KR20160013163A - 과민성 대장 증후군 진단을 예측하기 위한 경로 특이적 검정법 - Google Patents

과민성 대장 증후군 진단을 예측하기 위한 경로 특이적 검정법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세로토닌, 트립토판 및 키뉴레닌 경로의 대사산물에 대한 항체, 및 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 제조된 항체는 관련 대사산물에 대해 낮은 교차반응성을 가지며, 특이적 및 민감성 면역학적 검정을 위한 유용한 시약이다. 본 발명은 또한, 각종 대사산물 및 단쇄 지방산의 안정한 유도체를 제공한다. 유도체는 담체 단백질과 같은 생체분자에 접합될 수 있으며 면역 반응을 자극하는 보강제와 조합될 수 있다. 유도체는 또한 다른 생체분자에 접합될 수 있다.

Description

과민성 대장 증후군 진단을 예측하기 위한 경로 특이적 검정법{PATHWAY SPECIFIC ASSAYS FOR PREDICTING IRRITABLE BOWEL SYNDROME DIAGNOSIS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 모든 목적을 위해 그의 교시 전체가 본원에 참조로 포함된, 2013년 5월 24일에 출원된 미국 특허출원 제61/827,506호에 대한 우선권을 주장한다. 본 출원은 동일한 날짜에 출원된 관리번호(Attorney Docket No. 88473-909073-026610PC)를 갖는 PCT 출원을 참조로 포함한다.
과민성 대장 증후군 (Irritable bowel syndrom, IBS) 는 모든 위장 장애중 가장 흔하며, 전체 인구의 10-20%가 발병하며 모든 환자 중 50% 초과에게서 소화 불량을 갖는 환자가 모든 환자의 50% 초과를 차지한다. 하지만, IBS 를 겪는 환자의 약 10% 내지 50% 만이 실제로 치료를 시도한다. IBS 를 갖는 환자들은, 예를 들어, 배변, 설사, 변비 또는 설사와 변비의 교대, 복부 팽만, 가스, 대변에서의 과도한 점액과 주로 관련된 복통과 같은 이질적인 증상이 존재한다. IBS 환자의 40% 이상은 직장에서 휴가를 쓰고, 사회 생활을 축소시키고, 성관계를 피하고, 약속을 취소하고, 여행을 중단하고, 약을 복용하고, 심지어 창피함의 공포 때문에 집 안에 갇혀 머물러야 할 정도로 심각한 증상이 있다. 미국에서 IBS 의 건강보험 추정 비용은 년간 $8조이다(Talley et al., Gastroenterol., 109:1736-1741 (1995)).
IBS 환자는 그들의 주된 장 증상에 따라 세 그룹으로 분류된다: 변비-우세 IBS (IBS-C), 설사-우세 IBS (IBS-D), 설사와 변비가 교대로 있는 증상이 있는 IBS (IBS-M), 및 아류형에 속하지 않는(unsubtyped) IBS (IBS-U). 현재의 의료 실무에서, IBS 의 진단은 환자에게 나타나는 증상에 따라 및 로마 III 기준 (Rome III criteria)을 기초로 한다. 상기 장애를 식별하기 위해 사용될 수 있는 구체적인 생물학적, 방사선학적, 내시경적 또는 생리학적 바이오마커(biomarkers)가 존재하지 않는다.
과민성 대장 증후군은 이종 위장관(gastrointestinal, GI) 기능 장애이다. 그의 병인에 면역계가 관여되었다고 지적하는 증거가 증가하고 있다. GI 감염은 IBS 증상의 발병을 초래하는 유발 요인일 수 있다. 한편, IBS 는 종종 "뇌-장 장애(brain-gut disorder)" 로도 설명된다. 5-HT 신호 전달 경로의 조절 장애에 의해 매개된 위장관(GI) 운동 및 분비의 변화는 배변 습관의 불규칙성의 기저가 될 수 있다. 대장 신경에 근접한 비만 세포(mast cell)의 활성화는 IBS 환자가 경험하는 비정상적 통증과 연관된다. 비만 세포는 활성화시 다양한 염증 전달물질(inflammatory mediators)을 생성 및 방출할 수 있는 것으로 잘 알려져 있다. 하지만, 이러한 다른 경로가 서로 어떻게 통신하는지 및 그들의 상호작용이 건강한 대상체에서와 동일한 방식으로 IBS 환자에서 동일한 방식으로 동작하는지 여부는 분명하지 않다.
IBS 의 정확한 병태 생리는 밝혀져야 할 것으로 남아있다. 소화관 운동 장애 및 변경된 내장 인식은 증상의 발병 기전에 중요한 기여자인 것으로 간주되는 한편 (Quigley, Scand. J. Gastroenterol., 38(Suppl. 237):1-8 (2003); Mayer et al., Gastroenterol., 122:2032-2048 (2002)), 이러한 상태는 방해된 뇌-장 통신, 장내 감염, 장 염증, 및/또는 변용 미생물총(altered microbiota)을 특징으로 하는 스트레스-관련 장애로 간주된다. 최근 장내 감염과 장 염증에 대한 역할도 제안되었다. 연구는 세균학적으로 확인된 위장염에 후속하는 IBS 의 발병을 입증한 한편, 다른 연구들은 IBS 에서 낮은 수준의 점막 염증(Spiller et al., Gut, 47:804-811 (2000); Dunlop et al., Gastroenterol., 125:1651-1659 (2003); Cumberl et al., Epidemiol. Infect., 130:453-460 (2003)) 및 면역 활성화(Gwee et al., Gut, 52:523-526 (2003); Pimentel et al., Am. J. Gastroenterol., 95:3503-3506 (2000))의 증거를 제공하였다. 창자 균무리(enteric flora) (예를 들어, 장내 마이크로비옴(gut microbiome)) 가 또한 원인임이 시사되었으며, 최근 연구는 면역 활성의 조절을 통해 질병을 치료하는 데 있어서 프로바이오틱 유기체 비피더스균(Bifidobacterium)의 효능을 입증하였다 (Simren et al., Gut, 62:159-176 (2013)).
각종 장 질환 또는 장애에서 항균 항체, 스트레스 호르몬, 염증성 사이토카인 및 비만 세포 마커의 역할을 지원하는 더 확실해지는 증거가 존재한다. 예를 들어, 항균 항체 OmpC, CBir1, FlaX 및 Fla2 는 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)의 유용한 바이오마커로 입증되었다. 크론병(CD)을 앓고 있는 개인과 정상 대조군 간, 및 CD 및 궤양성 대장염을 앓는 개인들 간을 식별하기 위해 대장균(Escherichia coli) K12 단백질에 대한 항체의 서브세트 (예를 들어, Era, FocA, FrvX, GabT, YbaN, YcdG, YhgN, 및 YidX) 를 사용할 수 있다 (Chen et al., Mol. Cell Proteomics, 8:1765-1776, (2009)). 캠필로박터 재주니 (Campylobacter jejuni)(C. jejuni , CJ), 대장균 (E. coli, EC), 살모넬라 엔테라이티디스 (Salmonella enteritidis) (S. enteritidis, Se ), 쉬겔라 플렉세네리(Shigella flexneri)(S. flexneri, Sf) 로부터의 감염에 의해 종종 유발된 IBS 와 관련된 후-감염성 소장 세균의 부산물 (SIBO) 을 갖는 개인은 감염 박테리아의 편모 단백질에 대한 항체를 보유할 수 있다 (Spiller R 및 Garsed K., Gastroenterology, 136:1979-1988 (2009)).
말초 장관(gut segments)에서의 증가된 비만 세포 침윤 및 활성화는 IBS 의 증상 발병 및 정도와 관련이 있다. 이들 세포는 또한 IBS 환자에서 점막 자극에 대한 내장 감각 신경의 반응이 증가된 원인임을 보여준다. 비만 세포 과다형성(hyperplasia)은 일반적으로, 후-감염 IBS 및 비 후-감염 IBS 모두에서 상기 박테리아들에 의한 감염에 이어 관찰된다. β-트립타제, 히스타민 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 와 같은 비만 세포 마커의 측정은 IBS의 임상적 진단에서 중요한 의미를 갖는다. IBS의 진단에 도움이 되기 위해 비만 세포 마커를 사용하는 방법의 상세한 내용은, 본원에 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제 8,114,616 호 및 미국 특허공개 제 2012/244,558 호에 기재되어 있다.
IBS 환자는 통상적으로 비정상적인 장 운동성 및 뇌-장 축과 장내 마이크로 비옴에 의해 매개된 내장 과민 반응을 경험한다. IBS 를 포함하는 스트레스-민감 장애에서, 시상하부-뇌하수체-부신 축(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis:HPA axis)의 스트레스 호르몬, 예컨대 장 호르몬, 세로토닌, 부신피질자극 호르몬(adrenocorticotropin hormon: ACTH), 코르티솔, 부신피질자극 호르몬 방출 호르몬 및 카테콜아민이 방출되어, 예를 들어 장의 생리적 기능을 제어한다. 대사산물 중심의 경로를 포함하는 뇌-장 축의 조절부전(dysregulation) 은 운동성을 감소시키고 통증 또는 불편함을 증가시킴으로써 위장 기능에 악영향을 미칠수 있다. 세로토닌 경로에 관한 치료제 약물이 현재 IBS 의 치료를 위해 조사 중이다. 창자 담즙산의 분비 및 흡수의 조절부전도 또한 IBS와 연관된다. 일부 연구는 또한 위장 기능이 장내 마이크로비옴의 영향을 받는 것을 나타낸다. 예를 들어, 다이어트, 항생제, 병원균 및 숙주의 면역 반응이 장의 마이크로비옴 군집을 변경할수 있고, 이는 결국 장 기능을 변경시킬 수 있다.
상기 내용을 고려하여, 관련 기술분야에는 뇌-장-마이크로비옴 축을 모니터링함으로써 개인에게서 IBS 를 진단하는 방법에 대한 요구가 존재한다. 각종 대사 경로 및 이화 경로(catabolic pathway)가 적절히 기능하고 있는지에 대해 평가하기 위한 검정법이 필요하다. 본 발명은 이들 및 기타 요구를 만족시킨다.
본 발명은 세로토닌, 트립토판 및 키뉴레닌(kynurenine) 경로의 대사산물에 대한 항체, 및 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 제조된 항체는 관련 대사산물에 대해 낮은 교차반응성을 가지며, 하기 대사산물 중 하나 이상에 대한 특이적 및 민감성 면역학적 검정을 위한 유용한 시약이다: 세로토닌 (5-HT), 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA), 5-히드록시트립토판 (5-HTP), 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 키뉴(KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산 및 안트라닐산.
본 발명은 또한, 세로토닌 (5-HT), 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA), 5-히드록시트립토판 (5-HTP), 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 (KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산 및 안트라닐산의 안정한 유도체를 제공한다. 유도체는 담체 단백질과 같은 생체분자에 접합(conjugated)될 수 있으며 면역 반응을 자극하는 보강제(adjuvant)와 조합될 수 있다. 유도체는 또한 다른 생체분자에 접합될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 하기를 포함한다:
(a) 담체 단백질(carrier protein)에 접합된, 세로토닌 (5-HT), 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA), 5-히드록시트립토판 (5-HTP), 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 (KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산 및 안트라닐산으로 구성된 군으로부터 선택된 유도체를 포함하는 면역원을 제공하는 단계;
(b) 동물의 면역계가 항체를 제조하도록 하는 조건하에서 면역원으로 동물을 면역화하는 단계; 및
(c) 동물에서 항체를 제거하는 단계.
다른 특정 양태에서, 본 발명은 인간과 같은 포유류로부터의 체액 또는 조직 샘플에서, 세로토닌 (5-HT), 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA), 5-히드록시트립토판 (5-HTP), 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 (KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산, 안트라닐산 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 검정하는 방법을 제공한다. 방법은 샘플을 본원에 기재된 항체와 조합하는 단계, 및 이어서, 샘플로부터의, 세로토닌 (5-HT), 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA), 5-히드록시트립토판 (5-HTP), 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 (KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산, 안트라닐산 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것에 항체가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법들에서, 샘플로부터의 세로토닌 (5-HT) 에 결합하는 특이적 항체는 세로토닌 (5-HT)가 샘플에 존재함을 나타낸다.
본 발명은 또한 담즙산 대사산물에 대한 항체, 및 그의 제조 방법을 제공한다. 제조된 항체는 관련 대사산물에 대해 낮은 교차반응성을 가지며, 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온에 대한 특이적 및 민감성 면역학적 검정을 위해 유용한 시약이다.
본 발명은 또한, 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온의 안정한 유도체를 제공한다. 유도체는 담체 단백질과 같은 생체분자에 접합될 수 있으며 면역 반응을 자극하기 위한 보강제와 조합될 수 있다. 유도체는 또한 기타 생체분자와 조합될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온의 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 하기를 포함한다:
(a) 담체 단백질에 접합된 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온의 유도체를 포함하는 면역원을 제공하는 단계;
(b) 동물의 면역계가 항체를 제조하도록 하는 조건 하에서 면역원으로 동물을 면역화하는 단계; 및
(c) 동물에서 항체를 제거하는 단계.
기타 특정 양태에서, 본 발명은 인간과 같은 포유류로부터의 체액 또는 조직 샘플에서 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온에 대한 검정 방법을 제공한다. 방법은 샘플을 본원에 기재된 항체와 조합하는 단계, 및 이어서 샘플로부터의 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온에 항체가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 이들 방법에서, 샘플로부터의 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온에 결합한 특이적 항체는 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온이 샘플에 존재함을 나타낸다.
또한, 본 발명은 단쇄 지방산에 대한 항체, 및 그의 제조 방법을 제공한다. 제조된 항체는 관련 대사산물에 대해 낮은 교차반응성을 가지며, 프로피온산 및 부티르산에 대한 특이적 및 민감성 면역학적 검정을 위한 유용한 시약이다.
본 발명은 또한 단쇄 지방산(SCFA), 예컨대 프로피온산 및 부티르산의 안정한 유도체를 제공한다. 유도체는 생체분자, 예컨대 담체 단백질에 접합될 수 있으며 면역 반응을 자극하기 위한 보강제와 조합될 수 있다. 유도체는 또한 기타 생체분자에 접합될 수 있다.
기타 양태에서, 본 발명은 단쇄 지방산의 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 하기를 포함한다:
(a) 담체 단백질에 접합된 단쇄 지방산의 유도체를 포함하는 면역원을 제공하는 단계;
(b) 동물의 면역계가 항체를 제조하도록 하는 조건 하에서 면역원으로 동물을 면역화하는 단계; 및
(c) 동물에서 항체를 제거하는 단계.
기타 특정 양태에서, 본 발명은 인간과 같은 포유류로부터의 체액 또는 조직 샘플에서 단쇄 지방산을 검정하는 방법을 제공한다. 방법은 샘플을 본원에 기재된 항체와 조합하는 단계, 및 이어서 샘플로부터의 단쇄 지방산에 항체가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 이들 방법에서, 샘플로부터의 프로피온산에 결합한 특이적 항체는 프로피온산이 샘플에 존재함을 나타낸다.
상술한 내용에 추가하여, 본 발명은 본원의 대사산물의 존재 또는 농도를 이용하여 대상체에서 IBS 의 진단을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 본원에 기재된 검정 방법에 의해 환자의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 하나 이상의 대사산물을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 환자의 IBS 치료가 유효한지 여부를 결정하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 본원에 기재된 검정 방법에 의해 환자의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 하나 이상의 대사산물을 측정하는 단계를 포함한다.
기타 특정 양태에서, 본 발명은 IBS 로 이미 진단된 환자를 평가하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 본원에 기재된 검정 방법에 의해 환자의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 하나 이상의 대사산물을 측정하는 단계를 포함한다.
이들 및 기타 양태에서, 장점 및 구현예들은 후속하는 상세 설명 및 도면을 판독할 경우 더 명백하게 될 것이다.
도 1 은 IBS 의 복잡한 병태 생리를 예시하며 세로토닌, 트립토판 및 키뉴레닌 경로의 대사산물을 강조한다.
도 2 는 본 발명의 항체 생성 방법 중 하나의 흐름도를 예시한다.
도 3 은 특정 대사산물의 불안정한 속성을 도시하는 TLC 크로마토그램을 예시한다.
도 4 는 본 발명의 안정화된 유도체에 대한 필요성을 도시하는, 세로토닌 신호의 손실을 예시한다.
도 5 는 본 발명의 유도된 대사산물의 안정한 속성을 도시하는 TLC 크로마트그램을 예시한다.
도 6 은 본 발명의 세로토닌 및 유도체의 HPLC 트레이스를 예시한다.
도 7 은 본 발명의 5-히드록시인돌 아세트산 및 유도체의 HPLC 트레이스를 예시한다.
도 8 은 환자 혈청의 경로 대사산물을 검출하기 위해 사용된 경쟁적 ELISA 의 예시적 구현예를 도시한다.
도 9 는 블리드(bleeds) 1-5 (B1, B2, B3, B4 및 B5) 에서 토끼 A 및 토끼 B로부터의 항혈청에서 검출된 벤족사졸 유도체에 대한 항체 데이터의 막대 그래프를 도시한다.
도 10 은 토끼 A 및 B 에서 Ser-D 에 대해 발생된 항체의 친화도를 평가하기 위해 수행된 적정(titration) 실험으로부터의 데이터를 도시한다.
도 11a-d 는 도 11b 에 도해된 직접 검정을 이용한 항혈청의 교차반응성의 결여를 예시한다. 항혈청은 5-HT (도 11a)에 특이적이며 구조적으로 유사한 화합물, 예컨대 5-히드록시트립토판 (5-OH Tryp; 도 11c) 및 5-히드록시인돌아세트산 (5-HIAA; 도 11d) 에 교차반응성을 나타내지 않는다.
도 12a-e 는 도 12b 에 도해된 경쟁적 검정법을 이용하여 테스트된 항혈청의 교차반응성의 결여를 예시한다. 도 12a 는 인간 혈청 내에서 Ser-D 의 존재가 비오틴화 Ser-D에 항-Ser-D 항체가 결합하는 것을 억제함을 도시한다. 자유 Ser-D 의 양이 증가함에 따라 더 적은 항체가 검출되었다. 도 12c-e 는 트립토판 (도 12c), 5-히드록시트립토판 (도 12d), 및 5-히드록시인돌아세트산 (도 12e) 유도체가 존재하였을 경우 비오틴화 Ser-D 에 결합한 항체의 양의 변화가 없거나 약간 변화하였음을 도시한다.
도 13a-c 는 IBS-D 환자에서 세로토닌의 평균 량이 정상 대조군에 비해 현저하게 다름을 도시한다. 도 13a 는 ELISA 데이터의 그래프를 도시한다. 도 13b 는 표로 만들어진 데이터 요약을 도시한다. 도 13c 는 사분위 분석을 도시한다.
도 14 는 며칠 간에 수행된 세로토닌 검정이 안정하고 재현성있음을 도시한다.
도 15 는 본 발명의 항체로 ELISA 를 이용하여 측정한 세로토닌 수준을 도시한다. 유암종(carcinoid tumor), 알츠하이머 질환 또는 자폐증을 앓는 환자로부터의 샘플을 테스트하였다. 정상 대조군에 비해, 유암종을 앓는 환자는 세로토닌 수준이 더 높은 반면, 알츠하이머 질환 또는 자폐증을 앓는 환자는 수준이 더 낮았다.
도 16a 는 담즙산이 FGF19 신호전달을 활성화하여 결국 담즙산 대사를 조절함을 도시한다. 도 16b 는 각종 지표에 대한 FGF-19 데이터의 그래프이다.
도 17a 는 500 ng/ml 내지 31.3 ng/ml 범위의 항원 (예를 들어, KYA-L) 으로부터의 데이터를 도시하고; 도 17b 는 31.3 ng/ml 내지 0 범위의 KYA-L 을 도시한다. 데이터는 항체가 키뉴렌산에 특이적으로 결합함을 예시한다.
도 18a-d 는 항-KYA-L 항체의 교차반응성의 결여를 예시한다. 도 18a 는 비오틴화 항원과 경쟁적인 KYA-L 항원을 도시한다. 대조적으로, 증가하는 양의 Ky (도 18b), H-Ky (도 18c) 및 Trypt (도 18d) 의 존재가 검정에서 검출된 항-KYA-L 수준을 변화시키지 않았다. 결과는 항-KYA-L 항체가 키뉴레닌 대사산물과 교차 반응하지 않으며 키뉴렌산에 특이적임을 도시한다.
도 19 는 프로피온산 특이적 항체의 존재에 대해 테스트한, 면역화된 토끼로부터의 항혈청의 결과를 도시한다.
도 20a-b 는 경쟁적 검정법을 이용하여 테스트한 항-PropL 항체의 교차반응성의 결여를 도시한다. 항체는 프로피온산 (도 20a)에 대해 특이적이며 부티르산 (20b) 또는 세로토닌 (20c) 과의 교차반응성을 나타내지 않았다.
I. 정의
본원에 사용된 관사("a", "an", 또는 "the")는 하나의 요소를 갖는 양태를 포함할뿐만 아니라 하나 초과의 요소를 갖는 양태도 또한 포함한다. 예를 들어, "폴리아민 화합물 및 부형제"를 포함하는 구현예는 적어도 제2 폴리아민 화합물, 적어도 제2 부형제, 또는 둘 모두를 갖는 특정 양태를 제공하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "검정법(assay)"은 분석물의 검출 또는 정량을 포함한다. 통상적으로, 검정법의 구현은 사용된 퍼옥시다아제의 양에 대한 광 출력의 상관관계를 요구하여, 퍼옥시다아제는 직접적으로 결정된 물질이다. 비록 본 발명은 임의의 반응물 (루미놀, 퍼옥시다아제 또는 산화제)의 존재 또는 양을 결정하는 데 유용하지만, 반응물이 반드시 결정되는 물질 자체일 필요는 없다. 예를 들어, 산화제 (예를 들어, H2O2)는 이전의 반응, 또는 일련의 이전 반응에 의해 생성될 수있다.
항체 또는 항원 결합 단편은 다른 대사산물에 대한 1 % 미만의 교차반응성으로 관심 대사산물에 특이적으로 결합된다. 임의의 교차반응성이 발생할 경우, 교차반응성은 최소한(de minimus)이며, 예컨대 다른 대사산물에 대한 교차반응성이 1% 미만, 또는 약 0.03-0.9%; 또는 0.02-0.8%; 또는 0.05% 내지 0.5% 또는 0.03%-0.9% 이다.
본원에 사용된 "아실" 은 본원에 정의된 알카노일, 아로일, 헤테로시클로일, 또는 헤테로아로일 기를 포함한다. 대표적인 아실 기는 아세틸, 벤조일, 니코티노일 등을 포함한다.
본원에 사용된 "알카노일" 은 알킬-C-(0)- 기(알킬 기는 본원에 정의된 바와 같음)를 포함한다. 대표적인 알카노일 기는 아세틸, 에타노일 등을 포함한다.
본원에 사용된 "알케닐" 은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합 또는 삼중 결합을 포함하는 2 내지 약 15 탄소 원자의 직쇄 또는 분지쇄 지방족 탄화수소 기를 포함한다. 바람직한 알케닐 기는 2 내지 약 12 탄소 원자를 갖는다. 더욱 바람직한 알케닐 기는 2 내지 약 6 탄소 원자를 포함한다. 한 양태에서, 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 탄화수소 기가 바람직하다. 두번째 양태에서, 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 탄화수소 기(즉, 알키닐)가 바람직하다. 본원에 사용된 "저급 알케닐"은 2 내지 약 6 탄소 원자의 알케닐을 포함한다. 대표적인 알케닐 기는 비닐, 알릴, n-부테닐, 2-부테닐, 3-메틸부테닐, n-펜테닐, 헵테닐, 옥테닐, 데세닐, 프로피닐, 2-부티닐, 3-메틸부티닐, n-펜티닐, 헵티닐 등을 포함한다.
알케닐 기는 비치환되거나 선택적으로 치환될 수 있다. 선택적으로 치환된 경우, 알케닐기의 하나 이상의 수소 원자 (예를 들어, 1 내지 4, 1 내지 2, 또는 1)가, 플루오로, 히드록시, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 아실아미노, 티오 및 알킬티오로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 부분(moiety)으로 대체될 수 있다.
본원에 사용된 "알케닐렌" 은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 2가 탄화수소 사슬을 포함한다. 바람직한 알케닐렌 기는 사슬에 2 내지 약 12 개의 탄소를 포함하하며, 보다 바람직한 알케닐렌 기는 사슬에 2 내지 6 개의 탄소를 포함한다. 한 양태에서, 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 탄화수소 기가 바람직하다. 두번째 양태에서, 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 탄화수소 기가 바람직하다. 대표적인 알케닐렌 기는 -CH=CH-, -CH2-CH=CH-, -C(CH3)=CH-, -CH2CH=CHCH2-, 에티닐렌, 프로피닐렌, n-부티닐렌 등을 포함한다.
본원에 사용된 "알콕시"는 알킬-O- 기(알킬기는 본원에 정의된 바와 같음)를 포함한다. 대표적인 알콕시 기는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, 헵톡시 등을 포함한다.
알콕시 기는 비치환될 수 있거나 선택적으로 치환될 수 있다. 선택적으로 치환된 경우, 알콕시 기의 하나 이상의 수소 원자 (예컨대, 1 내지 4, 1 내지 2, 또는 1)는 플루오로, 히드록시, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 아실아미노, 티오, 및 알킬티오로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 부분으로 대체될 수 있다.
본원에 사용된 "알콕시알킬"은 알킬-O-알킬렌- 기(알킬 및 알킬렌은 본원에 정의된 바와 같음)를 포함한다. 대표적인 알콕시알킬 기는 메톡시에틸, 에톡시메틸, n-부톡시메틸 및 시클로펜틸메틸옥시에틸을 포함한다.
본원에 사용된 "알콕시카르보닐"은 에스테르 기, 즉 알킬-O-CO- 기(알킬은 본원에 정의된 바와 같음)를 포함한다. 대표적인 알콕시카르보닐 기는 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, t-부틸옥시카르보닐 등을 포함한다.
본원에 정의된 "알콕시카르보닐알킬"은 알킬-O-CO-알킬렌- 기(알킬 및 알킬렌은 본원에 정의된 바와 같음)를 포함한다. 대표적인 알콕시카르보닐알킬은 메톡시카르보닐메틸, 에톡시카르보닐메틸, 메톡시카르보닐에틸 등을 포함한다.
본원에 사용된 "알킬" 은 사슬에 약 1 내지 약 20 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는 지방족 탄화수소 기를 포함한다. 바람직한 알킬 기는 사슬에 1 내지 약 12 개의 탄소 원자를 갖는다. 더욱 바람직한 알킬 기는 사슬에 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는다. 본원에 사용된 "분지쇄" 는 하나 이상의 저급 알킬, 예컨대 메틸, 에틸 또는 프로필이 선형 알킬 사슬에 부착된 것을 포함한다. 본원에 사용된 "저급 알킬" 은 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는 사슬에 1 내지 약 6 개의 탄소 원자, 바람직하게는 5 또는 6 개의 탄소 원자를 포함한다. 대표적인 알킬 기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, n-펜틸, 및 3-펜틸을 포함한다.
알킬 기는 비치환될 수 있거나 선택적으로 치환될 수 있다. 선택적으로 치환될 경우, 알킬 기의 하나 이상의 수소 원자 (예컨대, 1 내지 4, 1 내지 2, 또는 1)는 플루오로, 히드록시, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 아실아미노, 티오, 및 알킬티오로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 부분으로 대체될 수 있다.
본원에 사용된 "알킬렌" 은 1 내지 약 6 개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 2가 탄화수소 사슬을 포함한다. 바람직한 알킬렌 기는 1 내지 약 4 개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬렌 기이다. 대표적인 알킬렌 기는 메틸렌, 에틸렌 등을 포함한다.
본원에 사용된 "알킬티오" 는 알킬-S-기(알킬 기는 본원에 정의된 바와 같음)를 포함한다. 바람직한 알킬티오 기는 알킬 기가 저급 알킬인 것들이다. 대표적인 알킬티오 기는 메틸티오, 에틸티오, 이소프로필티오, 헵틸티오 등을 포함한다.
본원에 사용된 "알킬티오알킬" 은 알킬티오-알킬렌- 기(알킬티오 및 알킬렌은 본원에 정의된 바와 같음)를 포함한다. 대표적인 알킬티오알킬 기는 메틸티오메틸, 에틸티오프로필, 이소프로필티오에틸 등을 포함한다.
본원에 사용된 "아미도" 는 화학식 Y1Y2N-C(O)- (식중, Y1 및 Y2 는 독립적으로 수소, 알킬 또는 알케닐이거나; Y1 및 Y2 는 Y1 과 Y2 가 이를 통해 연결된 질소와 함께 연결되어, 4- 내지 7-원 아자헤테로시클릴 기 (예를 들어, 피페리디닐)를 형성함) 의 기를 포함한다. 대표적인 아미도 기는 1차 아미도 (H2N-C(O)-), 메틸아미도, 디메틸아미도, 디에틸아미도 등을 포함한다. 바람직하게는, "아미도" 는 -C(O)NRR' 기 (식중, R 및 R' 는 H 및 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것임) 이다. 보다 바람직하게는, 적어도 하나의 R 및 R' 는 H 이다.
본원에 사용된 "아미도알킬" 은 아미도-알킬렌 기(식중, 아미도 및 알킬렌은 본원에 정의된 바와 같음)를 포함한다. 대표적인 아미도알킬 기는 아미도메틸, 아미도에틸렌, 디메틸아미도메틸 등을 포함한다.
본원에 사용된 "아미노" 는 화학식 Y1Y2N- (식중, Y1 및 Y2 는 독립적으로 수소, 아실 또는 알킬이거나; Y1 및 Y2 는, 이를 통해 Y1 및 Y2 가 연결된 질소와 함께 연결되어 4- 내지 7-원 아자헤테로시클릴 기 (예를 들어, 피페리디닐)를 형성함) 의 기를 포함한다. 선택적으로, Y1 및 Y2 가 독립적으로 수소 또는 알킬일 경우, 질소에 추가 치환기가 추가되어 4급 암모늄 이온을 형성할 수 있다. 대표적인 아미노 기는 1차 아미노 (H2N-), 메틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노 등을 포함한다. 바람직하게는, "아미노" 는 -NRR' 기(식중, R 및 R' 는 H 및 알킬로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것임) 이다. 바람직하게는, 적어도 하나의 R 및 R' 는 H 이다.
본원에 사용된 "아미노알킬" 은 아미노-알킬렌 기(아미노 및 알킬렌은 본원에 정의된 바와 같음)를 포함한다. 대표적인 아미노알킬 기는 아미노메틸, 아미노에틸, 디메틸아미노메틸 등을 포함한다.
본원에 사용된 "아로일" 은 아릴-CO- 기(아릴은 본원에 정의된 바와 같음)를 포함한다. 대표적인 아로일은 벤조일, 나프트-1-오일(naphth-1-oyl) 및 나프트-2-오일을 포함한다.
본원에 사용된 "아릴" 은 6 내지 약 14 개의 탄소 원자, 바람직하게는 6 내지 약 10 개의 탄소 원자의 단환 또는 다환 고리 시스템을 포함한다. 대표적인 아릴 기는 페닐 및 나프틸을 포함한다.
본원에 사용된 "방향족 고리" 는 산소, 황, 셀레늄, 및 질소로 구성된 군으로부터 선택된 0 내지 4 개의 헤테로원자를 포함할 수 있는 5-12 원 방향족 단환 또는 축합 다환 부분을 포함한다. 예시적인 방향족 고리는 벤젠, 피롤, 푸란, 티 오펜, 이미다졸, 옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피라졸, 피리딘, 피라진, 피리다진, 피리미딘, 나프탈렌, 벤자티아졸린, 벤조티오펜, 벤조푸란, 인돌, 벤즈인돌, 퀴놀린 등을 포함한다. 방향족 고리 기는 할로, 알킬, 알콕시, 알콕시 카르보닐, 할로알킬, 시아노, 술포나토, 아미노 술포닐, 아릴, 술포닐, 아미노카르보닐, 카르복시, 아실아미노, 알킬 술포닐, 아미노 및 치환 또는 비치환 치환기로 하나 이상의 위치가 치환될 수 있다.
본원에 사용된 "생체분자" 는 생물학적 시스템에 사용하기 위한 천연 또는 합성 분자를 포함한다. 바람직한 생체 분자는 단백질, 펩티드, 효소 기질, 호르몬, 항체, 항원, 합텐, 아비딘, 스트렙타비딘, 탄수화물, 탄수화물 유도체, 올리고당, 다당류, 및 핵산을 포함한다. 보다 바람직한 생체 분자는 단백질, 펩티드, 아비딘, 스트렙타비딘, 또는 비오틴을 포함한다.
본원에 사용된 "카르복시" 및 "카르복실" 은 - HOC(O)- 기 (즉, 카르복실산) 또는 그의 염을 포함한다.
본원에 사용된 "카르복시알킬" 은 - HOC(O)-알킬렌- 기(알킬렌은 본원에 정의된 바와 같음)를 포함한다. 대표적인 카르복시알킬은 카르복시메틸 (즉, HOC(O)CH2-) 및 카르복시에틸 (즉, HOC(O)CH2CH2-) 을 포함한다.
본원에 사용된 "시클로알킬" 은 약 3 내지 약 10 개의 탄소 원자의, 바람직하게는 약 5 내지 약 10 개의 탄소 원자의 비-방향족 단환 또는 다환 고리 시스템을 포함한다. 더욱 바람직한 시클로알킬 고리는 5 또는 6 개의 고리 원자를 포함한다. 시클로알킬 기는 선택적으로 적어도 하나의 sp2-혼성 탄소 (예를 들어, 내향고리 또는 외향고리 올레핀을 포함하는 고리) 를 포함한다. 대표적인 단환 시클로알킬 기는 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 포함한다. 대표적인 다환 시클로알킬은 1-데카린, 노르보르닐, 아다만틸 등을 포함한다.
본원에 사용된 "시클로알킬렌" 은 약 4 내지 약 8 개의 탄소 원자를 갖는 2가 시클로알킬을 포함한다. 바람직한 시클로알킬레닐 기는 1,2-, 1,3-, 또는 1,4- 시스 또는 트랜스-시클로헥실렌 등을 포함한다.
본원에 사용된 "할로" 또는 "할로겐" 은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 포함한다.
본원에 사용된 "헤테로원자" 는 탄소 또는 수소 이외의 원자를 포함한다. 대표적인 헤테로원자는 O, S 및 N을 포함한다. 헤테로원자의 질소 또는 황 원자는 선택적으로, 상응하는 N-산화물, S-산화물 (술폭시드), 또는 S,S-디옥시드 (술폰)로 산화된다. 바람직한 양태에서, 헤테로원자는 알킬렌 탄소 원자 (예를 들어, -C1-C9 알킬렌-O-C1-C9 알킬렌-) 에 적어도 2개의 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 헤테로원자는 아실, 알킬, 아릴, 시클로알킬, 헤테로시클릴, 또는 헤테로아릴 기 (예를 들어, -N(Me)-; -N(Ac)-)로 추가로 치환된다.
본원에 사용된 "히드록시알킬" 은 하나 이상의 히드록시 기로 치환된 본원에 정의된 알킬 기를 포함한다. 바람직한 히드록시알킬은 저급 알킬을 포함한다. 대표적인 히드록시알킬 기는 히드록시메틸 및 2-히드록시에틸을 포함한다.
"연결 기", 즉 L 은 대사산물 유도체를 생체분자, 예컨대 담체 단백질, 비오틴 또는 스트렙타비딘으로 연결하는 원자를 포함한다. 또한 문헌 [R. Haugland, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes 및 Research Chemicals, Molecular Probes, Inc. (1992)] 참조. 한 구현예에서, L 은 단백질과의 부착 반응 이전의 연결기 전구체를 나타내며, R11 은 본 발명의 화합물과 단백질 또는 비오틴 간의 생성된 부착을 나타낸다(즉, R11 은 생체분자에 연결된 연결 기 간의 생성된 부착임). 바람직한 반응성 작용기들은 포스포라미디트 기, 활성화된 에스테르 (예를 들어, NHS 에스테르), 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드 및 요오도아세트아미드를 포함한다. L은 고리에 공유결합으로 부착된, 말단 아미노, 카르복실산, 또는 술피드릴 기를 포함할 수 있다. 특정한 경우에는, 말단 아미노, 카르복실산, 또는 술피드릴 기가 도시되고 -L-NH2, 또는 -LC(O)OH 또는 -L-SH 로 나타낸다.
본원에 사용된 "옥소" 는 화학식 >C=O (즉, 카르보닐 기 -C(O)-)의 기를 포함한다.
본원에 사용된 "술포나토" 는 -SO3 - 기, 바람직하게는 H+, Na+, K+, 등과 같은 양이온에 의해 균형이 맞춰진 것을 포함한다.
본원에 사용된 "술포나토알킬" 은 술포나토 및 알킬렌이 본원에 정의된 바와 같은 술포나토-알킬렌- 기를 포함한다. 더 바람직한 구현예는 2 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는 알킬렌 기를 포함하며, 가장 바람직한 구현예는 2, 3 또는 4 개의 탄소를 갖는 알킬렌 기를 포함한다. 대표적인 술포나토알킬은 술포나토메틸, 3-술포나토프로필, 4-술포나토부틸, 5-술포나토펜틸, 6-술포나토헥실 등을 포함한다.
II. 구현예
세로토닌 (5-HT) 은 위장관 운동, 분비 및 감각의 조절에 중요한 역할을 한다. 장 신경계 내의 세로토닌 신호전달에서 5-HT 수준의 불균형은 과민성 대장 증후군 (IBS), 기능성 소화 불량, 비-심장 가슴 통증, 자폐증 및 위궤양 형성을 포함하는 다양한 질환과 관련되어 있다. 특정 신경계 영역에서 5-HT 수준의 동기화된 조절이 필요하며, 5-HT의 이화 작용이 상기 조절에 중요한 역할을 한다. 다른 화합물로 5-HT의 이화 전환이 5-HT의 전반적인 수준에 영향을 미치므로, 이러한 전환 생성물의 형성은 5-HT 조절의 근본적인 인자가 될 수 있다. 5-HT를 수반하는 세 가지 경로는 트립토판, 세로토닌 및 키뉴레닌 경로이다. 그들이 연결관계의 개략적인 묘사가 도 1에 예시된다.
특정 양태에서, 본 발명은, 트립토판, 세로토닌 및 키뉴레닌 경로에서의 대사산물을 측정하기 위한 검정법을 제공한다. 예를 들어, 도 1을 참조하여, 키뉴레닌 경로 내에서 5-HT (101), 5-HIAA (5-히드록시인돌-3-아세트산) (115) 및 대사산물을 측정함으로써 IBS 및 기타 병리학적 현상, 예컨대 카르시노이드 증후군, 우울증, 고혈압, 자폐증, 알츠하이머 질환 및 편두통의 진단을 보조하는 것이 이해될 수 있다.
종래의 대사산물 측정방법은 민감도, 특이성 및 재현성이 없거나 부족한 것이다. 또한, 대사산물, 예컨대 5-HT 및 5-HIAA는 측정하기가 매우 어렵게 매우 불안정하다.
A. 세로토닌 경로 대사산물에 대한 검정
한 양태에서, 본 발명은 세로토닌 대사산물의, 대사산물 유도체 및 그의 접합체(conjugates), 항체 생성을 위한 방법 및 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 5-HT 및 5-HIAA 와 같은 대사산물이 산소에 민감하고 따라서 불안정하므로 유도체화(derivatization)가 바람직하다. 혈장에서 세로토닌 수준은 약 0.6 내지 179 nmol/L 의 범위이다. 온화한 조건 하에서 5-HT 및 5-HIAA 의 화학적 유도체화는 화합물을 안정화시킨다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 세로토닌 대사산물의 안정한 벤족사졸 유도체를 제공한다. 안정한 벤족사졸 유도체는 형광으로 인해 감도가 높은 HPLC에 의해 검출될 수 있다.
본 발명은 세로토닌 (5-HT) 및 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA)의 안정한 유도체를 제공한다.
한 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 I 의 화합물을 제공한다:
Figure pct00001
식중, R 은 알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 아미노알킬, 아미도알킬, 카르복시 알킬, 치환 카르복시알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 것이고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8 은 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고;
L 은 링커(linker)이고;
R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고;
B는 생체 분자이다.
한 양태에서, R 은 아미노알킬, 카르복시알킬, 및 치환 카르복시알킬로 구성된 군으로부터 선택된 것이다. 다른 양태에서, R 은 -CH2CH2NH2, -CH2CH2CO2H 및 -CH2CH(NH2)CO2H 로 구성된 군으로부터 선택된 것이다.
L 은 담체 단백질 또는 비오틴과 같은 생체분자에 부착하기 위한 연결기를 나타낸다. 예를 들어, L 은 고리에 공유결합으로 부착된, 말단 아미노, 카르복실 산, 또는 술피드릴 기를 포함할 수 있다. 특정한 경우에는, 말단 아미노, 카르복실 산, 또는 술피드릴 기가 도시되고 -L-NH2, 또는 -LC(O)OH 또는 -L-S 로 나타낸다.
R11 은 본 발명의 화합물과, 담체 단백질, 펩티드, 또는 비오틴과 같은 생체분자 간에 생성된 부착을 나타낸다(즉, R11 은 생체분자에 연결된 연결기를 포함한다).
L 은 직접 결합 또는 공유 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 것이며, 상기에서 공유 결합은 선형 또는 분지형, 시클릭 또는 헤테로시클릭, 포화 또는 불포화이고 C, N, P, O, 및 S 로 구성된 군으로부터 선택된 1-60 개의 원자를 가지며, L 은 원자가를 채우기 위해 추가의 수소 원자를 가질 수 있으며, 결합은 에테르, 티오에테르, 아민, 에스테르, 카르바메이트, 우레아, 티오우레아, 옥시 또는 아미드 결합; 또는 단일, 이중, 삼중 또는 방향족 탄소-탄소 결합; 또는 인-산소, 인-황, 질소-질소, 질소-산소, 또는 질소-백금 결합; 또는 방향족 또는 헤테로방향족 결합의 임의의 조합을 포함한다. 특정 양태에서, L은 말단 아미노, 카르복실 산, 또는 술피드릴 기를 포함한다.
바람직한 특정 구현예에서, L 은 하기 화학식의 것이다.
-X1-Y1-X2-
식중: X1 은 2가 라디칼, 직접 결합, 산소, 선택적으로 치환된 질소 및 황의 군으로부터 선택된 것이고; Y1 은 직접 결합 및 선택적으로 헤테로 원자에 의해 차단된 C1-C10 알킬의 군에서 선택된 것이고; X2 는 2가 라디칼, 직접 결합, 산소, 선택적으로 치환된 질소 및 황의 군으로부터 선택된 것이다.
바람직하게는, X1 및 X2 의 2가 라디칼은 각각, 직접 결합, 선택적으로 치환된 알킬렌, 선택적으로 치환된 알킬렌옥시카르보닐, 선택적으로 치환된 알킬렌카르바모일, 선택적으로 치환된 알킬렌술포닐, 아릴렌술포닐, 선택적으로 치환된 아릴렌옥시카르보닐, 선택적으로 치환된 아릴렌카르바모일, 선택적으로 치환된 티오카르보닐, 선택적으로 치환된 술포닐, 및 선택적으로 치환된 술피닐의 군으로부터 독립적으로 선택된다.
바람직한 특정 양태에서, L 은 -(CH2)n- (식중, r 은 1 내지 10 의 정수이고, 바람직하게는 n 은 1 내지 5, 예컨대 1 내지 4, 또는 1, 2, 3, 4, 또는 5의 정수이다.
또한, 벤족사졸 유도체는 면역성 접합체를 만드는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 본 발명의 접합체는 관심 대사산물에 특이적인 면역 반응을 증가시키기 위해 사용된다. 특정한 경우에는, 벤족사졸 유도체 및 링커 아암(linker arm) (n은 약 1 내지 4 임) 은 BSA 와 같은 담체 단백질을 아미노 (또는 술피드릴) 단부에 덧붙이기 위해 사용될 수 있다. 이렇게 제조된 항체의 친화성 및 특이성을 테스트하기 위해, 비오틴화 합텐이 제조된다. 본 발명은 세로토닌 경로에서 세로토닌 (5-HT), 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA) 및 기타 대사산물의 안정한 유도체를 제공한다. 유도체는 담체 단백질과 같은 생체분자에 접합될 수 있으며 면역 반응을 자극하기 위한 보강제와 조합될 수 있다. 유도체는 또한 기타 생체분자에 접합될 수 있다. 특정 양태에서, 추가의 접합을 위한 하나의 세로토닌 대사산물 유도체는 하기의 구조를 갖는다:
Figure pct00002
화학식 I의 화합물은 당 업계에 잘 알려진 접합 화학을 이용하여 캐리어 분자와 반응 할 수 있다. 예를 들어, 활성화된 에스테르 (NHS 에스테르)는 1차 아민과 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성할 수 있다. 말레이미드와 티올이 함께 반응하여 티오에테르를 제조할 수 있다. 할로겐화 알킬은 아민 및 티올과 반응하여 각각 알킬아민 및 티오에테르를 제조한다. 단백질에 접합될 수 있는 반응성 부분을 제공하는 임의의 유도체가 본원에 사용될 수 있다. 당 업계에 공지된 바와 같이, 유리(free) 아미노 기, 자유(free) 카르복실산 기, 또는 자유 술피드릴 기를 포함하는 부분은 단백질 접합에 유용한 반응성 기를 제공한다. 예를 들어, 유리 아미노 기는, 단백질 상의 이용가능한 카르복시 부분에의 글루타르알데히드 가교 결합 또는 카르보디이미드 가교결합을 통해 단백질에 접합될 수 있다. 또한, 자유 술피드릴 기를 갖는 합텐은, 예를 들어 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 이용한 단백질의 말레이미드 활성화에 이어 술피드릴기에의 연결을 통해 단백질에 접합될 수 있다.
대사산물을 함유하는 아민에의 부착을 위해 카르복실산 기를 갖는 담체 단백질을 연결하는 경우, 카르복실산은 먼저, 활성화 시약을 사용하여 좀더 반응성인 형태로 전환되어, 예를 들어, N-히드록시 숙신이미드 (NHS) 에스테르 또는 혼합 무수물을 형성할 수 있다. 아민-함유 대사산물은 생성된 활성화 산으로 처리되어 아미드 결합을 형성한다. 이와 달리, NHS 에스테르가 대사산물 상에 존재할 수 있고 아민이 담체 단백질 상에 존재할 수 있음을 당업자는 인지할 것이다.
유도체화에 의한 대사산물 안정화 공정은 면역성 접합체에 대한 항체의 생성을 가능하게 한다. 다루고 있는 항체에 있어서, 항체가 관심 대사산물에 대해 고도로 특이적인 면역검정, 예컨대 ELISA를 사용할 수 있다.
다른 경우에, 유도체는 하기 도시된 바와 같은 O-술페이트 및 세로토닌-O-포스페이트를 포함한다:
Figure pct00003
식중, R, R1, R6, 및 R7 는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이다.
도 1에 예시된 바와 같이, 세로토닌 경로의 관심 대사산물은, 예를 들어 세로토닌(101), 5-히드록시인돌 아세트알데히드(105) 및 5-히드록시인돌 아세트산 (115)이다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 5-히드록시트립타민 (5-HT)(101)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기에서 항체는, 트립토판 (122), 5-히드록시트립토판(125) 및 5-히드록시인돌 아세트산 (115)으로 구성된 군으로부터 선택된 것과 같은 하나 이상의 대사산물에 대해 1 % 미만의 교차반응성을 갖는다. 다른 양태에서, 본 발명은 5-히드록시인돌 아세트산 (115)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기에서 항체는, 트립토판 (122), 5-히드록시트립토판(125) 및 5-히드록시트립타민 (5-HT)(101) 으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 대사산물에 대해 1 % 미만의 교차반응성을 갖는다.
이제 다시 도 2에 있어서, 한 양태에서, 본 발명은 대사산물 접합체에 대한 항체를 제공한다. 단계 201 에서, 대사산물 또는 그의 안정한 유도체가 제조된다. 단계 222 에서, BSA(bovine serum albumin) 와 같은 담체 단백질이 유도체에 접합된다. 단계 231 에서, 항체는 토끼, 마우스, 양, 닭, 염소 등과 같은 포유류에 접합체를 주입함으로써 제조된다. 그 후, 비오틴화 합탄 (251) 을 사용하여 상기와 같이 제조된 항체를 테스트할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 각 유도체가 담체 단백질에 접합된, 세로토닌 (5-HT), 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA), 5-히드록시트립토판 (5-HTP)으로 구성된 군으로부터 선택된 유도체를 포함하는 면역원을 제공하는 단계;
(b) 동물의 면역계가 항체를 제조하도록 하는 조건 하에서 면역원으로 동물을 면역화하는 단계; 및
(c) 동물에서 항체를 제거하는 단계.
한 양태에서, 포유류로부터 생성된 항체는 본 발명의 접합체를 이용하여 혈청으로부터 제거할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 화학식 Ia, Ib 및 Ic 의 화합물을 사용하여 항체를 혈청으로부터 제거할 수 있으며, 접합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00004
화학식 Ia, Ib 또는 Ic 의 비오틴화 화합물을 사용하여 포유류(예컨대, 토끼, 마우스 또는 염소)로부터 상응하는 항체를 제거할 수 있다. 그 후, 2차 항체를 사용하여 항체 접합체를 검출한다.
다른 양태에서, 본원에 기재된 방법을 이용하여 상기와 같이 제조된 항체를 사용하여, ELISA 또는 CEER 과 같은 면역검정법을 이용함으로써 관심 경로의 대사산물의 양 또는 수준을 정량할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 항체-항원 반응이 수행되는 검정 방법을 제공한다. 예를 들어, 항원 또는 대사산물, 예컨대 5-HT 는 퍼옥시다제 표지된 항체와 반응하여 항원-항체 복합체를 형성하는 것이 가능하게 된다. 이와 같이 형성된 항원-항체 복합체는 이어서 고정된 항체와 반응하는 것이 가능하게 되고, 예를 들어, 기질로서 작용하는 루미놀과의 반응에 의해 생성되는 화학발광에 의해 퍼옥시다제의 활성이 측정된다.이로써, 대사산물의 존재, 농도 및/또는 수준이 측정된다.
특정한 경우에, 본 발명의 항체는 대사산물의 존재, 수준 및 농도의 검출을위해 효소 라벨을 이용하는 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)와 같은 면역검정에 사용된다. 한 양태에서, 본 발명의 특이적 항체는 플레이트로 흡수된다. 비특이적 부위는 특정 검정의 특이적 면역화학 반응에서 활성 부분을 갖지 않는 단백질 용액으로 차단된다. 관심 대사산물은 플레이트 상에서 항체에 의해 포획된다. 그 후, 효소 라벨을 갖는 다른 항체에 의해 접합체가 검출될 수 있다. 효소 라벨은 화학발광 시약과 반응하여 검출된다.
다른 ELISA 구현예에서, 대사산물 또는 유도체는 고정화될 수 있다. 본 발명의 항체는 고정화된 대사산물에 결합하도록 사용될 수 있다. 그 후, 효소 라벨을 갖는 다른 항체에 의해 접합체가 검출될 수 있다. 이어서, 효소 라벨은 화학발광 시약과 반응하여 검출된다.
본원에 기재된 임의의 대사산물을 검출하는 검정 방법은 당업계에 공지된 임의의 면역검정법을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 검정은 액상으로 수행된다. 다른 구현예에서, 검정은 고상, 예를 들어 비드(bead) 또는 마이크로플레이트, 예를 들어 96 웰 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 상에서 수행된다. 이들 방법에 유용한 면역검정법의 비제한적 예는 방사 면역 측정법, 마이크로 어레이 검정법, 형광 편광 면역검정법, FRET을 포함하는 면역검정법, 효소 결합 면역흡수 검정법 (ELISA) 또는 CEER 이다.
합텐 검출에 유용한 것으로 당업계에 공지된 임의의 ELISA 는 즉석 검정법에 사용될 수 있다. 합텐에 대한 ELISA 는 일반적으로 경쟁적 포맷을 사용하며, 즉 샘플의 합텐(대사산물)은, 샘플에 더 많은 합텐이 존재할 경우 더 적게 표지된 합텐이 결합되도록, 항-합텐 항체 결합 부위에 대해 표지된 합텐 (예를 들어, 비오틴-합텐 또는 효소-합텐 접합체)과 경쟁적이다. 따라서, 이들 경쟁적 검정법에서, 샘플의 합텐의 양이 증가하여 더 적은 효소가 고상에 결합하는 결과를 초래하고, 결과적으로 더 적은 발색 신호를 초래한다. 상기 경쟁적 검정법에서, 항체 결합 부위에 대해 직접 경쟁하기 위해 표지된 합텐과 함께 샘플에 첨가될 수 있거나, 샘플 합텐이 결합하지 않은 곳에 표지된 합텐이 단순히 결합하도록 샘플 및 표지된 합텐을 순차적으로 첨가할 수 있다.
일부 구현예에서, ELISA는 합텐이 신호전달 효소에 직접 결합하는 직접 경쟁 ELISA 이거나, 효소가 다른 분자, 예를 들어 제2 항체 또는 스트렙타비딘에 결합하는 간접 경쟁 ELISA 이다.
한 구현예에서, 본원에서 생성된 항체는 직접 또는 간접적으로 고상에 결합하며, 후자에서 고상은 항-항체(예를 들어, 토끼 IgG 항체)에 결합하는 염소 항체(염소 항-토끼 IgG))로 코팅되며 항체는 항-항체에 결합된다. 항-항체는 또한 "제2 항체"로도 공지되어 있다. 이러한 검정법에서, 샘플와 표지된 합텐이 고상에 첨가되어 코팅된 고상 상의 항체 결합 부위와 경쟁한다. 세척 후, 신호가 생성되고, 이는 고상에 결합된 표지된 합텐의 양을 측정한다.
B. 트립토판 경로 대사산물에 대한 검정법
다른 양태에서, 본 발명은 트립토판 경로에서 대사산물의 항체 생성을 위한항원을 제공한다. 특정한 경우에, IBS 에서의 세로토닌 기능의 불규칙성은 세로토닌 전구체, L-트립토판 (122) 대사의 변화에 기인한 것이다. 트립토판 (122)은 세로토닌으로의 전구체로서 작용하는 필수 아미노산이지만, 이와 달리, 다른 신경 활성제의 생성을 초래하는 키뉴레닌 경로 내에서 대사될 수 있다.
본 발명은 5-히드록시 트립토판 (5-HTP)에 대한 항체 및 그의 제조 방법을 제공한다.
벤족사졸에 대한 트립토판 대사산물(세로토닌 대사산물과 유사)의 유도체화는 선택적이다. 트립토판 경로의 관심 대사산물은, 예를 들어 5-히드록시트립토판 (5-HTP) (125) 및 트립토판 (122)이다. 한 양태에서, 트립토판 대사산물 유도체는 하기 화학식 II 의 구조를 갖는다:
Figure pct00005
R1, R6, R7, R8, 및 R9 은 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고;
L 은 링커이고;
R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고;
B는 생체 분자이다.
다른 양태에서, 화학식 II의 화합물은 항체를 제조하기 위해 당업계에 공지 된 접합 화학을 이용하여 담체 단백질을 접합하는 데 사용될 수 있다. 활성화 에스테르 (NHS 에스테르) 는 1차 아민과 반응하여 안정한 아미드 결합을 제조할 수 있다. 말레이미드 및 티올은 함께 반응하여 티오에테르를 제조할 수 있다. 할로겐화 알킬은 아민 및 티올과 반응하여 각각 알킬아민 및 티오에테르를 제조한다. 단백질에 접합될 수 있는 반응성 부분을 제공하는 임의의 유도체가 본원에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 유리 아미노 기, 자유 카르복실산 기, 또는 자유 술피드릴 기를 포함하는 부분은 단백질 접합에 유용한 반응성 기를 제공한다. 예를 들어, 유리 아미노 기는, 단백질 상의 이용가능한 카르복시 부분에의 글루타르알데히드 가교결합 또는 카르보디이미드 가교결합을 통해 단백질에 접합될 수 있다. 또한, 자유 술피드릴 기를 갖는 합텐은, 예를 들어 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 이용한 단백질의 말레이미드 활성화에 이어, 술피드릴기로의 연결을 통해 단백질에 접합될 수 있다.
한 접합의 예시적 개략도는 하기와 같다:
Figure pct00006
포유류로부터 생성된 항체는 본 발명의 접합체를 이용하여 혈청으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 화학식 II 의 화합물은 하기 화학식 IIa 의 구조를 갖는다:
Figure pct00007
본 발명은 또한, 5-히드록시트립토판 (5-HTP)의 안정한 유도체 및 항체의 제조 방법을 제공한다. 방법은 하기를 포함한다:
(a) 5-히드록시트립토판 (5-HTP)의 유도체를 포함하는 면역원을 제공하는 단계;
(b) 동물의 면역계가 항체를 제조하도록 하는 조건 하에서 면역원으로 동물을 면역화하는 단계; 및
(c) 동물에서 항체를 제거하는 단계.
다른 양태에서, 본 발명은 5-히드록시트립토판 (5-HTP) (125)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기에서 항체는, 트립토판 (122), 5-히드록시트립타민 (5-HT) (101) 및 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA) (125)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1 % 미만의 교차반응성을 갖는다.
다른 특정 양태에서, 본 발명은 인간과 같은 포유류로부터의 체액 또는 조직 샘플에서, 5-히드록시트립토판 (5-HTP)에 대한 검정 방법을 제공한다. 방법은 샘플을 본원에 기재된 항체와 조합하는 단계, 및 이어서, 샘플로부터의 5-히드록시트립토판 (5-HTP)에 항체가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법들에서, 샘플로부터의 (5-HTP) 에 결합하는 특이적 항체는 세로토닌 (5-HTP)가 샘플에 존재함을 나타낸다.
특정한 경우에, 본 발명의 항체는 대사산물 수준 및 농도의 검출을 위해 효소 라벨을 사용할 수 있는 ELISA 또는 CEER 과 같은 면역검정법에 사용된다.
C. 키뉴레닌 경로 대사산물에 대한 검정법
특정한 경우에, 키뉴레닌 경로 대사산물은 내장 통증의 기전에 역할을 하고 IBS에서 낮은 수준의 면역 활성화로 연결되었다. 식이 트립토판의 1 % 만이 세로토닌으로 전환되고, 95 % 초과가 키뉴레닌으로 대사된다. 두 키뉴레닌 수준 및 "키뉴레닌:트립토판 비" 가 IBS 에서 현저히 증가한다. 키뉴레닌 경로는 퀴놀린 산, 신경퇴행성 과정의 원인이 되는 NMDA 수용체 익사이토톡신(excitotoxin)의 생성을 포함한다. 통상적으로, IBS 환자는 키뉴렌산 (N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA) 수용체 길항제)의 농도 감소 및 안트라닐산 및 3-히드록시안트라닐산(내인성 NMDA 수용체 작용제의 전구체)의 증가를 나타낸다. 키뉴레닌 경로를 따르는 트립토판 대사는 IBS-D에서 억제된다. 본 발명은 IBS 환자의 상태를 결정하기 위해 진단상 중요한, 트립토판 및 키뉴레닌 경로 대사산물의 수준을 결정하기 위한 면역검정법을 제공한다.
본 발명은 또한, 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 (KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산 및 안트라닐산의 안정한 유도체를 제공한다. 유도체는 담체 단백질과 같은 생체분자에 접합될 수 있으며 면역 반응을 자극하기 위한 보강제와 조합될 수 있다. 유도체는 또한 다른 생체분자에 접합될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 항체의 제조 방법을 제공한다. 방법은 하기를 포함한다:
(a) 각 유도체가 담체 단백질에 접합된, 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 (KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산 및 안트라닐산으로 구성된 군으로부터 선택된 유도체를 포함하는 면역원을 제공하는 단계;
(b) 동물의 면역계가 항체를 제조하도록 하는 조건 하에서 면역원으로 동물을 면역화하는 단계; 및
(c) 동물에서 항체를 제거하는 단계.
다른 특정 양태에서, 본 발명은 인간과 같은 포유류로부터의 체액 또는 조직 샘플에서 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 (KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산 및 안트라닐산으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 검정하는 방법을 제공한다. 방법은 샘플을 본원에 기재된 항체와 조합하는 단계, 및 이어서, 샘플로부터의, 세로토닌 (5-HT), 5-히드록시인돌 아세트산(5-HIAA), 5-히드록시 트립토판(5-HTP), 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 (KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산 및 안트라닐산에 항체가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법들에서, 샘플로부터의 키뉴레닌에 결합하는 특이적 항체는 샘플에 키뉴레닌이 존재함을 나타낸다.
특정 양태에서, 본 발명의 면역검정법은 생물학적 유체에서 대사산물을 모니터링하기 위한 신뢰성있고 용이한 방식을 제공한다. 본 발명은 키뉴레닌 대사산물의 검출 및 정량에 대해 특이성 및 민감도가 높은 신뢰성있는 면역검정법을 제공한다.
도 1에 도시된 바와 같이, 특정한 경우에, 키뉴레닌 경로의 대사산물은 키뉴레닌 (131), 키뉴렌산 (135), 3-히드록시키뉴레닌 (146), 3-히드록시안트라닐산 (149), 퀴놀린산 (160), 안트라닐산 (140), 및 젠듀레닉산(xanthurenic acid) (148)을 포함한다. 본 발명은 매우 특이적이고 민감한 면역검정법이 또한 제공되도록 이들 대사산물 각각에 대해 특이적인 항체를 제공한다.
표 I 은 본 발명의 특정 관심 대사산물, 상응하는 대사산물 유사체 및 비오틴화 유사체를 도시한다.
Figure pct00008
Figure pct00009
상기에서, L 은 고리에 공유결합으로 부착된, 말단 아미노, 카르복실산, 또는 술피드릴 기를 포함할 수 있다. 특정한 경우에, 말단 아미노, 카르복실산, 또는 술피드릴 기가 도시되고 -L-NH2, 또는 -LC(O)OH 또는 -L-SH 로 나타낸다.
또다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 III 의 화합물을 제공한다:
Figure pct00010
식중, R1, R2, R3, 및 R4 는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고; L 은 링커이고; R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고; B는 생체 분자이다. 화학식 III 의 화합물은 키뉴레닌에 특이적인 항체를 제조하는데 유용하다.
한 양태에서, 화학식 III 의 화합물은 하기 화학식 IIIa 의 구조를 가지고, 상기에서 L 은 말단 SH 를 포함한다:
Figure pct00011
상기에서 특정한 경우에, 티올 기를 사용하여 담체 단백질, 비오틴 또는 기타 생체분자를 연결할 수 있다.
다른 양태에서, 화학식 III 의 화합물은 또한 항체를 제조하기 위해 당업계에 공지된 접합 화학을 이용하여 담체 단백질에 접합되도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 활성화 에스테르 (NHS 에스테르)는 1차 아민과 반응하여 안정한 아미드 결합을 제조할 수 있다. 말레이미드 및 티올은 함께 반응하여 티오에테르를 제조할 수 있다. 할로겐화 알킬은 아민 및 티올과 반응하여 각각 알킬아민 및 티오에테르를 제조한다. 단백질에 접합될 수 있는 반응성 부분을 제공하는 임의의 유도체가 본원에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 유리 아미노 기, 자유 카르복실산 기, 또는 자유 술피드릴 기를 포함하는 부분은 단백질 접합을 위한 유용한 반응성 기를 제공한다. 예를 들어, 유리 아미노 기는, 단백질 상의 이용가능한 카르복시 부분에의 글루타르알데히드 가교 결합 또는 카르보디이미드 가교결합을 통해 단백질에 접합될 수 있다. 또한, 자유 술피드릴 기를 갖는 합텐은 예를 들어 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 이용한 단백질의 말레이미드 활성화에 이어 술피드릴기에의 연결을 통해 단백질에 접합된다.
접합의 예시적 개략도는 하기와 같고, L 은 말단 SH 를 포함한다:
Figure pct00012
포유류로부터 생성된 항체는 본 발명의 접합체를 이용하여 혈청으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 화학식 III 의 화합물은 하기 화학식 IIIa 의 구조를 갖는다:
Figure pct00013
식중, R, R1, R2, R3, 및 R4 는 각각 수소이다.
한 양태에서, 본 발명은 키뉴레닌에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기에서 항체는, 키뉴레닌 (135), 3-히드록시키뉴레닌 (146), 3-히드록시안트라닐산 (149), 퀴놀린산 (160) 및 안트라닐산 (140)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1 % 미만의 교차반응성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 IV 의 화합물을 제공한다:
Figure pct00014
식중, R1, R2, R3, R4 및 R5 는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고; L 은 링커이고; R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고; B는 생체 분자이다. 화학식 IV 의 화합물은 키뉴렌산 (135)에 특이적인 항체를 제조하는데 유용하다.
다른 양태에서, 화학식 IV 의 화합물은 또한 항체를 제조하기 위해 당업계에 공지된 접합 화학을 이용하여 담체 단백질에 접합되도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 활성화 에스테르 (NHS 에스테르)는 1차 아민과 반응하여 안정한 아미드 결합을 제조할 수 있다. 말레이미드 및 티올은 함께 반응하여 티오에테르를 제조할 수 있다. 할로겐화 알킬은 아민 및 티올과 반응하여 각각 알킬아민 및 티오에테르를 제조한다. 단백질에 접합될 수 있는 반응성 부분을 제공하는 임의의 유도체가 본원에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 유리 아미노 기, 자유 카르복실산 기, 또는 자유 술피드릴 기를 포함하는 부분은 단백질 접합을 위한 유용한 반응성 기를 제공한다. 예를 들어, 유리 아미노 기는, 단백질 상의 이용가능한 카르복시 부분에의 글루타르알데히드 가교 결합 또는 카르보디이미드 가교결합을 통해 단백질에 접합될 수 있다. 또한, 자유 술피드릴 기를 갖는 합텐은 예를 들어 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 이용한 단백질의 말레이미드 활성화에 이어 술피드릴기에의 연결을 통해 단백질에 접합된다.
접합의 예시적 개략도는 하기와 같고, L 은 말단 SH 를 포함한다:
Figure pct00015
포유류로부터 생성된 항체는 본 발명의 접합체를 이용하여 혈청으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 화학식 IV 의 화합물은 하기 화학식 IVa 의 구조를 갖는다:
Figure pct00016
식중, R1, R3, R4, 및 R5 는 각각 수소이다.
다른 양태에서, 본 발명은 키뉴렌산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 상기에서 항체는, 키뉴레닌 (131), 3-히드록시키뉴레닌 (146), 3-히드록시안트라닐산 (149), 퀴놀린산 (160) 및 안트라닐산 (140)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1 % 미만의 교차반응성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 V 의 화합물을 제공한다:
Figure pct00017
식중, R1, R2, R3 및 R4 는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이다. 화학식 V 의 화합물은 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK) (146)에 대한 항체를 제조하는데 유용하다.
다른 양태에서, 화학식 V 의 화합물은 또한 항체를 제조하기 위해 당업계에 공지된 접합 화학을 이용하여 담체 단백질에 접합되도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 활성화된 에스테르 (NHS 에스테르)는 1차 아민과 반응하여 안정한 아미드 결합을 제조할 수 있다. 말레이미드 및 티올은 함께 반응하여 티오에테르를 제조할 수 있다. 할로겐화 알킬은 아민 및 티올과 반응하여 각각 알킬아민 및 티오에테르를 제조한다. 단백질에 접합될 수 있는 반응성 부분을 제공하는 임의의 유도체가 본원에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 유리 아미노 기, 자유 카르복실산 기, 또는 자유 술피드릴 기를 포함하는 부분은 단백질 접합을 위한 유용한 반응성 기를 제공한다. 예를 들어, 유리 아미노 기는, 단백질 상의 이용가능한 카르복시 부분에의 글루타르알데히드 가교 결합 또는 카르보디이미드 가교결합을 통해 단백질에 접합될 수 있다. 또한, 자유 술피드릴 기를 갖는 합텐은 예를 들어 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 이용한 단백질의 말레이미드 활성화에 이어 술피드릴기에의 연결을 통해 단백질에 접합된다.
접합의 예시적 개략도는 하기와 같고, L 은 말단 SH 를 포함한다:
Figure pct00018
포유류로부터 생성된 항체는 본 발명의 접합체를 이용하여 혈청으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 화학식 V 의 화합물은 하기 화학식 Va 의 구조를 갖는다:
Figure pct00019
식중, R1, R2, R3, 및 R4 는 각각 수소이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK) 에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기에서 항체는 키뉴레닌 (131), 키뉴렌산 (135), 3-히드록시안트라닐산 (149), 퀴놀린산 (160), 안트라닐산 (140)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1 % 미만의 교차반응성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 VI 의 화합물을 제공한다:
Figure pct00020
식중, R1, R2 및 R3 는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고; L 은 링커이고; R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이다. 화학식 VI 의 화합물은 3-히드록시아트라닐산 (3-HAA) (149)에 대한 항체를 제조하는데 유용하다.
다른 양태에서, 화학식 VI 의 화합물은 또한 항체를 제조하기 위해 당업계에 공지된 접합 화학을 이용하여 담체 단백질에 접합되도록 사용될 수 있다. 활성화 에스테르 (NHS 에스테르)는 1차 아민과 반응하여 안정한 아미드 결합을 제조할 수 있다. 말레이미드 및 티올은 함께 반응하여 티오에테르를 제조할 수 있다. 할로겐화 알킬은 아민 및 티올과 반응하여 각각 알킬아민 및 티오에테르를 제조한다. 단백질에 접합될 수 있는 반응성 부분을 제공하는 임의의 유도체가 본원에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 유리 아미노 기, 자유 카르복실산 기, 또는 자유 술피드릴 기를 포함하는 부분은 단백질 접합을 위한 유용한 반응성 기를 제공한다. 예를 들어, 유리 아미노 기는, 단백질 상의 이용가능한 카르복시 부분에의 글루타르알데히드 가교 결합 또는 카르보디이미드 가교결합을 통해 단백질에 접합될 수 있다. 또한, 자유 술피드릴 기를 갖는 합텐은 예를 들어 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 이용한 단백질의 말레이미드 활성화에 이어 술피드릴기에의 연결을 통해 단백질에 접합된다.
접합의 예시적 개략도는 하기와 같고, L 은 말단 SH 를 포함한다:
Figure pct00021
포유류로부터 생성된 항체는 본 발명의 접합체를 이용하여 혈청으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 화학식 VI 의 화합물은 하기 화학식 VIa 의 구조를 갖는다:
Figure pct00022
식중, R1, 및 R3 는 각각 수소이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 3-히드록시안트라닐산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기에서 항체는 키뉴레닌 (131), 키뉴렌산 (135), 3-히드록시키뉴레닌 (146), 퀴놀린산 (160) 및 안트라닐산 (140)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1 % 미만의 교차반응성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 VII 의 화합물을 제공한다:
Figure pct00023
식중, R1, R2 및 R3 는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; L 은 링커이고; R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고; B 는 생체분자이다. 화합물은 퀴놀린산에 대한 항체를 제조하는데 유용하다.
다른 양태에서, 화학식 VII 의 화합물은 또한 당업계에 공지된 접합 화학을 이용하여 담체 단백질을 접합하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 활성화 에스테르 (NHS 에스테르)는 1차 아민과 반응하여 안정한 아미드 결합을 제조할 수 있다. 말레이미드 및 티올은 함께 반응하여 티오에테르를 제조할 수 있다. 할로겐화 알킬은 각각 아민 및 티올과 반응하여 알킬아민 및 티오에테르를 제조한다. 단백질에 접합될 수 있는 반응성 부분을 제공하는 임의의 유도체가 본원에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 유리 아미노 기, 자유 카르복실산 기, 또는 자유 술피드릴 기를 포함하는 부분은 단백질 접합을 위한 유용한 반응성 기를 제공한다. 예를 들어, 유리 아미노 기는, 단백질 상의 이용가능한 카르복시 부분에의 글루타르알데히드 가교 결합 또는 카르보디이미드 가교결합을 통해 단백질에 접합될 수 있다. 또한, 자유 술피드릴 기를 갖는 합텐은 예를 들어 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 이용한 단백질의 말레이미드 활성화에 이어 술피드릴기에의 연결을 통해 단백질에 접합된다.
접합의 예시적 개략도는 하기와 같고, L 은 말단 SH 를 포함한다:
Figure pct00024
포유류로부터 생성된 항체는 본 발명의 접합체를 이용하여 혈청으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 화학식 VII 의 화합물은 하기 화학식 VIIa 의 구조를 갖는다:
Figure pct00025
식중, R1, 및 R3 는 각각 수소이다.
한 양태에서, 본 발명은 퀴놀린산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기에서 항체는 키뉴레닌, 키뉴렌산, 3-히드록시키뉴레닌, 3-히드록시안트라닐산 및 안트라닐산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1 % 미만의 교차반응성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 VIII 의 화합물을 제공한다:
Figure pct00026
식중, R1, R2, R3 및 R4 는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되고; L 은 링커이고; R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고; B 는 생체분자이다. 화학식 VIII의 화합물은 안트라닐산에 대한 항체를 제조 및 생성하는데 유용하다.
다른 양태에서, 화학식 VIII 의 화합물은 당업계에 공지된 접합 화학을 이용하여 담체 단백질을 접합하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 활성화 에스테르 (NHS 에스테르)는 1차 아민과 반응하여 안정한 아미드 결합을 제조할 수 있다. 말레이미드 및 티올은 함께 반응하여 티오에테르를 제조할 수 있다. 할로겐화 알킬은 아민 및 티올과 반응하여 각각 알킬아민 및 티오에테르를 제조한다. 단백질에 접합될 수 있는 반응성 부분을 제공하는 임의의 유도체가 본원에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 유리 아미노 기, 자유 카르복실산 기, 또는 자유 술피드릴 기를 포함하는 부분은 단백질 접합을 위한 유용한 반응성 기를 제공한다. 예를 들어, 유리 아미노 기는, 단백질 상의 이용가능한 카르복시 부분에의 글루타르알데히드 가교결합 또는 카르보디이미드 가교결합을 통해 단백질에 접합될 수 있다. 또한, 자유 술피드릴 기를 갖는 합텐은 예를 들어 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 이용한 단백질의 말레이미드 활성화에 이어 술피드릴기에의 연결을 통해 단백질에 접합된다.
접합의 예시적 개략도는 하기와 같고, L 은 말단 SH 를 포함한다:
Figure pct00027
포유류로부터 생성된 항체는 본 발명의 접합체를 이용하여 혈청으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 화학식 VII 의 화합물은 하기 화학식 VIIIa 의 구조를 갖는다:
Figure pct00028
식중, R1, R2,및 R3 는 각각 수소이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 안트라닐산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기에서 항체는 키뉴레닌, 키뉴렌산, 3-히드록시키뉴레닌, 3-히드록시안트라닐산 및 퀴놀린산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1 % 미만의 교차반응성을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 임의의 다른 대사산물에 대한 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 도 1의 대사산물 각각에 대한 항체를 제공한다.
다른 특정한 양태에서, 본 발명은 인간과 같은 포유류로부터의 체액 또는 조직 샘플에서 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 (KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산, 안트라닐산 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것에 대한 검정 방법을 제공한다.
방법은 샘플을 본원에 기재된 항체와 조합하는 단계, 및 이어서, 샘플로부터의, 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 (KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산, 안트라닐산 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것에 항체가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법들에서, 샘플로부터의 3-HK에 결합하는 특이적 항체는 샘플에 3-HK가 존재함을 나타낸다.
D. 단쇄 지방산에 대한 검정법
특정한 양태에서, 본 발명은 단쇄 지방산 (SCFA) 에 대한 검정법을 제공한다. 예를 들어, IBS-D 를 앓는 소아 환자의 배설물 SCFA 프로파일은 총 SCFA, 아세테이트 및 프로피온네이트의 농도가 낮고 n-부티레이트의 농도 및 백분율이 높은 것을 특징으로 한다. IBS-D 환자의 결장 세균에 의한 SCFA 생성량의 차이는 위장관 증상의 확산과 관련될 수 있다. 연구는 베이요넬라(Veillonella) 및 락토바실루스(Lactobacillus)의 조합이 아세트산 및 프로피온산을 생성하는 것으로 알려져 있음을 보여주었다. 높은 수준의 아세트산 및 프로피온산은 복부 증상 및 손상된 삶의 질과 연관이 있다. (Treem WR, J Pediatr Gastroentrol Nutr., 1996 Oct; 23(3):280-6; Le Gall et al., J Proteome Res., 2011 Sep 2;10(9):4208-1; 및 Tana C., Neurogastroenterol Motil.,2010 May; 22(5):512-9. 참조).
본 발명은 소인(predisposition)을 결정하거나 IBS의 진단에 도움을 주기 위해 SCFA 수준 및 농도를 측정하기 위한 ELISA 및 CEER 과 같은 면역검정법을 제공한다.
본 발명은 단쇄 지방산에 대한 항체 및 그의 제조 방법을 제공한다. 제조 된 항체는 관련 대사산물에 대해 낮은 교차반응성을 갖고 프로피온산 및 부티른산에 대한 특이적 및 민감성 면역 검정을 위한 유용한 시약이다.
본 발명은 또한, 단쇄 지방산 (SCFA), 예컨대 프로피온산 및 부티르산의 안정한 유도체를 제공한다. 유도체는 담체 단백질과 같은 생체 분자에 접합될 수 있으며 면역 반응을 자극하는 보강제와 조합될 수 있다. 유도체는 또한 기타 생체 분자에 접합될 수 있다.
아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트의 작은 분자 크기로 인해, 면역성 합텐을 제조하기 위해 SCFA 를 접합하는데 링커가 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정한 경우에, 하기의 링커가 사용될 수 있다:
Figure pct00029
식중, R1 은 단쇄 알킬 기 (C2, C3, C4, C5 or C6) 이다.
다른 예에서, 화합물은 하기 화학식 IX 를 갖는다:
Figure pct00030
R2 는 L 또는 R11B 이고; 상기에서 B 는 생체분자이다.
이들 화합물을 이용하여 포유류로부터 생성된 항체는 본 발명의 접합체를 이용하여 혈청으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 상기 접합체는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00031
다른 양태에서, 본 발명은 단쇄 지방산의 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 하기를 포함한다:
(a) 담체 단백질에 접합된 단쇄 지방산의 유도체를 포함하는 면역원을 제공하는 단계;
(b) 동물의 면역계가 항체를 제조하도록 하는 조건 하에서 면역원으로 동물을 면역화하는 단계; 및
(c) 동물에서 항체를 제거하는 단계.
한 양태에서, 본 발명은 프로피온산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기에서 항체는 부티르산에 대해 1 % 미만의 교차반응성을 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명은 부티르산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기에서 항체는 프로피온산에 대해 1 % 미만의 교차반응성을 갖는다.
다른 특정한 양태에서, 본 발명은 인간과 같은 포유류로부터의 체액 또는 조직 샘플에서 단쇄 지방산에 대한 검정 방법을 제공한다. 체액은 혈액, 소변, 혈장, 땀, 침, 흡인물, 눈물, 등과 같은 임의의 생물학적 유체 일 수 있다. 방법은 샘플을 본원에 기재된 항체와 조합하는 단계, 및 이어서, 샘플로부터의 단쇄 지방산에 항체가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법들에서, 샘플로부터의 프로피온산에 결합하는 특이적 항체는 샘플에 프로피온산이 존재함을 나타낸다.
E. 담즙산 흡수 장애를 측정하는 검정법
담즙산 흡수 장애 (BAM)은 만성 설사 및 IBS-D의 전개에 기여할 수있다. 혈청 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온은 담즙산(간) 합성을 결정하기 위한 하나의 테스트였으며, 이는 콜레스테롤로부터의 담즙산 합성에서 콜레스테롤 7-히드록실라제 (속도 제한 효소임)의 활성과 연관이 있다.
본 발명은 또한, 담즙산 대사산물에 대한 항체 및 그의 제조 방법을 제공한다. 제조된 항체는 관련 대사산물에 대해 낮은 교차반응성을 갖고 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온에 대한 특이적 및 민감성 면역검정을 위한 유용한 시약이다.
본 발명은 또한, 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온의 안정한 유도체를 제공한다. 유도체는 담체 단백질과 같은 생체분자에 접합될 수 있으며, 면역 반응을 자극하는 보강제와 조합될 수 있다. 유도체는 또한 기타 생체 분자에 접합될 수 있다.
본 발명은 링커를 가지며 생물학적으로 중요한 작용기를 보유한 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온의 합성을 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 하기 도시된 바와 같은, 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온 유도체 및 그의 비오틴 유사체의 합성을 제공한다:
Figure pct00032
다른 양태에서, 화학식 XI 의 화합물은 당업계에 공지된 접합 화학을 이용하여 담체 단백질을 접합하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 활성화 에스테르 (NHS 에스테르)는 1차 아민과 반응하여 안정한 아미드 결합을 제조할 수 있다. 말레이미드 및 티올은 함께 반응하여 티오에테르를 제조할 수 있다. 할로겐화 알킬은 아민 및 티올과 반응하여 각각 알킬아민 및 티오에테르를 제조한다. 단백질에 접합될 수 있는 반응성 부분을 제공하는 임의의 유도체가 본원에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 유리 아미노 기, 자유 카르복실산 기, 또는 자유 술피드릴 기를 포함하는 부분은 단백질 접합을 위한 유용한 반응성 기를 제공한다. 예를 들어, 유리 아미노 기는, 단백질 상의 이용가능한 카르복시 부분에의 글루타르알데히드 가교결합 또는 카르보디이미드 가교결합을 통해 단백질에 접합될 수 있다. 또한, 자유 술피드릴 기를 갖는 합텐은 예를 들어 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(술포-SMCC)를 이용한 단백질의 말레이미드 활성화에 이어 술피드릴기에의 연결을 통해 단백질에 접합된다.
이와 같이, 한 양태에서, 본 발명은 하기 화학식 X 의 화합물을 제공한다:
Figure pct00033
식중, R, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 및 R10 은 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고; L 은 링커이고; R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고; B 는 생체분자이다.
다른 양태에서, 본 발명은 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온의 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 하기를 포함한다:
(a) 담체 단백질에 접합된 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온의 유도체를 포함하는 면역원을 제공하는 단계;
(b) 동물의 면역계가 항체를 제조하도록 하는 조건 하에서 면역원으로 동물을 면역화하는 단계; 및
(c) 동물에서 항체를 제거하는 단계.
다른 특정한 양태에서, 본 발명은 인간과 같은 포유류로부터의 체액 또는 조직 샘플에서 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온에 대한 검정 방법을 제공한다. 방법은 샘플을 본원에 기재된 항체와 조합하는 단계, 및 이어서, 샘플로부터의 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온에 항체가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 상기 방법들에서, 샘플로부터의 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온에 결합하는 특이적 항체는 샘플에 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온이 존재함을 나타낸다.
포유류로부터 생성된 항체는 본 발명의 접합체를 이용하여 혈청으로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 화학식 Xa 의 화합물은 하기 화학식 Xa 의 구조를 갖는다:
Figure pct00034
식중, R, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, 및 R10 는 각각 수소이다.
다른 양태에서, 본 발명은 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온 유도체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 상기에서 항체는 콜레스테롤 및 7-α-콜레스테롤로 구성된 군으로부터 선택된 것에 대해 1 % 미만의 교차반응성을 갖는다.
F. 항체
일반적으로, 작은 분자 (합텐)에 대한 항체의 생성을 위해, 합텐은 이를 면역성 있게 만들기 위해 담체 단백질 (CP)와 가교된다. 특정한 경우에는, 아민 함유 신경전달물질 및 생체 아민 (즉, 아미노화 합텐)이 글루타릭 알데히드를 통한 1-단계 연결에 의해 적절한 담체 단백질 (CP)에 연결되고, 비-아민 함유 합텐 (예를 들어, 5-HIAA, DOPAC, 멜라토닌 등)이 만니히 축합 반응을 통해 CP 에 접합되었다. 특정한 경우에, 합텐은 면역계에 의해 인식되는 주요 분자 특징부(feature)에서 먼 부위의 스페이서 기(spacer group)에 연결된 목적 주쇄(backbone) 분자 구조로 구성된다. 링커의 다른 단부상의 작용기는 항원성 담체 단백질에 용이하게 공유결합 부착을 형성할 수 있다. 링커 아암은 또한 관심 화합물에 대한 친화성 및 특이성을 최대화하기 위해 최적의 거리에서 담체 단백질로부터 합텐을 분리하는 역할을 한다. 링커의 양 단부에 형성된 화학 결합 및 상기 스페이서 아암(3개 내지 9개 탄소 원자)의 길이는 면역 반응의 친화성 및 특이성 및 수량(항체의 양) 측면에서 품질에 결정적이다 (Meyer et al., 1991 J. Histochem. Cytochem. 39, 749-60: Singh, Suri et al., Bioconjugate Chem., Vol. 15, No. 1, 2004; Ivy Carroll et al., J. Med. Chem., 2011, 54 (14), pp 5221-5228).
III. 항체의 생성
항체의 생성 및 선택은 여러가지 방식으로 달성될 수 있다. 관심 대사산물에 상응하는 합성 및 정제된 항원은, 예를 들어 마우스 또는 토끼 또는 다른 포유류에 주입되어 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생성한다. 당업자는 예를 들어, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow 및 Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)] 에 기재된 바와 같은, 다수의 많은 방법을 항체의 생성에 사용할 수 있음을 인식할 것이다. 당업자는 또한, 항체를 모방하는 (예를 들어, 항체의 기능성 결합 영역을 보유하는) 결합 단편 또는 Fab 단편이 또한 다양한 방법에 의해 유전 정보로부터 제조될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Antibody Engineering: A Practical Approach, Borrebaeck, Ed., Oxford University Press, Oxford (1995); 및 Huse et al., J. Immunol., 149:3914-3920 (1992)] 참조.
이어서, 상기 방법들에 의해 발생된 항체는, 먼저, 정제된 관심 항원(예컨대, 본원에 기재된 비오틴화 항원)으로 친화성 및 특이성에 대해 스크리닝하는 단계, 및 필요할 경우, 그 결과를 결합에서 배제되는 것이 바람직한 기타 항원를 갖는 항체의 친화성 및 특이성에 대해 비교하는 단계에 의해 선택될 수 있다. 스크리닝 과정은 마이크로타이터 플레이트의 별도 웰에 정제 항원의 고정화를 수반할 수 있다. 플레이트는 그 위에 스트렙타비딘이 고정화되게 할 수 있고, 이어서 잠재적 항체 또는 항체군을 포함하는 용액을 각각의 마이크로타이터 웰에 두어 약 30분 내지 2시간 동안 배양한다. 이어서, 마이크로타이터 웰을 세착하고 표지된 이차 항체 (예를 들어, 생성된 항체가 마우스 항체인 경우 알칼리 포스파타제에 접합된 항-마우스 항체)를 웰에 첨가하여 약 30 분 동안 배양한 다음 세척한다. 웰에 기질을 첨가하고, 고정화된 항원, 예컨대 비오틴화 항원에 대한 항체가 존재하는 곳에 발색 반응이 나타난다.
이어서, 상기와 같이 식별된 항체에 대해 친화성 및 특이성을 추가로 분석할 수 있다. 타겟 대사산물에 대한 면역검정법의 개발에서, 정제된 타겟 대사산물은,선택된 항체를 이용한 면역검정법의 민감성 및 특이성을 판단하는 기준으로서 작용한다. 각종 항체의 결합 친화성이 상이할 수 있으므로, 예를 들어, 특정 항체 조합은 서로 방해할 수 있으므로, 항체의 검정 성능이 상기 항체의 절대 친화성 및 특이성보다 더 중요한 척도일 수 있다.
당업자는 항체 또는 결합 단편을 생성하고 각종 관심 대사산물의 친화성 및 특이성을 스크리닝 및 선택하는 데 있어서 다수의 접근법이 취해질 수 있지만, 이들 접근법은 본 발명의 범위를 변경하지 않는다.
A. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 바람직하게는, 본 발명의 항원 및 보강제를 피하 (sc) 또는 복강 내 (ip) 주사함으로써 동물에서 발생된다. 이는, 면역화될 종에서 면역성인 담체 단백질, 예컨대, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 이관능성 또는 유도체화 제제를 이용하여 관심 항원을 접합하는 데 유용할 수 있다. 이관능성 또는 유도체화 제제의 비제한적 예는 말레이미도벤조일, 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 부분을 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 부분을 통한 접합), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2 및 R1N=C=NR (식중, R 및 R1 은 상이한 알킬기임)을 포함한다.
예를 들어, 항원 또는 접합체 100 ㎍ (토끼) 또는 5 ㎍ (마우스) 을 FCA(Freund's complete adjuvant) 3 볼륨(volume) 과 조합하고 다수의 부위에 용액을 피내 주사함으로써, 본 발명의 항원 또는 그의 면역성 접합체 또는 유도체에 대해 동물이 면역을 갖게 된다. 한달 후, 동물은 다수의 부위에서 피하 주사함으로써 FIA (Freund's incomplete adjuvant)에서의 접합체 원래 양의 약 1/5 내지 1/10 으로 부스트된다(boosted). 7 일 내지 14 일후, 동물을 채혈하고 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 동물은 통상적으로 역가 정체기(titer plateaus)까지 부스트된다. 바람직하게는, 동물은 동일한 항원의 접합체로 부스트되지만, 상이한 면역성 항원에 대한 및/또는 상이한 가교 시약을 통한 접합이 사용될 수 있다. 특정한 경우에, 면역 반응을 증대시키기 위해 명반과 같은 응집체가 사용될 수 있다.
B. 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 일반적으로, 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득되며, 즉 그 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 변경유전자(modifier) "모노클로날"은 항체의 특성이 개별 항체의 혼합물이 아닌 것임을 나타낸다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)] 에 기재된 하이브리도마(hybridoma) 방법을 이용하여, 또는 당업계에 공지된 임의의 재조합 DNA 법에 의해(미국특허 제4,816,567호 참조) 제조될 수 있다.
하이브리도마법에서, 면역화를 위해 사용된 관심 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 상술한 바와 같이 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물(예컨대, 햄스터)이 면역화된다. 이와 달리, 림프구는 생체외에서 면역화된다. 이어서, 면역화된 림프구는 적절한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다(예를 들어, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles 및 Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986) 참조). 이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 심고 성장시킨다. 예를 들어, 모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT)가 결여될 경우, 하이브리도마 세포에 대한 배양 배지는 통상적으로, HGPRT-결여 세포의 성장을 억제하는, 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 안정안 높은 수준의 항체 생성을 지원하고, 및/또는 HAT 배지와 같은 배지에 민감성인 것들이다. 인간 모노클로날 항체의 생성을 위한 그러한 바람직한 골수종 세포주의 예는, 이에 제한되지는 않지만, 뮤린(murine) 골수종 세포 라인, 예컨대 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (Salk Institute Cell Distribution Center; San Diego, CA에서 구입가능), SP-2 or X63-Ag8-653 세포 (American Type Culture Collection; Rockville, MD 에서 구입가능), 및 인간 골수종 또는 마우스-인간 헤테로골수종 세포주로부터 유래된 것들을 포함한다 (예를 들어, Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques 및 Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987) 참조).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 관심 폴리펩티드에 대한 것인 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정될 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역 침전에 의해, 또는 생체외 결합 검정, 예컨대 방사선 면역 측정법 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA)에 의해 결정된다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들어, 문헌 [the Scatchard analysis of Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]를 이용하여 결정될 수 있다.
목적하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 식별된 후, 희석 과정을 제한함으로써 클론이 서브클로닝(subcloned)될 수 있고 표준 방법에 의해 성장할 수 있다 (예를 들어, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles 및 Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986) 참조). 상기 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다. 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는, 예를 들어 단백질 A-세파로오스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 종래의 항체 정제 과정에 의해 배양 배지, 복수 액 또는 혈청으로부터 분리될 수 있다.
모노클로날 항체를 코딩하는 DNA 는 종래의 방법 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써)을 이용하여 용이하게 단리 및 서열분석할 수 있다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA 의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA 는 발현 벡터에 배치될 수 있고, 이어서 이는 숙주 세포, 예컨대 대장균(E. coli) 세포, 유인원(simian) COS 세포, CHO (Chinese Hamster Ovary) 세포, 또는 다르게는 항체를 생성하지 않는 골수종 세포 내로 세포감염되어, 재조합 숙주 세포 내의 모노클로날 항체의 합성을 유도한다. 예를 들어, 문헌 [Skerra et al., Curr. Opin. Immunol., 5:256-262 (1993); 및 Pluckthun, Immunol Rev., 130:151-188 (1992)] 참조. DNA 는 또한, 예를 들어, 상동 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환하거나 (예를 들어, 미국특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) 참조), 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변경될 수 있다.
추가 구현예에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)] 에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 연쇄 셔플링(chain shuffling)에 의한 고 친화성 (nM 범위) 인간 모노클로날 항체의 생성은 문헌 [Marks et al., BioTechnology, 10:779-783 (1992)]에 기재되어 있다. 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 조합 감염 (combinatorial infection) 및 생체내 재조합의 사용이 문헌 [Waterhouse et al., Nucl Acids Res 21:2265 (1993)] 에 기재되어 있다. 따라서, 상기 기술들은 모노클로날 항체의 생성을 위한 종래의 모노클로날 항체 하이브리도마 방법에 대한 실용적인 대안이다.
C. 항체 단편
항체 단편을 생성하기 위한 다양한 기술들이 개발되었다. 종래에는, 상기 단편들은 항체의 단백질 분해 소화를 통해 온전한(intact) 항체의 단백질분해 소화(proteolytic digestion)를 통해 유래된다(예를 들어, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Meth., 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al.,Science, 229;81(1985) 참조). 하지만, 상기 단편들은 이제 재조합 숙주 세포를 이용하여 직접 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 이와 달리, Fab'-SH 단편은 대장균(E. coli) 세포로부터 직접 회수될 수 있으며 화학적으로 결합되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (예를 들어, Carter et al., BioTechnology, 10:163-167 (1992) 참조). 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 구현예에서, 선택한 항체는 단쇄 Fv 단편 (scFv)이다. 예를 들어, PCT 공개특허 제WO 93/16185호; 및 미국특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조. 항체 단편은 또한 예를 들어 미국특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 선형 항체일 수 있다. 그러한 선형 항체 단편은 단일특이성(monospecific) 또는 이중특이성(bispecific) 일 수 있다.
D. 이중특이성 항체
이중특이성 항체는 적어도 두 개의 상이한 에피토프(epitope)에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이성 항체는 동일한 관심 폴리펩티드의 2 개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 이중특이성 항체는 관심 폴리펩티드에 대한 결합 부위를 하나 이상의 부가적인 항원에 대한 결합 부위(들)와 조합할 수 있다. 이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, F (ab ')2 이중특이성 항체)으로서 제조될 수 있다.
이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 종래의 전장 이중특이성 항체의 생성은 2 개의 사슬이 상이한 특이성을 갖는, 2 개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 기초한다 (예를 들어, Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983) 참조). 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 하나만이 올바른 이중특이성 구조를 갖는 10 개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성한다. 올바른 분자의 정제는 일반적으로 친화도 크로마토그래피에 의해 수행된다. 유사한 방법이 PCT 공개 제WO 93/08829 호 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10 :3655-3659 (1991)]에 개시된다.
상이한 접근법에 따라, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지(hinge), CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 이용한 것이다. 이는 융합체 중 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체를 코딩하는 DNA, 및 원할 경우 면역글로불린 경쇄가 개별 발현 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 유기체에 공동-세포감염된다. 이는, 구축에 사용된 3 개의 폴리펩티드 사슬의 동일하지 않은 비율이 최적의 수율을 제공하는 경우 구현예에서 3 개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 융통성을 제공한다. 하지만, 동일한 비율의 적어도 2 개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고 수율을 초래하거나, 비율이 특별한 중요하지 않은 경우에는 2 개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열은 하나의 발현 벡터에 삽입하는 것이 가능하다.
상기 접근법의 바람직한 구현예에서, 이중특이성 항체는 한 아암의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 아암의 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공)으로 구성된다. 이중특이성 분자의 절반에만 존재하는 면역글로불린 경쇄가 용이한 단리 방식을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원하지 않는 면역글로불린 사슬 조합에서 목적하는 이중특이성 화합물의 단리를 용이하게 한다. 예를 들어, PCT 공개 제WO 94/04690호 및 문헌 [Suresh et al., Meth. Enzymol., 121:210 (1986)] 참조.
미국특허 제5,731,168호에 기재된 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 들 간의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서는 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상성 "공동(cavities)"은 큰 아미노산 측쇄를 작은 것 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치않는 최종-생성물에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.
이중특이성 항체는 가교결합 또는 "헤테로접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로접합체의 항체 중 하나는 아비딘에 결합될 수 있고, 다른 하나는 비오틴에 결합될 수 있다. 헤테로접합 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제 및 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국특허 제4,676,980호에 개시된다.
항체 단편으로부터 이중특이성 항체를 생성하기 위한 적절한 기술도 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 화학 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 특정한 경우에, 이중특이성 항체는 온전한 항체가 단백질분해 절단되어 F (ab')2 단편을 생성하는 방법에 의해 생성될 수 있다 (예를 들어, Brennan et al., Science, 229:81 (1985) 참조). 이들 단편은 디티올 착화제 아비산 나트륨의 존재하에 감소하여 인접 디티올을 안정화하고 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. 이어서, Fab'-TNB 유도체의 하나는 메르캅토에틸아민으로 환원됨으로써 Fab'-티올로 재전환되고, 동몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이성 항체를 형성한다.
일부 구현예에서, Fab'-SH 단편은 E. coli 로부터 직접 회수되고 화학적으로 결합되어 이중특이성 항체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 완전히 인간화된 이중특이성 항체 F(ab')2 분자는 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)] 에 기재된 방법에 의해 생성될 수 있다. 각각의 Fab' 단편은 E. coli 로부터 별도로 분비되며 생체외 디렉티드 화학 연결(directed chemical coupling)을 수행하여 이중특이성 항체를 생성한다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 이중특이성 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술도 또한 기재되었다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 류신 지퍼(leucine zipper)를 이용하여 생성되었다. 예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)] 참조. 포스 및 준(Fos 및 Jun) 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 두 개의 상이한 항체의 Fab '부분에 연결하였다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생성에 이용할 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디(diabody)" 기술은 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 기전을 제공하였다. 단편은 너무 짧아서 동일 사슬상의 두 도메인 간의 짝지음(pairing)을 허용할 수 없는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 짝짓도록 강요되어, 2 개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일 사슬 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중 특이성 항체 단편을 제조하는 다른 전략이 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]에 기재된다.
2 초과의 원자가를 갖는 항체도 또한 고려된다. 예를 들어, 삼중특이성 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991)] 참조.
E. 항체 정제
재조합 기술을 이용할 경우, 숙주 세포의 주변 세포질 공간의 단리된 숙주 세포 내부에서 생성될 수 있거나 또는 숙주 세포로부터 배지에 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생산되는 경우, 미립자 파편(particulate debris)이 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 먼저 제거된다. 문헌 [Carter et al., BioTech., 10:163-167 (1992)] 에는 E. coli 의 주변 세포질 공간으로 분비되는 항체를 단리하기 위한 방법이 기재된다. 간략하게, 세포 페이스트를 약 30 분 동안 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재하에 해동시킨다. 세포 파편은 원심 분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현계로부터의 상청액은 일반적으로 시판되는 단백질 농축 여과기, 예를 들어, 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘(Amicon or Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 이용하여 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 저해하기 위해 임의의 상기 단계에 포함될 수 있고, 외래 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토 그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종(species) 및 동종형(isotype)에 따라 달라진다. 단백질 A 는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기초로 한 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983) 참조). 단백질 G 는 모든 마우스 동종형 및 인간 γ3 에 대해 추천된다 (예를 들어, Guss et al., EMBO J., 5:1567-1575 (1986) 참조). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 대부분 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 사용될 수 있다. 조절된 공극 유리(pore glass) 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스를 이용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABXTM 수지 (J. T. Baker; Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 회수되는 항체에 따라, 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 컬럼 상에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSETM 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예컨대, 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산 암모늄 침전도 또한 가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들)에 이어, 관심 항체 및 오염 물질을 포함하는 혼합물에, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25 M 염)에서 수행되는, 약 2.5-4.5 사이의 pH의 용리 완충액을 이용한 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피를 실시할 수 있다.
당업자는, 항체와 유사한 기능을 갖는 임의의 결합 분자, 예를 들어 샘플의 관심 분석물 하나 이상에 대해 특이적인 결합 분자 또는 결합 파트너가 또한 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수도 있음을 인식할 것이다. 적절한 항체-유사 분자의 예는, 이에 제한되지는 않지만, 도메인 항체, 유니바디(unibodies), 나노바디(nanobodies), 상어 항원 반응성 단백질, 아비머(avimers), 아드넥틴(adnectins), 안티캄(anticalms), 친화성 리간드, 필로머(phylomers), 압타머(aptamers), 아피바디(affibodies), 트리넥틴(trinectins) 등이 포함된다.
IV. 사용 방법
본 발명은 본원의 대사산물의 존재 또는 농도를 이용하여 대상체에서 IBS 의진단을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 본원에 기재된 검정법으로 환자의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 하나 이상의 대사산물을 측정하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한, 환자의 IBS 치료가 유효한지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 방법은 본원에 기재된 검정법으로 환자의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 하나 이상의 대사산물을 측정하는 것을 포함한다.
다른 특정한 양태에서, 본 발명은 IBS 로 이미 진단된 환자를 평가하는 방법을 제공한다. 방법은 본원에 기재된 검정법으로 환자의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 하나 이상의 대사산물을 측정하는 것을 포함한다.
V. 실시예
청구된 본 발명을 예시하기 위해 하기 실시예들이 제공되지만, 청구된 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
A. 산소에 민감한 세로토닌 (5-HT) 및 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA)
5-HT 및 5-HIAA 는 산소에 민감하며 매우 불안정하다. 상기 화합물의 열화는 해동으로부터 약 7 시간 내에 4 ℃ 에서 일어난다. 도 3 은 박층 크로마토그램 (TLC) 이며, 5-HT 및 5- HIAA의 열화를 도시한다. 5-히드록시인돌의 불안정한 속성은 그들의 농도를 측정하는 검정법에서의 불신을 초래한다. 도 4 는 1 주의 기간 동안 5-HT가 불안정함을 도시한다.
B. 벤족사졸을 생성하기 위한 세로토닌의 유도체화
Figure pct00035
상기 반응물을 0.1　M CAPS 완충액 (pH 11.0), 0.1　M p-(아미노메틸) 벤질 화합물, 산화제 (예를 들어, 0.05 M 칼륨 헥사시아노페레이트 (III) 또는 MnO2), 및 메탄올 (10/11/22/23, v/v/v/v) 을 포함하는 동일 부피의 유도체화 혼합물과 혼합하였다. 유도체화는 약 5 내지 약 30 분 동안 실온(RT) 내지 약 37 ℃ 에서 수행될 수 있다. 이와 같이 생성된 형광 벤족사졸 유도체는 안정하며 TLC 플레이트 상에서 UV 하에 가시화될 수 있다.
다른 양태에서, 하기 조건이 사용될 수 있다: 0.3M CAPS (pH 12), 0.1M p-(아미노메틸)벤질 화합물, 50 mM 칼륨 헥사시아노페레이트(III) 및 메탄올 (1/1/2/2 v/v/v/v). 특정한 양태에서, v/v/v/v 비는 1-10/1-11/2-22/2-23 의 범위이다. 유도체화는 5 내지 약 30 분 동안 실온( RT) 내지 약 37 ℃ 에서 수행될 수 있다.
C. 형광이며 HPLC 에 의해 검출될 수 있는 안정한 벤족사졸 유도체
벤족사졸 유도체는 안정하며 형광이고, TLC 플레이트 상에서 UV 하에 가시화될 수 있다(도 5). 안정한 벤족사졸 유도체는 고 감도 HPLC에 의해 검출될 수 있다. 샘플 제조: 5-30 분 동안 약 20 ℃ (실온) 내지 약 37 ℃ 의 온도에서 50 ㎕ 혈청을 50 ㎕ 유도체화 혼합물로 배양한다. 아세토니트릴(ACN)로 단백질을 제거하고 (1:2 v/v 혈청: ACN); 20 분간 14,000 rpm으로 원심분리, 0.2 ㎛를 통해 여과, 및 50 ㎕ 주사; HPLC 방법: 칼럼: 역상, C18 컬럼: 도 6은 5-HT 분리의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 7 은 5-HIAA의 HPLC를 도시한다.
실시예 2: 5-HT 의 벤족사졸 유도체 및 그의 비오틴화 유도체의 합성
하기 스킴은 I6, I7 및 I8 의 합성을 예시한다:
I6:4-(8-(2-아미노에틸)-6H-옥사졸로[4,5-e]인돌-2-일)-N-(4-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)부틸)벤즈아미드;
I7:N,N'-(디술판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(4-(8-(2-아미노에틸)-6H-옥사졸로[4,5-e]인돌-2-일)벤즈아미드)를 갖는 4-(8-(2-아미노에틸)-6H-옥사졸로[4,5-e]인돌-2-일)-N-(4-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)부틸)벤즈아미드 화합물 (1:1);
I8:4-(8-(2-아미노에틸)-6H-옥사졸로[4,5-e]인돌-2-일)-N-(4-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)부틸)벤즈아미드.
Figure pct00036
단계 1: 0 ℃ 의 MeOH (30 ml) 중 화합물 I-1(2.3 g, 10.8 mmol)에 트리에틸아민 (3.3 ml, 23.4 mmol) 을 첨가한 다음, MeOH 중 Boc2O (3.47 ml, 16.2 mmol) 를 적가하였다. 혼합물을 실온까지 데우고 추가 2 시간 교반한 다음, 실리카겔 크로마토그래피로 농축 및 정제하여 황색 오일의 목적 boc 생성물(I-2)(2.88)을 수득하였다.
단계 2: 화합물 I-2 (2.36g, 8.55 mmol) 및 화합물 I-3 (2.82g, 17.1mmol) 을 하루 동안 DMF ( 30ml) 중 MnO2( 5.98 g, 68.4 mmol) 와 함께 교반하였다. 혼합물을 여과하고 물과 에틸 아세테이트 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고 정제하여 I-4 (510 mg) 을 황색 고체로서 수득하였다. MS: 436.0 (M+H)+.
단계 3: 하루 동안 THF (10 ml) 및 물 (4 ml) 중의 LiOH.H2O (0.98g, 23.4 mmol) 와 함께 I-5 (510 mg, 1.15mmol) 를 교반하고, 포화 NaHSO4 로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축하여 황색 고체 (0.5g)를 수득하였다.
단계 4: 건조 DMF (1.5 ml) 중의 화합물 I-5 (71 mg, 0.17 mmol)에, 화합물 38 (62 mg, 0.2 mmol), TEA (0.04 ml, 0.26 mmol) 및 HATU (103 mg, 0.26 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 3 시간 동안 교반한 다음, 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배하였다. 이어서, 유기 층을 분리 및 농축하였다. DCM/MeOH (90/10) 로 용리되는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 조생성물을 정제하여 목적 생성물 (35 mg)을 수득하고, 이를 4 시간 동안 MeOH (2 ml) 중의 6N HCl로 처리한 다음, 농축하여 목적 화합물 I-6 (30 mg)을 수득하였다. MS: 618.0(M+H)+, 4-(8-(2-아미노에틸)-6H-옥사졸로[4,5-e]인돌-2-일)-N-(4-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)부틸)벤즈아미드.
단계 5: 건조 DMF (2 ml) 중의 화합물 I-5 (100 mg, 0.23 mmol)에, 화합물 32 (53 mg, 0.16 mmol), TEA (0.11 ml, 0.8 mmol) 및 HATU (180 mg, 0.48 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 밤새 교반한 다음, 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배하였다. 이어서, 유기 층을 분리 및 농축하였다. DCM/에틸 아세테이트 (10/1) 로 용리되는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 조생성물을 정제하여 목적 생성물 (30 mg)을 수득하고, 이를 밤새 디옥산 (2 ml) 중의 4N HCl로 처리한 다음, 농축하여 목적 화합물 I-7 (12.4 mg)을 수득하였다. MS: 872.2(M+H)+, N,N'-(디술판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(4-(8-(2-아미노에틸)-6H-옥사졸로[4,5-e]인돌-2-일)벤즈아미드)을 갖는 4-(8-(2-아미노에틸)-6H-옥사졸로[4,5-e]인돌-2-일)-N-(4-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)부틸)벤즈아미드 화합물 (1:1).
단계 6: 밤새 디옥산 (2 ml) 및 DCM ( 2ml) 중의 4N HCl과 함께 I-5 (50 mg, 0.12 mmol)을 교반한 다음, 농축하여 목적 생성물 I-8 (26 mg)을 수득하였다. MS: 322.0 (M+H)+, 4-(8-(2-아미노에틸)-6H-옥사졸로[4,5-e]인돌-2-일)-N-(4-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)부틸)벤즈아미드.
실시예 3: 링커를 갖고 비오틴화된 키뉴렌산의 합성
화합물 24: 6-(6-아미노헥산아미도)-4-히드록시퀴놀린-2-카르복실산
Figure pct00037
단계 1: DCM (5ml) 및 아세토니트릴 (5 ml) 중에서 30 분간 boc-아미노-헥산산 (21, 277 mg, 1.2 mmol), DIPEA(0.21 ml, 1.2 mmol) 및 HATU (456 mg, 1.2 mmmol) 의 혼합물을 교반하였다.
단계 2: 물 (5 ml) 및 아세토니트릴 (5 ml)의 혼합물 중의 화합물 22 (218 mg, 1mmol)에 NaHCO3 (840 mg, 10 mmol)을 첨가한 다음, 격렬하게 교반하면서 단계 1로부터의 반응 혼합물을 천천히 첨가하였다. 그 후에 혼합물을 추가 4 시간 동안 교반한 다음, 포화 NaHSO4 로 산성화하여, 침전을 수득하였다. 고체를 여과하여 중간체 23을 생성되게 하였다.
단계 3: 단계 2 로부터의 고체 23 을 4 시간 동안 60 ℃ 에서 MeOH (10 ml) 중의 LiOH.H2O(410 mg, 10 mmol)로 교반한 다음, 포화 NaHSO4 용액으로 pH 3 까지 산성화하고, 농축하였다. 수득된 고체를 여과하고, 물로 세척하여, 건조시켰다. 이어서, 이를 DCM (2 ml) 에 현탁한 다음, TFA (2 ml) 를 첨가하였다. 4 시간 동안 실온에서 슬러리를 교반한 다음 농축하였다. 수득된 고체를 5 분간 에틸 아세테이트 (30 ml) 로 교반하고, 불용성물을 여과하고 에틸 아세테이트로 세척하고 건조시켜 목적 생성물 24 (120mg) 를 회색 고체로서 수득하였다. MS: 318.0 (M+H)+ 6-(6-아미노헥산아미도)-4-히드록시퀴놀린-2-카르복실산.
화합물 27의 합성: 4-히드록시-6-(6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)헥산아미도)헥산아미도)퀴놀린-2-카르복실산.
Figure pct00038
화합물 25 (327mg, 1.5 mmol) 및 LiOH.H2O (430 mg, 10 mmol)의 혼합물을 MeOH (10 ml) 중에서 밤새 교반한 다음, 6N HCl 로 pH 7 까지 조심스럽게 산성화하고, 농축하여 MeOH 를 제거하였다. 이어서, 아세토니트릴 및 물 (10ml/10ml) 로 조생성물을 희석하고, NaHCO3 (1.26g) 를 첨가한 다음, 비오틴-LC-LC-NHS (852mg, 1.5 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 1일 동안 격렬하게 교반하고, 6N HCl 로 산성화하고, 수득된 고체를 여과하고, MeOH 에 이어 물로 세척한 다음, 건조시켜 순수 화합물 27 (140mg) 을 제조하였다. MS: 657.2(M+H)+, 4-히드록시-6-(6-(6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)헥산아미도)헥산아미도)퀴놀린-2-카르복실산.
실시예 4: 링커를 갖고 비오틴화된 퀴놀린산의 합성
Py-6: 5-(1-((2-아미노에틸)티오)에틸)피리딘-2,3-디카르복실산; 및 Py7: 5-(1-((2-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)에틸)티오)에틸)피리딘-2,3-디카르복실산의 합성
Figure pct00039
단계 1: MeOH (100ml) 중 py-1 (5.0g, 25.6mmol)에 AcCl (20ml, 230 mmol) 을 30 분에 걸쳐 조심스럽게 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 밤새 환류시킨 다음, 농축시키고 MeOH (100ml)에 재용해시키고 AcCl (20ml)을 첨가하였다. 혼합물을 1일 동안 다시 환류시키고 농축하여 물과 에틸 아세테이트 사이에 분배하였다. 유기 층을 포화 NaHCO3로 세척하고, 건조시키고, 농축하여 디메틸 에스테르 py-2 (3.1g)를 수득하였다.
단계 2: 8 시간 동안 AIBN (100mg) 의 존재하에 NBS (2.4g, 13.5 mmol) 로 CCl4 (50 ml) 중에서 py-2 (3g, 13.4mmol)를 환류시켰다. 고체를 여과하고 용액을 농축하여 황색 오일 (py-3)을 수득하였다. MS: 301.9 (M+H)+. 추가 정제하지 않고 다음 단계에 물질을 사용하였다.
단계 3: 트리에틸아민 (2.1ml, 15mmol) 및 DBU (2.28g , 15mmol) 을 첨가하면서 상기 DCM (30 ml) 중 오일에 BocNHCH2CH2SH (2.74g, 15mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하고 물과 에틸 아세테이트 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고 헥산 및 에틸 아세테이트의 혼합 용매로 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 목적 화합물 py-4 (2.9g)을 수득하였다. MS: 399.0 (M+H)+.
단계 4: 1일 동안 MeOH (20 ml) 중 LiOH.H2O (2.22g, 10 eq.) 과 함께 py-4 (2.1g, 5.3mmol)의 혼합물을 교반하고, 포화 NaHSO4 로 pH 3 까지 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 분리하고 농축하여 목적 생성물 (py-5, 1.7g)을 수득하였다. MS: 371.1 (M+H)+.
단계 5: 2 시간 동안 디옥산 (4N, 10ml) 중의 HCl 과 함께 py-5 (0.5 g, 1.35 mmol)을 교반하고, 농축하여 py-6 로서 오일(HCl 염)을 형성하였다. MS: 271.0 (M+H)+, 5-(1-((2-아미노에틸)티오)에틸)피리딘-2,3-디카르복실산.
단계 6: MeOH (3 ml) 중의 HCl 염 형태 (200mg, 0.88mmol)의 py-6 에 DIPEA (1 ml, 5.5mmol)를 첨가한 다음, 비오틴-NHS (341mg, 1.0 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 12 시간 동안 실온에서 교반한 다음, 농축하고 HPLC로 정제하여 목적 생성물 py-7 (85mg)을 수득하였다. MS: 497.1(M+H)+ , 5-(1-((2-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)에틸)티오)에틸)피리딘-2,3-디카르복실산.
실시예 5: 링커를 갖는 안트라닐산 및 비오틴화 유도체의 합성
화합물 30: 2-아미노-4-((4-아미노부틸)카르바모일)벤조산; 및
화합물 31: 2-아미노-4-((4-(5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)부틸)카르바모일)벤조산의 합성
Figure pct00040
단계 1: Boc-4-아미노부틸아민 (564 mg, 3 mmol), 화합물 28 (675 mg, 3 mmol), DIPEA (0.8ml, 4.5 mmol), 건조 DMF (12 ml) 중 HATU (1.52g, 4 mmol)의 혼합물을 12 시간 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 분리하고, 포화 NaHSO4 및 6 N NaOH 로 세척한 다음, 농축하여 화합물 29를 오일로서 수득하였다.
단계 2: 2일간 THF (20ml) 및 물 (0.5 ml)의 혼합물에서 LiOH.H2O (1.4g, 30 mmol)과 함께 오일을 교반하고, 포화 NaHSO4 로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 농축하여, 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다.
단계 3: 단계 2로부터의 물질을 에탄올 (30ml)에 용해시키고, Pd/C (200 mg) 및 NH4HCO3 (3.78g, 60 mmol) 를 첨가하였다. 3 시간 동안 환류 하에 슬러리를 교반한 다음, 여과하고 농축하여 고체를 수득하였다. 부생성물을 DCM/MeOH 로부터 추가로 침전시키고 여과제거하고, 모액을 농축하여 황색 고체를 수득하였다.
단계 4: 단계 3으로부터의 황색 고체를 2 시간 동안 DCM (10 ml) 중의 50% TFA 과 함께 교반하였다. 이를 농축하고 HPLC로 정제하여 목적 생성물 30 (500mg)을 황색 분말로서 수득하였다. MS: 252.0 (M+H)+, 2-아미노-4-((4-아미노부틸)카르바모일)벤조산.
단계 5: 물 (4 ml) 중 50% 아세토니트릴 중의 화합물 30 (250mg, 0.68 mmol)에 NaHCO3 (172mg, 1.5 eq) 를 첨가한 다음, 비오틴-NHS (232mg, 0.68 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 4N HCl로 산성화하고, 농축하고 HPLC로 정제하여 목적 생성물 31 (158 mg)을 수득하였다. 2-아미노-4-((4-(5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)부틸)카르바모일)벤조산.
실시예 6: 키뉴레닌 비오틴화 유도체의 합성
K4: N-(4-(2-아미노-4-(2-아미노페닐)-4-옥소부탄아미도)부틸)-5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미드의 합성
Figure pct00041
단계 1: 아세토니트릴 및 물의 혼합물(10ml/20ml) 중의 DL-키뉴레닌 (K-1, 1.0 g, 4.8 mmol)에 디-t-부틸디카르보네이트 (2.18g, 10mmol)를 첨가한 다음, 중탄산 나트륨 (1.2 g, 20 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 1 일 동안 슬러리를 교반한 다음, 포화 NaHSO4 용액으로 pH 3까지 산성화하였다. 에틸 아세테이트로 조 생성물을 추출하고 헥산 및 에틸 아세테이트를 이용한 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 (1.5g)을 수득하였다.
단계 2: K-1 (330 mg, 1.3 mmol), DMF (2ml) 중 화합물 32 (219mg, 0.65 mmol), HATU (760mg, 2 mmol) 및 TEA (0.278ml, 2.0 mmol)의 혼합물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하고, 헥산 및 에틸 아세테이트를 이용한 크로마토그래피로 정제하여 220 mg의 목적 생성물을 수득하였다.
단계 3: 단계 2로부터의 물질을 2 시간 동안 디옥산 (10 ml) 중 4N HCl로 교반한 다음, 농축하고 HPLC로 정제하여 목적 생성물 K-3 를 HCl 염 (118mg)으로서 수득하였다. MS: 645.1 (M+H)+.
단계 4: K-1 (650mg, 1.6 mmol), DMF (5 ml) 중 화합물 38 (500 mg, 1.6 mmol), HATU (1.14 g, 3 mmol) 및 TEA (0.418 ml, 3.0 mmol)의 혼합물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24 시간 동안 교반하고, 에틸 아세테이트로 추출한 다음, 물로 세척하여 조생성물로서 오일 760 mg을 수득하였다.
단계 5: 단계 4 로부터의 물질을 8 시간 동안 DCM (10 ml) 중 50% TFA 로 교반한 다음, 농축하고 HPLC 로 정제하여 목적 생성물 K-4 를 TFA 염 (200 mg)으로서 수득하였다. MS:505.1 (M+H)+, N-(4-(2-아미노-4-(2-아미노페닐)-4-옥소부탄아미도)부틸)-5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미드.
실시예 7: 링커를 갖는 3-히드록시안트라닐산의 합성
P026: 2-아미노-5-(N-(4-아미노부틸)-2,2,2-트리플루오로아세트아미도)-3-히드록시벤조산; 화합물 P027: 2-아미노-3-히드록시-5-(2,2,2-트리플루오로-N-(4-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)부틸)아세트아미도)벤조산의 합성
Figure pct00042
단계 1: 건조 DMF (16 ml) 중 Z-1 (1.45g, 7.2 mmol)에 벤질 브로마이드 (1.9 ml, 15.9 mmol) 및 K2CO3(2.51 g, 18.1 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 4 시간 동안 60 ℃에서 교반하였다. 이어서, 조생성물을 에틸 아세테이트 및 물로 희석하였다. 유기 층을 분리하고 브라인(brine)으로 세척하고, 농축하고, 헥산/에틸 아세테이트로 용리되는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, Z-2 (2.2g)을 수득하였다.
단계 2: Z-2 (1.5g, 4 mmol) 및 BocNH-(CH2)4NH2 (0.9 g, 4.8 mmol) 및 트리에틸아민 (1.3 ml, 9.6 mmol)의 혼합물을 1 일 간 아세토니트릴 (20 ml) 중에서 100 ℃로 가열하였다. 조생성물을 농축하고 헥산/에틸 아세테이트로 용리되는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 1.0 g 의 대체 생성물을 수득하였다. MS :450.1 (M-Boc+H)+.
단계 3: DCM (10ml) 중의 상기 생성물(1g, 1.8 mmol)에 트리에틸아민 (1.0ml , 4 eq) 및 트리플루오로아세트산 무수물 (0.5 ml, 3.6 mmol) 을 첨가하였다. 혼합물을 30 분간 실온에서 교반하였다. 조생성물을 농축하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 생성물 Z-3 (1.2 g)을 수득하였다.
단계 4: 에탄올 (10ml) 중 Z-3 (1.17g, 1.8 mmol)에, Pd/C (380mg) 및 암모늄 포르메이트 (0.7g, 11 mmol) 를 첨가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 환류시킨 다음 여과하여 촉매를 제거하였다. 이어서, 용액을 농축하고 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적 중간체 (480mg)를 수득하였다. MS : 436.0 (M+H)+.
단계 5: 상기 중간체를 1 시간 동안 디옥산 (3 ml) 중의 4 N HCl 에서 교반하였다. 형성된 고체를 여과하고 에테르로 세척하고, 건조시켜 CRN-P026 (260mg)을 수득하였다. MS: 336.0 (M+H)+, 2-아미노-5-(N-(4-아미노부틸)-2,2,2-트리플루오로아세트아미도)-3-히드록시벤조산
단계 6: DMF (5ml) 중 CRN-P026 (130 mg, 0.35 mmol)에, 트리에틸아민 (0.19 ml, 1.4 mmol) 및 비오틴-NHS (120 mg)를 첨가하였다. 혼합물을 1 일 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 조생성물을 LC 로 정제하여 CRN-P027 (150mg)을 수득하였다. MS: 562.0 (M+H)+, 2-아미노-3-히드록시-5-(2,2,2-트리플루오로-N-(4-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)부틸)아세트아미도)벤조산
실시예 8: 링커를 갖는 단쇄 지방산의 합성
P002 : 6,6'-디이소술판디일비스(헥산-1-올)의 합성
1) 디술피드 유사체
Figure pct00043
에틸 아세테이트 (100 ml) 중 화합물 1 (5 g, 37 mmol) 에 8 입자의 I2를 첨가한 다음, I2의 적색이 지속적일 때까지 과산화수소 (31%)를 천천히 첨가하였다. 이어서, 용액을 포화 Na2S2O3 으로 세척하고, 건조시키고 농축하여 실온에 두었을시 천천히 고화하는 황색 오일을 수득하였다 (4.4 g). TLC 는 생성물이 출발 물질보다 덜 극성이며 약간 UV 양성임을 나타냈다.
2) 에스테르 형성
Figure pct00044
DCM (5 ml) 중 화합물 2 (470 mg, 1,77 mmol)에 프로피오닐 클로라이드 (0.337 ml, 2.4 eq)를 첨가한 다음, 트리에틸아민 (0.511 ml, 2.4 eq) 및 10mg 의 DMAP를 첨가하였다. 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 교반하고, 농축하였다. 이어서, 조생성물을 에틸 아세테이트/헥산 (1/9)으로 용리되는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 직접 정제하여 목적 생성물 3a (620mg)를 수득하였다. NMR 은 구조와 일치하였다.
DCM ( 5 ml) 중 화합물 2 (266mg, 1 mmol)에 10 mg 의 DMAP에 이어 트리에틸아민 (0.278ml, 2 mmol)을 첨가한 다음, n-부티르산 무수물 (0.326ml, 2 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 교반한 다음 더 많은 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기 층을 포화 NaHCO3, NaHSO4 로 세척하고, 건조하고 농축하여 목적 생성물 3b (380mg)을 수득하였다. NMR: 일치
P006: (N-(6-(4-(2-아세트아미도에틸)피페라진-1-일)-6-옥소헥실)-6-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)헥산아미드;
P007: N-(6-(4-(2-포름아미도에틸)피페라진-1-일)-6-옥소헥실)-6-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미도)헥산아미드 의 합성
Figure pct00045
DCM (3 ml) 중 화합물 4 (183mg , 0.8 mmol)에 DIPEA (0.278 ml, 2 eq) 및 이어서 프로피오닐 클로라이드 (130mg, 1 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 1 시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 농축하고 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배하고, 에틸 아세테이트 층을 분리하고 건조하고, 농축한 다음, 디옥산 (4N, 2 ml) 중 HCl을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하고, 농축하여 조생성물 5a를 수득하였다. 이어서, 건조 DMF (5 ml)로 희석한 다음, DIPEA (0.278ml, 1.6 mmol) 및 이어서 비오틴-LC-LC-NHS (454mg, 0.8mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 12 시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 농축한 다음 HPLC 로 정제하여 목적 생성물 6a (390 mg)를 수득하였다. NMR: 일치
n-부티르산 무수물을 사용한 것을 제외하고는 6b 의 제조에서와 동일한 방법을 이용하여 목적 생성물 6a (390 mg)을 수득하였다. NMR: 일치
실시예 9: 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온 유도체(Cho-D)의 합성
P022: (D5) (4R)-4-((7R,10R,13R)-7-히드록시-10,13-디메틸-3-옥소-2,3,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-시클로펜타[a]페난트렌-17-일)-N-(4-(5-(2-옥소헥사히드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-yl)펜탄아미도)부틸)펜탄아미드 의 합성
Figure pct00046
단계 1: MeOH ( 90ml) 중 화합물 D1( 9.0 g, 23.0 mmol)에 H2SO4 (3.0 ml)를 첨가하였다. 수득된 반응 혼합물을 4 시간 동안 95 ℃에서 환류시켰다. 반응액을 농축하고, EtOAc 에 용해시키고 포화 NaHCO3 용액으로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 로 건조시키고, 여과하고 농축하여 목적 메틸 에스테르 생성물 (9.2 g)을 수득하였다. 이 물질 (6.0 g, 14.8 mmol) 을 이후에 톨루엔 (180 ml) 및 아세톤 (78 mL) 중의 Al(Ot-Bu)3 (7.3 g, 29.7 mmol)와 조합하였다. 수득된 혼합물을 17 시간 동안 95-100 ℃에서 환류시켰다. 반응 혼합물을 2.0 M H2SO4 (100 mL)로 처리하고, 물 및 포화 NaHCO3 용액으로 세척하였다. 유기 층을 MgSO4 로 건조시키고, 여과 및 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 컬럼으로 정제하여 화합물 D2 (3.0 g)를 수득하였다.
단계 2: 화합물 D2 (2.5 g, 6.2 mmol)을 KOH ( 50 mL MeOH 중 5.6 g) 와 조합하고 수득된 혼합물을 17 시간 동안 주위 온도에서 교반되게 하였다. 반응 혼합물을 pH ~3 까지 2.0 HCl 로 처리하고, 이후에 이를 EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 브라인으로 세척하고, 건조 및 농축하였다. 수득된 잔류물을 실리카겔 컬럼으로 정제하여 목적 생성물 D3 를 황색 오일로서 수득하였다 (2.16 g).
단계 3: HIO3 (3.52 g) 를 DMSO (20 mL)와 조합하고 수득된 혼합물을 어둠에서 1 시간 동안 80 ℃로 가열하였다. DMSO (5.6 mL) 및 시클로헥센 (1.44 mL) 중 화합물 D3 (2.16 g, 5.56 mmol)의 혼합물에 사전 제조된 HIO3 용액을 첨가하였고 수득된 혼합물을 어둠에서 17 시간 동안 45 ℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 50 mL 물에 용해시키고 EtOAc로 추출하였다. 유기 층을 건조, 여과 및 농축하였다. 수득된 잔류물을 실리카겔 컬럼으로 정제하여, 분리불가능한 부생성물 D4-1 (0.58 g)이 포함되는 목적 생성물 D4 를 수득하였다.
단계 4: D4 및 D4-1 (0.64 mmol, 250 ㎎), HATU (0.64 mmol, 243 ㎎) 및 화합물 38 을 DMF (5 ㎖)과 조합하였다. 트리에틸아민 (0.71 mmol, 0.097 ㎖)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 2 시간 동안 주위 온도에서 교반되게 하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액에 용해시키고, EtOAc로 추출하고, MgSO4로 건조시키고, 여과 및 농축하였다. 이어서 잔류물을 실리카 겔 컬럼으로 정제하여 분리불가능한 부생성물 D5-1을 포함하는 목적 생성물 D5 를 수득하였다 (95 ㎎, 1H NMR에 의해 결정된 비율은 82:18). MS: 685.4 (M+H)+.
단계 5: D4 및 D4-1 (0.73 mmol, 284 ㎎), HATU (0.73 mmol, 277 ㎎) 및 화합물 32의 혼합물을 DMF (5 ㎖)과 합쳤다. 트리에틸아민 (1.46 mmol, 0.25 ㎖)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 1 시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 용해시키고, EtOAc로 추출하고, MgSO4 로 건조시키고, 여과 및 농축하였다. 이후에 잔류물을 실리카 겔 컬럼으로 정제하여, 분리불가능한 부생성물 D6-1 (165 ㎎, 1H NMR에 의해 결정된 비율 80:20) 을 수반하는 목적 생성물 D6 을 수득하였다. MS : 503.2 (M + H) +.
실시예 10: 경로 대사산물에 대한 ELISA 검정법
이 실시예는 본원에 제공된 대사산물, 예컨대, 트립토판, 세로토닌, 키뉴레닌, 담즙산 대사 및 단쇄 지방산 경로에서의 대사산물에 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 기재한다. 이 실시예는 또한 이들 항체들이 검정법, 예컨대 샘플, 예를 들어 환자 혈청에서 대사산물을 검출하기 위한 면역-기반 검정법에 사용될 수 있음을 도시한다.
면역 접합체 (예를 들어, 항원)로서 작용하는, 합성으로 제조된 대사산물 유사체(합텐)에 발생된(raised) 새로운 항체를 기반으로 하는 경쟁적 ELISA가 여기서 제공된다. 유사체는 작은 분자를 투사하고 합텐에 특이적인 면역 반응을 유도하기 위한 링커를 갖도록 특이적으로 설계되었다. 도 8은 환자 혈청에서 경로 대사산물을 검출하기 위해 사용되었던 경쟁적 ELISA의 예시적인 구현예를 제공한다. 검정 플레이트는 스트렙타비딘 플레이트를 관심 비오틴화 합텐(예를 들어, 비오틴화 Ser-D)으로 코팅함으로써 제조된다. 대사산물, 예컨대 세로토닌 및 그의 유도체를 안정화시키기 위해 환자 샘플을 유도체화 혼합물로 유도체화하였다. 이어서, 유도체화 환자 혈청을 관심 대사산물(합텐)에 대한 항체(예를 들어, 항-Ser-D 항체)와 혼합한 다음, 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 수회 세척하였다. 2차 항체, 예컨대 염소 항-토끼 항체-HRP 접합체를 첨가하고 플레이트를 1 시간 동안 실온에서 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 수회 세척하였다. 발색 반응을 위해 기질 용액을 첨가하였다. 기질 반응을 중단하기 위해 정지 용액을 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 405 nm의 분광 광도계로 판독하였다.
상기 기재된 실시예에 기재된 합텐을 기초로 면역성 접합체를 제조하였다. 간략하게, 경로 대사산물 또는 그의 유도체는 링커 아암과 접합되었다. 링커 아암의 자유 단부는 아민 또는 티올 활성화를 통해 담체 단백질에 연결되었다. 이어서, 생성된 합텐은 경로 대사산물 또는 그의 유도체에 대한 항체의 생성을 위해 항원으로 사용되었다. 폴리클로날 항체는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)]에 기재된 표준 방법에 따라 발생되었다.
비오틴화 합텐은 또한 각 경로 대사산물 또는 그의 유도체에 대해 생성되었다. 링커 아암을 담체 단백질에 접합하는 대신, 링커를 비오틴에 접합하였다. 예를 들어, 세로토닌의 비오틴화 벤족사졸 유도체는 유도체의 페닐 단부에 링커 아암을 함유하고 링커의 다른 단부에 비오틴을 함유하도록 화학적으로 합성되었다.
생성된 항체의 유효성 및 특이성을 테스트하기 위해 하기 검정법을 사용하였다. 관심 비오틴화 합텐 (2 ㎍/㎖)을 실온에서 1 시간 동안 스트렙타비딘 플레이트 상에 코팅하였다. 플레이트를 세척하고 블로킹 완충액(예를 들어, 수퍼 블록 버퍼)으로 블로킹하여 비-특이적 결합을 최소화하였다. 토끼 항혈청을 연속적으로 희석하고 (1:100, 1:125, 1:250, 1:500, 1:1000) 플레이트의 개별 웰로 옮겼다. 궤도 진탕(orbital shaking)으로 플레이트를 약 1 시간 동안 실온(RT)에서 배양하였다. 세척 완충액 (예를 들어, PBST)으로 플레이트를 수회 세척하였다. 염소 항-토끼 항체-겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP) 접합체를 희석하고(1 : 5000), 각 웰에 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세청 완충액(예를 들어, PBST)에서 여러 번 세척 하여 과량의 HRP 접합체를 제거하였다. 컬러 기질을 첨가하고 HRP-촉매 반응을 위해 실온에서 플레이트를 배양하여 검출가능한 색(예를 들어, 어둠에서 15분)을 발생시켰다. 발색 후, 정지 용액(예를 들어, 4N의 NaOH)을 첨가하여 기질 반응을 중단시켰다. 플레이트를 405 nm에서 판독하였다. 흡광도는 샘플 중의 항체의 양에 직접 비례하였다.
I. 세로토닌의 벤족사졸 유도체(Ser-D)에 대한 항체
유도체로 면역화된 토끼에서 세로토닌의 벤족사졸 유도체 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 Ser-D)에 대한 항체를 성공적으로 배양하였다. 블리드 1-5 (B1, B2, B3, B4 및 B5)에서 토끼 A 및 토끼 B로부터의 항혈청에서 벤족사졸 유도체에 대한 항체가 검출되었다. 도 9 참조. 토끼 A 및 B에서 발생된 항체의 Ser-D 에 대한 친화도를 평가하기 위해 적정 실험을 수행하였다 (도 10).
도 11b 에 도해된 직접 검정법을 이용하여 항혈청의 교차반응성을 테스트하였다. 간략하게, 인간 혈청의 세로토닌 (5-HT) 또는 그의 경로 대사산물 (예를 들어, 5-OH Tryp 또는 5-HIAA) 을 유도체화하였고 4 ℃에서 밤새 멀티-웰 플레이트 상에 코팅하였다. 세척 완충액으로 플레이트를 수회 세척하였다. Ser-D 항원에 대해 발생하는 항혈청을 1 시간 동안 실온에서 플레이트상에 배양하였다. 플레이틀르 세척 완충액으로 수회 세척하였다. 염소 항-토끼 항체-HRP 접합체 용액을 플레이트에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 수회 세척하였다. 비색 반응을 위해 컬러 기질을 첨가하였고, 405 nm에서 플레이트를 판독하기 전에 정지 용액을 첨가하였다. 항혈청은 5-HT (도 11a)에 특이적이었으며 구조적으로 유사한 화합물, 예컨대 5-히드록시트립토판 (5-OH Tryp;도 11c) 및 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA, 도 11d)에 교차반응성을 나타내지 않았다.
또한, 항혈청의 교차반응성은 도 12b에 도해된 바와 같은 경쟁적 검정법을 이용하여 테스트하였다. 스트렙타비딘 플레이트 상에 비오틴화 항원(예를 들어, 비오틴화 Ser-D)을 코팅하였다. 인간 혈청 중의 세로토닌 (5-HT) 또는 그의 경로 대사산물 (예를 들어, Tryp, 5-OH Tryp 또는 5-HIAA) 을 유도체화하였고 항혈청에 첨가하였다. 혼합물을 플레이트에 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 완충액으로 플레이트를 수회 세척하였다. 염소 항-토끼 항체-HRP 접합체 용액을 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 수회 세척하였따. 비색 반응을 위해 컬러 기질을 참가하였고, 405 nm에서 플레이트를 판독하기 전에 정지 용액을 첨가하였다. 인간 혈청에서 Ser-D의 존재는 항-Ser-D 항체가 비오틴화 Ser-D에 결합하는 것을 억제하였다(도 12a). 자유 Ser-D 의 양이 증가함에 따라 더 적은 항체가 검출되었다. 대조적으로, 트립토판 (도 12c), 5-히드록시트립토판 (도 12d), 및 5-히드록시인돌 아세트산 (도 12e) 유도체가 존재할 경우 비오틴화 Ser-D에 결합된 항체의 양은 전혀 변화가 없거나 약간의 변화만 있었다.
II. 세로토닌 ELISAs
혈청 중 세로토닌의 수준이 IBS-D 환자 대 정상 대조군에서 상이한지를 결정하기 위해 상술한 경쟁적 ELISA에 항-세로토닌 항체를 사용하였다. 연구된 IBS-D 환자의 평균 세로토닌 양은 정상 대조군에서 23±10 nM 인 것에 비해 50±20 nM 이었다(도 13). 사분위 분석은 또한 3 분위 및 4 분위의 환자가 정상 대조군에 비해 높은 수준을 가짐을 나타내어, 이들 환자들이 세로토닌 기능장애를 나타냄을 보여준다.
세로토닌 검정법이 여러 날에 실행된 경우, 방법은 안정성 및 재현성을 나타냈다. 표준 곡선의 비교는 실험 일에 걸쳐 값에 거의 차이가 없음을 도시하였다. 도 14 는 4 일동안 생성된 상이한 표준 곡선을 도시한다. 실험에서 세로토닌의 검출 상한은 약 1mM 또는 0.213 mg/㎖ 였고 검출 하한은 약 1e-10 mM (21.3 ng/㎖) 였다. 본원에 제공된 세로토닌 ELISA 는 50~220 ng/㎖의 범위를 갖는 HPLC (ARUP 실험실)와 같은 다른 방법에 비해 더 넓은 검출 범위를 가졌다.
다른 질환 상태에서 세로토닌 기능장애를 검출하기 위해 세로토닌 ELISA 가 사용되었다. 특히, 유암종, 알츠하이머 질환 또는 자폐증 환자로부터의 샘플을 테스트하였다. 정상 대조군에 비해, 유암종 환자는 더 높은 수준의 세로토닌을 갖는 반면, 알츠하이머 질환 또는 자폐증 환자는 더 낮은 수준을 가졌다(도 15).
II. FGF19 ELISAs
담즙산 대사는 만성 설사 및 IBS-D의 전개에 기여한다. 담즙산 합성을 평가하기 위한 방법은 속도 제한 효소 콜레스테롤 7-히드록실라제의 활성과 연관되는 혈청 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온을 검출하는 것을 포함한다. 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온은, 민감하지만 고가이고 재현성의 문제에 취약한 HPLC 에 의해 측정될 수 있다. 담즙산은 FGF19 신호전달을 활성화하여 결국 담즙산 대사를 조절한다(도 16). FGF19 ELISA 방법은 혈청 샘플에서 FGF19의 수준을 측정하기 위해 개발되었다. 이 검정법은 IBS-D 또는 IBS-C 환자가 정상 대조군 및 IBD 환자에 비해 더 높은 수준의 FGF19를 가짐을 나타내기 위해 사용되었다(도 16b).
III. 키뉴렌산에 대한 항체
링커 유사체를 갖는 키뉴렌산 (예를 들어, 실시예 3 에 기재된 KYA-L)에 대한 폴리클로날 항체를 유사체로 면역화된 토끼에 생성시켰다. 항체의 유효성을 평가하기 위해 적정 실험을 수행하였다. 도 17a 는 500 ng/ml 내지 31.3 ng/ml 범위의 항원 (예를 들어, KYA-L)으로부터의 데이터를 도시한다. 도 17b 는 31.3 ng/ml 내지 0 범위의 KYA-L 을 도시한다. 데이터는 항체가 키뉴렌산에 특이적으로 결합함을 예시한다.
상기 기재된 경쟁적 검정법을 이용하여 항-KYA-L 항체의 교차반응성을 테스트하였다. 간략하게, 항체 결합을 위해 비오틴화 키뉴렌산과 경쟁하기 위해 키뉴렌산 대사산물, 예컨대 L-키뉴레닌 (Ky), 3-히드록시-DL-키뉴레닌 (H-Ky) 및 L-트립토판 (Tryp)을 사용하였다. 도 18a 는 KYA-L 항원이 비오틴화 항원과 경쟁함을 도시한다. 대조적으로, Ky (도 18b), H-Ky (도 18c) 및 Trypt (도 18d)의 증가하는 양의 존재가 검정에서 검출된 항-KYA-L의 수준을 변화시키지 않았다. 결과는 항-KYA-L 항체가 키뉴레닌 대사산물과 교차반응하지 않으며 키뉴렌산에 대해 특이적임을 도시한다.
III. 프로피온산에 대한 항체
실시예 8에 기재된 링커 유사체를 갖는 프로피온산 (PropL) 을 합성하였다. 폴리클로날 항체를 생성하기 위한 표준 방법에 따라 PropL에 대한 항체를 발생시켰다. 프로피온산 특이적 항체의 존재에 대해 면역화된 토끼로부터의 항혈청을 테스트하였다(도 19). 항-PropL 항체를 블리드 10-12에서 검출하였다.
상술한 경쟁적 검정법을 이용하여 항-PropL 항체의 교차반응성을 테스트하였다. 항체는 프로피온산에 대해 특이적이었으며(도 20a) 부티르산 또는 세로토닌과의 교차반응성을 나타내지 않았다.
본원에 기재된 실시예 및 구현예는 오직 예시적 목적을 위한 것이며 그 관점에서 다양한 변경 및 변형이 당업자에게 제시될 것이고 이는 본 출원의 사상 및 이해범위 및 첨부 청구항의 범위 이내에 포함될 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위해 전체가 참조로 본원에 포함된다.

Claims (59)

  1. 화학식 I의 화합물.
    Figure pct00047

    식 중, R 은 알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 아미노알킬, 아미도알킬, 카르복시 알킬, 치환 카르복시알킬로 구성된 군으로부터 선택된 것이고;
    R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 및 R8 은 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고;
    L 은 링커(linker)이고;
    R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고;
    B는 생체 분자이다.
  2. 제 1 항에 있어서, R 은 아미노알킬, 카르복시알킬, 및 치환 카르복시알킬로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, R 은 -CH2CH2NH2, -CH2CH2CO2H 및 -CH2CH(NH2)CO2H 로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7 의 군의 적어도 하나가 R11B 인 화합물.
  5. 제 4 항에 있어서, B 가 단백질, 면역성 펩티드 및 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  6. 화학식 II 의 화합물.
    Figure pct00048

    식중, R1, R6, R7, R8, 및 R9 은 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고;
    L 은 링커이고;
    R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고;
    B는 생체 분자이다.
  7. 제 6 항에 있어서, R1, R6, R7, R8, 및 R9 의 군의 적어도 하나가 R11B 인 화합물.
  8. 제 7 항에 있어서, B 가 단백질, 면역성 펩티드 또는 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식을 갖는 화합물.
    Figure pct00049
  10. 화학식 III 의 화합물.
    Figure pct00050

    식중, R, R1, R2, R3, 및 R4 는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고;
    L 은 링커이고;
    R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고;
    B는 생체 분자이다.
  11. 제 10 항에 있어서, R, R1, R2, R3 및 R4 의 군의 적어도 하나가 R11B 인 화합물.
  12. 제 11 항에 있어서, B 가 단백질, 면역성 펩티드 또는 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  13. 제 12 항에 있어서, 화합물이 하기 화학식을 갖는 화합물.
    Figure pct00051

    식중, R, R1, R2, R3 및 R4 는 각각 수소이다.
  14. 화학식 IV 의 화합물.
    Figure pct00052

    식중, R1, R2, R3, R4, 및 R5는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고;
    L 은 링커이고;
    R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고;
    B는 생체 분자이다.
  15. 제 14 항에 있어서, R1, R2, R3, R4 및 R5의 군의 적어도 하나가 R11B 인 화합물.
  16. 제 15 항에 있어서, B 가 단백질, 면역성 펩티드 또는 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  17. 제 16 항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 화합물.
    Figure pct00053
  18. 화학식 V 의 화합물.
    Figure pct00054

    식중, R1, R2, R3, 및 R4 는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고;
    L 은 링커이고;
    R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고;
    B는 생체 분자이다.
  19. 제 18 항에 있어서, R1, R2, R3, 및 R4 의 군의 적어도 하나가 R11B 인 화합물.
  20. 제 19 항에 있어서, B 가 단백질, 면역성 펩티드 및 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  21. 제 20 항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 화합물.
    Figure pct00055

    식중, R1, R2, R3, 및 R4 는 각각 수소이다.
  22. 화학식 VI 의 화합물.
    Figure pct00056

    식중, R1, R2, 및 R3 는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고;
    L 은 링커이고;
    R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고;
    B는 생체 분자이다.
  23. 제 22 항에 있어서, R1, R2, R3, 및 R4 의 군의 적어도 하나가 R11B 인 화합물.
  24. 제 23 항에 있어서, B 가 단백질, 면역성 펩티드 또는 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  25. 제 24 항에 있어서, 화합물이 하기 화학식을 갖는 화합물.
    Figure pct00057

    식중, R1 및 R3 는 각각 수소이다.
  26. 화학식 VII 의 화합물.
    Figure pct00058

    식중, R1, R2, 및 R3 는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고;
    L 은 링커이고;
    R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고;
    B는 생체 분자이다.
  27. 제 26 항에 있어서, R1, R2, 및 R3 의 군의 적어도 하나가 R11B 인 화합물.
  28. 제 27 항에 있어서, B 가 단백질, 면역성 펩티드 및 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  29. 제 28 항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 화합물.
    Figure pct00059

    식중, R1 및 R3 는 각각 수소이다.
  30. 화학식 VIII의 화합물.
    Figure pct00060

    식중, R1, R2, R3, 및 R4 는 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고;
    L 은 링커이고;
    R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고;
    B는 생체 분자이다.
  31. 제 30 항에 있어서, R1, R2, 및 R3 의 군의 적어도 하나가 R11B 인 화합물.
  32. 제 31 항에 있어서, B 가 단백질, 면역성 펩티드 또는 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  33. 제 32 항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 화합물.
    Figure pct00061

    식중, R1, R2, 및 R3 는 각각 수소이다.
  34. 화학식 X 의 화합물.
    Figure pct00062

    식중, R, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 및 R10 은 각각, 수소, 알킬, 할로, 히드록실, 알콕시, 아미노, 아로일, 알카노일, 아미도, 치환 아미도, 시아노, 카르복실, 알콕시카르보닐, 술포나토, 알콕시알킬, 카르복시, 카르복시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 술포나토알킬, L 및 R11B 로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된 것이고;
    L 은 링커이고;
    R11 은 화합물과 생체분자 간에 생성된 부착이고;
    B 는 생체분자이다.
  35. 제 34 항에 있어서, R1, R2, 및 R3 의 군의 적어도 하나가 R11 인 화합물.
  36. 제 35 항에 있어서, B 가 단백질, 면역성 펩티드 또는 비오틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 화합물.
  37. 제 36 항에 있어서, 하기 화학식을 갖는 화합물.
    Figure pct00063
  38. 5-히드록시트립타민 (5-HT)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 트립토판, 5-히드록시트립토판 및 5-히드록시인돌 아세트산으로 구성된 군으로부터 선택된 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  39. 5-히드록시트립토판 (5-OH)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 트립토판, 5-히드록시트립타민 및 5-히드록시인돌 아세트산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  40. 5-트립토판에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 5-히드록시트립토판, 5-히드록시트립타민 및 5-히드록시인돌 아세트산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  41. 5-히드록시인돌 아세트산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 트립토판, 5-히드록시트립토판 및 5-히드록시트립타민으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  42. 키뉴레닌에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 키뉴렌산, 3-히드록시키뉴레닌, 3-히드록시안트라닐산, 퀴놀린산, 안트라닐산, 세로토닌-O-술페이트 및 세로토닌-O-포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  43. 키뉴렌산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 키뉴레닌, 3-히드록시키뉴레닌, 3-히드록시안트라닐산, 퀴놀린산, 안트라닐산, 세로토닌-O-술페이트 및 세로토닌-O-포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  44. 3-히드록시키뉴레닌에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 키뉴레닌, 키뉴렌산, 3-히드록시안트라닐산, 퀴놀린산, 안트라닐산, 세로토닌-O-술페이트 및 세로토닌-O-포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  45. 3-히드록시안트라닐산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 키뉴레닌, 키뉴렌산, 3-히드록시키뉴레닌, 퀴놀린산, 안트라닐산, 세로토닌-O-술페이트 및 세로토닌-O-포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  46. 퀴놀린산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 키뉴레닌, 키뉴렌산, 3-히드록시키뉴레닌, 3-히드록시안트라닐산, 안트라닐산, 세로토닌-O-술페이트 및 세로토닌-O-포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  47. 안트라닐산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 키뉴레닌, 키뉴렌산, 3-히드록시키뉴레닌, 3-히드록시안트라닐산, 퀴놀린산, 세로토닌-O-술페이트 및 세로토닌-O-포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  48. 세로토닌-O-술페이트에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 키뉴레닌, 키뉴렌산, 3-히드록시키뉴레닌, 3-히드록시안트라닐산, 퀴놀린산, 안트라닐산, 및 세로토닌-O-포스페이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  49. 세로토닌-O-포스페이트에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 키뉴레닌, 키뉴렌산, 3-히드록시키뉴레닌, 3-히드록시안트라닐산, 퀴놀린산, 안트라닐산 및 세로토닌-O-술페이트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  50. 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온 유도체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 콜레스테롤 및 7-α-콜레스테롤로 구성된 군으로부터 선택된 것에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  51. 프로피온산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 부티르산에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  52. 부티르산에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체가 프로피온산에 대해 1% 미만의 교차반응성을 갖는, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  53. 제 38 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 폴리클로날 또는 모노클로날 항체인 항체 또는 그의 단편.
  54. 제 53 항에 있어서, 폴리클로날 항체가 토끼 항체인 항체 또는 그의 단편.
  55. 제 38 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 Fab 또는 Fab2 단편인 항체 또는 그의 단편.
  56. 제 38 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 재조합 항체인 항체 또는 그의 단편.
  57. 포유류로부터의 체액 또는 조직 샘플에서 세로토닌 (5-HT), 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA), 5-히드록시트립토판 (5-HTP), 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 (KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산, 안트라닐산 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 대사산물을 검정하는 방법으로서,
    샘플을, 세로토닌 (5-HT), 5-히드록시인돌 아세트산 (5-HIAA), 5-히드록시트립토판 (5-HTP), 키뉴레닌 (K), 키뉴렌산 (KA), 3-히드록시키뉴레닌 (3-HK), 3-히드록시안트라닐산 (3-HAA), 퀴놀린산, 안트라닐산 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 대사산물에 특이적으로 결합하는 항체와 혼합하는 단계; 및
    항체가 대사산물에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계 - 특이적 항체 결합은 대사산물이 샘플에 존재함을 나타냄 -
    를 포함하는 검정법.
  58. 포유류로부터의 체액 또는 조직 샘플에서 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온을 검정하는 방법으로서,
    샘플을, 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온에 특이적으로 결합하는 항체와 혼합하는 단계; 및
    항체가 7-α-히드록시-4-콜레스텐-3-온에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계 - 특이적 항체 결합은 대사산물이 샘플에 존재함을 나타냄 -
    를 포함하는 검정법.
  59. 포유류로부터의 체액 또는 조직 샘플에서 프로피온산 및 부티르산 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 대사산물을 검정하는 방법으로서,
    샘플을, 프로피온산 및 부티르산 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 대사산물에 특이적으로 결합하는 항체와 혼합하는 단계; 및
    항체가 대사산물에 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 단계 - 특이적 항체 결합은 대사산물이 샘플에 존재함을 나타냄 -
    를 포함하는 검정법.
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