KR20150102515A - 제주 조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제주조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방, 치료, 또는 개선용 조성물에 관한 것이며, 본 발명은 염증성 장질환에 대한 염증 억제 효과를 가짐으로써 염증성 장질환 예방, 치료 또는 개선에 우수한 효과를 보인다.

Description

제주 조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방, 치료, 또는 개선용 조성물{Composition for the prevention, treatment or improvement of Inflammatory Bowel Disease comprising extract of Sasa quelpaertensis Nakai}
본 발명은 제주 조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방, 치료, 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)은 대장 및 소장의 점막에 만성적인 염증 또는 궤양이 야기되어, 장기적으로 설사, 혈변이 계속되고, 재발을 반복하는 난치병이다.
염증성 장질환은 위장관의 만성적인 염증성 질환으로 개발도상국에서 이환율이 증가하고 있다(Molodecky, Soon, Rabi, Ghali, Ferris, Chernoff, et al., Increasing incidence and prevalence of the inflammatory bowel diseases with time, based on systematic review, Gastroenterology, 142(1), 46-54 e42; quiz e30, 2012).
염증성 장질환은 환경적 인자, 유전적 및 면역의 인자에 의해 유발될 수 있으며(Kitahora, T., Familial prevalence of inflammatory bowel disease, Nihon Rinsho, 70 Suppl 1, 44-47, 2012, Lowe, A. M., Roy, P. O., M, B. P., Michel, P., Bitton, A., St-Onge, L., & Brassard, P. Epidemiology of Crohn's disease in Quebec, Canada. Inflamm Bowel Dis, 15(3), 429-435, 2009), 염증성 장질환의 정확한 병인(etiology) 불명확한 것으로 남아있다(Toumi, R., Abdelouhab, K., Rafa, H., Soufli, I., Raissi-Kerboua, D., Djeraba, Z., & Touil-Boukoffa, C. (2013). Beneficial role of the probiotic mixture Ultrabiotique on maintaining the integrity of intestinal mucosal barrier in DSS-induced experimental colitis. Immunopharmacol Immunotoxicol, 35(3), 403-409).
염증성 장질환은 임상적으로 유사하면서도 조직학적 소견과 내시경 및 면역학적 측면에서 서로 다른 궤양성 대장염 및 크론병의 두 가지 질환으로 분류되며, 이러한 염증성 장질환은 염증성 매개 인자와 면역세포의 활성화가 중요한 병인인 것으로 알려져 있다.
궤양성 대장염(ulcerative colitis)이란, 대장에 염증이 발생하여 궤양을 형성하는 만성 질환으로, 출혈성 설사나 복부의 격한 통증, 발열을 수반하는 발작을 일으킨다. 크론병(Crohn's disease)은 국한성 장염 또는 육아종성 회장염이나 회결장염 이라고도 하여, 장벽에 발생하는 만성 염증으로 소화관의 어느 부위에도 발생한다.
장면역계의 지속적이거나 부적절한 활성화는 만성 점막성 염증의 병리생리에서 중요한 역할을 하며, 특히 호중구, 대식세포, 림프구 및 비만세포의 침윤에 의해 결국 점막 파괴 및 궤양을 초래한다.
또한, 침윤되고 활성화된 호중구는 활성산소질소종의 중요한 원인이 되며, 이러한 활성종은 세포독성 물질로서 가교 단백질, 지질 및 핵산에 의해 세포성 산화 스트레스를 유도하고 상피성 기능장애 및 손상을 초래한다.
활성 산소 종을 포함하는 염증성 매개인자의 증가와 유도형 산화질소합성효소(inducible nitiric oxide synthase, iNOS) 또는 시클로옥시게나아제(cyclooxygenase, COX-2) 단백질에 대한 상향 조절(up-regulation)은 면역 조절장애에 중요한 역할을 한다(Braus, N. A., & Elliott, D. E. Advances in the pathogenesis and treatment of IBD, Clin Immunol, 132(1), 1-9, 2009, Coskun, M., Troelsen, J. T., & Nielsen, O. H., The role of CDX2 in intestinal homeostasis and inflammation, Biochim Biophys Acta, 1812(3), 283-289, 2011, Kolios, G., Valatas, V., & Ward, S. G., Nitric oxide in inflammatory bowel disease: a universal messenger in an unsolved puzzle, Immunology, 113(4), 427-437, 2004).
한편, 미토겐-활성화 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)는 전사 인자 활성화에 포함되는 신호 경로이며, 핵 전사 인자-카파 B(Nuclear transcription factor-kappa B, NF-κB)는 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 활성화의 조절에 역할을 하고, 궤양성 대장염 발명에 중요한 역할을 한다(Wei, J., & Feng, J., Signaling pathways associated with inflammatory bowel disease. Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov, 4(2), 105-117, 2010).
또한, NF-κB 활성화는 IκB 키나아제(IκB Kinase)에 의한 IκB(inhibitor-κB)의 유도에 기초할 수 있으며, 퍼옥시좀 증식 활성화 수용체 감마(PPARγ)은 결장(colon)에서 많이 발현되는 핵 수용체이고, NF-κB 활성화와 발현은 PPARγ에 의해 조절될 수 있다(Wahli, W. (2008). A gut feeling of the PXR, PPAR and NF-kappaB connection. J Intern Med, 263(6), 613-619).
염증성 장질환이 있으면 장관의 점막에서 다양한 염증성 사이토카인들이 분비되고, TNF-α는 궤양성 대장염 환자의 대장 루멘과 대장 상피세포에서 높게 나타나며, 최근 연구에 의하면, TNF-α는 궤양성 대장염의 병인으로 중요한 역할을 한다고 알려졌다. 항-TNF-α 항체인 인플릭시맵(infliximab)은 종기의 치료 뿐 아니라, 기존에 치료되지 않던 크론병의 치료에 효과적이라고 알려졌다. 그러나, 이러한 치료법은 비용이 많이 들고, 일부 환자에게서는 수액 반응 또는 전염성 합병증과 같은 부작용이 야기된다.
염증성 장질환 치료제로는 통상의 설사 치료제 등은 유효하지 않으며, 현재 염증성 장질환 치료제로는 프로스타글란딘(prostaglandins)의 생성을 차단하는 5-아미노살리실산(5-aminosalicylic acid; 5-ASA) 계통 약물 예를 들어, 설파살라진 등을 이용하거나 스테로이드류의 면역억제제를 사용하고 있다.
설파살라진(sulfasalazine)은 복부허실(fullness), 두통, 발진, 간질환, 백혈구 감소증, 무과립구증, 남성 불임 등과 같은 부작용 또는 역효과를 일으키기 쉽다. 또한, 설파살라진이 장의 환부를 절개한 환자 또는 차도가 있는 환자에게 충분한 재발 억제 효과가 있는지는 불분명하다.
스테로이드류의 면역억제제는 부신피질 스테로이드로서, 단기적인 효과는 인정받고 있지만, 장기적인 예후를 향상시킬 수는 없으며, 유도된 감염성 질환, 2차 부신피질 부전증, 소화성 궤양, 당뇨병, 정신장애, 스테로이드성 신장병 등과 같은 부작용의 측면에서 단지 급성인 경우에만 사용되어야 하는 한계가 있다.
한편, 천연 추출물 및 이를 이용한 제형들이 기침, 감기에서부터 기생충 감염 및 염증에 이르는 다양한 질환을 완화하고 치료하는데 사용되어 왔다. 오늘날 시장에서 이용되는 항암제의 60% 이상 그리고 감염성 질환의 75% 이상이 천연물에서 기원하고 있다. 이는 천연물이 매우 다양하며 높은 특이적인 생리적 활성을 제공하기 때문이다.
그러나, 염증성 장질환에 대해 아직까지 신뢰할 만한 치료요법은 없으며 이러한 질환에 대해 효과적인 치료제 또는 건강기능식품의 개발이 요구되고 있고, 이를 위하여 염증성 장질환에 유용한 천연 추출물이 필요하다.
한국등록특허 제10-1332909호, 2013. 11. 19 한국등록특허 제10-1180546호, 2012. 08. 31
Gastroenterology, 142(1), 46-54 e42; quiz e30, 2012 Nihon Rinsho, 70 Suppl 1, 44-47, 2012 Inflammatory Bowel Diseases, 15(3), 429-435, 2009 Immunopharmacol Immunotoxicol, 35(3), 403-409), 2013 Clin Immunol, 132(1), 1-9, 2009 Biochim Biophys Acta, 1812(3), 283-289, 2011 Immunology, 113(4), 427-437, 2004).
본 발명의 목적은 제주조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 염증성 장 질환 예방, 치료 또는 개선 효과를 가지는 천연물 의약품을 개발하고자 연구한 결과, 제주조릿대 추출물이 염증성 장 질환 예방, 치료 또는 개선에 뛰어난 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제주조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제주조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 유효성분은 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명에서 제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai)는 한라산 일대에서만 제한적으로 분포하는 지역 고유종으로 분포지 내에서 대규모의 군락을 이루어 생육하고 있으며, 내륙 지방의 조릿대와는 형태상의 특징으로 구별된다.
본 발명에서 제주조릿대는 속씨식물, 외떡잎식물, 벼목에 속하며, 녹색의 줄기는 털이 없고 마디가 자주색으로 도드라진다. 장타원형의 잎은 길이 7~20cm, 폭 15~20cm 정도이다. 털이 없는 표면은 연녹색을 띄고 뒷면은 회록색으로 약간의 털이 있다. 꽃은 원추화서로 달리는데 6~7년 주기로 핀다. 열매는 영과로 먹을 수 있다. 가지가 갈라지지 않고 마디가 공처럼 둥글며 털이 없는 것이 조릿대와 다르다.
본 발명에서 제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai)는 대한민국, 일본 중국 등의 국내외 시장에서 구입하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 제주조릿대는 한라산 일대에서만 제한적으로 분포하는 지역 고유종일 수 있다.
본 발명에서 염증성 질환은 외부의 물리화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염 또는 다른 원인에 의한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포의 활성화에 의할 수 있으며, 이와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증성 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타날 수 있다.
본 발명에서 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 가질 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다.
또한, 본 발명에서 상기 염증성 질환은 염증성 장질환을 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 또는 크론병(Crohn's disease)일 수 있다.
본 발명에서 제주조릿대 추출물은 염증성 장질환의 염증 반응을 억제함으로써 염증성 장질환의 예방 및 개선 효과를 가진다.
본 발명에서 상기 제주조릿대 추출물은 p-ERK 단백질, p-JNK 단백질, 또는 p38 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질 발현의 억제를 포함하는 미토겐-활성화 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)의 신호전달을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 제주조릿대 추출물은 염증성 지표 단백질인 시클로옥시게나아제(cyclooxygenase, COX-2) 단백질 또는 유도형 산화질소합성효소(inducible nitiric oxide synthase, iNOS) 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질 발현을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 제주조릿대 추출물은 염증성 매개인자인 산화질소(NO, nitric oxide) 또는 TNF-α 분비 중 어느 하나 이상을 억제할 수 있다.
본 발명에서 제주조릿대 추출물은 p-쿠마린산(p-coumaric acid) 또는 트리신(tricin) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 제주조릿대 추출물은 농축된 액상일 수도 있고, 동결건조된 분말형태일 수도 있다.
본 발명에서 제주조릿대 추출물은 천연물인 제주조릿대로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미한다.
본 발명에서 제주조릿대 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 제조할 수 있으며, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매의 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함할 수 있다. 또한, 상기 추출물은 상기 추출과정을 거친 추출액을 분획한 것도 포함할 수 있다.
본 발명에서 제주조릿대 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올 및 이소프로판올 등을 포함하는 탄소수 1 내지 5의 무수 또는 함수의 저가 알코올, 아세트산, 아세톤, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 극성용매, 헥산, 시클로헥산, 디에틸에테르, 클로로포름 등의 비극성용매, 또는 이들의 혼합 용매로 추출할 수 있다.
본 발명에서 제주조릿대 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수의 저가 알코올 또는 이들의 혼합용매일 수 있으며, 특히는 물, 50 내지 100%의 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올일 수 있으며, 더욱 특히는 50 내지 100%의 에탄올일 수 있다.
본 발명에서 제주조릿대 추출물은 15∼120℃에서 1∼72시간 동안 추출할 수 있으며, 1 내지 5회 반복하여 추출할 수 있으며, 특히, 실온(15~20℃)에서 48시간 동안 1 내지 5회 반복하여 추출할 수 있다.
본 발명에서 제주조릿대 추출물은 상기 추출물에서 추출 용매를 감압농축기로 농축하여 수득할 수 있다.
또한, 상기 열거한 추출용매에 공지된 열수추출법, 냉침추출법, 초음파 추출법, 환류냉각 추출법 또는 가열추출법 등을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명에서 제주조릿대 추출물은 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 90 중량부로 포함할 수 있다.
본 발명에서 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명에서 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 이때 식품학적으로 허용 가능한 첨가제로는 당류, 향미제, 방부제, 착색제, 부형제, 결합제, 활택제, 윤활제 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명에서 약제학적으로 허용 가능한 첨가제 또는 식품학적으로 허용 가능한 첨가제는 제주조릿대 추출물 100 중량부에 대해 0.1 ~ 90중량부로 포함할 수 있다.
본 발명에서 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여할 수 있는데, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 제주조릿대 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calciumcarbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제를 포함할 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 선택할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명에서 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 제주조릿대 추출물의 양을 기준으로 0.1 내지 500 ㎎/㎏으로 투여할 수 있으며, 특히, 100 내지 400 ㎎/㎏으로 투여할 수 있으며, 더욱 특히, 200 내지 400㎎/㎏으로 투여할 수 있으며, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량의 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명에서 제주조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 단독으로 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 병용하여 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 상기 제주조릿대 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 면류, 껌류, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함할 수 있다.
상기 외에 본 발명에서 제주조릿대 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 제주조릿대 추출물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 제주조릿대 추출물을 포함하는 조성물은 염증성 장질환에 있어 염증 억제 효과를 가짐으로써, 염증성 장질환의 예방, 치료 또는 개선에 효과적이다.
도 1은 제주조릿대 추출물에서의 (A) p-쿠마린산(p-coumaric acid)과 (B) 트리신(tricin)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vitro 모델에서 (A) 산화질소(NO), (B) PGE2, (C) IL-1β, 및 (D) IL-6 생산에 대한 영향을 나타낸다.
도 3은 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vitro 모델에서 (A) iNOS 단백질, (B) COX-2 단백질 발현에 대한 영향을 나타낸다.
도 4는 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vivo 모델에서 (A) 몸무게 변화 (B), (C)대장 길이에 대한 영향 및 (D) 질병활성지수(DAI score)를 나타낸다.
도 5는 제주조릿대잎 추출물의 투여에 따른 in vivo 모델에서 조직형태학적 변화를 나타낸다.
도 6은 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vivo 모델에서 세포분열마커 PCNA에 대한 영향을 나타낸다.
도 7은 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vivo 모델에서 (A), (B)염증성 매개인자인 TNF-α와 염증성 지표 단백질인 (C) iNOS 단백질, (D) COX-2 단백질에 대한 영향을 나타낸다.
도 8은 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vivo 모델에서 신호전달 단백질인 (A) p-ERK 단백질, (B) p-JNK 단백질, (ｃ) p-p38 단백질,（D) IκBα 인산화 (E) PPAR-γ 단백질에 대한 영향을 나타낸다.
도 9는 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vivo 모델에서 염증성 매개인자인 TNF-α mRNA 발현에 대한 영향을 나타낸다.
이하, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
<실시예1> 제주조릿대 추출물의 제조
제주조릿대(Sasa quelpaertensis) 잎 1kg(원산지: 제주도의 한라산)을 세척, 건조하여 70% 에탄올로 실온(RT)에서 48시간동안 추출하였다. 상기 추출물의 여과액을 40℃에서 농축기(모델명:R-200, 제조사:BUCHI)로 감압 농축 후, 동결건조하여(모델명:PVTFD10A, 제조사((주)일신랩) 분말상태로 제주조릿대 추출물 117g(수율12%)을 제조하였다.
<실시예2> 제주조릿대잎 추출물의 지표성분 분리 및 분석
상기 실시예 1에 따른 제주조릿대잎 에탄올 추출물 중에서 p-쿠마린산(p-coumaric acid)과 트리신(tricin)을 HPLC-PDA 시스템(2695 Alliance system, Waters Corp., Milford, MA, USA)을 통해 분리하였다.
제주조릿대 추출물(SQE)의 정량적인 분석은 30℃에서 Sunfire RP 18 컬럼(column) (4.6 mm ㅧ 250 mm, ID; 5μm)을 이용하여 수행하였다.
상기 HPLC 분리는 검체(SQE) 10㎕를 컬럼에 주입하였고, 컬럼의 온도는 35℃로 유지하였고, 이동상의 유속은 0.8 mL/min으로 유지하였다.
상기 이동상은 (A) acetonitrile과 (B) 0.1% acetic acid를 함유하는 수층으로 구성되었고, 기울기 용리(gradient elution) 프로그램은 40분간 A:B (15:85)에서 (42.5:57.5)로 기울기 용리, 40.1분간 A:B (0.0:100)로 등용매성 용리하였고 이후 45분 동안 컬럼을 세척한 후 55분간 A:B (15:85)으로 기울기 용리하면서 컬럼을 초기 용매 조건으로 돌아와서 유속 0.8 mL/min으로 10분(min) 동안 유지하고, 상기 분리물(elute)을 200-600 nm에서 모니터하였다.
제주조릿대잎 추출물의 대표적인 물질인 p-쿠마린산(p-coumaric acid)과 트리신(tricin)을 HPLC-PDA 시스템을 통해 분석하였다. p-coumaric acid, tricin의 보존 시간(retention time)은 각각 11.175 분(min), 18.396 분(min)이며, 이 때 각각 유효성분의 함량은 1.13 mg/g과 0.82 mg/g인 것으로 분석 되었다(도 1).
<제조예1> 항염기능성을 규명을 위한 in vitro 모델 제조
제주조릿대의 항염기능성을 규명하기 위한 in vitro 실험을 위해 대장암세포 Caco2 세포(출처:한국세포주은행)를 Transwell (4.67 ㎠, 0.4 μm pore size, Corning CoStar Corp., Cambridge, MA) 1 well 당 3.75 × 105개를 넣어준 뒤, 세포의 배지(medium)를 3일에 한번 씩 교체해 주며 세포(cell)가 가득 찬 상태에서 21일을 키우고 (TER value >1200 Ω ㎠을 이용하여 측정) 분화시킨 후, RAW264.7 세포 (DMEM+10%FBS+1%P/S)을 1 well 당 8.5 × 105 세포를 6-well plate에 넣어주고 세포가 완전히 바닥에 붙게 인큐베이터 안에서(37℃, 5% CO2 대기상태로 유지) 오바나잇(overnight)시켰다. 이후 RPMI1640 (10%FBS+1%P/S) 배지로 교체한 후 분화시킨 Caco-2 세포가 있는 Trasnsell에 합쳐 준 다음, 조릿대를 처리한 후 3시간 후에 LPS(1㎍/mL)로 Raw264.7을 자극시켜 염증반응을 유도함으로써 실제 인체 내의 대장과 비슷한 환경을 조성하였다. 이후, 세포실험에서 일반적으로 염증을 유도하는데 널리 이용되는 LPS를 처리하여 염증 반응을 유도하였다.
<실시예3> 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vitro 모델의 염증성 매개인자 혈중 분비 분석　
상기 in vitro 모델에 조릿대잎 추출물을 100 μg/ml, 200 μg/ml, 400 μg/ml 농도별로 처리한 후, 세포 배양액에서 여러 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)을 측정하여 세포가 분비하는 염증성 매개 인자의 정도를 비교하였다.
염증반응에 관여하는 가장 중요한 인자인 NFκB가 활성화됨에 따라 수많은 염증전성 사이토카인(proinflammatory cytokines)을 촉진시키는데, 대표적인 예로 COX-2, iNOS, IL-6, TNF-α, IL-1β 등이 있으며, 활성화 된 COX-2와 iNOS는 각각 PGE2를 활성화(activation)시킨다.
LPS로 염증이 유도되어 NFκB가 활성 됨에 따라 함께 증가하게 되는 여러 염증성 매개인자 가운데 NO, PGE2, IL-1β, IL-6의 분비를 측정하였다.
(1) 산화질소 (Nitric oxide, NO)측정
제조예1에서 제조한 공생배양 배지(Co-culture media)에서 제주조릿대잎 추출물(SQE)와 LPS (1㎍/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였고, 생성된 NO는 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다. 세포배양 상층액 100㎕와 Griess 시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 2.5% (v/v) phosphoric acid 내에 0.1% (w/v) naphylethylenediamine]을 동량 혼합하여 5분간 실온 암소에서 반응시킨 후 ELISA 리더기(reader)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite (NaNO2)를 순차적 희석(serial dilution)하여 얻었다 (1-100uM).
NO를 측정한 결과 LPS로 염증을 유도한 군에서 NO의 활성이 유의적으로 증가하였고, 조릿대잎 추출물을 처리한 모든 군에서 LPS 대조군에 비해 NO 활성이 감소하였다(도 2A). 특히 LPS 대조군, 조릿대잎 추출물 100 μg/ml, 조릿대잎 추출물 200 μg/ml 세 군은 용량 의존적(dose dependent)으로 감소하였다.
조릿대잎 추출물 400μg/ml 안에 함유된 것과 같은 농도의 두 가지 지표물질 tricin, p-coumaric acid을 처리한 co-culture media에서 NO측정한 결과 LPS로 염증을 유도한 군에 비해서 조릿대잎 추출물 400μg/ml를 처리한 군에서 모두 NO 활성이 유의적으로 감소하였다.
(2) PGE2, IL-1β, 및 IL-6 측정
제조예1에서 제조한 공생배양 배지(Co-culture media)에서 제주조릿대잎 추출물(SQE)와 LPS (1㎍/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 인큐베이션 시킨 후 얻어진 상층액으로 PGE2, IL-1β, 및 IL-6의 함량을 측정하였다. 정량은 ELISA kit(PGE2 cat:KGE004B, IL-6 cat:M6000B, IL-1β cat:MLB00C)를 R&D system (Minneapolis, USA)에서 구입하여 이용하였다.
1) PGE2측정 결과 :　LPS로 염증을 유도한 군에서 증가한 PGE2활성은 조릿대를 처리함으로써 감소하였으며, 조릿대잎 추출물 200 μg/ml, 400 μg/ml 처리한 군은 조릿대잎 추출물을 처리하지 않은 그룹에 비해 통계적으로 유의하게 감소하였다(도 2B).
2) IL-1β측정 결과 : LPS에 의해 증가된 IL-1β는 조릿대잎 추출물을 처리함에 따라 감소하였으며, 특히 조릿대잎 추출물 200 μg/ml, 400 μg/ml 농도를 처리한 군은 LPS로 염증을 유도하지 않은 대조군 수준까지 유의적으로 IL-1β의 수준을 억제하였다(도 2C).
3) IL-6측정 결과 : 염증반응에서 염증전(pro-inflammatory) 인자로 중요한 역할을 하는 IL-6의 분비는 조릿대잎 추출물의 처리에 따라 감소하였으며, 특히, 조릿대잎 추출물 200 μg/ml와 400 μg/ml 농도를 처리한 군은 LPS 대조군과 유의적 차이를 보였다(도 2D).
<실시예4> 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vitro 모델의 염증성 지표의 단백질 발현 분석
제조예1에서 제조한 공생배양 배지(Co-culture media)에서 Caco-2 장 상피세포에 제주조릿대잎 추출물(SQE)을 처리하고 RAW264.7 대식세포에 LPS (1㎍/mL)를 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척한 후 세포를 얻어 원심분리하여 펠릿(pellet)에 용해 버퍼(lysis buffer)를 가하여 얼음에 배양(incubation) 후 13,000 rpm으로 15분 동안 원심분리 하여 상등액을 모았다. 모은 상등액은 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 사용하여 단백질을 정량하였다. 단백질 20 μL을 5ㅧ샘플 버퍼(sample buffer)에 넣고 100℃에서 5분간 불활성화 시킨 후 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에 전기영동 하였다. 분리된 단백질은 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF) 막(membrane)으로 트랜스 블랏팅(transblotting) 한 후 5% 탈지 분유(non-fat dry milk)에서 90분 동안 블랏팅(blocking)하였다. iNOS, COX-2, anti-IκBα, anti-PPAR-γ (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-p38, p38, anti-pJNK, JNK, anti-pERK, ERK (Cell signaling, Danvers, MA, USA)와 α-tubulin (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 항체는 각각 4℃에서 오버나잇(overnight)시켰다. TBST(트리스-완충 식염수 트윈-20(Tris-buffered saline Tween-20)) 버퍼(buffer)로 10분간 3회 세척(washing)하였고 2차 항체는 토끼(rabbit) 1:5,000, 마우스(mouse) 1:2000의 비율로 희석하여 2시간 상온에서 부착시켰다. TBST 버퍼(buffer)로 10분간 3회 세척(washing)한 막(membrane)에 ECL(증강 화학 발광(enhanced chemiluminescence)) (Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway, NJ, USA)을 처리하여 확인하였다. 염증성 지표의 단백질 발현을 측정하기 위하여 웨스턴 블랏(western blot) 실험을 수행하였다.
(1) iNOS 단백질 발현 측정 결과 : 조릿대잎 추출물 100 μg/ml에서는 iNOS 억제 효과가 거의 없었으나, 200 μg/ml, 400 μg/ml 농도에서는 용량 의존적(dose dependent)으로 iNOS 단백질 발현이 감소되었다(도 3A).
(2) COX-2 단백질 발현 측정 결과： LPS에 의해 발현된 COX-2를 억제하는 효능은 조릿대 100 μg/ml에는 거의 효과가 없었으나 200 ug/ml와 400 μg/ml 농도에서는 발현을 감소시켰다(도 3B).
<제조예 2> 마우스 모델에서 만성 염증성 장질환 유도
4주령 웅성 마우스(C57BL/6)을 중앙 실험실 동물 회사(Jung-Ang Lab Animal Inc) (서울l, 한국)에서 구입하여 1주일의 적응기간을 거친 후, a) 염증을 유도하지 않은 정상 대조군, b) DSS(dextran sulfate sodium) (분자량 36000-50000, MP Biomediacls, Costa Mesa, CA, USA) 염증유도군, c) DSS+SQE 100 mg/kg b.w.(body weight), d) DSS+SQE 300 mg/kg b.w., e) DSS+설파살라진(sulfasalazine) 100 mg/kg (약물 대조군)으로 총 5군을 각 8마리로 구성하여 실험 그룹으로 하였다.
상기 b) DSS 염증 유도군은 2.5% DSS가 포함된 식수를 7일간 공급하고, 그 후, 7일은 일반 식수, 그 후 다시 7일간 2.5% DSS가 포함된 식수를 공급하는 사이클(cycle)을 반복하여 만성염증 장질환을 유도하였다.
상기 c), d) 조릿대군들은 조릿대잎 추출물을 투여하기 시작한 14일 후에 2.5% DSS가 포함된 식수를 7일간 공급하고, 그 후, 7일은 일반 식수, 그 후 다시 7일간 2.5% DSS가 포함된 식수를 공급하는 사이클을 반복하여 만성염증 장질환을 유도하였다. 상기 c), d) 조릿대군들은 조릿대잎 추출물(SQE)을 각각 총 35일(35d) 동안 경구 투여하였다.
상기 e) 약물대조군은 2.5% DSS가 포함된 식수를 7일간 공급하고, 그 후, 7일은 일반 식수, 그 후 다시 7일간 2.5% DSS가 포함된 식수를 공급하는 사이클을 반복하여 만성염증 장질환을 유도하였고, DSS를 투여하기 시작 한 후 21일(21d) 동안 설파살라진(sulfasalazine) 100 mg/kg b.w.을 투여하였다.
<실시예5> 제주조릿대잎 추출물의 투여에 따른 in vivo 모델의 임상적 변화 분석
(1) 몸무게 변화
총 4주의 실험기간 동안 동물 몸무게의 변화를 측정하였다. DSS를 이용해 대장염을 유도하지 않은 대조군에 비해서 DSS로 대장염을 유도한 나머지 군에서 몸무게가 감소되는 경향을 보였으며 이는 대장의 염증으로 인한 증상으로 판단되었다. 특히, 항생제를 처리한 설파살라진(SSZ)군 이외의 DSS 대조군, DSS와 조릿대잎 추출물을 경구투여한 군은 DSS유도하지 않은 대조군군과 비교했을 때 유의적으로 몸무게 감소가 일어난 것으로 측정되었다(도 4(A)).
(2) 대장 길이
DSS로 대장 염증을 유발한 DSS군의 경우 염증을 유도하지 않은 군에 비해서 대장의 길이가 짧았고, 장 출혈의 흔적도 육안으로 확인할 수 있었다(도 4(B)).
또한, 조릿대잎 추출물을 경구투여한 군의 경우, 대장의 길이가 DSS만 투여한 군 보다 장 길이를 회복한 것으로 측정 되었고, 특히, 조릿대를 300 mg/kg b.w. 경구 투여시킨 군은 대장 염증을 유도하지 않은 수준까지 대장길이를 회복하였다(도 4(C)).
(3) 임상적 염증척도 분석
DSS로 유도된 만성 대장염의 심각도는 질병활성도(Disease Activity Index, DAI score)에 따라 평가되었다(Okayasu, Hatakeyama, Yamada, Ohkusa, Inagaki, & Nakaya, 1990).
실험기간 동안 주 3회에 걸쳐 대장 염증의 척도로 여겨지는 실험동물의 혈변 여부, 변의 농도와 몸무게 변화를 측정하여 이를 수치화(DAI score)하여 분석하였다.
DAI = (Stool consistency + Bleeding + Weight loss)/3
DSS로 대장염증을 유도하지 않은 대조군은 DAI score가 0점 이었고, DSS 대조군은 나머지 4개의 그룹과 비교했을 때 유의적으로 DAI score가 높았다(도 4(D)). 통계적 유의성 검증 결과 조릿대잎 추출물 100 mg/kg b.w., 300 mg/kg b.w.을 경구투여한 군에서는 항생제(SSZ)를 먹인 군과 비슷한 수준 까지 장의 염증 정도가 완화되는 결과를 얻었다.
<실시예6> 제주조릿대잎 추출물의 투여에 따른 in vivo 모델의 조직형태학적 변화 분석
대장의 조직형태학적 분석을 위해 해부 당시 포르말린에 고정된 대장의 헤마톡실린-에오진염색(hematoxylin-eosin stain)을 수행하였다.
DSS로 염증을 유도하지 않은 대조군은 정상적인 대장의 조직학적 구조(histological architecture)와 세포학(cytology)을 보였고(도 5(A-a)), DSS로 염증을 유도한 군은 장의 상피 층(epithelial layer)이 무너지고 경계를 잃었으며 극심한 염증에 따른 염증성 세포(inflammatory cells)의 침투를 관찰할 수 있었다(도 5(A-b)).
DSS로 염증을 유도한 군에서 보인 심각한 층(layer)과 조직형태학적 파괴는 조릿대잎 추출물 100 mg/kg b.w.(도 5(A-c)), 300 mg/kg b.w.(도 5(A-d)), 및 항생제인 설파살라진(SSZ) 100 mg/kg b.w(도 5(A-e))의 각각의 처리로 인해 완화되고 감소되었다. DSS로 염증을 유도한 군에 비해 조릿대잎 추출물과 항생제(SSZ)를 처리한 군에서는 염증의 징후(sign)가 적어지고, 상피세포와 크립트(crypt)의 재생(regeneration)이 관찰되었다((도 5(A-c,d,e)).
또한, 조직염색학적 분석에 근거하여 염증 정도를 점수화(Dieleman, Palmen, Akol, Bloemena, Pena, Meuwissen, et al., 1998)하여 비교한 결과, 조릿대잎 추출물과 항생제(SSZ)를 처리한 군에서 염증정도와 크립트 손상(crypt damage)이 DSS 군에 비해 회복된 것을 볼 수 있었다. 특히, 조릿대잎 추출물을 투여한 경우가 설파살라진(SSZ)만을 투여한 경우보다 전반적인 회복정도가 더 좋은 것으로 측정 되었다(도 5(B)).
<실시예7> 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vivo 모델의 세포분열마커의 변화 분석
마우스의 대장 조직 시험체를 면역염색 (Immunohistochemistry)하여 세포의 분열과 염증과정에 중요한 증식세포항원(Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA))의 발현을 분석하였다.
해부 당시 포르말린에 고정된 대장 조직을 탈파라핀, 수화 및 3% 과산화수소로 처리한 후 4℃에서 PCNA로 오버나잇(overnight)하였다(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). 이후, 상기 시험체 슬라이드를 항-마우스 IgG 항체로 처리하여 스트렙타아비딘-겨자무과산화효소(streptavidin-horseradish peroxidase) 반응시켜서 헤마톡실린(hematoxylin) 및 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine)으로 대비염색하여 시각화하였다.
도 6에서 알 수 있듯이 DSS로 염증을 유도한 군에서 PCNA의 발현이 대조군에 비해 크게 증가 한 것을 볼 수 있었고, 조릿대잎 추출물 300 mg/kg b.w.를 경구투여 한 군(도 6(A-d))과 항생제(SSZ)를 처리한 군(도 6(A-e))에서 PCNA의 발현이 통계적으로 유의하게 감소하였다.
<실시예8> 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vivo 모델의 염증성 매개인자 혈중 분비 분석
ELISA 키트(R&D System, Minneapolis, USA)를 사용하여 마우스 TNF-α의 혈중 분비를 분석하였다.
동물의 희생당시 분리한 혈청에서부터 측정한 TNF-α의 결과, DSS로 염증을 유도한 군에서 혈액 내의 TNF-α분비량이 유의적으로 많았으며, 제주조릿대잎 추출물 100 mg/kg b.w., 300 mg/kg b.w.와 항생제(SSZ)를 투여시킴으로써 염증을 유도하지 않은 군의 수준까지 TNF-α분비량이 감소하였다(도 7(A, B)).
<실시예9> 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vivo 모델의 염증성 지표의 단백질 및 신호전달 단백질의 발현 분석
마우스 대장 조직으로부터 분리한 단백질에서 염증성 지표의 단백질 발현과 염증반응 단계에 관여한다고 알려져 있는 유전자의 인산화 및 단백질 발현을 측정하기 위하여 웨스턴 블랏(western blot) 실험을 수행하였다.
대장 조직을 차가운(ice-cold) PRO-PREP 단백질 추출 용액(Intron Biotechnology, 서울, 한국)을 사용하여 균질화 하였다. 이를 원심분리 (12,000 g, 15 min, 4℃)하여 상청액을 모았다. 이를 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 단백질을 분리하였다. 상기 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF) 막으로 이동시켜서 특정 일차 항체와 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 특정 항체는 마우스 항-COX-2, 토끼 항-iNOS, 토끼 항-p-IκBα, 마우스 항-PPAR-γ(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), 토끼 항-p-ERK, 마우스 항-ERK. 마우스 항-p-JNK, 토끼 항-p-JNK, 토끼 항-p-p38, 및 토끼 p38(Cell signaling, Danvers, MA, USA)이다.
면역 측정(Immunodetection)은 강화된 화학발광(enhanced chemiluminescence, ECL) 웨스턴 블랏을 사용하여 수행되었다(Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA). α-튜불린(α-tubulin) (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 측정이 로딩 대조군으로 사용되었다.
(1) iNOS 단백질 발현
DSS로 염증을 유도한 군에서 iNOS 발현이 증가되어 염증이 유도됨을 확인할 수 있었고, 제주조릿대잎 추출물과 항생제(SSZ)를 투여한 군에서 유의적으로 감소하였다(도 7(C)).
(2) COX-2 단백질 발현
DSS로 염증을 유도한 군에서 COX-2가 발현되어 염증이 유도됨을 확인할 수 있었고, 제주조릿대잎 추출물과 항생제(SSZ)를 투여한 군에서 유의적으로 감소하였다(도 7(D)).
(3) p-ERK 단백질 발현
DSS로 염증을 유도한 군에서 ERK의 인산화가 크게 증가하였고 제주조릿대 잎 추출물과 항생제(SSZ)의 투여에 따라 감소하는 경향을 보였다(도 8(A)).
(4) p-JNK 단백질 발현
DSS로 염증을 유도한 군에서 p-JNK의 단백질 발현이 크게 증가하였고 제주조릿대잎 추출물과 항생제(SSZ)의 처리로 감소하는 경향을 보였다. 특히, 항생제인 설파살라진(SSZ)을 처리한 군보다도 제주조릿대잎 추출물 300 mg/kg b.w.을 처리한 군에서 JNK의 인산화가 더 큰 감소를 보였다(도 8(B)).
(5) p-p38 단백질 발현
DSS군에서 증가된 p38의 단백질 발현은 제주조릿대 잎 추출물과 항생제(SSZ)의 처리로 감소하는 경향을 보였다(도 8(C)).
(6) IκBα 인산화(phosphorylation)
NF-κB 저해제인 IκBα의 인산화가 DSS의 유도로 크게 증가하였고, 제주조릿대잎 추출물 처리에 의해 유의적으로 감소하였으며, 항생제(SSZ)를 처리한 군은 감소 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지 않았다(도 8(D)).
(7) PPAR-γ 단백질 발현
대장 염증을 조절하는 주요한 인자인 PPAR-γ의 단백질 발현이 DSS의 유도로 크게 증가하였고, 제주조릿대잎 추출물과 항생제(SSZ)를 각각 처리한 군 모두에서 유의적으로 감소하였다. 특히, 제주조릿대 추출물 300 mg/kg b.w.군을 투여한 군에서 PPAR-γ가 DSS로 염증을 유도하지 않은　정도까지 억제되었다(도 8(E)).
<실시예10> 제주조릿대잎 추출물 투여에 따른 in vivo 모델의 염증성 매개인자인 TNF-α의 mRNA 발현 분석
트리졸(Trizol) 시약(Invitrogen, CA, USA)을 사용해서 대장 조질으로부터 전체 RNA를 추출하였고, RevertAid™ First Strand cDNA 합성 키트(Fermentas, Vilnius, Lithuania)를 사용해서 1 μg 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. PCR 증폭은 94℃에서 5분 동안 초기 배양(incubation), 이어서 30초 동안 94℃에서 변성(denaturation), 60초 동안 57℃에서 어닐링(annealing), Taq 중합효소(TAKARA, Tokyo, Japan)를 사용해서 30초 동안 72℃에서 확장(extension)을 포함하였다.
상기 생성된 PCR 생성물은 브롬화 에티듐(ethidium bromide)을 함유하는 2% 아가로스 겔을 사용하여 분리되었다.
TNFα에 대한 상기 프라이머(primer)는 5'-ACTGGACCCTGGCTTTACTG-3'(정방향, 서열번호 1)과 및 5'-TCTGCT CTCCTTCTGTCGTG-3'(역방향, 서열번호 2)이다.
모든 샘플은 실험의 처리에 의해 영향을 주지 않는 항존유전자(housekeeping gene)인 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)에 의해 정상화되었다.
DSS로 대장 염증을 유도한 동물 모델의 대장세포에서 분리한 샘플로부터의 TNF-α의 mRNA를 측정하였다. DSS군에서 증가한 TNF-α mRNA 이 조릿대 추출물과 항생제(SSZ)의 경구투여로 감소하였으며, 통계적 검증 결과, 제주조릿대잎 추출물 100 mg/kg b.w.와 300 mg/kg b.w. 군에서 DSS를 유도하지 않은 대조군 수준까지 억제되었다(도 9(A, B)).
통계적인 분석 방법
각각의 군에서 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표현되었다. 통계적인 분석은 일원 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA), 이어서 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism), 3.0 버전(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)을 사용하는 Tukey's 사후 검증에 의해 수행되었다.
각각의 군들의 차이는 Duncan's의 다중비교검정(multiple-comparison test)을 사용하여 분석 되었다. P<0.05의 차이는 통계적으로 유의하다고 해석되었다.

Claims (10)

  1. 제주조릿대(Sasa quelpaertensis Nakai) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Disease) 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제주조릿대 추출물은 p-ERK 단백질, p-JNK 단백질, 또는 p38 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질 발현의 억제를 포함하는 미토겐-활성화 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)의 신호전달을 억제하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제주조릿대 추출물은 염증성 지표 단백질인 시클로옥시게나아제(cyclooxygenase, COX-2) 단백질 또는 유도형 산화질소합성효소(inducible nitiric oxide synthase, iNOS) 단백질 중 어느 하나 이상의 단백질 발현을 억제하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제주조릿대 추출물은 염증성 매개인자인 산화질소(NO, nitric oxide) 또는 TNF-α 분비 중 어느 하나 이상을 억제하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제주조릿대 추출물은 p-쿠마린산(p-coumaric acid) 또는 트리신(tricin) 중 어느 하나 이상을 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 또는 크론병(Crohn's disease)인 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제주조릿대 추출물은 제주조릿대를 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로판올 및 이소프로판올을 포함하는 탄소수 1 내지 5의 무수 또는 함수의 저가 알코올, 아세트산, 아세톤, 에틸아세테이트, 디클로로메탄, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 헥산, 시클로헥산, 디에틸에테르, 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 용매로 추출한 추출물인 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제주조릿대 추출물을 조성물 100 중량부에 대하여 0.1 내지 90 중량부 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제주조릿대 추출물의 투여량은 건조 중량 기준으로 1일에 0.1 내지 500 mg/kg인 염증성 장질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제주조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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WO2017176001A1 (ko) * 2016-04-05 2017-10-12 (주)아모레퍼시픽 제주조릿대 추출물을 포함하는 여성 갱년기 증상 개선용 조성물
KR20200137707A (ko) 2019-05-31 2020-12-09 공주대학교 산학협력단 신규 설파디아진 유도체 화합물 및 이의 용도

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