电-酶促氧化的Faraday效率：

F_NADH-电流＝ΔC/(Δc×V×2×F)

其中F_NADH-电流是NADH的电-酶促氧化的法拉第效率，ΔC是总电荷(C)增加的斜率，Δc是NADH浓度降低的斜率(M)，V是反应体积(L)，2代表每个消耗的NADH产生2个电子，F是法拉第常数。

在阳极室的无氧条件下，EFC的法拉第效率是97.6±3.0％(图18)，表明NADH的电-酶促氧化是高效的。此外，从阳极室中除去氧气对于得到高的法拉第效率并防止NADH的非选择性氧化是必要的。

在室温下15-mL含有13种酶和低浓度的麦芽糊精的EFC(图9B)中，电流密度在24小时时增加至0.12mA cm^-2的峰值并随后由于底物消耗而缓慢下降。在超过150小时后，电流输出降低至接近零。相对于基于葡萄糖单元的消耗产生的理论电荷(即，53.0C，原理上1摩尔的葡萄糖单元可产生24×96,485C)，产生的累积电荷为48.9C。所得的结果表明累积的法拉第效率为92.3％，其中1摩尔的葡萄糖产生22.2摩尔的电子。

注意到阴性对照(即，不含底物的相同EFC)并不产生显著的电流输出(图19)。如之前证明，法拉第效率高于基于葡萄糖的微生物燃料电池的效率(83％)，因为无细胞生物系统并不在细胞生长和副产物形成上浪费有机燃料。Bujara等，″Optimization of a blueprint for in vitro glycolysis by metabolicreal-time analysis(通过代谢实时分析的体外糖酵解的蓝图优化)″Nat.Chem.Biol.7：271-277(2011)；Martín del Campo，J.S.等，″High-Yield Production ofDihydrogen from Xylose by Using a Synthetic Enzyme Cascade in a Cell-FreeSystem(通过在无细胞系统中使用合成酶级联从木糖高产率生产氢气)″Angew.Chem.Iht.Ed.52：4587-4590(2013)。我们的系统提供了在EFC中每个葡萄糖单元产生接近24个电子的首个定量证据。此外，我们的数据表明，我们可将来自糖的全部化学能转化成电能并且使EFC的能量密度增加一个数量级。

高-能量密度高-功率EFC

在EFC中功率密度是另一个重要考虑方面。为了增加功率密度，我们优化了多个因素，包括EFC构造、酶加载和非固定的G6PDH对G6P发挥作用的实验条件。

最优的CNT加载为每cm²碳纸3mg(图10，组图A)。6个电极堆叠在一起作为3-D阳极使功率密度增加50％并使最大电流密度增加4倍(图10，组图A和B)。在室温下(23℃)，将酶加载从每个电池1U增加至10U使最大功率密度和最大电流密度分别显著增加至0.35mW cm^-2和4.1mA cm^-2(图10，组图C)。将温度升高至50℃使最大功率密度翻倍至0.8mW cm^-2(图10，组图D)。

基于15％(wt/v)麦芽糊精，由13种非固定的酶组成的EFC在室温下以1mV s^-1的扫描速率产生0.4mW cm^-2的最大功率密度。在封闭的系统中，EFC持续60小时产生约0.32mW cm^-2的接近恒定的功率输出(图10，组图F)。另外，2个基于样品池的EFC的堆叠可驱动数字时钟和LCD灯(图20)，表明这些EFC可在不久的未来用于驱动多种电器。

15％麦芽糊精溶液的葡萄糖单元的完全氧化表明这种糖-驱动的EFC的能量储存密度可高达596Ah kg^-1，这比锂离子电池和原电池的能量储存密度高出超过一个数量级(图15和表4)。

表4.电池和EFC的能量密度的比较

*燃烧能或较高的热值。

虽然EFC的电压(例如，0.5V)远低于锂离子电池的电压(3.6V)，15％糖-驱动的EFC的能量密度可达到298Whkg^-1，是常见可充电电池(例如，Pd-酸、NiMH和锂离子电池)的数倍并且高于常见的原电池(例如，锌-碳、碱性和Li-MnO₂电池)(图15)。对于整个系统，基于样品池的EFC(图20)具有约238Wh kg^-1的能量储存密度，因为合并的电极材料，塑料样品池和膜电极组件的重量占整个装置重量的约20％。这类生物电池可被认为是环境友好的一次性电池，因为它们具有更好的能量密度和较少的环境影响。

除了相对于具有一种氧化还原酶的系统，该糖生物电池通过该合成通路在能量密度上提高一个数量级以外(图15)，配置有非固定的酶级联的生物电池还可通过加入糖溶液来再填充，因为唯一的气体产物(CO₂)可容易地从阳极室中释放并且非固定的酶不会从EFC中洗出。通过两次加入糖溶液来测试非固定的酶EFC(图21)。然而，EFC的性能下降表明还需要更多的研究和开发来延长EFC的寿命。

这些糖生物电池代表了一种新型的可充电电池。与最接近的原电池和二次电池相比，这些燃料电池的最大优势之一是它们是使用可持续(例如，质子交换膜燃料电池)或偶尔(例如，定向甲醇燃料电池和糖电池)地加入燃料电池装置的高能量密度燃料(例如，H₂、甲醇、葡萄糖和麦芽糊精)的开放系统。当燃料与燃料电池系统的重量比足够大时(即5-10)或如果多次再填充燃料电池，包括燃料、燃料罐和燃料电池系统的整个系统的能量密度能接近于使用的燃料的理论能量密度。明显地，就能量储存密度而言，使用无水化学品作为燃料是更有吸引力的(图15)。然而，在这类系统中需要单独的燃料罐和复杂的燃料进料系统。

麦芽糊精是比醇类(例如，甲醇)或葡萄糖更好的EFC燃料。通过合成通路缓慢利用麦芽糊精来产生接近恒定的功率输出(图10F)而不是在短时间内的峰值功率。另外，由于抑制或低水活性，大多数酶不能在高浓度的醇或葡萄糖中很好地作用。例如，可用于EFC中的最高甲醇浓度大约为0.5M，导致40.2Wh kg^-1的较低能量储存密度(图15)。相似地，高浓度的葡萄糖(例如，0.4M)导致高渗透压(约9.85atm)，其能削弱酶活性。与将葡萄糖氧化成CO₂的6-酶EFC相比，催化几种底物的酶的固有的低但是混杂的活性一度导致非常低的功率密度。使用超过10种酶来实现用于产生生物产品、精制化学品和药品的复杂反应似乎在经济上并不过于昂贵。

糖生物电池的最重要问题之一在于延长它们的寿命。这涉及提高酶、辅助因子和介体的稳定性。进行初步诊断实验来研究非固定的EFC的下降的性能(图22A)。向EFC中加入新的底物和酶混合物产生四分之一的最大功率输出，表明酶失活是在室温下运行一周后功率输出降低的原因之一。与大多数EFC中所用的固定酶不同，我们使用了从(超)嗜热微生物中分离的非固定热酶来延长酶的寿命。明显地，可用来自超嗜热菌的酶或通过蛋白质工程(例如，合理设计、定向进化或多种方法的组合)生成的经工程改造的突变体酶替换从嗜热菌中分离的较不稳定热酶，如PGI、αGP和RMG。另外，通过加入1g L^-1牛血清白蛋白和0.1％曲通X-100使非固定的酶的半衰期从5.0天增加至7.7天(图22B)，表明也可调节酶混合物的组成来延长非固定酶混合物的寿命。此外，用新的阳极代替旧的阳极使功率输出达到接近最大功率输出的一半(图22A)，表明从阳极浸出吸附的VK₃导致较低的功率输出。因此，采用更好的方法来在阳极的表面上固定VK₃-样的介体是重要的。

因此，构建在透气的EFC中由13种酶组成的合成的不含ATP和CoA的代谢通路以完全氧化麦芽糊精的葡萄糖单元，每个葡萄糖产生接近24个电子。我们发现基于非固定酶的EFC展现出远高于基于固定酶那些的最大功率输出。这些糖-驱动的生物电池的特征是高能量储存密度和高安全性。因此，这些电池代表了可特别用于电子便携装置的新一代微型能源。

经工程改造的GsG6PDH

野生型嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearother mophilus)G6PDH(GsG6PDH)相对NADP更优选NAD，但是这并不在仿生物上起作用(图7，化合物A-E)。通过合理设计和/或定向进化的蛋白质工程之后，产生了对NMN发挥作用的经工程改造的GsG6PDH(T13G/R46G)(化合物A)(图11)。

上述的公开提供了本发明的具体实施方式。上述公开应被认为是自然中的示例并且不背离本发明的实质的该变化被认为在本发明的范围内。以上所述的具体实施方式仅仅是示例性的，本领域技术人员通过阅读本发明的教导，可以了解可通过许多不同的等价形式对本发明进行改良和实施。

很明显，可以对上文所述的具体实施方式进行改变或改良，所有这些变化都包括在本发明的范围和精神之内。对本领域的技术人员显而易见的是，可以对本发明的实践中的上述公开进行各种修改和变动而不偏离本发明的范围或精神。本领域技术人员会认识到这些特征可基于给定的应用或设计的要求和特点单独使用或以任意组合使用。

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Claims (36)

1.一种从己糖产生电子的方法，所述方法包括：

通过所述己糖与聚磷酸酯/盐、ATP或游离的磷酸酯/盐的化学反应产生葡萄糖6-磷酸(G6P)和6-磷酸葡萄糖酸(6PG)，其中：

(i)当使用聚磷酸酯/盐时，在聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶的存在下，在所述聚磷酸酯/盐与所述己糖之间进行所述化学反应；

(ii)当使用ATP时，在己糖激酶的存在下，在所述ATP与所述己糖之间进行所述化学反应，并且其中通过在聚磷酸激酶存在下使ADP与所述聚磷酸酯/盐反应来再生所述ATP；或者

(iii)当使用游离的磷酸酯/盐时，在葡聚糖磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶的存在下，在所述游离的磷酸酯/盐与所述己糖之间进行所述化学反应；

使所述G6P和6PG与NAD⁺或其氧化的仿生物在水中反应以得到NADH或其还原的仿生物；和

在阳极表面上使所述NADH或其还原的仿生物氧化以在所述阳极处产生电子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过磷酸戊糖通路、糖酵解和糖异生的混合通路从核酮糖5-磷酸再生G6P。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在利用NAD⁺的葡萄糖6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的存在下，使所述G6P和6PG与NAD⁺反应。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在利用NAD⁺仿生物的经工程改造的葡萄糖6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的存在下，使所述G6P和6PG与氧化的NAD⁺仿生物反应。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述己糖是葡萄糖或果糖。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过以下方式产生所述葡萄糖：

(i)通过使用葡萄糖(木糖)异构酶将果糖转化为葡萄糖；或

(ii)通过使用山梨糖醇脱氢酶和醛还原酶将果糖转化为葡萄糖。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过以下方式产生所述果糖：

(i)使用甘露糖异构酶将甘露糖转化为果糖；

(ii)使用聚磷酸-葡萄糖甘露糖磷酸转移酶和磷酸甘露糖异构酶将甘露糖转化为果糖-6-磷酸(F6P)，然后由磷酸葡萄糖异构酶将F6P转化为G6P；或

(iii)使用聚磷酸激酶、己糖激酶和磷酸甘露糖异构酶将甘露糖转化为果糖-6-磷酸(F6P)，然后由磷酸葡萄糖异构酶将F6P转化为G6P。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述己糖是淀粉或麦芽糊精。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，由淀粉磷酸化酶或麦芽糊精磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶从磷酸酯/盐和淀粉或麦芽糊精产生所述G6P。

10.一种糖电池，其包含：

包含己糖和酶的溶液，其中所述溶液能够从所述己糖和聚磷酸酯/盐、ATP或游离的磷酸酯/盐产生葡萄糖6-磷酸(G6P)，并且使所述G6P与NAD⁺或其氧化的仿生物在水中反应以得到NADH或其还原的仿生物，其中：

(i)当使用聚磷酸酯/盐时，在聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶的存在下，在所述聚磷酸酯/盐和所述己糖之间进行所述化学反应；

(ii)当使用ATP时，在己糖激酶的存在下，在所述ATP和所述己糖之间进行所述化学反应，并且其中通过在聚磷酸激酶存在下使ADP与所述聚磷酸酯/盐反应来再生所述ATP；或者

(iii)当使用游离的磷酸酯/盐时，在葡聚糖磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶的存在下，在所述游离的磷酸酯/盐与所述己糖之间进行所述化学反应；

任选地经酶修饰的阳极；

酶修饰或标准铂参考阴极；和

电解质，

其中使所述任选地经酶修饰的阳极与所述溶液接触，并且所述经酶修饰或标准铂参考阴极和所述任选地经酶修饰的阳极均与所述电解质接触，并且

其中所述电解质包含含有金属离子、NAD⁺或NADH或其仿生物，和硫胺焦磷酸素的pH-控制缓冲液。

11.如权利要求10所述的电池，其特征在于，可操作地配置所述电池以允许在所述阳极的表面上使NADH或其还原的仿生物氧化以在所述阳极处产生电子。

12.一种用于发电的系统，所述系统包含：

一种溶液，其用于通过使来自寡己糖或多聚己糖的6-碳糖单体或一种或多种6-碳糖与聚磷酸酯/盐或ATP或游离的磷酸酯/盐反应来产生葡萄糖6-磷酸(G6P)，并且使所述G6P与NAD⁺或其氧化的仿生物在水中反应以得到NADH或其还原的仿生物，其中：

(i)当使用聚磷酸酯/盐时，在聚磷酸-葡萄糖磷酸转移酶的存在下，在所述聚磷酸酯/盐和所述糖单体之间进行所述化学反应；

(ii)当使用ATP时，在己糖激酶的存在下，在所述ATP和所述糖单体之间进行所述化学反应，并且其中通过在聚磷酸激酶存在下，使ADP与所述聚磷酸酯/盐反应来再生所述ATP；或者

(iii)当使用游离的磷酸酯/盐时，在葡聚糖磷酸化酶和葡萄糖磷酸变位酶的存在下，在所述游离的磷酸酯/盐与所述寡己糖或多聚己糖之间进行所述化学反应；和

一种燃料电池，其被可操作地配置用于在阳极使所述NADH或其还原的仿生物氧化来产生电子并且将质子递送到阴极。

13.如权利要求12所述的系统，其特征在于，所述系统在所述阴极上还包含催化剂，用于在所述阴极处将质子和氧转化为水。

14.一种从戊糖产生电子的方法，所述方法包括：

从己糖与聚磷酸酯/盐或ATP的化学反应产生木酮糖5-磷酸(X5P)，其中：

(i)当使用聚磷酸酯/盐时，在木糖异构酶和聚磷酸木酮糖激酶的存在下，在所述戊糖和所述聚磷酸酯/盐之间进行所述化学反应；或

(ii)当使用ATP时，在木糖异构酶和基于ATP的木酮糖激酶的存在下，在所述戊糖和所述ATP之间进行化学反应，并且其中通过在聚磷酸激酶或聚磷酸：AMP磷酸转移酶和聚磷酸酯非依赖性腺苷酸激酶的组合存在下，使ADP与所述聚磷酸酯/盐发生反应来产生所述ATP；

使所述X5P进入磷酸戊糖通路以产生G6P；

将所述G6P与NAD⁺或其氧化的仿生物在水中反应以得到NADH或其还原的仿生物；并且

在阳极表面上使所述NADH或其还原的仿生物氧化以在所述阳极处产生电子。

15.一种糖电池，其包含：

包含5-碳糖和酶的溶液，其中所述溶液能够从所述5-碳糖和聚磷酸酯/盐或ATP产生木酮糖5-磷酸，通过非氧化磷酸戊糖通路从所述木酮糖5-磷酸产生葡萄糖6-磷酸(G6P)，并且使所述G6P与NAD⁺或其氧化的仿生物在水中反应以得到NADH或其还原的仿生物，其中：

a.当使用聚磷酸酯/盐时，在聚磷酸-木糖激酶的存在下，在所述聚磷酸酯/盐和所述5-碳糖之间进行所述化学反应；或

b.当使用ATP时，在木酮糖激酶的存在下，在所述ATP和所述5-碳糖之间进行所述化学反应，并且其中通过在聚磷酸激酶存在下使ADP与所述聚磷酸酯/盐反应来产生所述ATP；

任选地经酶修饰的阳极；

经酶修饰或标准铂参考阴极；和

电解质，其中使所述任选地经酶修饰的阳极与所述溶液接触，并且使所述经酶修饰或标准铂参考阴极和所述任选地经酶修饰的阳极均与所述电解质接触，并且

其中所述电解质包含含有金属离子、NAD⁺或NADH或其仿生物，和硫胺焦磷酸素的pH-控制缓冲液。

16.一种用于发电的系统，所述系统包含：

一种溶液，所述溶液用于从5-碳糖和聚磷酸酯/盐或ATP产生木酮糖5-磷酸，通过非氧化磷酸戊糖通路从木酮糖5-磷酸产生葡萄糖6-磷酸(G6P)，并且使所述G6P与NAD⁺或其氧化的仿生物在水中反应以得到NADH或其还原的仿生物，其中：

(i)当使用聚磷酸酯/盐时，在聚磷酸-木酮糖激酶的存在下，在所述聚磷酸酯/盐和所述5-碳糖之间进行所述化学反应；或

(ii)当使用ATP时，在木酮糖激酶的存在下，在所述ATP和所述5-碳糖之间进行所述化学反应，并且其中通过在聚磷酸激酶存在下使ADP与所述聚磷酸酯/盐反应来产生所述ATP；

一种燃料电池，其被可操作地配置用于在阳极使所述NADH或其还原的仿生物氧化来产生电子并且将质子递送到阴极；

一种阴极催化剂，其用于将质子和氧转化为水。

17.如权利要求10或15所述的糖电池，其特征在于，所述pH-控制缓冲液是HEPES缓冲液。

18.如权利要求10或15所述的糖电池，其特征在于，所述金属离子是选自下组的一种或多种离子：Mg²⁺和Mn²⁺。

19.一种从糖产生电子的方法，所述方法包括：

从所述糖产生NADH或其还原的仿生物；和

使所述NADH或其还原的仿生物氧化来在阳极处产生电子，

其中使用一组酶产生所述NADH或其还原的仿生物，所述一组酶包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、核糖5-磷酸异构酶、核酮糖5-磷酸3-差向异构酶、转酮酶、转醛酶、丙糖磷酸异构酶、醛缩酶、果糖1，6-二磷酸酶和磷酸葡糖异构酶。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述糖是己糖或戊糖。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述NADH或其还原的仿生物被心肌黄酶氧化。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，在维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种的存在下，所述NADH或其还原的仿生物被氧化。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种被固定在所述阳极表面上。

24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种在所述阳极室内游离。

25.一种糖电池，其包括：

包含糖、酶和电解质的溶液；

阳极；和

阴极，

其中所述阳极和所述阴极与所述溶液接触；

其中所述电解质包含含有金属离子、NAD⁺或NADH或其仿生物，和硫胺焦磷酸素的pH-控制缓冲液，并且

其中所述酶包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、核糖5-磷酸异构酶、核酮糖5-磷酸3-差向异构酶、转酮酶、转醛酶、丙糖磷酸异构酶、醛缩酶、果糖1，6-二磷酸酶、磷酸葡糖异构酶，以及能够使NADH或其还原的仿生物氧化的酶。

26.如权利要求25所述的糖电池，其特征在于，所述糖是己糖或戊糖。

27.如权利要求25所述的糖电池，其特征在于，所述能够使NADH或其还原的仿生物氧化的酶是心肌黄酶。

28.如权利要求25所述的糖电池，其特征在于，所述糖电池还包含维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种。

29.如权利要求28所述的糖电池，其特征在于，维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种被固定在所述阳极表面上。

30.如权利要求28所述的糖电池，其特征在于，维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种在所述阳极室内游离。

31.一种用于发电的系统，所述系统包含：

包含糖、酶和电解质的溶液；

包含阳极和阴极的燃料电池；和

发电机，

其中所述溶液和所述发电机与所述燃料电池接触；

其中所述电解质包含含有金属离子、NAD⁺或NADH或其仿生物，和硫胺焦磷酸素的pH-控制缓冲液；并且

其中所述酶包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、核糖5-磷酸异构酶、核酮糖5-磷酸3-差向异构酶、转酮酶、转醛酶、丙糖磷酸异构酶、醛缩酶、果糖1，6-二磷酸酶、磷酸葡糖异构酶，以及能够使NADH或其还原的仿生物氧化的酶。

32.如权利要求31所述的系统，其特征在于，所述糖是己糖或戊糖或其混合物。

33.如权利要求31所述的系统，其特征在于，所述能够使NADH或其还原的仿生物氧化的酶是心肌黄酶。

34.如权利要求31所述的系统，其特征在于，所述系统还包含维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种。

35.如权利要求34所述的系统，其特征在于，维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种被固定在所述阳极表面上。

36.如权利要求34所述的系统，其特征在于，维生素K₃、苄基紫精或其仿生物中的一种或多种在所述阳极室内游离。