JP2013511988A - 過敏性腸症候群診断用の新規なゲノムバイオマーカー - Google Patents
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Abstract
本発明は、IBSを診断し、予後診断し、及び細分類する、新規なバイオマーカー、キット、及び方法を提供する。1つの側面において、本発明は、IBSを診断し、分類し、予後診断を提供し、及びIBS治療を割り当てる必要のある被験者においてそれらを行うための新規なゲノムバイオマーカーを提供する。別の側面において、本発明はIBSの診断及び予後診断に対する新規なアルゴリズムを提供する。
Description
本願は、2009年11月25日出願の米国出願第61/264,634号の優先権を主張するものであり、あらゆる目的でその内容の全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
過敏性腸症候群(IBS)は、あらゆる胃腸疾患の中で最も一般的であり、総人口の10〜20%が罹患しており、消化器系愁訴の全患者の50%超を占める。しかしながら、研究はIBSを患う者の約10%〜50%だけが実際に医療を求めるに過ぎないことを示唆している。IBS患者は、異なる症状、例えば、主に排便に関連した腹痛、下痢、便秘又は下痢便秘交替症、腹部膨満、ガス、及び便中の過剰粘液などを示す。IBS患者の40%超は、仕事を休み、彼らの社会生活を切り詰め、性交を避け、約束を取り消し、旅行を止め、薬を服用し、そして恥をかくことを恐れて家に閉じこもったままにさえなければならないほどの重症の症状を呈する。米国で試算されたIBSの健康管理費用は1年当たり80億ドルである(Talley et al., Gastroenterol., 109:1736-1741 (1995))。
IBSの正確な病態生理は充分にはわかっていない。それでも、末梢感作として知られる内臓の痛みの知覚に対する高められた感受性が存在する。この感作は、モノアミン(例えば、カテコールアミン及びインドールアミン)、サブスタンスP、及び様々なサイトカイン及びプロスタノイド、例えば、E型プロスタグランジンなどを含む様々なメディエイタに起因する、一次求心性ニューロンの変換過程の獲得(gain)の増加及びしきい値の低下を含む(例えば、Mayer et al., Gastroenterol., 107:271-293 (1994)参照)。管腔内の内容物の異常な処理及び/又はガスをもたらす、腸運動機能不全もIBSの原因病理に関係している(例えば、Kellow et al., Gastroenterol., 92:1885-1893 (1987);Levitt et al., Ann. Int. Med., 124:422-424 (1996)参照)。心理的要因もIBS症状の一因となることがあり、IBS症状はうつ病及び不安を含む障害によって誘発されない場合にはそれらと共に現れることがある(例えば、Drossman et al., Gastroenterol. Int., 8:47-90 (1995)参照)。
IBSの原因は充分には理解されていない。腸壁は、胃から腸管を通って直腸まで食物を移動させるときに収縮及び弛緩する筋肉の層で覆われている。通常、これらの筋肉は調和したリズムで収縮及び弛緩する。IBS患者において、これらの収縮は一般的に正常より強くかつ長く持続する。結果として、食物は腸をより急速に通過させられ、場合によりガス、鼓張、及び下痢を引き起こす。他の場合には、その逆が生じ:食物はゆっくりと通過し、便は硬くそして湿り気がなくなり便秘を引き起こす。
IBSの正確な病理生態はまだ解明されていない。腸運動不全及び変化した内臓知覚が症状の原因となる重要な因子であると考えられている(Quigley, Scand. J. Gastroenterol., 38(Suppl. 237):1-8 (2003);Mayer et al., Gastroenterol., 122:2032-2048 (2002))が、この状態は今や一般的には脳−腸軸の疾患と考えられている。最近になって、腸管感染症(enteric infection)及び腸炎の役割も提案されている。細菌学的に確認された胃腸炎の後にIBSが発症することを示した研究がある一方で、他の研究では、IBSにおける低グレードの粘膜炎症(Spiller et al., Gut, 47:804-811 (2000);Dunlop et al., Gastroenterol., 125:1651-1659 (2003);Cumberland et al., Epidemiol. Infect., 130:453-460 (2003))及び免疫活性化(Gwee et al., Gut,52:523-526 (2003); Pimentel et al., Am. J. Gastroenterol., 95:3503-3506 (2000))の証拠が提供された。腸内フローラも関係しており、最近の研究で、免疫活性の調節によって疾患を治療することにおけるプロバイオティック生物ビブィドバクテリウム(Bifidobacterium)属の有効性が示された(O'Mahony et al., Gastroenterol., 128:541-551 (2005))。
視床下部−脳下垂体−副腎軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis)(HPA)はヒトにおけるコアの内分泌ストレス系であり(De Wied et al., Front. Neuroendocrinol., 14:251-302 (1993))、脳と腸免疫系との間の重要な連結を提供する。この軸の活性化は身体的ストレス及び心理的ストレスの双方に対する応答によって起こり(Dinan, Br. J. Psychiatry, 164:365-371 (1994))、それら双方がIBSの病態生理に関係している(Cumberland et al., Epidemiol. Infect., 130:453-460 (2003))。IBS患者は、成人期にストレスの多い人生の出来事の割合が高いとともに、幼児期に性的及び身体的な虐待の割合が高いことが報告されている(Gaynes et al., Baillieres Clin. Gastroenterol.,13:437-452 ( 1999))。このような心理社会的なトラウマ又は乏しい認識に基づいた対処方法は症状の重症度、日常の機能及び健康転帰に深く影響を与える。
IBSの病因は充分に特徴付けられていないが、医学界はローマII基準として知られる、合意に基づく定義及び基準を作り出し、患者の履歴に基づくIBSの診断における補助とした。ローマII基準では、1年間期間にわたり3ヶ月間の持続的な又は再発性の腹痛又は腹部不快感があり、これらが排便によって軽減されること、及び/又は便の頻度若しくは硬さの変化並びに以下の2つ又は3つ以上と関連することを求めている:排便頻度の変化、便形状の変化、便通の変化、粘液の排泄、又は鼓張及び腹部膨満。症状を引き起こしている可能性のある構造的又は生化学的な任意の疾患が存在しないことも必要な条件である。その結果、ローマII基準は、実質的な患者履歴が存在する場合にのみ用いることができ、他にその症状を説明する異常な腸の構造又は代謝過程が存在しない場合にのみ確実となる。同様に、医学界によって最近作られたローマIII基準は、症状の特定のセット、詳細な患者履歴、及び理化学的検査の提示がある場合にのみ用いることができる。
患者がIBSに罹患していると診断するのは、IBSと他の疾病又は疾患との間の症状の類似性のため困難なことがあるということは充分に実証されている。実際に、IBSの症状は多くの他の腸疾患の症状と似ているか又は同じであるので、正確な診断を下すには数年間を要することがある。例えば、炎症性腸疾患(IBD)に罹っているが、例えば、鼓張、下痢、便秘、及び腹痛などの、軽度の徴候及び症状を示す患者は、IBS患者と見分けるのが難しいことがある。結果として、IBSとIBDとの間の症状の類似点は迅速かつ正確な診断を困難にする。IBSとIBDとを差異的に診断することの難しさはこれらの疾病の早期のかつ有効な治療を妨げる。あいにくなことに、IBSを同様な症状を示す他の腸疾病又は疾患から明確に識別する迅速かつ正確な診断方法で現在利用できるものはない。本発明はこの要求を満たすとともに関連した利点も提供する。
本発明は、個体由来の試料が過敏性腸症候群(IBS)又はそのサブタイプと関連しているか否かを正確に分類する方法、システム、及びコードを提供する。限定的でない例として、本発明は、統計的アルゴリズム及び/又は経験的データ(empirical data)を用いて、個体由来の試料をIBS試料と分類するのに有効である。本発明は、統計的アルゴリズム及び/又は経験的データの組み合わせを用いてIBS様の症状を示す1種又は2種以上の疾病又は疾患を除外し及びIBSを判定する(ruling in IBS)のにも有効である。従って、本発明は、IBSの正確な診断予測、IBSサブタイプの分類、及び治療決定を導くのに有効な予後診断情報を提供する。
1つの側面において、本発明は、過敏性腸症候群(IBS)の診断を必要とする被験者においてIBSを診断する方法であって、以下の工程:(a)被験者から採取された生物学的試料からRNAを単離及び/又は増幅する工程と;(b)検出試薬を該検出試薬とIBSのRNAバイオマーカーとを含む複合体に変換する(transform)のに適した条件下に、前記単離及び/又は増幅されたRNAを前記検出試薬と接触させる工程と;(c)前記複合体のレベルを検出する工程と;及び(d)前記複合体のレベルがIBSと関連する第一の参照レベル又はIBSの非存在と関連する第二の参照レベルとより密接に類似しているか否かを決定し、それによって被験者におけるIBS又はそのサブタイプを診断する工程と、を含み、前記バイオマーカーが表4に見出される遺伝子からなる群から選択される遺伝子、例えば、CCDC147など、由来のRNAである、方法を提供する。別の実施形態において、遺伝子は表6に見出される遺伝子からなる群から選択される。より好ましい実施形態において、遺伝子は表7に見出される遺伝子からなる群から選択される。
別の側面において、本発明は、被験者における過敏性腸症候群(IBS)の進行又は退行をモニタリングする方法であって、以下の工程:(a)第一の時点で被験者から採取された第一の生物学的試料から第一のバイオマーカープロファイルを決定する工程と;(b)第二の時点で被験者から採取された第二の生物学的試料から第二のバイオマーカープロファイルを決定する工程と;及び(c)前記第一のバイオマーカープロファイルと前記第二のバイオマーカープロファイルとを比較して、(i)いずれのバイオマーカープロファイルがIBSと関連する第一の参照プロファイルと最も多く類似しているか又は最も少なく類似しているかを決定し、(ii)いずれのバイオマーカープロファイルがIBSの非存在と関連する第二の参照プロファイルと最も少なく類似しているか又は最も多く類似しているかを決定し、又は(iii)前記類似性(resemblance)の少なくとも2つを決定し、ここで前記バイオマーカープロファイルが表4に見出される少なくとも2種のバイオマーカーの発現についての情報を含んでおり、そのことによって前記被験者におけるIBSの進行又は退行をモニタリングする工程と、を含む方法を提供する。別の実施形態において、バイオマーカープロファイルは、表6に見出される少なくとも2種のバイオマーカーの発現についての情報を含んでいる。より好ましい実施形態において、バイオマーカープロファイルは、表7に見出される少なくとも2種のバイオマーカーの発現についての情報を含んでいる。
さらに別の側面において、本発明は、IBS治療が必要な被験者に対してIBS治療を割り当てる(assigning)方法であって、以下の工程:(a)被験者から採取された生物学的試料からRNAを単離及び/又は増幅する工程と;(b)検出試薬を該検出試薬とIBSのRNAバイオマーカーとを含む複合体に変換するのに適した条件下に、前記単離及び/又は増幅されたRNAを前記検出試薬と接触させる工程と;(c)前記複合体のレベルを検出する工程と;及び(d)前記複合体のレベルがIBSと関連する第一の参照レベル又はIBSの非存在と関連する第二の参照レベルとより密接に類似しているか否かを決定する工程と;及び(e)前記レベルがIBSと関連する前記第一の参照レベルとより密接に類似している場合はIBS治療を割り当て、前記IBSのRNAバイオマーカーが表4に見出されるものからなる群から選択される工程と、を含む方法を提供する。別の実施形態において、遺伝子は表6に見出される遺伝子からなる群から選択される。より好ましい実施形態において、遺伝子は表7に見出される遺伝子からなる群から選択される。
或る実施形態において、本発明の方法はさらに、試料をIBS−便秘型(IBS−C)、IBS−下痢型(IBS−D)、IBS−混合型(IBS−M)、IBS−交替型(IBS−A)、又は感染後型(post-infectious)IBS(IBS−PI)試料と分類する工程を含む。他の実施形態において、本発明の方法はさらに、非IBS試料を正常試料、炎症性腸疾患(IBD)試料、又は非IBD試料と分類する工程を含む。
或る実施形態において、IBSを診断し、IBSの進行又は退行をモニタリングし、及び/又はIBS治療を割り当てる方法は、表2、表4、表6、及び表7に見出されるバイオマーカー少なくとも2種、3種、4種、5種、又は6種以上の検出を含む。他の実施形態において、本発明の方法はさらに、サイトカイン、成長因子、抗好中球抗体、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体、抗菌抗体、抗組織トランスグルタミナーゼ(tTG)抗体、リポカリン(lipocalin)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、リポカリンとMMPとの複合体、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤(TIMP)、グロブリン(例えば、アルファ−グロブリン)、アクチン切断タンパク質、S100タンパク質、フィブリノペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、タキキニン(tachykinin)、グレリン(ghrelin)、ニューロテンシン(neurotensin)、コルチコトロピン放出ホルモン(CRH)、エラスターゼ、C−反応性タンパク質(CRP)、ラクトフェリン、抗ラクトフェリン抗体、カルプロテクチン、ヘモグロビン、NOD2/CARD15、セロトニン再取り込み輸送体(SERT)、トリプトファンヒドロキシラーゼ−1、5−ヒドロキシトリプタミン(5−HT)、ラクツロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるバイオマーカーの検出を含む。
或る他の実施形態において、本発明の方法はさらに、症状プロファイルを決定する工程であって、前記症状プロファイルが前記個体における少なくとも1種の症状の存在又は重症度を同定すること(identifying)によって決定される工程と;及び前記診断マーカープロファイル及び前記症状プロファイルに基づきアルゴリズムを用いて前記試料をIBS試料又は非IBS試料と分類する工程とを含む。
これらの及び他の目的、側面及び実施形態は、以下の詳細な説明及び図面によりさらに明らかなものとなるであろう。
2007年8月14日出願の米国特許公報第2008/0085524号の図面は、あらゆる目的でその内容の全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
I.序論
過敏性腸疾病(IBS)は、西洋諸国において人口の15〜20%が発症している高い有病率の機能性消化器疾患であり、女性で有病率がより高い。IBSは、主な腸の症状に従って次の3つの群に分類される:便秘優勢型IBD(IBS−C)、下痢優勢型IBS(IBS−D)、及び下痢及び便秘が交替する症状のIBS(IBS−A)。
過敏性腸疾病(IBS)は、西洋諸国において人口の15〜20%が発症している高い有病率の機能性消化器疾患であり、女性で有病率がより高い。IBSは、主な腸の症状に従って次の3つの群に分類される:便秘優勢型IBD(IBS−C)、下痢優勢型IBS(IBS−D)、及び下痢及び便秘が交替する症状のIBS(IBS−A)。
患者がIBSに罹患していると診断するのは、IBSと他の疾病又は疾患との間の症状の類似性のため困難なことがある。例えば、炎症性腸疾患(IBD)に罹っているが、例えば、鼓張、下痢、便秘、及び腹痛などの、軽度の徴候及び症状を示す患者は、IBS患者と見分けるのが難しいことがある。結果として、IBSとIBDとの間の症状の類似性は迅速かつ正確な診断を困難なものにし、疾病の早期のかつ有効な治療を妨げる。
IBSは、現在の臨床診療において除外の診断となっている。患者は、症状に基づくローマ基準によって診断されるが、該基準とされるのは、排便による改善と関連する過去3ヶ月間の間に1月当たり少なくとも3日間の再発性の腹痛又は腹部不快感及び便の頻度又は形状の変化と関連する発症である。これらの症状は、他のGI疾患、例えば、機能性消化不良、線維筋痛(fibromyalgia)、慢性骨盤痛、及び間質性膀胱炎など、においてしばしば見られる。合併症の存在は診断をさらに複雑にする。
この疾病の原因は不明なままであるが、セロトニン生合成及び代謝(Gershon MD., J Clin Gastroenterol 39(5 Suppl 3):S184-93 (2005);Coates MD et al., Gastroenterology 126(7):1657-64 (2004);Mawe GM et al., Aliment Pharmacol Ther 23(8):1067-76 (2006))、肥満細胞浸潤(Roka R et al., Clin Gastroenterol Hepatol5(5):550-5 (2007);Barbara G et al., Gastroenterology 2007 Jan;132(1):26-37;Guilarte M et al., Gut56(2):203-9 (2007);Barbara G et al., Gastroenterology 126(3):693-702 (2004);O'Sullivan M et al., Neurogastroenterol Motil 12(5):449-57 (2000))、内臓過敏症、ストレス反応及び細菌感染(感染後IBS)を含む、幾つかの病態生理学的経路が調節不全にされる(dysregulated)ことを示す証拠がある。この表現型的に異質性の疾病の多数の可能性のある病理生態学的病因を考慮すれば、任意の単一の診断検査又はバイオマーカーがIBS患者を確実に同定することは考えにくい。さらに、症状に基づいた基準に頼ってIBSを診断することを医師が嫌うこと及び現在利用することのできる検査の診断値が乏しいことは、医師がIBSの信頼できる診断を行うのに役立つ簡単であるが高感度かつ特異的なアッセイの開発を正当化する。この目的に向けて、Prometheus Laboratories社は、10種の血清バイオマーカー及びアルゴリズムからなる血液をベースとする初めてのIBS検査を開発した。マーカーは、腸の運動性、脳−腸軸、ニューロン調節又は免疫機能に関与する生化学的又は生理学的経路と関連している。Prometheus IBS Diagnostic検査の感度、特異度及び正確度は、それぞれ、50%、88%及び70%である。
本発明は、とりわけ、候補遺伝子フォーカス経路駆動型(focus pathway driven)アプローチ並びにゲノムワイド遺伝子発現プロファイリングを用いた、第二世代のIBS診断検査を提供する。IBS患者から採取された組織試料におけるS字結腸粘膜組織を用いた遺伝子発現プロファイリングが報告されている(Schmulson MW and Chang L., Am J Med 107(5A):20S-26S (1999))。しかしながら、IBS患者の末梢血細胞中に「代用の」転写バイオマーカーが存在するか否かは知られていない。かかる遺伝子発現バイオマーカーが文献に報告されているが、そのマーカーは発行された炎症性腸疾患の研究のデータマイニングから引き出されたものである(Tillisch K and Chang L., Curr Gastroenterol Rep 7(4):249-56 (2005))。ここで、本発明者らは、IBS患者及び健常被験者から採取された末梢血試料中の遺伝子発現バイオマーカーを同定する最初のマイクロアレイ研究を行い、その結果をこの公報の中で提示する。
現在の臨床診療において、IBSの診断は、患者によって示された症状に加えて他の胃腸疾患の除外に基づく。この診療では、医師がIBSの信頼できる診断を行う前に広範囲の検査を指示する。あいにくなことに、全血球算定、化学、肝臓酵素、甲状腺機能検査、及び検便(stool sampling)を含む、医師が日常的に指示する検査の大部分は、典型的なIBS症状を有する患者における診断価値が極めて低くそして警告的な特徴(体重減少、便中の血液、原因不明の鉄欠乏性貧血、夜間下痢、又はIBDの家族歴、セリアックスプルー、又は結腸癌)を有していない(Cash BD et al., American Journal of Gastroenterology 97(11): 2812-2819 (2002))。患者は、症状に基づくローマ基準によって診断されるが、該基準とされるのは、排便による改善と関連する、過去3ヶ月間の間に1月当たり少なくとも3日間の再発性腹痛又は腹部不快感及び便の頻度又は形状の変化と関連する発症である。これらの症状は、他のGI疾患、例えば、機能性消化不良、線維筋痛、慢性骨盤痛、及び間質性膀胱炎など、においてしばしば見られる。結果として、IBS患者は医者に通院する頻度が高まり、薬の消費量が増え、そして非IBS患者より多くの診断検査を受けることになる(Schmulson MW and Chang L., Am J Med 107(5A):20S-26S (1999);Tillisch K and Chang L., Curr Gastroenterol Rep7(4):249-56 (2005))。合併症の存在は診断をさらに複雑にする。IBS症状は、有意に患者の生活の質を落としそして医療費を増大させる(Spiegel BM et al., Arch Intern Med 164(16):1773-80 (2004))。
S字結腸粘膜組織を用いたIBS患者試料の遺伝子発現プロファイル研究が報告されている。IBS患者の末梢血細胞中の「代用の」バイオマーカーがこれまでに報告されているが、当該マーカーは、既存の炎症性腸疾患の研究からのデータマイニングによって選択されたものである。このように、IBSの診断をより良好に促進する新規の代用バイオマーカーの発見に対する要求が存在する。
本発明は、1つの側面において、IBSの診断及び予後診断に有効な新規の遺伝子発現マーカーの発見によってこの要求を満たす。3人のIBS−D患者、2人のIBS−C患者及び3人の健常ボランティア由来の末梢全血試料を用いたAffymetrixマイクロアレイ研究。すべてのIBS患者がローマ基準IIIに合致しており健常ボランティアはIBS又は他の活性の合併症(active co-morbidities)の履歴を有していなかった。マイクロアレイデータの教師なし分析は、IBS患者と健常ボランティアとを識別する72遺伝子のセットを同定した。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって、選択された遺伝子のマイクロアレイ発現プロファイルをさらに検証した。選択された遺伝子の妥当性確認を22人のIBS−C、17人のIBS−D、12人のIBD−M、及び21人の健常ボランティアにおいて実施した。多重ロジスティック回帰及びランダムフォレスト予測を用いて発現データを分析した。このようにして、高い正確度で健常被験者からIBS患者を識別する新規の予測遺伝子のサブセットを確認した。これらの遺伝子の発現をさらに、全血球細胞及びその照合(matching)腸生検組織において比較した。
本発明は、IBS診断に対して重要な意味を持つ。例えば、本発明の1つの側面において、これらの新規なIBS発現マーカーは、IBSを診断し、IBSの予後診断を提供し、及び/又はIBSを細分類する(subtyping)ことを必要とする被験者においてそれらを行うのに用いることができる。別の側面において、これらのマーカーは既存の症状に基づくIBS診断を補完することができる。さらに別の側面において、IBSの診断及び予後診断に対して当該技術分野において公知の他の血清学的マーカーと組み合わせてこれらのマーカーを用いることができる。
II.定義
本明細書中で、以下の用語は他に特に断らない限りそれらに与えられた意味を有する。
本明細書中で、以下の用語は他に特に断らない限りそれらに与えられた意味を有する。
「分類すること(classifying)」という用語は、或る疾病状態を伴う試料を「関連づけること(to associate)」又は「類別すること(to categorize)」を含む。或る場合には、「分類すること」は、統計的証拠、経験的証拠、又はその双方に基づく。或る実施形態において、分類の方法及びシステムは、既知の疾病状態を有する試料のいわゆる訓練用セットを用いる。いったん方法及びシステムが確立されれば、その訓練データセットは未知の試料の特徴が比較される基礎、モデル、又はテンプレートとして機能して、試料の未知の疾病状態を分類する。或る場合には、試料を分類することは試料の疾患状態を診断することに通じる。或る他の場合には、試料を分類することは、別の疾患状態から試料の疾病状態を識別することに通じる。
「過敏性腸症候群」又は「IBS」という用語は、限定的でなく、一般に任意の明白な構造的異常が存在しない、腹痛、腹部不快感、排便パターンの変化、軟便又はより頻繁な便通、下痢、及び便秘、を含む1種又は2種以上の症状を特徴とする一群の機能性腸疾患を含む。症状の優位性に応じて、少なくとも3種のIBS型が存在する:(1)下痢優勢型(IBS−D);(2)便秘優勢型(IBS−C);及び(3)交替性の排便パターンを有するIBS(IBS−A)。IBSは、症状の混合型(IBS−M)として生じることもある。IBSの種々の臨床的サブタイプ、例えば、感染後IBS(IBS−PI)も存在する。
「試料」という用語は、個体から得られる任意の生物学的検体を含む。本発明に用いるのに適当な試料として、限定的でなく、全血、血漿、血清、唾液、尿、便、痰、涙、任意の他の体液、組織試料(例えば、生検)、及びそれらの細胞抽出物(例えば、赤血球細胞抽出物)を挙げることができる。好ましい実施形態において、試料は血清試料である。試料、例えば、血清、唾液、及び尿の使用が当該技術分野で周知である(例えば、Hashida et al., J. Clin. Lab. Anal., 11:267-86 (1997)参照)。当業者であれば、マーカーレベルの分析前に試料、例えば、血清試料など、を希釈することができることを理解されよう。
「バイオマーカー」又は「マーカー」という用語は、任意の診断マーカー、例えば、生化学的マーカー、血清学的マーカー、遺伝学的マーカー、又は個体由来の試料をIBS試料と分類し又は個体由来の試料においてIBS様の症状に関連する1種又は2種以上の疾病若しくは疾患を除外するのに用いることができる他の臨床的若しくは超音波検査上の特徴など、を含む。「バイオマーカー」又は「マーカー」という用語は、任意の分類マーカー、例えば、生化学的マーカー、血清学的マーカー、遺伝学的マーカー、又はIBSをその種々の型若しくは臨床的サブタイプの1つに分類するのに用いることができる他の臨床的若しくは超音波検査上の特徴など、も含む。本発明において用いるのに好適な診断マーカーの非限定的な例は後記するが、下記表2及び表3に見出されるmRNA及びタンパク質(例えば、FOXD3、PI4K2A、MAP1LC3A、ACSS2、ASIP、OR2L8、LPAR5、JARID1B、CDKN1C等)を含む。他の診断マーカーの例として、あらゆる目的でそれらの内容の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、2007年8月14日出願の米国特許公報第2008/0085524号、2009年6月25日出願の米国特許仮出願第61/220,525号、及び2009年10月30日出願の米国特許仮出願第61/256,717号に記載されたものを挙げることができる。或る実施形態において、診断マーカーを用いてIBSをその種々の型又は臨床的サブタイプの1つに分類することができる。他の実施形態において、分類マーカーを用いて、試料をIBS試料と分類し又はIBS様の症状に関連する1種又は2種以上の疾病若しくは疾患を除外することができる。当業者であれば、本発明に用いるのに好適な追加の診断及び分類マーカーを承知しているであろう。
「プロファイル」という用語は、本明細書中で用いられる場合、疾病又は疾患、例えば、IBS又はIBDなど、と関連する明確な特徴又は特性を表す、データの任意のセットを含む。この用語は、試料中の1種又は2種以上の診断マーカーを分析する「診断マーカープロファイル」、個体が経験している又は経験した1種又は2種以上のIBSと関連する臨床的因子(例えば、症状)を同定する「症状プロファイル」、及びそれらの組み合わせを含む。例えば、「診断マーカープロファイル」は、IBS及び/又はIBDと関連する1種又は2種以上の診断マーカーの存在又はレベルを表すデータのセットを含んでいることができる。1つの実施形態において、プロファイルは、被験者から採取された試料中のマーカー又はマーカーのセット(例えば、RNA、mRNA、miRNA、非コードRNA、タンパク質等)の発現のレベルに対応するデータのセットを含む「発現プロファイル」又は「核酸プロファイル」を含む。「遺伝子発現プロファイル」は、IBS、IBD、又はそのサブタイプと関連する1種又は2種以上の遺伝子のRNA、mRNA、miRNA、及び/又は非コードRNAレベルを表す遺伝子発現データのセットを含む。同様に、「症状プロファイル」は、IBS及び/又はIBDと関連する1種又は2種以上の症状の存在、重症度、頻度、及び/又は持続期間を表すデータのセットを含んでいることができる。
「個体」、「被験者」又は「患者」という用語は、一般にはヒトを指すが、例えば、他の霊長類、齧歯類、イヌ科動物、ネコ科動物、ウマ科動物、ヒツジ科動物、ブタ科動物など、を含む他の動物も指す。
「遺伝子」という用語は、mRNA、miRNA、tRNA、rRNA、非コードRNAなどを含むRNAに転写されるDNAのセグメントを含む。この用語は、ポリペプチド鎖を生成することに関与するDNAのセグメント並びにコード領域に先行する領域及び後続する領域、例えば、プロモーター、5’−非翻訳領域(5’UTR)、及び3’−非翻訳領域(3’UTR)など、並びに個々のコードセグメント(エクソン)間に位置する介在配列(イントロン)を含む。
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖型又は二本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを含む。明確に限定した場合を除いて、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有しかつ天然に存在するヌクレオチドと同様な方法で代謝される天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。他に断らない限り、特定の核酸配列は、その保存的に改変された(conservatively modified)変異体(例えば、縮重コドン置換)、対立遺伝子、スプライス変異体、オルソログ、SNP、及び相補的配列並びに明示的に示された配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1種又は2種以上の選択された(又はすべての)コドンの第3番目の位置が混合塩基及び/又はデオキシイノシン残基によって置換された配列を作製することによって達成することができる(Batzer et al., Nucleic Acid Res.,19:5081 (1991);Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985);Rossolini et al., Mol. Cell. Probes,8:91-98 (1994))。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、及び遺伝子によってコードされたRNA(例えば、mRNA、miRNA、tRNA、rRNA等)と互換的に用いられる。
「多型」という用語は、母集団(population)内における2種又は3種以上の遺伝学的に決定される代替(alternative)配列または対立遺伝子の存在を含む。「多型部位」は、差違(divergence)が生じる遺伝子座を含む。多型遺伝子座は、1塩基対という小ささであることができ(一塩基(single nucleotide)多型、すなわちSNP)、又は複数のヌクレオチドの挿入又は欠失を含んでいることができる。多型マーカーとして、限定的でなく、制限酵素断片長多型、可変数の縦列反復(VNTR)、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純反復、および挿入要素、例えば、Aluなど、を挙げることができる。最初に同定された対立遺伝子を任意に参照対立遺伝子と呼び、そして他の対立遺伝子を代替又は「変異対立遺伝子」と呼ぶ。選択された母集団において最も頻繁に出現する対立遺伝子を「野生型」対立遺伝子と呼ぶことがある。二倍体生物は変異対立遺伝子についてホモ接合又はヘテロ接合であることができる。変異対立遺伝子は、該変異対立遺伝子を有する個体において観察することのできる身体的又は生化学的特徴(「表現型」)を生じさせることがあり又は生じさせないことがある。例えば、変異対立遺伝子は、着目した遺伝子によってコードされるタンパク質の酵素活性を変えることができる。
「一塩基多型」又は「SNP」は、対立遺伝子配列間の変異部位である、一塩基によって占められた多型部位で生じる。通常、対立遺伝子の高度に保存された配列(例えば、母集団の1/100又は1/1000未満の構成員において変化する配列)がこの部位に先行し及び後続する。SNPは、通常、多型部位における1つのヌクレオチドの別のヌクレオチドへの置換によって生じる。トランジションは、1つのプリンの別のプリンによる置換、又は1つのピリミジンの別のピリミジンによる置換である。トランスバージョンはプリンのピリミジンによる置換又はその逆である。一塩基多型は、参照対立遺伝子に対する1つのヌクレオチドの欠失又は1つのヌクレオチドの挿入から生じることもある。
「遺伝子型」という用語は、本明細書中で用いる場合、生物の遺伝子構成を含んでおり、例えば、二倍体生物が着目した1つ又は2つ以上の変異対立遺伝子についてホモ接合であるか又はヘテロ接合であるかということを含んでいる。
「実質的に同じアミノ酸配列」という用語は、本明細書中で用いる場合、天然に存在するアミノ酸配列と同一ではないが類似するアミノ酸配列を含む。例えば、天然に存在するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するアミノ酸配列は、改変された配列が天然に存在するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の実質的に少なくとも1つの生物学的活性、例えば、免疫反応性、を保っているという条件で、天然に存在するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列に対して1つ又は2つ以上の改変、例えば、アミノ酸付加、欠失、又は置換、を有していることができる。アミノ酸配列間の実質的な類似性に対する比較は、通常、約6〜100残基、好ましくは、約10〜100残基、そしてより好ましくは、約25〜35残基の配列に関して行われる。本発明のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質のとりわけ有効な改変、又はその断片は、例えば、高められた安定性、を与える改変である。1つ又は2つ以上のD−アミノ酸の導入は、ポリペプチド又はポリペプチド断片の安定性を高めるのに有効な改変である。同様に、リシン残基の欠失又は置換は、ポリペプチド又はポリペプチド断片を分解に対して保護することによって安定性を高めることができる。
「IBSの進行又は退行をモニタリングすること」という用語は、本発明の方法、システム及びコードを用いて個体の疾病状態(例えば、IBSの存在又は重症度)を決定することを含む。或る場合に、アルゴリズム(例えば、学習統計的分類子システム(learning statistical classifier system))の結果は、より早期において同一個体について得られたそれらの結果と比較される。或る実施形態において、本発明の方法、システム及びコードを用いて、例えば、診断マーカーの分析及び/又は同定若しくはIBS関連症状に基づき、個体においてIBSが急速に又は徐々に進行する可能性を決定することによって、IBSの進行を予測することができる。他の実施形態において、本発明の方法、システム及びコードを用いて、例えば、診断マーカーの分析及び/又は同定若しくはIBS関連症状に基づき、個体においてIBSが急速に又は徐々に退行する可能性を決定することによって、IBSの退行を予測することができる。
「IBSの治療に有効な薬剤を受けている個体における薬剤の有効性をモニタリングすること」という用語は、本発明の方法、システム及びコードを用いて、IBS処置用の治療薬の投与後にこの治療薬の有効性を決定することを含む。ある場合には、アルゴリズム(例えば、学習統計的分類子システム)の結果を、治療薬の使用開始前又は治療のより早期段階における同一個体について得られたそれらの結果と比較する。IBSの治療に有効な薬剤は、本明細書で用いる場合、個体の健康を改善するために使用される任意の化合物又は薬剤であり、その例として、限定的でなく、IBS薬、例えば、セロトニン作動薬、抗うつ剤、塩化物チャネル活性化剤、塩化物チャネル遮断剤、グアニル酸シクラーゼアゴニスト、抗生物質、オピオイド、ニューロキニンアンタゴニスト、鎮痙薬又は抗コリン作動薬、ベラドンナアルカロイド、バルビツール酸塩、グルカゴン様ペプチド1(GLP−1)アナログ、コルチコトロピン放出因子(CRF)アンタゴニスト、プロバイオティクス、それらの遊離塩基、それらの薬剤学的に許容することのできる塩、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。
「治療的有効量又は用量」という用語は、治療効果の達成を必要とする被験者において該治療効果を達成することができる薬剤の用量を含む。例えば、IBSを治療するのに有効な薬剤の治療的有効量は、IBSと関連する1種又は2種以上の症状を予防又は軽減することができる量であることができる。正確な量は、公知の技術を用いて当業者によって確認することができる(例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms, Vols. 1-3 (1992);Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999);Pickar, Dosage Calculations(1999);及びRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2003)参照)。
III.実施形態の説明
本発明は、個体由来の試料がIBSと関連しているか否かを正確に分類する方法、システム、及びコードを提供する。或る実施形態において、本発明は、統計的アルゴリズム(例えば、学習統計的分類子システム)及び/又は経験的データ(例えば、IBSマーカーの存在若しくはレベル)を用いて、個体由来の試料をIBS試料と分類するのに有効である。本発明は、統計的アルゴリズム及び/又は経験的データの組み合わせを用いてIBS様の症状を示す1種又は2種以上の疾病又は疾患を除外し及びIBSを判定するのにも有効である。従って、本発明は、治療決定を導くのに有効なIBSの正確な診断予測及び予後診断情報を提供する。
本発明は、個体由来の試料がIBSと関連しているか否かを正確に分類する方法、システム、及びコードを提供する。或る実施形態において、本発明は、統計的アルゴリズム(例えば、学習統計的分類子システム)及び/又は経験的データ(例えば、IBSマーカーの存在若しくはレベル)を用いて、個体由来の試料をIBS試料と分類するのに有効である。本発明は、統計的アルゴリズム及び/又は経験的データの組み合わせを用いてIBS様の症状を示す1種又は2種以上の疾病又は疾患を除外し及びIBSを判定するのにも有効である。従って、本発明は、治療決定を導くのに有効なIBSの正確な診断予測及び予後診断情報を提供する。
A.IBS診断
1つの側面において、本発明は、過敏性腸症候群(IBS)の診断を必要とする被験者においてIBSを診断する方法であって、以下の工程:(a)被験者から採取された生物学的試料からRNAを単離及び/又は増幅する工程と;(b)検出試薬を該検出試薬とIBSのRNAバイオマーカーとを含む複合体に変換するのに適した条件下に、前記単離及び/又は増幅されたRNAを前記検出試薬と接触させる工程と;(c)前記複合体のレベルを検出する工程と;及び(d)前記複合体のレベルがIBSと関連する第一の参照レベル又はIBSの非存在と関連する第二の参照レベルとより密接に類似しているか否かを決定し、それによって被験者におけるIBSを診断する工程と、を含み、前記バイオマーカーが表4に見出される遺伝子からなる群から選択される遺伝子に由来するRNAである、方法を提供する。別の実施形態において、遺伝子は表6に見出される遺伝子からなる群から選択される。より好ましい実施形態において、遺伝子は表7に見出される遺伝子からなる群から選択される、例えば、少なくとも1種、少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、若しくは26種である。
1つの側面において、本発明は、過敏性腸症候群(IBS)の診断を必要とする被験者においてIBSを診断する方法であって、以下の工程:(a)被験者から採取された生物学的試料からRNAを単離及び/又は増幅する工程と;(b)検出試薬を該検出試薬とIBSのRNAバイオマーカーとを含む複合体に変換するのに適した条件下に、前記単離及び/又は増幅されたRNAを前記検出試薬と接触させる工程と;(c)前記複合体のレベルを検出する工程と;及び(d)前記複合体のレベルがIBSと関連する第一の参照レベル又はIBSの非存在と関連する第二の参照レベルとより密接に類似しているか否かを決定し、それによって被験者におけるIBSを診断する工程と、を含み、前記バイオマーカーが表4に見出される遺伝子からなる群から選択される遺伝子に由来するRNAである、方法を提供する。別の実施形態において、遺伝子は表6に見出される遺伝子からなる群から選択される。より好ましい実施形態において、遺伝子は表7に見出される遺伝子からなる群から選択される、例えば、少なくとも1種、少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、若しくは26種である。
本発明の或る実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーはmRNA又は発現される非コードRNAである。或る実施形態において、本発明の方法は、表4に見出される遺伝子少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、55種、60種、65種、70種、若しくはそれを超える種類の検出を含む。別の好ましい実施形態において、RNAバイオマーカー(1種又は2種以上)は、表6に見出される、例えば、少なくとも1種、少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、若しくは40種である。より好ましい実施形態において、RNAバイオマーカー(1種又は2種以上)は表7に見出される、例えば、少なくとも1種、少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、若しくは26種である。
1つの実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーは配列番号:1〜75及び154〜162のいずれか1つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするmRNA分子である。別の実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーは配列番号:76〜153のいずれか1つの核酸配列を含むRNA分子である。
特定の実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーは、CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A、及びFOXD3からなる群から選択される遺伝子から転写されるRNA分子である。好ましい実施形態において、遺伝子はCCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、又はGNG3である。別の実施形態において、IBSを診断又は細分類する方法は、少なくとも約5種のバイオマーカーのパネルを検出することを含む。好ましい実施形態において、マーカーはCCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、及びGNG3を含む。
或る実施形態において、検出試薬はオリゴヌクレオチドを含みそして複合体(例えば、変換(transformation)による)のレベルを検出する工程はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(例えば、マイクロアレイ又はビーズをベースとするハイブリダイゼーションアッセイ、xMAPアッセイ、ノーザンブロット、ドットブロット、RNアーゼ保護アッセイなど)及び/又は核酸増幅(例えば、PCR、qPCR、RT−PCR、qRT−PCR、質量分析など)を含む。さらに他の実施形態において、検出試薬は抗体でありそして試料中の複合体(例えば、変換による)のレベルを決定する方法は免疫化学的アッセイ(すなわち、免疫蛍光アッセイ、ELISA、IFAなど)を含む。
少なくとも1種の診断マーカーの存在又はレベルを検出又は決定するのに用いられる試料は、一般には、全血、血漿、血清、唾液、尿、便(すなわち、糞便)、涙、及び任意の他の体液、又は組織試料(すなわち、生検)、例えば、小腸又は結腸試料など、である。好ましくは、試料は、血清、全血、血漿、便、尿、又は組織生検である。或る場合に、本発明の方法はさらに、試料中の少なくとも1種の診断マーカーの存在又はレベルを検出又は決定する前に個体から試料を得る工程を含む。
或る実施形態において、本発明の方法は、追加のタンパク質又は血清学的IBSバイオマーカーと組み合わせてRNA IBSバイオマーカープロファイルを決定することを含む。或る実施形態において、追加の診断マーカープロファイルは、表2に見出される診断マーカー、2007年8月14日出願の米国特許公報第2008/0085524号、2009年6月25日出願の米国特許仮出願第61/220,525号、及び2009年10月30日出願の米国特許仮出願第61/256,717号に見出される診断マーカーから選択される追加の診断マーカー少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、又は11種以上の存在又はレベルを検出することによって決定される。
或る実施形態において、試料をIBS試料、IBSサブタイプ試料、又は非IBS試料と分類することに対して上記の診断マーカー1種又は2種以上を測定するパネルを構築し及び使用することができる。当業者であれば、例えば、個体の試料のアリコート又は希釈物を用いて、複数の診断マーカーの存在又はレベルを同時に又は順次に決定することができることを理解されよう。或る場合に、個体の試料中の特定の診断マーカーのレベルは、それが比較試料(例えば、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料)又は試料の母集団中の同じマーカーのレベルより少なくとも約25%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、又は1000%大きい(例えば、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料の比較母集団中の同じマーカーの中央値(median)レベルより大きい)場合に高いと考えられる。或る他の場合に、個体試料中の特定の診断マーカーのレベルは、それが比較試料(例えば、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料)又は試料の母集団中の同じマーカーのレベルより少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%小さい(例えば、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料の比較母集団中の同じマーカーの中央値レベルより小さい)場合に低いと考えられる。さらに他の実施形態において、IBSマーカーは、そのlog2倍の変化の大きさ(the magnitude its log2 fold change)(すなわち、陽性値又は陰性値)が、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料の比較母集団中の同じマーカーに対して、少なくとも約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0又はそれより大きい場合に、差異的に発現されていると考えられる。好ましい実施形態において、差異的に発現されるIBSバイオマーカーの前記大きさは、少なくとも約1.0、より好ましくは少なくとも約1.5、そして最も好ましくは少なくとも約2.5である。
或る実施形態において、IBSを判定し、IBSを診断し、又はIBSを分類する方法は、場合により症状プロファイルと組み合わせて診断マーカープロファイルを決定する工程であって、前記症状プロファイルが個体における少なくとも1種の症状の存在又は重症度を同定することによって決定される、工程と;及び前記診断マーカープロファイル及び症状プロファイルに基づきアルゴリズムを用いて試料をIBS試料又は非IBS試料と分類する工程と、を含む。当業者であれば、前記診断マーカープロファイル及び症状プロファイルを同時に又は任意の順序で順次に決定することができることを理解されよう。
或る実施形態において、試料をIBS試料又は非IBS試料と分類する工程は、統計的アルゴリズムと共に、単独での又は症状プロファイルと組み合わせた、診断マーカープロファイルに基づく。或る場合に、統計的アルゴリズムは学習統計的分類子システムである。学習統計的分類子システムは、ランダムフォレスト(RF)、分類及び回帰木(C&RT)、ブースト型の木(boosted tree)、ニューラルネットワーク(NN)、サポートベクターマシーン(SVM)、一般的なカイ二乗による相互作用の自動検出(chi-squared automatic interaction detector)モデル、相互作用型の木(interactive tree)、多変量適応回帰スプライン(multiadaptive regression spline)、機械学習分類子(machine learning classifier)、及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。好ましくは、学習統計的分類子システムは木をベースとする統計的アルゴリズム(例えば、RF、C&RT等)及び/又はNN(例えば、人工NN等)である。
或る場合に、統計的アルゴリズムは、単一の学習統計的分類子システムである。好ましくは、前記単一の学習統計的分類子システムは、木をベースとする統計的アルゴリズム、例えば、RF又はC&RTなど、を含む。限定的でない例として、単一の学習統計的分類子システムを用いて、単独での又は少なくとも1種の症状の存在又は重症度(すなわち、症状プロファイル)と組み合わせた、予測値又は確率値及び少なくとも1種の診断マーカーの存在又はレベル(すなわち、診断マーカープロファイル)に基づき、試料をIBS試料又は非IBS試料と分類することができる。単一の学習統計的分類子システムを使用することにより、一般には、少なくとも約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、及び/又は全体的正確度(overall accuracy)で試料をIBS試料と分類する。
或る他の場合において、統計的アルゴリズムは少なくとも2つの学習統計的分類子システムの組み合わせである。好ましくは、学習統計的分類子システムの組み合わせは、例えば、タンデム又はパラレルで用いられる、RF及びNNを含む。限定的でない例として、最初にRFを用いて、単独での又は症状プロファイルと組み合わせた、診断マーカープロファイルに基づき予測値又は確率値を生成することができ、そして次にNNを用いて前記予測値又は確率値及び同じ若しくは異なる診断マーカープロファイル又はプロファイルの組み合わせに基づいて試料をIBS試料又は非IBS試料と分類することができる。有利なことに、本発明のハイブリッド型RF/NN学習統計的分類子システムは、少なくとも約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、及び/又は全体的正確度で試料をIBS試料と分類する。
或る場合において、単数又は複数の学習統計的分類子システムを用いることによって得られるデータは、処理アルゴリズムを用いて処理することができる。かかる処理アルゴリズムは、例えば、多層パーセプトロン、バックプロパゲーションネットワーク、及びレーベンバーグ・マルカートアルゴリズム(Levenberg-Marquardt algorithm)からなる群から、選択することができる。他の場合において、前記処理アルゴリズムの組み合わせは、例えば、パラレル又はシリアル方式で用いることができる。
或る実施形態において、本発明の方法はさらに、非IBS試料を正常試料、炎症性腸疾患(IBD)試料、又は非IBD試料と分類する工程を含む。非IBS試料の分類は、例えば、上記した診断マーカーの少なくとも1種を用いて、行うことができる。
或る他の実施形態において、本発明の方法はさらに、IBS分類結果を臨床医、例えば、消化器専門医又は一般医に送信する工程を含む。別の実施形態において、本発明の方法は、個体がIBSに罹っている確率の形態で診断を提供する。例えば、個体は、約0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又はそれを超えるIBS罹患確率を有していることがある。さらに別の実施形態において、本発明の方法はさらに、個体におけるIBSの予後診断を提供する。例えば、予後診断は、外科的処置、IBSの或るカテゴリー又は臨床的サブタイプの発現(development)、1種又は2種以上の症状の発現、又は疾病からの回復であることができる。
或る実施形態において、個体がIBSに罹っているという診断があれば、それに続いてIBSと関連する1種又は2種以上の症状を治療するのに有効な薬剤の治療的有効量をその個体に投与する。適切なIBS薬として、限定的でなく、セロトニン作動薬、抗うつ剤、塩化物チャネル活性化剤、塩化物チャネル遮断剤、グアニル酸シクラーゼアゴニスト、抗生物質、オピオイドアゴニスト、ニューロキニンアンタゴニスト、鎮痙薬又は抗コリン作動薬、ベラドンナアルカロイド、バルビツール酸塩、GLP−1アナログ、CRFアンタゴニスト、プロバイオティクス、それらの遊離塩基、それらの薬剤学的に許容することのできる塩、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。他のIBS薬として、膨張性薬剤(bulking agents)、ドーパミンアンタゴニスト、駆風薬、トランキライザ、デクストフィソパム(dextofisopam)、フェニトイン、チモロール、及びジルチアゼムを挙げることができる。さらに、ニューロン細胞又はグリア細胞シグナル伝達に影響を及ぼすことによって腸透過性を調節するグルタミン及びグルタミン酸のようなアミノ酸を投与してIBS患者を治療することができる。
他の実施形態において、本発明の方法はさらに、IBS試料をIBS−便秘型(IBS−C)、IBS−下痢型(IBS−D)、IBS−混合型(IBS−M)、IBS−交替型(IBS−A)、又は感染後型IBS(IBS−PI)試料と分類する工程を含む。或る場合には、少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、又は11種以上の分類マーカーの存在又はレベルに基づいて、IBS試料をIBSのカテゴリー、形態、又は臨床的サブタイプに分類する。分類マーカーの限定的でない例を後記する。好ましくは、レプチンの存在又はレベルに基づきIBSの少なくとも1つの形態をIBSの少なくとも1つの他の形態から識別する。或る場合には、本発明の方法を用いて、IBSに罹っていると前に同定された個体においてIBS−A試料及び/又はIBS−D試料からIBS−C試料を識別することができる。或る他の場合に、本発明の方法を用いて、前にIBSに罹っているとは診断されなかった個体由来の試料をIBS−A試料、IBS−C試料、IBS−D試料、又は非IBS試料と分類することができる。
或る実施形態において、本発明の方法はさらに、分類の結果を臨床医に送信する工程を含む。或る他の実施形態において、本発明の方法はさらに、個体がIBS−A、IBS−C、IBS−D、IBS−M、又はIBS−PIに罹っている確率の形態で診断を提供する。本発明の方法はさらに、IBS−A、IBS−C、IBS−D、IBS−M、又はIBS−PIを治療するのに有効な薬剤の治療的有効量を個体に投与する工程を含んでいることができる。適切な薬剤として、限定的でなく、テガセロド(Zelnorm)、アロセトロン(Lotronex(商標))、ルビプロストン(Amitiza)、リファミキシン(Xifaxan)、MD−1100、プロバイオティクス、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。試料がIBS−A又はIBS−C試料と分類され及び/又はその個体がIBS−A又はIBS−Cに罹っていると診断された場合には、治療的有効量のテガセロド又は他の5−HT4アゴニスト(例えば、モサプリド、レンザプリド、AG1−001等)をその個体に投与することができる。或る場合において、試料がIBS−Cと分類され及び/又はその個体がIBS−Cに罹っていると診断された場合には、治療的有効量のルビプロストン若しくは他の塩化物チャネル活性化剤、リファミキシン若しくは腸内細菌異常増殖を制御することのできる他の抗生物質、MD−1100若しくは他のグアニル酸シクラーゼアゴニスト、アシマドリン若しくは他のオピオイドアゴニスト、又はタルネタント若しくは他のニューロキニンアゴニストをその個体に投与することができる。他の場合において、試料がIBS−Dと分類され及び/又はその個体がIBS−Dに罹っていると診断された場合には、治療的有効量のアロセトロン若しくは他の5−HT3アンタゴニスト(例えば、ラモセトロン、DDP−225等)、クロフェレマー若しくは他の塩化物チャネル遮断剤、タルネタント若しくは他のニューロキニンアゴニスト(例えば、サレデュタント(saredutant)等)、又は抗うつ剤、例えば、三環系抗うつ剤などをその個体に投与することができる。
追加の実施形態において、本発明の方法はさらに、腸炎を除外する工程を含む。腸炎の限定的でない例として、急性炎症、憩室炎、回腸嚢−肛門吻合、顕微鏡的大腸炎、感染性下痢、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。或る場合に、腸炎は、C反応性タンパク質(CRP)、ラクトフェリン、カルプロテクチン、又はそれらの組み合わせの存在又はレベルに基づいて除外される。
B.IBSモニタリング
別の側面において、本発明は、被験者における過敏性腸症候群(IBS)の進行又は退行をモニタリングする方法であって、以下の工程:(a)第一の時点で被験者から採取された第一の生物学的試料から第一のバイオマーカープロファイルを決定する工程と;(b)第二の時点で被験者から採取された第二の生物学的試料から第二のバイオマーカープロファイルを決定する工程と;及び(c)前記第一のバイオマーカープロファイルと前記第二のバイオマーカープロファイルとを比較して、(i)いずれのバイオマーカープロファイルがIBSと関連する第一の参照プロファイルと最も多く類似しているか又は最も少なく類似しているかを決定し、(ii)いずれのバイオマーカープロファイルがIBSの非存在と関連する第二の参照プロファイルと最も少なく類似しているか又は最も多く類似しているかを決定し、又は(iii)前記類似性の少なくとも2つを決定し、ここで前記バイオマーカープロファイルが表4に見出される少なくとも2種のバイオマーカーの発現についての情報を含んでおり、そのことによって前記被験者におけるIBSの進行又は退行をモニタリングする工程と、を含む方法を提供する。別の実施形態において、バイオマーカープロファイルは、表6に見出されるバイオマーカー少なくとも2種、例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、又は40種の、発現についての情報を含んでいる。好ましい実施形態において、バイオマーカープロファイルは、表7に見出されるバイオマーカー少なくとも2種、例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、又は26種、の発現についての情報を含んでいる。
別の側面において、本発明は、被験者における過敏性腸症候群(IBS)の進行又は退行をモニタリングする方法であって、以下の工程:(a)第一の時点で被験者から採取された第一の生物学的試料から第一のバイオマーカープロファイルを決定する工程と;(b)第二の時点で被験者から採取された第二の生物学的試料から第二のバイオマーカープロファイルを決定する工程と;及び(c)前記第一のバイオマーカープロファイルと前記第二のバイオマーカープロファイルとを比較して、(i)いずれのバイオマーカープロファイルがIBSと関連する第一の参照プロファイルと最も多く類似しているか又は最も少なく類似しているかを決定し、(ii)いずれのバイオマーカープロファイルがIBSの非存在と関連する第二の参照プロファイルと最も少なく類似しているか又は最も多く類似しているかを決定し、又は(iii)前記類似性の少なくとも2つを決定し、ここで前記バイオマーカープロファイルが表4に見出される少なくとも2種のバイオマーカーの発現についての情報を含んでおり、そのことによって前記被験者におけるIBSの進行又は退行をモニタリングする工程と、を含む方法を提供する。別の実施形態において、バイオマーカープロファイルは、表6に見出されるバイオマーカー少なくとも2種、例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、又は40種の、発現についての情報を含んでいる。好ましい実施形態において、バイオマーカープロファイルは、表7に見出されるバイオマーカー少なくとも2種、例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、又は26種、の発現についての情報を含んでいる。
本発明の或る実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーはmRNA又は発現される非コードRNAである。或る実施形態において、本発明の方法は、表4に見出される遺伝子少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、55種、60種、65種、70種、若しくはそれを超える種類の検出を含む。別の好ましい実施形態において、RNAバイオマーカー(1種又は2種以上)は、表6に見出される、例えば、少なくとも1種、少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、若しくは40種である。より好ましい実施形態において、RNAバイオマーカー(1種又は2種以上)は表7に見出される、例えば、少なくとも1種、少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、若しくは26種である。
本発明の1つの実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーは、配列番号:1〜75及び154〜162のいずれか1つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするmRNA分子である。別の実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーは配列番号:76〜153のいずれか1つの核酸配列を含むRNA分子である。
特定の実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーは、CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A、及びFOXD3からなる群から選択される遺伝子から転写されるRNA分子である。好ましい実施形態において、遺伝子はCCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、又はGNG3である。別の実施形態において、被験者におけるIBSの進行又は退行をモニタリングする方法は、少なくとも約5種のバイオマーカーのパネルを検出する工程を含む。好ましい実施形態において、マーカーはCCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、及びGNG3を含む。
或る実施形態において、検出試薬はオリゴヌクレオチドを含みそして複合体(例えば、変換による)のレベルを検出する工程はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(例えば、マイクロアレイ又はビーズをベースとするハイブリダイゼーションアッセイ、xMAPアッセイ、ノーザンブロット、ドットブロット、RNアーゼ保護アッセイなど)及び/又は核酸増幅(例えば、PCR、qPCR、RT−PCR、qRT−PCR、質量分析など)を含む。さらに他の実施形態において、検出試薬は抗体でありそして試料中の複合体(例えば、変換による)のレベルを決定する方法は免疫化学的アッセイ(すなわち、免疫蛍光アッセイ、ELISA、IFAなど)を含む。
少なくとも1種の診断マーカーの存在又はレベルを検出又は決定するのに用いられる試料は、一般的には、全血、血漿、血清、唾液、尿、便(すなわち、糞便)、涙、及び任意の他の体液、又は組織試料(すなわち、生検)、例えば、小腸又は結腸試料など、である。好ましくは、試料は、血清、全血、血漿、便、尿、又は組織生検である。或る場合に、本発明の方法はさらに、試料中の少なくとも1種の診断マーカーの存在又はレベルを検出又は決定する前に個体から試料を得る工程を含む。
或る実施形態において、本発明の方法は、追加のタンパク質又は血清学的IBSバイオマーカーと組み合わせてRNA IBSバイオマーカープロファイルを決定する工程を含む。或る実施形態において、追加の診断マーカープロファイルは、表2に見出される診断マーカー、2007年8月14日出願の米国特許公報第2008/0085524号、2009年6月25日出願の米国特許仮出願第61/220,525号、及び2009年10月30日出願の米国特許仮出願第61/256,717号に見出される診断マーカーから選択される追加の診断マーカー少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、又は11種以上の存在又はレベルを検出することによって決定される。
或る実施形態において、被験者におけるIBSの進行又は退行をモニタリングするために上記の診断マーカー1種又は2種以上を測定するパネルを構築し及び使用することができる。当業者であれば、例えば、個体の試料のアリコート又は希釈物を用いて、複数の診断マーカーの存在又はレベルを同時に又は順次に決定することができることを理解されよう。或る場合に、個体の試料中の特定の診断マーカーのレベルは、それが比較試料(例えば、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料)又は試料の母集団中の同じマーカーのレベルより少なくとも約25%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、又は1000%大きい(例えば、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料の比較母集団中の同じマーカーの中央値レベルより大きい)場合に高いと考えられる。
1つの側面において、被験者における過敏性腸症候群(IBS)の進行又は退行をモニタリングする方法は、第一の時点及び第二の時点における1種又は2種以上のバイオマーカーのレベル又はプロファイルを決定する工程と及び前記レベル又はプロファイルを比較する工程とを含む。1つの実施形態において、バイオマーカーの増加したレベル又は発現がIBSと関連している場合、1回目に被験者から採取された試料中のバイオマーカーの発現と比較したときの、2回目に被験者から採取された試料中のバイオマーカーのレベルの減少は、被験者におけるIBSの退行を示す。別の実施形態において、バイオマーカーの増加したレベル又は発現がIBSと関連している場合、1回目に被験者から採取された試料中のバイオマーカーの発現と比較したときの、2回目に被験者から採取された試料中のバイオマーカーのレベルの増加は、被験者におけるIBSの進行を示す。
或る他の場合に、個体の試料中の特定の診断マーカーのレベルは、それが比較試料(例えば、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料)又は試料の母集団中の同じマーカーのレベルより少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%小さい(例えば、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料の比較集団中の同じマーカーの中央値レベルより小さい)場合に低いと考えられる。
別の実施形態において、バイオマーカーの低下したレベル又は発現がIBSと関連している場合に、1回目に被験者から採取された試料中のバイオマーカーの発現と比較したときの、2回目に被験者から採取された試料中のバイオマーカーのレベルの増加は、被験者におけるIBSの退行を示す。別の実施形態において、バイオマーカーの低下したレベル又は発現がIBSと関連している場合に、1回目に被験者から採取された試料中のバイオマーカーの発現と比較したときの、2回目に被験者から採取された試料中のバイオマーカーのレベルの減少は、被験者におけるIBSの進行を示す。
さらに他の実施形態において、IBSマーカーは、そのlog2倍の変化の大きさ(すなわち、陽性値又は陰性値)が、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料の比較母集団中の同じマーカーに対して、少なくとも約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0又はそれより大きい場合に、差異的に発現されていると考えられる。好ましい実施形態において、差異的に発現されるIBSバイオマーカーの前記大きさは、少なくとも約1.0、より好ましくは少なくとも約1.5、そして最も好ましくは少なくとも約2.5である。
或る実施形態において、被験者におけるIBSの進行又は退行をモニタリングする方法は、場合により症状プロファイルと組み合わせて診断マーカープロファイルを決定する工程であって、前記症状プロファイルが、第一の時点における個体の少なくとも1種の症状の存在又は重症度を同定し;第二の時点における個体の少なくとも1種の症状の存在又は重症度を同定し;前記第一の時点と前記第二の時点とにおける少なくとも1種の症状プロファイルの存在又は重症度を比較することによって決定される工程と;前記診断マーカープロファイル及び症状プロファイルに基づきアルゴリズムを用いてその個体においてIBSの進行又は退行があったか否かを決定する工程と、を含む。当業者であれば、前記診断マーカープロファイル及び症状プロファイルを同時に又は任意の順序で順次に決定することができることを理解されよう。
或る実施形態において、被験者におけるIBSの進行又は退行をモニタリングする方法は、場合により症状プロファイルと組み合わせて診断マーカープロファイルを決定する工程であって、前記症状プロファイルが個体の少なくとも1種の症状の存在又は重症度を同定することによって決定される工程と;及び前記診断マーカープロファイル及び症状プロファイルに基づきアルゴリズムを用いて試料をIBS試料又は非IBS試料と分類する工程と、を含む。当業者であれば、前記診断マーカープロファイル及び症状プロファイルを同時に又は任意の順序で順次に決定することができることを理解されよう。
或る実施形態において、被験者におけるIBSの進行又は退行のモニタリングは、統計的アルゴリズムとともに、単独での又は症状プロファイルと組み合わせた診断マーカープロファイルに基づく。或る場合に、統計的アルゴリズムは学習統計的分類子システムである。学習統計的分類子システムは、ランダムフォレスト(RF)、分類及び回帰木(C&RT)、ブースト型の木、ニューラルネットワーク(NN)、サポートベクターマシーン(SVM)、一般的なカイ二乗による相互作用の自動検出モデル、相互作用型の木、多変量適応回帰スプライン、機械学習分類子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。好ましくは、学習統計的分類子システムは木をベースとする統計的アルゴリズム(例えば、RF、C&RT等)及び/又はNN(例えば、人工NN等)である。
或る場合に、統計的アルゴリズムは、単一の学習統計的分類子システムである。好ましくは、前記単一の学習統計的分類子システムは、木をベースとする統計的アルゴリズム、例えば、RF又はC&RTを含む。限定的でない例として、単一の学習統計的分類子システムを用いて、予測値又は確率値及び少なくとも1種の診断マーカーの存在又はレベル(すなわち、診断マーカープロファイル)に基づき、単独で又は少なくとも1種の症状の存在又は重症度(すなわち、症状プロファイル)と組み合わせて、被験者におけるIBSの進行又は退行をモニタリングすることができる。単一の学習統計的分類子システムを使用することにより、一般的には、少なくとも約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、及び/又は全体的正確度で試料を進行性又は退行性のIBS試料と分類する。
或る他の場合に、統計的アルゴリズムは少なくとも2つの学習統計的分類子システムの組み合わせである。好ましくは、学習統計的分類子システムの組み合わせは、例えば、タンデム又はパラレルで用いられる、RF及びNNを含む。限定的でない例として、最初にRFを用いて診断マーカープロファイルに基づき、単独で又は症状プロファイルと組み合わせて、予測値又は確率値を生成することができ、そして次にNNを用いて前記予測値又は確率値及び同じ若しくは異なる診断マーカープロファイル又はプロファイルの組み合わせに基づき試料がIBSの進行又は退行に該当するか否かを決定することができる。有利なことに、本発明のハイブリッド型RF/NN学習統計的分類子システムは、少なくとも約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、及び/又は全体的正確度で試料を進行性又は退行性のIBS試料と分類する。
或る場合において、単数又は複数の学習統計的分類子システムを用いることによって得られるデータは、処理アルゴリズムを用いて処理することができる。かかる処理アルゴリズムは、例えば、多層パーセプトロン、バックプロパゲーションネットワーク、及びレーベンバーグ・マルカートアルゴリズムからなる群から、選択することができる。他の場合において、前記処理アルゴリズムの組み合わせは、例えば、パラレル又はシリアル方式で用いることができる。
或る他の実施形態において、本発明の方法はさらに、IBS分類結果を臨床医、例えば、消化器専門医又は一般医に送信する工程を含む。別の実施形態において、本発明の方法は、被験者においてIBSが進行性又は退行性である確率の形態で診断を提供する。例えば、個体は、約0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又はそれを超える、進行性又は退行性であるIBS罹患の確率を有していることがある。さらに別の実施形態において、本発明の方法はさらに、個体のIBSの予後診断を提供する。例えば、予後診断は、外科的処置、IBSの或るカテゴリー又は臨床的サブタイプの発現、1種又は2種以上の症状の発現、又は疾病からの回復であることができる。
或る実施形態において、個体がIBSに罹っているという診断があれば、それに続いてIBSと関連する1種又は2種以上の症状を治療するのに有効な薬剤の治療的有効量をその個体に投与する。適切なIBS薬として、限定的でなく、セロトニン作動薬、抗うつ剤、塩化物チャネル活性化剤、塩化物チャネル遮断剤、グアニル酸シクラーゼアゴニスト、抗生物質、オピオイドアゴニスト、ニューロキニンアンタゴニスト、鎮痙薬又は抗コリン作動薬、ベラドンナアルカロイド、バルビツール酸塩、GLP−1アナログ、CRFアンタゴニスト、プロバイオティクス、それらの遊離塩基、それらの薬剤学的に許容することのできる塩、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。他のIBS薬として、膨張性薬剤、ドーパミンアンタゴニスト、駆風薬、トランキライザ、デクストフィソパム、フェニトイン、チモロール、及びジルチアゼムを挙げることができる。さらに、ニューロン細胞又はグリア細胞シグナル伝達に影響を及ぼすことによって腸の透過性を調節するグルタミン及びグルタミン酸のようなアミノ酸を投与してIBS患者を治療することができる。
本発明の方法はさらに、IBS−A、IBS−C、IBS−D、IBS−M、又はIBS−PIを治療するのに有効な薬剤の治療的有効量を個体に投与する工程を含んでいることができる。適切な薬剤として、限定的でなく、テガセロド(Zelnorm)、アロセトロン(Lotronex(商標))、ルビプロストン(Amitiza)、リファミキシン(Xifaxan)、MD−1100、プロバイオティクス、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。試料がIBS−A又はIBS−C試料と分類され及び/又はその個体がIBS−A又はIBS−Cに罹っていると診断された場合には、治療的有効量のテガセロド又は他の5−HT4アゴニスト(例えば、モサプリド、レンザプリド、AG1−001等)をその個体に投与することができる。或る場合において、試料がIBS−Cと分類され及び/又はその個体がIBS−Cに罹っていると診断された場合には、治療的有効量のルビプロストン若しくは他の塩化物チャネル活性化剤、リファミキシン若しくは腸内細菌異常増殖を制御することのできる他の抗生物質、MD−1100若しくは他のグアニル酸シクラーゼアゴニスト、アシマドリン若しくは他のオピオイドアゴニスト、又はタルネタント若しくは他のニューロキニンアゴニストをその個体に投与することができる。他の場合において、試料がIBS−Dと分類され及び/又はその個体がIBS−Dに罹っていると診断された場合には、治療的有効量のアロセトロン若しくは他の5−HT3アンタゴニスト(例えば、ラモセトロン、DDP−225等)、クロフェレマー若しくは他の塩化物チャネル遮断剤、タルネタント若しくは他のニューロキニンアンタゴニスト(例えば、サレデュタント等)、又は抗うつ剤、例えば、三環系抗うつ剤などをその個体に投与することができる。
1つの実施形態において、IBSの進行又は退行をモニタリングする方法は、IBS治療を施された被験者、例えば、第一の生物学的試料の採取と第二の生物学的試料の採取との間に挟まれた期間にIBS治療を施された被験者、をモニタリングする工程を含んでいることができる。従って、1つの実施形態において、IBSの進行又は退行をモニタリングする方法はIBS治療の臨床的有効性を評価するのに役立つ。
1つの実施形態において、バイオマーカーの増加したレベル又は発現がIBSと関連している場合、IBS治療の適用前の時点で被験者から採取された試料中のバイオマーカーの発現と比較したときの、該治療の適用後の時点で被験者から採取された試料中のバイオマーカーのレベルの低下は、治療の有効性を示す。別の実施形態において、バイオマーカーの増加したレベル又は発現がIBSと関連している場合、IBS治療の適用前の時点で被験者から採取された試料中のバイオマーカーの発現と比較したときの、該治療の適用後の時点で被験者から採取された試料中のバイオマーカーのレベルの増加は、治療の有効性の欠如を示す。
別の実施形態において、バイオマーカーの低下したレベル又は発現がIBSと関連している場合、IBS治療の適用前の時点で被験者から採取された試料中のバイオマーカーの発現と比較したときの、該治療の適用後の時点で被験者から採取された試料中のバイオマーカーのレベルの増加は、治療の有効性を示す。さらに別の実施形態において、バイオマーカーの低下したレベル又は発現がIBSと関連している場合、IBS治療の適用前の時点で被験者から採取された試料中のバイオマーカーの発現と比較したときの、該治療の適用後の時点で被験者から採取された試料中のバイオマーカーのレベルの低下は、治療の有効性の欠如を示す。
被験者におけるIBS治療の有効性を決定した後、本発明の方法はさらに、被験者が治療に応答する場合には、治療を継続的に適用する工程を含んでいることができ、又はその代わりに、被験者が治療に応答しない場合には、被験者に対する治療を中止し、変更し、及び/又は代わりの治療を適用する工程を含んでいることができる。
C.IBS治療の割り当て
別の側面において、本発明は、IBS治療が必要な被験者に対してIBS治療を割り当てる方法であって、以下の工程:(a)被験者から採取された生物学的試料からRNAを単離及び/又は増幅する工程と;(b)検出試薬を該検出試薬とIBSのRNAバイオマーカーとを含む複合体に変換するのに適した条件下に、前記単離及び/又は増幅されたRNAを前記検出試薬と接触させる工程と;(c)前記複合体のレベルを検出する工程と;(d)前記複合体のレベルがIBSと関連する第一の参照レベル又はIBSの非存在と関連する第二の参照レベルとより密接に類似しているか否かを決定する工程と;及び(e)前記レベルがIBSと関連する前記第一の参照レベルとより密接に類似している場合はIBS治療を割り当てる工程と、を含み、前記IBSのRNAバイオマーカーが表4に見出されるものからなる群から選択される、方法を提供する。好ましい実施形態において、RNAバイオマーカー(1種又は2種以上)は表6に見出される、例えば、少なくとも1種、少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、又は40種である。より好ましい実施形態において、RNAバイオマーカー(1種又は2種以上)は表7に見出される、例えば、少なくとも1種、少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、又は26種である。
別の側面において、本発明は、IBS治療が必要な被験者に対してIBS治療を割り当てる方法であって、以下の工程:(a)被験者から採取された生物学的試料からRNAを単離及び/又は増幅する工程と;(b)検出試薬を該検出試薬とIBSのRNAバイオマーカーとを含む複合体に変換するのに適した条件下に、前記単離及び/又は増幅されたRNAを前記検出試薬と接触させる工程と;(c)前記複合体のレベルを検出する工程と;(d)前記複合体のレベルがIBSと関連する第一の参照レベル又はIBSの非存在と関連する第二の参照レベルとより密接に類似しているか否かを決定する工程と;及び(e)前記レベルがIBSと関連する前記第一の参照レベルとより密接に類似している場合はIBS治療を割り当てる工程と、を含み、前記IBSのRNAバイオマーカーが表4に見出されるものからなる群から選択される、方法を提供する。好ましい実施形態において、RNAバイオマーカー(1種又は2種以上)は表6に見出される、例えば、少なくとも1種、少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、又は40種である。より好ましい実施形態において、RNAバイオマーカー(1種又は2種以上)は表7に見出される、例えば、少なくとも1種、少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、又は26種である。
本発明の或る実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーはmRNA又は発現される非コードRNAである。或る実施形態において、本発明の方法は、表4に見出される遺伝子少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、55種、60種、65種、70種、若しくはそれを超える種の検出を含む。好ましい実施形態において、本発明の方法は、表6に見出される遺伝子少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、若しくは40種の検出を含む。好ましい実施形態において、RNAバイオマーカー(1種又は2種以上)は、表6に見出される、例えば、少なくとも1種、少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、若しくは40種である。より好ましい実施形態において、本発明の方法は、表7に見出される遺伝子少なくとも2種又は少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、若しくは26種すべての検出を含む。
本発明の1つの実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーは配列番号:1〜75及び154〜162のいずれか1つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするmRNA分子である。別の実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーは配列番号:76〜153のいずれか1つの核酸配列を含むRNA分子である。
特定の実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーは、CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A、及びFOXD3からなる群から選択される遺伝子から転写されるRNA分子である。好ましい実施形態において、遺伝子はCCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、又はGNG3である。別の実施形態において、IBS治療を割り当てる必要のある被験者にIBS治療を割り当てる方法は、少なくとも約5種のバイオマーカーのパネルを検出する工程を含む。好ましい実施形態において、マーカーはCCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、及びGNG3を含む。
或る実施形態において、検出試薬はオリゴヌクレオチドを含みそして複合体(例えば、変換による)のレベルを検出する工程はオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション(例えば、マイクロアレイ又はビーズをベースとするハイブリダイゼーションアッセイ、xMAPアッセイ、ノーザンブロット、ドットブロット、RNアーゼ保護アッセイなど)及び/又は核酸増幅(例えば、PCR、qPCR、RT−PCR、qRT−PCR、質量分析など)を含む。さらに他の実施形態において、検出試薬は抗体でありそして試料中の複合体(例えば、変換による)のレベルを決定する方法は免疫化学的アッセイ(すなわち、免疫蛍光アッセイ、ELISA、IFAなど)を含む。
少なくとも1種の診断マーカーの存在又はレベルを検出又は決定するのに用いられる試料は、一般的には、全血、血漿、血清、唾液、尿、便(すなわち、糞便)、涙、及び任意の他の体液、又は組織試料(すなわち、生検)、例えば、小腸又は結腸試料など、である。好ましくは、試料は、血清、全血、血漿、便、尿、又は組織生検である。或る場合に、本発明の方法はさらに、試料中の少なくとも1種の診断マーカーの存在又はレベルを検出又は決定する前に個体から試料を得る工程を含む。
或る実施形態において、本発明の方法は、追加のタンパク質又は血清学的IBSバイオマーカーと組み合わせてRNA IBSバイオマーカープロファイルを決定することを含む。或る実施形態において、追加の診断マーカープロファイルは、表2に見出される診断マーカー、2007年8月14日出願の米国特許公報第2008/0085524号、2009年6月25日出願の米国特許仮出願第61/220,525号、及び2009年10月30日出願の米国特許仮出願第61/256,717号に見出される診断マーカーから選択される追加の診断マーカー少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、又は11種以上の存在又はレベルを検出することによって決定される。
或る実施形態において、IBS治療を割り当てる必要のある被験者にそれを割り当てるために上記の診断マーカー1種又は2種以上を測定するパネルを構築し及び使用することができる。当業者であれば、例えば、個体の試料のアリコート又は希釈物を用いて、複数の診断マーカーの存在又はレベルを同時に又は順次に決定することができることを理解されよう。或る場合に、個体の試料中の特定の診断マーカーのレベルは、それが比較試料(例えば、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料)又は試料の母集団中の同じマーカーのレベルより少なくとも約25%、50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、又は1000%大きい(例えば、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料の比較母集団中の同じマーカーの中央値レベルより大きい)場合に高いと考えられる。或る他の場合に、個体の試料中の特定の診断マーカーのレベルは、それが比較試料(例えば、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料)又は試料の母集団中の同じマーカーのレベルより少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%小さい(例えば、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料の比較母集団中の同じマーカーの中央値レベルより小さい)場合に低いと考えられる。さらに他の実施形態において、IBSマーカーは、そのlog2倍の変化の大きさ(すなわち、陽性値又は陰性値)が、正常、GI対照、IBS、IBD、及び/又はセリアック病試料の比較母集団中の同じマーカーに対して、少なくとも約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0又はそれより大きい場合に、差異的に発現されていると考えられる。好ましい実施形態において、差異的に発現されるIBSバイオマーカーの前記大きさは、少なくとも約1.0、より好ましくは少なくとも約1.5、そして最も好ましくは少なくとも約2.5である。
或る実施形態において、IBS治療を割り当てる方法は、場合により症状プロファイルと組み合わせて診断マーカープロファイルを決定する工程であって、前記症状プロファイルが個体における少なくとも1種の症状の存在又は重症度を同定することによって決定される、工程と;及び前記診断マーカープロファイル及び症状プロファイルに基づきアルゴリズムを用いてIBS治療を割り当てる工程と、を含む。当業者であれば、前記診断マーカープロファイル及び症状プロファイルを同時に又は任意の順序で順次に決定することができることを理解されよう。
或る実施形態において、IBS治療を割り当てる工程は、統計的アルゴリズムとともに、単独での又は症状プロファイルと組み合わせた、診断マーカープロファイルに基づく。或る場合に、統計的アルゴリズムは学習統計的分類子システムである。学習統計的分類子システムは、ランダムフォレスト(RF)、分類及び回帰木(C&RT)、ブースト型の木、ニューラルネットワーク(NN)、サポートベクターマシーン(SVM)、一般的なカイ二乗による相互作用の自動検出モデル、相互作用型の木、多変量適応回帰スプライン、機械学習分類子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択することができる。好ましくは、学習統計的分類子システムは木をベースとする統計的アルゴリズム(例えば、RF、C&RT等)及び/又はNN(例えば、人工NN等)である。
或る場合に、統計的アルゴリズムは、単一の学習統計的分類子システムである。好ましくは、前記単一の学習統計的分類子システムは、木をベースとする統計的アルゴリズム、例えば、RF又はC&RTなど、を含む。限定的でない例として、単一の学習統計的分類子システムを用いて、単独での又は少なくとも1種の症状の存在又は重症度(すなわち、症状プロファイル)と組み合わせた、予測値又は確率値及び少なくとも1種の診断マーカーの存在又はレベル(すなわち、診断マーカープロファイル)に基づき、IBS治療を割り当てることができる。単一の学習統計的分類子システムを使用することにより、一般には、少なくとも約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、及び/又は全体的正確度で試料をIBS試料と分類する。
或る他の場合において、統計的アルゴリズムは少なくとも2つの学習統計的分類子システムの組み合わせである。好ましくは、学習統計的分類子システムの組み合わせは、例えば、タンデム又はパラレルで用いられる、RF及びNNを含む。限定的でない例として、最初にRFを用いて、単独での又は症状プロファイルと組み合わせた、診断マーカープロファイルに基づき予測値又は確率値を生成することができ、そして次にNNを用いて前記予測値又は確率値及び同じ若しくは異なる診断マーカープロファイル又はプロファイルの組み合わせに基づいてIBS治療を割り当てることができる。有利なことに、本発明のハイブリッド型RF/NN学習統計的分類子システムは、少なくとも約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、及び/又は全体的正確度で試料をIBS試料と分類する。
或る場合において、単数又は複数の学習統計的分類子システムを用いることによって得られるデータは、処理アルゴリズムを用いて処理することができる。かかる処理アルゴリズムは、例えば、多層パーセプトロン、バックプロパゲーションネットワーク、及びレーベンバーグ・マルカートアルゴリズムからなる群から、選択することができる。他の場合において、前記処理アルゴリズムの組み合わせは、例えば、パラレル又はシリアル方式で用いることができる。
或る他の実施形態において、本発明の方法はさらに、治療の割り当てを臨床医、例えば、消化器専門医又は一般医に送信する工程を含む。別の実施形態において、本発明の方法は、個体が割り当てられた特定の治療に応答する確率の形態で治療の割り当てを提供する。例えば、個体は、約0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又はそれを超える、治療に対する応答確率を有していることがある。さらに別の実施形態において、本発明の方法はさらに、個体における治療の予後診断を提供する。例えば、予後診断は、外科的処置、IBSの或るカテゴリー又は臨床的サブタイプの発現、1種又は2種以上の症状の発現、IBSの退行、IBSの進行、又は疾病からの回復であることができる。
或る実施形態において、治療の割り当てに続いてIBSと関連する1種又は2種以上の症状を治療するのに有効な薬剤の治療的有効量をその個体に投与する(すなわち、割り当てられた治療の適用)。適切なIBS薬として、限定的でなく、セロトニン作動薬、抗うつ剤、塩化物チャネル活性化剤、塩化物チャネル遮断剤、グアニル酸シクラーゼアゴニスト、抗生物質、オピオイドアゴニスト、ニューロキニンアンタゴニスト、鎮痙薬又は抗コリン作動薬、ベラドンナアルカロイド、バルビツール酸塩、GLP−1アナログ、CRFアンタゴニスト、プロバイオティクス、それらの遊離塩基、それらの薬剤学的に許容することのできる塩、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。他のIBS薬として、膨張性薬剤、ドーパミンアンタゴニスト、駆風薬、トランキライザ、デクストフィソパム、フェニトイン、チモロール、及びジルチアゼムを挙げることができる。さらに、ニューロン細胞又はグリア細胞シグナル伝達に影響を及ぼすことによって腸の透過性を調節するグルタミン及びグルタミン酸のようなアミノ酸を投与してIBS患者を治療することができる。
他の実施形態において、本発明の方法はさらに、IBS試料をIBS−便秘型(IBS−C)、IBS−下痢型(IBS−D)、IBS−混合型(IBS−M)、IBS−交替型(IBS−A)、又は感染後型IBS(IBS−PI)試料と分類する工程を含む。或る場合には、少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、又は11種以上の分類マーカーの存在又はレベルに基づいて、IBS試料をIBSのカテゴリー、形態、又は臨床的サブタイプに分類する。分類マーカーの限定的でない例を後記する。好ましくは、レプチンの存在又はレベルに基づいてIBSの少なくとも1つの形態をIBSの少なくとも1つの他の形態から識別する。或る場合に、本発明の方法を用いて、IBSに罹っていると前に同定された個体においてIBS−A試料及び/又はIBS−D試料からIBS−C試料を識別することができる。或る他の場合に、本発明の方法を用いて、前にIBSに罹っているとは診断されなかった個体由来の試料をIBS−A試料、IBS−C試料、IBS−D試料、又は非IBS試料と分類することができる。
或る実施形態において、本発明の方法はさらに、分類の結果を臨床医に送信する工程を含む。或る他の実施形態において、本発明の方法はさらに、個体がIBS−A、IBS−C、IBS−D、IBS−M、又はIBS−PIに罹っている確率の形態で診断を提供する。本発明の方法はさらに、IBS−A、IBS−C、IBS−D、IBS−M、又はIBS−PIを治療するのに有効な薬剤の治療的有効量を個体に投与する工程を含んでいることができる。適切な薬剤として、限定的でなく、テガセロド(Zelnorm)、アロセトロン(Lotronex(商標))、ルビプロストン(Amitiza)、リファミキシン(Xifaxan)、MD−1100、プロバイオティクス、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。試料がIBS−A又はIBS−C試料と分類され及び/又はその個体がIBS−A又はIBS−Cに罹っていると診断された場合には、治療的有効量のテガセロド又は他の5−HT4アゴニスト(例えば、モサプリド、レンザプリド、AG1−001等)をその個体に投与することができる。或る場合に、試料がIBS−Cと分類され及び/又はその個体がIBS−Cに罹っていると診断された場合には、治療的有効量のルビプロストン若しくは他の塩化物チャネル活性化剤、リファミキシン若しくは腸内細菌異常増殖を制御することのできる他の抗生物質、MD−1100若しくは他のグアニル酸シクラーゼアゴニスト、アシマドリン若しくは他のオピオイドアゴニスト、又はタルネタント若しくは他のニューロキニンアンタゴニストをその個体に投与することができる。他の場合において、試料がIBS−Dと分類され及び/又はその個体がIBS−Dに罹っていると診断された場合には、治療的有効量のアロセトロン若しくは他の5−HT3アンタゴニスト(例えば、ラモセトロン、DDP−225等)、クロフェレマー若しくは他の塩化物チャネル遮断剤、タルネタント若しくは他のニューロキニンアンタゴニスト(例えば、サレデュタント等)、又は抗うつ剤、例えば、三環系抗うつ剤などをその個体に投与することができる。
D.症状プロファイルの決定
症状プロファイルは、一般には、胸痛、胸部不快感、胸焼け、普通量の食事後の不快な膨満感、普通量の食事の完食不能、腹痛、腹部不快感、便秘、下痢、鼓張、腹部膨満、痛み又は不快感があることと関連づけられる消極的な思考又は感情、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1種の症状の存在及び重症度を同定することによって決定される。
症状プロファイルは、一般には、胸痛、胸部不快感、胸焼け、普通量の食事後の不快な膨満感、普通量の食事の完食不能、腹痛、腹部不快感、便秘、下痢、鼓張、腹部膨満、痛み又は不快感があることと関連づけられる消極的な思考又は感情、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1種の症状の存在及び重症度を同定することによって決定される。
好ましい実施形態において、本明細書中に記載した症状1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、又は11種以上の存在又は重症度を同定することによって、IBSを診断し、IBSを判定し、IBDを除外し、IBSを予測し、IBSの進行又は退行をモニタリングし、IBSの予後診断を提供し、IBS治療を割り当てることなどに対して有効である症状プロファイルを作成する。或る場合に、質問票(questionnaire)又は他の形態の書面、口頭、若しくは電話での調査を用いて症状プロファイルを作成する。質問票又は調査は、一般には、回答者から彼らの現在及び/又は最近のIBS関連症状についての情報を収集する目的のために標準化された一式の質問及び回答を含む。例えば、米国特許公報第2008/0085524号の実施例13は、個体におけるIBS関連症状1種又は2種以上の存在又は重症度を同定するために質問票に含まれていることができる典型的な質問を提供する。
或る実施形態において、症状プロファイルは、質問票又は調査において示された質問に対する回答のすべて又はサブセットを編集及び/又は分析することによって作成される。或る他の実施形態において、症状プロファイルは、次の質問:「貴方は現在何らかの症状がありますか?」に対する個人の回答に基づいて作成される。これらの実施形態のいずれかに従って作成された症状プロファイルを、本明細書中に記載のアルゴリズムに基づく方法において診断マーカープロファイルと組み合わせて用いることによって、IBSを診断し、IBSを判定し、IBDを除外し、IBSを予測し、IBSの進行又は退行をモニタリングし、IBSの予後診断を提供し、IBS治療を割り当てるなどの正確度を改善することができる。
IV.診断マーカー
本明細書中に提供したように、IBSと正常被験者との間で2倍を超える変化をした試料の少なくとも20%中に存在する検出された転写物(transcript)を用いて66の遺伝子を同定した。中でもIBSにおいて最も有意に増加した転写物は、痛み、炎症、及び腸透過性に関連した遺伝子であり、TACR2、SH3GRL3、MICALL1、Rab7L1、VIPR1を含む。TACR2は、タキキニンニューロペプチドサブスタンスK(ニューロキニンA)の受容体である。それは、ホスファチジルイノシトール−カルシウムセカンドメッセンジャー系を活性化するGタンパク質と関連している。イボデュタント(ibodutant)は、現在IBSのフェーズII臨床試験下のタキキニンNK2受容体(TACR2)アンタゴニストである。セロトニンは媒介性のニューロン刺激(mediate neuronal excitation)によってウサギ回腸において収縮を引き起こす。ニューロキニン(NK1及びNK2)受容体のアンタゴニストはセロトニン応答を部分的に遮断する。VIPR1はVIPの受容体である。この受容体の活性は、アデニリルシクラーゼを活性化するGタンパク質によって媒介される。VIP濃度はIBS患者の血清中で増加する。別の着目すべきDEGは、Rab13に結合する細胞骨格調節因子であるMICALL1である。MICALL1/Rab13相互作用は、細胞表面へのインテグリン輸送に関与していると報告されている。インテグリンは、炎症状態の腸への白血球浸潤における重要な媒介因子である。増加した白血球浸潤はIBS患者のサブセットにおいて観察されている。上記遺伝子はIBSに対して生物学的関連を有していることがある一方で、未知の生物学的機能を有する他のDEGが同定されており、例えば、CCDC147は未定義の生物学的機能を有するタンパク質を含有するコイルドコイルである。IBSは複合疾病でありその病因は定義されないままになっているので、かかる遺伝子はIBSリサーチに対する今後の研究を保証することができる。同じファミリー内の多くの他の遺伝子の変化しないレベルは、それらの経路の全体的な(global)というよりむしろ特異的な活性化がIBS末梢血中の疾病シグネチャの重要な部分を構成することを示唆した。
本明細書中に提供したように、IBSと正常被験者との間で2倍を超える変化をした試料の少なくとも20%中に存在する検出された転写物(transcript)を用いて66の遺伝子を同定した。中でもIBSにおいて最も有意に増加した転写物は、痛み、炎症、及び腸透過性に関連した遺伝子であり、TACR2、SH3GRL3、MICALL1、Rab7L1、VIPR1を含む。TACR2は、タキキニンニューロペプチドサブスタンスK(ニューロキニンA)の受容体である。それは、ホスファチジルイノシトール−カルシウムセカンドメッセンジャー系を活性化するGタンパク質と関連している。イボデュタント(ibodutant)は、現在IBSのフェーズII臨床試験下のタキキニンNK2受容体(TACR2)アンタゴニストである。セロトニンは媒介性のニューロン刺激(mediate neuronal excitation)によってウサギ回腸において収縮を引き起こす。ニューロキニン(NK1及びNK2)受容体のアンタゴニストはセロトニン応答を部分的に遮断する。VIPR1はVIPの受容体である。この受容体の活性は、アデニリルシクラーゼを活性化するGタンパク質によって媒介される。VIP濃度はIBS患者の血清中で増加する。別の着目すべきDEGは、Rab13に結合する細胞骨格調節因子であるMICALL1である。MICALL1/Rab13相互作用は、細胞表面へのインテグリン輸送に関与していると報告されている。インテグリンは、炎症状態の腸への白血球浸潤における重要な媒介因子である。増加した白血球浸潤はIBS患者のサブセットにおいて観察されている。上記遺伝子はIBSに対して生物学的関連を有していることがある一方で、未知の生物学的機能を有する他のDEGが同定されており、例えば、CCDC147は未定義の生物学的機能を有するタンパク質を含有するコイルドコイルである。IBSは複合疾病でありその病因は定義されないままになっているので、かかる遺伝子はIBSリサーチに対する今後の研究を保証することができる。同じファミリー内の多くの他の遺伝子の変化しないレベルは、それらの経路の全体的な(global)というよりむしろ特異的な活性化がIBS末梢血中の疾病シグネチャの重要な部分を構成することを示唆した。
IBSは、その存在を定義する任意の明確な生化学的、構造的、又は血清学的な異常とは関連づけられていない。IBSの顕著な特徴は、排便習慣の変化と関連する腹痛又は腹部不快感であり、そして、しばしば、腹痛のため患者は医師の診察を受ける。IBSの症状は多くの他のGI状態と共通しているので、IBSは長い間「除外の診断」とみなされ、それが特有の症状を有する患者の過度の試験に導いた。幸いなことに、研究における進歩がIBSの病態生理についての本発明者らの理解を増進してくれ、そのことは生物学的に関連するバイオマーカーの開発及びIBS患者における疾病及び転写変化に関与する経路に主として基づくIBSの陽性診断を支持する(advocating)コンセンサスガイドラインの開発を可能にした。生物学的関連性を有する遺伝子発現バイオマーカー、例えば、TACR2及びVIPR1など、の同定はIBSの病因についての我々の理解をさらに高めるであろう。
末梢血細胞から同定された、本明細書中に示したバイオマーカーは、腸生検組織を用いて同定された公表されているバイオマーカーとは重複していない。サロゲートエンドポイント又は推定上のサロゲート(putative surrogate)に頼ることの一般的な限界は、「サロゲートマーカー」の生物学的関連性を欠いている可能性である。一例として、痛みの応答が開始されそして伝えられる場合に、末梢血細胞中のTACR2の発現の変化は腸組織における、とりわけ、腸内ニューロン細胞における、TACR2の変化と相関していないことがある。腸組織を用いた遺伝子発現プロファイリングは、IBSを予測するためのより良い測定法であるが、実行可能なIBS診断の検査ではない。末梢血及び腸生検組織をマッチングさせることを用いて、選択された遺伝子の発現を比較する研究が今後行われるであろう。
最初の遺伝子チップ研究では、IBS−C及びIBS−D患者試料だけを用いた(実施例2)。選択された遺伝子を、qPCRを用いてIBS−M患者試料で妥当性確認(validate)した。個々の遺伝子の相対的な発現はIBSの3つのサブタイプの間で変化し、大部分のDEGの全体的パターンは3つのサブタイプ間で一致する。IBSサブタイプの臨床的割り当ては下痢、便秘、又は混合型の症状に直接基づいているので、この研究の焦点は3つのサブタイプすべてにおいて例外なく調節されている遺伝子を同定することである。
IBSの症状は、他のGI疾患、例えば、炎症性腸疾患、セリアック病、胆道疾患、消化性潰瘍疾患、結腸直腸癌などの症状と重なるので、IBSは診断上の課題を与える。合併症はさらに診断を複雑にする。「ゴールドスタンダード」の欠如が診断検査の開発を極めて困難なものにしている。本明細書中に示した実施例では、IBS診断及び治療において専門的なGI医を導くこと(leading)によって試料を集めた。合併症と関連づけられることがある交絡マーカーを避けるために、他のGI疾患及び精神疾患を有する患者を除外した。この研究に本発明者らが用いた試料は、「均質な」IBS患者集団に由来した。
臨床的な薬理ゲノム学的分析は臨床試験において受け入れられそしてより一般的になってきているので、診断装置としてマイクロアレイが普通に用いられることはますます明白である。重要な課題の一つは、診断アッセイから発現パターン結果を報告する厳密でかつ数値に基づいた方法を確立すること及びそのパターンに対して関連づけられる参照範囲をどのように計算し報告するかということである。1つの実施形態において、加重投票法を用いて多くの遺伝子からの発現パターン結果を単一の数字で表した信頼スコア(single numerical confidence score)にコラプスする(collapse)ことができる。1つの重要な利点は、それが各患者に対して予測上の信頼を表す予測強度スコアを報告することである。将来は、正しく診断された患者及び正しく診断されなかった(correctly nondiagnosed)無病の個体の蓄積プールについて収集された平均信頼スコアを計算することができるであろうし、問題としている診断上の特定の予測遺伝子セットに対する値の参照範囲を報告することができるであろう。
このように、1つの実施形態において、本発明はIBS患者の末梢血中に疾病に関連する遺伝子シグニチャーが存在することを確証する。血液は体中を循環するので、それらの発現プロファイルは疾病及び健常の感度の良い指標及び生理学的モニターとして機能することができることが可能である。
A.RNAマーカー
様々な診断マーカーが、個体由来の試料をIBS試料と分類し又は個体由来の試料中のIBS様症状に関連する1種又は2種以上の疾病又は疾患を除外する本発明の方法、システム、及びコードに用いるのに適している。診断マーカーの例として、限定的でなく、任意の遺伝子、発現されるRNA、又はIBS又はIBSサブタイプにおいて差異的に発現されることが見出されたタンパク質、例えば、表1、表4、表5、表6、又は表7に見出されるもの、を挙げることができる。特定の実施形態において、本発明の方法、システム、及びコードに有効な診断マーカーは、表1に見出される遺伝子、発現されるRNA、又はタンパク質である。好ましい実施形態において、本発明の方法、システム、及びコードに有効な診断マーカーは、表6に見出される遺伝子、発現されるRNA、又はタンパク質である。より好ましい実施形態において、本発明の方法、システム、及びコードに有効な診断マーカーは、表7に見出される遺伝子、発現されるRNA、又はタンパク質である。本発明の1つの実施形態において、バイオマーカーは、配列番号:1〜75及び154〜162のいずれか1つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするmRNA分子である。関連する実施形態において、バイオマーカーは配列番号:76〜153のいずれか1つの核酸配列を含むRNA分子である。
様々な診断マーカーが、個体由来の試料をIBS試料と分類し又は個体由来の試料中のIBS様症状に関連する1種又は2種以上の疾病又は疾患を除外する本発明の方法、システム、及びコードに用いるのに適している。診断マーカーの例として、限定的でなく、任意の遺伝子、発現されるRNA、又はIBS又はIBSサブタイプにおいて差異的に発現されることが見出されたタンパク質、例えば、表1、表4、表5、表6、又は表7に見出されるもの、を挙げることができる。特定の実施形態において、本発明の方法、システム、及びコードに有効な診断マーカーは、表1に見出される遺伝子、発現されるRNA、又はタンパク質である。好ましい実施形態において、本発明の方法、システム、及びコードに有効な診断マーカーは、表6に見出される遺伝子、発現されるRNA、又はタンパク質である。より好ましい実施形態において、本発明の方法、システム、及びコードに有効な診断マーカーは、表7に見出される遺伝子、発現されるRNA、又はタンパク質である。本発明の1つの実施形態において、バイオマーカーは、配列番号:1〜75及び154〜162のいずれか1つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするmRNA分子である。関連する実施形態において、バイオマーカーは配列番号:76〜153のいずれか1つの核酸配列を含むRNA分子である。
本発明の好ましい実施形態において、IBSのRNAバイオマーカーは、CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A、及びFOXD3から選択される遺伝子から発現されるRNA(例えば、mRNA)を含む。関連する実施形態において、バイオマーカーは、表4に見出される遺伝子から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質又はポリペプチドであることができる。好ましい実施形態において、バイオマーカーは、表6に見出される遺伝子から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質又はポリペプチドであることができる。さらに好ましい実施形態において、バイオマーカーは、表7に見出される遺伝子から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質又はポリペプチドであることができる。特定の実施形態において、タンパク質は、CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A、及びFOXD3から選択される遺伝子によってコードされる。
最も好ましい実施形態において、本発明のバイオマーカーは、CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、及びGNG3から選択される遺伝子によってコードされる。1つの実施形態において、本発明の方法は、CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、及びGNG3の少なくとも2種、3種、4種、又はすべての検出を含む。或る実施形態において、バイオマーカーはRNA(例えば、mRNA)である。他の実施形態において、バイオマーカーはIBSのRNAバイオマーカーによってコードされるタンパク質又はポリペプチドである。
1.CCDC147コイルドコイルドメイン含有147(CCDC147 coiled-coil domain containing 147)(CCDC147)
CCDC147は、CCDC147遺伝子(Entrez GeneID:159686;NM_001008723(配列番号:75))によってコードされる104kDaのタンパク質(NP_001008723(配列番号:144))である。CCDC147の生物学についてはほとんど知られていない。98人のIBS患者由来の末梢血試料についてのqRT−PCR妥当性確認研究は、CCDC147がIBS、とりわけ、IBS−Dサブタイプを高率で予測することを示す(実施例4)。或る実施形態において、CCDC147及び/又はCCDC147をコードするmRNAはIBSに対する有効なバイオマーカーである。
CCDC147は、CCDC147遺伝子(Entrez GeneID:159686;NM_001008723(配列番号:75))によってコードされる104kDaのタンパク質(NP_001008723(配列番号:144))である。CCDC147の生物学についてはほとんど知られていない。98人のIBS患者由来の末梢血試料についてのqRT−PCR妥当性確認研究は、CCDC147がIBS、とりわけ、IBS−Dサブタイプを高率で予測することを示す(実施例4)。或る実施形態において、CCDC147及び/又はCCDC147をコードするmRNAはIBSに対する有効なバイオマーカーである。
或る場合に、CCDC147又はその前駆体の存在又はレベルは、アッセイ(例えば、変換による)、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅をベースとするアッセイ、例えば、qPCRアッセイ、RT−PCRアッセイ、又は質量分析をベースとするアッセイなどを用いてmRNA発現のレベルで検出される。或る他の場合に、CCDC147の存在又はレベルは、例えば、イムノアッセイ(例えば、ELISA)、免疫組織化学的アッセイ、又は質量分析をベースとするアッセイを用いて、タンパク質発現(例えば、変換による)のレベルで検出される。
2.血管作動性腸管ペプチド受容体1(Vasoactive Intestinal Peptide Receptor 1)(VIPR1)
VIPR1は、血管作動性腸管ペプチド(VIP)と相互作用する7回膜貫通ドメインニューロペプチド受容体である。VIPR1は、脳、末梢血白血球、及び小腸を含む多くの組織中に見出される。とりわけ、VIPは、平滑筋弛緩を誘発し、胃酸分泌及び腸管腔からの吸収の阻害を引き起こし、そして膵液及び胆汁中への水の分泌を刺激する。VIPR1は、血管作動性腸管ペプチド受容体1遺伝子(Entrez GeneID:7433;NM_004624(配列番号:58))によってコードされる48.5kDaの膜貫通タンパク質であり、血管作動性腸管ペプチド受容体1前駆体ポリペプチド(NP_004615(配列番号:127))のプロセッシング後に産生される。98人のIBS患者由来の末梢血試料のqRT−PCR妥当性確認研究は、VIPR1がIBS、そしてとりわけ、IBS−Dサブタイプを高率で予測することを示す(実施例4)。或る実施形態において、VIPR1、VIPR1前駆体タンパク質、及び/又はVIPR1をコードするmRNAはIBSに対する有効なバイオマーカーである。
VIPR1は、血管作動性腸管ペプチド(VIP)と相互作用する7回膜貫通ドメインニューロペプチド受容体である。VIPR1は、脳、末梢血白血球、及び小腸を含む多くの組織中に見出される。とりわけ、VIPは、平滑筋弛緩を誘発し、胃酸分泌及び腸管腔からの吸収の阻害を引き起こし、そして膵液及び胆汁中への水の分泌を刺激する。VIPR1は、血管作動性腸管ペプチド受容体1遺伝子(Entrez GeneID:7433;NM_004624(配列番号:58))によってコードされる48.5kDaの膜貫通タンパク質であり、血管作動性腸管ペプチド受容体1前駆体ポリペプチド(NP_004615(配列番号:127))のプロセッシング後に産生される。98人のIBS患者由来の末梢血試料のqRT−PCR妥当性確認研究は、VIPR1がIBS、そしてとりわけ、IBS−Dサブタイプを高率で予測することを示す(実施例4)。或る実施形態において、VIPR1、VIPR1前駆体タンパク質、及び/又はVIPR1をコードするmRNAはIBSに対する有効なバイオマーカーである。
或る場合に、VIPR1の存在又はレベルは、アッセイ、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅をベースとするアッセイ、例えば、qPCRアッセイ、RT−PCRアッセイ、又は質量分析をベースとするアッセイなどを用いてmRNA発現(例えば、変換による)のレベルで検出される。或る他の場合に、VIPR1又はその前駆体の存在又はレベルは、例えば、イムノアッセイ(例えば、ELISA)、免疫組織化学的アッセイ、又は質量分析をベースとするアッセイ、を用いてタンパク質発現のレベルで検出される。血清、血漿、唾液、又は尿試料中のVIPR1の存在又はレベルを決定するのに適したELISAキットは、例えば、Sigma−Aldrich社(ミズーリ州セントルイス)、US Biological社(マサチューセッツ州スワンプスコット)、及びNovus Biologicals社(コロラド州リトルトン)、から入手することができる。
3.リソホスファチジン酸受容体5(Lysophosphatidic acid receptor 5)(GPR98;LPAR5)
LPAR5は、細胞外シグナルをリソホスファチジン酸からヘテロ三量体Gタンパク質を介して細胞に伝える7回膜貫通ドメインGタンパク質共役受容体である。LPAR5は、ファルネシルピロリン酸(FPP)、N−アラキドニルグリシン(NAG)、及びリソホスファチジン酸を含む多くのシグナル伝達分子と相互作用する。LPARは、リソホスファチジン酸受容体5遺伝子(Entrez GeneID:57121;NM_020400(配列番号:9); NM_001142961(配列番号:10))によってコードされる41.3kDaの膜貫通タンパク質(NP_065133(配列番号:84及び85))である。98人のIBS患者由来の末梢血試料のqRT−PCR妥当性確認研究は、LPAR5がIBS、とりわけ、IBS−Dサブタイプを高率で予測することを示す(実施例4)。或る実施形態において、LPAR5及び/又はLPAR5をコードするmRNAはIBSに対する有効なバイオマーカーである。
LPAR5は、細胞外シグナルをリソホスファチジン酸からヘテロ三量体Gタンパク質を介して細胞に伝える7回膜貫通ドメインGタンパク質共役受容体である。LPAR5は、ファルネシルピロリン酸(FPP)、N−アラキドニルグリシン(NAG)、及びリソホスファチジン酸を含む多くのシグナル伝達分子と相互作用する。LPARは、リソホスファチジン酸受容体5遺伝子(Entrez GeneID:57121;NM_020400(配列番号:9); NM_001142961(配列番号:10))によってコードされる41.3kDaの膜貫通タンパク質(NP_065133(配列番号:84及び85))である。98人のIBS患者由来の末梢血試料のqRT−PCR妥当性確認研究は、LPAR5がIBS、とりわけ、IBS−Dサブタイプを高率で予測することを示す(実施例4)。或る実施形態において、LPAR5及び/又はLPAR5をコードするmRNAはIBSに対する有効なバイオマーカーである。
或る場合に、LPAR5又はその前駆体の存在又はレベルは、アッセイ、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅をベースとするアッセイ、例えば、qPCRアッセイ、RT−PCRアッセイ、又は質量分析をベースとするアッセイなどを用いてmRNA発現(例えば、変換による)のレベルで検出される。或る他の場合に、LPAR5の存在又はレベルは、例えば、イムノアッセイ(例えば、ELISA)、免疫組織化学的アッセイ、又は質量分析をベースとするアッセイ、を用いてタンパク質発現のレベルで検出される。血清、血漿、唾液、又は尿試料中のLPAR5の存在又はレベルを決定するのに適したELISAキットは、例えば、Sigma−Aldrich社(ミズーリ州セントルイス)、Abcam社(マサチューセッツ州ケンブリッジ)、及びNovus Biologicals社(コロラド州リトルトン)、から入手することができる。
4.コイルドコイルドメイン含有144A(Coiled-Coil domain Containing 144A)(CCDC144A)
CCDC144Aは、CCDC147遺伝子(Entrez GeneID:9720;NM_014695(配列番号:28))によってコードされる165kDaのタンパク質(NP_055510(配列番号:103))である。CCDC144Aの生物学についてはほとんど知られていない。98人のIBS患者由来の末梢血試料についてのqRT−PCR妥当性確認研究は、CCDC144AがIBS、とりわけ、IBS−Dサブタイプを高率で予測することを示す(実施例4)。或る実施形態において、CCDC144A及び/又はCCDC144AをコードするmRNAはIBSに対する有効なバイオマーカーである。
CCDC144Aは、CCDC147遺伝子(Entrez GeneID:9720;NM_014695(配列番号:28))によってコードされる165kDaのタンパク質(NP_055510(配列番号:103))である。CCDC144Aの生物学についてはほとんど知られていない。98人のIBS患者由来の末梢血試料についてのqRT−PCR妥当性確認研究は、CCDC144AがIBS、とりわけ、IBS−Dサブタイプを高率で予測することを示す(実施例4)。或る実施形態において、CCDC144A及び/又はCCDC144AをコードするmRNAはIBSに対する有効なバイオマーカーである。
或る場合に、CCDC144A又はその前駆体の存在又はレベルは、アッセイ、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅をベースとするアッセイ、例えば、qPCRアッセイ、RT−PCRアッセイ、又は質量分析をベースとするアッセイなど、を用いてmRNA発現(例えば、変換による)のレベルで検出される。或る他の場合に、CCDC144Aの存在又はレベルは、例えば、イムノアッセイ(例えば、ELISA)、免疫組織化学的アッセイ、又は質量分析をベースとするアッセイを用いて、タンパク質発現のレベルで検出される。
5.グアニンヌクレオチド結合タンパク質G(I)/G(S)/G(O)サブユニットガンマ−3(Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(O) subunit gamma-3)(GNG3)
GNG3は、ヘテロ三量体Gタンパク質のガンマサブユニットである。GNG3は、ヘテロ三量体Gタンパク質とGタンパク質受容体(GPR)との間の相互作用に対して特異性を与える。GNG3は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質),ガンマ3遺伝子(Entrez GeneID:2785;NM_012202(配列番号:16))によってコードされそしてグアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質),ガンマ3前駆体ポリペプチド(NP_036334(配列番号:91))のプロセッシング後に産生される。98人のIBS患者由来の末梢血試料のqRT−PCR妥当性確認研究は、GNG3がIBS、そしてとりわけ、IBS−Dサブタイプを高率で予測することを示す(実施例4)。或る実施形態において、GNG3、GNG3前駆体ポリペプチド、及び/又はGNG3をコードするmRNAはIBSに対する有効なバイオマーカーである。
GNG3は、ヘテロ三量体Gタンパク質のガンマサブユニットである。GNG3は、ヘテロ三量体Gタンパク質とGタンパク質受容体(GPR)との間の相互作用に対して特異性を与える。GNG3は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質),ガンマ3遺伝子(Entrez GeneID:2785;NM_012202(配列番号:16))によってコードされそしてグアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質),ガンマ3前駆体ポリペプチド(NP_036334(配列番号:91))のプロセッシング後に産生される。98人のIBS患者由来の末梢血試料のqRT−PCR妥当性確認研究は、GNG3がIBS、そしてとりわけ、IBS−Dサブタイプを高率で予測することを示す(実施例4)。或る実施形態において、GNG3、GNG3前駆体ポリペプチド、及び/又はGNG3をコードするmRNAはIBSに対する有効なバイオマーカーである。
或る場合に、GNG3の存在又はレベルは、アッセイ、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、増幅をベースとするアッセイ、例えば、qPCRアッセイ、RT−PCRアッセイ、又は質量分析をベースとするアッセイなど、を用いてmRNA発現(例えば、変換による)のレベルで検出される。或る他の場合に、GNG3又はその前駆体の存在又はレベルは、例えば、イムノアッセイ(例えば、ELISA)、免疫組織化学的アッセイ、又は質量分析をベースとするアッセイ、を用いてタンパク質発現のレベルで検出される。血清、血漿、唾液、又は尿試料中のGNG3の存在又はレベルを決定するのに適したELISAキットは、例えば、Sigma−Aldrich社(ミズーリ州セントルイス)、Abcam社(マサチューセッツ州ケンブリッジ)、及びNovus Biologicals社(コロラド州リトルトン)、から入手することができる。
B.追加の診断マーカー
或る実施形態において、本発明の方法は、追加のタンパク質又は血清学的IBSバイオマーカーと組み合わせてRNA IBSバイオマーカープロファイルを決定する工程を含む。或る実施形態において、追加の診断マーカープロファイルは、サイトカイン(例えば、IL−8、IL−1β、TWEAK、レプチン、OPG、MIP−3β、GROα、CXCL4/PF−4、及び/又はCXCL7/NAP−2)、成長因子(例えば、EGF、VEGF、PEDF、BDNF、及び/又はSDGF)、抗好中球抗体(例えば、ANCA、pANCA、cANCA、NSNA、及び/又はSAPPA)、ASCA(例えば、ASCA−IgA、ASCA−IgG、及び/又はASCA−IgM)、抗菌抗体(例えば、抗OmpC抗体、抗フラジェリン抗体、及び/又は抗I2抗体)、肥満細胞マーカー(例えば、トリプターゼ、ヒスタミン、及び/又はプロスタグランジンE2(PEG2))、ストレスマーカー(例えば、ウロコルチン(Ucn)、コルチコトロピン放出ホルモン結合タンパク質(CRFBP)、コルチゾール、及び/又は副腎皮質刺激ホルモン(ACTH、コルチコトロピン))、胃腸ホルモン(例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、サブスタンスP、神経成長因子(NGF)、ニューロキニンA、ニューロキニンB、血管作動性腸管ペプチド(VIP)、グルカゴン様ペプチド2(GLP−2)、モチリン、及び/又は下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド(PACAP))、セロトニン代謝産物(例えば、トリプトファン、5−HT−o−スルフェート、セロトニンO−スルフェート(5−ヒドロキシトリプタミンO−スルフェート;5−HT−o−スルフェート)、5−ヒドロキシインドール酢酸(5−HIAA)、5−HTグルクロニド(5−HT−GA)、又は5−ヒドロキシトリトフォール(hydroxytrytophol)(5−HTOL))、セロトニン経路マーカー(例えば、UDP−グルクロノシルトランスフェラーゼ1−6(UGT1A6)、セロトニン再取り込み輸送体(SERT)、トリプトファンヒドロキシラーゼ1(TPH1)、モノアミンオキシダーゼA(MAO−A)、モノアミンオキシダーゼB(MAO−B)、又はヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体3A(5−HT3A;5−HT3R))、炭水化物欠乏トランスフェリン(CDT)、ラクトフェリン、抗組織トランスグルタミナーゼ(tTG)抗体、リポカリン(例えば、NGAL、NGAL/MMP−9複合体)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP;例えば、MMP−9)、リポカリンとMMPとの複合体、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤(TIMP;例えば、TIMP−1)、グロブリン(例えば、アルファ−グロブリン、アルファ−2−マクログロブリン、ハプトグロビン、及び/又はオロソムコイド)、アクチン切断タンパク質(例えば、ゲルソリン)、S100タンパク質(例えば、カルグラニュリン)、フィブリノペプチド(すなわち、FIBA)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、タキキニン(例えば、サブスタンスP)、グレリン、ニューロテンシン、コルチコトロピン放出ホルモン(CRH)、エラスターゼ、C−反応性タンパク質(CRP)、ラクトフェリン、抗ラクトフェリン抗体、カルプロテクチン、ヘモグロビン、NOD2/CARD15、セロトニン再取り込み輸送体(SERT)、トリプトファンヒドロキシラーゼ−1、5−ヒドロキシトリプタミン(5−HT)、ラクツロース、セリンプロテアーゼ(例えば、トリプターゼ、例えば、β−トリプターゼなど)、プロスタグランジン(例えば、PGE2)、ヒスタミン、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される診断マーカー少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、又は11種以上の存在又はレベルを検出することによって決定される。或る実施形態において、追加のバイオマーカーは、表2に見出されるものから選択される。本発明の方法に用いるのに適したバイオマーカーの他の限定的でない例として、2007年8月14日出願の米国特許公報第2008/0085524号、2009年6月25日出願の米国特許仮出願第61/220,525号、及び2009年10月30日出願の米国特許仮出願第61/256,717号に見出されるものを挙げることができる。本発明の1つの実施形態において、本発明の新規なRNA IBSバイオマーカーを表2に見出される診断マーカーと組み合わせることができる。当業者であれば、本発明に用いるのに適切な他の診断マーカーを承知しているであろう。
或る実施形態において、本発明の方法は、追加のタンパク質又は血清学的IBSバイオマーカーと組み合わせてRNA IBSバイオマーカープロファイルを決定する工程を含む。或る実施形態において、追加の診断マーカープロファイルは、サイトカイン(例えば、IL−8、IL−1β、TWEAK、レプチン、OPG、MIP−3β、GROα、CXCL4/PF−4、及び/又はCXCL7/NAP−2)、成長因子(例えば、EGF、VEGF、PEDF、BDNF、及び/又はSDGF)、抗好中球抗体(例えば、ANCA、pANCA、cANCA、NSNA、及び/又はSAPPA)、ASCA(例えば、ASCA−IgA、ASCA−IgG、及び/又はASCA−IgM)、抗菌抗体(例えば、抗OmpC抗体、抗フラジェリン抗体、及び/又は抗I2抗体)、肥満細胞マーカー(例えば、トリプターゼ、ヒスタミン、及び/又はプロスタグランジンE2(PEG2))、ストレスマーカー(例えば、ウロコルチン(Ucn)、コルチコトロピン放出ホルモン結合タンパク質(CRFBP)、コルチゾール、及び/又は副腎皮質刺激ホルモン(ACTH、コルチコトロピン))、胃腸ホルモン(例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、サブスタンスP、神経成長因子(NGF)、ニューロキニンA、ニューロキニンB、血管作動性腸管ペプチド(VIP)、グルカゴン様ペプチド2(GLP−2)、モチリン、及び/又は下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド(PACAP))、セロトニン代謝産物(例えば、トリプトファン、5−HT−o−スルフェート、セロトニンO−スルフェート(5−ヒドロキシトリプタミンO−スルフェート;5−HT−o−スルフェート)、5−ヒドロキシインドール酢酸(5−HIAA)、5−HTグルクロニド(5−HT−GA)、又は5−ヒドロキシトリトフォール(hydroxytrytophol)(5−HTOL))、セロトニン経路マーカー(例えば、UDP−グルクロノシルトランスフェラーゼ1−6(UGT1A6)、セロトニン再取り込み輸送体(SERT)、トリプトファンヒドロキシラーゼ1(TPH1)、モノアミンオキシダーゼA(MAO−A)、モノアミンオキシダーゼB(MAO−B)、又はヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体3A(5−HT3A;5−HT3R))、炭水化物欠乏トランスフェリン(CDT)、ラクトフェリン、抗組織トランスグルタミナーゼ(tTG)抗体、リポカリン(例えば、NGAL、NGAL/MMP−9複合体)、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP;例えば、MMP−9)、リポカリンとMMPとの複合体、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤(TIMP;例えば、TIMP−1)、グロブリン(例えば、アルファ−グロブリン、アルファ−2−マクログロブリン、ハプトグロビン、及び/又はオロソムコイド)、アクチン切断タンパク質(例えば、ゲルソリン)、S100タンパク質(例えば、カルグラニュリン)、フィブリノペプチド(すなわち、FIBA)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、タキキニン(例えば、サブスタンスP)、グレリン、ニューロテンシン、コルチコトロピン放出ホルモン(CRH)、エラスターゼ、C−反応性タンパク質(CRP)、ラクトフェリン、抗ラクトフェリン抗体、カルプロテクチン、ヘモグロビン、NOD2/CARD15、セロトニン再取り込み輸送体(SERT)、トリプトファンヒドロキシラーゼ−1、5−ヒドロキシトリプタミン(5−HT)、ラクツロース、セリンプロテアーゼ(例えば、トリプターゼ、例えば、β−トリプターゼなど)、プロスタグランジン(例えば、PGE2)、ヒスタミン、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される診断マーカー少なくとも1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、又は11種以上の存在又はレベルを検出することによって決定される。或る実施形態において、追加のバイオマーカーは、表2に見出されるものから選択される。本発明の方法に用いるのに適したバイオマーカーの他の限定的でない例として、2007年8月14日出願の米国特許公報第2008/0085524号、2009年6月25日出願の米国特許仮出願第61/220,525号、及び2009年10月30日出願の米国特許仮出願第61/256,717号に見出されるものを挙げることができる。本発明の1つの実施形態において、本発明の新規なRNA IBSバイオマーカーを表2に見出される診断マーカーと組み合わせることができる。当業者であれば、本発明に用いるのに適切な他の診断マーカーを承知しているであろう。
C.分類マーカー
種々の分類マーカーが、IBSをカテゴリー、形態、又は臨床的サブタイプ、例えば、IBS−便秘型(IBS−C)、IBS−下痢型(IBS−D)、IBS−混合型(IBS−M)、IBS−交替型(IBS−A)、又は感染後型IBS(IBS−PI)など、に分類する本発明の方法、システム、及びコードに用いるのに適している。分類マーカーの例として、限定的でなく、任意の上記診断mRNAマーカー、並びに、例えば、レプチン、セロトニン再取り込み輸送体(SERT)、トリプトファンヒドロキシラーゼ−1、5−ヒドロキシトリプタミン(5−HT)、トリプターゼ、PGE2、ヒスタミン、粘膜タンパク質(mucosal protein)8、ケラチン−8、クローディン(claudin)−8、ゾヌリン(zonulin)、コルチコトロピン放出ホルモン受容体1(CRHR1)、コルチコトロピン放出ホルモン受容体2(CRHR2)などを挙げることができる。
種々の分類マーカーが、IBSをカテゴリー、形態、又は臨床的サブタイプ、例えば、IBS−便秘型(IBS−C)、IBS−下痢型(IBS−D)、IBS−混合型(IBS−M)、IBS−交替型(IBS−A)、又は感染後型IBS(IBS−PI)など、に分類する本発明の方法、システム、及びコードに用いるのに適している。分類マーカーの例として、限定的でなく、任意の上記診断mRNAマーカー、並びに、例えば、レプチン、セロトニン再取り込み輸送体(SERT)、トリプトファンヒドロキシラーゼ−1、5−ヒドロキシトリプタミン(5−HT)、トリプターゼ、PGE2、ヒスタミン、粘膜タンパク質(mucosal protein)8、ケラチン−8、クローディン(claudin)−8、ゾヌリン(zonulin)、コルチコトロピン放出ホルモン受容体1(CRHR1)、コルチコトロピン放出ホルモン受容体2(CRHR2)などを挙げることができる。
例えば、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書中に組み込まれる、2009年6月25日出願の米国特許仮出願第61/220,525号の実施例1及び2は、α−トリプターゼのレベルを測定することがIBS−C患者試料をIBS−A及びIBS−D患者試料から識別するのにとりわけ有効であることを示している。同様に、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書中に組み込まれる、2007年8月14日出願の米国特許公報第2008/0085524号の実施例1は、レプチンのレベルを測定することがIBS−C患者試料をIBS−A及びIBS−D患者試料から識別するのにとりわけ有効であることを示している。さらに、粘膜SERT及びトリプトファンヒドロキシラーゼ−1発現がIBS−C及びIBS−Dにおいて減少することが示されている(例えば、Gershon, J. Clin. Gastroenterol., 39(5 Suppl):S184-193 (2005)参照)。さらに、IBS−C患者は減じられた食後の5−HT放出を示すのに対して、IBS−PI患者はより高いピークレベルの5−HTを有する(例えば、Dunlop, Clin Gastroenterol Hepatol., 3:349-357 (2005)参照)。
V.アッセイ
当該技術分野において公知の様々なアッセイ、技法、及びキットのいずれかを用いて、試料中の1種又は2種以上のマーカーの存在又はレベルを決定してその試料がIBSと関連するか否かを分類することができる。
当該技術分野において公知の様々なアッセイ、技法、及びキットのいずれかを用いて、試料中の1種又は2種以上のマーカーの存在又はレベルを決定してその試料がIBSと関連するか否かを分類することができる。
本発明は、個体から得られる試料中の少なくとも1種のマーカーの存在又はレベルを決定することに一部分依存している。「少なくとも1種のマーカーの存在を決定すること」という用語は、本明細書中で用いる場合、当業者に公知の任意の定量又は定性アッセイを用いることによって着目した各マーカーの存在を決定することを含む。或る場合に、特定の特徴、変数(variable)、又は生化学的若しくは血清学的物質(例えば、RNA、mRNA、miRNA、タンパク質、又は抗体)の存在又は非存在を決定する定性アッセイは、着目した各マーカーを検出するのに適している。或る他の場合に、RNA、タンパク質、抗体、又は活性の存在又は非存在を決定する定量アッセイは、着目した各マーカーを検出するのに適している。「少なくとも1種のマーカーのレベルを決定すること」という用語は、本明細書中で用いる場合、当業者に公知の任意の直接的又は間接的な定量アッセイを用いることによって着目した各マーカーのレベルを決定することを含む。或る場合に、例えば、RNA、mRNA、miRNA、タンパク質、抗体、又は活性の相対量又は絶対量を決定する定量アッセイは、着目した各マーカーのレベルを検出するのに適している。当業者であれば、マーカーのレベルを決定するのに有効な任意のアッセイがマーカーの存在又は非存在を決定するのにも有効であることを理解されよう。
ルーチン技術、例えば、ノーザン分析、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(例えば、qRT−PCR、RT−PCR)、マイクロアレイアッセイ、Luminex MultiAnalyte Profiling(xMAP)技術又はマーカーコード配列の一部に相補的である核酸配列に対するハイブリダイゼーション(例えば、スロットブロットハイブリダイゼーション)に基づく任意の他の方法など、を用いたマーカーmRNAレベルの分析は、本発明の範囲内にある。適用することができるPCR増幅技術は、例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York (1999), Chapter 7及びSupplement 47;Theophilus et al., “PCR Mutation Detection Protocols,” Humana Press, (2002);及びInnis et al., PCR Protocols, San Diego, Academic Press, Inc. (1990)に記載されている。一般的な核酸ハイブリダイゼーション法は、Anderson, “Nucleic Acid Hybridization,” BIOS Scientific Publishers, 1999に記載されている。複数の転写された核酸配列(例えば、mRNA又はcDNA)の増幅又はハイブリダイゼーションは、マイクロアレイに配置されたmRNA又はcDNAから実施することもできる。マイクロアレイ法は、一般的に、Hardiman, “Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts,” DNA Press, 2003;及び Baldi et al., “DNA Microarrays and Gene Expression: From Experiments to Data Analysis and Modeling,” Cambridge University Press, 2002に記載されている。
マーカー、例えば、遺伝子マーカーの遺伝子型の分析は、限定的でなく、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)をベースとする分析、配列分析、及び電気泳動分析を含む、当該技術分野で公知の技術を用いて実施することができる。PCRをベースとする分析の限定的でない例として、Applied Biosystems社から入手することができるTaqman(商標)対立遺伝子識別アッセイを挙げることができる。配列分析の限定的でない例として、マクサム−ギルバート(Maxam-Gilbert)配列決定、サンガー配列決定、キャピラリーアレイDNA配列決定、熱サイクル配列決定(Sears et al., Biotechniques, 13:626-633 (1992))、固相配列決定(Zimmerman et al., Methods Mol. Cell Biol., 3:39-42 (1992))、質量分析を用いた配列決定、例えば、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−TOF/MS;Fu et al., Nature Biotech., 16:381-384 (1998))など、及びハイブリダイゼーションによる配列決定(Chee et al., Science, 274:610-614 (1996);Drmanac et al., Science, 260:1649-1652 (1993);Drmanac et al., Nature Biotech., 16:54-58 (1998))を挙げることができる。電気泳動分析の限定的でない例として、スラブゲル電気泳動、例えば、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動など、キャピラリー電気泳動、及び変性勾配ゲル電気泳動を挙げることができる。マーカー中の多型部位において個体の遺伝子型を決定するための他の方法として、例えば、Third Wave Technologies社のINVADER(商標)アッセイ、制限断片長多型(RFLP)分析、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、ヘテロ二重鎖移動度アッセイ、及び一重鎖高次構造多型(SSCP)分析を挙げることができる。
「抗体」という用語は、本明細書中で用いる場合、ポリクローナル又はモノクローナル及び任意のアイソタイプであることができる免疫グロブリン分子の母集団、又は免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片を含む。かかる免疫学的に活性な断片は、抗原と特異的に結合する抗体分子の一部を構成するH鎖及びL鎖可変領域を含む。例えば、Fab、Fab’又はF(ab’)2として当該技術分野で公知の免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片は、抗体という用語の意味の範疇に含まれる。
フローサイトメトリーを用いて試料中の1種又は2種以上のマーカーの存在又はレベルを決定することができる。ビーズをベースとするイムノアッセイを含む前記フローサイトメトリーアッセイを用いて、例えば、カンジダ・アルビカンス及びHIVタンパク質に対する血清抗体の検出について記載されている方法(例えば、Bishop and Davis, J. Immunol. Methods, 210:79-87 (1997);McHugh et al., J. Immunol. Methods, 116:213 (1989);Scillian et al., Blood, 73:2041 (1989)参照)と同じ方法により抗体マーカーレベルを決定することができる。
マーカーに特異的な組換え抗原を発現させるためにファージディスプレイ法を用いて試料中の1種又は2種以上のマーカーの存在又はレベルを決定することもできる。例えば、抗体マーカーに特異的な抗原を発現するファージ粒子を、所望により、抗体、例えば、抗ファージモノクローナル抗体などを用いてマルチウェルプレートに固定することができる(Felici et al., “Phage-Displayed Peptides as Tools for Characterization of Human Sera” in Abelson (Ed.), Methods in Enzymol., 267, San Diego: Academic Press, Inc. (1996))。
競合イムノアッセイ及び非競合イムノアッセイを含む様々なイムノアッセイ法を用いて、試料中の1種又は2種以上のマーカーの存在又はレベルを決定することができる(例えば、Self and Cook, Curr. Opin. Biotechnol., 7:60-65 (1996)参照)。イムノアッセイという用語は、限定的でなく、酵素イムノアッセイ(EIA)、例えば、酵素増幅イムノアッセイ(EMIT)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、抗原捕捉ELISA、サンドイッチELISA、IgM抗体捕捉ELISA(MAC ELISA)、及び微粒子酵素イムノアッセイ(MEIA);キャピラリー電気泳動イムノアッセイ(CEIA);ラジオイムノアッセイ(RIA);免疫放射定量測定法(IRMA);蛍光偏光イムノアッセイ(FPIA);及び化学発光測定法(CL)を含む技術を包含する。所望により、前記イムノアッセイは自動化することができる。イムノアッセイは、レーザ誘起蛍光法と併せて用いることもできる(例えば、Schmalzing and Nashabeh, Electrophoresis, 18:2184-2193 (1997);Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci., 699:463-480 (1997)参照)。リポソームイムノアッセイ、例えば、フローインジェクションリポソームイムノアッセイ及びリポソーム免疫センサーも本発明に用いるのに適している(例えば、Rongen et al., J. Immunol. Methods, 204:105-133 (1997)参照)。さらに、タンパク質/抗体複合体の形成がマーカー濃度の関数としてピークレートシグナルに転換される増大した光散乱を生じさせる比濁分析は本発明に用いるのに適している。比濁分析アッセイはBeckman Coulter社(カリフォルニア州ブレア;キット#449430)から商業的に入手することができそしてベーリング・ネフェロメーター・アナライザー(Behring Nephelometer Analyzer)を用いて実施することができる(Fink et al., J. Clin. Chem. Clin. Biol. Chem., 27:261-276 (1989))。
抗原捕捉ELISAは、試料中の1種又は2種以上のマーカーの存在又はレベルを決定するのに有効であることができる。例えば、抗原捕捉ELISAにおいては、着目したマーカーに向けられた抗体を固相に結合させ、そして前記抗体がマーカーに結合するように試料を添加する。結合されないタンパク質を洗浄によって除去した後、結合したマーカーの量を、例えば、ラジオイムノアッセイを用いて定量化することができる(例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988)参照)。サンドイッチELISAも本発明に用いるのに適していることができる。例えば、2抗体サンドイッチ分析において、一次抗体を固体支持体に結合させ、そして着目したマーカーを前記一次抗体に結合させる。マーカーの量は、マーカーと結合する二次抗体の量を測定することにより定量化される。抗体は、種々の固体支持体、例えば、磁性又はクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイプレート(例えば、マイクロタイターウェル)の表面、固体基体材料又は膜(例えば、プラスチック、ナイロン、紙)の小片(pieces)など、の上に固定化することができる。アッセイストリップは、固体支持体上のアレイ内にその抗体又は複数種の抗体をコーティングすることによって調製することができる。次いで、このストリップを検査試料中に浸漬し、そして洗浄及び検出工程を通して迅速に処理して、測定可能なシグナル、例えば、発色スポットなど、を生成することができる。
例えば、ヨウ素125(125I)で標識された二次抗体を用いたラジオイムノアッセイ(Harlow and Lane、前記参照)も、試料中の1種又は2種以上のマーカーの存在又はレベルを測定するのに適している。化学発光マーカーで標識された二次抗体も本発明に用いるのに適していることができる。化学発光二次抗体を用いた化学発光イムノアッセイは、マーカーレベルの鋭敏な非放射性検出に適している。かかる二次抗体は種々の供給源、例えば、Amersham Lifesciences社(イリノイ州アーリントンハイツ)から商業的に入手することができる。
前記イムノアッセイは、試料中の1種又は2種以上のマーカーの存在又はレベルを決定するのにとりわけ有効である。限定的でない例として、IL−8結合分子、例えば、抗IL−8抗体又は細胞外IL−8結合タンパク質(例えば、IL−8受容体)など、を用いたELISAは、試料がIL−8タンパク質に陽性であるか否かを決定し又は試料中のIL−8タンパク質レベルを決定するのに有効である。固定された好中球ELISAは、試料がANCAに陽性であるか否かを決定し又は試料中のANCAレベルを決定するのに有効である。同様に、酵母細胞壁ホスホペプチドマンナンを用いたELISAは、試料がASCA−IgA及び/又はASCA−IgGに陽性であるか否かを決定し、又は試料中のASCA−IgA及び/又はASCA−IgGレベルを決定するのに有効である。OmpCタンパク質又はその断片を用いたELISAは、試料が抗OmpC抗体に陽性であるか否かを決定し、又は試料中の抗OmpC抗体レベルを決定するのに有効である。I2タンパク質又はその断片を用いたELISAは、試料が抗I2抗体に陽性であるか否かを決定し、又は試料中の抗I2抗体レベルを測定するのに有効である。フラジェリンタンパク質(例えば、Cbir−1フラジェリン)又はその断片を用いたELISAは、試料が抗フラジェリン抗体に陽性であるか否かを決定し、又は試料中の抗フラジェリン抗体レベルを決定するのに有効である。さらに、前記イムノアッセイは、試料中の他の診断マーカーの存在又はレベルを決定するのにとりわけ有効である。
着目したマーカーへの抗体の特異的な免疫学的結合は直接的又は間接的に検出することができる。直接的な標識として、抗体に付けられる蛍光又は発光(luminescent)タグ、金属、色素、放射性核種などを挙げることができる。ヨウ素125(125I)で標識された抗体は、試料中の1種又は2種以上のマーカーのレベルを決定するのに用いることができる。マーカーに特異的な化学発光抗体を用いた化学発光アッセイは、マーカーレベルの鋭敏な非放射性検出に適している。蛍光色素で標識された抗体も、試料中の1種又は2種以上のマーカーのレベルを決定するのに適している。蛍光色素の例として、限定的でなく、DAPI、フルオレセイン、ヘキスト(Hoechst)33258、R−フィコシアニン、B−フィコエリトリン、R−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを挙げることができる。蛍光色素に結合される二次抗体は商業的に入手することができ、例えば、ヤギF(ab’)2抗ヒトIgG−FITCは、Tago Immunologicals社(カリフォルニア州バーリンゲーム)から入手することができる。
間接的な標識として、当該技術分野で周知の種々の酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼなどを挙げることができる。西洋ワサビペルオキシダーゼ検出系は、例えば、450nmにおいて検出可能な可溶性生成物を過酸化水素の存在下に生ずる色素生産性基質テトラメチルベンジジン(TMB)と共に用いることができる。アルカリホスファターゼ検出系は、例えば、405nmにおいて容易に検出可能な可溶性生成物を生ずる、色素生産性基質p−ニトロフェニルホスフェートと共に用いることができる。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出系は、410nmにおいて検出可能な可溶性生成物を生ずる、色素生産性基質o−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(ONPG)と共に用いることができる。ウレアーゼ検出系は、基質、例えば、尿素−ブロモクレゾールパープル(Sigma Immunochemicals社;ミズーリ州セントルイス)と共に用いることができる。酵素に結合される有用な二次抗体は多くの商業的供給源から入手することができ、例えば、ヤギF(ab’)2抗ヒトIgG−アルカリホスファターゼは、Jackson ImmunoResearch社(ペンシルバニア州ウェストグローブ)から購入することができる。
直接的又は間接的な標識からのシグナルは、例えば、色素生産性基質由来の色を検出するために分光光度計を用いて;放射線を検出するために放射線測定器、例えば、125Iの検出用ガンマカウンターを用いて;又は所定の波長の光の存在下に蛍光を検出する蛍光光度計を用いて、分析することができる。酵素結合抗体の検出には、分光光度計、例えば、EMAX Microplate Reader(Molecular Devices社;カリフォルニア州メンロパーク)を製造業者の使用説明書に従って用いて、マーカーレベルの量の定量分析を行なうことができる。所望により、本発明のアッセイは自動化し又はロボット制御により実施することができ、そして多数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。
定量的ウエスタンブロット法を用いて、試料中の1種又は2種以上のマーカーの存在又はレベルを検出又は決定することもできる。ウエスタンブロットは、周知の方法、例えば、走査デンシトメトリー又はホスホアイメージング(phosphorimaging)によって定量化することができる。限定的でない例として、タンパク質試料を10%SDS−PAGEレムリ(Laemmli)ゲル上で電気泳動する。一次マウスモノクローナル抗体をブロットと反応させ、そして予備的なスロットブロット試験を用いて抗体結合が直線的であることを確認することができる。二次抗体としてヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体(BioRad社)を用い、そして例えば、Renaissance化学発光キット(New England Nuclear社;マサチューセッツ州ボストン)を用い製造業者の使用説明書に従って、化学発光を用いたシグナル検出を行なう。ブロットのオートラジオグラフは、走査デンシトメーター(Molecular Dynamics社;カリフォルニア州サニーヴェール)を用いて分析し、そしてポジティブコントロールに対して正規化する。数値は、例えば、ポジティブコントロールに対する実測値の間の比(デンシトメトリックインデックス)として報告される。かかる方法は、例えば、Parra et al., J. Vasc. Surg., 28:669-675 (1998)に記載されているように当該技術分野で周知である。
代わりに、様々な免疫組織化学的アッセイ法を用いて試料中の1種又は2種以上のマーカーの存在又はレベルを決定することができる。免疫組織化学的アッセイという用語は、着目したマーカーと反応する抗体に結合される(すなわち、コンジュゲートされる)蛍光色素又は酵素の蛍光顕微鏡検査法又は光学顕微鏡検査法を用いた視覚的検出を利用する方法を包含し、そして限定的でなく、直接蛍光抗体アッセイ、間接蛍光抗体(IFA)アッセイ、抗補体免疫蛍光法、アビジン−ビオチン免疫蛍光法、及び免疫ペルオキシダーゼアッセイを含む。IFAアッセイは、例えば、試料がANCAに陽性であるか否か、試料中のANCAのレベル、試料がpANCAに陽性であるか否か、試料中のpANCAのレベル、及び/又はANCA染色パターン(例えば、cANCA、pANCA、NSNA、及び/又はSAPPA染色パターン)を決定するのに有効である。試料中のANCAの濃度は、例えば、終点滴定(endpoint titration)により又は公知の標準品と比較した蛍光の視覚的強度を測定することにより、定量化することができる。
代わりに、着目したマーカーの存在又はレベルは、精製されたマーカーの量を検出又は定量化することによって決定することができる。マーカーの精製は、例えば、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)単独によって、又はそれと質量分析(例えば、MALDI/MS、MALDI−TOF/MS、SELDI−TOF/MS、タンデムMS等)との組み合わせにより、達成することができる。着目したマーカーの定性又は定量検出は、限定的でなく、ブラッドフォード(Bradford)アッセイ、クーマシーブルー染色法、銀染色法、放射標識されたタンパク質に対するアッセイ、及び質量分析を含む周知の方法によって決定することもできる。
複数のマーカーの分析は、1つの試験試料について別々に又は同時に実施することができる。マーカーの別個の又は順次のアッセイに適した装置として、臨床検査分析装置、例えば、ElecSys(Roche社)、AxSym(Abbott社)、Access(Beckman社)、ADVIA(商標)、CENTAUR(商標)(Bayer社)、及びNICHOLS ADVANTAGE(商標)(Nichols Institute社)イムノアッセイ装置を挙げることができる。好ましい装置又はタンパク質チップは、単一表面上で複数のマーカーの同時分析を行なう。とりわけ有用な物理フォーマットは、複数の異なるマーカーの検出に対して複数の分離したアドレス可能な位置を有する表面を含む。かかるフォーマットは、プロテインマイクロアレイ、又は「プロテインチップ」(例えば、Ng et al., J. Cell Mol. Med., 6:329-340 (2002)参照)及び所定のキャピラリー装置(例えば、米国特許第6,019,944号参照)を含む。これらの実施形態において、分離した表面位置のそれぞれが各位置において検出のための1種又は2種以上のマーカーを固定化するための抗体を含んでいることができる。表面は、代わりに、表面の分離した位置に固定化された1つ又は2つ以上の分離した粒子(例えば、マイクロ粒子又はナノ粒子)を含んでいることができ、前記マイクロ粒子は検出用の1種又は2種以上のマーカーを固定化するための抗体を含んでいる。複数のマーカーの同時アッセイを行うためのさらに別の適当なフォーマットは、以前にはFlowMetrix及びLabMAP (Elshal and McCoy, 2006)として知られた、Luminex MultiAnalyte Profiling(xMAP)技術である。これは、種々の強度の赤色及び赤外フルオロフォアによって内部染色されるポリスチレンビーズを用いる多重のビーズをベースとするフローサイトメトリーアッセイである。種々の捕捉試薬、例えば、抗体、オリゴヌクレオチド、及びペプチドがビーズに結合することができるので、種々のRNA、mRNA、miRNA、タンパク質、リガンド、及びDNAの定量化を促進することができる(Fulton et al, 1997;Kingsmore, 2006;Nolan and Mandy, 2006, Vignali, 2000;Ray et al, 2005)。
着目した数種のマーカーを複数の試料の効率的な処理のために1つの検査にまとめることができる。さらに、当業者であれば、同じ被験者由来の複数の試料(例えば、連続的な時点での、等)を検査する価値を認めるであろう。かかる一連の試料の検査は、マーカーレベルの経時的な変化の同定を可能にすることができる。マーカーレベルの増加又は減少、並びにマーカーレベルの変化がないことは、IBSを分類し又はIBS様症状と関連する疾病及び疾患を除外するための有効な情報を提供することもできる。
上記の1種又は2種以上のマーカーを測定するパネルは、試料をIBSに関連していると分類するための本発明のアプローチに関する適切な情報を与えるように構成することができる。かかるパネルは、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、55種、60種、65種、70種、75種、80種、85種、90種、95種、100種又はそれを超える種類の個別のマーカーの存在又はレベルを決定するように構成することができる。単一のマーカー又はマーカーのサブセットの分析は、種々の臨床的環境において当業者によって実施することもできる。これらの例として、限定的でなく、外来診療、応急手当て、救命救急診療、集中治療、モニタリング装置、入院患者、院外患者、診療室、クリニック、及び健康診断の環境を挙げることができる。
マーカーの分析は、さらに様々な物理フォーマットにより実施することができるであろう。例えば、マイクロタイタープレートを用いて又は自動化により多量の検査試料の処理を促進することができるであろう。代わりに、単一の試料フォーマットを開発してタイムリーに治療及び診断を促進することができるであろう。
VI.統計的アルゴリズム
或る側面において、本発明は、試料をIBS試料又は非IBS試料と分類する統計的アルゴリズム又は統計処理を用いて試料がIBSと関連しているか否かを分類する方法、システム、及びコードを提供する。他の側面において、本発明は、試料を非IBD試料又はIBD試料と分類する(すなわち、IBD除外工程)第一の統計的アルゴリズム又は統計処理、それに続いて非IBD試料をIBS試料又は非IBS試料と分類する(すなわち、IBS判定工程)第二の統計的アルゴリズム又は統計処理を用いて試料がIBSと関連しているか否かを分類する方法、システム、及びコードを提供する。好ましくは、統計的アルゴリズム又は統計処理は、独立して、1つ又は2つ以上の学習統計的分類子システムを含む。本明細書中に記載のように、学習統計的分類子システムの組み合わせは、有利なことに、試料がIBSと関連しているか否かを分類するための改善された感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率、及び/又は全体的正確度を提供する。
或る側面において、本発明は、試料をIBS試料又は非IBS試料と分類する統計的アルゴリズム又は統計処理を用いて試料がIBSと関連しているか否かを分類する方法、システム、及びコードを提供する。他の側面において、本発明は、試料を非IBD試料又はIBD試料と分類する(すなわち、IBD除外工程)第一の統計的アルゴリズム又は統計処理、それに続いて非IBD試料をIBS試料又は非IBS試料と分類する(すなわち、IBS判定工程)第二の統計的アルゴリズム又は統計処理を用いて試料がIBSと関連しているか否かを分類する方法、システム、及びコードを提供する。好ましくは、統計的アルゴリズム又は統計処理は、独立して、1つ又は2つ以上の学習統計的分類子システムを含む。本明細書中に記載のように、学習統計的分類子システムの組み合わせは、有利なことに、試料がIBSと関連しているか否かを分類するための改善された感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率、及び/又は全体的正確度を提供する。
「統計的アルゴリズム」又は「統計処理」という用語は、変数間の相関関係を決定するために用いられる様々な統計分析の任意のものを含む。本発明において、変数は着目した少なくとも1種のマーカーの存在又はレベル及び/又は少なくとも1種のIBS関連症状の存在又は重症度である。本明細書中に記載の統計的アルゴリズムを用いて任意の数のマーカー及び/又は症状を分析することができる。例えば、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、25種、30種、35種、40種、45種、50種、55種、60種、65種、70種、75種、80種、85種、90種、95種、100種、又はそれを超える種類のバイオマーカー及び/又は症状を統計的アルゴリズムに含めることができる。1つの実施形態において、ロジスティック回帰を用いる。別の実施形態において、直線回帰を用いる。或る場合において、本発明の統計的アルゴリズムは、変数として所定の母集団内の特定のマーカーの分位点測定値(quantile measurement)を用いることができる。分位点は、データのサンプルを(できるだけ)等しい観察数を含む群に分割する「カットポイント」のセットである。例えば、四分位数は、(できるだけ)等しい観察数を含む4つの群にデータのサンプルを分割する値である。下位四分位数は、配列された(ordered)データのセットを通して4分の1上がった(quarter way up)データ値であり;上位四分位数は、配列されたデータのセットを通して4分の1下がった(quarter way down)データ値である。五分位数は(できるだけ)等しい観察数を含む5つの群にデータのサンプルを分割する値である。本発明は、アルゴリズムの変数として(連続変数を用いた場合と同様に)マーカーレベルの百分位数範囲(例えば、三分位数、四分位数、五分位数等)、又はそれらの累積的指標(例えば、マーカーレベルの四分位数の合計等)の使用も含んでいることができる。
好ましくは、本発明の統計的アルゴリズムは1種又は2種以上の学習統計的分類子システムを含む。「学習統計的分類子システム」という用語は、本明細書中で用いる場合、複合データセット(例えば、着目したマーカーのパネル及び/又はIBS関連症状のリスト)に適用しそしてかかるデータセットに基づいて決定を行なうことができる機械学習アルゴリズム技術を含む。或る実施形態において、単一の学習統計的分類子システム、例えば、分類木(例えば、ランダムフォレスト)を用いる。他の実施形態において、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、又は11種以上の学習統計的分類子システムの組み合わせを、好ましくはタンデムで用いる。学習統計的分類子システムの例として、限定的でなく、帰納学習(例えば、決定/分類木、例えば、ランダムフォレスト、分類及び回帰木(C&RT)、ブースト型の木等)、Probably Approximately Correct(PAC)学習、コネクショニスト学習(例えば、ニューラルネットワーク(NN)、人工ニューラルネットワーク(ANN)、ニューロファジーネットワーク(NFN)、ネットワーク構造、パーセプトロン、例えば、多層パーセプトロン、多層フィードフォワードネットワーク、ニューラルネットワークのアプリケーション、信念ネットワーク(belief network)におけるベイジアン学習等)、強化学習(例えば、既知環境における受動的学習(passive learning)、例えば、単純学習(naive learning)、適応型動的(adaptive dynamic)学習、及び時間差学習、未知環境における受動的学習、未知環境における能動的学習、行動−価値関数学習(learning action-value functions)、強化学習のアプリケーション等)、及び遺伝的アルゴリズム及び進化的プログラミングを用いたものを挙げることができる。他の学習統計的分類子システムとして、サポート・ベクター・マシーン(例えば、カーネル法)、多変量適応回帰スプライン(MARS)、レーベンバーグ・マルカートアルゴリズム、ガウス・ニュートンアルゴリズム、ガウス混合(mixtures of Gaussians)、勾配降下アルゴリズム、及び学習ベクトル量子化(LVQ)を挙げることができる。
ランダムフォレストは、Leo Breiman及びAdele Cutlerによって開発されたアルゴリズムを用いて構築された学習統計的分類子システムである。ランダムフォレストは多数の個別の決定木を用いそして個別の木によって決定されるクラスのモード(すなわち、最頻値(most frequently occurring))を選択することによってクラスを決定する。ランダムフォレスト分析は、例えば、Salford Systems社(カリフォルニア州サンディエゴ)から入手することができるRandomForestsソフトウェアを用いて実施することができる。例えば、ランダムフォレストの説明については、Breiman, Machine Learning, 45:5-32 (2001);及びhttp://stat-www.berkeley.edu/users/breiman/RandomForests/cc_home.htmを参照されたい。
分類及び回帰木は、適当な古典的回帰モデルに対するコンピュータ集約型の代替を表すものであり、そして一般には、1種又は2種以上の予測変数に基づき分類及び回帰木を用いて着目したカテゴリー的又は連続的な応答に対する最良の可能なモデルを決定する。分類及び回帰木分析は、例えば、Salford Systems社から入手することができるCARTソフトウェア又はStatSoft社(オクラホマ州タルサ)から入手することができるStatisticalデータ分析ソフトウェアを用いて実施することができる。分類及び回帰木の説明は、例えば、Breiman et al. “Classification and Regression Trees,” Chapman and Hall, New York (1984);及びSteinberg et al., “CART: Tree-Structured Non-Parametric Data Analysis,” Salford Systems, San Diego, (1995)に見出される。
ニューラルネットワークは、計算に対するコネクショニストアプローチに基づく情報処理のための数理又は計算モデルを用いる人工ニューロンの相互接続されたグループである。一般には、ニューラルネットワークは、ネットワークを流れる外部又は内部情報に基づいてその構造を変える適応システムである。ニューラルネットワークの具体例として、フィードフォワードニューラルネットワーク、例えば、パーセプトロン、単層パーセプトロン、多層パーセプトロン、バックプロパゲーションネットワーク、ADALINEネットワーク、MADALINEネットワーク、Learnmatrixネットワーク、動径基底関数(RBF)ネットワーク、及び自己組織化マップ又はコホーネン自己組織化ネットワーク;リカレントニューラルネットワーク、例えば、シンプルリカレントネットワーク及びホップフィールドネットワーク;確率的ニューラルネットワーク、例えば、ボルツマンマシン;モジュール型ニューラルネットワーク、例えば、機械及び連合的ニューラルネットワークの委員会(committee of machines and associative neural networks);及び他の型のネットワーク、例えば、即時訓練型(instantaneously trained)ニューラルネットワーク、スパイキング(spiking)ニューラルネットワーク、動的ニューラルネットワーク、及びカスケーディング(cascading)ニューラルネットワークを挙げることができる。ニューラルネットワーク分析は、例えば、StatSoft社から入手することができるStatisticalデータ分析ソフトウェアを用いて実施することができる。ニューラルネットワークの説明については、例えば、Freeman et al., In “Neural Networks: Algorithms, Applications and Programming Techniques,” Addison-Wesley Publishing Company (1991);Zadeh, Information and Control, 8:338-353 (1965);Zadeh, “IEEE Trans. on Systems, Man and Cybernetics,” 3:28-44 (1973);Gersho et al., In “Vector Quantization and Signal Compression,” Kluywer Academic Publishers, Boston, Dordrecht, London (1992);及びHassoun, “Fundamentals of Artificial Neural Networks,” MIT Press, Cambridge, Massachusetts, London (1995)を参照されたい。
サポートベクターマシーンは、分類及び回帰に対して用いられる関連する教師あり学習技術のセットでありそして例えば、Cristianini et al., “An Introduction to Support Vector Machines and Other Kernel-Based Learning Methods,” Cambridge University Press (2000)に記載されている。サポートベクターマシーン分析は、例えば、Thorsten Joachims(コーネル大学)によって開発されたSVMlightソフトウェアを用いて又はChih−Chung Chang及びChih−Jen Lin(国立台湾大学)によって開発されたLIBSVMソフトウェアを用いて実施することができる。
本明細書中に記載した学習統計的分類子システムは、健常個体、IBS患者、IBD患者、及び/又はセリアック病患者由来の試料(たとえば、血清学的試料)のコホートを用いて訓練及び試験することができる。例えば、医師によって、そして好ましくは消化器専門医によって生検、大腸内視鏡検査(colonoscopy)、又は例えば、米国特許第6,218,129号に記載のイムノアッセイを用いてIBDに罹患していると診断された患者由来の試料は、本発明の学習統計的分類子システムの訓練及び試験に用いるのに適している。IBDに罹患していると診断された患者由来の試料を、例えば、米国特許第5,750,355号及び第5,830,675号に記載のイムノアッセイを用いてクローン病又は潰瘍性大腸炎に分類することもできる。IBSと診断された患者由来の試料を、IBS−便秘型(IBS−C)、IBS−下痢型(IBS−D)、IBS−混合型(IBS−M)、IBS−交替型(IBS−A)、又は感染後型IBS(IBS−PI)に分類することができる。公表された基準、例えば、マニング(Manning)、ローマI、ローマII、又はローマIII診断基準など、を用いてIBSと診断された患者由来の試料は、本発明の学習統計的分類子システムの訓練及び試験に用いるのに適している。健常個体由来の試料は、IBD及び/又はIBS試料と同定されなかった試料を含んでいることができる。当業者であれば、本発明の学習統計的分類子システムの訓練及び試験に用いることができる患者試料のコホートを得るための追加の技術及び診断基準があることを承知しているであろう。
「感度」という用語は、本明細書中で用いる場合、試料が陽性、例えば、IBSに罹患しているものである場合に、本発明の診断方法、システム、又はコードが陽性の結果を与える確率をいう。感度は、真陽性結果を真陽性及び偽陰性の合計で割った数値として計算される。感度は、本質的に、本発明の方法、システム、又はコードがIBSに罹患したものを、前記疾病に罹患していないものからどれだけよく正確に同定するかの尺度である。統計的アルゴリズムは、IBSを分類する感度が少なくとも約60%であり、そして、例えば、少なくとも約65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%であることができるように選択されることができる。好ましい実施形態において、IBSを分類する感度は、学習統計的分類子システムの組み合わせを用いる場合には少なくとも約90%であり(あらゆる目的でその内容の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許公報第2008/0085524号の実施例10参照)、又は単一の学習統計的分類子システムを用いる場合には少なくとも約85%である(あらゆる目的でその内容の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許公報第2008/0085524号の実施例11参照)。
「特異度」という用語は、試料が陽性でない、例えば、IBSに罹患していないものである場合に、本発明の診断方法、システム、又はコードが陰性の結果を与える確率をいう。特異度は、真陰性結果を真陰性及び偽陽性の合計で割った数値として計算される。特異度は、本質的に、本発明の方法、システム、又はコードがIBSに罹患していないものを、前記疾病に罹患しているものからどれだけよく除外するかの尺度である。統計的アルゴリズムは、IBSを分類する特異度が少なくとも約70%、例えば、少なくとも約75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%であるように選択されることができる。好ましい実施形態において、IBSを分類する特異度は、学習統計的分類子システムの組み合わせを用いる場合には少なくとも約86%であり(あらゆる目的でその内容の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許公報第2008/0085524号の実施例10参照)、又は単一の学習統計的分類子システムを用いる場合には少なくとも約84%である(あらゆる目的でその内容の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許公報第2008/0085524号の実施例11参照)。
「陰性的中率」又は「NPV」という用語は、本明細書中で用いる場合、IBSに罹患していないと同定された個体が実際に当該疾病に罹患していない確率をいう。陰性的中率は、真陰性を真陰性及び偽陰性の合計で割った数値として計算することができる。陰性的中率は、診断方法、システム、又はコードの特性はもちろん分析される母集団内の疾病の有病率によっても決定される。統計的アルゴリズムは、或る疾病有病率を有する母集団における陰性的中率が約70%〜約99%の範囲内であり、そして、例えば、少なくとも約70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%であることができるように選択されることができる。好ましい実施形態において、IBSを分類する陰性的中率は、学習統計的分類子システムの組み合わせを用いる場合には少なくとも約87%である(あらゆる目的でその内容の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許公報第2008/0085524号の実施例10参照)。
「陽性的中率」又は「PPV」という用語は、IBSに罹患していると同定された個体が実際に当該疾病に罹患している確率をいう。陽性的中率は、真陽性を真陽性及び偽陽性の合計で割った数値として計算することができる。陽性的中率は、診断方法、システム、又はコードの特性はもちろん分析される母集団内の疾病の有病率によっても決定される。統計的アルゴリズムは、或る疾患有病率を有する母集団における陽性的中率が約80%〜約99%の範囲内であり、そして、例えば、少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%であることができるように選択されることができる。好ましい実施形態において、IBSを分類する陽性的中率は、学習統計的分類子システムの組み合わせを用いる場合には少なくとも約90%である(あらゆる目的でその内容の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許公報第2008/0085524号の実施例10参照)。
陰性的中率及び陽性的中率を含む的中率は、分析される母集団内の疾病の有病率に影響される。本発明の方法、システム、及びコードにおいて、特定のIBS有病率を有する臨床的母集団について望ましい臨床的パラメータを生成するように統計的アルゴリズムを選択することができる。例えば、学習統計的分類子システムは、例えば、臨床医の診療室、例えば、消化器専門医の診療室又は一般開業医の診療室で見ることができる、約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、又は70%までのIBS有病率に対して選択されることができる。
「全体的一致」又は「全体的正確度」という用語は、本明細書中で用いる場合、本発明の方法、システム、又はコードが病状を分類する場合の正確度をいう。全体的正確度は、試料結果の総数で真陽性及び真陰性の合計を割った値として計算され、そしてそれは分析される母集団内の疾病の有病率によって影響される。例えば、統計的アルゴリズムは、或る疾病有病率を有する患者母集団における全体的正確度が少なくとも約60%であり、そして、例えば、少なくとも約65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%であることができるように選択されることができる。好ましい実施形態において、IBSを分類する全体的正確度は、学習統計的分類子システムの組み合わせを用いる場合には少なくとも約80%である(あらゆる目的でその内容の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許公報第2008/0085524号の実施例10参照)。
VII.疾病分類システム
あらゆる目的でその内容の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許公報第2008/0085524号の図2は、本発明の1つの実施形態による疾病分類システム(disease classification system)(DCS)(200)を表す。そこに示されているように、DCSは、プロセッサ(215)及びメモリモジュール(210)を備えた、DCSインテリジェンスモジュール(205)、例えば、コンピュータなどを含む。インテリジェンスモジュールは、1つ又は2つ以上の直接接続(例えば、USB、Firewire、又は他のインターフェース)及び1つ又は2つ以上のネットワーク接続(例えば、モデム又は他のネットワークインターフェース機器を含む)を通じて情報を送信及び受信するための通信モジュール(図示せず)も含む。メモリモジュールは、内部メモリ装置及び1つ又は2つ以上の外部メモリ装置を含んでいることができる。インテリジェンスモジュールは、ディスプレイモジュール(225)、例えば、モニター又はプリンターなども含んでいる。1つの側面において、インテリジェンスモジュールは、データ、例えば、データ取得モジュール、例えば、検査システム(250)からの患者検査結果など、を直接接続により又はネットワーク(240)を通じて受信する。例えば、検査システムは、1つ又は2つ以上の患者試料(255)についてマルチアナライト(multianalyte)検査を行いそしてその検査結果をインテリジェンスモジュールに自動的に提供するように構成されていることができる。データは、ユーザーによる直接入力を介してインテリジェンスモジュールに提供することもでき、又はポータブル媒体、例えば、コンパクトディスク(CD)又はデジタル多用途ディスク(DVD)からダウンロードすることができる。検査システムは、インテリジェンスモジュールに直結させて、インテリジェンスモジュールと統合させることができ、又はネットワークを通じてインテリジェンスモジュールと遠隔結合させることができる。インテリジェンスモジュールは、周知であるようなネットワークを通じて1つ又は2つ以上のクライアントシステム(230)へ及びそこからデータ通信することもできる。例えば、要求している医師又はヘルスケア提供者は、クライアントシステム(230)を用いて、研究室又は病院に設置されている(resident)ことができるインテリジェンスモジュールからレポートを取得及び閲覧することができる。
あらゆる目的でその内容の全体が参照により本明細書中に組み込まれる、米国特許公報第2008/0085524号の図2は、本発明の1つの実施形態による疾病分類システム(disease classification system)(DCS)(200)を表す。そこに示されているように、DCSは、プロセッサ(215)及びメモリモジュール(210)を備えた、DCSインテリジェンスモジュール(205)、例えば、コンピュータなどを含む。インテリジェンスモジュールは、1つ又は2つ以上の直接接続(例えば、USB、Firewire、又は他のインターフェース)及び1つ又は2つ以上のネットワーク接続(例えば、モデム又は他のネットワークインターフェース機器を含む)を通じて情報を送信及び受信するための通信モジュール(図示せず)も含む。メモリモジュールは、内部メモリ装置及び1つ又は2つ以上の外部メモリ装置を含んでいることができる。インテリジェンスモジュールは、ディスプレイモジュール(225)、例えば、モニター又はプリンターなども含んでいる。1つの側面において、インテリジェンスモジュールは、データ、例えば、データ取得モジュール、例えば、検査システム(250)からの患者検査結果など、を直接接続により又はネットワーク(240)を通じて受信する。例えば、検査システムは、1つ又は2つ以上の患者試料(255)についてマルチアナライト(multianalyte)検査を行いそしてその検査結果をインテリジェンスモジュールに自動的に提供するように構成されていることができる。データは、ユーザーによる直接入力を介してインテリジェンスモジュールに提供することもでき、又はポータブル媒体、例えば、コンパクトディスク(CD)又はデジタル多用途ディスク(DVD)からダウンロードすることができる。検査システムは、インテリジェンスモジュールに直結させて、インテリジェンスモジュールと統合させることができ、又はネットワークを通じてインテリジェンスモジュールと遠隔結合させることができる。インテリジェンスモジュールは、周知であるようなネットワークを通じて1つ又は2つ以上のクライアントシステム(230)へ及びそこからデータ通信することもできる。例えば、要求している医師又はヘルスケア提供者は、クライアントシステム(230)を用いて、研究室又は病院に設置されている(resident)ことができるインテリジェンスモジュールからレポートを取得及び閲覧することができる。
ネットワークは、LAN(ローカルエリアネットワーク)、WAN(ワイドエリアネットワーク)、ワイヤレスネットワーク、地点間ネットワーク、スター型ネットワーク、トークンリングネットワーク、ハブネットワーク、又は他の構成であることができる。現在用いられているネットワークの最も一般的な型は、TCP/IP(伝送制御プロトコル及びインターネットプロトコル)ネットワーク、例えば、大文字の「I」を用いて「Internet」としばしば呼ばれるネットワークのグローバルインターネットワークであるので、本明細書中の実施例の多くに用いられるが、本発明で使用することができるネットワークは、現在のところTCP/IPが好ましいプロトコルであるもののこれに限定されないことを理解されたい。
米国特許公報第2008/0085524号の図2に示されたシステムのいくつかの要素は、本明細書において詳細に説明することを必要としない一般的な周知要素を含んでいることができる。例えば、インテリジェンスモジュールは、デスクトップパーソナルコンピュータ、ワークステーション、メインフレーム、ラップトップ等として実装されていることができる。各クライアントシステムは、デスクトップパーソナルコンピュータ、ワークステーション、ラップトップ、PDA、携帯電話、又はあらゆるWAP対応装置、又はInternet若しくは他のネットワーク接続に直接又は間接的にインターフェースすることができる任意の他のコンピューティング装置を含んでいることができる。クライアントシステムは、一般には、HTTPクライアント、例えば、ブラウジングプログラム、例えば、Microsoft社のInternet Explorerブラウザ、Netscape社のNavigatorブラウザ、Opera社のブラウザ、又は携帯電話、PDA若しくは他のワイヤレス装置の場合にはWAP対応ブラウザ等を実行して、クライアントシステムのユーザーがネットワークを通じてインテリジェンスモジュールからユーザーに利用可能な情報及びページにアクセスし、処理し、及び閲覧することができるようにする。それぞれのクライアントシステムは、一般には、インテリジェンスモジュールによって提供されるページ、フォーム、及び他の情報と共にディスプレイ(例えば、モニター画面、LCDディスプレイ等)(235)上のブラウザによって提供されるグラフィカルユーザーインターフェース(GUI)と相互作用するための、1つ又は2つ以上のユーザーインターフェース機器、例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーン、ペン等も含んでいる。上記のように、本発明は、ネットワークのうち特定のグローバルインターネットワークを指す、Internetを用いて使用するのに適している。しかしながら、Internetの代わりに他のネットワーク、例えば、イントラネット、エクストラネット、バーチャル私設ネットワーク(VPN)、非TCP/IPベースネットワーク、任意のLAN又はWAN等を用いることができることを理解されたい。
1つの実施形態によれば、各クライアントシステム及びその構成要素のすべては、中央処理装置、例えば、Intel(商標)Pentium(商標)プロセッサ等を用いて実行されるコンピュータコードを含むアプリケーション、例えば、ブラウザなど、を用いてオペレータ設定可能である。同様に、インテリジェンスモジュール及びその構成要素のすべては、中央処理装置(215)、例えば、Intel Pentiumプロセッサ等、又は複数のプロセッサユニットを用いて実行されるコンピュータコードを含むアプリケーションを用いてオペレータ設定可能であることができる。本明細書中に記載のデータ及び検査結果を処理するべきインテリジェンスモジュールを操作及び設定するためのコンピュータコードは、好ましくは、ダウンロードされそしてハードディスク上に保存されるが、その全プログラムコード又はその一部を、周知であるような任意の他の揮発性又は不揮発性のメモリ媒体又は装置、例えば、ROM又はRAMに保存することもでき、又はプログラムコードを保存することができる任意の他のコンピュータ可読媒体(260)、例えば、コンパクトディスク(CD)媒体、デジタル多用途ディスク(DVD)媒体、フロッピーディスク、ROM、RAM等に備えることもできる。
本発明の種々の側面及び実施形態を実行するためのコンピュータコードは、コンピュータシステムにおいて実行することができる任意のプログラミング言語、、例えば、C、C++、C#、HTML、Java、JavaScriptなど、又は任意の他のスクリプト言語、例えば、VBScriptなど、により実行することができる。さらに、全プログラムコード又はその一部は、Internetを通じて、又は周知であるような任意の通信媒体及びプロトコル(例えば、TCP/IP、HTTP、HTTPS、Ethernet等)を用いて周知であるような任意の他の通常のネットワーク接続(例えば、エクストラネット、VPN,LAN等)を通じて、ソフトウェアソース(例えば、サーバー)から伝送及びダウンロードすることができるキャリアシグナル(carrier signal)として具現化することができる。
1つの実施形態によれば、インテリジェンスモジュールは、患者検査結果及び/又は質問票の回答を分析して患者試料がIBSと関連しているか否かを決定するための疾病分類処理を実行する。データは、インテリジェンスモジュールと結合されたセパレート型の保存又はデータベースシステム又はメモリ(210)内の1つ又は2つ以上のデータテーブル又は他の論理データ構造に保存することができる。一般には、特定の患者についての検査データを含むデータセットに1つ又は2つ以上の統計処理を適用する。例えば、検査データは、患者由来の試料中の少なくとも1種のマーカーの存在又はレベルを示すデータを含む、診断マーカープロファイルを含んでいることができるであろう。検査データは、患者が経験している又は最近経験したIBSに関連する少なくとも1つの症状の存在又は重症度を示すデータを含む、症状プロファイルを含んでいることもできるであろう。1つの側面において、統計処理は、前記診断マーカープロファイル及び/又は症状プロファイルに基づいて患者試料をIBS試料又は非IBS試料と分類する統計的に導き出された決定を生成する。別の側面において、第一の統計処理は、前記診断マーカープロファイル及び/又は症状プロファイルに基づいて患者試料をIBD試料又は非IBD試料と分類する統計的に導き出された第一の決定を生成する。患者試料が非IBD試料と分類された場合、同じ又は異なるデータセットに第二の統計処理を適用して、当該非IBD試料をIBS試料又は非IBS試料と分類する統計的に導き出された第二の決定を生成する。前記第一及び/又は第二の統計的に導き出された決定を、インテリジェンスモジュールと関連づけられた又はそれに結合されたディスプレイ装置上に表示することができ、又は当該決定(単数又は複数)をセパレートシステム、例えば、クライアントシステム(230)に提供してそこに表示することができる。表示された結果は、医師が妥当な診断又は予後診断を行なうことを可能とする。
VIII.IBS様症状を伴う疾病及び疾患
様々な構造的又は代謝的疾病及び疾患は、IBSと類似する徴候又は症状を引き起こすことがある。限定的でない例として、疾病及び疾患、例えば、炎症性腸疾患(IBD)、セリアック病(CD)、急性炎症、憩室炎、回腸嚢−肛門吻合、顕微鏡的大腸炎、慢性感染性下痢、ラクターゼ欠乏症、癌(例えば、結腸直腸癌)、小腸又は結腸の機械的閉塞、腸管感染症、虚血、消化不良、吸収不良、子宮内膜症、及び腸管の未同定の炎症性疾患など、を有する患者は、IBSに類似する軽度から中等度の痛み、及び便の硬さ及び/又は便通頻度における変化と関連する腹部不快感をに示すことがある。追加のIBS様症状として、慢性下痢若しくは慢性便秘若しくは下痢便秘交替症、体重減少、腹部膨満又は鼓張、及び便中の粘液を挙げることができる。
様々な構造的又は代謝的疾病及び疾患は、IBSと類似する徴候又は症状を引き起こすことがある。限定的でない例として、疾病及び疾患、例えば、炎症性腸疾患(IBD)、セリアック病(CD)、急性炎症、憩室炎、回腸嚢−肛門吻合、顕微鏡的大腸炎、慢性感染性下痢、ラクターゼ欠乏症、癌(例えば、結腸直腸癌)、小腸又は結腸の機械的閉塞、腸管感染症、虚血、消化不良、吸収不良、子宮内膜症、及び腸管の未同定の炎症性疾患など、を有する患者は、IBSに類似する軽度から中等度の痛み、及び便の硬さ及び/又は便通頻度における変化と関連する腹部不快感をに示すことがある。追加のIBS様症状として、慢性下痢若しくは慢性便秘若しくは下痢便秘交替症、体重減少、腹部膨満又は鼓張、及び便中の粘液を挙げることができる。
大部分のIBD患者は、2つの明確な臨床サブタイプであるクローン病及び潰瘍性大腸炎のうちの1つに分類することができる。クローン病は、回腸下部に影響を与えそしてしばしば結腸及び腸管の他の領域を含む炎症性疾患である。潰瘍性大腸炎は、主に大腸の粘膜及び粘膜下組織に局在する炎症によって特徴付けられる。IBDのこれらの臨床サブタイプを患う患者は、一般に、IBS様症状、例えば、腹痛、慢性下痢、体重減少、及び痙攣(cramping)などを示す。
セリアック病の臨床症状は、慢性下痢、体重減少及び腹部膨満と関連する腹部不快感などのIBS様症状によって特徴付けられる。セリアック病は、一般に絨毛性萎縮(villous atrophy)、陰窩過形成(crypt hyperplasia)、及び/又は小腸の粘膜内層の炎症に関連する腸粘膜の免疫介在疾患である。セリアック病の個体は、栄養の吸収不良に加えて、無機物欠乏、ビタミン欠乏、骨粗鬆症、自己免疫疾患、及び腸悪性疾患(例えば、リンパ腫及び癌腫)のリスクがある。特定の遺伝的及び環境的な関係において、タンパク質、例えば、グルテン(例えば、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、雑穀、ライ小麦、スペルトムギ及びカムートに存在するグルテニン及びプロラミンタンパク質)などへの暴露がセリアック病の発症の原因であると考えられている。
IBS様症状を示す腸炎によって特徴付けられる他の疾病及び疾患として、例えば、急性炎症、憩室炎、回腸嚢−肛門吻合、顕微鏡的大腸炎、及び慢性感染性下痢、並びに腸管の未同定の炎症性疾患を挙げることができる。急性炎症を発症している患者では、一般には、IBS様症状に加えて、C−反応性タンパク質(CRP)レベルが上昇した。CRPは、炎症過程の急性期の間に肝臓によって産生されそして通常、炎症過程の開始後約24時間で放出される。憩室炎、回腸嚢−肛門吻合、顕微鏡的大腸炎、及び慢性感染性下痢を患う患者では、一般に、IBS様症状に加えて、糞便中のラクトフェリン及び/又はカルプロテクチンのレベルが増加する。ラクトフェリンは、粘膜によって分泌される糖タンパク質であり、白血球の二次顆粒中の主要タンパク質である。白血球は、一般に、炎症部位に補充され、そこで活性化されて、周辺領域に顆粒内容物を放出する。この過程が便中のラクトフェリン濃度を増加させる。
過敏性嚢症候群(irritable pouch syndrome)のような、嚢の他の非炎症状態と比較した場合に、回腸嚢−肛門吻合(すなわち、クローン病の重症のケースでは、結腸の完全な切除後に嚢が形成される)の患者では、増加したラクトフェリンレベルが観察される。ラクトフェリンの増加レベルは、憩室炎患者でも観察され、憩室炎の症状では消化管における突出した嚢(すなわち、憩室)が炎症を起こし、及び/又は感染して、重症度の腹痛、発熱、悪心、及び排便習慣の顕著な変化を引き起こす。顕微鏡的大腸炎は、糞便中の増加したラクトフェリンレベルとも関連する慢性の炎症性疾患である。顕微鏡的大腸炎は、持続性の漿液性下痢(非血性)、通常は体重の減少と関連する腹痛、大腸内視鏡検査及び放射線検査の間の正常な粘膜、及び極めて特有の組織病理学的変化によって特徴付けられる。顕微鏡的大腸炎は、膠原性大腸炎(collagenous colitis)及びリンパ球性大腸炎(lymphocytic colitis)の2つの疾病からなる。膠原性大腸炎は病因不明であり、長期間の漿液性下痢及び正常な大腸内視鏡検査を示す患者に見出される。膠原性大腸炎及びリンパ球性大腸炎は双方とも、結腸内膜における増加したリンパ球によって特徴付けられる。膠原性大腸炎はさらに、結腸の上皮下コラーゲン層の肥厚によって特徴付けられる。慢性感染性下痢は、糞便中の増加したラクトフェリンレベルとも関連する疾病である。慢性感染性下痢は通常、細菌、ウイルス、又は原生動物の感染によって引き起こされ、患者はIBS様症状、例えば、下痢及び腹痛などを示す。増加ラクトフェリンレベルは、IBD患者においても観察される。
CRP及び/又はラクトフェリン及び/又はカルプロテクチンレベルを決定することに加えて、便中の血液、例えば、糞便中のヘモグロビンなどの存在を検出することによって腸炎に関連する疾病及び疾患を除外することもできる。患者の自覚なく起こる腸出血は、潜在出血又は隠れた出血(hidden bleeding)と呼ばれる。潜在出血(例えば、糞便中のヘモグロビン)の存在は、一般に患者由来の便試料中に観察される。他の症状、例えば、潰瘍(例えば、胃、十二指腸)、癌(胃癌、結腸直腸癌)、及び痔疾も、腹痛及び便の硬さ及び/又は排便頻度の変化を含むIBS様症状を示すことがある。
さらに、糞便中のカルプロテクチンのレベルを評価することもできる。カルプロテクチンは、主に好中球及び単球から誘導される抗菌活性を持ったカルシウム結合タンパク質である。カルプロテクチンは、嚢胞性線維症、間接リウマチ、IBD、結腸直腸癌、HIV及び他の炎症性疾患において臨床的関連性を有していることが見出されている。そのレベルは、血清、血漿、口腔、脳脊髄液及び滑液、尿、及び糞便において測定されている。GI疾患における糞便中のカルプロテクチンの利点は、次の通りに認識されている:室温で3〜7日間安定であるので普通郵便による試料発送が可能であり;クローン病患者の糞便中のアルファ1−抗トリプシンと相関しており;そして大多数の消化管癌及びIBD患者において増加する。糞便中のカルプロテクチンは、潰瘍性大腸炎における疾病活性の内視鏡的及び組織学的グレーディング、及びIBDにおける疾病活性の標準であるインジウム111で標識された好中性顆粒球の糞便中への排出とよく相関していることが見出された。
上述したことを考慮すれば、広範囲の疾病及び疾患がIBS様症状を引き起こすことがあり、それによって、試料をIBS試料と明確に分類することに対して実質的な障害が形成されていることは明らかである。しかしながら、本発明は、例えば、統計的アルゴリズムを用いて、個体由来の試料をIBS試料と分類することによって、又は、例えば、統計的アルゴリズムの組み合わせを用いて、IBSと同様な臨床症状を共有するそれらの疾病又は疾患を排除し(すなわち、除外し)及び試料中のIBSを同定する(すなわち、判定する)することによって、この制限を克服する。
IX.治療及び治療モニタリング
個体由来の試料がIBS試料と分類された後は、本発明の方法、システム、及びコードはさらにその個体にIBSと関連する1種又は2種以上の症状を治療するのに有効な薬剤(すなわち、IBS薬)の治療的有効量を投与する工程を含んでいることができる。治療的適用に対して、IBS薬は、単独で投与することができ、又は1種若しくは2種以上の追加のIBS薬及び/又はIBS薬と関連する副作用を軽減する1種若しくは2種以上の薬剤と組み合わせて同時投与することができる。
個体由来の試料がIBS試料と分類された後は、本発明の方法、システム、及びコードはさらにその個体にIBSと関連する1種又は2種以上の症状を治療するのに有効な薬剤(すなわち、IBS薬)の治療的有効量を投与する工程を含んでいることができる。治療的適用に対して、IBS薬は、単独で投与することができ、又は1種若しくは2種以上の追加のIBS薬及び/又はIBS薬と関連する副作用を軽減する1種若しくは2種以上の薬剤と組み合わせて同時投与することができる。
IBS薬は必要に応じて適当な薬剤学的賦形剤と共に投与することができ、そして任意の許容された投与方法によって実施することができる。このように、投与は、例えば、静脈内、局所的、皮下、経皮的(transcutaneous)、経皮性(transdermal)、筋肉内、経口、経頬的(buccal)、舌下、歯肉、口蓋、関節内(intra-joint)、非経口、細動脈内(intra-arteriole)、皮内、心室内(intraventricular)、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸内、腟内、又は吸入によるものであることができる。「同時投与する」とは、第二薬(例えば、別のIBS薬、IBS薬の副作用を軽減するのに有効な薬剤等)の投与と同時に、その直前に、又はその直後にIBS薬を投与することを意味する。
治療的有効量のIBD薬は、繰り返して、例えば、少なくとも2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、又は9回以上にわたり投与することができ、又はその用量を持続点滴によって投与することができる。投与は、固体、半固体、凍結乾燥粉末、又は液体の剤形、例えば、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、水剤、懸濁液、乳濁液、坐剤、停留浣腸、クリーム、軟膏、ローション、ゲル、エアロゾル、フォーム等の形態を、好ましくは、正確な投与量の単一投与に適した単位剤形において、とることができる。
「単位剤形」という用語は、本明細書中で用いる場合、ヒト対象及び他の動物に対する単位投与量として適当な物理的に分離した単位を指し、各単位は望ましい作用発現、忍容性(tolerability)、及び/又は治療効果を生ずるように計算されたIBS薬の所定量を、適当な薬学的賦形剤と共に含む(例えば、アンプル)。さらに、より濃厚な剤形を製造することができ、次にその剤形から希釈された単位剤形を調製することができる。このように、より濃厚な剤形は、IBS薬の量より実質的に多い量、例えば、少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、又はそれを超える倍数の量を含む。
前記のような剤形を製造する方法は、当業者に公知である(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)参照)。剤形は、一般には、通常の薬剤学的担体又は賦形剤を含みそしてさらに他の薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、組織透過促進剤(tissue permeation enhancer)、及び可溶化剤等を含んでいることができる。適切な賦形剤は、当該技術分野で周知の方法によって特定の剤形及び投与経路に適合させることができる(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences参照、前記参照)。
適当な賦形剤の例として、限定的でなく、ラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリアクリル酸、例えば、Carbopol、例えば、Carbopol 941、Carbopol 980、Carbopol 981等を挙げることができる。剤形はさらに、潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油など;湿潤剤;乳化剤;懸濁剤;保存剤、例えば、メチル−、エチル−、及びプロピル−ヒドロキシ−ベンゾエート(すなわち、パラベン);pH調整剤、例えば、無機及び有機の酸及び塩基;甘味料;及び香味料を含んでいることができる。剤形は、生分解性ポリマビーズ、デキストラン、及びシクロデキストリン包接複合体も含んでいることができる。
経口投与に対して、治療的に有効な投与は、錠剤、カプセル剤、乳濁液、懸濁液、水剤、シロップ剤、噴霧剤、ロゼンジ、散剤、及び徐放性製剤の形態であることができる。経口投与に適した賦形剤として、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカン、セルロース、グルコース、ゼラチン、ショ糖、及び炭酸マグネシウム等を挙げることができる。
或る実施形態において、治療的に有効な投与は、丸剤、錠剤、又はカプセル剤の形態をとり、そしてこのように、剤形はIBS薬と共に以下のいずれかを含んでいることができる:希釈剤、例えば、ラクトース、ショ糖、リン酸二カルシウム等;崩壊剤、例えば、デンプン又はその誘導体;潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム等;及び結合剤、例えば、デンプン、アカシアガム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロース及びそれらの誘導体。IBS薬は、坐剤、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)担体中に配置された(disposed)坐剤に製剤化することもできる。
液体剤形は、担体、例えば、生理食塩水(例えば、塩化ナトリウム0.9%w/v)、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等の中にIBS薬及び場合により1種又は2種以上の薬剤学的に許容することのできるアジュバントを溶解又は分散させて、例えば、経口、局所、又は静脈内投与のための、溶液又は懸濁液を形成することにより製造することができる。IBS薬は、停留浣腸に製剤化することもできる。
局所的投与に対して、治療的に有効な投与は、乳濁液、ローション、ゲル、フォーム、クリーム、ゼリー、水剤、懸濁液、軟膏、及び経皮パッチの形態であることができる。吸入による投与に対して、IBS薬は乾燥粉末として又はネブライザーを介する液体の形態で送達することができる。非経口的投与に対して、治療的に有効な投与は、滅菌した注射用溶液及び滅菌包装された散剤の形態であることができる。好ましくは、注射用溶液はpH約4.5〜約7.5で製剤化される。
治療的に有効な投与は、凍結乾燥された形態で提供することもできる。かかる剤形は、投与前の再構成のために、緩衝剤、例えば、炭酸水素塩を含んでいることができ、又は例えば、水による、再構成のために凍結乾燥された剤形中に緩衝剤を含んでいることができる。凍結乾燥された剤形はさらに、適当な血管収縮剤、例えば、エピネフリンを含んでいることができる。凍結乾燥された剤形は、場合により、再構成された剤形を直ちに個体に投与することができるように再構成用の緩衝剤と一緒に包装された、シリンジにより提供することができる。
IBSの処置のための治療用途において、IBS薬は、初回投与量一日当たり約0.001mg/kg〜約1000mg/kgで投与されることができる。一日用量範囲約0.01mg/kg〜約500mg/kg、約0.1mg/kg〜約200mg/kg、約1mg/kg〜約100mg/kg、又は約10mg/kg〜約50mg/kgを用いることができる。しかしながら、投与量は、その個体、IBS症状の重症度、及び用いられるIBS薬の要件に応じて変化させることができる。例えば、本明細書中に記載の方法に従ってIBDに罹患していると分類された個体のIBS症状の重症度を考慮して投与量を経験的に決定することができる。本発明に照らせば、個体に投与される用量は、その個体において経時的に有利な治療応答を与えるのに充分な量であるべきである。投与量の大きさは、個体における特定のIBS薬の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定することもできる。特定の状況に対して適正な用量の決定は、医師の技能の範囲内である。一般に、治療はIBS薬の最適用量より少ない低用量から開始される。その後、状況に応じて最適な効果が達成されるまで用量は少しずつ増やされる。便宜のために、望ましい場合には、一日量全体をその一日間でいくつかの部分に分けて投与することができる。
「IBS薬」という用語は、本明細書中で用いる場合、IBSと関連する1種又は2種以上の症状を治療するのに有効な薬剤学的に許容することのできる任意の形態の薬剤を含む。例えば、IBS薬は、ラセミ又は異性体混合物、又はイオン交換樹脂に結合された固体複合体(solid complex)等であることができる。さらに、IBS薬は溶媒和型であることができる。「IBS薬」という用語はまた、記載されたIBS薬の薬剤学的に許容することのできるあらゆる塩、誘導体、及びアナログはもちろん、それらの組み合わせも含むように意図される。例えば、IBS薬の薬剤学的に許容することのできる塩として、限定的でなく、それらの酒石酸エステル(tartrate)、コハク酸塩、酒石酸塩(tartarate)、酒石酸水素塩(bitartarate)、二塩酸塩、サリチル酸塩、ヘミコハク酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、塩酸塩、カルバミン酸塩、カルバメート、硫酸塩、硝酸塩、及び安息香酸塩型、並びにそれらの組み合わせ等も挙げることができる。任意の形態のIBS薬、例えば、IBS薬の薬剤学的に許容することのできる塩、IBS薬の遊離塩基、又はそれらの混合物が本発明の方法に用いられるのに適している。
IBSと関連する1種又は2種以上の症状を治療するのに有効な適当な薬剤として、限定的でなく、セロトニン作動薬、抗うつ剤、塩化物チャネル活性化剤、塩化物チャネル遮断剤、グアニル酸シクラーゼアゴニスト、抗生物質、オピオイド、ニューロキニンアンタゴニスト、鎮痙薬又は抗コリン作動薬、ベラドンナアルカロイド、バルビツール酸塩、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)アナログ、コルチコトロピン放出因子(CRF)アンタゴニスト、プロバイオティクス、それらの遊離塩基、それらの薬剤学的に許容することのできる塩、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。他のIBS薬として、膨張性薬剤、ドーパミンアンタゴニスト、駆風薬、トランキライザ、デクストフィソパム、フェニトイン、チモロール、及びジルチアゼムを挙げることができる。
セロトニン作動薬は、IBS症状、例えば、便秘、下痢、及び/又は便秘下痢交替症など、の治療に有効である。セロトニン作動薬の限定的でない例はCash et al., Aliment. Pharmacol. Ther., 22:1047-1060 (2005)に記載されており、そしてその例として、5−HT3受容体アゴニスト(例えば、MKC−733等)、5−HT4受容体アゴニスト(例えば、テガセロド(Zelnorm)、プルカロプリド、AG1−001等)、5−HT3受容体アンタゴニスト(例えば、アロセトロン(Lotronex(商標))、シランセトロン、オンダンセトロン、グラニセトロン、ドラセトロン、ラモセトロン、パロノセトロン、E−3620、DDP−225、DDP−733等)、混合型5−HT3受容体アンタゴニスト/5−HT4受容体アゴニスト(例えば、シサプリド、モサプリド、レンザプリド等)、それらの遊離塩基、それらの薬剤学的に許容することのできる塩、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。さらに、ニューロン細胞又はグリア細胞シグナル伝達に影響を及ぼすことによって腸透過性を調節するグルタミン及びグルタミン酸のようなアミノ酸を投与してIBS患者を治療することができる。
抗うつ剤、例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤(SSRI)又は三環系抗うつ剤などは、IBS症状、例えば、腹痛、便秘及び/又は下痢などの治療にとりわけ有効である。SSRI抗うつ剤の限定的でない例として、シタロプラム、フルボキサミン、パロキセチン、フルオキセチン、セルトラリン、それらの遊離塩基、それらの薬剤学的に許容することのできる塩、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。三環系抗うつ剤の例として、限定的でなく、デシプラミン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、アミトリプチリン、クロミプラミン、ドキセピン、イミプラミン、トリミプラミン、マプロチリン、アモキサピン、クロミプラミン、それらの遊離塩基、それらの薬剤学的に許容することのできる塩、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの組み合わせを挙げることができる。
塩化物チャネル活性化剤は、IBS症状、例えば、便秘などの治療に有効である。塩化物チャネル活性化剤の限定的でない例は、ルビプロストン(Amitiza)、その遊離塩基、その薬剤学的に許容することのできる塩、その誘導体、又はそのアナログである。さらに、塩化物チャネル遮断剤、例えば、クロフェレマーは、IBS症状、例えば、下痢などの治療に有効である。グアニル酸シクラーゼアゴニスト、例えば、MD−100などは、IBSと関連する便秘の治療に有効である(例えば、Bryant et al., Gastroenterol., 128:A-257 (2005)参照)。抗生物質、例えば、ネオマイシンも、IBSと関連する便秘の治療に用いるのに適当であることができる(例えば、Park et al., Gastroenterol., 128:A-258 (2005)参照)。リファキシミン(Xifaxan)のような非吸収性の抗生物質は、IBSと関連する小腸内細菌異常増殖及び/又は便秘を治療するのに適している(例えば、Sharara et al., Am. J. Gastroenterol., 101:326-333 (2006)参照)。
オピオイド、例えば、カッパオピオイド(例えば、アシマドリン)は、IBSと関連する痛み及び/又は便秘を治療するのに有効であることができる。ニューロキニン(NK)アンタゴニスト、例えば、タルネタント、サレデュタント、及び他のNK2及び/又はNK3アンタゴニストは、IBS症状、例えば、結腸の筋肉の過敏性(oversensitivity)、便秘、及び/又は下痢などを治療するのに有効であることができる。鎮痙薬又は抗コリン作動薬、例えば、ジシクロミン(dicyclomine)は、IBS症状、例えば、腸及び膀胱の筋痙攣などの治療に有効であることができる。他の鎮痙薬又は抗コリン作動薬、例えば、ベラドンナアルカロイド(例えば、アトロピン、スコポラミン、ヒヨスチアミン等)をバルビツール酸塩、例えば、フェノバルビタールなどと組み合わせて用いてIBSと関連する腸痙攣を低減させることができる。GLP−1アナログ、例えば、GTP−010は、IBS症状、例えば、便秘を治療するのに有効であることができる。CRFアンタゴニスト、例えば、アストレシン(astressin)など及びプロバイオティクス、例えば、VSL#3(商標)は、1種又は2種以上のIBS症状を治療するのに有効であることができる。当業者であれば、IBSと関連する1種又は2種以上の症状を治療するのに適している現在使用されている又は開発中のさらなるIBS薬を承知しているであろう。
個体由来の試料がIBS試料と分類された後は、所定の治療レジメンの効果を評価するために周期的な時間間隔で個体をモニタリングすることもできる。例えば、所定のマーカーのレベルは、処置、例えば、薬剤などの治療効果に基づいて変化する。患者をモニタリングして応答を評価しそして個別化されたアプローチによる所定の薬剤又は処置の効果を理解する。さらに、患者は薬剤に応答しないこともあるが、マーカーは変化していることがあり、このことは、これらの患者がそのマーカーレベルにより同定することができる(応答を示さない)特別な集団に属することを示唆している。これらの患者には、目下の治療を中止し、そして代わりの治療を処方することができる。
X.実施例
A.実施例1
本例は、血液試料採取及び血液試料からのRNA単離を説明する。簡潔に述べると、3人のIBS−D患者、2人のIBS−C患者、及び3人の健常ボランティアから血液試料を採取した。IBS患者は全員がローマIII基準を満たしており、そして健常ボランティアはIBS又は他の活性の合併症の履歴を有していなかった。本例の場合、各被験者から全血約2.4mLを採取した。血液試料を2つのアリコートに分け、そして一方を上記した白血球プロトコル(leukocyte protocol)に従って処理したが、他方をPAXgeneシステム(PreAnalytiX社;スイス・ホムブレヒティコン(Hombrechtikon))により採取しそれに応じて処理した。
A.実施例1
本例は、血液試料採取及び血液試料からのRNA単離を説明する。簡潔に述べると、3人のIBS−D患者、2人のIBS−C患者、及び3人の健常ボランティアから血液試料を採取した。IBS患者は全員がローマIII基準を満たしており、そして健常ボランティアはIBS又は他の活性の合併症の履歴を有していなかった。本例の場合、各被験者から全血約2.4mLを採取した。血液試料を2つのアリコートに分け、そして一方を上記した白血球プロトコル(leukocyte protocol)に従って処理したが、他方をPAXgeneシステム(PreAnalytiX社;スイス・ホムブレヒティコン(Hombrechtikon))により採取しそれに応じて処理した。
2つの技術間の主たる相違は赤血球画分からのRNAの包含(inclusion)であるので、ヘモグロビンmRNAの過多は全血試料と白血球から生じた試料(leukocyte generated sample)との間の発現の差を説明することができるであろう。PAXgene血液採取スキームを用いて健常被験者由来の全血から追加のRNAを単離した。試料中の複数のヘモグロビンmRNA種の分解を、4のドナー試料について、9の共通(common)ヘモグロビン遺伝子に対して特異的に設計されたプライマー及びRNアーゼHを用いて実施した(Feezor RJ et al., Physiol Genomics 19:247-254 (2004))。簡潔に述べると、10mM Tris・HCl、pH7.6、20mM KCl中で全細胞性(total cellular)RNA5μgをオリゴヌクレオチドプライマー10μMと70℃において5分間インキュベートした。試料を4℃まで冷却しそしてSUPERase阻害剤(Ambion社)20Uと共に、RNアーゼH(New England Biolabs社)2Uを添加した。バッファ条件を55mM Tris・HCl、85mM KCl、3mM MgCl2及び10mMジチオスレイトールに調整し、そして試料を37℃で15分間インキュベートした。インキュベーション後直ちに、試料を再び4℃まで冷却しそして0.5M EDTA1μLを添加してRNアーゼH消化を止めた。次いで、RNAクリーンアップのためのRNeasy Mini Protocol(Qiagen社)を、製造業者の仕様書に従い及び任意のDNアーゼ処理を含めて用いて試料を再精製した。
B.実施例2
本例は、抽出されたmRNA試料のオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションを示す。IBD及び対照血清RNA試料の分析のために、Affymetric human Gene 1.0STアレイ(Affymatrix社、カリフォルニア州サンタクララ)を用いた。これらのアレイは、オリゴヌクレオチド−プローブをベースとする〜35,000の転写物を含む遺伝子アレイチップであり、全ヒトゲノムの包括的な適用範囲(comprehensive coverage)を提供する。
本例は、抽出されたmRNA試料のオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションを示す。IBD及び対照血清RNA試料の分析のために、Affymetric human Gene 1.0STアレイ(Affymatrix社、カリフォルニア州サンタクララ)を用いた。これらのアレイは、オリゴヌクレオチド−プローブをベースとする〜35,000の転写物を含む遺伝子アレイチップであり、全ヒトゲノムの包括的な適用範囲(comprehensive coverage)を提供する。
ハイブリダイゼーションに対してRNA試料を調製するために、全(total)RNA8μgを用いてcDNAを合成した。次いで、ファーストストランド合成の間に導入されるT7プロモーター配列を用いてcRNA合成を導き(direct)、製造業者のプロトコル(Affymatrix社、カリフォルニア州サンディエゴ)に従ってビオチニル化デオキシヌクレオチド三リン酸で標識した。断片化後、ビオチニル化されたcRNAを45℃において16時間にわたり遺伝子チップにハイブリダイズさせた。チップを洗浄し、フィコエリテリン(phycoerytherin)−ストレプトアビジンで染色し、そしてGene Chip Scanner 3000を用いてスキャンした。バックグランド補正後、Microarray Suite 5.0ソフトウェア(MAS 5.0、Stratagene社、カリフォルニア州ラホヤ)により予備的なデータ分析を行った。ソフトウェアGene Spring GX10.0(Agilent Technologies社、サンタクララ)のワークフローにおいて推奨されているように主要分析としてPLIERを用いた。
例3
本例は、先の実施例において記載した通りに、実施されたマイクロアレイのデータ分析を記載する。各試料のRNAインテグリティナンバー(RIN)及び各マイクロアレイ試験の性能を品質管理の目的で分析した。その結果を表3に示す。
本例は、先の実施例において記載した通りに、実施されたマイクロアレイのデータ分析を記載する。各試料のRNAインテグリティナンバー(RIN)及び各マイクロアレイ試験の性能を品質管理の目的で分析した。その結果を表3に示す。
各プローブセットの蛍光強度をArray Assist 6.5及びGene Spring GX10.0(Agilent Technologies社、サンタクララ)ソフトウェアにアップロードした。定量的正規化によってデータを正規化した後、さらなる分析のために対数関数に変換して(transferred logarithmically)、IBS患者における特定の遺伝子の変化を決定した。遺伝子発現における変化を比較するために、しきい値(threshold)として50RFU蛍光値を用いることによってデータをさらに正規化し、そして倍率変化(fold changes)を示す統計分析を決定した(p≦0.05)。カットオフとして2log2倍の変化(2 log2 fold change)を用いて同定した上位(top)72のマーカーを表4に示す。
ストリンジェントな統計的検定において定性化された遺伝子を、遺伝子オントロジー及び経路分析に用いた。遺伝子識別子を含む発現データセット及びそれらの対応する発現値を、倍率変化(fold-change)として、タブ区切りテキストファイルとしてインジェヌイティーパスウェイアナリシス(Ingenuity pathway Analysis)(IPA)ソフトウェア(Ingenuity systems社、カリフォルニア州マウンテンビュー)にアップロードした。インジェヌイティーパスウェイデータベースにマッピングされた遺伝子を、分子機能、遺伝子オントロジー及び生物学的プロセスに基づいて分類した。各クラスをそれらのp値に基づいて分類した。焦点を当てた遺伝子(focused gene)として指定された(named)同定された遺伝子もIPAデータベースにおける遺伝子ネットワーク(genetic network)にマッピングしスコアによってランク付けした。計算された確率スコアは、ネットワーク内の遺伝子の集合が偶然のみによって見出される得るものであるか否かを示した。
MAS5アルゴリズム
Affymetrix GeneChipアレイを用いたマイクロアレイ試験からの相対強度を測定する、Microarray Analysis Suite 5.0(MAS 5.0)アルゴリズムがAffymetrix社によって開発された。One−Step Tukey’s Biweight Estimateを用いてシグナルを計算し、相対的に孤立値の影響を受けない(relatively insensitive to outliers)頑健加重平均値(robust weighted mean)を生成する。Tukey’s Biweight法は、標準偏差が平均値に対する変動量を測定するのと全く同様に、データ内の変動量の推定値(estimate)を与える。MAS 5.0は、MMシグナルの強度に基づいたPMシグナルから「ストレイ(stray)シグナル」推定値を減じる。しかしながら、MMシグナルがPMシグナルよりまさっている(outweigh)場合には、調整された値が用いられる。これらの調整は負値(negative value)を消去する。
Affymetrix GeneChipアレイを用いたマイクロアレイ試験からの相対強度を測定する、Microarray Analysis Suite 5.0(MAS 5.0)アルゴリズムがAffymetrix社によって開発された。One−Step Tukey’s Biweight Estimateを用いてシグナルを計算し、相対的に孤立値の影響を受けない(relatively insensitive to outliers)頑健加重平均値(robust weighted mean)を生成する。Tukey’s Biweight法は、標準偏差が平均値に対する変動量を測定するのと全く同様に、データ内の変動量の推定値(estimate)を与える。MAS 5.0は、MMシグナルの強度に基づいたPMシグナルから「ストレイ(stray)シグナル」推定値を減じる。しかしながら、MMシグナルがPMシグナルよりまさっている(outweigh)場合には、調整された値が用いられる。これらの調整は負値(negative value)を消去する。
RMAアルゴリズム
8つのマイクロアレイからのデータを、RMAアルゴリズム(Irizarry,RA et al., Biostatistics, 4, 249-264 (2003))を用いて同様に前処理した。アルゴリズムの出力はlog2尺度で表わされた生の遺伝子発現強度である。すべての試料の強度のプロットを図1に示す。
8つのマイクロアレイからのデータを、RMAアルゴリズム(Irizarry,RA et al., Biostatistics, 4, 249-264 (2003))を用いて同様に前処理した。アルゴリズムの出力はlog2尺度で表わされた生の遺伝子発現強度である。すべての試料の強度のプロットを図1に示す。
ANOVA検定
分散分析(ANOVA)は統計モデル、及び観測された分散(variance)を異なる説明変数により成分に分割するそれらの関連手順、の集合である。ANOVAは通常、2より多い群の平均値(means)を比較するように用いられる。
分散分析(ANOVA)は統計モデル、及び観測された分散(variance)を異なる説明変数により成分に分割するそれらの関連手順、の集合である。ANOVAは通常、2より多い群の平均値(means)を比較するように用いられる。
各プローブセットについて分散分析(ANOVA)を行った。任意の対の群間で差異的に発現される遺伝子(DEG)を検出するように検定を設計する。多重仮説検定(multiple hypothesis tests)において偽陽性率(false discovery rate)(FDR)を制御するようにp値を調整した(Benjamini & Hochberg, 1995)。表4は、種々の生p値及びFDR調整されたp値しきい値における多数のDEGを示す。しきい値p.fdr<0.25を用いると、累積して228の差異的に発現される遺伝子(DEG)が存在する。上位5のDEGの遺伝子発現レベルを図2にプロットする。
多重仮説検定
仮説検定において、帰無仮説が真である場合にそれを棄却して第1種の過誤を犯すこと(committing)の許容することのできる最大確率(maximum probability)が一般に特定される。マイクロアレイ研究において、多くの仮説検定が行われる。多くの仮説が検定され、そして各検定が特定された第1種の過誤確率を有する場合、少なくとも一部の第1種の過誤が犯される確率は、仮説の数に伴って、しばしば急激に、増加する。全体の第1種の過誤を制御するために、統計的検定のp値について調整を加えて全体の偽陽性率すなわちFDRを制御する(Benjamini & Hochberg, 1995)。他の利用することのできる多重仮説補正法として、p値に比較の数を乗じるBonferroni補正、Holm補正(Holm, 1979)、Hochberg補正(Hochberg, 1988)、及びHommel補正(Hommel, 1988)を挙げることができる。
仮説検定において、帰無仮説が真である場合にそれを棄却して第1種の過誤を犯すこと(committing)の許容することのできる最大確率(maximum probability)が一般に特定される。マイクロアレイ研究において、多くの仮説検定が行われる。多くの仮説が検定され、そして各検定が特定された第1種の過誤確率を有する場合、少なくとも一部の第1種の過誤が犯される確率は、仮説の数に伴って、しばしば急激に、増加する。全体の第1種の過誤を制御するために、統計的検定のp値について調整を加えて全体の偽陽性率すなわちFDRを制御する(Benjamini & Hochberg, 1995)。他の利用することのできる多重仮説補正法として、p値に比較の数を乗じるBonferroni補正、Holm補正(Holm, 1979)、Hochberg補正(Hochberg, 1988)、及びHommel補正(Hommel, 1988)を挙げることができる。
階層的クラスタリング分析
階層的クラスタリング分析は、観測された特徴に基づくケースの比較的均一なクラスタを見出すための統計的手法である。この方法は、各ケースを別個のクラスタにして開始(starts with each case in a separate cluster)した後、クラスタ同士を順々に一緒にして、ただ1つのクラスタが残されるまで各工程においてクラスタ数を減らしていく。N個のケースがある場合に、この方法はN−1のクラスタリング工程、すなわち、融合(fusion)を含む。マイクロアレイ分析においては、2次元の階層的クラスタリング結果によるヒートマップをしばしば用いて、遺伝子発現プロファイルに基づく試料及び遺伝子クラスタリング構造が示される。
階層的クラスタリング分析は、観測された特徴に基づくケースの比較的均一なクラスタを見出すための統計的手法である。この方法は、各ケースを別個のクラスタにして開始(starts with each case in a separate cluster)した後、クラスタ同士を順々に一緒にして、ただ1つのクラスタが残されるまで各工程においてクラスタ数を減らしていく。N個のケースがある場合に、この方法はN−1のクラスタリング工程、すなわち、融合(fusion)を含む。マイクロアレイ分析においては、2次元の階層的クラスタリング結果によるヒートマップをしばしば用いて、遺伝子発現プロファイルに基づく試料及び遺伝子クラスタリング構造が示される。
階層的クラスタリング分析を実行して、DEGの遺伝子発現プロファイルがIBS試料と対照試料とを別個のクラスに分離することができるか否かを調査した。この分析には、すべてがアンマスクされたプローブセットを用いた。図3はクラスタリング結果を示し、そして図4は表4に示した選択された72遺伝子サブセットを含む遺伝子のセット(a set of genes the include the selected 72-gene subset)の差異的な発現を示すヒートマップを提供する。IBS−C群(グループ1;HG1及び2)、IBS−D群(グループ2;HG3、4、及び5)、及び対照群(グループ3;HG6、7、及び8)は、DGEの遺伝子発現プロファイルによって完全に分離されており、ヒートマップの上部のカラーパネルによって示される。
多次元尺度構成法
多次元尺度構成法(MDS)は、データ内の類似性又は非類似性を調査するための情報の可視化にしばしば用いられる関連する統計的手法のセットである。MDSはオーディネーション(ordination)の特別のケースである。MDSアルゴリズムは項目(item)−項目の類似性のマトリックスから開始した後、2D又は3D可視化に適した低次元空間に各項目の位置を割り当てる。すべてがアンマスクされたプローブセットの遺伝子発現プロファイルに基づく試料間の分離のプロットを図5に示す。
多次元尺度構成法(MDS)は、データ内の類似性又は非類似性を調査するための情報の可視化にしばしば用いられる関連する統計的手法のセットである。MDSはオーディネーション(ordination)の特別のケースである。MDSアルゴリズムは項目(item)−項目の類似性のマトリックスから開始した後、2D又は3D可視化に適した低次元空間に各項目の位置を割り当てる。すべてがアンマスクされたプローブセットの遺伝子発現プロファイルに基づく試料間の分離のプロットを図5に示す。
主成分分析
主成分分析(PCA)は、多くの(おそらく(possibly))相関する変数を主成分と呼ばれる(より少ない)数の無相関な変数に変換する数理処理を含む。第一主成分はデータ内の変動性(variability)をできるだけ多く説明し、そして続く各成分は残りの変動性をできるだけ多く説明する。図6Aは、上位の各主成分によって説明することができる変動(variation)を示す。図6Bは、上位2つの主成分による試料の分離を示す。
主成分分析(PCA)は、多くの(おそらく(possibly))相関する変数を主成分と呼ばれる(より少ない)数の無相関な変数に変換する数理処理を含む。第一主成分はデータ内の変動性(variability)をできるだけ多く説明し、そして続く各成分は残りの変動性をできるだけ多く説明する。図6Aは、上位の各主成分によって説明することができる変動(variation)を示す。図6Bは、上位2つの主成分による試料の分離を示す。
t検定
t検定は2つの群の平均値が相互に統計的に異なるか否かを評価する。この分析は2つの群の平均値の比較を考慮する。ペアワイズ(pair-wise)t検定を、各対の群間で実施した。各比較においてアレイ上の各プローブセットについて、倍率変化、p値及びFDR調整されたp値(Benjamini & Hochberg, 1995)を計算した。差異的に発現される遺伝子(DEG)を、FDR調整されたp値<0.25及び2log2倍率変化>2を有する遺伝子と定義した。例えば、表4は、グループ2とグループ3との間で倍率変化によって順序付けられた72のDEGを示している。
t検定は2つの群の平均値が相互に統計的に異なるか否かを評価する。この分析は2つの群の平均値の比較を考慮する。ペアワイズ(pair-wise)t検定を、各対の群間で実施した。各比較においてアレイ上の各プローブセットについて、倍率変化、p値及びFDR調整されたp値(Benjamini & Hochberg, 1995)を計算した。差異的に発現される遺伝子(DEG)を、FDR調整されたp値<0.25及び2log2倍率変化>2を有する遺伝子と定義した。例えば、表4は、グループ2とグループ3との間で倍率変化によって順序付けられた72のDEGを示している。
ボルケーノプロット(volcano plot)
ボルケーノプロットは生物学的及び統計的有意性の次元に沿って遺伝子を配列する。第一の(水平の)次元は2つの群間の倍率変化(アップレギュレーション及びダウンレギュレーションが対称的に現れるように、対数尺度で)であり、そして第二の(垂直の)軸は試料間の差のt検定に対するp値(より小さいp値がより高く現れる(appear higher up)ように、最も簡便に負の対数(negative log)尺度で)を表す。第一の軸は変化の生物学的影響(biological impact)を示し;第二は変化の統計上の証拠、又は信頼性を示す。
ボルケーノプロットは生物学的及び統計的有意性の次元に沿って遺伝子を配列する。第一の(水平の)次元は2つの群間の倍率変化(アップレギュレーション及びダウンレギュレーションが対称的に現れるように、対数尺度で)であり、そして第二の(垂直の)軸は試料間の差のt検定に対するp値(より小さいp値がより高く現れる(appear higher up)ように、最も簡便に負の対数(negative log)尺度で)を表す。第一の軸は変化の生物学的影響(biological impact)を示し;第二は変化の統計上の証拠、又は信頼性を示す。
ボルケーノプロットは生物学的有意性(倍率変化)と統計的有意性(p値)との間の関係を示す。図7A〜Cは各対((A)IBS−C群対IBS−D群、(B)IBS−C群対対照群、及び(C)IBS−D群対対照群)の群間の比較のボルケーノプロットを示す。生のp値をY軸上にプロットするが、DEGはしきい値であるFDR調整されたp値<0.25及び倍率変化>2によって決定され、それらの境界は図7Cにおいて点線で示される。DEGは赤色で強調されている。
フィッシャーの直接確率検定(Fisher exact test)
フィッシャーの直接確率検定は、2つのカテゴリー変数の間に非ランダムな関連(nonrandom association)が存在するか否かを決定するために用いられる統計的検定である。フィッシャーの直接確率検定は、第一の変数が第二の変数にどの程度の影響を与えるか又はその逆はどうかを示す分割表を調べる。その帰無仮説はその2つが独立しているということである。
フィッシャーの直接確率検定は、2つのカテゴリー変数の間に非ランダムな関連(nonrandom association)が存在するか否かを決定するために用いられる統計的検定である。フィッシャーの直接確率検定は、第一の変数が第二の変数にどの程度の影響を与えるか又はその逆はどうかを示す分割表を調べる。その帰無仮説はその2つが独立しているということである。
C.実施例3
マイクロアレイ試験によって同定されたIBSマーカーの有用性を検証するために、5つの同定された遺伝子のmRNA発現レベルを、定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)分析を用いて妥当性確認した。簡潔に述べると、PCR RNAコアキット(Applied Biosystems社、マサチューセッツ州ベッドフォード)によって、12人のIBS−M被験者、22人のIBS−C被験者、12人のIBS−D被験者、及び21人の対照被験者由来のRNA試料からcDNAを合成した。遺伝子特異的なPCRプライマーを用いた、サイバーグリーン(SYBER Green)によるリアルタイム定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)を実施してマイクロアレイデータを検証した。Log2倍率変化>2及びFDR調整されたp値<0.25を有する5つの遺伝子(FOXD3、PI4K2A、ACSS2、ASIP、及びOR2L8)を選択しそして各遺伝子を増幅するために用いられるプライマーを生成した。試料を3連で実行し、そしてABI 7700サーモサイクラー(thermocycler)(Applied Biosystems社、マサチューセッツ州ベッドフォード)によってPCRを実施した。qRT−PCR分析の結果を図8に示す。
マイクロアレイ試験によって同定されたIBSマーカーの有用性を検証するために、5つの同定された遺伝子のmRNA発現レベルを、定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)分析を用いて妥当性確認した。簡潔に述べると、PCR RNAコアキット(Applied Biosystems社、マサチューセッツ州ベッドフォード)によって、12人のIBS−M被験者、22人のIBS−C被験者、12人のIBS−D被験者、及び21人の対照被験者由来のRNA試料からcDNAを合成した。遺伝子特異的なPCRプライマーを用いた、サイバーグリーン(SYBER Green)によるリアルタイム定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)を実施してマイクロアレイデータを検証した。Log2倍率変化>2及びFDR調整されたp値<0.25を有する5つの遺伝子(FOXD3、PI4K2A、ACSS2、ASIP、及びOR2L8)を選択しそして各遺伝子を増幅するために用いられるプライマーを生成した。試料を3連で実行し、そしてABI 7700サーモサイクラー(thermocycler)(Applied Biosystems社、マサチューセッツ州ベッドフォード)によってPCRを実施した。qRT−PCR分析の結果を図8に示す。
D.実施例4
上記同定された新規な遺伝子発現IBSマーカーの有用性をさらに妥当性確認するために、Log2倍率変化によって決定された、上位72の発見フェーズ(discovery phase)遺伝子の中の14の発現レベルを、独立に確認され、連続的に登録された、98のIBS患者の前向きコホートの臨床研究において検定した。患者はそれぞれ認定された(board-certified)消化器専門医によって診断された;IBSは生検によって確認されそしてIBSはローマIII基準を満たしていた。すべてのプロトコルはIRBに承認された;インフォームドコンセントを得ており、末梢血試料及び臨床データをすべての患者から集めた。末梢全血試料から、全mRNAを単離し、cDNAを合成し、そしてリアルタイム定量的PCRを実施することによって発現データを得た。各患者の検体について候補バイオマーカー遺伝子の発現レベルをアッセイし、患者内(within-patient)リファレンス遺伝子に対して正規化した。選択されたバイオマーカーの発現レベルを図9A〜Cに示す。
上記同定された新規な遺伝子発現IBSマーカーの有用性をさらに妥当性確認するために、Log2倍率変化によって決定された、上位72の発見フェーズ(discovery phase)遺伝子の中の14の発現レベルを、独立に確認され、連続的に登録された、98のIBS患者の前向きコホートの臨床研究において検定した。患者はそれぞれ認定された(board-certified)消化器専門医によって診断された;IBSは生検によって確認されそしてIBSはローマIII基準を満たしていた。すべてのプロトコルはIRBに承認された;インフォームドコンセントを得ており、末梢血試料及び臨床データをすべての患者から集めた。末梢全血試料から、全mRNAを単離し、cDNAを合成し、そしてリアルタイム定量的PCRを実施することによって発現データを得た。各患者の検体について候補バイオマーカー遺伝子の発現レベルをアッセイし、患者内(within-patient)リファレンス遺伝子に対して正規化した。選択されたバイオマーカーの発現レベルを図9A〜Cに示す。
PCR RNAコアキット(Applied Biosystems社、マサチューセッツ州ベッドフォード)によってRNA試料からcDNAを合成した。遺伝子特異的なPCRプライマーを用いた、サイバーグリーンによるリアルタイム定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)を実施してマイクロアレイデータを検証した。試料を3連で実行し、そしてABI 7700サーモサイクラー(Applied Biosystems社、マサチューセッツ州ベッドフォード)によってPCRを実施した。ハウスキーピング遺伝子β−アクチンの発現を、geNorm法に従って、正規化に対して決定した。直線回帰分析を実施しそして変動係数を計算してこれらの選択された遺伝子のRT−PCRの結果と遺伝子アレイの結果との間の相関を評価した。候補遺伝子の発現のLog2倍率変化及びp値を表5に示す。
E.実施例5
IBSを最も予測する遺伝子発現パターンをさらに決定するために、分散分析(ANOVA)を用いることによって実施例2で得られた生の遺伝子発現データを分析して、3つの群すべてにおけるハイブリダイゼーションシグナルの平均値を比較した。t検定を用いてIBS−D群及び健常ボランティア群を比較した。この2つの群において統計的に異なる遺伝子を評価した。使用した分析ソフトウェアはAffymetrix Command Console、Affymetrix Expression Console、及びRである。
IBSを最も予測する遺伝子発現パターンをさらに決定するために、分散分析(ANOVA)を用いることによって実施例2で得られた生の遺伝子発現データを分析して、3つの群すべてにおけるハイブリダイゼーションシグナルの平均値を比較した。t検定を用いてIBS−D群及び健常ボランティア群を比較した。この2つの群において統計的に異なる遺伝子を評価した。使用した分析ソフトウェアはAffymetrix Command Console、Affymetrix Expression Console、及びRである。
ネットワーク、遺伝子オントロジー及びカノニカル経路分析
ストリンジェントな統計的検定において定性化された遺伝子を、遺伝子オントロジー及び経路分析に用いた。遺伝子識別子及びそれらの対応する発現値を含む発現データセットを、倍率変化として、タブ区切りテキストファイルとしてインジェヌイティーパスウェイアナリシス(IPA)ソフトウェア(Ingenuity systems社、カリフォルニア州マウンテンビュー)にアップロードした。インジェヌイティーパスウェイデータベースにマッピングされた遺伝子を、分子機能、遺伝子オントロジー及び生物学的プロセスに基づいて分類した。各クラスをそれらのp値に基づいて分類した。焦点を当てた遺伝子として指定された同定された遺伝子もIPAデータベースにおける遺伝子ネットワークにマッピングしてスコアによってランク付けした。計算された確率スコアは、ネットワーク内の遺伝子の集合が偶然のみによって見出される得るものであるか否かを示した。
ストリンジェントな統計的検定において定性化された遺伝子を、遺伝子オントロジー及び経路分析に用いた。遺伝子識別子及びそれらの対応する発現値を含む発現データセットを、倍率変化として、タブ区切りテキストファイルとしてインジェヌイティーパスウェイアナリシス(IPA)ソフトウェア(Ingenuity systems社、カリフォルニア州マウンテンビュー)にアップロードした。インジェヌイティーパスウェイデータベースにマッピングされた遺伝子を、分子機能、遺伝子オントロジー及び生物学的プロセスに基づいて分類した。各クラスをそれらのp値に基づいて分類した。焦点を当てた遺伝子として指定された同定された遺伝子もIPAデータベースにおける遺伝子ネットワークにマッピングしてスコアによってランク付けした。計算された確率スコアは、ネットワーク内の遺伝子の集合が偶然のみによって見出される得るものであるか否かを示した。
定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)によるmRNA発現アッセイ
66の選択された遺伝子をさらにqRT−PCRによって妥当性確認した。PCR RNAコアキット(Applied Biosystems社、マサチューセッツ州ベッドフォード)によってRNA試料からcDNAを合成した。遺伝子特異的なPCRプライマーを用いた、サイバーグリーンによるリアルタイム定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)を実施してマイクロアレイデータを検証した。11の遺伝子を無作為に選択したが、各遺伝子を増幅するために用いたプライマーをAdditional File−1にリストする。試料を3連で実行し、そしてABI 7700サーモサイクラー(Applied Biosystems社、マサチューセッツ州ベッドフォード)によってPCRを実施した。複数のハウスキーピング遺伝子(GNB、β−アクチン、GAPDH及びチューブリン)を、geNorm法に従って、正規化に対して同時に決定した。直線回帰分析を実施しそして変動係数を計算してこれらの11の無作為に選択された遺伝子のRT−PCRの結果と遺伝子アレイの結果との間の相関を評価した。
66の選択された遺伝子をさらにqRT−PCRによって妥当性確認した。PCR RNAコアキット(Applied Biosystems社、マサチューセッツ州ベッドフォード)によってRNA試料からcDNAを合成した。遺伝子特異的なPCRプライマーを用いた、サイバーグリーンによるリアルタイム定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)を実施してマイクロアレイデータを検証した。11の遺伝子を無作為に選択したが、各遺伝子を増幅するために用いたプライマーをAdditional File−1にリストする。試料を3連で実行し、そしてABI 7700サーモサイクラー(Applied Biosystems社、マサチューセッツ州ベッドフォード)によってPCRを実施した。複数のハウスキーピング遺伝子(GNB、β−アクチン、GAPDH及びチューブリン)を、geNorm法に従って、正規化に対して同時に決定した。直線回帰分析を実施しそして変動係数を計算してこれらの11の無作為に選択された遺伝子のRT−PCRの結果と遺伝子アレイの結果との間の相関を評価した。
Affymetrixチップ研究からの差異的に発現される遺伝子の同定
簡潔に述べると、分散分析(ANOVA)を各プローブセットについて実施した。任意の対の群間で差異的に発現される遺伝子を検出するように検定を設計した。多重仮説検定において偽陽性率(FDR)を制御するようにp値を調整した(Benjamini & Hochberg, 1995)。しきい値p.fdr<0.25を用いて、累積して228の差異的に発現される遺伝子(DEG)を同定した。次いで、階層的クラスタリング分析を実施して、DEGの遺伝子発現プロファイルが試料を明確なクラスに分離することができるか否かを調査した。この分析には、すべてアンマスクされたプローブセットを用いた。図4はクラスタリング結果を示す。3つの群は、DGEの遺伝子発現プロファイルによって完全に分離され、ヒートマップの上部のカラーパネルによって示される(図4)。多次元尺度構成プロットを用い、すべてがアンマスクされたプローブセットの遺伝子発現プロファイルに基づいて、試料間の分離をさらに可視化した(図5)。
簡潔に述べると、分散分析(ANOVA)を各プローブセットについて実施した。任意の対の群間で差異的に発現される遺伝子を検出するように検定を設計した。多重仮説検定において偽陽性率(FDR)を制御するようにp値を調整した(Benjamini & Hochberg, 1995)。しきい値p.fdr<0.25を用いて、累積して228の差異的に発現される遺伝子(DEG)を同定した。次いで、階層的クラスタリング分析を実施して、DEGの遺伝子発現プロファイルが試料を明確なクラスに分離することができるか否かを調査した。この分析には、すべてアンマスクされたプローブセットを用いた。図4はクラスタリング結果を示す。3つの群は、DGEの遺伝子発現プロファイルによって完全に分離され、ヒートマップの上部のカラーパネルによって示される(図4)。多次元尺度構成プロットを用い、すべてがアンマスクされたプローブセットの遺伝子発現プロファイルに基づいて、試料間の分離をさらに可視化した(図5)。
差異的に発現される遺伝子を選択するために、ペアワイズt検定を、各対の群間で実施した。各比較においてアレイ上の各プローブセットについて、倍率変化、p値及びFDR調整されたp値(Benjamini & Hochberg, 1995)を計算した。差異的に発現される遺伝子(DEG)を、FDR調整されたp値<0.25及び倍率変化>2を有する遺伝子と定義した。例えば、表6はIBS−Dと健常ボランティアとの間で倍率変化によって順序付けられた40のDEGを示している。各対の群間のt検定DEGの完全なリスト(complete list of t-test DEGs)が導かれる(conducted)。IBS−Cサブグループ及びIBS−Dサブグループの双方に対して用いることができる遺伝子を同定するために、倍率変化及びp値に基づいて双方の群においてアップレギュレートされる選択された26遺伝子をさらに選択した(表7)。
選択された差異的に発現される遺伝子(DEG)のリアルタイム定量的PCR妥当性確認。マイクロアレイデータ分析から同定された66の選択された遺伝子を、Applied Biosystems社から購入したプローブを用いてq−PCRによってさらに妥当性確認した(表8)。27人の健常ボランティア、19人のIBS−C患者、22人のIBS−D患者、及び17人のIBS−M患者由来のPaxgene血液試料中のβ−アクチンを用いて各遺伝子の発現を標準化する(standardizing)ことによって、選択された遺伝子の相対的発現(relative expression)を測定した。66の選択された遺伝子の中で、16の遺伝子はRTq−PCRによって検出できなかった。残る50の遺伝子における相対的発現量は、個々のIBS患者の倍率変化レベルに関するマイクロアレイの結果を充分に確認した。これらのq−PCR反応の36についてのデータを図10に示す。さらに、qRT−PCRデータを5つの標的された遺伝子(SERT、TPH1、MAO−A、TLR2、及びTLR4)についても得たが、これらの遺伝子はIBS−C患者、IBS−D患者、及びIBS−M患者で差異的に発現されなかった(図11)。
F.実施例6
末梢血における発現のパターンを用いたIBS及び正常状態の分類
次に、実施例5において見出された結果を適用して、末梢血における発現パターンを用いてIBS対正常状態を分類する最小の遺伝子セットの能力を決定した。すべてのデータ分析は、Rバーション2.7.2を用いて実施した。生データをlog変換してガウス分布により近似した分布を達成した。0値を、各遺伝子に対した検出された値の最小値の50%に置き換えた。値が欠けているために1つの試料(#3)を除去した後、62掛ける28のデータマトリックスを形成した。IBS患者試料をラベル「1」として一緒に結合し、そして健常ボランティアには「0」のラベルをした。各遺伝子について疾病ステージと健常ステージとの間で標準t検定を実施し、平均値間の差及びp値を表7にリストする。組み合わせた基準であるp値<0.01及びabs(差.平均値(difference.mean))>0.5を基準にして遺伝子を選択した。試験され健常ステージから疾病ステージを予測するモデルを築いた4つの異なる機械学習アルゴリズムを用いたRにより予測を実施した(Prediction was performed in R using 4 different machine learning algorithms were tested to build a model to predict disease stage from healthy stage)。表9は、異なるモデルを設けた場合のIBSの予測の正確度を示す。
末梢血における発現のパターンを用いたIBS及び正常状態の分類
次に、実施例5において見出された結果を適用して、末梢血における発現パターンを用いてIBS対正常状態を分類する最小の遺伝子セットの能力を決定した。すべてのデータ分析は、Rバーション2.7.2を用いて実施した。生データをlog変換してガウス分布により近似した分布を達成した。0値を、各遺伝子に対した検出された値の最小値の50%に置き換えた。値が欠けているために1つの試料(#3)を除去した後、62掛ける28のデータマトリックスを形成した。IBS患者試料をラベル「1」として一緒に結合し、そして健常ボランティアには「0」のラベルをした。各遺伝子について疾病ステージと健常ステージとの間で標準t検定を実施し、平均値間の差及びp値を表7にリストする。組み合わせた基準であるp値<0.01及びabs(差.平均値(difference.mean))>0.5を基準にして遺伝子を選択した。試験され健常ステージから疾病ステージを予測するモデルを築いた4つの異なる機械学習アルゴリズムを用いたRにより予測を実施した(Prediction was performed in R using 4 different machine learning algorithms were tested to build a model to predict disease stage from healthy stage)。表9は、異なるモデルを設けた場合のIBSの予測の正確度を示す。
収縮重心(PAM)モデル
Rにおいて「pamr」パッケージにより実装された収縮重心アルゴリズムに基づいて収縮重心(PAM)モデルを構築した。このモデルは24遺伝子で構成されておりリーブ・ワン・アウト(leave-one-out)正確度は79%であった。
Rにおいて「pamr」パッケージにより実装された収縮重心アルゴリズムに基づいて収縮重心(PAM)モデルを構築した。このモデルは24遺伝子で構成されておりリーブ・ワン・アウト(leave-one-out)正確度は79%であった。
ランダムフォレストモデル
本発明者らが用いた第二の予測モデルは、Rにおいて「ランダムフォレスト(randomForest)」パッケージにより実装されたランダムフォレストアルゴリズムに基づくものであった。第一のモデルは全遺伝子セットに基づいており第二のモデルはt検定から選択された7遺伝子に基づいていた。2つのモデルのリーブ・ワン・アウト正確度はそれぞれ80%及び82%である。
本発明者らが用いた第二の予測モデルは、Rにおいて「ランダムフォレスト(randomForest)」パッケージにより実装されたランダムフォレストアルゴリズムに基づくものであった。第一のモデルは全遺伝子セットに基づいており第二のモデルはt検定から選択された7遺伝子に基づいていた。2つのモデルのリーブ・ワン・アウト正確度はそれぞれ80%及び82%である。
サポートベクターマシンモデル:
Rにおいて「svm」パッケージにより実装されたサポートベクターマシンアルゴリズムに基づいて2つのモデルを構築した。第一のモデルは全遺伝子セットに基づいており第二のモデルはt検定から選択された7遺伝子に基づいていた。2つのモデルのリーブ・ワン・アウト正確度はそれぞれ74%及び82%である。
Rにおいて「svm」パッケージにより実装されたサポートベクターマシンアルゴリズムに基づいて2つのモデルを構築した。第一のモデルは全遺伝子セットに基づいており第二のモデルはt検定から選択された7遺伝子に基づいていた。2つのモデルのリーブ・ワン・アウト正確度はそれぞれ74%及び82%である。
ニューラルネットワークモデル:
Rにおいて「nnet」パッケージにより実装されたニューラルネットワークアルゴリズムに基づいて2つのモデルを構築した。第一のモデルは全遺伝子セットに基づいており第二のモデルはt検定から選択された7遺伝子に基づいていた。2つのモデルのリーブ・ワン・アウト正確度はそれぞれ71%及び77%である。
Rにおいて「nnet」パッケージにより実装されたニューラルネットワークアルゴリズムに基づいて2つのモデルを構築した。第一のモデルは全遺伝子セットに基づいており第二のモデルはt検定から選択された7遺伝子に基づいていた。2つのモデルのリーブ・ワン・アウト正確度はそれぞれ71%及び77%である。
表10に示すように、実施例5において同定された66DEGの遺伝子オントロジー分析は、リボソーム、タンパク質生合成、RNA結合、細胞内(intracellular)、シグナル伝達、及びタンパク質結合オントロジーを含む、6遺伝子オントロジーがIBS−Dと健常ボランティアとの間のDEGと有意に関連していることを示す。IBSの診断及び予後診断に対してとりわけ有効な7遺伝子の生物学的機能の概略を表11に示す。
前述の発明は、明確に理解されることを目的として説明及び実施例によって多少とも詳細に記載してきたが、当業者であれば、特許請求の範囲に記載した発明の範囲内において所定の変化及び修正を行うことができるということは理解されよう。さらに、本明細書中に引用された各参考文献は、それら参考文献のそれぞれが参照により個々に引用されたと同程度にそれらの全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
Claims (63)
- 過敏性腸症候群(IBS)の診断を必要とする被験者においてIBSを診断する方法であって、以下の工程:
(a)被験者から採取された生物学的試料からRNAを単離及び/又は増幅する工程と;(b)検出試薬を該検出試薬とIBSのRNAバイオマーカーとを含む複合体に変換するのに適した条件下に、前記単離及び/又は増幅されたRNAを前記検出試薬と接触させる工程と;
(c)前記複合体のレベルを検出する工程と;及び
(d)前記複合体のレベルがIBSと関連する第一の参照レベル又はIBSの非存在と関連する第二の参照レベルとより密接に類似しているか否かを決定し、それによって被験者におけるIBSを診断する工程と、
を含み、前記バイオマーカーが表4に見出される遺伝子からなる群から選択される遺伝子、例えば、CCDC147など、由来のRNAである、前記方法。 - 前記方法が表4に見出されるIBSバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも2種のIBSバイオマーカー、例えば、CCDC147及びVIPR1など、のレベルを検出する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記方法が表4に見出されるIBSマーカーからなる群から選択される少なくとも5種のIBSバイオマーカーのレベルを検出する工程を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記バイオマーカーがCCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、及びGNG3である、請求項3に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが表1に見出されるバイオマーカーから選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオマーカーがCCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A、及びFOXD3からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記バイオマーカーがCCDC147である、請求項6に記載の方法。
- 前記バイオマーカーがVIPR1である、請求項6に記載の方法。
- 前記バイオマーカーがLPAR5である、請求項6に記載の方法。
- 前記バイオマーカーがCCDC144Aである、請求項6に記載の方法。
- 前記バイオマーカーがGNG3である、請求項6に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが配列番号:1〜75及び154〜162のいずれか1つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするmRNA分子である、請求項1に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが配列番号:76〜162のいずれか1つの核酸配列を含むRNA分子である、請求項1に記載の方法。
- 前記検出試薬がオリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複合体のレベルを検出する工程がオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記方法がマイクロアレイ又はビーズをベースとするハイブリダイゼーションを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記複合体のレベルを検出する工程が核酸増幅を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記方法がqPCR又は質量分析を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記複合体のレベルを検出する工程が複数のバイオマーカーのレベルを定量化し、それによってバイオマーカープロファイルを決定する工程を含む、請求項2又は3に記載の方法。
- 前記複合体のレベルが第一又は第二の参照レベルとより密接に類似しているか否かを決定する工程が、アルゴリズムを用いて前記バイオマーカープロファイルがIBSと関連する第一の参照レベル又はIBSの非存在と関連する第二の参照レベルとより密接に類似しているか否かを決定する工程を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記アルゴリズムが学習統計的分類子システムを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記学習統計的分類子システムがランダムフォレスト、分類及び回帰木、ブースト型の木、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシーン、一般的なカイ二乗による相互作用の自動検出モデル、相互作用型の木、多変量適応回帰スプライン、機械学習分類子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
- 前記統計的アルゴリズムが単一の学習統計的分類子システムを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記統計的アルゴリズムが少なくとも2つの学習統計的分類子システムの組み合わせを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記生物学的試料が血清、血漿、全血、又は便からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記方法がさらに、サイトカイン、成長因子、抗好中球抗体、抗サッカロミセス・セレビシエ抗体(ASCA)、抗菌抗体、肥満細胞マーカー、ストレスマーカー、胃腸ホルモン、セロトニン代謝産物、セロトニン経路マーカー、炭水化物欠乏トランスフェリン(CDT)、ラクトフェリン、抗組織トランスグルタミナーゼ(tTG)抗体、リポカリン、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、リポカリンとMMPとの複合体、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤(TIMP)、グロブリン(例えば、アルファ−グロブリン)、アクチン切断タンパク質、S100タンパク質、フィブリノペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)、タキキニン、グレリン、ニューロテンシン、コルチコトロピン放出ホルモン(CRH)、エラスターゼ、C−反応性タンパク質(CRP)、ラクトフェリン、抗ラクトフェリン抗体、カルプロテクチン、ヘモグロビン、NOD2/CARD15、セロトニン再取り込み輸送体(SERT)、トリプトファンヒドロキシラーゼ−1、5−ヒドロキシトリプタミン(5−HT)、ラクツロース、セリンプロテアーゼ、プロスタグランジン、ヒスタミン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるバイオマーカーの検出を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記サイトカインが、IL−8、IL−1β、TNF関連アポトーシス弱誘導因子(TWEAK)、レプチン、オステオプロテジェリン(OPG)、MIP−3β、GROα、CXCL4/PF−4、CXCL7/NAP−2、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記成長因子が、上皮成長因子(EGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、色素上皮由来因子(PEDF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、アンフィレグリン(SDGF)、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記抗好中球抗体が、抗好中球細胞質抗体(ANCA)、核周囲抗好中球細胞質抗体(pANCA)、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記ASCAが、ASCA−IgA、ASCA−IgG、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記抗菌抗体が、抗外膜タンパク質C(抗OmpC)抗体、抗フラジェリン抗体、抗I2抗体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記リポカリンが、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)、NGAL/MMP−9複合体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記MMPがMMP−9である、請求項26に記載の方法。
- 前記TIMPがTIMP−1である、請求項26に記載の方法。
- 前記アルファ−グロブリンが、アルファ−2−マクログロブリン、ハプトグロビン、オロソムコイド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記アクチン切断タンパク質がゲルソリンである、請求項26に記載の方法。
- 前記S100タンパク質がカルグラニュリンである、請求項26に記載の方法。
- 前記フィブリノペプチドがフィブリノペプチドA(FIBA)である、請求項26に記載の方法。
- 前記方法がさらに、症状プロファイルを決定する工程であって、前記症状プロファイルが前記個体における少なくとも1種の症状の存在又は重症度を同定することによって決定される工程と;及び前記診断マーカー及び前記症状プロファイルに基づきアルゴリズムを用いて前記試料をIBS試料又は非IBS試料と分類する工程とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の症状が、胸痛、胸部不快感、胸焼け、普通量の食事後の不快な膨満感、普通量の食事の完食不能、腹痛、腹部不快感、便秘、下痢、鼓張、腹部膨満、痛み又は不快感があることと関連づけられる消極的な思考又は感情、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の症状の存在又は重症度が質問票を用いて同定される、請求項39に記載の方法。
- 前記質問票が、前記個人に前記少なくとも1種の症状の存在又は重症度について尋ねる質問のセット、前記個人に痛み又は不快感があることと関連づけられる消極的な思考又は感情の存在又は重症度を尋ねる質問のセット、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項41に記載の方法。
- 前記少なくとも1種の症状の存在又は重症度が、前記個人に目下何らかの症状があるか否かを前記個人に尋ねることによって同定される、請求項39に記載の方法。
- 前記症状プロファイルが、少なくとも2種、3種、4種、5種、又は6種の症状の存在又は重症度を同定することによって決定される、請求項39に記載の方法。
- 前記方法がさらに、被験者に該被験者がIBSに罹患している確率という形態の診断を提供する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記方法がさらに、試料をIBS−便秘型(IBS−C)、IBS−下痢型(IBS−D)、IBS−混合型(IBS−M)、IBS−交替型(IBS−A)、又は感染後型IBS(IBS−PI)試料と分類する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記方法がさらに、非IBS試料を正常試料、炎症性腸疾患(IBD)試料、又は非IBD試料と分類する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記方法がさらに、腸炎を除外する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 被験者における過敏性腸症候群(IBS)の進行又は退行をモニタリングする方法であって、以下の工程:
(a)第一の時点で被験者から採取された第一の生物学的試料から第一のバイオマーカープロファイルを決定する工程と;
(b)第二の時点で被験者から採取された第二の生物学的試料から第二のバイオマーカープロファイルを決定する工程と;及び
(c)前記第一のバイオマーカープロファイルと前記第二のバイオマーカープロファイルとを比較して、(i)いずれのバイオマーカープロファイルがIBSと関連する第一の参照プロファイルと最も多く類似しているか又は最も少なく類似しているかを決定し、(ii)いずれのバイオマーカープロファイルがIBSの非存在と関連する第二の参照プロファイルと最も少なく類似しているか又は最も多く類似しているかを決定し、又は(iii)前記類似性の少なくとも2つを決定する工程と、
を含み、前記バイオマーカープロファイルが表4に見出される少なくとも2種のバイオマーカーの発現についての情報を含んでおり、そのことによって、前記被験者におけるIBSの進行又は退行をモニタリングする、前記方法。 - 前記バイオマーカーが、CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A、及びFOXD3からなる群から選択される、請求項49に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが、CCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、及びGNG3である、請求項50に記載の方法。
- 前記第一の生物学的試料が採取された時と前記第二の生物学的試料が採取された時との間の時間期間において前記被験者がIBSに対する治療を施される、請求項49に記載の方法。
- 前記治療が、セロトニン作動薬、抗うつ剤、塩化物チャネル活性化剤、グアニル酸シクラーゼアゴニスト、抗生物質、オピオイド、ニューロキニンアンタゴニスト、鎮痙薬又は抗コリン作動薬、ベラドンナアルカロイド、バルビツール酸塩、それらの遊離塩基、それらの薬剤学的に許容することのできる塩、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤である、請求項52に記載の方法。
- IBS治療が必要な被験者に対してIBS治療を割り当てる方法であって、以下の工程:
(a)被験者から採取された生物学的試料からRNAを単離及び/又は増幅する工程と;(b)検出試薬を該検出試薬とIBSのRNAバイオマーカーとを含む複合体に変換するのに適した条件下に、前記単離及び/又は増幅されたRNAを前記検出試薬と接触させる工程と;
(c)前記複合体のレベルを検出する工程と;
(d)前記複合体のレベルがIBSと関連する第一の参照レベル又はIBSの非存在と関連する第二の参照レベルとより密接に類似しているか否かを決定する工程と;及び
(e)前記レベルがIBSと関連する前記第一の参照レベルとより密接に類似している場合はIBS治療を割り当て、ここで前記IBSのRNAバイオマーカーが表4に見出されるものからなる群から選択される工程と、
を含む、前記方法。 - 前記方法が表4に見出されるIBSバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも2種のIBSバイオマーカーのレベルを検出する工程を含む、請求項54に記載の方法。
- 前記方法が表4に見出されるIBSマーカーからなる群から選択される少なくとも5種のIBSマーカーのレベルを検出する工程を含む、請求項54に記載の方法。
- 前記バイオマーカーがCCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、及びGNG3である、請求項54に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが表1に見出されるものから選択される、請求項54〜56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バイオマーカーがCCDC147、VIPR1、LPAR5、CCDC144A、GNG3、ACSS2、ZNF33B、PMS2L2、RUSC1、ARHGE、ASIP、OR2L8、PI4K2A、及びFOXD3からなる群から選択される、請求項54に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが配列番号:1〜75及び154〜162のいずれか1つのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするmRNA分子である、請求項54に記載の方法。
- 前記バイオマーカーが配列番号:76〜162のいずれか1つの核酸配列を含むRNA分子である、請求項54に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記被験者にIBS治療を施す工程を含む、請求項54に記載の方法。
- 前記治療が、セロトニン作動薬、抗うつ剤、塩化物チャネル活性化剤、グアニル酸シクラーゼアゴニスト、抗生物質、オピオイド、ニューロキニンアンタゴニスト、鎮痙薬又は抗コリン作動薬、ベラドンナアルカロイド、バルビツール酸塩、それらの遊離塩基、それらの薬剤学的に許容することのできる塩、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤の投与を含む、請求項62に記載の方法。
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