JP2022528466A - 疾患を診断する方法 - Google Patents

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Abstract

本出願は、ＢＡＭを診断するための新規かつ改善された方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、診断、特に、胆汁酸吸収不良（ＢＡＭ）の診断の分野におけるものである。
胆汁酸吸収不良（ＢＡＭ）は、幾つかの消化管関連障害、特に、慢性下痢の原因である。これは胃腸疾患に続発する吸収不良の結果として生じ得るか、または過度の胆汁酸生成に関連する原発性障害であり得る。下痢優位型過敏性腸症候群（ＩＢＳ－Ｄ）及び交代型または混合型過敏性腸症候群（ＩＢＳ－Ｍ）に罹患していると誤診される一部の患者は、実際にはＢＡＭに罹患しており（１、２）、ＢＡＭの処置法は過敏性腸症候群（ＩＢＳ）のそれとは異なる（３）。重要なことに、ＢＡＭはＩＢＳとは異なる臨床単位であり、ＢＡＭに罹患している全ての患者がＩＢＳを有するわけではなく、全てのＩＢＳ患者がＢＡＭに罹患しているわけではない。ＢＡＭは機能性下痢または下痢優位型過敏性腸症候群（ＩＢＳ－Ｄ）を有する患者の２５％～５０％を占めると推定され、集団の１％がそれに罹患している（４）。
ＢＡＭは胆汁酸隔離剤により処置され得る。胆汁酸は肝臓で生成され、胆管系に分泌され、胆嚢に貯蔵され、食後にコレシストキニンにより刺激されて放出される。通常、９５％超の胆汁酸が終末回腸で吸収され、肝臓により取り込まれ、再分泌される。多量の胆汁酸が大腸に入る場合、それらは大腸における水分泌及び腸運動を刺激し、このことが慢性下痢の症状を引き起こす。頂端側ナトリウム依存性胆汁酸輸送体（ＡＳＢＴ、ＩＢＡＴ、遺伝子記号ＳＬＣ１０Ａ２）、細胞質の回腸胆汁酸結合タンパク質（ＩＢＡＢＰ、ＩＬＢＰ、遺伝子記号ＦＡＢＰ６）、ならびにＯＳＴα及びＯＳＴβの基底側ヘテロ二量体が含まれる胆汁酸輸送体が胆汁酸を輸送する。これらの輸送体の発現が減少する場合、腸管が胆汁酸を吸収する能力が低下する（１型胆汁酸吸収不良）。腸運動が胃腸手術により影響を受けるか、または胆汁酸が小腸内細菌異常増殖症により脱抱合される場合、吸収効率が低下する（３型胆汁酸吸収不良）。原発性胆汁酸下痢（２型胆汁酸「吸収不良」）は、胆汁酸の過剰生成により引き起こされ得る。明らかな疾患のないごく少数の割合の患者（２型胆汁酸吸収不良）は、ＡＳＢＴの変異を有し得る。
ＢＡＭは、タウリン抱合型７５セレン（Ｓｅ）標識ホモコール酸（ＳｅＨＣＡＴ）試験により診断され得、これは、胆汁酸を再吸収及び代謝できないことを検出する。この試験は、放射標識胆汁化合物を投与すること、及び１週間後にその保持率を測定することを含む（５）。ＢＡＭはＩＢＳとは異なる臨床単位であり、例えば、胆汁酸隔離剤により成功裡に処置され得る。ＳｅＨＣＡＴ試験は、高価であり、広く利用可能ではない、診療所におけるＢＡＭ診断のための確定的な検査である（６）。
ＩＢＳは消化器系に影響を及ぼす一般的な疾患である。症状としては、腹痛、腹部膨満、下痢、及び便秘が挙げられ、長期間、一般に数年にわたり発生する。不安、大うつ病、及び慢性疲労症候群などの障害は、ＩＢＳを有する人々の間で一般的である。ＩＢＳの既知の治療法は存在せず、一般に、症状を改善するための処置が実施される。処置としては、食事変更、薬物、プロバイオティクス、及び／またはカウンセリングが挙げられ得る。処置として一般に提案される食事療法としては、可溶性繊維の摂取量を増やすこと、無グルテン食、または発酵性のオリゴ糖、二糖、単糖、及びポリオール（ＦＯＤＭＡＰ）の少ない短期間の食事が挙げられる。薬物であるロペラミドが下痢を軽くするために使用され、緩下剤が便秘を軽くするために使用される。抗うつ薬は、全般的症状及び疼痛を改善し得る。ほとんどの慢性非伝染性障害の様に、ＩＢＳは不均一であるようである（７）。ＩＢＳの重症度は煩わしい腸障害から社会的障害までの範囲があり、症状の顕著な不均一性を伴う（８）。しばしば、脳腸軸の障害とみなされるが（９、１０）、ＩＢＳが消化管もしくは脳または両方から生じるのかどうかは不明である。感染後ＩＢＳの発生（１１）は、幾つかは心理社会的なものであり得る感受性リスク因子を有するにもかかわらず、一部の症例が末端器官において起きることを示唆する。マイクロバイオーム科学の進歩は、神経発生及びおそらく行動に対する微生物叢による影響を修飾することについての新たに得られつつある証拠により、心／身連関の概念を、微生物叢－腸－脳軸（１２）を包含するように広げた。しかしながら、ＩＢＳの理解及び処置における進展は、信頼性の高いバイオマーカーの欠如により制限されており、ＩＢＳは依然として症状により定義される。更に、主症状に基づいて臨床的サブタイプ（下痢優位型（ＩＢＳ－Ｄ）または便秘型（ＩＢＳ－Ｃ））に患者を層別化する現行の手法には、数日内に時としてサブタイプ間を行き来する患者の処置法の決定を誤ることを含め、大きな制約がある（１３）。正反対の症状に取り組むように設計された医薬品は、誤分類された患者に処方される場合、望ましくない重篤な有害作用の可能性を有する（１４）。
腸障害を有する患者における腸内微生物叢の対照群と比較した変化の調査が行われている（１５～１８）。マイクロバイオームの食事、抗生物質、及び腸管感染症（これらの全てが腸障害に関与し得る）との相互作用は、マイクロバイオームの変化が、この症候群の病態生理学的メカニズムを活性化し得るか、または永続させ得るという仮説と一致する（１９、２０）。しかしながら、腸障害を有する患者を対照と区別し、治療法を決めるのに役立つ強いマイクロバイオームシグネチャまたはバイオマーカーはない。しかし、ＩＢＳ重症度のシグネチャは示唆されている。更に、これまでのほとんどの微生物叢研究は、１６Ｓ ｒＲＮＡプロファイルを用いており、細菌の代謝産物を分析しなかった。
ＢＡＭなどの腸障害を診断するための更なるかつ改善された方法が必要とされている。類似の症状を有する別の疾患、例えば、ＩＢＳとすでに診断された患者におけるＢＡＭなどの腸障害を診断するための更なるかつ改善された方法も必要とされている。
本発明者らは、胆汁酸吸収不良（ＢＡＭ）を診断するための新規かつ改善された方法を開発した。患者及び対照（非ＢＡＭ）個体におけるマイクロバイオーム及びメタボロームの網羅的かつ詳細な分析は、疾患の新規の指標が同定されるのを可能にした。本発明は、ＢＡＭに関連する分類群の細菌種及び／またはＢＡＭに関連する代謝産物を検出することを含む、患者のＢＡＭを診断する方法を提供する。
～ ＳｅＨＣＡＴにより分析された対象における胆汁酸吸収不良（ＢＡＭ）の分布、マイクロバイオーム及びメタボロームプロファイルを示す。（Ａ）対照及びＩＢＳ患者のＳｅＨＣＡＴ保持率。（Ｂ）試験されたＩＢＳ－Ｄ及びＩＢＳ－Ｍ患者におけるＢＡＭクラスの分布。（Ｃ）ＩＢＳ患者におけるＢＡＭクラス間の有意差を示さない微生物叢の組成のＰＣｏＡ（１６Ｓ ＯＴＵレベルでのスピアマン距離を用いた並べ替えＭＡＮＯＶＡ；ｐ値＝０．２８９）。（Ｄ）試験されたＩＢＳ患者におけるＢＡＭクラス間の有意差を示す糞便ＭＳメタボロミクスのＰＣｏＡ（１６Ｓ ＯＴＵレベルでのスピアマン距離を用いた並べ替えＭＡＮＯＶＡ；ｐ値＜０．００１）。 ＳｅＨＣＡＴにより分析された対象（ＩＢＳ：ｎ＝４５；対照：ｎ＝９）の糞便代謝産物及びランダムフォレストに基づくＢＡＭの予測確率を示す。 代替的機械学習パイプラインのコアワークフローを示す。Ｎは最小絶対収縮及び選択演算子（ＬＡＳＳＯ）により返された特徴の数を示す。 ＳｅＨＣＡＴにより分析されたＩＢＳ患者（ＩＢＳ－ＢＡＭ：ｎ＝１９；ＩＢＳ－非ＢＡＭ：ｎ＝２１）の糞便代謝産物及びランダムフォレストに基づくＢＡＭの予測確率を示す。境界型（borderline）ＢＡＭを有するＩＢＳ患者はモデルから除外された。
実施例に示すように、本発明者らは、効果的であり、タウリン抱合型７５セレン（Ｓｅ）標識ホモコール酸（ＳｅＨＣＡＴ）試験より顕著に安価、利用しやすい、かつ安全な、胆汁酸吸収不良（ＢＡＭ）を診断するための方法を開発した。ＳｅＨＣＡＴ試験は、ＢＡＭを診断するための現在最も広く使用されている技術であるが、本発明の方法とは異なり、患者を放射線に曝露させ、臨床環境を必要とし、非常に高価である。ＳｅＨＣＡＴ試験では、放射標識された７５ＳｅＨＣＡＴを含有するカプセル（３７０ｋＢｑのセレン７５及び０．１ｍｇ未満のＳｅＨＣＡＴを含有する）が水と共に経口投与される。カプセルを服用した１～３時間後、及び次いで、７日目にコリメートされていないガンマカメラを使用して測定が行われる。次いで、７日目でのＳｅＨＣＡＴの保持率が計算され、７日目での１５％超のＳｅＨＣＡＴ保持値が正常であるとみなされ、１５％未満の値が胆汁酸吸収不良において見られるような過度の胆汁酸喪失を示す。
一実施形態では、本発明は、患者をＢＡＭと診断するための方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、患者を軽度ＢＡＭと診断するための方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、患者を中等度ＢＡＭと診断するための方法を提供する。中等度ＢＡＭは、ＳｅＨＣＡＴ試験における標識された胆汁酸アナログの１０％保持を特徴とし得る。特定の実施形態では、本発明は、患者を重度ＢＡＭと診断するための方法を提供する。データは、本発明の方法が重度ＢＡＭを診断するのに特に効果的であることを示す。重度ＢＡＭは、ＳｅＨＣＡＴ試験における標識された胆汁酸アナログの５％以下の保持を特徴とし得る。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、ＩＢＳと診断された患者のＢＡＭを診断するためのものである。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、ＩＢＳ－Ｍと診断された患者のＢＡＭを診断するためのものである。幾つかの好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＩＢＳ－Ｄと診断された患者のＢＡＭを診断するためのものである。特定の実施形態では、本発明の方法は、ＩＢＳと診断された患者の重度ＢＡＭを診断するためのものである。
一実施形態では、本方法は、患者をそれらの微生物叢の組成に基づいて重度ＢＡＭに罹患していると診断することを含む。特定の実施形態では、ＩＢＳ及び重度ＢＡＭに罹患している患者は、異なる微生物叢の組成を有する。特定の実施形態では、重度ＢＡＭに罹患しているＩＢＳ患者は、正常、軽度ＢＡＭ、中等度ＢＡＭ、または境界型ＢＡＭと診断されたＩＢＳ患者と異なる微生物叢の組成を有する。
一実施形態では、本発明は、明白な糞便メタボロームシグネチャを検出することを含む、患者をＢＡＭと診断するための方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、明白な糞便メタボロームシグネチャを検出することを含む、ＩＢＳ患者を重度ＢＡＭと診断するための方法を提供する。一実施形態では、ＢＡＭを予測するために、機械学習が糞便メタボロームデータに適用され得る。
一実施形態では、本発明は、ＢＡＭを予測する１または２以上の代謝産物を検出することを含む、患者をＢＡＭと診断するための方法を提供する。一般に、本発明の方法においてＢＡＭを予測するか、またはＢＡＭに関連する代謝産物を検出することは、試料中の当該代謝産物の濃度を測定すること、または代謝産物の濃度の変化を測定すること、及び任意に濃度を対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と、または基準値と比較することを含む。特定の実施形態では、本発明の方法においてＢＡＭを予測するか、またはＢＡＭに関連する代謝産物を検出することは、試料中の当該代謝産物の濃度を測定すること、または代謝産物の濃度の変化を測定すること、及び濃度をＩＢＳに罹患している患者由来の対応する試料と比較することを含む。一実施形態では、ＢＡＭを予測する１または２以上の代謝産物は以下から選択される：ＰＧ（Ｐ－１６：０／１４：０）、２－エチルスベリン酸、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ、１，２，３－Ｔｒｉｓ（１－エトキシエトキシ）プロパン、ＰＧ（Ｏ－３０：１）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ＭＧ（２２：２（１３Ｚ，１６Ｚ）／０：０／０：０）、Ｌ－リジン、Ｏ－ホスホエタノールアミン、ＰＥ（２２：５（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／２４：０）、及び／またはヘプタデカン酸。別の実施形態では、ＢＡＭを予測する１または２以上の代謝産物は以下から選択される：１，３－ジ－（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ－エイコサペンタノイル）－２－ヒドロキシ－グリセロール（ｄ５）、ジメチルベンジルカルビニルブチレート、１－１８：０－２－１８：２－モノガラクトシルジアシルグリセロール、ＰＧ（Ｐ－１６：０／１４：０）、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ、ＰＣ（２２：２（１３Ｚ，１６Ｚ）／１５：０）、ＰＧ（３４：０）、ＰＥ（１８：３（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）／Ｐ－１８：０）、ＭＧ（２２：２（１３Ｚ，１６Ｚ）／０：０／０：０）、Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｉｌｅ、ＰＥ（２２：５（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／２４：０）、ＰＣ（１８：１（９Ｚ）／１５：０）、チオファネートメチル、Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ、１，２，３－Ｔｒｉｓ（１－エトキシエトキシ）プロパン、ＰＳ（３９：６）、２－ヒドロキシラウロイルカルニチン、ヒポキサンチン、アデノシン、ＰＣ（４０：６）、Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ、３－デヒドロキシカルニチン、イノシン、ＰＧ（Ｏ－３４：３）、１１－デオキソククルビタシンＩ、カプリン酸メチル、リノレオイルエタノールアミド、Ｈｉｓ－Ｍｅｔ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ、１－デカノール、グラベリフェロン、ウリジン、アラキジルカルニチン、グアノシン、ノニル酸メチル、３－エピデミッシジン、モモルドール、Ｎ－［２－（１Ｈ－インドール－３－イル）エチル］ドコサンアミド、カプロン酸メチル、アスコルビン酸、Ｎ－アセチル－ｌｅｕ－ｌｅｕ－ｔｙｒ、４－ヒドロキシ酪酸、［ＳＴ ジメチル（４：０／３：０）］（５Ｚ，７Ｅ，１７Ｚ）－（１Ｓ，３Ｒ）－２６，２７－ジメチル－９，１０－セコ－５，７，１０（１９），１７（２０）－コレスタテトラエン－２２－イン－１，３，２５－トリオール、Ｎ－メチルインドロ［３，２－ｂ］－５α－コレスト－２－エン、及びγ－グルタミル－Ｓ－メチルシステイニル－β－アラニン。好ましい実施形態では、本方法は、ウルソデオキシコール酸を検出することを含む。好ましい実施形態では、本方法は、Ｌ－リジンを検出することを含む。好ましい実施形態では、本方法は、１，３－ジ－（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ－エイコサペンタノイル）－２－ヒドロキシ－グリセロール（ｄ５）を検出することを含む。好ましい実施形態では、本方法は、ジメチルベンジルカルビニルブチレートを検出することを含む。好ましい実施形態では、本方法は、１－１８：０－２－１８：２－モノガラクトシルジアシルグリセロールを検出することを含む。好ましい実施形態では、本方法は、ＰＧ（Ｐ－１６：０／１４：０）を検出することを含む。好ましい実施形態では、本方法は、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒを検出することを含む。任意のかかる実施形態では、代謝産物を検出することは、例えば、対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と比較した、または基準値と比較した、試料中の代謝産物の相対濃度を測定することを含む。好ましい実施形態では、代謝産物を検出することは、例えば、ＩＢＳに罹患している患者由来の対応する試料と比較した、試料中の代謝産物の相対濃度を測定することを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、上記の代謝産物の前駆体または分解生成物を検出することを含む。
一実施形態では、本発明は、ＢＡＭを予測する１または２以上の代謝産物の濃度の増加を検出することを含む、患者をＢＡＭと診断するための方法を提供する。幾つかの実施形態では、本発明の方法においてＢＡＭを予測するか、またはＢＡＭに関連する代謝産物を検出することは、試料中の当該代謝産物の濃度を測定すること、及び任意に濃度を対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と、または基準値と比較することを含む。幾つかの実施形態では、ＢＡＭを予測する代謝産物は、対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と比較して、または基準値と比較してより高い濃度を有する。特定の実施形態では、本発明の方法においてＢＡＭを予測するか、またはＢＡＭに関連する代謝産物を検出することは、代謝産物の濃度を測定すること、及び濃度をＩＢＳに罹患している患者由来の対応する試料と比較することを含む。幾つかの実施形態では、ＢＡＭを予測する代謝産物は、ＩＢＳに罹患している患者由来の対応する試料と比較してより高い濃度を有する。特定の実施形態では、ＢＡＭを予測する１または２以上の代謝産物は以下から選択される：１，３－ジ－（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ－エイコサペンタノイル）－２－ヒドロキシ－グリセロール（ｄ５）、ジメチルベンジルカルビニルブチレート、ＰＧ（Ｐ－１６：０／１４：０）、ＰＧ（３４：０）、ＰＥ（１８：３（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）／Ｐ－１８：０）、チオファネートメチル、ＰＳ（３９：６）、Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ、ＰＧ（Ｏ－３４：３）、１－デカノール、３－エピデミッシジン、及び／またはモモルドール。
一実施形態では、本発明は、対照個体（非ＢＡＭ）を予測する１または２以上の代謝産物の濃度の減少を検出することを含む、患者をＢＡＭと診断するための方法を提供する。幾つかの実施形態では、本発明の方法においてＢＡＭを予測するか、またはＢＡＭに関連する代謝産物を検出することは、試料中の当該代謝産物の濃度を測定すること、及び任意に濃度を対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と、または基準値と比較することを含む。幾つかの実施形態では、ＢＡＭを予測する代謝産物は、対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と比較して、または基準値と比較してより低い濃度を有する。特定の実施形態では、本発明の方法においてＢＡＭを予測するか、またはＢＡＭに関連する代謝産物を検出することは、代謝産物の濃度を測定すること、及び濃度をＩＢＳに罹患している患者由来の対応する試料と比較することを含む。幾つかの実施形態では、ＢＡＭを予測する代謝産物は、ＩＢＳに罹患している患者由来の対応する試料と比較してより低い濃度を有する。特定の実施形態では、対照（非ＢＡＭ）個体を予測する１または２以上の代謝産物は以下から選択される：１－１８：０－２－１８：２－モノガラクトシルジアシルグリセロール、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ、ＰＣ（２２：２（１３Ｚ，１６Ｚ）／１５：０）、ＭＧ（２２：２（１３Ｚ，１６Ｚ）／０：０／０：０）、Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｉｌｅ、ＰＥ（２２：５（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／２４：０）、ＰＣ（１８：１（９Ｚ）／１５：０）、Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ、１，２，３－Ｔｒｉｓ（１－エトキシエトキシ）プロパン、２－ヒドロキシラウロイルカルニチン、ヒポキサンチン、アデノシン、ＰＣ（４０：６）、３－デヒドロキシカルニチン、イノシン、１１－デオキソククルビタシンＩ、カプリン酸メチル、リノレオイルエタノールアミド、Ｈｉｓ－Ｍｅｔ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ、グラベリフェロン、ウリジン、アラキジルカルニチン、グアノシン、ノニル酸メチル、Ｎ－［２－（１Ｈ－インドール－３－イル）エチル］ドコサンアミド、カプロン酸メチル、アスコルビン酸、Ｎ－アセチル－ｌｅｕ－ｌｅｕ－ｔｙｒ、４－ヒドロキシ酪酸、［ＳＴ ジメチル（４：０／３：０）］（５Ｚ，７Ｅ，１７Ｚ）－（１Ｓ，３Ｒ）－２６，２７－ジメチル－９，１０－セコ－５，７，１０（１９），１７（２０）－コレスタテトラエン－２２－イン－１，３，２５－トリオール、Ｎ－メチルインドロ［３，２－ｂ］－５α－コレスト－２－エン、及び／またはγ－グルタミル－Ｓ－メチルシステイニル－β－アラニン。
幾つかの実施形態では、本発明の方法においてＢＡＭに関連する代謝産物を検出することは、当該代謝産物の前駆体の濃度を測定すること、及び任意に濃度を対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と、または基準値と比較することを含む。幾つかの実施形態では、本発明の方法においてＢＡＭに関連する代謝産物を検出することは、当該代謝産物の分解生成物の濃度を測定すること、及び任意に濃度を対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と、または基準値と比較することを含む。ある種の実施形態では、本方法は、ＢＡＭを予測する代謝産物を生成することが既知の細菌分類群を検出することを含む。
一実施形態では、本発明は、表１及び／または表７から選択されるＢＡＭを予測する代謝産物を検出することを含む、患者をＢＡＭと診断するための方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、表１及び／または表７から選択されるＢＡＭを予測する代謝産物を検出することを含む、ＩＢＳ患者を重度ＢＡＭと診断するための方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の方法は、脂肪酸代謝に関連する代謝産物を検出することを含む。好ましい実施形態では、本発明の方法は、ウルソデオキシコール酸を検出することを含む。一実施形態では、ＢＡＭを診断するために機械学習が使用される。任意のかかる実施形態では、代謝産物を検出することは、例えば、対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と比較した、または基準値と比較した、試料中の代謝産物の相対濃度を測定することを含む。
本発明者らは、実施例において実証されるように、ＢＡＭに関連する細菌分類群を同定した。従って、本発明は、特定の細菌分類群の存在を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。好ましくは、これらの方法は、患者由来の糞便試料中の細菌株を検出することを含む。あるいは、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、綿棒などの口腔試料から検出され得る。一般に、本発明の方法においてＢＡＭに関連する細菌分類群を検出することは、試料中の細菌（すなわち１または２以上の細菌株）の、例えば、対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と比較した、または基準値と比較した相対存在量を測定することを含む。
一実施形態では、本発明は、以下の科のうちの１または２以上の細菌種を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する：ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）、バクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、ビフィドバクテリウム科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）、ベイヨネラ科（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ）、及びコリオバクテリウム科（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）。一実施形態では、本発明は、以下の属のうちの１または２以上の細菌種を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する：ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、オシリバクター（Ｏｓｃｉｌｌｉｂａｃｔｅｒ）属、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コプロコッカス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、パラプレボテラ（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、ゲミガー（Ｇｅｍｍｉｇｅｒ）属、ジアリスタ（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）属、及びメガモナス（Ｍｅｇａｍｏｎａｓ）属。任意のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することは、試料中の細菌の、例えば、対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と比較した、または基準値と比較した相対存在量を測定することを含む。実施例は、これらの細菌を検出する方法が特に効果的であることを実証する。本発明において使用される細菌分類群は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を参照して定義され得るか、または本発明はリンネ式分類法を使用し得る。いずれの種類の分類群の細菌も、クレード特異的細菌遺伝子、１６Ｓ配列、トランスクリプトミクス、メタボロミクス、またはかかる技術の組み合わせを使用して検出され得る。ある種の実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、クレード特異的細菌遺伝子、１６Ｓ配列、トランスクリプトミクス、またはメタボロミクスを使用して検出され得る。
一実施形態では、本発明は、ＢＡＭに関連する操作的分類単位（ＯＴＵ）に属する１または２以上の細菌株を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。当該技術分野において周知であるように、操作的分類単位（ＯＴＵ）は、密接に関連する個体群を分類するために使用される操作的定義である。本明細書で使用する場合、「ＯＴＵ」は、特定の分類マーカー遺伝子のＤＮＡ配列類似性により分類される一群の生物である（３９）。幾つかの実施形態では、特定の分類マーカー遺伝子は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子である。幾つかの実施形態では、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）分類子が、代表的なＯＴＵ配列に分類を割り当てるために使用される。例えば、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）が表２に列挙されるＯＴＵに属するかどうかを分類するために、表３の配列情報が使用され得る。表３の配列に対する少なくとも９７％の配列同一性を有する細菌は、表２の対応するＯＴＵに属する。好ましい実施形態では、ＯＴＵは、表２から選択される。任意のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することは、試料中の細菌の、例えば、対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と比較した、または基準値と比較した相対存在量を測定することを含む。
一実施形態では、本発明は、ＢＡＭに関連する操作的分類単位（ＯＴＵ）に属する１または２以上の細菌株を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。好ましい実施形態では、ＯＴＵは、表２から選択される。一実施形態では、ＢＡＭに関連するＯＴＵは、以下の門のうちの１つに属すると分類される：ファーミキューテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、またはアクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）門。特定の実施形態では、ＢＡＭに関連するＯＴＵは、以下の綱のうちの１つに属すると分類される：クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）、バクテロイデス綱（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｉａ）、アクチノバクテリア綱、またはネガティウィクテス綱（Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ）。特定の実施形態では、ＢＡＭに関連するＯＴＵは、以下の目のうちの１つに属すると分類される：クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ）、バクテロイデス目（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ）、セレノモナス目（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ）、またはコリオバクテリウム目（Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）。特定の実施形態では、ＢＡＭに関連するＯＴＵは、以下の科のうちの１つに属すると分類される：ラクノスピラ科、バクテロイデス科、ルミノコッカス科、ビフィドバクテリウム科、プレボテラ科、ベイヨネラ科、またはコリオバクテリウム科。特定の実施形態では、ＢＡＭに関連するＯＴＵは、以下の属のうちの１つに属すると分類される：ブラウティア属、バクテロイデス属、フィーカリバクテリウム属、オシリバクター属、ラクノスピラ＿インケルタエ＿セディス属（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａ＿ｉｎｃｅｒｔａｅ＿ｓｅｄｉｓ）、ルミノコッカス２属、ビフィドバクテリウム属、コプロコッカス属、パラプレボテラ属、ゲミガー属、ジアリスタ属、またはメガモナス属。
一実施形態では、本発明は、表２に列挙される１または２以上のＯＴＵに属する細菌株を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を表２に列挙されるＯＴＵに属すると分類するために、表３の配列が使用され得る。表３の配列に対する少なくとも９７％の配列同一性を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、表２の対応するＯＴＵに属する。アラインメントは配列の全長にわたる。Ｍｅｔａｐｈｌａｎ２及びＨＵＭＡｎＮ２の両方の実行において、種組成のためのアラインメントは、ｂｏｗｔｉｅ ２を使用して行われる。Ｂｏｗｔｉｅ２は「高感度な引数」で実行され、実行されるアラインメントは「グローバルアラインメント」である。
一実施形態では、本発明は、配列番号１と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ブラウティア属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号２と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、バクテロイデス属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号３と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、クロストリジウム目に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号４と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、フィーカリバクテリウム属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号５と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、オシリバクター属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号６と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ラクノスピラ属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号６と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ラクノスピラ科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号７と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ラクノスピラ科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号８と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ラクノスピラ科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号９と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ルミノコッカス科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号１０と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ルミノコッカス属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号１１と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ラクノスピラ科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号１２と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ビフィドバクテリウム属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号１３と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、コプロコッカス属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号１４と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、クロストリジウム目に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号１５と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、パラプレボテラ属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号１６と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、バクテロイデス属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号１７と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ルミノコッカス科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号１８と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ゲミガー属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号１９と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ルミノコッカス科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号２０と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ジアリスタ属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号２１と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、クロストリジウム目に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号２２と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、クロストリジウム目に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号２３と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、クロストリジウム目に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号２４と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ラクノスピラ科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号２５と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、フィーカリバクテリウム属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号２６と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、クロストリジウム目に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号２７と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、メガモナス属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号２８と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、コリオバクテリウム科に属すると分類される。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１～２８のうちの２以上、例えば、５、８、または配列番号１～２８の全てと少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する異なる細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、表５に列挙される１または２以上のＯＴＵに属する細菌株を検出することを含む、ＩＢＳを診断する更なるステップを提供する。細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を表５に列挙されるＯＴＵに属すると分類するために、表６の配列が使用され得る。表６の配列に対する少なくとも９７％の配列同一性を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、表５の対応するＯＴＵに属する。アラインメントは配列の全長にわたる。Ｍｅｔａｐｈｌａｎ２及びＨＵＭＡｎＮ２の両方の実行において、種組成のためのアラインメントは、ｂｏｗｔｉｅ ２を使用して行われる。Ｂｏｗｔｉｅ２は「高感度な引数」で実行され、実行されるアラインメントは「グローバルアラインメント」である。
一実施形態では、本発明は、配列番号２９と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ラクノスピラ科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号３０と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ファーミキューテス門に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号３１と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ブチリコッカス（Ｂｕｔｙｒｉｃｉｃｃｕｓ）属に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号３２と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ラクノスピラ科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号３３と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、クロストリジウム目に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号３４と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ルミノコッカス科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号３５と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ルミノコッカス科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号３６と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ファーミキューテス門に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号３７と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ルミノコッカス科に属すると分類される。
一実施形態では、本発明は、配列番号３８と少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。ある種のかかる実施形態では、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）は、ラクノスピラ科に属すると分類される。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２９～３８のうちの２以上、例えば、５、８、または配列番号２９～３８の全てと少なくとも９７％（例えば、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する異なる細菌（すなわち１または２以上の細菌株）を検出することを含む、ＢＡＭを診断するための方法を提供する。
ある種の実施形態では、細菌種は、配列に基づく分類群に属する。好ましい実施形態では、配列に基づく分類群は表２から選択される。
好ましい実施形態では、ＢＡＭを診断するための方法は、上述されるような少なくとも１の代謝産物を検出すること、及び上述されるような少なくとも１の細菌株または細菌種を検出することを含む。メタボロミクスモデルは重度及び中等度ＢＡＭについて１００％の精度で機能した一方で、ＯＴＵモデルは、糞便メタボロミクスモデル（９個）と比較してより少ない誤分類（５個）をもたらした。モデル間で誤分類された対象は重複しなかった。このことは、組み合わされたマイクロバイオーム－メタボロームモデルがＢＡＭ予測精度を増加させることを示す。
一実施形態では、本発明は、ＢＡＭと併存する疾患とすでに診断された患者のＢＡＭを診断するための方法を提供する。別の実施形態では、ＢＡＭメタボロームシグネチャを使用したＢＡＭの診断は、ＢＡＭに罹患している患者を、他の疾患、例えば、ＢＡＭと併存する疾患に罹患している患者と区別する。
特定の実施形態では、本発明は、炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病とすでに診断された患者のＢＡＭを診断するための方法を提供する。特定の実施形態では、ＢＡＭメタボロームシグネチャを使用したＢＡＭの診断は、ＢＡＭに罹患している患者を、他の疾患、例えば、炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病に罹患している患者と区別する。
一実施形態では、本発明は、すでに神経性食欲不振症と診断された患者のＢＡＭを診断するための方法を提供する。別の実施形態では、ＢＡＭメタボロームシグネチャを使用したＢＡＭの診断は、ＢＡＭに罹患している患者を、他の疾患、例えば、神経性食欲不振症に罹患している患者と区別する。
ある種の実施形態では、ＢＡＭを診断するための方法は、１または２以上の細菌種及び１または２以上の代謝産物を検出することを含む。
ＢＡＭ患者における食事、マイクロバイオーム、及びメタボロームの統合解析
ある種の実施形態では、本発明は、ｉ）例えば、上記のような細菌種を検出すること、ｉｉ）例えば、上記のような代謝産物を検出することのうちの１または２以上を含む、ＢＡＭを診断する方法を提供する。任意のかかる実施形態では、細菌、遺伝子、または代謝産物を検出することは、例えば、対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料と比較した、または基準値と比較した、試料中の上記マーカーの存在量または濃度を測定すること含む。
診断方法
本発明者らは、ＢＡＭを診断するための新規かつ改善された方法を開発した。
好ましい実施形態では、本発明の方法は、ヨーロッパ、例えば、北ヨーロッパ、好ましくはアイルランドに居住する患者またはヨーロッパ、北ヨーロッパ、もしくはアイルランドの食生活を有する患者の診断に使用するためのものである。実施例は、本発明の方法がかかる患者に特に有効であることを実証する。他の実施形態では、患者は、アメリカ合衆国に在住していてもよい。
本発明の任意の態様のある種の実施形態では、細菌、遺伝子、または代謝産物の存在量は、対照（非ＢＡＭ）個体と比較して評価される。かかる基準値は、当該技術分野において確立された任意の技術を使用して生成され得る。
本発明の任意の態様のある種の実施形態では、対照（非ＢＡＭ）個体由来の対応する試料との比較は、健常個体由来の対応する試料との比較である。
好ましくは、ＢＡＭを診断する方法は、４０％超（例えば、４５％、５０％、または５２％超、例えば、５３％または５８％）の感度及び９０％超（例えば、９３％または９５％超、例えば、９６％）の特異性を有する。
ある種の実施形態では、診断方法は、ＢＡＭの処置過程をモニタリングする方法である。
ある種の実施形態では、細菌、例えば、糞便試料中の細菌の存在または存在量を検出するステップは、核酸に基づく定量化方法、例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンシーケンシングを含む。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンシーケンシングを使用した試料中の細菌の定性的及び定量的測定のための方法は、文献に記載されており、当業者に公知であろう。他の技術は、ＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ハイスループットシーケンシング、メタトランスクリプトームシーケンシング、または１６Ｓ ｒＲＮＡ解析を含み得る。
本発明の任意の実施形態の代替的態様では、本発明は、ＢＡＭを発症するリスクを診断するための方法を提供する。
本発明の任意の実施形態では、細菌株、細菌種、または代謝産物の調節された存在量は、ＢＡＭの存在を示す。好ましい実施形態では、試料中の微生物叢全体のうちの割合としての細菌株、細菌種、またはＯＴＵの存在量が、細菌株、細菌種、またはＯＴＵの相対存在量を決定するために測定される。好ましい実施形態では、代謝産物の濃度が測定される。好ましい実施形態では、試料中の微生物叢全体のうちの割合としての細菌株の存在量が、細菌株の相対存在量を決定するために測定される。次いで、かかる好ましい実施形態では、試料中の細菌もしくはＯＴＵの相対存在量または代謝産物もしくは遺伝子配列の濃度が、基準対照（非ＢＡＭ）個体由来の同じ試料における相対存在量または濃度と比較される。試料中の細菌またはＯＴＵの相対存在量の基準と比較した差、例えば、減少または増加が、調節された相対存在量である。本明細書において説明されるように、調節された存在量の検出は、試料の存在量値を絶対基準値と比較することにより絶対的な方法で実行され得る。従って、本発明は、個体のＢＡＭ状態を決定する方法であって、当該個体由来の生体試料を、１または２以上のＢＡＭに関連する細菌の相対存在量及び／または代謝産物の調節された濃度について分析するステップを含み、細菌の調節された相対存在量または代謝産物の調節された濃度がＢＡＭの存在を示す、当該方法を提供する。同様に、本発明は、個体がＢＡＭに罹患する増加したリスクを有するかどうかを決定する方法であって、当該個体由来の生体試料を、１または２以上のＢＡＭに関連する口腔細菌またはＢＡＭに関連する代謝産物の相対存在量について分析するステップを含み、調節された相対存在量または濃度が増加したリスクの存在を示す、当該方法を提供する。
本発明の任意の実施形態では、細菌を検出することは、「調節された相対存在量」を検出することを含み得る。本明細書で使用する場合、個体由来の試料中の細菌またはＯＴＵに適用される、用語「調節された相対存在量」は、当該試料中の当該細菌またはＯＴＵの相対存在量の、基準対照（非ＢＡＭ）個体由来の同じ試料における相対存在量（以下「基準相対存在量」）と比較した差を意味すると理解すべきである。一実施形態では、細菌またはＯＴＵは、基準相対存在量と比較して増加した相対存在量を示す。一実施形態では、細菌またはＯＴＵは、基準相対存在量と比較して減少した相対存在量を示す。調節された存在量の検出は、試料の存在量値を絶対基準値と比較することにより絶対的な方法で実行され得る。一実施形態では、基準存在量値は、年齢及び／または性別が一致する個体から取得される。一実施形態では、基準存在量値は、試料と同じ集団（すなわちケルト起源、北アフリカ起源、中東起源）の個体から取得される。口腔及び糞便試料から細菌を単離する方法は、細菌（すなわち１または２以上の細菌株）の存在量を検出するための方法と同様に以下で記載される。特定の種または属の細菌を単離するための任意の好適な方法が用いられ得、それらの方法は当業者にとって明らかである。寒天プレート定量化アッセイ、蛍光試料の定量化、ｑＰＣＲ、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンシーケンシング、及び色素に基づく代謝産物枯渇アッセイまたは代謝産物生成アッセイが含まれる、細菌の存在量を検出する任意の好適な方法が用いられ得る。
本発明は、本発明の方法を実行するための試薬を含むキット、例えば、上記で述べた細菌種、遺伝子、または代謝産物のうちの１または２以上、例えば、２または３以上を検出するための試薬を含有するキットも提供する。上記のようなＢＡＭを診断する主題の方法を実施するのに有用であるキットも提供される。キットは、個体からの生体試料、例えば、尿試料または糞便試料を採取するように構成され得る。個体はＢＡＭを有すると疑われていてもよい。個体はＢＡＭを有するリスクが高いことが疑われていてもよい。キットは、生体試料を入れるように構成された密封可能な容器を含み得る。キットはポリヌクレオチドプライマーを含み得る。ポリヌクレオチドプライマーは、少なくとも１のＢＡＭに関連する細菌由来の１６Ｓ ｒＲＮＡポリヌクレオチド配列を増幅して、増幅された１６Ｓ ｒＲＮＡポリヌクレオチド配列を形成するように構成されていてもよい。キットは、増幅された１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を検出するための検出試薬を含み得る。キットは使用説明書を含み得る。
要約
背景及び目的：ＢＡＭの診断はＳｅＨＣＡＴ分析に基づく。一部の患者は、それらの微生物叢の変化を有する。従って、マイクロバイオーム及びメタボロームプロファイリングが、状態のバイオマーカーを同定するために実施された。
方法：マイクロバイオーム及びメタボローム解析のために、身体測定情報、医療情報、及び食事情報が、糞便試料と共に収集された。ショットガンシーケンシング及び１６Ｓ ｒＲＮＡアンプリコンシーケンシングが糞便に対して実行され、糞便代謝産物がガスクロマトグラフィー（ＧＣ）質量分析（ＭＳ）及び液体クロマトグラフィー（ＬＣ）質量分析（ＭＳ）により解析された。タウリン抱合型７５セレン（Ｓｅ）放射標識ホモコール酸（ＳｅＨＣＡＴ）の保持率により胆汁酸吸収不良（ＢＡＭ）が下痢を有する患者において同定された。
結果：糞便メタボロミクスにより、ＢＡＭがＩＢＳ患者内で正確に区別された。
結論：ＢＡＭは、ＩＢＳ患者からの種シグネチャ、メタゲノミクスシグネチャ、及び、糞便メタボロミクスシグネチャにより同定され得る。これらの発見は、ＢＡＭを診断するのに、ならびにＩＢＳ及びＢＡＭの正確な治療薬を開発するのに有用である。
実施例１．胆汁酸吸収不良（ＢＡＭ）を有するＩＢＳ患者の糞便マイクロバイオーム及びメタボローム解析
材料及び方法
対象の募集：ローマＩＶ基準を満たすＩＢＳを有する１６～７０歳の８０人の患者が、Ｃｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌで募集された。患者の臨床的サブタイプ分類（２１）は、以下の通りであった：便秘型ＩＢＳ（ＩＢＳ－Ｃ）、混合型ＩＢＳ（ＩＢＳ－Ｍ）、または下痢型ＩＢＳ（ＩＢＳ－Ｄ）。同じ年齢範囲の、かつ同じ民族性及び地理的領域の６５人の対照が募集された。試験集団の記述統計を表４に示す。
除外基準は、試験登録前の６週間内での抗生物質の使用、胃腸疾患を含む他の慢性疾患、重度の精神疾患、ヘルニア修復または虫垂切除以外の腹部手術を含んでいた。最近の結果が利用可能でない場合に、標準的な血液分析が全ての参加者に対して実施され、小児脂肪便症を除外するために、全ての対象は血清学的に検査された。対照集団の選択／除外基準は、ＩＢＳについてローマＩＶ基準を満たすことを除いてＩＢＳ集団と同じであった。胃腸（ＧＩ）症状歴、精神症状、食事、病歴及び投薬データが、各参加者（ＩＢＳ及び対照の両方）について以下の質問表を使用して収集された：ブリストル便性状スコア（ＢＳＳ）、（２２）病院不安及びうつ尺度（ＨＡＤＳ）；（２３）食物摂取頻度質問票（ＦＦＱ）。下痢を報告したＩＢＳ－Ｄ及びＩＢＳ－Ｍ患者ならびに同意が得られた対照対象のサブセットは、ＢＡＭの臨床診断に使用され、細菌により代謝されず、内因性の胆汁酸のように腸肝循環を通過する、放射標識された合成胆汁酸であるＳｅＨＣＡＴにより胆汁酸吸収不良について評価された。試験を始める前に試験の倫理的承認を、Ｃｏｒｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより得た（プロトコール番号：４ＤＣ００１）。全ての参加者は、参加するための署名されたインフォームドコンセントを提供した。
試料収集：マイクロバイオーム及びメタボロミクスプロファイリングのために、糞便試料及び尿試料を全ての参加者から収集した。対象は、自宅で排泄された新鮮な糞便試料を収集キットを使用して収集し、新鮮な尿試料が収集される日に診療所に試料を持って来た。試料は、試料収集の数時間以内の－８０℃での保存のために検査室に持ってこられるまで４℃で維持された。
マイクロバイオームプロファイリング及びメタゲノミクス：Ｂｒｏｗｎｅ ｅｔ ａｌ．（２４）により記載された方法を使用して、ゲノムＤＮＡを凍結糞便試料（０．２５ｇ）から抽出し、増幅した。Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１８）により記載された方法からの変更には、０．１ｍｍのジルコニアビーズ及び４×３．５ｍｍのガラスビーズの０．５ｇからなるビーズ破砕チューブが含まれた。糞便試料を６０秒×３サイクルでビーズ破砕により均質化し、各サイクルの間、氷上で冷却した。ゲノムＤＮＡを０．８％のアガロースゲルで可視化し、ＳｉｍｐｌｉＮａｎｏスペクトロメーター（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ（商標）、ＵＳ）を使用して定量化した。ＰＣＲマスターミックスは、２Ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｔａｑ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｒｅｌａｎｄ）及び１５ｎｇのＤＮＡを使用した。得られたＰＣＲ産物を精製し、定量化し、次いで、ＭｉＳｅｑ（２×２５０ｂｐ）ケミストリープラットフォームでのシーケンシングのために商業的供給者（ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ、Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に送付する前に等モル量の各アンプリコンをプールした。シーケンシングは、ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器で２×２５０ｂｐペアードエンドシーケンシングランを使用して実行された。
マイクロバイオームプロファイリング及びメタゲノミクス（１６Ｓアンプリコンシーケンシング）：Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用し、製造者の使用説明書に従って、微生物ＤＮＡを、１４４個の各々の凍結糞便試料のうちの０．２５ｇから抽出した（ＩＢＳ：ｎ＝８０及び対照（ｎ＝６４））。１人の対照の対象について、糞便試料が利用可能でなかった。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンの調製及びシーケンシングを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）により開発された１６Ｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｎｅｘｔｅｒａプロトコールを使用して実施した。各々のＤＮＡ糞便抽出物のうちの１５ｎｇを、ＰＣＲ及び１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３～Ｖ４可変領域を標的とするプライマーを使用し、以下の遺伝子特異的プライマーを使用して増幅した：
１６ＳアンプリコンＰＣＲフォワードプライマー（Ｓ－Ｄ－Ｂａｃｔ－０３４１－ｂ－Ｓ－１７）＝５’側（配列番号４４）
ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ
１６ＳアンプリコンＰＣＲリバースプライマー（Ｓ－Ｄ－Ｂａｃｔ－０７８５－ａ－Ａ－２１）＝５’側（配列番号４５）
ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ
アンプリコンサイズは５３１ｂｐであった。生成物を精製し、２回のアダプターＰＣＲによりフォワード及びリバースバーコードを結合させた。
マイクロバイオームプロファイリング及びメタゲノミクス（ショットガンシーケンシング）：ゲノムＤＮＡは上記の通りに抽出された。ＤＮＡの品質が０．８％アガロースゲルで確認され、Ｓｉｍｐｌｉｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して定量化された。ショットガンシーケンシングについて、各試料について１μｇ（濃度＞５ｎｇ／μｌ）の高分子量ＤＮＡが、２×２５０ｂｐペアードエンドケミストリーを使用したＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑプラットフォーム（ＨｉＳｅｑ ２５００）でのシーケンシングのためにＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｇｅｒｍａｎｙ）に送付された。これにより、２，７１４，１５８，１４４の生リード（２，６１２，２０１，５９８の加工されたリード）が返され、このうちの４５．６％が、試料当たり平均２２２，９４５個の遺伝子ファミリーに位置付けられ、平均カウント値は試料当たり８，９２４，３０２±２，５６９，３５３であった。
バイオインフォマティクス解析（１６Ｓアンプリコンシーケンシング）：Ｍｉｓｅｑ １６Ｓシーケンシングデータが１４４人の対象について返された。３つの試料（２人のＩＢＳ及び１人の対照）について生成されたデータは、シーケンシングにより返されたリード数が解析するのにあまりに少なかったため除去され、１４１個の試料（対照：ｎ＝６３、ＩＢＳ ｎ＝７８）が残された。ｆｌａｓｈ法（２５）を使用してアンプリコン配列生データがマージされ、リードがトリミングされた。ＯＴＵテーブルを生成するために、ＵＳＥＡＲＣＨパイプラインが使用された（２６）。９７％の類似性でＯＴＵに配列をクラスター化するために、ＵＰＡＲＳＥアルゴリズムが使用された（２７）。キメラ配列（２８）を除去するために、ＵＣＨＩＭＥキメラ除去アルゴリズムが、Ｃｈｉｍｅｒａｓｌａｙｅｒと共に使用された。代表的なＯＴＵ配列（２６）に分類を割り当てるために、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＤＰ）分類子が使用され、微生物叢の組成情報（存在量及び多様性）が生成された。
バイオインフォマティクス解析（ショットガンメタゲノムシーケンシング）：ショットガンメタゲノミクスについて、６つの対照試料が、データがＱＣを通過しなかったか、または利用可能な試料でないためにシーケンシングされなかった（対照：ｎ＝５９；ＩＢＳ：ｎ＝８０）。シーケンシング後に得られた生リードペアの数は、５，２４７，０１３から２１，２８０，７２３までの間で変化した（平均＝９，７６３，１５９±２，４０８，０４８）。リードは、Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＨＭＰ） Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２９）の標準操作手順に従って処理された。メタゲノム組成及び機能プロファイルが、ＨＵＭＡｎＮ２パイプライン（３０）を使用して生成された。各試料について、クレード特異的遺伝子情報による微生物組成プロファイル（ＭｅｔａＰｈｌＡｎ２を使用する）及び遺伝子ファミリー存在量が含まれる、複数のプロファイルが取得された。
糞便ＧＣ／ＬＣ－ＭＳ：１ｇの凍結糞便試料を、Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ（現在はＭｅｔａｂｏｌｏｎ）、Ｐｏｔｓｄａｍ、Ｇｅｒｍａｎｙにドライアイス詰めで送付した。ＬＣＭＳについて、試料は乾燥され、分析前に４００μｌ当たり１０ｍｇの最終濃度に再懸濁された。ＧＣ－ＭＳ及びＳＣＦＡ解析は、湿潤試料を使用して実行された。非標的型メタボロミクス解析を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を使用して実行し、代謝産物をエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）を使用して同定した。ＳＣＦＡ解析もＬＣ－タンデム型質量分析により実行した。
糞便メタボロームデータのバイオインフォマティクス解析：全てのＩＢＳ対象（ｎ＝８０）及び２つを除く（これらはＱＣを通過しなかったか、または試料が利用可能でなかった）全ての対照（ｎ＝６３）の糞便ＭＳメタボロミクスデータが返された。２，９３３種の代謝産物が、サービスプロバイダーにより実施された非標的型糞便メタボロミクス解析により返され、このうちの７５３種が同定された。ＬＣ－ＭＳを使用して同定された代謝産物は、糞便試料が試料調製において、すでに乾燥重量（４００μｌ当たり１０ｍｇ）で正規化されていたため、正規化されなかった。ＧＣ－ＭＳを使用して同定された代謝産物は、対応する試料の湿重量で正規化された。同定された代謝産物のみが更なる解析での使用を考慮された。機械学習解析が下記で述べる様に実施された。全てのデータセットについて要約統計量が、多重検定のためにｑ値の調整を行うウィルコクソン順位和検定を使用して生成された。
ＢＡＭ ＳｅＨＣＡＴアッセイ：ＳｅＨＣＡＴは、０．１ｍｇ未満のタウロセルコール酸（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）を含有し、基準日での３７０ｋＢｑの放射能用量を有する単回用量カプセルとしてＣｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌで投与された。コリメートされていないガンマカウンター（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｅｃａｍカメラ）を使用したベースライン全身吸収の読み取りが、カプセル投与の２～３時間後に各対象について行われた。フォローアップスキャンが７日後に行われ、胆汁酸保持率が計算された。Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（３１）により述べられたように、＜１５％の保持値は軽度から重度のＢＡＭを示し、１５～２０％のＳｅＨＣＡＴスコアは境界群への分類を意味する。
機械学習：インハウス機械学習パイプラインは、最小絶対収縮及び選択演算子（ＬＡＳＳＯ）による特徴選択を適用し、続いて、ランダムフォレスト（ＲＦ）モデリング（３２）を適用する２段階の手法を使用して、各データ種類（１６Ｓ、ショットガン、及びＢＡＭ－糞便ＭＳメタボロミクス）に適用された。モデルは、Ｒソフトウェアバージョン３．４．０を使用し、ＬＡＳＳＯによる特徴選択のためのｇｌｍｎｅｔパッケージバージョン２．０－１０、及びＲＦのｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔパッケージバージョン４．６－１２を使用して実装された。
最初に、関連する特徴を効率的に選択することによりモデルの精度及び解釈可能性を改善するために、特徴選択がＬＡＳＳＯアルゴリズムを使用して実行された。このプロセスは、λパラメータにより調整され、これはグリッドサーチを使用して各データセットについて最適化された。訓練データは、ＬＡＳＳＯアルゴリズムにより選択された特徴のみを含むようにフィルタリングされ、次いで、ＲＦがモデリングのために使用され、これにより、１５００本の木が構築された。ＬＡＳＳＯによる特徴選択及びＲＦモデリングの両方が、１０分割交差検証（ＣＶ）を使用して実行され、これにより、試料のＩＢＳまたは対照への分類を予測する最適モデルをもたらす内部１０分割予測が生成された。
ＢＡＭ－糞便メタボロミクスデータ解析について、機械学習は、１０分割交差検証の代わりに１個抜き（ＬＯＯ）ＣＶが全ての交差検証ステップで使用されたことのみが異なる同様の方法で実行された。
モデル１：ＩＢＳ及び対照対象についてＢＡＭ（境界型から重度のＢＡＭまたはＳｅＨＣＡＴ保持率＜２０％）または正常な胆汁酸（ＳｅＨＣＡＴ保持率＞２０％）。
モデル２：ＩＢＳ対象のみについてＢＡＭ（軽度から重度のＢＡＭまたはＳｅＨＣＡＴ保持率＜１５％）または正常な胆汁酸（ＳｅＨＣＡＴ保持率＞２０％）。
データ種類の共慣性分析：マイクロバイオームから得られたデータセットはＨｅｌｌｉｎｇｅｒ変換された。共慣性分析は、Ｒ（バージョン３．２．０）のａｄｅ４（バージョン１．７．２）パッケージを使用して実行された。主成分分析（ＰＣＡ）は、比較ペアにおけるプロファイルの各々に対して実行され、続いて、これらのＰＣＡオブジェクトに対し、最初の５つの主軸に関して共慣性分析が実行された。共慣性の有意性は、ｒａｎｄｔｅｓｔ関数を使用した並べ替え検定により計算された。
結果
胆汁酸吸収不良を有するＩＢＳ患者は、変化した糞便マイクロバイオームを有する
ＩＢＳ－Ｄを有する一部の患者は、通過時間及びおそらく微生物叢の組成に影響を与える胆汁酸吸収不良（ＢＡＭ）を有し得るため、ＩＢＳ－Ｄを有する１９／２１人の患者、ＩＢＳ－Ｍを有する２６／２９人の対象、及び９／６５人の対照が、ＢＡＭを同定するためのゴールドスタンダードであるＳｅＨＣＡＴ保持率（３３）について試験された。現行のガイドライン（３４）に従って、標識された胆汁酸アナログのうちの＞１５％を保持できなければＢＡＭと分類され、１０～１５％の保持率は軽度ＢＡＭと分類され、５～１０％は中等度ＢＡＭと分類され、＜５％は重度ＢＡＭと分類された（図１ａ）。
試験された４５人のＩＢＳ患者（５４％）のうちの１８人がＢＡＭと診断され、このうち４人が重度ＢＡＭを有し、７人が中等度ＢＡＭを有し、７人が軽度ＢＡＭを有していた。更に５人の患者が境界型ＢＡＭ（１６～２０％の保持）であった。１５％の閾値を使用して、ＢＡＭ陽性分類は、試験されたＩＢＳ集団の４０％において報告された。軽度ＢＡＭは１人の対照対象で同定され、この対照対象はその後にＩＢＳと診断された。予想通りに、ＢＡＭ陽性診断は、ＩＢＳ－Ｍ（３５％）と比べてＩＢＳ－Ｄ（７４％）においてより一般的であった（ｐ値＝０．０３）（図１ｂ）。
重度ＢＡＭカテゴリーのＩＢＳ患者のみが、それらの微生物叢における、正常、軽度ＢＡＭ、中等度ＢＡＭ、または境界型ＢＡＭと診断された患者の微生物叢からの明白な分離を示した（上述した分析を使用、図１ｃを参照のこと）。更にＢＡＭの生物学的影響を調査するために、非標的型糞便代謝産物解析が（上述したように）ＧＣ－ＭＳ及びＬＣ－ＭＳにより実行された。重度ＢＡＭと診断されたＩＢＳ患者の糞便メタボロームは、ＳｅＨＣＡＴアッセイを受けたＩＢＳを有する患者における他のＢＡＭクラスのそれと有意に異なった（図１ｄ）。糞便メタボロームデータに適用された機械学習は、ＩＢＳ患者及び対照のテストセットにおける全てのＢＡＭクラス（境界型を含む）の検出について、０．９２のＡＵＣでＢＡＭを成功裡に予測した。モデルは、重度及び中等度ＢＡＭについて１００％（感度：０．８０及び特異性：０．８６）、軽度ＢＡＭについて６２．５％、及び境界型ＢＡＭについて６０％の精度で機能した（図２及び表１）。ＢＡＭを予測する主な代謝産物には、Ｌ－リジン、２種のグリセロリン脂質、及び胆汁酸（ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ））が含まれた。これらのカテゴリーの化合物のレベル上昇は、脂肪酸代謝の変化及び疾患に関連付けられている（３５）、（３６）。
マイクロバイオームＯＴＵデータセットに適用された機械学習はＢＡＭを同定した（ＡＵＣ：０．９５、感度：０．８８、及び特異性：０．９３）（表２）。メタボロミクスモデルは重度及び中等度ＢＡＭについて１００％の精度で機能した一方で、ＯＴＵモデルは、糞便メタボロミクスモデル（９個）と比較してより少ない誤分類（５個）をもたらした。モデル間で誤分類された対象は重複しなかった。このことは、組み合わされたマイクロバイオーム－メタボロームモデルがＢＡＭ予測精度を増加させることを示す。
考察
重度胆汁酸吸収不良を有するＩＢＳ－Ｄ及びＩＢＳ－Ｍ患者のサブセットは、変化したマイクロバイオーム及び糞便メタボロームを有することが示された。
臨床的ＩＢＳサブタイプ間でマイクロバイオームには有意な差はなく、患者をこれらの分類に割り当てる臨床的有用性は疑問の余地がある。しかしながら、マイクロバイオーム及びメタボロームシグネチャにより区別可能である、ＢＡＭを有するＩＢＳ－Ｄ及びＩＢＳ－Ｍ患者のサブセットが同定された。他には、ＩＢＳ－Ｄにおける変化した微生物叢が報告されているが、ＢＡＭを層別化しなかった（１５）。通過時間（ブリストル便性状スコアに反映される）は、微生物叢の組成との主要な共変量である（３７）が、混合、便秘、及び下痢サブタイプ間を行き来するＩＢＳ患者の傾向が微生物叢の通過時間との関連性をマスクまたは「平均化」し得ることも注目に値する。にもかかわらず、３つ全てのサブタイプは、共通の糞便マイクロバイオームシグネチャにより対照と区別され得る。ＢＡＭは、ＳｅＨＣＡＴにより試験されたＩＢＳ－Ｄ及びＭ対象の総計の過半数で検出された。マイクロバイオームにおける差は重度ＢＡＭ群で最も明白であった。ＢＡＭを有するかなりの数の対象が存在することが認識されていないことが、様々なＩＢＳ治療薬の以前の治験（３８）におけるプラセボと比較して低い処置の成功率に寄与した可能性がある。重度ＢＡＭカテゴリーの対象は有意に変化したマイクロバイオームを有していた一方で、糞便メタボロミクスシグネチャは、全てのＢＡＭと診断された対象で同定された。ＢＡＭのこの糞便メタボロミクスシグネチャは、ＳｅＨＣＡＴ（これはＵＳＡにおいて現在利用可能でない）より便利であり、利用しやすく、かつ安価である計測手段を必要とするため、容易に臨床応用されるであろう。
実施例２．代替的機械学習パイプラインによる胆汁酸吸収不良（ＢＡＭ）を有するＩＢＳ患者の糞便メタボローム解析
材料及び方法
対象の募集：ローマＩＶ基準を満たすＩＢＳを有する１６～７０歳の８０人の患者が、Ｃｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌで募集された。患者の臨床的サブタイプ分類（２１）は、以下の通りであった：便秘型ＩＢＳ（ＩＢＳ－Ｃ）、混合型ＩＢＳ（ＩＢＳ－Ｍ）、または下痢型ＩＢＳ（ＩＢＳ－Ｄ）。同じ年齢範囲の、かつ同じ民族性及び地理的領域の６５人の対照が募集された。試験集団の記述統計を表４に示す。
除外基準は、試験登録前の６週間内での抗生物質の使用、胃腸疾患を含む他の慢性疾患、重度の精神疾患、ヘルニア修復または虫垂切除以外の腹部手術を含んでいた。最近の結果が利用可能でない場合に、標準的な血液分析が全ての参加者に対して実施され、小児脂肪便症を除外するために、全ての対象が検査された。対照集団の選択／除外基準は、ＩＢＳについてローマＩＶ基準を満たすことを除いてＩＢＳ集団と同じであった。胃腸（ＧＩ）症状歴、精神症状、食事、病歴及び投薬データが、各参加者（ＩＢＳ及び対照の両方）について以下の質問表を使用して収集された：ブリストル便性状スコア（ＢＳＳ）、（２２）病院不安及びうつ尺度（ＨＡＤＳ）；（２３）食物摂取頻度質問票（ＦＦＱ）。下痢を報告したＩＢＳ－Ｄ及びＩＢＳ－Ｍ患者ならびに同意が得られた対照対象のサブセットは、ＢＡＭの臨床診断に使用され、細菌により代謝されず、内因性の胆汁酸のように腸肝循環を通過する、放射標識された合成胆汁酸であるＳｅＨＣＡＴにより胆汁酸吸収不良について評価された。試験を始める前に試験の倫理的承認を、Ｃｏｒｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより得た（プロトコール番号：４ＤＣ００１）。全ての参加者は、参加するための署名されたインフォームドコンセントを提供した。
試料収集：メタボロミクスプロファイリングのために、糞便試料及び尿試料を全ての参加者から収集した。対象は、自宅で排泄された新鮮な糞便試料を収集キットを使用して収集し、新鮮な尿試料が収集される日に診療所に試料を持って来た。試料は、試料収集の数時間以内の－８０℃での保存のために検査室に持ってこられるまで４℃で維持された。
糞便ＧＣ／ＬＣ－ＭＳ：１ｇの凍結糞便試料を、Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ（現在はＭｅｔａｂｏｌｏｎ）、Ｇｅｒｍａｎｙ Ｐｏｔｓｄａｍにドライアイス詰めで送付した。ＬＣＭＳについて、試料は乾燥され、分析前に４００μｌ当たり１０ｍｇの最終濃度に再懸濁された。ＧＣ－ＭＳ及びＳＣＦＡ解析は、湿潤試料を使用して実行された。非標的型メタボロミクス解析を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及び固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を使用して実行し、代謝産物をエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）を使用して同定した。ＳＣＦＡ解析もＬＣ－タンデム型質量分析により実行した。
糞便メタボロームデータのバイオインフォマティクス解析：全てのＩＢＳ対象（ｎ＝８０）及び２つを除く（これらはＱＣを通過しなかったか、または試料が利用可能でなかった）全ての対照（ｎ＝６３）のＭＳ糞便メタボロミクスデータが返された。２，９３３種の代謝産物が、サービスプロバイダーにより実施された非標的型糞便メタボロミクス解析により返され、このうちの７５３種が同定された。ＬＣ－ＭＳを使用して同定された代謝産物は、糞便試料が試料調製において、すでに乾燥重量（４００μｌ当たり１０ｍｇ）で正規化されていたため、正規化されなかった。ＧＣ－ＭＳを使用して同定された代謝産物は、対応する試料の湿重量で正規化された。同定された代謝産物のみが更なる解析での使用を考慮された。機械学習解析が下記で述べる様に実施された。全てのデータセットについて要約統計量が、多重検定のためにｑ値の調整を行うウィルコクソン順位和検定を使用して生成された。
ＢＡＭ ＳｅＨＣＡＴアッセイ：ＳｅＨＣＡＴは、０．１ｍｇ未満のタウロセルコール酸（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）を含有し、基準日での３７０ｋＢｑの放射能用量を有する単回用量カプセルとしてＣｏｒｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌで投与された。コリメートされていないガンマカウンター（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｅｃａｍカメラ）を使用したベースライン全身吸収の読み取りが、カプセル投与の２～３時間後に各対象について行われた。フォローアップスキャンが７日後に行われ、胆汁酸保持率が計算された。Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）（３１）により述べられたように、＜１５％の保持値は軽度から重度のＢＡＭを示し、１５～２０％のＳｅＨＣＡＴスコアは境界群への分類を意味する。
機械学習：インハウス機械学習パイプラインが糞便メタボロミクスデータに適用された。この実施例で使用された機械学習パイプラインは、実施例１で使用された機械学習パイプラインと同様であるが、１０分割交差検証内での２ステップの手法を使用した追加の最適化及び検証ステップを含んでいた。各検証分割内で、最小絶対収縮及び選択演算子（ＬＡＳＳＯ）による特徴選択が実施され、続いて、ランダムフォレスト（ＲＦ）モデリングが実施され、最適化されたモデルが、交差検証訓練サブセットの外部にある交差検証テストデータに照らして検証された。
モデルは、Ｒソフトウェアバージョン３．４．０を使用し、ＬＡＳＳＯによる特徴選択のためのｇｌｍｎｅｔパッケージバージョン２．０－１０、及びＲのｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔパッケージバージョン４．６－１２を使用して実装された。
糞便試料メタボロームプロファイルは、機械学習パイプラインで解析される前にｌｏｇ１０変換された。ＳｅＨＣＡＴの情報を有するＩＢＳ試料のみが変換された。次いで、境界型ＢＡＭを有する試料が除去され、残りの試料がＢＡＭ（１９個の試料）または正常（２１個の試料）に分類された。次いで、分類された試料は、機械学習パイプラインで解析された。
図３は、この実施例で使用される機械学習パイプラインを示す。分類された糞便試料メタボロームプロファイルは、最初に訓練セット及びテストセットに分割された。次いで、訓練セットは、ＬＡＳＳＯアルゴリズムで使用するための最適ラムダ（λ）範囲を生成するために使用された。最適ラムダ（λ）範囲は、以前に記載された交差検証されたＬＡＳＳＯを使用し、ｇｌｍｎｅｔパッケージ（バージョン２．０－１８）を使用して生成された。最適ラムダ（λ）範囲の事前決定は、パイプラインを実行する計算時間を低減し、ユーザが手作業で範囲を指定する必要性をなくす。
ラムダ（λ）範囲の決定後、試料は、それらのクラス確率に基づいて重みを割り当てられた。このステップで訓練サンプルに割り当てられる重みは、その後に適用される全てのステップで使用された。
次いで、実施例１において大体が記載されたＬＡＳＳＯアルゴリズムが、重み付き訓練サンプルに適用された。この実施例では、ＬＡＳＳＯアルゴリズムには、事前に計算された最適ラムダ（λ）範囲が使用され、Ｃａｒｅｔ（この実施例ではバージョン６．０－８４）及びｇｌｍｎｅｔ（この実施例ではバージョン２．０－１８）パッケージが使用された。ＲＯＣ ＡＵＣ（受信者動作特性曲線下面積）メトリックが、１個抜き交差検証を使用して計算された。１個抜き交差検証は、モデル最適化に利用可能な試料数を最大化するために使用された。最適化されたＬＡＳＳＯアルゴリズムにより同定された特徴係数が抽出され、ゼロでない係数を有する特徴が更なる解析のために選択された。図３において、ＮはＬＡＳＳＯアルゴリズムにより返された特徴の数を指す。ＬＡＳＳＯにより選択された特徴の数が５未満であった場合、全ての特徴（プレＬＡＳＳＯ）がランダムフォレストを生成するために使用された（すなわち、ＬＡＳＳＯフィルタリングは、ランダムフォレスト生成プログラムにより無視された。ＬＡＳＳＯにより選択された特徴の数が５以上であった場合、ＬＡＳＳＯにより選択されたそれらの特徴のみがランダムフォレストの生成のために使用された。
ＬＡＳＳＯを使用した特徴選択後に、最適化されたランダムフォレスト分類子（１５００本の木を有する）が、選択された特徴を使用して生成された。ランダムフォレスト生成は、Ｃａｒｅｔ（バージョン６．０－８４）及び内部交差検証を使用して実行され、ＲＯＣ ＡＵＣメトリックを最大化するために、「ｍｔｒｙ」パラメータが調整された。次いで、最適化されたランダムフォレスト分類子がテストセットに適用され、分類子の性能は、ＡＵＣ、感度、及び特異性メトリックにより計算された。
結果
糞便メタボロームはＢＡＭクラスを予測する
糞便メタボロームプロファイルが、試料をＢＡＭまたは非ＢＡＭに分類する予測能力について調査された。交差検証は１個抜きＣＶであった。１個抜きＣＶは、モデル最適化に利用可能な最大限の試料数を確保にするために使用された。
機械学習は、ＳｅＨＣＡＴアッセイを受けたＩＢＳ患者の糞便メタボロームデータセットに適用されたが、境界型ＢＡＭと診断された患者は除外された。予測モデルは、３つ全てのＢＡＭ重症度において０．８５のＡＵＣでＢＡＭを有する対象を成功裡に同定した。モデルは、重度ＢＡＭについて１００％、中等度ＢＡＭについて７５％、及び軽度ＢＡＭについて４３％の精度で機能した。性能の概要及び特徴の詳細を表７に記載し、図４に示す。ゼロ未満の係数を有するＬＡＳＳＯにより選択された特徴はＢＡＭに関連し、一方で正の係数は正常に関連する。交差検証の結果は、糞便メタボロームプロファイルがＢＡＭを予測することを示唆する。総合的なテスト性能は、０．８５２のＡＵＣ、０．６８４の感度、０．７６２の特異性、及び０．７２５の精度であり、誤分類数は１１であった（表７）。
最大限の感度及び特異性を達成するために、ｐＲＯＣパッケージ（バージョン１．１５．０）及びＹｏｕｄｅｎのＪスコアを使用して分類閾値が最適化された。得られた最適化された感度及び特異性の値は、それぞれ０．６８４及び０．９０４であった。
このパイプラインを使用して、ＢＡＭを予測すると同定された代謝産物を表７に列挙する。主な予測的代謝産物の中には、様々なグリセロリン脂質があった。これらの化合物のレベルの上昇は、脂肪酸代謝の変化及び疾患に関連付けられている。ＢＡＭを予測する主な代謝産物の中には、１，３－ジ－（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ－エイコサペンタノイル）－２－ヒドロキシ－グリセロール（ｄ５）及びジメチルベンジルカルビニルブチレートがあった。
考察
機械学習解析により、糞便メタボロームがＩＢＳにおけるＢＡＭの状態を予測することが示された。胆汁酸吸収不良を有するＩＢＳ－Ｄ及びＩＢＳ－Ｍ患者のサブセットが変化した糞便メタボロームを有し、場合によっては、これはＳｅＨＣＡＴ試験を必要とせずにこれらの対象を区別するために使用され得ることを示している。
臨床的ＩＢＳサブタイプ間でマイクロバイオームには有意な差はなく、患者をこれらの分類に割り当てる臨床的有用性は疑問の余地がある。しかしながら、メタボロームシグネチャにより区別可能である、ＢＡＭを有するＩＢＳ－Ｄ及びＩＢＳ－Ｍ患者のサブセットが同定された。他には、ＩＢＳ－Ｄにおける変化した微生物叢が報告されているが、ＢＡＭを層別化しなかった（１５）。ＢＡＭは、ＳｅＨＣＡＴにより試験されたＩＢＳ－Ｄ及びＭ対象の総計の過半数で検出された。マイクロバイオームにおける差は重度ＢＡＭ群で最も明白であった。ＢＡＭを有するかなりの数の対象が存在することが認識されていないことが、様々なＩＢＳ治療薬の以前の治験（３８）におけるプラセボと比較して低い処置の成功率に寄与した可能性がある。重度ＢＡＭカテゴリーの対象は有意に変化したマイクロバイオームを有していた一方で、糞便メタボロミクスシグネチャは、全てのＢＡＭと診断された対象で同定された。ＢＡＭのこの糞便メタボロミクスシグネチャは、ＳｅＨＣＡＴ（これはＵＳＡにおいて現在利用可能でない）より便利であり、利用しやすく、かつ安価である計測手段を必要とするため、容易に臨床応用されるであろう。
ＢＡＭの糞便メタボロミクスシグネチャを認識するための上記したパイプラインも、ＳｅＨＣＡＴより便利であり、利用しやすく、かつ安価である計測手段を同様に利用するため、臨床応用されるであろう。
結論
この研究の発見は臨床的意義を有する。糞便メタボロームプロファイルは、ＢＡＭと関連付けられ、ＢＡＭをＢＡＭに関連しないＩＢＳと正確に区別することができる。
この実施例で同定されたＢＡＭ対象をＢＡＭに関連しないＩＢＳ対象と区別する分類群及び代謝産物は、微生物叢に対して指向された様々な治療法、例えば、糞便移植、抗生物質、プロバイオティクス、または生きた生物学的製剤により標的とされ得る。
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Claims (15)

  1. 患者の胆汁酸吸収不良（ＢＡＭ）を診断する方法であって、
    ａ．ＢＡＭに関連する分類群の細菌株、または
    ｂ．ＢＡＭに関連する代謝産物
    を検出することを含む、前記方法。
  2. 前記方法が、ＢＡＭに関連する分類群の細菌株及びＢＡＭに関連する代謝産物を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細菌株が、ラクノスピラ科、バクテロイデス科、ルミノコッカス科、 ビフィドバクテリウム科、 プレボテラ科、ベイヨネラ科、及びコリオバクテリウム科からなるリストから選択される科のものである、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記細菌株が、ブラウティア属、バクテロイデス属、フィーカリバクテリウム属、オシリバクター属、ルミノコッカス属、ビフィドバクテリウム属、コプロコッカス属、パラプレボテラ属、ゲミガー属、ジアリスタ属、メガモナス属、及びブチリコッカス属からなるリストから選択される属のものである、請求項１または請求項２に記載の方法。
  5. 前記細菌株が、表２及び／または表５から選択される操作的分類単位（ＯＴＵ）に属する、請求項２～４に記載の方法。
  6. 前記細菌株が、配列番号１～３８のうちの１と少なくとも９７％同一である１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する、請求項１または請求項２に記載の方法。
  7. ２、５、１０、１５、または２０の細菌分類群の細菌株が検出される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記代謝産物が、ＰＧ（Ｐ－１６：０／１４：０）、２－エチルスベリン酸、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ、１，２，３－Ｔｒｉｓ（１－エトキシエトキシ）プロパン、ＰＧ（Ｏ－３０：１）、ウルソデオキシコール酸、ＭＧ（２２：２（１３Ｚ，１６Ｚ）／０：０／０：０）、Ｌ－リジン、Ｏ－ホスホエタノールアミン、ＰＥ（２２：５（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／２４：０）、及びヘプタデカン酸からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
  9. 前記代謝産物が、１，３－ジ－（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ－エイコサペンタノイル）－２－ヒドロキシ－グリセロール（ｄ５）、ジメチルベンジルカルビニルブチレート、１－１８：０－２－１８：２－モノガラクトシルジアシルグリセロール、ＰＧ（Ｐ－１６：０／１４：０）、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ、ＰＣ（２２：２（１３Ｚ，１６Ｚ）／１５：０）、ＰＧ（３４：０）、ＰＥ（１８：３（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）／Ｐ－１８：０）、ＭＧ（２２：２（１３Ｚ，１６Ｚ）／０：０／０：０）、Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｉｌｅ、ＰＥ（２２：５（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／２４：０）、ＰＣ（１８：１（９Ｚ）／１５：０）、チオファネートメチル、Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ、１，２，３－Ｔｒｉｓ（１－エトキシエトキシ）プロパン、ＰＳ（３９：６）、２－ヒドロキシラウロイルカルニチン、ヒポキサンチン、アデノシン、ＰＣ（４０：６）、Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ、３－デヒドロキシカルニチン、イノシン、ＰＧ（Ｏ－３４：３）、１１－デオキソククルビタシンＩ、カプリン酸メチル、リノレオイルエタノールアミド、Ｈｉｓ－Ｍｅｔ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ、１－デカノール、グラベリフェロン、ウリジン、アラキジルカルニチン、グアノシン、ノニル酸メチル、３－エピデミッシジン、モモルドール、Ｎ－［２－（１Ｈ－インドール－３－イル）エチル］ドコサンアミド、カプロン酸メチル、アスコルビン酸、Ｎ－アセチル－ｌｅｕ－ｌｅｕ－ｔｙｒ、４－ヒドロキシ酪酸、［ＳＴ ジメチル（４：０／３：０）］（５Ｚ，７Ｅ，１７Ｚ）－（１Ｓ，３Ｒ）－２６，２７－ジメチル－９，１０－セコ－５，７，１０（１９），１７（２０）－コレスタテトラエン－２２－イン－１，３，２５－トリオール、Ｎ－メチルインドロ［３，２－ｂ］－５α－コレスト－２－エン、及びγ－グルタミル－Ｓ－メチルシステイニル－β－アラニンからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
  10. 前記代謝産物が、ＰＧ（Ｐ－１６：０／１４：０）、２－エチルスベリン酸、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ、１，２，３－Ｔｒｉｓ（１－エトキシエトキシ）プロパン、ＰＧ（Ｏ－３０：１）、ウルソデオキシコール酸、ＭＧ（２２：２（１３Ｚ，１６Ｚ）／０：０／０：０）、Ｌ－リジン、Ｏ－ホスホエタノールアミン、ＰＥ（２２：５（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／２４：０）、ヘプタデカン酸、１，３－ジ－（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ－エイコサペンタノイル）－２－ヒドロキシ－グリセロール（ｄ５）、ジメチルベンジルカルビニルブチレート、１－１８：０－２－１８：２－モノガラクトシルジアシルグリセロール、ＰＣ（２２：２（１３Ｚ，１６Ｚ）／１５：０）、ＰＧ（３４：０）、ＰＥ（１８：３（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）／Ｐ－１８：０）、Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｇｌｎ－Ｉｌｅ、ＰＣ（１８：１（９Ｚ）／１５：０）、チオファネートメチル、Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ、ＰＳ（３９：６）、２－ヒドロキシラウロイルカルニチン、ヒポキサンチン、アデノシン、ＰＣ（４０：６）、Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ、３－デヒドロキシカルニチン、イノシン、ＰＧ（Ｏ－３４：３）、１１－デオキソククルビタシンＩ、カプリン酸メチル、リノレオイルエタノールアミド、Ｈｉｓ－Ｍｅｔ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ、１－デカノール、グラベリフェロン、ウリジン、アラキジルカルニチン、グアノシン、ノニル酸メチル、３－エピデミッシジン、モモルドール、Ｎ－［２－（１Ｈ－インドール－３－イル）エチル］ドコサンアミド、カプロン酸メチル、アスコルビン酸、Ｎ－アセチル－ｌｅｕ－ｌｅｕ－ｔｙｒ、４－ヒドロキシ酪酸、［ＳＴ ジメチル（４：０／３：０）］（５Ｚ，７Ｅ，１７Ｚ）－（１Ｓ，３Ｒ）－２６，２７－ジメチル－９，１０－セコ－５，７，１０（１９），１７（２０）－コレスタテトラエン－２２－イン－１，３，２５－トリオール、Ｎ－メチルインドロ［３，２－ｂ］－５α－コレスト－２－エン、及びγ－グルタミル－Ｓ－メチルシステイニル－β－アラニンからなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
  11. 前記方法が重度ＢＡＭを診断するためのものである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記患者が、ＩＢＳ、神経性食欲不振症、または炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎またはクローン病に罹患しているとすでに診断されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 請求項１～１２のいずれかに記載の方法を実行するための試薬を含むキット。
  14. 請求項２～６に定義される細菌株及び／または請求項８に定義される代謝産物のうちの２もしくは３以上を検出するための試薬を含むキット。
  15. 糞便試料を分析するように構成される、請求項１３または１４に記載のキット。
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