CN114127317A - 诊断疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供用于诊断BAM的新的且改进的方法。

Description

诊断疾病的方法
技术领域
本发明涉及诊断领域且具体地涉及胆酸吸收不良(BAM)的诊断。
背景技术
胆酸吸收不良(BAM)是若干肠相关问题(尤其是慢性腹泻)的原因。它可能由继发于胃肠道疾病的吸收不良所致或者为原发性病症，与过量的胆酸产生有关。一部分被错误诊断为患有腹泻型肠易激综合征(IBS-D)及交替型或混合型肠易激综合征(IBS-M)的患者实际上患有BAM(1,2)，其治疗与针对肠易激综合征(IBS)的治疗不同(3)。重要的是，BAM是与IBS临床上不同的实体，不是所有患有BAM的患者均患有IBS，且不是所有IBS患者均患有BAM。据估计，BAM占患有功能性腹泻或腹泻型肠易激综合征(IBS-D)的患者的25％至50％且群体中有1％患有它(4)。
BAM可用胆酸螯合剂(sequestrant)进行治疗。胆酸在肝中产生，被分泌至胆道系统中，储存在胆囊中且在进餐之后通过胆囊收缩素的刺激而释放。通常超过95％的胆酸经末端回肠吸收且由肝吸收并重新分泌。当大量胆酸进入大肠时，它们刺激结肠中的水分泌及肠蠕动，从而引起慢性腹泻症状。包括顶端钠依赖性胆酸运输蛋白(ASBT，IBAT，基因符号SLC10A2)、细胞质回肠胆酸结合蛋白(IBABP，ILBP，基因符号FABP6)及OSTα与OSTβ的底侧异二聚体的胆酸运输蛋白运输胆酸。若这些运输蛋白的表达减少，则肠不太能吸收胆酸(1型胆酸吸收不良)。若肠蠕动受到胃肠手术的影响，或胆酸因小肠细菌过度生长而去结合，则吸收效率较低(3型胆酸吸收不良)。原发性胆酸腹泻(2型胆酸“吸收不良”)可能由胆酸过度产生引起。很小部分的未患有明显疾病(2型胆酸吸收不良)的患者可能具有ASBT突变。
BAM可通过75硒(Se)高胆酸牛磺酸(SeHCAT)测试进行诊断，所述测试检测再吸收及代谢胆酸的能力缺乏。所述测试涉及施用放射性标记胆汁化合物并在一周后测量其保留(5)。BAM是与IBS临床上不同的实体，IBS可通过例如用胆酸螯合剂成功地管理。SeHCAT测试是临床中针对BAM诊断的确定性测试(6)，其价格昂贵且不是广泛可用的。
IBS是一种影响消化系统的常见疾患。症状包括痉挛、腹胀、腹泻及便秘且在很长的一段时间(通常数年)内发生。IBS患者中常见诸如焦虑、重度抑郁及慢性疲劳综合征的病症。目前尚未知IBS的治愈方法且治疗通常是为了改善症状而进行。治疗可包括饮食变化、用药、益生菌和/或心理辅导。通常建议作为治疗方法的饮食措施包括：增加可溶性纤维摄入；无麸质饮食；或短期低可发酵寡糖、双糖、单糖及多元醇(FODMAP)的饮食。用药洛哌丁胺(loperamide)用于帮助治疗腹泻，而泻药用于帮助治疗便秘。抗抑郁剂可改善整体症状及疼痛。像大多数慢性非传染性病症一样，IBS似乎是异质性的(7)。其严重程度范围从恼人的肠紊乱到社交失能，伴有明显的症状异质性(8)。尽管经常被视为脑-肠轴的病症(9,10)，但尚不清楚IBS是起于肠，还是起于脑，还是两者。感染后IBS的发生(11)表明，一部分病例起始于终末器官(end-organ)，但具有易感性风险因素，其中一些可能为社会心理因素。微生物组(microbiome)科学的进步，以及出现针对微生物群(microbiota)对神经发育及可能对行为的影响不断变化的证据，将心/身联系的概念拓宽成涵盖微生物群-肠-脑轴(12)。但是，理解及治疗IBS的进步受到不存在可靠的生物标志物的限制，且IBS仍通过症状来定义。此外，目前基于主导症状(腹泻型(IBS-D)或便秘型(IBS-C))将患者阶层化为临床亚型的方法具有显著的限制，包括无法告知有时在数天内在亚型之间交替的患者的治疗方法(13)。当对错误分类的患者开具处方时，经设计以应对截然相反症状的药剂可能产生严重的非所要的不良作用(14)。
已研究了肠症患者与对照组相比的肠道微生物群变化(15-18)。微生物组与饮食、抗生素及肠道感染(全部都可能涉及肠症)的相互作用与微生物组变化可能激活或延长综合征的病理生理机制的假说相符(19,20)。然而，缺乏将肠症患者与对照分开且有助于告知疗法的健全的微生物组识别标志(signature)或生物标志物，但是提出了针对IBS严重程度的识别标志。此外，迄今为止，大多数微生物群研究均采用16S rRNA定量分析(profiling)且不分析细菌代谢物。
需要用于诊断诸如BAM的肠症的进一步且改进的方法。还需要用于诊断已经诊断为患有具有类似症状的另一疾病(例如IBS)的患者中的肠症(诸如BAM)的进一步且改进的方法。
发明内容
发明人开发了用于诊断胆酸吸收不良(BAM)的新的且改进的方法。对患者及对照(非BAM)个体中的微生物组及代谢物体(metabolome)的全面且详细的分析允许对新的疾病指标进行鉴别。本发明提供一种诊断患者中的BAM的方法，其包括检测：与BAM有关的分类群的细菌种和/或与BAM有关的代谢物。
附图说明
图1.SeHCAT测定的受试者中的胆酸吸收不良(BAM)分布、微生物组及代谢组学概况。(A)对照及IBS患者中的SeHCAT保留率。(B)所测试的IBS-D及IBS-M患者中的BAM类别的分布。(C)微生物群组成的PCoA，其显示在IBS患者中的BAM类别之间没有显著差异(在16SOTU水平下以Spearman距离的置换MANOVA；p值＝0.289)。(D)粪便MS代谢组学的PCoA，其显示在所测试的IBS患者中的BAM类别之间的显著差异(在16S OTU水平下以Spearman距离的置换MANOVA；p值<0.001)。
图2.基于粪便代谢物及随机森林，对SeHCAT测定的受试者(IBS：n＝45；对照：n＝9)的BAM预测机率。
图3：替代性机器学习管线的核心工作流程。N代表最小绝对值收敛与选择算子(LASSO)返回的特征数。
图4：基于粪便代谢物及随机森林，对SeHCAT测定的IBS患者(IBS-BAM：n＝19；IBS非BAM：n＝21)的BAM预测机率。模型排除患有临界性BAM的IBS患者。
具体实施方式
如实例中所示，发明人开发了用于诊断胆酸吸收不良(BAM)的方法，与75硒(Se)高胆酸牛磺酸(SeHCAT)测试相比，其有效且明显更便宜、更易获得且更安全。SeHCAT测试为目前最广泛用于诊断BAM的技术，但是与本发明的方法不同，它使患者暴露于辐射，需要临床环境且非常昂贵。在SeHCAT测试中，用水经口施用含有放射性标记75SeHCAT的胶囊(具有370kBq硒-75及少于0.1mg SeHCAT)。在服用胶囊之后1-3小时随后当7天时使用非准直γ照相机取得测量值。然后计算7天时SeHCAT的保留百分比，大于15％的7天SeHCAT保留值被视为正常，且小于15％的值表示过量的胆酸损失，如胆酸吸收不良中所见。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断患有BAM的患者的方法。在具体实施方案中，本发明提供一种用于诊断患有轻度BAM的患者的方法。在具体实施方案中，本发明提供一种用于诊断患有中度BAM的患者的方法。中度BAM的特征可在于标记胆汁酸保留10％，与SeHCAT测试中类似。在具体实施方案中，本发明提供一种用于诊断患有严重BAM的患者的方法。数据显示，本发明的方法对于诊断严重BAM来说特别有效。严重BAM的特征可在于标记胆汁酸保留小于或等于5％，与SeHCAT测试中类似。在一些实施方案中，本发明的方法用于诊断经诊断为患有IBS的患者中的BAM。在一些实施方案中，本发明的方法用于诊断经诊断为患有IBS-M的患者中的BAM。在一些优选实施方案中，本发明的方法用于诊断经诊断为患有IBS-D的患者中的BAM。在具体实施方案中，本发明的方法用于诊断经诊断为患有IBS的患者中的严重BAM。
在一个实施方案中，所述方法包括基于患者的微生物群组成将患者诊断为患有严重BAM。在具体实施方案中，患有IBS及严重BAM的患者具有不同的微生物群组成。在具体实施方案中，患有严重BAM的IBS患者具有与具有正常、轻度、中度或临界性BAM诊断的IBS患者不同的微生物群组成。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断患有BAM的患者的方法，其包括检测不同的粪便代谢物体识别标志。在具体实施方案中，本发明提供一种用于诊断患有严重BAM的IBS患者的方法，其包括检测不同的粪便代谢物体识别标志。在一个实施方案中，将机器学习应用于粪便代谢物体数据以预测BAM。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断患有BAM的患者的方法，其包括检测一种或多种预测BAM的代谢物。通常，在本发明的方法中检测预测BAM或与BAM有关的代谢物包含测量样品中的代谢物的浓度或测量代谢物的浓度变化，以及任选地将浓度与对照(非BAM)个体的对应样品或相对于参考值进行比较。在具体实施方案中，在本发明的方法中检测预测BAM或与BAM有关的代谢物包含测量样品中代谢物的浓度或测量代谢物的浓度变化，以及将浓度与患有IBS的患者的对应样品进行比较。在一个实施方案中，所述一种或多种预测BAM的代谢物选自：PG(P-16:0/14:0)、2-乙基栓酸、Glu-Glu-Gly-Tyr、1,2,3-三(1-乙氧基乙氧基)丙烷、PG(O-30:1)、熊去氧胆酸(UDCA)、MG(22:2(13Z,16Z)/0:0/0:0)、L-赖氨酸、O-磷酸乙醇胺、PE(22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/24:0)和/或十七酸。在另一实施方案中，所述一种或多种预测BAM的代谢物选自：1,3-二-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-二十碳五烯酰基)-2-羟基-甘油(d5)、丁酸二甲基苄基原酯、1-18:0-2-18:2-单半乳糖基二酰基甘油、PG(P-16:0/14:0)、Glu-Glu-Gly-Tyr、PC(22:2(13Z,16Z)/15:0)、PG(34:0)、PE(18:3(6Z,9Z,12Z)/P-18:0)、MG(22:2(13Z,16Z)/0:0/0:0)、Arg-Ile-Gln-Ile、PE(22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/24:0)、PC(18:1(9Z)/15:0)、甲基硫菌灵、Asn-Ser-His-His、1,2,3-三(1-乙氧基乙氧基)丙烷、PS(39:6)、2-羟基月桂酰基肉碱、次黄嘌呤、腺苷、PC(40:6)、Asp-Phe-Phe-Val、3-脱羟基肉碱、肌苷、PG(O-34:3)、11-脱氧葫芦苦味素I、癸酸甲酯、亚油酰乙醇酰胺、His-Met-Phe-Phe、1-癸醇、云香酚内酯(Gravelliferone)、尿苷、二十烷基肉碱(Arachidylcarnitine)、鸟苷、壬酸甲酯、3-Epidemissidine、Momordol、N-[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]二十二酰胺、己酸甲酯、抗坏血酸、N-乙酰基-leu-leu-tyr、4-羟基丁酸、[ST二甲基(4:0/3:0)](5Z,7E,17Z)-(1S,3R)-26,27-二甲基-9,10-开环-5,7,10(19),17(20)-胆甾四烯-22-炔-1,3,25-三醇、N-甲基吲哚并[3,2-b]-5α-胆甾-2-烯及γ-谷氨酰基-S-甲基半胱氨酰基-β-丙氨酸。在优选实施方案中，所述方法包括检测熊去氧胆酸。在优选实施方案中，所述方法包括检测L-赖氨酸。在优选实施方案中，所述方法包括检测1,3-二-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-二十碳五烯酰基)-2-羟基-甘油(d5)。在优选实施方案中，所述方法包括检测丁酸二甲基苄基原酯。在优选实施方案中，所述方法包括检测1-18:0-2-18:2-单半乳糖基二酰基甘油。在优选实施方案中，所述方法包括检测PG(P-16:0/14:0)。在优选实施方案中，所述方法包括检测Glu-Glu-Gly-Tyr。在任何此类实施方案中，检测代谢物包含测量样品中的代谢物的相对浓度，例如相对于对照(非BAM)个体的对应样品或相对于参考值。在优选实施方案中，检测代谢物包含测量样品中的代谢物的相对浓度，例如相对于患有IBS的患者的对应样品。在一些实施方案中，所述方法包括检测上述代谢物的前体或分解产物。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断患有BAM的患者的方法，其包括检测一种或多种预测BAM的代谢物的浓度的增加。在一些实施方案中，在本发明的方法中检测预测BAM或与BAM有关的代谢物包含测量样品中的代谢物的浓度，以及任选地将浓度与对照(非BAM)个体的对应样品或相对于参考值进行比较。在一些实施方案中，与对照(非BAM)个体的对应样品相比或相对于参考值，预测BAM的代谢物的浓度较高。在具体实施方案中，在本发明的方法中检测预测BAM或与BAM有关的代谢物包含测量代谢物的浓度以及将浓度与患有IBS的患者的对应样品的浓度进行比较。在一些实施方案中，与患有IBS的患者的对应样品相比，预测BAM的代谢物的浓度较高。在具体实施方案中，所述一种或多种检测BAM的代谢物选自：1,3-二-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-二十碳五烯酰基)-2-羟基-甘油(d5)、丁酸二甲基苄基原酯、PG(P-16:0/14:0)、PG(34:0)、PE(18:3(6Z,9Z,12Z)/P-18:0)、甲基硫菌灵、PS(39:6)、Asp-Phe-Phe-Val、PG(O-34:3)、1-癸醇、3-Epidemissidine和/或Momordol。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断患有BAM的患者的方法，其包括检测一种或多种预测对照个体(非BAM)的代谢物的浓度的降低。在一些实施方案中，在本发明的方法中检测预测BAM或与BAM有关的代谢物包含测量样品中的代谢物的浓度，以及任选地将浓度与对照(非BAM)个体的对应样品或相对于参考值进行比较。在一些实施方案中，与对照(非BAM)个体的对应样品相比或相对于参考值，预测BAM的代谢物的浓度较低。在具体实施方案中，在本发明的方法中检测预测BAM或与BAM有关的代谢物包含测量代谢物的浓度以及将浓度与患有IBS的患者的对应样品的浓度进行比较。在一些实施方案中，与患有IBS的患者的对应样品相比，预测BAM的代谢物的浓度较低。在具体实施方案中，所述一种或多种预测对照(非BAM)个体的代谢物选自：1-18:0-2-18:2-单半乳糖基二酰基甘油、Glu-Glu-Gly-Tyr、PC(22:2(13Z,16Z)/15:0)、MG(22:2(13Z,16Z)/0:0/0:0)、Arg-Ile-Gln-Ile、PE(22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/24:0)、PC(18:1(9Z)/15:0)、Asn-Ser-His-His、1,2,3-三(1-乙氧基乙氧基)丙烷、2-羟基月桂酰基肉碱、次黄嘌呤、腺苷、PC(40:6)、3-脱羟基肉碱、肌苷、11-脱氧葫芦苦味素I、癸酸甲酯、亚油酰乙醇酰胺、His-Met-Phe-Phe、云香酚内酯、尿苷、二十烷基肉碱、鸟苷、壬酸甲酯、N-[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]二十二酰胺、己酸甲酯、抗坏血酸、N-乙酰基-leu-leu-tyr、4-羟基丁酸、[ST二甲基(4:0/3:0)](5Z,7E,17Z)-(1S,3R)-26,27-二甲基-9,10-开环-5,7,10(19),17(20)-胆甾四烯-22-炔-1,3,25-三醇、N-甲基吲哚并[3,2-b]-5α-胆甾-2-烯和/或γ-谷氨酰基-S-甲基半胱氨酰基-β-丙氨酸。
在一些实施方案中，在本发明的方法中检测与BAM相关的代谢物包含测量代谢物的前体的浓度，以及任选地将浓度与来自对照(非BAM)个体的对应样品或相对于参考值进行比较。在一些实施方案中，在本发明的方法中检测与BAM相关的代谢物包含测量代谢物的分解产物的浓度，以及任选地将浓度与来自对照(非BAM)个体的对应样品或相对于参考值进行比较。在某些实施方案中，所述方法包括检测已知产生预测BAM的代谢物的细菌分类群。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断患有BAM的患者的方法，其包括检测选自表1和/或表7的预测BAM的代谢物。在具体实施方案中，本发明提供一种用于诊断患有严重BAM的IBS患者的方法，其包括检测选自表1和/或表7的预测BAM的代谢物。在优选实施方案中，本发明的方法包括检测与脂肪酸代谢有关的代谢物。在优选实施方案中，本发明的方法包括检测熊去氧胆酸。在一个实施方案中，使用机器学习来诊断BAM。在任何此类实施方案中，检测代谢物包含测量样品中的代谢物的相对浓度，例如相对于对照(非BAM)个体的对应样品或相对于参考值。
如实例中所说明，发明人已鉴别出与BAM有关的细菌分类群。因此，本发明提供用于诊断BAM的方法，其包括检测某些细菌分类群的存在。优选的是，这些方法包括检测患者的粪便样品中的细菌菌株。替代地，可检测诸如拭子的口腔样品的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。通常，在本发明的方法中检测与BAM相关的细菌分类群包含测量样品中的细菌(即，一个或多个细菌菌株)的相对丰度，例如相对于对照(非BAM)个体的对应样品或相对于参考值。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测属以下科中的一或多者的细菌种：毛螺菌科(Lachnospiraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、普雷沃菌科(Prevotellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)及红蝽菌科(Coriobacteriaceae)。在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测属以下属中的一或多者的细菌种：布劳特氏菌属(Blautia)、拟杆菌属(Bacteroides)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、颤杆菌属(Oscillibacter)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、副普雷沃菌属(Paraprevotella)、吉米菌属(Gemmiger)、小杆菌属(Dialister)及巨单胞菌属(Megamonas)。在任何此类实施方案中，检测细菌(即，一个或多个细菌菌株)包含测量样品中的细菌的相对丰度，例如相对于对照(非BAM)个体的对应样品或相对于参考值。实例说明检测这些细菌的方法特别有效。本发明中所用的细菌分类群可参考16SrRNA基因序列来定义，或本发明可使用林奈分类法(Linnaean taxonomy)。可使用演化支特有的细菌基因、16S序列、转录组学、代谢组学或此类技术的组合来检测分类群中任一类目的细菌。在某些实施方案中，可使用演化支特有的细菌基因、16S序列、转录组学或代谢组学来检测细菌(即，一个或多个细菌菌株)。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测一个或多个属与BAM有关的操作分类单元(OTU)的细菌菌株。如所属领域中所熟知，操作分类单元(OTU)为用于分类密切相关个体的群的操作定义。如本文所用，“OTU”为通过特有的分类学标志基因的DNA序列相似性进行分组的一组生物(39)。在一些实施方案中，特有的分类学标志基因为16S rRNA基因。在一些实施方案中，使用核糖体数据库项目(Ribosomal DatabaseProject；RDP)分类学分类器为来代表性OTU序列分配分类。例如，表3中的序列信息可用于分类细菌(即，一个或多个细菌菌株)是否属表2中所列出的OTU。与表3中的序列具有至少97％序列同一性的细菌属表2中的对应OTU。在优选实施方案中，OTU选自表2。在任何此类实施方案中，检测细菌(即，一个或多个细菌菌株)包含测量样品中的细菌的相对丰度，例如相对于对照(非BAM)个体的对应样品或相对于参考值。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测一个或多个属与BAM有关的操作分类单元(OTU)的细菌菌株。在优选实施方案中，OTU选自表2。在一个实施方案中，与BAM有关的OTU经分类为属以下门之一：厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)或放线菌门(Actinobacteria)。在具体实施方案中，与BAM有关的OTU经分类为属以下类别之一：梭菌纲(Clostridia)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、放线菌门或Negativicutes。在具体实施方案中，与BAM有关的OTU经分类为属以下目之一：梭菌目(Clostridiales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、Selenomonadales或红蝽杆菌目(Coriobacteriales)。在具体实施方案中，与BAM有关的OTU经分类为属以下科之一：毛螺菌科、拟杆菌科、瘤胃球菌科、双歧杆菌科、普雷沃菌科、韦荣氏球菌科或红蝽菌科。在具体实施方案中，与BAM有关的OTU经分类为属以下目之一：布劳特氏菌属、拟杆菌属、栖粪杆菌属、颤杆菌属、Lachnospiracea_incertae_sedis、瘤胃球菌属2、双歧杆菌属、粪球菌属、副普雷沃菌属、吉米菌属、小杆菌属或巨单胞菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测属表2中所列出的一个或多个OTU的细菌菌株。表3中的序列可用于将细菌(即，一个或多个细菌菌株)分类为属表2中所列的OTU。与表3中的序列具有至少97％序列同一性的细菌(即，一个或多个细菌菌株)属表2中的对应OTU。比对在序列的长度上进行。在Metaphlan2及HUMAnN2运行中，使用bowtie 2进行种组成的比对。Bowtie2以“非常敏感的引数”运行，且所进行的比对为“全域比对”。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:1有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属布劳特氏菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:2有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属拟杆菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:3有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属梭菌目。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:4有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属栖粪杆菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:5有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属颤杆菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:6有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属Lachnospiracea属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:6有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属毛螺菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:7有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属毛螺菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:8有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属毛螺菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:9有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属瘤胃球菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:10有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属瘤胃球菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:11有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属毛螺菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:12有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属双歧杆菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:13有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属粪球菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:14有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属梭菌目。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:15有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属副普雷沃菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:16有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属拟杆菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:17有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属瘤胃球菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:18有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属吉米菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:19有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属瘤胃球菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:20有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属小杆菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:21有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属梭菌目。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:22有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属梭菌目。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:23有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属梭菌目。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:24有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属毛螺菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:25有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属栖粪杆菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:26有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属梭菌目。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:27有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属巨单胞菌属。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:28有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属红蝽菌科。
在优选实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:1-28中的两者或更多者(诸如SEQ ID No:1-28中的5者、8者或所有)有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的不同细菌(即，一个或多个细菌菌株)。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断IBS的进一步方法，其包括检测属表5中所列的一个或多个OTU的细菌菌株。表6中的序列可用于将细菌(即，一个或多个细菌菌株)分类为属表5中所列的OTU。与表6中的序列具有至少97％序列同一性的细菌(即，一个或多个细菌菌株)属表5中的对应OTU。比对在序列的长度上进行。在Metaphlan2及HUMAnN2运行中，使用bowtie 2进行种组成的比对。Bowtie2以“非常敏感的引数”运行，且所进行的比对为“全域比对”。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:29有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属毛螺菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:30有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属厚壁菌门。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:31有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属丁酸球菌属(Butyricicoccus)。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:32有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属毛螺菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:33有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属梭菌目。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:34有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属瘤胃球菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:35有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属瘤胃球菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:36有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属厚壁菌门。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:37有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即，一个或多个细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属瘤胃球菌科。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:38有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的细菌(即一种或多种细菌菌株)。在某些此类实施方案中，细菌(即，一个或多个细菌菌株)经分类为属毛螺菌科。
在优选实施方案中，本发明提供一种用于诊断BAM的方法，其包括检测与SEQ IDNo:29-38中的两者或更多者(诸如SEQ ID No:29-38中的5者、8者或所有)有至少97％(例如98％、99％、99.5％或100％)同一性的16S rRNA基因序列的不同细菌(即，一个或多个细菌菌株)。
在某些实施方案中，细菌种属基于序列的分类群。在优选实施方案中，基于序列的分类群选自表2。
在优选实施方案中，用于诊断BAM的方法包括检测至少一种如上文所述的代谢物以及检测至少一个如上文所述的细菌菌株或种。尽管代谢组学模型针对严重及中度BAM以100％准确度进行，但是与粪便代谢组学模型(九个)相比，OTU模型导致较少的错误分类(五个)。模型之间经错误分类的受试者中没有重叠，指示经组合的微生物组-代谢物体模型将增加BAM预测准确度。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断已诊断为患有作为与BAM共病的疾病的患者中的BAM的方法。在另一实施方案中，使用BAM代谢组学识别标志诊断BAM将患有BAM的患者与患有其他疾病(例如与BAM共病的疾病)的患者区分开。
在具体实施方案中，本发明提供一种用于诊断已诊断为患有发炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)的患者中的BAM的方法。在具体实施方案中，使用BAM代谢组学识别标志诊断BAM将患有BAM的患者与患有其他疾病(例如发炎性肠病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)的患者区分开。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于诊断已诊断为患有神经性厌食症的患者中的BAM的方法。在另一实施方案中，使用BAM代谢组学识别标志诊断BAM将患有BAM的患者与患有其他疾病(例如神经性厌食症)的患者区分开。
在某些实施方案中，用于诊断BAM的方法包括检测一个或多个细菌种及一种或多种代谢物。
BAM患者中的饮食、微生物组及代谢物体的综合分析
在某些实施方案中，本发明提供一种诊断BAM的方法，其包括以下中的一或多者：i)检测细菌种，例如如上文所论述；ii)检测代谢物，例如如上文所论述。在任何此类实施方案中，检测细菌、基因或代谢物包含测量样品中的所述标志物的丰度或浓度，例如相对于对照(非BAM)个体的对应样品或相对于参考值。
诊断方法
发明人开发了用于诊断BAM的新的且改进的方法。
在优选实施方案中，本发明的方法用于诊断居住在欧洲(诸如北欧，优选地爱尔兰)的患者或具有欧洲、北欧或爱尔兰饮食的患者。实例说明，本发明的方法对此类患者特别有效。在其他实施方案中，患者可居住在美国。
在本发明的任一方面的某些实施方案中，评定了细菌、基因或代谢物相对于对照(非BAM)个体的丰度。可以使用所属领域中建立的任何技术来生成此类参考值。
在本发明的任一方面的某些实施方案中，与对照(非BAM)个体的对应样品的比较为与健康个体的对应样品的比较。
优选的是，诊断BAM的方法的灵敏性大于40％(例如大于45％、50％或52％，例如53％或58％)且特异性大于90％(例如大于93％或95％，例如96％)。
在某些实施方案中，诊断方法为监测针对BAM的治疗过程的方法。
在某些实施方案中，检测(诸如粪便样品中的)细菌的存在或丰度的步骤包含基于核酸的定量方法，例如16s rRNA基因扩增子测序。使用16s rRNA基因扩增子测序来定性及定量确定样品中的细菌的方法在文献中有所描述且为所属领域技术人员已知的。其他技术可涉及PCR、rtPCR、qPCR、高通量测序、总体转录体测序或16S rRNA分析。
在本发明的任一实施方案的替代方面中，本发明提供一种用于诊断发展BAM的风险的方法。
在本发明的任一实施方案中，细菌菌株、种或代谢物的经调节的丰度指示BAM。在优选实施方案中，测量样品中的作为总微生物群的一部分的细菌菌株、种或OTU的丰度，以确定菌株、种或OTU的相对丰度。在优选实施方案中，测量代谢物的浓度。在优选实施方案中，测量样品中的作为总微生物群的一部分的细菌菌株的丰度，以确定菌株的相对丰度。然后，在此类优选实施方案中，将样品中的细菌或OTU的相对丰度或者代谢物或基因序列的浓度与参考对照(非BAM)个体的相同样品中的相对丰度或浓度进行比较。样品中的细菌或OTU的相对丰度与参考相比的差异(例如减少或增加)为经调节的相对丰度。如本文中所解释，也可以绝对方式，通过将样品丰度值与绝对参考值进行比较，来进行经调节的丰度的检测。因此，本发明提供一种确定个体中的BAM状态的方法，其包括以下步骤：测定个体的生物样品的一种或多种BAM有关的细菌的相对丰度和/或代谢物的经调节的浓度，其中细菌的经调节的相对丰度或者代谢物的经调节的浓度指示BAM。类似地，本发明提供一种确定个体患BAM的风险是否增加的方法，其包括以下步骤：测定个体的生物样品的一种或多种BAM有关的口腔细菌或BAM有关的代谢物的相对丰度，其中经调节的相对丰度或浓度指示风险增加。
在本发明的任一实施方案中，检测细菌可以包含检测“经调节的相对丰度”。如本文所用，当应用于个体样品中的细菌或OTU时，术语“经调节的相对丰度”应理解为意指样品中的细菌或OTU的相对丰度与参考对照(非BAM)个体的相同样品中的相对丰度(以下称为“参考相对丰度”)相比的差异。在一个实施方案中，与参考相对丰度相比，细菌或OTU表现出增加的相对丰度。在一个实施方案中，与参考相对丰度相比，细菌或OTU表现出减少的相对丰度。也可以绝对方式，通过将样品丰度值与绝对参考值进行比较，来进行经调节的丰度的检测。在一个实施方案中，参考丰度值获自年龄和/或性别匹配的个体。在一个实施方案中，参考丰度值获自与样品相同的群体(即凯尔特种源、北非种源、中东种源)的个体。下文描述自口腔及粪便样品中分离出细菌的方法，以及用于检测细菌(即，一种或多个细菌菌株)的丰度的方法。可以采用任何合适的方法来分离细菌的特定种或属，所述方法对本领域技术人员而言为显而易见的。可以采用任何合适的检测细菌丰度的方法，包括琼脂平板定量测定、荧光样品定量、qPCR、16S rRNA基因扩增子测序以及基于染料的代谢物耗乏或代谢物产生测定。
本发明还提供包含用于进行本发明的方法的试剂的试剂盒，诸如含有用于检测一个或多个(诸如两个或更多个)上文所述的细菌种、基因或代谢物的试剂的试剂盒。还提供用于实践如上文所提及的诊断BAM的标的方法的试剂盒。试剂盒可被配置来取得个体的生物样品，例如尿液样品或粪便样品。个体可疑似为患有BAM。个体可疑似为患有BAM的风险增加。试剂盒可包含被配置来接收生物样品的可密封容器。试剂盒可包含多核苷酸引物。多核苷酸引物可被配置用于扩增至少一种BAM有关的细菌的16S rRNA多核苷酸序列以形成经扩增的16S rRNA多核苷酸序列。试剂盒可包含用于检测经扩增的16SrRNA序列的检测试剂。试剂盒可包含使用说明。
实施例
概述
背景及目的：BAM的诊断基于SeHCAT分析。一些患者的微生物群发生了改变。因此，进行了微生物组及代谢组学定量分析以鉴别疾患的生物标志物。
方法：
以粪便样品收集了人体测量学、医学及饮食信息以用于微生物组及代谢组学分析。对粪便进行散弹枪及16S rRNA扩增子测序，且通过气相色谱法(GC)及液相色谱法(LC)质谱法(MS)分析粪便代谢物。通过放射性标记75硒(Se)高胆酸牛磺酸(SeHCAT)的保留来鉴别患有腹泻的患者中的胆酸吸收不良(BAM)。
结果：BAM通过粪便代谢组学在IBS内经准确区分。
结论：可通过IBS的种、宏基因组学及粪便代谢组学识别标志来鉴别BAM。这些发现可用于诊断BAM及开发IBS及BAM的精确疗法。
实施例1-患有胆酸吸收不良(BAM)的IBS患者的粪便微生物组及代谢物体分析
材料及方法
受试者招募：在科克大学医院招募了80名年龄在16-70岁的满足罗马准则IV的患有IBS的患者。患者的临床亚型(21)如下：便秘型IBS(IBS-C)、混合型IBS(IBS-M)或腹泻型IBS(IBS-D)。招募了65名年龄范围相同且种族及地理区域相同的对照。表4呈现研究群体的描述性统计。
排除标准包括：纳入研究前6周内使用抗生素；其他慢性疾病，包括胃肠道疾病；严重精神性疾病；除疝气修补术或阑尾切除术以外的腹部手术。若最新结果不可用，则对所有参与者进行标准护理血液分析，且通过血清学对所有受试者进行测试以排除乳糜泄。除必须满足IBS的罗马准则IV之外，对照群体的纳入/排除标准与IBS群体相同。收集各参与者(IBS及对照)的胃肠道(GI)症状史、精神症状、饮食、医疗史及用药数据且使用以下问卷：布里斯托大便分数(BSS)、医院焦虑与忧郁量表(HADS)(22)、食物频率问卷(FFQ)(23)。通过SeHCAT来评定报告腹泻的IBS-D及IBS-M患者以及同意的对照受试者亚组的胆酸吸收不良，SeHCAT为用于临床上诊断BAM的放射性标记合成胆酸，其不被细菌代谢且呈内源性胆酸穿过肠肝循环。在开始这项研究之前，科克研究伦理委员会(Cork Research EthicsCommittee)同意了研究的伦理批准(协议编号：4DC001)且所有参与者均提供了参加的书面知情同意书。
样品收集：自所有参与者收集粪便及尿液样品以用于微生物组及代谢组学定量分析。受试者使用收集试剂盒在家收集新排泄的粪便样品且在收集了新鲜尿液样品的当天将样品带到诊所。在样品收集后数小时内，将样品保存在4℃下直至送到实验室在-80℃下储存。
微生物组定量分析及宏基因组学：使用Browne等人(24)所述的方法自冷冻的粪便样品(0.25g)提取出基因组DNA并扩增。Brown等人(18)所述的方法的修改包括由0.5g0.1mm氧化锆珠及4×3.5mm玻璃珠组成的珠磨管。将粪便样品经由珠磨3×60s循环来均质化且在各循环之间在冰上冷却。在0.8％琼脂糖凝胶上可视化基因组DNA且使用SimpliNano分光计(BiochromTM，US)进行定量。PCR master mix使用2X Phusion Taq高保真Mix(ThermoScientific，Ireland)及15ng DNA。将所得PCR产物纯化、定量，然后合并等摩尔量各扩增子，之后送至商业供应商(GATC Biotech AG，Konstanz，Germany)在MiSeq(2×250bp)化学平台上进行测序。测序由德国GATC Biotech在Illumina MiSeq仪器上使用2×250bp双端测序运行来进行。
微生物组定量分析及宏基因组学-16S扩增子测序：使用Qiagen DNeasy Blood&Tissue试剂盒且根据制造商的说明，自144份各0.25g冷冻的粪便样品(IBS：n＝80及对照：n＝64)中提取出微生物DNA。一名对照受试者没有粪便样品可供使用。使用由Illumina(SanDiego，California，USA)开发的16S测序文库制备Nextera协议进行16S rRNA基因扩增子制备及测序。使用PCR扩增各15ng DNA粪便提取物，且靶向16S rRNA基因的V3-V4可变区的引物使用以下基因特异性引物：
16S扩增子PCR前向引物(S-D-Bact-0341-b-S-17)＝5'：(SEQ ID NO:44)
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG
16S扩增子PCR反向引物(S-D-Bact-0785-a-A-21)5'：(SEQ ID NO:45)
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC
扩增子大小为531bp。将产物纯化且通过第二轮接头PCR连接正向及反向条形码。
微生物组定量分析及宏基因组学-散弹枪测序：如上文所述提取基因组DNA。在0.8％琼脂凝胶上检查DNA品质且使用Simplinano(Thermo Scientific,Ireland)进行定量。对于散弹枪测序，将各样品的1μg(浓度>5ng/μl)高分子量DNA送至德国GATC Biotech，以用于使用2×250bp双端化学在Illumina HiSeq平台(HiSeq 2500)上测序。这返回了2,714,158,144个原始读长(read)(2,612,201,598个经处理的读长)，其中45.6％经映射至每个样品平均222,945个基因家族，平均计数值为每个样品8,924,302±2,569,353。
生物信息学分析(16S扩增子测序)：返回了144名受试者的Miseq16S测序数据。由于自测序返回的读长的数目太少而无法进行分析，所以移除3个样品(2个IBS及1个对照)生成的数据，留下141个样品(对照：n＝63，IBS n＝78)。合并原始扩增子序列数据且使用快速方法(25)修剪读长。使用USEARCH管线来生成OTU表(26)。使用UPARSE算法来在97％相似度下将序列分群成OTU(27)。UCHIME嵌合体移除算法与Chimeraslayer一起使用以移除嵌合序列(28)。使用核糖体数据库项目(RDP)分类学分类器来为代表性OTU序列分配分类(26)，且生成了微生物群组成(丰度及多样性)信息。
生物信息学分析(散弹枪宏基因组测序)：对于散弹枪宏基因组学，由于数据未通过QC或无可用样品，未对6个对照样品进行测序(对照：n＝59；IBS：n＝80)。测序之后获得的原始读长对的数目从5,247,013到21,280,723变化(平均值＝9,763,159±2,408,048)。根据人类微生物组计划(Human Microbiome Project；HMP)联盟的标准操作程序对读长进行处理(29)。使用HUMAnN2管线生成宏基因组组成及功能概况(30)。对于各样品，获得了多个概况，包括：演化支特有的基因信息的微生物组成概况(使用MetaPhlAn2)及基因家族丰度。
粪便GC/LC MS：将1g冷冻的粪便样品在干冰上送至德国波茨坦的MetabolomicDiscoveries(现在为Metabolon)。对于LC-MS，在分析之前，将样品干燥且重悬浮至最终浓度为10mg/400μl。使用湿样品进行GC-MS及SCFA分析。使用液相色谱法(LC)及固相微萃取(SPME)气相色谱法(GC)进行非靶向代谢组学分析，且使用电喷雾电离质谱法(ESI-MS)鉴别代谢物。还通过LC-串联式质谱法进行SCFA分析。
粪便代谢物体数据的生物信息学分析：返回所有IBS受试者(n＝80)及除2个对照以外的所有对照(n＝63)的粪便MS代谢组学数据，因为这2个对照未通过QC或没有可用样品。由服务提供商进行的非靶向粪便代谢组学分析返回了2,933种代谢物，其中753种经鉴别。使用LC-MS鉴别的代谢物未经归一化，因为粪便样品在样品制备期间已用干重(10mg/400μl)经归一化。使用GC-MS鉴别的代谢物用对应样品湿重经归一化。仅考虑经鉴别的代谢物用于进一步分析。如下文所述进行机器学习分析。使用Wilcoxon秩和检验生成所有数据集的汇总统计，其中q值调整用于多重测试。
BAM SeHCAT测定：在科克大学医院呈含有少于0.1mg牛磺硒胆酸(tauroselcholicacid)(GE Healthcare，UK)且在参考日期放射性剂量为370kBq的单胶囊剂量施用SeHCAT。施用胶囊之后2-3小时使用非准直γ计数器(Siemens Ecam照相机)取得各受试者的基线全身吸收读数。7天后进行追踪扫描且计算胆酸保留比例；<15％保留的值指示轻度至严重BAM，SeHCAT分数为15-20％表示临界性分类，如Watson等人(31)所讨论。
机器学习：使用两步法，采用最小绝对值收敛与选择算子(LASSO)特征选择，然后进行随机森林(RF)建模(32)，将内部机器学习管线应用于各数据类型(16S、散弹枪及BAM-粪便MS代谢组学)。使用R软件3.4.0版本、使用针对LASSO特征选择的程序包glmnet 2.0-10版本及RF程序包随机森林4.6-12版本实施模型。
首先，使用LASSO算法进行特征选择，以通过有效选择相关特征来改善模型的准确度及可解释性。此过程通过参数λ来调谐，针对各数据集使用网格搜索将参数优化。过滤训练数据以仅包括由LASSO算法所选择的特征，然后将RF用于建模，从而构建了1500棵树。LASSO特征选择及RF建模均使用10倍交叉验证(CV)进行，其生成了产生最佳模型的内部10倍预测，从而预测样品的IBS或对照分类。
对于BAM-粪便代谢组学数据分析，以类似方式进行机器学习，唯一差异在于，代替十倍交叉验证，在每个交叉验证步骤均使用留一(Leave-One-Out；LOO)CV
模型1；对于IBS及对照受试者，BAM(临界性至严重BAM或SeHCAT保留<20％)或正常胆酸(SeHCAT保留>20％)。
模型2；仅对于IBS受试者，BAM(轻度至严重BAM或SeHCAT保留率<15％)或正常胆酸(SeHCAT保留>20％)。
数据类型的协惯量分析：对微生物组来源的数据集进行Hellinger转换。使用R(v3.2.0)中的ade4(v.1.7.2)程序包进行协惯量分析。在比较对中对各概况进行主成分分析(PCA)，接着在前5个主轴上对这些PCA对象进行协惯量分析。通过置换检验，使用randtest函数，计算协惯量的显著性。
结果
患有胆酸吸收不良的IBS患者具有改变的粪便微生物组
因为一些患有IBS-D的患者具有胆酸吸收不良(BAM)，其将影响过渡时间及可能地微生物群组成，所以测试了19/21患有IBS-D的患者、26/29患有IBS-M的受试者及9/65对照的SeHCAT保留，其为鉴别BAM的黄金标准(33)。根据目前的指导(34)，将未能保留>15％标记胆酸类似物分类为BAM，将10-15％保留分类为轻度BAM，将5-10％分类为中度BAM且将<5％分类为严重BAM(图1a)。
所测试的45名IBS患者中有18名(54％)经诊断为患有BAM，其中4名患有严重BAM，7名患有中度BAM且7名患有轻度BAM。另外5名患者为临界性BAM(16-20％保留)。使用15％阈值，40％所测试的IBS群体中报告阳性BAM分类。在一名对照受试者中鉴别出轻度BAM，其随后经诊断为患有IBS。如所预期，与在IBS-M(35％)中相比，在IBS-D(74％)中的阳性BAM诊断更常见(p值＝0.03)(图1b)。
仅严重BAM类别中的IBS患者显示他们的微生物群与具有正常、轻度、中度或临界性BAM诊断的患者的微生物群的明显分开(使用如所述的分析，参见图1c)。为了进一步研究BAM的生物学影响，通过GC-MS及LC-MS(如上文所述)进行非靶向粪便代谢产物分析。具有严重BAM诊断的IBS患者的粪便代谢物体与经历SeHCAT测定的患有IBS的患者中的其他BAM类别的粪便代谢物体显著不同(图1d)。应用于粪便代谢物体数据的机器学习成功地预测了BAM，对于检测IBS患者及对照的测试集中的所有BAM类(包括临界性)而言，AUC为0.92；对于严重及中度BAM，模型以100％准确度进行(灵敏性：0.80且特异性：0.86)，对于轻度BAM为62.5％且对于临界性BAM为60％(图2及表1)。BAM的主要预测代谢物包括L-赖氨酸、两种甘油磷脂及胆酸(熊去氧胆酸(UDCA))。这些化合物类别的水平升高与改变的脂肪酸代谢及疾病有关(35),(36)。
应用于微生物组OTU数据集的机器学习鉴别出BAM(AUC：0.95，灵敏性s：0.88且特异性：0.93)(表2)。尽管代谢组学模型针对严重及中度BAM以100％准确度进行，但是与粪便代谢组学模型(九个)相比，OTU模型导致较少的错误分类(五个)。模型之间经错误分类的受试者中没有重叠，指示经组合的微生物组-代谢物体模型将增加BAM预测准确度。
讨论
已显示，患有严重胆酸吸收不良的IBS-D及IBS-M患者亚组具有改变的微生物组及粪便代谢物体。
IBS临床亚型中的微生物组没有显著不同，且将患者分配至这些类别的临床应用存在争论。但是，鉴别出了患有BAM的IBS-D及IBS-M患者亚组，他们可通过微生物组及代谢组学识别标志来区分开。其他人报告了IBS-D中的微生物群改变，但未针对BAM进行阶层化(15)。还值得注意的是，过渡时间(由布里斯托大便分数反映)为微生物群组成的主要协变量(37)，但IBS患者的在混合、便秘与腹泻亚型之间交替的趋势可能掩盖或“平均化”微生物群与过渡时间的关联。无论如何，所有三个亚型菌科通过常见的粪便微生物组识别标志而与对照区分开。通过SeHCAT在超过一半的所测试的合并IBS-D及M受试者中检测出BAM。严重BAM组中微生物组的差异最明显。与各种IBS疗法的先前试验中的安慰剂相比，未能识别出大量患有BAM的受试者的存在可能导致治疗成功率降低(38)。尽管严重BAM类别中的受试者具有显著改变的微生物组，但是鉴别了所有BAM诊断受试者的粪便代谢组学识别标志。BAM的这种粪便代谢组学识别标志将容易具有临床应用，因为与SeHCAT(其目前在USA不可用)相比，它需要更便利、更易获得且更便宜的仪器。
实施例2-用替代性机器学习管线的患有胆酸吸收不良(BAM)的IBS患者的粪便代谢物体分析
材料及方法
受试者招募：在科克大学医院招募了80名年龄在16-70岁的满足罗马准则IV的患有IBS的患者。患者的临床亚型(21)如下：便秘型IBS(IBS-C)、混合型IBS(IBS-M)或腹泻型IBS(IBS-D)。招募了65名年龄范围相同且种族及地理区域相同的对照。表4呈现研究群体的描述性统计。
排除标准包括：纳入研究前6周内使用抗生素；其他慢性疾病，包括胃肠道疾病；严重精神性疾病；除疝气修补术或阑尾切除术以外的腹部手术。若最新结果不可用，则对所有参与者进行标准护理血液分析，且对所有受试者进行测试以排除乳糜泄。除必须满足IBS的罗马准则IV之外，对照群体的纳入/排除标准与IBS群体相同。收集各参与者(IBS及对照)的胃肠道(GI)症状史、精神症状、饮食、医疗史及用药数据且使用以下问卷：布里斯托大便分数(BSS)、医院焦虑与忧郁量表(HADS)(22)、食物频率问卷(FFQ)(23)。通过SeHCAT来评定报告腹泻的IBS-D及IBS-M患者以及同意的对照受试者亚组的胆酸吸收不良，SeHCAT为用于临床上诊断BAM的放射性标记合成胆酸，其不被细菌代谢且呈内源性胆酸穿过肠肝循环。在开始这项研究之前，科克研究伦理委员会(Cork Research Ethics Committee)同意了研究的伦理批准(协议编号：4DC001)且所有参与者均提供了参加的书面知情同意书。
样品收集：自所有参与者收集粪便及尿液样品以用于代谢组学定量分析。受试者使用收集试剂盒在家收集新排泄的粪便样品且在收集了新鲜尿液样品的当天将样品带到诊所。在样品收集后数小时内，将样品保存在4℃下直至送到实验室在-80℃下储存。
粪便GC/LC MS：将1g冷冻的粪便样品在干冰上送至德国波茨坦的MetabolomicDiscoveries(现在为Metabolon)。对于LC-MS，在分析之前，将样品干燥且重悬浮至最终浓度为10mg/400μl。使用湿样品进行GC-MS及SCFA分析。使用液相色谱法(LC)及固相微萃取(SPME)气相色谱法(GC)进行非靶向代谢组学分析，且使用电喷雾电离质谱法(ESI-MS)鉴别代谢物。还通过LC-串联式质谱法进行SCFA分析。
粪便代谢物体数据的生物信息学分析：返回所有IBS受试者(n＝80)及除2个对照以外的所有对照(n＝63)的粪便MS代谢组学数据，因为这2个对照未通过QC或没有可用样品。由服务提供商进行的非靶向粪便代谢组学分析返回了2,933种代谢物，其中753种经鉴别。使用LC-MS鉴别的代谢物未经归一化，因为粪便样品在样品制备期间已用干重(10mg/400μl)经归一化。使用GC-MS鉴别的代谢物用对应样品湿重经归一化。仅考虑经鉴别的代谢物用于进一步分析。如下文所述进行机器学习分析。使用Wilcoxon秩和检验生成所有数据集的汇总统计，其中q值调整用于多重测试。
BAM SeHCAT测定：在科克大学医院呈含有少于0.1mg牛磺硒胆酸(tauroselcholicacid)(GE Healthcare，UK)且在参考日期放射性剂量为370kBq的单胶囊剂量施用SeHCAT。施用胶囊之后2-3小时使用非准直γ计数器(Siemens Ecam照相机)取得各受试者的基线全身吸收读数。7天后进行追踪扫描且计算胆酸保留比例；<15％保留的值指示轻度至严重BAM，SeHCAT分数为15-20％表示临界性分类，如Watson等人(2015)(31)所讨论。
机器学习：将内部机器学习管线应用于粪便代谢组学数据。此实施例中使用的机器学习管线与实施例1中使用的机器学习管线相似，但包含额外优化及验证步骤，在十倍交叉验证中使用两步法。在各验证倍数中，进行最小绝对值收敛与选择算子(LASSO)特征选择，然后进行随机森林(RF)建模，且针对在交叉验证训练子集之外的交叉验证测试数据验证经优化的模型。
使用R软件3.4.0版本、使用针对LASSO特征选择的程序包glmnet 2.0-10版本及RF程序包随机森林4.6-12版本实施模型。
将粪便代谢物体样品概况进行log10转换，之后在机器学习管线中对它们进行分析。仅对具有SeHCAT信息的IBS样品进行转换。然后移除具有临界性BAM的样品，且将剩余样品分类为BAM(19个样品)或正常(21个样品)。然后在机器学习管线中分析经分类的样品。
图3示出此实施例中使用的机器学习管线。首先将经分类的粪便代谢物体样品概况分为训练集及测试集。然后将训练集用于生成最佳λ范围，以供LASSO算法使用。使用先前所述的交叉验证的LASSO且使用glmnet程序包(2.0-18版本)生成最佳λ范围。最佳λ范围的预先确定减少了运行管线的计算时间，且无需使用者手动指定范围。
确定λ范围之后，基于其类别机率为样品分配权重。在此步骤中向训练样品分配的权重用于所有后续适用步骤。
然后将实质上如实施例1中所述的LASSO算法应用于加权训练样品。在此实施例中，LASSO算法使用了先前计算的最佳λ范围，且使用了Caret(在此实施例中为6.0-84版本)及glmnet(在此实施例中为2.0-18版本)程序包，使用留一交叉验证计算ROC AUC(接受者操作特征，曲线下面积)度量。留一法交叉验证用于最大化可用于模型优化的样品的数目。提取通过经优化的LASSO算法所鉴别的特征系数，且选择具有非零系数的特征以用于进一步分析。在图3中，N是指LASSO算法所返回的特征数。若LASSO所选择的特征数少于5，则所有特征(LASSO之前)都用于生成随机森林，即随机森林生成器忽略LASSO过滤。若LASSO所选择的特征数大于或等于5，则仅LASSO所选择的特征用于生成随机森林。
使用LASSO选择特征之后，使用选择的特征生成经优化的随机森林分类器(具有1500棵树)。通过调谐“mtry”参数以最大化ROC AUC度量，使用Caret(6.0-84版本)及内部交叉验证进行随机森林生成。然后将经优化的随机森林分类器应用于测试集，且经由AUC、灵敏性及特异性度量来计算分类器的性能。
结果
粪便代谢物体预测BAM类别
研究了粪便代谢物体概况将样品分类为BAM或非BAM的预测能力。交叉验证为“留一”CV。留一CV用于确保可用于模型优化的样品数目最大。
对经历SeHCAT测定的IBS患者的粪便代谢物体数据集进行机器学习，但排除具有临界性BAM诊断的患者。预测模型成功地鉴别出患有BAM的受试者，在所有三个BAM等级中AUC为0.85。对于严重BAM，模型以100％准确度进行，对于中度BAM为75％且对于轻度BAM为43％。性能汇总及特征细节描述于表7且示出于图4。由LASSO选择的系数小于零的特征与BAM有关而正系数与正常有关。交叉验证结果表明，粪便代谢物体概况预测BAM。总体测试性能为：AUC为0.852，灵敏性为0.684，特异性为0.762，且准确度为0.725，有11个错误分类(表7)。
使用pROC程序包(1.15.0版本)及Youden J评分对分类阈值进行优化，以达成最大灵敏性及特异性。获得的灵敏性及特异性的经优化的值分别为0.684及0.904。
在预测BAM时使用此管线所鉴别的代谢物列出于表7中。在主要的预测代谢产物中有一系列甘油磷脂。这些化合物的水平升高与改变的脂肪酸代谢及疾病有关。在BAM的主要的预测代谢物中有1,3-二-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-二十碳五烯酰基)-2-羟基-甘油(d5)及丁酸二甲基苄基原酯。
讨论
经由机器学习分析已显示，粪便代谢物体预测IBS中的BAM状态。经显示，患有胆酸吸收不良的IBS-D及IBS-M患者亚组具有改变的粪便代谢物体，其可潜在地用于区分这些受试者而无需SeHCAT测试。
IBS临床亚型中的微生物组没有显著不同，且将患者分配至这些类别的临床应用存在争论。但是，鉴别出了患有BAM的IBS-D及IBS-M患者亚组，他们可通过代谢组学识别标志来区分开。其他人报告了IBS-D中的微生物群改变，但未针对BAM进行阶层化(15)。通过SeHCAT在超过一半的所测试的合并IBS-D及M受试者中检测出BAM。严重BAM组中微生物组的差异最明显。与各种IBS疗法的先前试验中的安慰剂相比，未能识别出大量患有BAM的受试者的存在可能导致治疗成功率降低(38)。尽管严重BAM类别中的受试者具有显著改变的微生物组，但是鉴别了所有BAM诊断受试者的粪便代谢组学识别标志。BAM的这种粪便代谢组学识别标志将容易具有临床应用，因为与SeHCAT(其目前在USA不可用)相比，它需要更便利、更易获得且更便宜的仪器。
上文所述的用于识别BAM的粪便代谢组学识别标志的管线还具有临床应用，因为它类似地利用比SeHCAT更便利、更易获得且更便宜的仪器。
结论
目前研究的结果具有临床意义。粪便代谢组学概况与BAM有关，从而可准确地将其与非BAM有关的IBS区分开。
在此处所鉴别的将BAM受试者与非BAM有关的IBS受试者区分开的分类群及代谢物可能成为一系列微生物群定向疗法的目标，诸如粪便移植、抗生素、益生菌或活体生物疗法。
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<213> 梭菌目(Clostridiales)
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<213> 栖粪杆菌属(Faecalibacterium)
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<213> 颤杆菌属(Oscillibacter)
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<213> Lachnospiracea_incertae_sedis
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<213> 毛螺菌科(Lachnospiraceae)
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cctacgggtg gcagcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcaacgc 60
cgcgtgagtg aagaagtatt tcggtatgta aagctctatc agcagggaag aaaatgacgg 120
tacctgacta agaagccccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggggc 180
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gaaaacccgg ggctcaaccc cgggactgca tttgaaactg tcggactaga gtgccggaga 300
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cgaaggcggc ttactaaacc ataactgaca ctgaagcacg aaagcgtggg gagcaaacag 420
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gagtttaccc gttgaataag caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 180
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<211> 440
<212> DNA
<213> 粪球菌属(Coprococcus)
<400> 13
cctacggggg gcagcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcgacgc 60
cgcgtgagcg aagaagtatt tcggtatgta aagctctatc agcagggaag ataatgacgg 120
tacctgacta agaagcaccg gctaaatacg tgccagcagc cgcggtaata cgtatggtgc 180
aagcgttatc cggatttact gggtgtaaag ggtgcgtagg tggtgagaca agtctgaagt 240
gaaaatccgg ggcttaaccc cggaactgct ttggaaactg cctgactaga gtacaggaga 300
ggtaagtgga attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagat attaggagga acaccagtgg 360
cgaaggcgac ttactggact gctactgaca ctgaggcacg aaagcgtggg gagcaaacag 420
gattagatac cctggtagtc 440
<210> 14
<211> 441
<212> DNA
<213> 梭菌目(Clostridiales)
<400> 14
cctacggggg gcagcagtcg ggaatattgc gcaatggagg aaactctgac gcagtgacgc 60
cgcgtatagg aagaaggttt tcggattgta aactattgtc gttagggaag atacaagaca 120
gtacctaagg aggaagctcc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggag 180
caagcgttat ccggatttat tgggtgtaaa gggtgcgtag acgggacaac aagttagttg 240
tgaaatccct cggcttaact gaggaactgc aactaaaact attgttcttg agtgttggag 300
aggaaagtgg aattcctagt gtagcggtga aatgcgtaga tattaggagg aacaccggtg 360
gcgaaggcga ctttctggac aataactgac gttgaggcac gaaagtgtgg ggagcaaaca 420
ggattagata ccccagtagt c 441
<210> 15
<211> 459
<212> DNA
<213> 副普雷沃菌属(Paraprevotella)
<400> 15
cctacggggg gcagcagtga ggaatattgg tcaatgggcg ggagcctgaa ccagccaagt 60
agcgtgaagg acgacggccc tacgggttgt aaacttcttt tataagggaa taaagtgcgt 120
tacgtgtaat gttttgtatg taccttatga ataagcatcg gctaattccg tgccagcagc 180
cgcggtaata cggaagatgc gagcgttatc cggatttatt gggtttaaag ggagcgtagg 240
cgggctttta agtcagcggt caaatgtcac ggctcaaccg tggccagccg ttgaaactgc 300
aagccttgag tctgcacagg gcacatggaa ttcgtggtgt agcggtgaaa tgcttagata 360
tcacgaagaa ctccgatcgc gaaggcattg tgccggggca gcactgacgc tgaggctcga 420
aagtgcgggt atcaaacagg attagatacc cctgtagtc 459
<210> 16
<211> 460
<212> DNA
<213> 拟杆菌属(Bacteroides)
<400> 16
cctacgggag gcagcagtga ggaatattgg tcaatgggcg atggcctgaa ccagccaagt 60
agcgtgaagg atgactgccc tatgggttgt aaacttcttt tataaaggaa taaagtcggg 120
tatgcatacc cgtttgtatg taccttatga ataaggatcg gctaactccg tgccagcagc 180
cgcggtaata cggaggatcc gagcgttatc cggatttatt gggtttaaag ggagcgtagg 240
cggactatta agtcagctgt gaaagtttgc ggctcaaccg taaaattgca gttgatactg 300
gtcgtcttga gtgcagtaga ggtaggcgga attcgtggtg tagcggtgaa atgcttagat 360
atcacgaaga actccgattg cgaaggcagc ctgctaagct gcaactgaca ttgaggctcg 420
aaagtgtggg tatcaaacag gattagatac ccgagtagtc 460
<210> 17
<211> 440
<212> DNA
<213> 瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)
<400> 17
cctacggggg gctgcagtgg gggatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcgacgc 60
cgcgtggagg aagaaggttt tcggattgta aactcctgtc gttagggacg ataatgacgg 120
tacctaacaa gaaagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaaaa cgtagggtgc 180
aagcgttatc cggatttact gggtgtaaag ggagcgcagg cgggactgca agttggatgt 240
gaaataccgt ggcttaacca cggaactgca tccaaaactg tagttcttga gtgaagtaga 300
ggcaagcgga attccgagtg tagcggtgaa atgcgtagag atggggagga acaccagtgg 360
cgaaggcggc ctgctgggct ttaactgacg ctgaggcacg aaagcgtggg tagcaaacag 420
gattagatac cccagtagtc 440
<210> 18
<211> 440
<212> DNA
<213> 吉米菌属(Gemmiger)
<400> 18
cctacgggag gcagcagtgg gggatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcgacgc 60
cgcgtggagg aagaaggttt tcggattgta aactcctgtc gttagggacg ataatgacgg 120
tacctaacaa gaaagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaaaa cgtagggtgc 180
aagcgttgtc cggaattact gggtgtaaag ggagcgcaga cggcactgca agtctgaagt 240
gaaagcccgg ggctcaaccc cggtactgca ttggaaactg tcgtactaga gtgtcggagg 300
ggtaagcgga attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagat atcgggagga acaccagtgg 360
cgaaggcgac ctactgggca ccaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcaaacag 420
gattagatac ccctgtagtt 440
<210> 19
<211> 442
<212> DNA
<213> 瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)
<400> 19
cctacggggg gctgcagtgg ggaatattag gcaatgggcg aaagcctgac ctagcgacgc 60
cgcgtgaggg aagacggtct tcggattgta aacctctgtc ttcagggacg aagaagatga 120
cggtacctga agaggaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 180
ggcgagcgtt gtccggaatt actgggtgta aagggagcgt aggcgggtac gcaagttgaa 240
tgtgaaaact aacggctcaa ccgatagttg cgttcaaaac tgcggatctt gagtgaagta 300
gaggcaggcg gaattcctag tgtagcggta aaatgcgtag atattaggag gaacaccagt 360
ggcgaaggcg gcctgctggg ctttaactga cgctgaggct cgaaagtgtg gggagcaaac 420
aggattagat accccggtag tc 442
<210> 20
<211> 466
<212> DNA
<213> 小杆菌属(Dialister)
<400> 20
cctacggggg gctgcagtgg ggaatcttcc gcaatgggcg aaagcctgac ggagcaacgc 60
cgcgtgagtg atgacggcct tcgggttgta aaactctgtg atccgggacg aaaaggcaga 120
gtgcgaagaa caaactgcat tgacggtacc ggaaaagcaa gccacggcta actacgtgcc 180
agcagccgcg gtaatacgta ggtgacaagc gttgtccgga tttactgggt gtaaagggcg 240
cgtaggcgga ctgtcaagtc agtcgtgaaa taccggggct taaccccggg gctgcgattg 300
aaactgacag ccttgagtat cggagaggaa agtggaattc ctagtgtagc ggtgaaatgc 360
gtagagatta ggaagaacac cggtggcgaa ggcgactttc tggacgaaaa ctgacgctga 420
ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agatacccgg gtagtc 466
<210> 21
<211> 443
<212> DNA
<213> 梭菌目(Clostridiales)
<400> 21
cctacgggtg gctgcagtgg gggatattgc acaatggagg gaactctgat gcagcaacgc 60
cgcgtgaagg acgaaggcct tcgggttgta aacttctgtc cttggtgacg aagaaagtga 120
cggtagccag ggaggaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 180
ggcgagcgtt gtccggaatt actgggtgta aagggtgcgt aggcggcttc taaagtcaga 240
tgtgaaatac cgcagctcaa ctgcggggct gcatttgaaa cttgggagct tgagtgaagt 300
agaggtaagc ggaattccta gtgtagcggt ggaatgcgta gatattagga ggaacaccag 360
tggcgaaggc ggcttactgg gctttaactg acgctgaggc acgaaagcgt ggggagcaaa 420
caggattaga taccccagta gtc 443
<210> 22
<211> 441
<212> DNA
<213> 梭菌目(Clostridiales)
<400> 22
cctacgggag gctgcagtgg ggaatattgg gcaatgggcg aaagcctgac ccagcaacgc 60
cgcgtgaagg aagaaggcct tcgggttgta aacttctttt aagagggacg aagaagtgac 120
ggtacctctt gaataagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 180
gcaagcgttg tccggattta ttgggtgtaa agggagcgca gacggcactg caagtctgaa 240
gtgaaagccc ggggctcaac cccgggactg ctttggaaac tgtagagcta gagtgctgga 300
gaggcaagcg gaattcctag tgtagcggtg aaatgcgtag atattaggag gaacaccagt 360
ggcgaaggcg gcttactgga cggtaactga cgttgaggct cgaaagcgtg gggagcaaac 420
aggattagat acccgtgtag c 441
<210> 23
<211> 442
<212> DNA
<213> 梭菌目(Clostridiales)
<400> 23
cctacgggtg gctgcagtgg gggatattgc gcaatggggg caaccctgac gcagcaacgc 60
cgcgtgaagg aagaaggctt tcgggttgta aacttctttt gtcggggacg aaacaaatga 120
cggtacccga cgaataagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg 180
ggctagcgtt atccggaatt actgggcgta aagggtgcgt aggtggtttc ttaagtcaga 240
ggtgaaaggc tacggctcaa ccgtagtaag cctttgaaac tgggaaactt gagtgcagga 300
gaggagagtg gaattcctag tgtagcggtg aaatgcgtag atattaggag gaacaccagt 360
tgcgaaggcg gctctctgga ctgtaactga cactgaggca cgaaagcgtg gggagcaaac 420
aggattagat accctagtag tc 442
<210> 24
<211> 440
<212> DNA
<213> 毛螺菌科(Lachnospiraceae)
<400> 24
cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcgacgc 60
cgcgtgaagg atgaagtatt tcggtatgta aagctctatc agtagggaag aaaatgacgg 120
tacctgacta agaagcaccg gctaaatacg tgccagcagc cgcggtaata cgtatggtgc 180
aagcgttatc cggatttact gggtgtaaag gaagtgtagg tggccaggca agtcagaagt 240
gaaagcccgg ggctcaaccc cgggactgct tttgaaactg cagggctaga gtgcaggaga 300
ggtaagtgga attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagat attaggagga acaccagtgg 360
cgaaggcggc ttgctggacg atgactgacg ttgaggctcg aaagcgtggg gagcaaacag 420
gattagatac cctagtagtc 440
<210> 25
<211> 441
<212> DNA
<213> 栖粪杆菌属(Faecalibacterium)
<400> 25
cctacggggg gctgcagtga gggatattgg gcaatggggg aaaccctgac ccagcgacgc 60
cgcgtgaggg aagacggtct tcggattgta aacctctgtc tttggggacg aaaaaggacg 120
gtacccaagg aggaagctcc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggag 180
cgagcgttgt ccggaattac tgggtgtaaa gggagcgcag gcgggaaggc aagttggaag 240
tgaaatccat gggctcaacc catgaactgc tttcaaaact gtttttcttg agtagtgcag 300
aggtaggcgg aattcccggt gtagcggtgg aatgcgtaga tattcggagg aacaccagtg 360
gcgaaggcgg cctactgggc tttaactgac gctgaggctc gaaagtgtgg ggagcaaaca 420
ggattagata ccccggtagt c 441
<210> 26
<211> 443
<212> DNA
<213> 梭菌目(Clostridiales)
<400> 26
cctacgggag gctgcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcaacgc 60
cgcgtgaagg atgacggttt tcggattgta aacttctttt cttagtgacg aagacagtga 120
cggtagctaa ggaataagca tcggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtagga 180
tgcaagcgtt atccggattt actgggtgta aagggagcgt aggtggcgag gcaagccaga 240
agtgaaaacc cggggctcaa ccgcgggatt gcttttggaa ctgtcatgct agagtgcagg 300
aggggtgagc ggaattccta gtgtagcggt gaaatgcgta gatattagga ggaacaccag 360
tggcgaaggc ggcctactgg gcaccaactg acgctgaggc tcgaaagtgt gggtagcaaa 420
caggattaga taccccggta gtc 443
<210> 27
<211> 465
<212> DNA
<213> 巨单胞菌属(Megamonas)
<400> 27
cctacggggg gctgcagtgg ggaatcttcc gcaatgggcg aaagcctgac ggagcaacgc 60
cgcgtgaacg atgaaggtct taggatcgta aagttctgtt gttagggacg aagggtaaga 120
atcataataa ggtttttatt tgacggtacc taacgaggaa gccacggcta actacgtgcc 180
agcagccgcg gtaatacgta ggcggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggag 240
cgcaggcggg aaactaagcg gatcttaaaa gtgcggggct caaccccgtg atggggtccg 300
aactggtttt cttgagtgca ggagaggaaa gcggaattcc cagtgtagcg gtgaaatgcg 360
tagatattgg gaagaacacc agtggcgaag gcggctttct ggactgtaac tgacgctgag 420
gctcgaaagc tagggtagcg aacgggatta gataccccag tagtc 465
<210> 28
<211> 446
<212> DNA
<213> 红蝽菌科(Coriobacteriaceae)
<400> 28
cctacggggg gctgcagtgg ggaatcttgc gcaatggggg gaaccctgac gcagcgacgc 60
cgcgtgcggg acgaaggccc tcgggtcgta aaccgctttc agcagggaag aggccgaaag 120
gtgacggtac ctgcagaaga agccccggct aaatacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 180
atggggcgag cgttatccgg attcattggg cgtaaagcgc gcgtaggcgg cctcgtaggc 240
cgggagtcaa atccgggggc tcaacccccg cccgctcccg gaaccccgag gcttgagtct 300
ggcaggggag ggtggaattc ccagtgtagc ggtggaatgc gcagatattg ggaagaacac 360
cggtggcgaa ggcggccctc tgggccacga ctgacgctga ggcgcgaaag ctgggggagc 420
gaacaggatt agatacccga gtagtc 446
<210> 29
<211> 440
<212> DNA
<213> 毛螺菌科(Lachnospiraceae)
<400> 29
cctacggggg gcagcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcgacgc 60
cgcgtgagtg aagaagtatt tcggtatgta aagctctatc agcagggaag aaaatgacgg 120
tacctgacta agaagccccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggggc 180
aagcgttatc cggatttact gggtgtaaag ggagcgtagg tggtatggca agtcagaggt 240
gaaaacccag ggcttaacct tgggattgcc tttgaaactg tcagactaga gtgcaggagg 300
ggtaagtgga attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagat attaggagga acaccagtgg 360
cgaaggcggc ttactggact gtaactgaca ctgaggctcg aaagcgtggg gagcaaacag 420
gattagatac ccgagtagtc 440
<210> 30
<211> 442
<212> DNA
<213> 厚壁菌门(Firmicutes)
<400> 30
cctacggggg gctgcagtgg ggaatattgg gcaatggagg aaactctgac ccagcaacgc 60
cgcgtggagg aagaaggttt tcggatcgta aactcctgtc cttggagacg agtagaagac 120
ggtatccaag gaggaagccc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggg 180
gcaagcgttg tccggaataa ttgggcgtaa agggcgcgta ggcggctcgg taagtctgga 240
gtgaaagtcc tgcttttaag gtgggaattg ctttggatac tgtcgggctt gagtgcagga 300
gaggttagtg gaattcccag tgtagcggtg aaatgcgtag agattgggag gaacaccagt 360
ggcgaaggcg actaactgga ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagtgtg gggagcaaac 420
aggattagat accccagtag tc 442
<210> 31
<211> 441
<212> DNA
<213> 丁酸球菌属(Butyricicoccus)
<400> 31
cctacggggg gctgcagtgg ggaatattgc gcaatggggg aaaccctgac gcagcaacgc 60
cgcgtgattg aagaaggcct tcgggttgta aagatcttta atcagggacg aaacatgacg 120
gtacctgaag aataagctcc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggag 180
caagcgttat ccggatttac tgggtgtaaa gggcgcgcag gcgggccggc aagttggaag 240
tgaaatccgg gggcttaacc cccgaactgc tttcaaaact gctggtcttg agtgatggag 300
aggcaggcgg aattccgtgt gtagcggtga aatgcgtaga tatacggagg aacaccagtg 360
gcgaaggcgg cctgctggac attaactgac gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca 420
ggattagata cccctgtagt c 441
<210> 32
<211> 440
<212> DNA
<213> 毛螺菌科(Lachnospiraceae)
<400> 32
cctacgggtg gctgcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcaacgc 60
cgcgtgagtg aagaagtatt tcggtatgta aagctctatc agcaggaaag aaaatgacgg 120
tacctgacta agaagccccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggggc 180
aagcgttatc cggatttact gggtgtaaag ggagcgtaga cggtgaggca agtctgaagt 240
gaaatgccgg ggctcaaccc cggaactgct ttggaaactg tcgtactaga gtgtcggagg 300
ggtaagcgga attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagat attaggagga acaccagtgg 360
cgaaggcggc ttgctggact gtaactgaca ctgaggctcg aaagcgtggg gagcaaacag 420
gattagatac ccttgtagtc 440
<210> 33
<211> 441
<212> DNA
<213> 梭菌目(Clostridiales)
<400> 33
cctacggggg gcagcagtcg ggaatattgc gcaatggagg aaactctgac gcagtgacgc 60
cgcgtatagg aagaaggttt tcggattgta aactattgtc gttagggaag atacaagaca 120
gtacctaagg aggaagctcc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggag 180
caagcgttat ccggatttat tgggtgtaaa gggtgcgtag acgggacaac aagttagttg 240
tgaaatccct cggcttaact gaggaactgc aactaaaact attgttcttg agtgttggag 300
aggaaagtgg aattcctagt gtagcggtga aatgcgtaga tattaggagg aacaccggtg 360
gcgaaggcga ctttctggac aataactgac gttgaggcac gaaagtgtgg ggagcaaaca 420
ggattagata ccccagtagt c 441
<210> 34
<211> 443
<212> DNA
<213> 瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)
<400> 34
cctacggggg gctgcagtgg ggaatattgg gcaatgggcg aaagcctgac ccagcaacgc 60
cgcgtgaagg aagaaggtct tcggattgta aacttctttt atgagggacg aaggaagtga 120
cggtacctca tgaataagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 180
ggcaagcgtt gtccggattt actgggtgta aagggcgcgt aggcgggatg gcaagtcaga 240
tgtgaaatcc atgggctcaa cccatgaact gcatttgaaa ctgtcgttct tgagtatcgg 300
agaggcaagc ggaattccta gtgtagcggt gaaatgcgta gatattagga ggaacaccag 360
tggcgaaggc ggcttgctgg acgacaactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa 420
caggattaga tacccctgta gtc 443
<210> 35
<211> 440
<212> DNA
<213> 瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)
<400> 35
cctacggggg gctgcagtgg gggatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcaacgc 60
cgcgtgaggg aagaaggttt tcggattgta aacctctgtc ctcagggaag ataatgacgg 120
tacctgagga ggaagctccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggagc 180
aagcgttgtc cggatttact gggtgtaaag ggtgcgtagg cgggatatca agtcagacgt 240
gaaatccatc ggcttaactg atgaactgcg tttgaaactg gtattcttga gtgagtcaga 300
ggcaggcgga attcccggtg tagcggtgaa atgcgtagag atcgggagga acaccagtgg 360
cgaaggcggc ctgctggggc ttaactgacg ctgaggcacg aaagcgtggg gagcaaacag 420
gattagatac ccgagtagtc 440
<210> 36
<211> 443
<212> DNA
<213> 厚壁菌门(Firmicutes)
<400> 36
cctacggggg gctgcagtgg ggaatattgg gcaatggagg gaactctgac ccagcaatgc 60
cgcgtgagtg aagaaggttt tcggattgta aaactcttta agcagggacg aagaaagtga 120
cggtacctgc agaataagca tcggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtagga 180
tgcaagcgtt atccggaatg actgggcgta aagggtgcgt aggcggtaaa tcaagttggc 240
agcgtaattc cggggcttaa ctccggaact actgccaaaa ctggtgaact agagtgtgtc 300
aggggtaagt ggaattccta gtgtagcggt ggaatgcgta gatattagga ggaacaccgg 360
aggcgaaagc gacttactgg ggcacaactg acgctgaggc acgaaagcgt ggggagcaaa 420
caggattaga taccccggta gtc 443
<210> 37
<211> 440
<212> DNA
<213> 瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)
<400> 37
cctacgggag gcagcagtgg gggatattgc acaatggagg aaactctgat gcagcaacgc 60
cgcgtgaggg aagaaggatt tcggtttgta aacctctgtc ttcggtgacg aaaatgacgg 120
tagccgagga ggaagctccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggagc 180
aagcgttgtc cggaattact gggtgtaaag ggtgcgtagg tgggactgca agtcaggtgt 240
gaaaacggtc ggctcaaccg atcgcctgca cttgaaactg tggttcttga gtgaagtaga 300
ggtaggcgga attcccggtg tagcggtgaa atgcgtagag atcgggagga acaccagtgg 360
cgaaggcggc ctactgggct ttaactgacg ctgaggcacg aaagcatggg tagcaaacag 420
gattagatac cccggtagtc 440
<210> 38
<211> 440
<212> DNA
<213> 毛螺菌科(Lachnospiraceae)
<400> 38
cctacggggg gctgcagtgg ggaatattgc acaatggggg aaaccctgat gcagcgacgc 60
cgcgtgagcg aagaagtatt tcggtatgta aagctctatc agcagggaag ataatgacgg 120
tacctgacta agaagccccg gctaaatacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggagc 180
aagcgttatc cggatttatt gggtgtaaag ggtgcgtaga cgggacaaca agttagttgt 240
gaaatccctc ggcttaactg aggaactgca actaaaacta ttgttcttga gtgttggaga 300
ggaaagtgga attcctagtg tagcggtgaa atgcgtagat attaggagga acaccggtgg 360
cgaaggcggc ctactgggca ccaactgacg ctgaggctcg aaagtgtggg tagcaaacag 420
gattagatac cctagtagtc 440
<210> 39
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知的(Unknown)
<220>
<223> 代谢物
<400> 39
Glu Glu Gly Tyr
1
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知的(Unknown)
<220>
<223> 代谢物
<400> 40
Arg Ile Gln Ile
1
<210> 41
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知的(Unknown)
<220>
<223> 代谢物
<400> 41
Asn Ser His His
1
<210> 42
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知的(Unknown)
<220>
<223> 代谢物
<400> 42
Asp Phe Phe Val
1
<210> 43
<211> 4
<212> PRT
<213> 未知的(Unknown)
<220>
<223> 代谢物
<400> 43
His Met Phe Phe
1
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 44
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)
<223> n为g、t、a和c中的任一者
<220>
<221> misc_feature
<222> (46)
<223> w为a和t中的任一者
<210> 45
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 45
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)
<223> h为a、c和t中的任一者
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)
<223> v为a、g和c中的任一者

Claims (15)

1.一种诊断患者中的胆酸吸收不良(BAM)的方法，其包括检测：
a.与BAM有关的分类群的细菌菌株；或
b.与BAM有关的代谢物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括检测与BAM有关的分类群的细菌菌株及与BAM有关的代谢物。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细菌菌株属于选自由以下组成的清单的科：毛螺菌科、拟杆菌科、瘤胃球菌科、双歧杆菌科、普雷沃菌科、韦荣氏球菌科及红蝽菌科。
4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细菌菌株属于选自由以下组成的清单的属：布劳特氏菌属、拟杆菌属、栖粪杆菌属、颤杆菌属、瘤胃球菌属、双歧杆菌属、粪球菌属、副普雷沃菌属、吉米菌属、小杆菌属、巨单胞菌属及丁酸球菌属。
5.如权利要求2-4所述的方法，其中所述细菌菌株属于选自表2和/或表5的操作分类单元(OTU)。
6.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细菌菌株具有与SEQ ID NO:1-38之一有至少97％同一性的16S rRNA基因序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中检测2、5、10、15或20个细菌分类群的菌株。
8.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述代谢物选自由以下组成的组：PG(P-16:0/14:0)、2-乙基栓酸、Glu-Glu-Gly-Tyr、1,2,3-三(1-乙氧基乙氧基)丙烷、PG(O-30:1)、熊去氧胆酸、MG(22:2(13Z,16Z)/0:0/0:0)、L-赖氨酸、O-磷酸乙醇胺、PE(22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/24:0)及十七酸。
9.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述代谢物选自由以下组成的组：1,3-二-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-二十碳五烯酰基)-2-羟基-甘油(d5)、丁酸二甲基苄基原酯、1-18:0-2-18:2-单半乳糖基二酰基甘油、PG(P-16:0/14:0)、Glu-Glu-Gly-Tyr、PC(22:2(13Z,16Z)/15:0)、PG(34:0)、PE(18:3(6Z,9Z,12Z)/P-18:0)、MG(22:2(13Z,16Z)/0:0/0:0)、Arg-Ile-Gln-Ile、PE(22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/24:0)、PC(18:1(9Z)/15:0)、甲基硫菌灵、Asn-Ser-His-His、1,2,3-三(1-乙氧基乙氧基)丙烷、PS(39:6)、2-羟基月桂酰基肉碱、次黄嘌呤、腺苷、PC(40:6)、Asp-Ph e-Phe-Val、3-脱羟基肉碱、肌苷、PG(O-34:3)、11-脱氧葫芦苦味素I、癸酸甲酯、亚油酰乙醇酰胺、His-Met-Phe-Phe、1-癸醇、云香酚内酯、尿苷、二十烷基肉碱、鸟苷、壬酸甲酯、3-Epidemissidine、Momord ol、N-[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]二十二酰胺、己酸甲酯、抗坏血酸、N-乙酰基-leu-leu-tyr、4-羟基丁酸、[ST二甲基(4:0/3:0)](5Z,7E,17Z)-(1S,3R)-26,27-二甲基-9,10-开环-5,7,10(19),17(20)-胆甾四烯-22-炔-1,3,25-三醇、N-甲基吲哚并[3,2-b]-5α-胆甾-2-烯及γ-谷氨酰基-S-甲基半胱氨酰基-β-丙氨酸。
10.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述代谢物选自由以下组成的组：PG(P-16:0/14:0)、2-乙基栓酸、Glu-Glu-Gly-Tyr、1,2,3-三(1-乙氧基乙氧基)丙烷、PG(O-30:1)、熊去氧胆酸、MG(22:2(13Z,16Z)/0:0/0:0)、L-赖氨酸、O-磷酸乙醇胺、PE(22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/24:0)、十七酸、1,3-二-(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-二十碳五烯酰基)-2-羟基-甘油(d5)、丁酸二甲基苄基原酯、1-18:0-2-18:2-单半乳糖基二酰基甘油、PC(22:2(13Z,16Z)/15:0)、PG(34:0)、PE(18:3(6Z,9Z,12Z)/P-18:0)、Arg-Ile-Gln-Ile、PC(18:1(9Z)/15:0)、甲基硫菌灵、Asn-Ser-Hi s-His、PS(39:6)、2-羟基月桂酰基肉碱、次黄嘌呤、腺苷、PC(40:6)、Asp-Phe-Phe-Val、3-脱羟基肉碱、肌苷、PG(O-34:3)、11-脱氧葫芦苦味素I、癸酸甲酯、亚油酰乙醇酰胺、His-Met-Phe-Phe、1-癸醇、云香酚内酯、尿苷、二十烷基肉碱、鸟苷、壬酸甲酯、3-Epidemissidin e、Momordol、N-[2-(1H-吲哚-3-基)乙基]二十二酰胺、己酸甲酯、抗坏血酸、N-乙酰基-leu-leu-tyr、4-羟基丁酸、[ST二甲基(4:0/3:0)](5Z,7E,17Z)-(1S,3R)-26,27-二甲基-9,10-开环-5,7,10(19),17(20)-胆甾四烯-22-炔-1,3,25-三醇、N-甲基吲哚并[3,2-b]-5α-胆甾-2-烯及γ-谷氨酰基-S-甲基半胱氨酰基-β-丙氨酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述方法用于诊断严重BAM。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述患者先前经诊断为患有IBS、神经性厌食症或发炎性肠病例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
13.一种试剂盒，其包含用于进行前述权利要求中任一项所述的方法的试剂。
14.一种试剂盒，其包含用于检测权利要求2-6中所定义的细菌菌株和/或权利要求8中所定义的代谢物中的两者或更多者的试剂。
15.如权利要求13或14的试剂盒，其被配置来分析粪便样品。
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