KR20160006882A - 락토바실러스 브레비스를 이용한 은행 외과피의 혐오취 저감 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 은행 외과피의 혐오취를 저감시킬수 있는 락토바실러스 브레비스 및 이를 이용하여 은행 외과피의 혐오취를 저감시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의할 경우 은행 외과피의 주요 혐오취 성분인 부티르산 및 헥산산의 함량을 감소시키고, 그 결과 은행 외과피의 혐오취를 저감시킬 수 있으며, 또한 혐오취가 저감된 은행 외과피 발효물을 제조할 수 있다.

Description

락토바실러스 브레비스를 이용한 은행 외과피의 혐오취 저감 방법{METHOD OF REDUCING STINK IN EPICARP OF GINKGO BILOBA USING LACTOBACILLUS BREVIS}
본 발명은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 이용하여 은행 외과피의 혐오취를 저감시키는 방법에 관한 것이다.
은행(Ginkgo biloba)은 예로부터 그 잎과 열매, 뿌리까지 한방과 민간요법에서 여러 질환에 약물로 쓰여져 왔으며, 은행나무의 수명이 길어서 장수를 돕는 식품으로 여겨져 왔다. 은행은 은행나무과에 속하는 낙엽교목으로 세계적으로 단 1과 1속 1종뿐이며, 한때 전세계에 분포되어 있었으나 지금은 동아시아 지역에서 주로 자생되고 있다. 은행나무에는 플라보노이드 계통의 살충, 살균 성분이 있어 병들거나 해충이 먹는 일이 없으며, 오염된 토양환경에서도 비교적 잘 생육하는 특성이 있다. 은행 추출물은 24%의 플라보노이드류(ginkgo flavone glycosides) 성분과 6%의 테르펜류(ginkgolides 및 bilobalides)로 이루어져 있으며, 수 천년 동안 중국에서 기관지 천식 및 기관지염 치료제로 사용되어 왔다. 또한 서구사회에서는 말초혈류장애와 뇌부전증의 치료에 탁월한 효과를 갖는 것으로 알려져 있다.
한국농업연감(2001)의 자료에 의하면, 2000년 우리나라의 은행 총 생산량은 약 1,760 M/T이며 계속 증가되고 있는 추세이다. 국내 은행 사용량은 총 생산량의 20% 정도이고 나머지 80%는 가공되지 않은 상태에서 매우 저가로 대부분 일본으로 수출되고 있어, 은행의 부가가치를 높이는 일이 시급한 실정이다.
은행은 은행나무의 황색의 열매로 다육성의 외과피(외과육)와, 흰색의 단단한 중과피, 그 중과피 안쪽의 갈색 피막의 내종피, 그 내종피 속의 청록색의 은행알(배젖과 배아)로 구성되어 있다. 은행알은 수분 55%, 당질 38%, 지방질 1.7%, 단백질 5%, 카로틴, 비타민 C, 칼슘, 칼륨, 인, 철분, 기타 레시틴, 아스파라긴산, 에르고스테롤 등을 함유한 영양성이 우수한 식품이다.
그러나 은행 외과피에는 탄소수 4의 포화 지방산인 부티르산(butyric acid, CH3CH2CH2COOH)이 주요 혐오취로 존재하기 때문에, 특유의 구린 악취로 인해 사용이 꺼려지고 있다. 게다가, 잎과 외과피에 존재하는 알레르기를 일으키는 물질인 우루시올류[Alkyl Phenolic acid and Alkyl Phenols; 일반적으로 10 ppm 미만 함유, Ginkgo Biloba, Edited by Teris A. van Beek, harwood academic publishers, in Introduction p3, 2005 참조]가 함유되어 있어 이용되지 않고 버려지는게 대부분이다.
또한 열매(은행알)와 외과피의 부피비가 약 1:4 정도가 되는데 은행 열매를 수확하여 은행알을 얻기 위하여 외과피인 과육을 분리하는 과정에서 폐기되는 외과피의 비율이 크다. 또한 은행 열매에는 많은 양의 과액이 함유되어 있으므로 은행을 얻는 도중에 많은 양의 과액이 생겨서 수율이 낮다.
현재까지 외과피에 함유된 과액과 외과피는 유효성분이 다량 함유되어 있음에도 불구하고 폐기처분되고 있어 자원낭비가 될 뿐 아니라, 폐기된 은행 열매에 함유된 과액과 외과피는 수질 환경을 오염시키고, 외과피가 썩는 동안에는 외과피의 특유의 냄새가 확산되어 대기 환경을 오염시키는 문제점이 제기되고 있다.
한편, 젖산균, 효모 등의 유용한 미생물을 이용한 발효는 악취제거, 수질정화, 산화방지와 같은 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여, 한국 공개특허공보 10-2008-0100535호 등에는 유기물과 미생물을 이용하여 악취제거제를 제조하는 방법을 제안한 바 있다. 하지만, 은행 외과피의 악취 유발 물질을 보다 효과적으로 제거하고 식품소재로 활용할 수 있는 은행 외과피에 특화된 새로운 기술은 전무한 실정이다.
이에, 본 발명에서는 은행 외과피의 혐오취를 저감시킬수 있는 균주 및 이를 이용하여 은행 외과피의 혐오취를 저감시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이에 본 발명자들은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 은행 외과피에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하여 발효시키는 경우 주요 혐오취 성분인 부티르산 및 헥산산의 함량을 감소시키고, 그 결과 은행 외과피의 혐오취를 저감시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 방법에 의할 경우 은행 외과피의 주요 혐오취 성분인 부티르산 및 헥산산의 함량을 감소시키고, 그 결과 은행 외과피의 혐오취를 저감시킬 수 있으며, 또한 혐오취가 저감된 은행 외과피 발효물을 제조할 수 있다. 이에 따라 은행 외과피의 산업적 활용도를 크게 높여 은행의 부가가치를 높일 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 은행 외과피 발효물의 MTT 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 은행 외과피 발효물의 NO 생성 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.
일 측면에서, 본 발명은 은행 외과피에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하여 발효시키는 것을 포함하는 은행 외과피의 혐오취를 저감시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 은행 외과피의 혐오취를 저감하기 위한 방법으로서, 은행 외과피 중 부티르산(butyric acid) 및/또는 헥산산(hexanoic acid)의 함량을 저감시키기 위해, 은행 외과피에 락토바실러스 브레비스를 접종하여 발효시키는 방법을 제공한다. 상기 부티르산 및 헥산산은 은행 외과피에서 발생하는 혐오취의 주요 성분으로서, 특히 부티르산의 경우 사람이 인지할 수 있는 최소감지농도가 0.000019 ppm에 이를 정도로 매우 낮으며 불쾌한 썩은 냄새를 풍기기 때문에, 은행 외과피의 혐오취를 저감시키기 위해서는 은행 외과피 중 부티르산의 함량을 감소시키는 것이 필수적이다. 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스를 은행 외과피에 접종하여 발효시키는 경우, 이러한 부티르산 및/또는 헥산산의 함량을 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 은행 외과피의 혐오취를 저감시키기 위한 방법으로서, 은행 외과피 중 휘발성 유기산의 함량을 증가시키기 위해 은행 외과피에 락토바실러스 브레비스를 접종하여 발효시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 마스킹법의 원리를 이용한 것으로, 마스킹법이란 혐오취 성분 외에 다른 방향성이 강한 물질을 이용하여 혐오취 성분을 감각적으로 인지하지 못하게 함으로써 혐오취를 덜 느끼게 하는 방법을 의미한다. 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스를 은행 외과피에 접종하여 발효시키는 경우, 은행 외과피 중 끊는점이 150℃ 이하인 아세트산, 프로피온산, 낙산, 포름산 등의 휘발성 유기산의 함량이 증가하여 주요 혐오취 성분인 부티르산 및/또는 헥산산으로부터 발생하는 냄새를 저감시키거나 완화시킬 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스를 은행 외과피에 접종하여 발효시키는 경우, 휘발성 유기산 중 아세트산 및/또는 포름산의 함량이 증가될 수 있다.
은행 외과피의 혐오취를 저감하기 위한 또 다른 방법으로서, 본 발명은 락토바실러스 브레비스를 접종시키기 전에 은행 외과피에 하나 이상의 첨가물을 혼합하는 방법을 제공한다. 상기 첨가물로는 중탄산나트륨, 중탄산칼륨 및 중탄산칼슘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 첨가물을 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 첨가물이 은행 외과피에 혼합되는 경우, 은행 외과피 중 부티르산의 함량이 저감되는 효과를 추가로 얻을 수 있다. 구체적으로, 은행 외과피 발효물의 전체 중량을 기준으로 하여 0.03 중량% 내지 0.5 중량%의 중탄산칼슘, 0.05 중량% 내지 1.0 중량%의 중탄산칼륨, 또는 0.05 중량% 내지 1.0 중량%의 중탄산나트륨을 각각 또는 함께 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 부티르산 함량이 저감되는 효과을 극대화하기 위해, 락토바실러스 브레비스를 접종시키기 전에 은행 외과피 발효물의 전체 중량을 기준으로 하여 0.03 중량% 내지 0.5 중량%의 중탄산칼슘을 은행 외과피에 첨가하는 것이 바람직하며, 0.25 중량% 내지 0.5 중량%의 중탄산칼슘을 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.
특히, 본 발명은 상기 락토바실러스 브레비스로서 락토바실러스 브레비스 KFCC11585P을 사용하여 은행 외과피의 혐오취를 저감시키는 방법에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 은행 외과피에 락토바실러스 브레비스를 접종하여 발효시키는 것을 포함하는 은행 외과피 발효물을 제조하는 방법 및 이러한 방법에 따라 제조되는 은행 외과피 발효물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 상기 락토바실러스 브레비스로서 락토바실러스 브레비스 KFCC11585P을 사용하여 은행 외과피 발효물을 제조하는 방법 및 이러한 방법에 따라 제조되는 은행 외과피 발효물에 관한 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기에 제시된 은행 외과피 발효물의 제조 방법에 따라 제조되는 은행 외과피 발효물을 유효성분으로 함유하는, 암 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상적인 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 멸균 주사용액, 사전 충전식 주사(pre-filled syringe) 용액제의 형태 또는 동결건조(lyophilized)된 형태로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
제형화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제도 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되며, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 증상의 정도, 질병의 종류, 약물 형태, 투여 경로, 투여 기간 등에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 유효성분인 은행 외과피 발효물이 1일 0.2 내지 200 ㎎/㎏ 투여되도록 하는 것이 최적의 효능을 위해 바람직하다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회 나누어 투여할 수도 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 암 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 상기 암은 유방암, 흑색종암, 위암, 간암 또는 폐암일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 면역 관련 질환은 전신성 홍반성 낭창, 류마티스성 관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증(경피증), 특발성 염증성 근장애(피부근염, 다발성근염), 쇼그렌 증후군, 전신성 맥관염, 유육종증, 자가면역성 용혈성 빈혈(면역성 범혈구 감소증, 발작성 야간 혈색소뇨증), 자가면역성 혈소판감소증(특발성 혈소판감소성 자반병, 면역 매개성 혈소판 감소증), 갑상선염(그레이브스병, 하시모도 갑상선염, 유년형 림프종성 갑상선염, 위축성 갑상선염), 당뇨병, 면역 매개 신장 질환(사구체신염, 세뇨관 간질성 신염), 다발성 경화증, 특발성 탈수초 다발성 신경염 또는 길랑랑-바레 증후군 및 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염과 같은 중추 및 말초 신경계의 탈수초 질환, 감염성 간염(A, B, C, D, E형 간염 및 기타 비-간친화성 바이러스), 자가 면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염 및 경화성 담관염과 같은 간담즙성 질환, 염증성 장질환(궤양성 대장염: 크론병), 글루텐-민감성 장질환 및 휘플병과 같은 염증성 및 섬유성 폐 질환, 수포성 피부 질환, 다형 삼출성 홍반 및 접촉성 피부염을 포함하는 자가면역 또는 면역 매개성 피부 질환, 건선, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 담마진과 같은 알레르기성 질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유종 및 과민성 폐렴과 같은 폐 면역질환일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기에 제시된 은행 외과피 발효물의 제조 방법에 따라 제조된 은행 외과피 발효물을 유효성분으로 함유하는, 면역력 증진용 건강기능식품에 관한 것이다.
본 발명의 건강기능식품은, 비제한적으로 각종 음료, 껌, 차, 과자, 비타민 복합체, 건강 보조식품 등의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품의 바람직한 섭취량은 섭취자의 상태, 체중, 증상의 정도, 식품 형태, 섭취 기간에 따라 다르며 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 유효성분인 은행 외과피 발효물이 1일 0.2 내지 200 ㎎/㎏ 섭취되도록 하는 것이 최적의 효과를 위해 바람직하다.
다른 측면에서, 본 발명은 신규 젖산균 균주 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KFCC11585P에 관한 것이다.
이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
1. 시료의 준비
본 실시예에서 사용된 은행은 2011년 10월 말에서 11월 초에 두성은행영농조합에서 수확한 것으로, 노랗게 잘 익은 상태의 열매를 사용하였다.
2. 균주의 선발
식품 균주 중에서 젖산균과 효모를 중심으로 은행 외과피의 혐오취를 저감시킬 수 있는 균주를 선발하고자 하였다. 본 실시예에서는 젖산균 60종과 효모 40의 균주를 대상으로 실험을 진행하였다. 실험에 사용된 젖산균 60종과 효모 40종을 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.
젖산균 60종
No. Strain 균주번호 분리원
1 Bifidobacterium longum KFRI 744 -
2 Bifidobacterium breve KFRI 743 Intestine of infant
3 Enterococcus faecalis KCTC 3195 -
4 Enterococcus faecalis var . liquefaciens KFRI 685 -
5 Enterococcus faecium KFRI 826 Kimchi
6 Enterococcus faecium KFRI 823 Kimchi
7 Enterococcus faecium KFRI 822 -
8 Enterococcus feacalis var . liquefaciens KFRI 685 -
9 Enterococcus feacium KFRI 1182 Fermaenting apple juice
10 Eubacterium limosum KFRI 753 -
11 Lactobacillus amylophilus KFRI 238 -
12 Lactobacillus brevis KCTC 3102 Fermenting Sevillano variety olives
13 Lactobacillus brevis KCTC 3498 human feces
14 Lactobacillus brevis KFRI 146 -
15 Lactobacillus brevis KFRI 812 Kimchi
16 Lactobacillus brevis KFRI 805 Kimchi
17 Lactobacillus casei KFRI 228 -
18 Lactobacillus corniformis subsp. corniformis KCTC 3505 Fermentating olives
19 Lactobacillus curvatus KFRI 654 Milk
20 Lactobacillus brevis KFRI 145 Fermented beets
21 Lactobacillus hilgardii KFRI 229 -
22 Lactobacillus honohiechii KFRI 234 -
23 Lactobacillus lactis KCTC 2181 -
24 Lactobacillus pentosus KFRI 1183 -
25 Lactobacillus pentosus KFRI 481
26 Lactobacillus plantarum KCTC3099 -
27 Lactobacillus plantarum KFRI 464 Pickled cabbage
28 Lactobacillus plantarum KFRI 144 -
29 Lactobacillus plantarum KFRI 814 Kimchi
30 Lactobacillus plantarum KFRI 813 Kimchi
31 Lactobacillus plantarum KFRI 660 Pickled cabbage
32 Lactobacillus plantarum KFRI 471 -
33 Lactobacillus plantarum KFRI 470 -
34 Lactobacillus plantarum 　 KFRI 464 Pickled cabbage
35 Lactobacillus sakei KFRI 815 Kimchi
36 Lactococcu lactic sp. lactis KFRI 669 -
37 Lactococcu lactic sp. lactis KFRI 670 -
38 Lactococcu lactic sp. lactis 　 KFRI 671 -
39 Lactococcus plantarum KFRI 1186 Frozen peas
40 Lactococcus plantarum KCTC 1048 -
41 Leuconostoc carnosum KCTC 3252 Soil
42 Leuconostoc lacits KFRI 232 -
43 Leuconostoc mesenteroides sp. mesenteroides KCTC 3505 Fermentating olives
44 Leuconostoc carnosum KCTC 3524 -
45 Leuconostoc carnosum KCTC 3525 Vakuum-packaged meats
46 Leuconostoc lactis KCTC 3528 Milk
47 Leuconostoc mesenteroides KCTC 3530 -
48 Leuconostoc mesenteroides KCTC 3505 Fermentating olives
49 Leuconostoc mesenteroides sp. mesenteroides KFRI 145 Fermented beets
50 Leuconostoc creoris KFRI 241 -
51 Leuconostoc menseteroides KFRI 818 -
52 Leuconostoc menseteroides sp. menseteroides KFRI 819 Kimchi
53 Leuconostoc menseteroides sp. menseteroides KFRI 820 Kimchi
54 Leuconostoc menseteroides sp. menseteroides KFRI 821 Kimchi
55 Pediococcus cerevisiae KCTC 3101 -
56 Pediococcus pentosaceus KCTC 3507 Dried American beer yeast
57 Pediococcus pentosaceus KFRI 832 -
58 Pediococcus pentosaceus KFRI 833 Kimchi
59 Pediococcus pentosaceus KFRI 834 Kimchi
60 Weissella confusa KFRI 1184 -
효모 40종
No. Strain 균주번호 분리원
1 Saccharomycopsis fibuligera KFRI 00106 Ragi
2 Candida edax KFRI 00113 Fermaented swine manure
3 Candidaintermedia KFRI 00115 Feces
4 Kluyveromyces marxianus var . KFRI 00137 Whey fermentation
5 Rhodotorula glutinis KFRI 00172 　-
6 Candida tropicalis KFRI 00178 　-
7 Schizosaccharomyces pombe KFRI 00259 Rum
8 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00265 　-
9 Saccharomyces heterogenicus KFRI 00270 　-
10 Rhodosporidium toruloides KFRI 00316 　-
11 Saccharomycopsis fibuligera KFRI 00441 Ragi
12 Crytococcus albidus KFRI 00457 soil
13 Torulaspora fermentati KFRI 00550 Sherry
14 Saccharomycodes ludwigii KFRI 00551 　-
15 Rhodosporidium toruloides KFRI 00552 　-
16 Filobasidium capsuligenum KFRI 00555 　-
17 Candida rugosa KFRI 00557 　-
18 Torulaspora hansenii KFRI 00560 　-
19 Hansenula sp. KFRI 00588 　-
20 Candida sp. KFRI 00589 　-
21 Citeromyces sp. KFRI 00590 　-
22 Cantharellus cibarius KFRI 00597 　-
23 Pleurotus sajor - caju KFRI 00600 　-
24 Hericium erinaceus KFRI 00606 　-
25 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00631 Wine
26 Schizosaccharomyces pombe KFRI 00635 　-
27 Rhodotorula gracillis KFRI 00636 　-
28 Sporobolomyces holsaticus KFRI 00637 　-
29 Sporobolomyces holsaticus KFRI 00638 　-
30 Torulopsis candida KFRI 00639 　-
31 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00795 　-
32 Candida lipolytica KFRI 00909 　-
33 Candida pseudotropicalis KFRI 00910 Yogurt
34 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00920 　-
35 Saccharomyces lactis KFRI 00922 Gassy cheese
36 Saccharomyces rosei KFRI 00926 　-
37 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00937 　-
38 Schizosaccharomyces pombe KFRI 00938 Rum
39 Saccharomyces cerevisiae KFRI 01013 Wine
40 Saccharomyces cerevisiae KFRI 01019 　-
2-1. 혐오취 분석
잘게 마쇄한 은행 외과피를 TSB에 첨가하여 10% 은행 외과피 액체 배지를 제조한 후, 상기 액체 배지에 1%의 균주 100종을 각각 접종한 다음, 효모는 25℃, 젖산균은 30℃의 온도에서 48시간 동안 배양하였다.
이렇게 배양된 발효물을 4,000 rpm, 4℃, 10분간 원심분리하여 회수한 상징액을 HPLC용 메탄올로 1:9 (w:v)의 비율로 희석한 후, 0.2 ㎛ PVDF 시린지 필터(Whatman사 제조)로 여과한 후에 분석에 이용하였다. 유기산 분석은 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였으며, 분석 조건은 하기 표 3에 나타내었다.
HPLC 기구 조건
Instrument Waters, E2695
Column Aminex HPX-87H (300×7.8 mm)
Elution 0.008 N H2SO4
Flow rate 0.6 mL/min
Detector UV 210 nm
Oven temperature 50℃
Injection volume 20 ㎕
균주별 부티르산, 헥산산, 아세트산 및 포름산의 함량 변화를 확인하여 하기 표 4에 나타내었다.
No. Strain 균주번호 함량
butyric acid
(ppm) 		hexanoic acid
(ppm)		 acetic acid
(ppm)		 formic acid
(ppm)
1 control (10% 은행 외과피 배지) - 54,199 17,045 1,211 1,381
2 Bifidobacterium longum KFRI 744 39,432 9,651 3,221 1,311
3 Bifidobacterium breve KFRI 743 50,218 15426 1,242 1,320
4 Enterococcus faecalis KCTC 3195 54,162 15,452 1,324 1,351
5 Enterococcus faecalis var . liquefaciens KFRI 685 51,357 17,065 1,240 1,384
6 Enterococcus faecium KFRI 826 52,394 16,532 1,242 1,320
7 Enterococcus faecium KFRI 823 41,469 16,523 1,652 1,302
8 Enterococcus faecium KFRI 822 48,253 12,354 1,452 1,375
9 Enterococcus feacalis var . liquefaciens KFRI 685 51,558 17,263 1,320 1,304
10 Enterococcus feacium KFRI 1182 31,362 7,292 2,248 1,329
11 Eubacterium limosum KFRI 753 41,734 16,267 1,246 1,276
12 Lactobacillus amylophilus KFRI 238 48,437 16,826 1,652 1,324
13 Lactobacillus brevis KCTC 3102 52,203 19,562 1,685 1,210
14 Lactobacillus brevis KCTC 3498 37,472 15,362 1,642 1,342
15 Lactobacillus brevis KFRI 146 49,290 16,428 1,520 1,324
16 Lactobacillus brevis KFRI 812 55,859 12,375 1,652 1,375
17 Lactobacillus brevis KFRI 805 54,943 16,845 1,423 1,365
18 Lactobacillus casei KFRI 228 47,125 14,562 1,652 1,354
19 Lactobacillus corniformis subsp. corniformis KCTC 3505 40,768 16,542 1,667 1,324
20 Lactobacillus curvatus KFRI 654 54,732 14,521 1,542 1,395
21 Lactobacillus brevis KFRI 145 36,881 6,554 2,432 3,241
22 Lactobacillus hilgardii KFRI 229 43,228 10,324 1,272 1,327
23 Lactobacillus honohiechii KFRI 234 46,672 16,247 1,264 1,248
24 Lactobacillus lactis KCTC 2181 51,202 12,522 1,320 1,249
25 Lactobacillus pentosus KFRI 1183 38,864 16,592 1,624 1,375
26 Lactobacillus pentosus KFRI 481 42,157 11,246 1,726 1,392
27 Lactobacillus plantarum KCTC 3099 54,218 16,275 1,246 1,346
28 Lactobacillus plantarum KFRI 464 37,181 15,894 1,325 1,270
29 Lactobacillus plantarum KFRI 144 44,678 15,782 1,342 3,200
30 Lactobacillus plantarum KFRI 814 51,120 15,410 1,279 1,276
31 Lactobacillus plantarum KFRI 813 46,984 16,242 1,360 1,138
32 Lactobacillus plantarum KFRI 660 54,123 10,325 1,249 1,356
33 Lactobacillus plantarum KFRI 471 54,621 12,024 1,247 1,301
34 Lactobacillus plantarum KFRI 470 41,785 12,530 1,368 1,395
35 Lactobacillus plantarum 　 KFRI 464 49,523 12,062 1,369 3,642
36 Lactobacillus sakei KFRI 815 32,245 7,501 2,032 2,039
37 Lactococcu lactic sp. lactis KFRI 669 56,782 12,071 1,652 1,207
38 Lactococcu lactic sp. lactis KFRI 670 43,582 12,620 1,624 1,295
39 Lactococcu lactic sp. lactis 　 KFRI 671 49,503 12,842 1,579 1,348
40 Lactococcus plantarum KFRI 1186 48,265 13,265 1,326 1,369
41 Lactococcus plantarum KCTC 1048 48,325 13,225 1,346 1,302
42 Leuconostoc carnosum KCTC 3252 39,237 16,220 1,262 1,327
43 Leuconostoc lacits KFRI 232 39,546 12,207 1,276 2,290
44 Leuconostoc mesenteroides sp. mesenteroides KCTC 3505 38,324 14,208 1,620 1,246
45 Leuconostoc carnosum KCTC 3524 42,651 10,325 1,462 1,203
46 Leuconostoc carnosum KCTC 3525 43,628 10,426 1,552 1,276
47 Leuconostoc lactis KCTC 3528 52,012 11,652 1,324 1,320
48 Leuconostoc mesenteroides KCTC 3530 46,823 10,328 1,320 1,267
49 Leuconostoc mesenteroides KCTC 3505 44,125 13,207 1,326 1,203
50 Leuconostoc mesenteroides sp. mesenteroides KFRI 145 41,032 12,039 1,342 1,380
51 Leuconostoc creoris KFRI 241 40,326 11,032 1,624 1,271
52 Leuconostoc menseteroides KFRI 818 38,230 16,121 1,607 1,235
53 Leuconostoc menseteroides sp. menseteroides KFRI 819 37,210 15,421 1,362 1,276
54 Leuconostoc menseteroides sp. menseteroides KFRI 820 41,265 11,451 1,380 1,320
55 Leuconostoc menseteroides sp. menseteroides KFRI 821 42,562 16,520 1,427 1,346
56 Pediococcus cerevisiae KCTC 3101 50,232 12,842 1,271 1,390
57 Pediococcus pentosaceus KCTC 3507 49,213 10,301 1,427 1,357
58 Pediococcus pentosaceus KFRI 832 44,032 9,984 1,268 1,304
59 Pediococcus pentosaceus KFRI 833 34,921 12,201 1,491 1,290
60 Pediococcus pentosaceus KFRI 834 46,366 11,065 1,274 1,302
61 Weissella confusa KFRI 1184 32,210 9,881 3,104 1,371
62 Saccharomycopsis fibuligera KFRI 00106 36,219 11,012 1,274 1,620
63 Candida edax KFRI 00113 42,689 10,482 1,650 1,652
64 Candidaintermedia KFRI 00115 46,865 10,113 2,111 1,384
65 Kluyveromyces marxianus var . KFRI 00137 53,265 13,024 1,241 1,271
66 Rhodotorula glutinis KFRI 00172 51,035 10,325 1,234 1,249
67 Candida tropicalis KFRI 00178 43,253 11,039 1,032 1,230
68 Schizosaccharomyces pombe KFRI 00259 47,856 12,745 1,652 1,901
69 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00265 47,965 8,452 1,745 1,320
70 Saccharomyces heterogenicus KFRI 00270 50,368 10,128 1,248 1,384
71 Rhodosporidium toruloides KFRI 00316 46,823 14,712 1,352 1,368
72 Saccharomycopsis fibuligera KFRI 00441 39,236 15,520 1,492 1,342
73 Crytococcus albidus KFRI 00457 39,520 14,403 1,614 1,420
74 Torulaspora fermentati KFRI 00550 38,652 16,210 1,268 1,562
75 Saccharomycodes ludwigii KFRI 00551 39,626 14,149 1,241 1,421
76 Rhodosporidium toruloides KFRI 00552 34,685 15,170 1,354 1,074
77 Filobasidium capsuligenum KFRI 00555 41,652 11,032 1,657 1,203
78 Candida rugosa KFRI 00557 45,469 12,071 1,492 1,273
79 Torulaspora hansenii KFRI 00560 51,253 11,682 1,542 1,032
80 Hansenula sp. KFRI 00588 42,656 12,302 1,642 1,024
81 Candida sp. KFRI 00589 52,315 12,212 1,426 1,065
82 Citeromyces sp. KFRI 00590 42,352 11,087 1,234 1,420
83 Cantharellus cibarius KFRI 00597 49,562 10,071 1,625 1,243
84 Pleurotus sajor - caju KFRI 00600 48,522 11,802 2,034 1,652
85 Hericium erinaceus KFRI 00606 47,326 13,260 1,121 1,275
86 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00631 46,523 8,940 1,652 1,359
87 Schizosaccharomyces pombe KFRI 00635 48,216 13,301 1,349 1,243
88 Rhodotorula gracillis KFRI 00636 47,326 12,032 1,362 1,652
89 Sporobolomyces holsaticus KFRI 00637 43,956 11,072 1,592 1,460
90 Sporobolomyces holsaticus KFRI 00638 38,962 13,017 1,397 1,246
91 Torulopsis candida KFRI 00639 41,356 11,420 1,032 1,320
92 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00795 43,579 9,052 3,626 1,324
93 Candida lipolytica KFRI 00909 43,692 11,073 1,624 1,320
94 Candida pseudotropicalis KFRI 00910 44,326 12,469 1,846 1,652
95 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00920 33,261 12,920 2,487 1,485
96 Saccharomyces lactis KFRI 00922 42,953 13,402 2,610 1,320
97 Saccharomyces rosei KFRI 00926 43,625 12,321 1,231 1,623
98 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00937 43,262 12,709 3,210 1,462
99 Schizosaccharomyces pombe KFRI 00938 49,562 10,478 1,624 1,954
100 Saccharomyces cerevisiae KFRI 01013 48,623 9,548 2,340 1,452
101 Saccharomyces cerevisiae KFRI 01019 31,742 8,221 4,120 2,641
락토바실러스 브레비스(KFRI 145)의 경우, 은행 외과피의 혐오취 성분인 부티르산 및 헥산산의 함량이 대조군에 비해 현저하게 줄어들었으며, 휘발성 유기산인 아세트산 및 포름산의 함량이 대조군에 비해 크게 증가하였음을 상기 표 4에서 확인할 수 있다.
2-2. 생육성 검토
우루시올류에 저항성 있는 균주 선발을 위해 우루시올 첨가배지에서 상기 100종의 균주를 대상으로 생육성 여부를 검토하였다. 이를 위해, 우루시올류가 포함되어 있는 옻엑기스와 은행 외과피를 각각 농도별로 첨가하여 고체 배지를 제조하였고, 균주의 생육 여부와 콜로니의 크기(콜로니 지름의 크기, mm)를 통해 우루시올류에 대한 저항성 여부를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
No. Strain 균주번호 고체 배지 조성
control
(TSA)		 옻
0.1%		 옻
1%		 은행 외과피
1%		 은행 외과피 10% 은행 외과피 50%
1 Bifidobacterium longum KFRI 744 15 15 10 12 8 3
2 Bifidobacterium breve KFRI 743 30 0 0 0 0 0
3 Enterococcus faecalis KCTC 3195 8 0 0 0 0 0
4 Enterococcus faecalis var . liquefaciens KFRI 685 30 0 0 0 0 0
5 Enterococcus faecium KFRI 826 18 20 3 0 0 0
6 Enterococcus faecium KFRI 823 5 50 1 0 0 0
7 Enterococcus faecium KFRI 822 6 0 0 0 0 0
8 Enterococcus feacalis var . liquefaciens KFRI 685 18 8 0 0 0 0
9 Enterococcus feacium KFRI 1182 22 16 9 19 8 0
10 Eubacterium limosum KFRI 753 11 0 0 0 0 0
11 Lactobacillus amylophilus KFRI 238 25 11 0 4 2 2
12 Lactobacillus brevis KCTC 3102 33 22 0 0 0 0
13 Lactobacillus brevis KCTC 3498 19 6 0 0 0 0
14 Lactobacillus brevis KFRI 146 8 6 4 1 1 1
15 Lactobacillus brevis KFRI 812 8 0 0 1 1 1
16 Lactobacillus brevis KFRI 805 7 3 0 1 2 1
17 Lactobacillus casei KFRI 228 8 6 0 1 2 1
18 Lactobacillus corniformis subsp. corniformis KCTC 3505 15 2 2 2 1 1
19 Lactobacillus curvatus KFRI 654 10 0 0 0 0 0
20 Lactobacillus brevis KFRI 145 19 11 11 3 2 1
21 Lactobacillus hilgardii KFRI 229 26 26 1 0 0 0
22 Lactobacillus honohiechii KFRI 234 14 8 2 0 0 0
23 Lactobacillus lactis KCTC 2181 39 30 23 20 20 1
24 Lactobacillus pentosus KFRI 1183 14 1 0 0 0 0
25 Lactobacillus pentosus KFRI 481 10 0 0 0 0 0
26 Lactobacillus plantarum KCTC 3099 22 10 0 5 0 0
27 Lactobacillus plantarum KFRI 464 11 1 0 0 0 0
28 Lactobacillus plantarum KFRI 144 22 0 0 0 0 0
29 Lactobacillus plantarum KFRI 814 20 3 0 0 0 0
30 Lactobacillus plantarum KFRI 813 4 2 0 0 0 0
31 Lactobacillus plantarum KFRI 660 4 4 2 0 0 0
32 Lactobacillus plantarum KFRI 471 4 2 0 0 0 0
33 Lactobacillus plantarum KFRI 470 4 2 0 0 0 0
34 Lactobacillus plantarum 　 KFRI 464 4 0 0 0 0 0
35 Lactobacillus sakei KFRI 815 15 15 12 15 8 1
36 Lactococcu lactic sp. lactis KFRI 669 4 2 0 0 0 0
37 Lactococcu lactic sp. lactis KFRI 670 5 0 0 0 0 0
38 Lactococcu lactic sp. lactis　 KFRI 671 23 11 0 0 0 0
39 Lactococcus plantarum KFRI 1186 23 1 0 0 0 0
40 Lactococcus plantarum KCTC 1048 4 3 0 0 0 0
41 Leuconostoc carnosum KCTC 3252 28 0 0 0 0 0
42 Leuconostoc lacits KFRI 232 5 2 0 0 0 0
43 Leuconostoc mesenteroides sp. mesenteroides KCTC 3505 5 1 0 0 0 0
44 Leuconostoc carnosum KCTC 3524 27 11 0 0 0 0
45 Leuconostoc carnosum KCTC 3525 7 3 0 0 0 0
46 Leuconostoc lactis KCTC 3528 13 3 0 3 1 1
47 Leuconostoc mesenteroides KCTC 3530 8 3 1 1 1 1
48 Leuconostoc mesenteroides KCTC 3505 7 3 0 0 0 0
49 Leuconostoc mesenteroides sp. mesenteroides KFRI 145 24 3 0 0 0 0
50 Leuconostoc creoris KFRI 241 4 3 0 1 1 1
51 Leuconostoc menseteroides KFRI 818 23 2 0 0 0 0
52 Leuconostoc menseteroides sp. menseteroides KFRI 819 23 8 0 0 0 0
53 Leuconostoc menseteroides sp. menseteroides KFRI 820 19 6 1 19 19 1
54 Leuconostoc menseteroides sp. menseteroides KFRI 821 4 5 0 3 0 0
55 Pediococcus cerevisiae KCTC 3101 7 6 1 1 1 1
56 Pediococcus pentosaceus KCTC 3507 11 5 0 2 1 1
57 Pediococcus pentosaceus KFRI 832 21 5 1 2 1 1
58 Pediococcus pentosaceus KFRI 833 6 5 0 2 1 1
59 Pediococcus pentosaceus KFRI 834 6 0 0 0 0 0
60 Weissella confusa KFRI 1184 12 10 0 8 6 3
61 Saccharomycopsis fibuligera KFRI 00106 30 0 0 0 0 0
62 Candida edax KFRI 00113 5 0 0 0 0 0
63 Candidaintermedia KFRI 00115 8 0 0 0 0 0
64 Kluyveromyces marxianus var . KFRI 00137 16 0 0 5 0 0
65 Rhodotorula glutinis KFRI 00172 5 0 0 0 0 0
66 Candida tropicalis KFRI 00178 27 0 0 0 0 0
67 Schizosaccharomyces pombe KFRI 00259 8 0 0 0 0 0
68 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00265 9 0 0 0 0 0
69 Saccharomyces heterogenicus KFRI 00270 14 0 0 0 0 0
70 Rhodosporidium toruloides KFRI 00316 7 0 0 0 0 0
71 Saccharomycopsis fibuligera KFRI 00441 5 0 0 0 0 0
72 Crytococcus albidus KFRI 00457 6 0 0 0 0 0
73 Torulaspora fermentati KFRI 00550 5 0 0 0 0 0
74 Saccharomycodes ludwigii KFRI 00551 4 0 0 0 0 0
75 Rhodosporidium toruloides KFRI 00552 7 0 0 0 0 0
76 Filobasidium capsuligenum KFRI 00555 8 0 0 0 0 0
77 Candida rugosa KFRI 00557 3 0 0 0 0 0
78 Torulaspora hansenii KFRI 00560 16 0 0 0 0 0
79 Hansenula sp. KFRI 00588 9 0 0 0 0 0
80 Candida sp. KFRI 00589 7 0 0 0 0 0
81 Citeromyces sp. KFRI 00590 11 0 0 0 0 0
82 Cantharellus cibarius KFRI 00597 10 0 0 0 0 0
83 Pleurotus sajor - caju KFRI 00600 20 0 0 0 0 0
84 Hericium erinaceus KFRI 00606 18 0 0 0 0 0
85 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00631 3 0 0 0 0 0
86 Schizosaccharomyces pombe KFRI 00635 3 0 0 0 0 0
87 Rhodotorula gracillis KFRI 00636 9 0 0 0 0 0
88 Sporobolomyces holsaticus KFRI 00637 3.5 0 0 2 0 0
89 Sporobolomyces holsaticus KFRI 00638 11 0 0 0 0 0
90 Torulopsis candida KFRI 00639 8 0 0 0 0 0
91 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00795 9 0 0 0 0 0
92 Candida lipolytica KFRI 00909 21 0 0 0 0 0
93 Candida pseudotropicalis KFRI 00910 9 0 0 0 0 0
94 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00920 2 0 0 0 0 0
95 Saccharomyces lactis KFRI 00922 11 0 0 7 2 0
96 Saccharomyces rosei KFRI 00926 13 0 0 6 3 0
97 Saccharomyces cerevisiae KFRI 00937 5 0 0 0 0 0
98 Schizosaccharomyces pombe KFRI 00938 8.5 0 0 0 0 0
99 Saccharomyces cerevisiae KFRI 01013 10 0 0 0 0 0
100 Saccharomyces cerevisiae KFRI 01019 9 0 0 5 2 0
락토바실러스 브레비스(KFRI 145)의 경우, 옻 0.1%, 1% 첨가 배지, 은행 외과피 1%, 10%, 50% 첨가 배지 모두에서 생존하였음을 상기 표 5를 통해 확인할 수 있다. 보다 자세한 생육성 검토를 위해, 락토바실러스 브레비스(KFRI 145)를 다시 액체 배지에 접종시켜 24시간 배양 및 48시간 배양 후의 생존 균수를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 6 및 표 7에 나타내었다.
24시간 배양 후 생존 균수
Strain 균주명 control 옻
0.1%		 옻
1%		 은행
외과피
0.5%		 은행
외과피
5%		 은행
외과피
10%
Log
(cfu/ml)		 Log
(cfu/ml)		 Log
(cfu/ml)		 Log
(cfu/ml)		 Log
(cfu/ml)		 Log
(cfu/ml)
Lactobacillus brevis KFRI 145 9.14 8.50 7.69 8.76 8.78 8.67
48시간 배양 후 생존 균수
Strain 균주명 control 옻 0.1% 옻
1%		 은행
외과피
0.5%		 은행
외과피
5%		 은행
외과피
10%
Log
(cfu/ml)		 Log
(cfu/ml)		 Log
(cfu/ml)		 Log
(cfu/ml)		 Log
(cfu/ml)		 Log
(cfu/ml)
Lactobacillus brevis KFRI 145 9.83 9.18 8.55 9.54 9.71 9.83
상기 표 6 및 7에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 브레비스(KFRI 145)는 24시간 및 48시간 배양 후 생존 균수를 확인한 모든 실험군에서 대조군과 유사한 생육 정도를 나타내었으며, 옻 엑기스와 은행 외과피를 첨가한 배지에서 약 log 7.7 내지 9.8 cfu/mL의 군집 크기를 나타내었다.
이와 같은 혐오취 분석 실험 및 생육성 검토 실험을 통해, 부티르산 및 헥산산을 저감시키는 효과를 지니며 우루시올류에 저항성이 있는 락토바실러스 브레비스(KFRI 145)를 선발하였고, 이를 GB3로 명명하였다. 또한, 한국미생물보존센터에 락토바실러스 브레비스(GB3)를 기탁하여 수탁번호 KFCC11585P을 부여받았다.
3. 은행 외과피 발효물
3-1. 은행 외과피 발효물의 제조 및 부티르산의 함량 확인
은행 외과피를 잘게 마쇄하여 하기 표 8과 같이 4가지의 고체 배지를 제조하였다. 이렇게 제조된 은행 외과피 고체 배지 각각에 활성화된 락토바실러스 브레비스(GB3) 1%를 접종하여 30℃의 온도에서 48시간 배양시켜 4종류의 은행 외과피 발효물을 제조하였다.
No. 배지 조성 수분함량(%)
1 은행 외과피:물=1:1(w/v) 80%
2 은행 외과피:물=1:2(w/v) 90%
3 은행 외과피:쌀:물=1:1:2(w/w/v) 80%
4 은행 외과피:쌀:물=1:1:4(w/w/v) 90%
이렇게 제조된 은행 외과피 발효물을 4,000 rpm, 4℃, 10분간 원심분리하여 회수한 상징액을 HPLC용 메탄올로 1:9 (w:v)의 비율로 희석한 후, 0.2 ㎛ PVDF 시린지 필터(Whatman사 제조)로 여과한 후에 분석에 이용하였다. 유기산 분석은 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 부티르산 함량을 분석하였으며, 상기 표 3에 나타낸 것과 동일한 분석 조건을 이용하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
No. substrate tR Quantity
1 control 1 28.92 36745.41
2 1-GB3 28.85 16629.96
3 control 2 28.81 15264.24
4 2-GB3 28.74 8703.83
5 control 3 28.68 8417.54
6 3-GB3 28.63 5869.12
7 control 4 28.60 4478.57
8 4-GB3 28.55 1785.93
상기 표 9에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 브레비스(GB3)를 접종하여 배양시킨 은행 외과피 발효물이 대조군에 비해 모든 실험군에서 부티르산의 함량이 감소하였음을 확인할 수 있다.
3-2. 세포 생존율의 측정
세포 생존율은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich사 제조) 측정을 통해 분석하였다. Raw 264.7 cell을 96 well plate에 2 x 105 cells/mL 농도로 분주하고 24 시간 배양한 후, 500 μg/mL로 은행 외과피 발효물을 50 μg/mL의 농도로 처리한 다음 20시간 동안 배양하였다. well의 media를 모두 제거한 뒤 5 mg/mL 농도의 MTT 시약을 무혈청 DMEM과 혼합한 뒤 well 당 200 μL씩 분주하고 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 상등액을 제거하고 DMSO를 첨가하여 세포를 용해시킨 후 MTT 환원에 의해 생성된 포르마잔을 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
MTT 분석을 통한 세포 생존율을 평가한 결과는 도 1에 나타내었다. 락토바실러스 브레비스(1-GB3, 2-GB3, 3-GB3, 4-GB3)를 기질에 접종시켜 배양한 은행 외과피 발효물은 모두 100% 이상의 세포 생존율을 보였다.
3-3. NO 생성량의 확인
배양액에서의 산화질소 생성은 산화질소의 산화물인 아질산의 측정을 통해 평가하였다. Griess 분석 방법을 이용하였으며 Raw 264.7 cell 세포를 96 well plate에 2 x 105 cells/mL 농도로 분주하고 24 시간 배양한 뒤, Raw 264.7 cell에서 선별된 시료를 500 μg/mL으로 제조하여 50 μg/mL의 농도로 처리한 다음, 20시간 동안 배양하였다. 배양 후 상등액 50 μL를 새로운 96-well plate에 옮긴 후 griess 시료(Sigma-Aldrich사 제조)와 1:1로 혼합하여 넣고 셰이커(shaker)에서 10분 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기(infinite M200 Pro, Tecan사 제조)를 이용하여 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 표준곡선(standard curve)은 아질산나트륨(sodium nitrite)를 이용하여 측정하였다.
LPS 처리군 대비 시료의 NO 생성량을 측정한 결과는 도 2에 나타내었다. 특히, 락토바실러스 브레비스(1-GB3, 2-GB3)를 기질에 접종시켜 배양한 은행 외과피 발효물은 대조군 1 및 2에 비해 높은 NO 생성능을 나타내었다.
4. 첨가물이 혼합된 은행 외과피 발효물
4-1. 첨가물을 혼합시킨 은행 외과피 발효물의 제조
은행 외과피 10%가 첨가된 배지에 중탄산칼슘(CaHCO3) 0.03%, 0.25%, 0.5%, 중탄산칼륨(KHCO3) 0.05%, 0.5%, 1%, 중탄산나트륨(NaHCO3) 0.05%, 0.5%, 1%를 각각 혼합시킨 후, 이렇게 제조된 은행 외과피 배지 각각에 활성화된 락토바실러스 브레비스(GB3)를 접종하여 30℃의 온도에서 48시간 배양시켜 은행 외과피 발효물을 제조하였다.
4-2. 부티르산의 함량 분석
첨가물이 혼합된 은행 외과피 발효물을 4,000 rpm, 4℃, 10분간 원심분리하여 회수한 상징액을 HPLC용 메탄올로 1:9 (w:v)의 비율로 희석한 후, 0.2 ㎛ PVDF 시린지 필터(Whatman사 제조)로 여과한 후에 분석에 이용하였다. 유기산 분석은 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 부티르산 함량을 분석하였으며, 상기 표 3에 나타낸 것과 동일한 분석 조건을 이용하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
No. 접종균주 조성 첨가물 첨가물
함량(%)		 균수확인 (cfu/ml) butyric acid 함량확인
(ppm)
1 Lactobacillus brevis
(GB3)		 은행
외과피
10%
첨가		 무첨가 - 10.55 36,881
2 CaHCO3 0.03 9.71 7,688
3 CaHCO3 0.25 10.23 7,126
4 CaHCO3 0.5 9.98 6,957
5 KHCO3 0.05 8.32 11,424
6 KHCO3 0.5 8.26 12,516
7 KHCO3 1 8.33 10,479
8 NaHCO3 0.05 10.64 13,237
9 NaHCO3 0.5 10.46 12,487
10 NaHCO3 1 9.94 12,364
상기 표 10에 나타난 바와 같이, 첨가물을 첨가한 모든 경우의 은행 외과피 발효물에서의 부티르산 함량이 첨가물을 첨가하지 않은 경우보다 감소된 것을 확인할 수 있으며, 특히, CaHCO3 0.25% 및 0.5%를 첨가한 경우, 발효물의 부티르산 함량이 가장 큰 폭으로 감소하였다.
한국미생물보존센터 KFCC11585P 20140609

Claims (18)

  1. 은행 외과피에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하여 발효시키는 것을 포함하는 은행 외과피의 혐오취를 저감시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 락토바실러스 브레비스가 락토바실러스 브레비스 KFCC11585P인 것을 특징으로 하는, 은행 외과피의 혐오취를 저감시키는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    은행 외과피 중 부티르산(butyric acid), 헥산산(hexanoic acid), 또는 부티르산 및 헥산산의 함량을 저감시키는 것을 특징으로 하는, 은행 외과피의 혐오취를 저감시키는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    은행 외과피 중 휘발성 유기산의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 은행 외과피의 혐오취를 저감시키는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 휘발성 유기산이 아세트산, 포름산, 또는 아세트산 및 포름산인 것을 특징으로 하는, 은행 외과피의 혐오취를 저감시키는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    락토바실러스 브레비스를 접종시키기 전에, 은행 외과피에 중탄산나트륨, 중탄산칼륨 및 중탄산칼슘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 첨가물을 혼합하는 것을 특징으로 하는, 은행 외과피의 혐오취를 저감시키는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    은행 외과피 발효물의 전체 중량을 기준으로 하여 0.25 중량% 내지 0.5 중량%의 중탄산칼슘을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 은행 외과피의 혐오취를 저감시키는 방법.
  8. 은행 외과피에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하여 발효시키는 것을 포함하는 은행 외과피 발효물을 제조하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 락토바실러스 브레비스가 락토바실러스 브레비스 KFCC11585P인 것을 특징으로 하는, 은행 외과피 발효물을 제조하는 방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    은행 외과피 중 부티르산(butyric acid), 헥산산(hexanoic acid), 또는 부티르산 및 헥산산의 함량이 저감되는 것을 특징으로 하는, 은행 외과피 발효물을 제조하는 방법.
  11. 제 8항에 있어서,
    은행 외과피 중 휘발성 유기산의 함량이 증가되는 것을 특징으로 하는, 은행 외과피 발효물을 제조하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 휘발성 유기산이 아세트산, 포름산, 또는 아세트산 및 포름산인 것을 특징으로 하는, 은행 외과피 발효물을 제조하는 방법.
  13. 제 8항에 있어서,
    락토바실러스 브레비스를 접종시키기 전에, 은행 외과피에 중탄산나트륨, 중탄산칼륨 및 중탄산칼슘으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 첨가물을 혼합하는 것을 특징으로 하는, 은행 외과피 발효물을 제조하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    은행 외과피 발효물의 전체 중량을 기준으로 하여 0.25 중량% 내지 0.5 중량%의 중탄산칼슘을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 은행 외과피 발효물을 제조하는 방법.
  15. 제 8항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 은행 외과피 발효물.
  16. 제 15항의 은행 외과피 발효물을 유효성분으로 함유하는, 암 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  17. 제 15항의 은행 외과피 발효물을 유효성분으로 함유하는, 면역력 증진용 건강기능식품.
  18. 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KFCC11585P.
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