TW202118877A - 使用腸道菌叢偵測慢性腎病及其嚴重度之方法 - Google Patents
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Abstract
一種使用腸道菌叢偵測慢性腎病及其嚴重度之方法,利用非侵入性的糞便檢驗方式,獲得副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌及擬桿菌存在於腸道菌中的相對數量,並透過上述四種菌叢相對數量變化來評估腎臟病的嚴重程度,進而提供補給或減少上述腸道菌數的指引,達到降低腎臟功能損傷的目的。
Description
本發明為一種偵測腎病及其嚴重度之方法,尤指一種使用腸道菌叢偵測慢性腎病及其嚴重度之方法,藉由非侵入性的糞便檢測方式測量四種腸道菌數的變化,進而診斷慢性腎病及其嚴重度,並提供下降腸道產生之尿毒素之治療標的。
慢性腎病增加心血管疾病、死亡率和醫療成本,成為世界的公共衛生困境,目前仍待開發有效的治療策略來減輕慢性腎病的發生與惡化。而慢性腎臟病患者,因為尿毒累積、酸鹼值及電解質異常、免疫功能變化及多重藥物治療,造成腸道微生態失調並有腸道微生物群組的改變,這些腸道異常進而產生代謝產物的變化對腎臟造成傷害,數種經腸道產生的代謝產物,例如:硫酸吲哚酯和對甲酚硫酸酯,均直接會引起腎臟細胞及腎絲球傷害而導致腎功能下降。
依照美國腎臟基金會DOQI的治療指引,目前傳統上仍仰賴血液中的肌酐酸及微量蛋白尿來診斷慢性腎病及其嚴重度,然而一旦這二個指標異常皆代表腎臟已經發生病理學上的損傷,因此無法達到早期診斷的效果。
早期的腎臟損傷與諸多因素有關,雖然有數種血液及尿液上的生物標識來輔助早期診斷,然而慢性腎臟病患之腸道菌叢中與腎臟功能
及疾病嚴重度,或者與腸道產生的代謝產物相關菌種仍不清楚,因此先前技術仍有改善空間。
本發明要解決的技術問題,是提供一種使用腸道菌叢偵測慢性腎病及其嚴重度之方法,利用非侵入式的糞便檢驗方式,檢驗到副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌及擬桿菌的相對數量,透過調控此些菌種相對數量以下降腸道產生的代謝物,進而達到降低腎臟功能的損傷。
為了解決上述技術問題,本發明揭露的使用腸道菌叢偵測慢性腎病及其嚴重度之方法,步驟如下:
步驟一:收集受試者糞便樣品,並採取糞便的腸道菌DNA。
步驟二:使用聚合酶鏈反應(PCR)檢驗腸道菌中16S rRna的第四可變區進行基因測序並生成測序文庫。
步驟三:處理後的測序讀數依照門、綱、目、科、屬、種辨識副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌及擬桿菌存在於腸道菌叢中的相對數量。
步驟四:隨著腎臟病嚴重程度上升,上述副普雷沃氏菌、假丁酸菌及擬桿菌之相對數量下降,柯林斯菌之相對數量則上升。
透過上述方法,以非侵入性的糞便檢驗方式,獲得副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌及擬桿菌存在於腸道菌中的相對數量,並透過上述四種菌叢相對數量變化來評估腎臟病的嚴重程度,進而提供補給或減少上述腸道菌數的指引,達到個人醫療的目的。
S1‧‧‧步驟一
S2‧‧‧步驟二
S3‧‧‧步驟三
S4‧‧‧步驟四
圖1為本發明使用腸道菌叢偵測慢性腎病及其嚴重度之方法的步驟流程圖
圖2為本發明副普雷沃氏菌存在於不同慢性腎病患之糞便中之相對濃度的分佈
圖3為本發明假丁酸菌存在於不同慢性腎病患之糞便中之相對濃度的分佈
圖4為本發明柯林斯菌存在於不同慢性腎病患之糞便中之相對濃度的分佈
圖5為本發明擬桿菌存在於不同慢性腎病患之糞便中之相對濃度的分佈
圖6為本發明腸道菌種標記與傳統標記對於診斷慢性腎病及其疾病嚴重度在發明組及驗證組的比較
圖7為本發明使用腸道菌種標記與傳統標記對於診斷有中度/重度慢性腎病或無慢性腎病的比較
圖8為本發明使用腸道菌種標記的相對濃度定量來診斷腎病
圖9為本發明不同嚴重度之慢性腎病其平均血清尿毒素濃度
圖10為本發明腸道菌種標記與血清尿毒素濃度之相關性
圖11為本發明副普雷沃氏菌和假丁酸菌與Log total PCS/Log free PCS及Log total IS/Log free IS關聯性的散佈圖
由圖1的方法流程圖可知,本發明提供一種使用腸道菌叢偵測慢性腎病及其嚴重度之方法,包括:
步驟一S1:收集受試者糞便樣品,並採取糞便的腸道菌DNA。
步驟二S2:使用聚合酶鏈反應(PCR)檢驗腸道菌中16S
rRna的第四可變區進行基因測序並生成測序文庫。
步驟三S3:處理後的測序讀數依照門、綱、目、科、屬、種辨識副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌及擬桿菌存在於腸道菌叢中的相對數量。
步驟四S4:隨著腎臟病嚴重程度上升,上述副普雷沃氏菌(Paraprevotella)、假丁酸菌(Pseudobutyrivibrio)及擬桿菌(Bacteroids eggerthiiy)之相對數量下降,柯林斯菌(Colinsella stercoris)之相對數量則上升,所述之副普雷沃氏菌相對濃度高於0.08%則表示患有腎臟疾病之可能性,假丁酸菌相對濃度高於2.47%則表示患有腎臟疾病之可能性,柯林斯菌相對濃度高於0.02%則表示患有腎臟疾病之可能性,擬桿菌相對濃度高於0.05%則表示患有腎臟疾病之可能性。
藉由上述非侵入性的方式,使用病患的糞便測量副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌及擬桿菌此四種腸道菌的變化,以評估慢性腎臟病及其嚴重程度,並提供下降腸道產生之尿毒素之治療標的方法。
具體詳細的實施例如下所示:
糞便DNA分離和16S rRNA基因測序
步驟一S1:從130位受試者收集10公克的糞便樣品,分別30位無腎臟功能異常,31例輕度、30例中度和39例重度未透析之慢性腎病患,在樣品採集前7天內,受試者不得服用含有益生菌,如優格、酸奶等任何補充劑或食物。使用FastDNA針對糞便的SPIN試劑盒(MP Biomedical),採取來自糞便的腸道菌DNA。
步驟二S2:使用聚合酶鏈反應(PCR)來擴增腸道菌中16S
rRNA的編碼基因的第四可變區(V4),使用具有條形碼的細菌/古細菌引物515F/806R來擴增16S rRNA基因的V4區域。應用GeneJET凝膠提取試劑盒(Thermo Scientific)純化擴增子,然後在Qubit 2.0熒光計(Qubit)上使用Qubit dsDNA HS測定試劑盒(Qubit)定量。使用NEBNext®UltraTMDNA文庫製備試劑盒(Illumina)(NEB)並生成測序文庫,對純化的文庫進行定量、標準化及合併,並應用於Illumina HiSeq 2500的平台進行簇生成和測序,以產生250bp的配對終端讀數。
處理和分析序列數據
步驟三S3:使用FLASH v1.2.7合併成對的終端讀數,並使用QIIME 1.7軟體分析流程評估所過濾的讀數質量,接著依序使用UCHIME嵌合體檢測軟體丟棄嵌合序列,UPARSE演算法處理的測序讀數(有效標籤),並將同一性97%的序列,聚類為操作分類單位(OTU),再根據從SILVA基因序列數據庫檢索的信息分配細菌學門分類,依據門(Phylum),綱(Class),目(Order),科(Family),屬(Genus),種(Species)辨識各種細菌並計算各種細菌存在於腸道菌叢的相對數量(relative abundancy)。刪除只出現一次性的單個序列(單個子)或僅在一個樣品中檢測到的序列,並且排除小於3×104有效標籤的樣本做進一步的分析。為了評估不同OTU的系統發育關聯性,使用PyNAST軟件v.1.2針對SILVA數據庫的數據集進行多個序列的比對,並以FastTree軟體套件生成系統發育樹(phylogenetic tree)。在隨後分析α和β多樣性之前,將OTU豐度的數據稀疏到最小序列深度,來做樣品間序列深度的變化之標準化。以Chao1指數的量測方法評估物種豐富度,來估計α多樣性。通過隨機選擇來自每個樣品的一定量的測序數據來表示觀察
到的物種的數量,並產出稀疏曲線(rarefaction curve),並且以連續性取樣中,新OTU(物種)出現的頻率繪製出物種積累曲線。以Bray-Curtis密度相似性係數差異及與純素相的比較來評估β多樣性,應用Bray-Curtis距離進行主坐標分析(PCoA),使用QIIME軟體分析流程來計算加權和未加權的UniFrac參數評估微生物群落樣品間的距離,並以樣本中的加權或未加權UniFrac參數的距離矩陣變換為一組新的正交軸,使用R軟件中的加權相關網絡分析(WGCNA),stat和ggplot2軟體進行非度量尺度縮放分析(NMDS)。
統計分析
步驟四S4:描述性統計以平均值,中位數或比率表示。使用Kolmogorov-Simirnov方法檢定統計量測試數值變量的正態性,依序應用學生t(Student's t)檢驗或Kruskal-Wallis單因子多樣本中位數差異檢定檢驗確定組間臨床指數的差異,以及應用斯皮爾曼(Spearman)相關性來判定主要屬(genera,>0.1%豐度和>90%樣品中存在的)與血清生物標誌物和疾病嚴重程度的關聯性,再使用邦费羅尼校正(Bonferroni)校正進行多重校正來調整p值(n=55)。使用微軟XP支援下的第22版統計產品與服務解決方案統計軟體(SPSS 22.0,SPSS Inc.,Chicago,IL)分析數據。應用整體分類學,屬級或物種之分級的豐度來分析不同CKD狀態的最具辨識性的細菌分類群,並以SPSS構建接收者操作特征曲線(ROC)測試了用於區分不同階段的CKD或腹膜透析患者與非CKD的對照組的腸道微生物豐度的表現。使用雙樣本Z-檢定計算ROC曲線的AUC之間的統計差異,並且以Bonferroni校正進行多次校正測試(n=80,對於存在於>80%樣品中的物種;n=98,對於存在的屬>98%的樣品)。所有統計檢驗都是雙尾的,p<0.05被認為具有統計學意
義。辨識出的有意義的四種菌,即副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌及擬桿菌存在於腸道菌叢中的相對數量,再於另外一個98位腹膜透析(代表重度腎病)病人之族群進行驗證。
上述驗證結果如下圖2~圖11內容所示:
參閱圖2~圖5,可看到四種腸道菌(副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌及擬桿菌)於不同慢性腎病患之糞便中之相對濃度的分佈,圖中的Non-CKD係指無腎臟病組,Mil.CKD為輕度腎臟病組,Mod.CKD為中度腎臟病組,Adv.CKD為重度腎臟病組;從圖中可看出,隨著腎臟病嚴重程度上升,副普雷沃氏菌、假丁酸菌及擬桿菌之相對數量下降,柯林斯菌之相對數量則上升。
參閱圖6,圖中的Non-CKD(30)係指無腎臟病的組別有30人,mild CKD(31)為輕度腎臟病的組別有31人,PD係指腹膜透析(peritoneal dialysis),AUC指的是ROC曲面下總面積,Pc(Corrected P)指的是P值以Bonferroni校正進行多次校正測試。副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌和擬桿菌在診斷有或無慢性腎病時其曲線下面積(area under curve)皆比傳統標記“尿蛋白/尿肌酸肝比值”(urine protein-creatinine ratio)有顯著性的更大,p值經過校正後仍有顯著統計意義。副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌和擬桿菌在診斷有輕度或無慢性腎病時其曲線下面積(area under curve)皆比傳統標記“尿蛋白/尿肌酸肝比值”(urine protein-creatinine ratio)有顯著性的更大。p值經過校正後副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌和擬桿菌在診斷有輕度或無慢性腎病時其曲線下面積(area under curve)皆比傳統標記“尿蛋白/尿肌酸肝比值”(urine protein-creatinine ratio)有顯著性的更大。
在驗證組中副普雷沃氏菌、假丁酸菌和柯林斯菌仍具顯著意義。換言之,使用副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌和擬桿菌作為檢測評估慢性腎臟病及其嚴重程度,相較於傳統使用血液中的肌酐酸及微量蛋白尿檢測效果更好。
參閱圖7,圖中的Non-CKD係指無腎臟病組,Mod.CKD為中度腎臟病組,Adv.CKD為重度腎臟病組,副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌和擬桿菌在診斷無或有中度慢性腎病時其曲線下面積(area under curve)皆比傳統標記“尿蛋白/尿肌酸肝比值”(urine protein-creatinine ratio)有顯著性的更大,p值經過校正後仍有顯著統計意義;上述4種腸道菌種標記用於診斷有重度或無慢性腎病時其曲線下面積(area under curve)卻比傳統標記更小。因此,此4種腸道菌種標記,與傳統尿液標記相比,用於鑑別中度慢性腎病更精準,但對鑑別重度慢性腎病卻沒有比較好。
參閱圖8,副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌和擬桿菌的相對濃度在診斷有/無慢性腎病及其嚴重性皆比傳統尿液標記有意義,進一步計算上述四種菌種診斷有/無慢性腎病及其嚴重性的相對濃度定量數值、特異度及靈敏度;特異度即在不患病的人群中,成功排除病患的概率,靈敏度即在患病人群中,成功確認患病的概率。副普雷沃氏菌相對濃度高於0.16%,診斷輕度腎臟病之靈敏度0.5667,特異度為0.8387;相對濃度高於0.08%,可診斷有罹患腎臟病(特異度靈敏度為0.9000,靈敏度為0.6196)。假丁酸菌相對濃度高於2.47%,可以診斷腎臟病(輕度或有無腎臟病)。柯林斯菌相對濃度高於0.01%,可診斷輕度腎臟病之特異度0.6333,靈敏度為0.9032;相對濃度高於0.02%可診斷有罹患腎臟病(特異度為0.7000,靈敏度
為0.8913)。擬桿菌相對濃度高於0.04%,可診斷輕度腎臟病之特異度0.8667,靈敏度為0.6774;相對濃度高於0.05%可診斷有罹患腎臟病(特異度為0.8667,靈敏度為0.75)。
參閱圖9,揭示血清尿毒素濃度皆隨著慢性腎病嚴重度的增加而顯著的上升(Non-CKD:無腎臟病組,Mil.CKD:輕度腎臟病組,Mod.CKD:中度腎臟病組,Adv.CKD:重度腎臟病組,IS:硫酸吲哚酯,PCS:對甲酚硫酸酯,* p<0.001)。
參閱圖10,為對數轉換後的血清總PCS,總IS,游離PCS,游離IS與細菌標誌物或腎功能之間的Spearman相關性,而PCS為對硫甲酚的縮寫,IS為硫酸吲哚酚。副普雷沃氏菌和假丁酸菌皆與Log total PCS/Log free PCS及Log total IS/Log free IS有顯著的負相關性,顯示這副普雷沃氏菌和假丁酸菌的量越高,尿毒素越低。柯林斯菌與Log total IS以及Log free IS有顯著的正相關性。
參閱圖11,副普雷沃氏菌和假丁酸菌相對濃度越高,Log total PCS/Log free PCS及Log total IS/Log free IS的血清濃度越低,代表於慢性腎病患增加副普雷沃氏菌和假丁酸菌之相對濃度可以降低IS/PCS等尿毒素,提供治療標的的方法。因此,副普雷沃氏菌和假丁酸菌可能可作為功能性益生菌的標的,來降低尿毒素的濃度。
S1‧‧‧步驟一
S2‧‧‧步驟二
S3‧‧‧步驟三
S4‧‧‧步驟四
Claims (5)
- 一種使用腸道菌叢偵測慢性腎病及其嚴重度之方法,步驟如下:步驟一:收集受試者糞便樣品,並採取糞便的腸道菌DNA;步驟二:使用聚合酶鏈反應(PCR)檢驗腸道菌中16S rRNA的第四可變區進行基因測序並生成測序文庫;步驟三:處理後的測序讀數依照門、綱、目、科、屬、種辨識副普雷沃氏菌、假丁酸菌、柯林斯菌及擬桿菌存在於腸道菌叢中的相對數量;步驟四:隨著腎臟病嚴重程度上升,上述副普雷沃氏菌、假丁酸菌及擬桿菌之相對數量下降,柯林斯菌之相對數量則上升。
- 如申請專利範圍第1項所述之使用腸道菌叢偵測慢性腎病及其嚴重度之方法,其中步驟二係使用具有條形碼的細菌/古細菌引物515F/806R來擴增16S rRNA基因的V4區域。
- 如申請專利範圍第1項所述之使用腸道菌叢偵測慢性腎病及其嚴重度之方法,其中步驟三在辨識出相對數量後先刪除只出現一次性的單個序列或僅在一個樣品中檢測到的序列,並且排除小於3×104有效標籤的樣本。
- 如申請專利範圍第1項所述之使用腸道菌叢偵測慢性腎病及其嚴重度之方法,其中步驟四所述之副普雷沃氏菌相對濃度高於0.08%則表示患有腎臟疾病之可能性,假丁酸菌相對濃度高於2.47%則表示患有腎臟疾病之可能性,柯林斯菌相對濃度高於0.02%則表示患有腎臟疾病之可能性,擬桿菌相對濃度高於0.05%則表示患有腎臟疾病之可能性。
- 如申請專利範圍第1項所述之使用腸道菌叢偵測慢性腎病及其嚴重度之方法,其中所述副普雷沃氏菌和假丁酸菌可作為功能性益生菌的標的降 低尿毒素的濃度。
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