KR20230022384A - 적작약 추출물을 포함하는 호흡기 염증 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 - Google Patents

적작약 추출물을 포함하는 호흡기 염증 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 Download PDF

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김호준
임수경
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동국대학교 와이즈캠퍼스 산학협력단
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Abstract

본 발명은 적작약 추출물을 포함하는 호흡기 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 호흡기 염증 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것으로, 상기 적작약 추출물은 손상된 점막에서의 ERK pathway에 관여하여 뮤신의 과다생성 및 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고 손상된 점막의 세포간 밀착연접을 개선하여 호흡기 염증을 예방 또는 완화할 수 있으므로, 이러한 적작약 추출물을 포함하는 식품 조성물 및 약학 조성물을 통해 호흡기 염증 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

적작약 추출물을 포함하는 호흡기 염증 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물{Composition comprising extract of Paeoniae Radix rubra for preventing, treating or improving respiratory inflammatory disease}
본 발명은 적작약 추출물을 포함하는 호흡기 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물, 또는 호흡기 염증 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
호흡기에 존재하는 점액(mucus)은 점막에서 분비되는 점액성 당단백질(mucous glycoprotein)인 뮤신(mucin)을 포함한다. 뮤신은 물과 중성염용액에 녹기 어려우며, 산성에서는 녹지 않고 침전되나 알칼리성에서는 점성질의 액이 되므로, 점액의 물리화학적 특성에 영향을 준다. 정상 생리상태에서는 호흡기 내 점액의 점도(viscosity)가 적정하게 유지되며, 점액이 호흡기 내 이물질을 밖으로 배출하는 섬모세포의 운반작용을 도와 기도 및 폐내 이물질 제거, 폐의 윤활작용 등을 수행한다. 반면, 호흡기가 미세먼지나 화석연료 연소에 의한 대기오염 물질, 자극성 기체, 감염, 흡연 등의 자극에 노출되면 자극 물질을 제거하기 위해 점액 생산 및 분비가 증가하게 된다.
그러나 점액의 과다생성은 오히려 섬모운동을 방해하여 자극 물질의 배출을 저해하고, 배출되지 않은 자극 물질과 과하게 생성되어 기도에 침착된 점액은 염증을 유발할 수 있으며, 이로 인해 기관지가 폐쇄될 수도 있다. 따라서 호흡기 내 점액의 과다분비를 조절하는 것이 호흡기 염증 질환을 예방하거나 치료하는데 있어서 매우 중요하다. 최근에는 점액 또는 뮤신 과다생성을 억제하는 효능을 가진 한약재를 이용하여 호흡기 염증 질환 치료제를 개발하려는 시도가 있었다. 그러나 호흡기 염증 질환에 대한 우수한 예방 또는 치료 효과를 나타내는 새로운 소재를 찾기 위해서는 여전히 많은 연구가 필요한 실정이다.
대한민국 등록특허공보 제10-2249916호 대한민국 등록특허공보 제10-2197445호 대한민국 등록특허공보 제10-2169920호
본 발명은 적작약 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 적작약 추출물을 포함하는 호흡기 염증 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 적작약 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
작약속 식물은 한국, 일본, 중국 등지에 분포하며 백작약(Paeonia japonica), 적작약(Paeonia lactiflora Pallas), 호작약(Paeonia albiflora var. hirta), 참작약(Paeonia lactiflora var. trichocarpa (Bunge) Stern) 등이 있다. 작약의 뿌리는 예로부터 한국과 중국에서 약재로 사용하였으며, 작약의 종류에 따라 그 효능이 다르다.
적작약 (생약명 Paeoniae Radix rubra)은 혈액순환을 돕는 작용을 하여 어혈을 없애고 생리통을 완화시켜주는 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 아직까지 적작약의 호흡기 염증 질환 예방 또는 치료 효과는 연구된 바가 없었다.
본 발명에서 사용된 "적작약 추출물"은 적작약 뿌리를 단독 사용하거나 혼합 사용하여 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액이나 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
상기 적작약 추출물은 자연에서 채취하거나 상업적으로 재배, 판매하는 적작약을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 적작약 추출물은 당 업계에 공지된 추출 방법을 제한 없이 사용하여 얻은 것일 수 있다. 상기 추출 방법은 일례로, 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 열수 추출, 가압 추출, 용매 추출 등을 들 수 있다. 여기서 사용된 용매는 당 업계에 공지된 추출 용매를 제한 없이 사용할 수 있다. 추출 용매의 일례로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게, 물, 저급알코올을 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 적작약 추출물은 감압 농축 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조된 것일 수 있다.
또한, 상기 적작약 추출물은 상술한 추출 방법에 의한 추출물뿐만 아니라 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예를 들어, 일정한 분자량 컷-오프(cut-off) 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시한 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 적작약 추출물은 적작약 뿌리를 70 내지 100% 에탄올로 열수 추출하여 수득한 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 적작약 대비 1 내지 50배, 바람직하게는 5 내지 20배의 70 내지 100% 에탄올을 사용하여 1 내지 12시간, 바람직하게는 2 내지 6시간 동안 열수 추출할 수 있으며, 적작약의 생리활성물질을 충분히 추출할 수 있도록 1회 이상 반복 추출할 수 있다. 이러한 추출물은 불용성 및 불순물을 제거하기 위해 1회 이상 여과할 수 있으며, 여과액을 감압 농축한 후 동결 건조할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 적작약 추출물은 뮤신의 과다생성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 사람의 호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포에서 TNFa에 의해 자극되어 증가된 뮤신 및 염증 유발 인자 (IL-1β 및 IL-8)의 생산 및 분비가 적작약 추출물에 의해 정상 세포와 유사한 수준으로 감소한 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 적작약 추출물은 손상된 호흡기 상피세포에서 ERK(extracellular signal-regulated kinase) pathway에 관여하여 염증반응을 개선하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, NCI-H292 세포에서 TNFa에 의해 자극되어 증가된 p-ERK의 발현이 적작약 추출물에 의해 정상 세포와 유사한 수준으로 감소한 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 적작약 추출물은 손상된 호흡기 상피세포에서 밀착연접(tight junction)을 개선하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, NCI-H292 세포에서는 TNFa에 의해 자극되어 세포의 염증반응 유발로 인해 세포간 밀착연접의 손상이 유발되었으나, 적작약 추출물이 밀착연접을 구성하는 단백질 Occludin의 발현을 증가시키고 Claudin-1의 발현을 감소시켜 손상된 호흡기 상피세포층의 밀착연접 장벽(tight junction barrier)을 개선하여 호흡기 상피세포층의 방어벽을 강화하는 것을 확인하였다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 호흡기 염증 질환은 천식, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 기관지 확장증, 편도선염, 인후염, 폐렴, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 낭포성 섬유증, 및 폐섬유화증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
이러한 적작약 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정 셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이드실리콘다이옥사이드, 하이드록시칼슘포스페이트, 락토오스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말 셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글라이콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 솔비톨 및 탈크 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 약제의 제조시에 통상적으로 이용되는 것으로, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 트레할로스, 하이알루로닉애씨드, 전분, 아카시아고무, 칼슘포스페이트, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘실리케이트, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 미네랄오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 약학 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (22th ed., 2013)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 지용성 폴리페놀 성분이 증가된 생약 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여 시 복강내 주사, 직장내 주사, 피하 주사, 정맥 주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 약학 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 0.01 ㎎ 내지 100 ㎎, 또는 0.1 ㎎ 내지 10 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양상은 적작약 추출물을 포함하는 호흡기 염증 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 적작약 추출물에 관한 설명은 전술한 바와 동일하므로, 중복 기재를 피하기 위해 생략한다. 이러한 적작약 추출물을 포함하는 호흡기 염증 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물은 뮤신의 과다생성 및 세포간 밀착연접을 개선하여 호흡기 염증 질환을 예방 또는 개선하는 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "식품 조성물"은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서 건강기능식품, 기능성식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함한다.
상기 식품 조성물은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등일 수 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품 (예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류 (예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품 (예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류 (예, 스넥류), 유가공품 (예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품 (각종 김치류, 장아찌 등), 음료 (예, 과실 및 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료 (예, 라면스프 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 식품, 기능성식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 적작약 추출물은 손상된 점막에서의 ERK pathway에 관여하여 뮤신의 과다생성 및 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고 손상된 점막의 세포간 밀착연접을 개선하여 호흡기 염증을 예방 또는 완화할 수 있으므로, 이러한 적작약 추출물을 포함하는 식품 조성물 및 약학 조성물을 통해 호흡기 염증 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 적작약 추출물이 TNFa에 의해 자극된 NCI-H292 세포의 뮤신 분비에 미치는 영향을 보여준다.
도 2는 적작약 추출물이 TNFa에 의해 자극된 NCI-H292 세포의 MUC5AC 단백질 분비에 미치는 영향을 보여준다.
도 3은 적작약 추출물이 TNFa에 의해 자극된 NCI-H292 세포의 MUC5AC 분비에 미치는 영향을 형광 염색 이미지로 보여준다.
도 4는 적작약 추출물이 TNFa에 의해 자극된 NCI-H292 세포의 MUC5AC, MUC5B, IL-1β 및 IL-8 발현에 미치는 영향을 보여준다.
도 5는 적작약 추출물이 TNFa에 의해 자극된 NCI-H292 세포의 pERK, pCREB, pGSK3β, Claudin-1 및 Occludin 발현에 미치는 영향을 보여준다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 적작약 추출물
적작약 추출물은 적작약(Paeoniae Radix rubra)의 뿌리를 95% 에탄올로 추출한 추출물로서 한국식물추출물은행에서 분양을 받아 사용하였다 (분양 번호 CA03-046).
적작약 추출물의 추출 방법을 간략히 설명하면, 95% 에탄올 1 L에 적작약의 뿌리를 넣고 45℃에서 3일 동안 (15분 초음파 처리한 후 2시간 정치, 1일 10회 반복) 추출하였다. 이후 무형광 솜을 필터로 사용하여 여과하였고 걸러진 추출물은 농축기를 이용하여 45℃에서 농축, 24시간 건조하였다.
실험예 1. 적작약 추출물의 뮤신 분비 억제 및 항염증 효과
1-1. PAS 염색
적작약 추출물이 뮤신 생산 및 분비에 미치는 영향을 조사하기 위해, 사람 호흡기 상피세포주인 NCI-H292 세포를 사용하였고, 세포를 자극하여 뮤신 분비를 촉진하기 위해 TNFa를 처리하였다.
NCI-H292 세포는 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양배지로서 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS) (ThermoFisher), 페니실린/스트렙토마이신 (ThermoFisher)을 함유하는 RPMI (WELGENE)으로 배양하였다. 이후 NCI-H292 세포를 24웰 마이크로플레이트(24-well microplate)에 2x105 cells/well로 분주한 후 TNFa (50 ng/ml)와 적작약 추출물 (10, 25 또는 50 μg/ml) 또는 ERK pathway의 억제제(inhibitor)인 U0126 (1 μM)을 24시간 처리하였다. 처리된 NCI-H292 세포를 PAS 염색하여 뮤신을 관찰하였고, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
PAS 염색은 다당류를 검색하는 염색법으로, 다당류가 과요오드산(periodic acid)에 의해 산화되어 알데히드(aldehyde)가 생성되는데 이와 시프 시약(Schiff's reagent)이 반응하여 푹신(fuchsin)을 방출하면서 붉은 자주색으로 염색된다.
도 1을 참고하면, NCI-H292 세포는 TNFa에 의해 자극되어 뮤신 분비가 증가하였으나, 적작약 추출물에 의해 농도 의존적으로 뮤신 분비가 감소하였다. 이는 ERK 억제제인 U0126을 처리한 세포의 뮤신 분비 억제효과와 동일한 정도의 효과를 보이는 것으로 보아 적작약에 의해 뮤신 분비 감소 기작은 ERK pathway와 관련이 있을 수 있음을 예측할 수 있다. 이는 ERK pathway 관련 단백질 발현을 관찰함으로 증명하였다.
1-2. ELISA
PAS 염색에 사용된 NCI-H292 세포와 동일한 조건으로 세포를 자극하여 적작약 추출물이 염증이 유발된 세포의 뮤신 분비와 생산에 미치는 영향을 살펴보았다. 세포가 만들어 낸 MUC5AC 단백질 양은 MUC5AC ELISA kit (Invitrogen)를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2를 참고하면, 적작약 추출물은 TNFa에 의해 생산된 뮤신 분비량을 유의적으로 감소시켰으며, 적작약 추출물이 25 ~ 50 μg/ml인 경우 정상 세포와 유사한 수준으로 뮤신 분비를 감소시켰다.
1-3. 면역형광분석
TNFa 및/또는 적작약 추출물이 처리된 NCI-H292 세포를 형광염색하였다.
24웰 마이크로플레이트에 커버슬립을 넣고 NCI-H292 세포를 2x105 cells/well로 분주한 후 TNFa (50 ng/ml)와 적작약 추출물 (10, 25 또는 50 μg/ml)을 24시간 처리하였다. 이후 NCI-H292 세포를 1xPBS로 3회 세척하고 4% 파라포름알데히드로 고정시켜 20분 동안 얼음 위에 올려놓고 실온에서 5분간 0.5% 트리톤 X-100 (Sigma-Aldrich)으로 투과시켰다. 이후, 세포를 1xPBS로 세척하고 2시간 동안 0.5% BSA로 차단시켜 4℃에서 항-MUC5AC 항체 (Invitrogen, MA5-12178)로 밤새 배양하였다. 세포를 1xPBS로 3회 세척하고 형광염료가 부착된 2차 항체 (abcam, ab150117)로 배양하였다. 핵은 DAPI로 염색하였다. NCI-H292 세포는 형광 현미경 (Olympus, BX61)을 배율 400x로 관찰하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3을 참고하면, 적작약 추출물은 TNFa에 의해 생산된 뮤신 분비량을 감소시켰다.
1-4. mRNA 발현 분석
NCI-H292 세포를 6웰 마이크로플레이트에 1x106 cells/well로 분주한 후 적작약 추출물 (10, 25 또는 50 μg/ml)과 TNFa (50 ng/ml)을 24시간 처리하였다. 이후 세포에서 RNA를 추출하고 cDNA를 합성한 후, 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 quantitative real-time PCR을 수행하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
유전자 프라이머 서열 (5' - 3') 서열번호
GAPDH 정방향(F) TGGGCTACACTGAGCACCAG 1
역방향(R) GGGTGTCGCTGTTGAAGTCA 2
MUC5AC 정방향(F) CTGTGAAGGTGGCTGACCAAGA 3
역방향(R) AAGGTGTAGTAGGTGCCGTCGAA 4
MUC5B 정방향(F) CACATCCACCCTTCCAAC 5
역방향(R) GGCTCATTGTCGTCTCTG 6
IL-1β 정방향(F) AAACAGATGAAGTGCTCCTTCCAGG 7
역방향(R) TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA 8
IL-8 정방향(F) CTTTCAGAGACAGCAGAG 9
역방향(R) CTAAGTTCTTTAGCACTCC 10
도 4를 참고하면, 적작약 추출물은 점액 물질 (MUC5AC 및 MUC5B), 전염증성 사이토카인 (IL-1β) 및 호흡기 염증 유발 물질 (IL-8)의 생산을 억제하며, 특히 적작약 추출물 25 ~ 50 μg/ml이 효과적으로 억제하는 것으로 확인되었다.
실험예 2. 적작약 추출물에 의한 ERK pathway 관련 단백질 발현 관찰 및 손상된 세포막 밀착연접 개선 효과
적작약 추출물이 손상된 호흡기 상피세포에 미치는 영향을 조사하기 위해, 사람 호흡기 상피세포주인 NCI-H292 세포를 사용하였고, 세포를 자극하여 뮤신 분비를 촉진하기 위해 TNFa를 처리하였다.
NCI-H292 세포를 6웰 마이크로플레이트에 1x106 cells/well로 분주한 후 TNFa (50 ng/ml)와 적작약 추출물 (10, 25 또는 50 μg/ml)을 24시간 처리하였다. 세포에서 전체 단백질을 분리하기 위해, 단백질분해효소 억제제 및 인산분해효소 억제제를 포함한 세포용해액으로 균질화하였다. 각 시료의 총 단백질 농도를 측정한 후 동일한 양의 단백질 (30 μg)을 8~10% 아크릴아미드 겔(acrylamide gel)로 분리하였으며, SDS-PAGE를 수행하였다. 겔은 나일론 막으로 옮겨 실온에서 1시간 동안 5% 스킴 밀크(skim milk)를 처리하였다. 막은 ERK (Cell Signaling, 4695), p-ERK (Cell Signaling, 4370), CREB (Cell Signaling, 9197), p-CREB (Cell Signaling, 9198), GSK3β (Cell Signaling, 9315), pGSK3β (Cell Signaling, 9336), Claudin-1 (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, sc-166338), Occludin (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, sc-133256) 또는 a-tubulin (AbFrontier, LF-MA0117) 각각의 1차 항체로 밤새 4℃에 두었다. 그런 다음, 막을 1xTBST(tris-buffered saline (pH 7.4) containing 0.1 % tween-20) 완충액으로 15분간 3회 세척하였다. 막을 2차 항체 HRP-표지 항-마우스(anti-mouse) 또는 항-토끼(anti-rabbit) IgG (Bio-Rad, 미국)로 실온에서 2시간 배양하여 1xTBST 완충액으로 3회 세척하였다. 이후 ECL 시약을 이용하여 단백질 밴드를 확인하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5를 참고하면, TNFa에 의해 염증이 유발된 세포에서는 적작약 추출물을 처리하였을 경우 농도 의존적으로 p-ERK의 발현이 감소되었다. 이는 적작약 추출물이 ERK pathway를 통해 호흡기 세포의 염증을 개선한다는 직접적인 결과이며, ERK 억제제인 U0126 (1 μM)을 처리한 경우보다 p-ERK의 발현을 더 효과적으로 감소시킨다는 것을 나타낸다. 또한 COPD 환자에서 높은 발현이 보고된 CREB의 경우, 적작약 추출물을 처리한 세포에서 농도 의존적으로 발현이 감소됨을 관찰하였다. 특히 p-GSK3β는 포도당 대사 과정에 관여하는데, 적작약 추출물을 처리한 세포에서 p-GSK3β 발현이 감소한 것으로 보아 적작약 추출물이 포도당 대사 조절에도 효과가 있음을 알 수 있다.
Claudin-1은 세포간 밀접연접이 손상된 경우 단백질 발현이 증가하고 Occludin은 밀접연접이 손상된 경우 단백질 발현이 감소한다. 이러한 세포간 밀착연접과 관련된 인자의 발현 또한 적작약 추출물에 의해 개선되었다. 특히 적작약 추출물 25 μg/ml과 50 μg/ml에서 Claudin-1 발현이 감소하고, Occludin 발현이 증가하는데 효과적이었다. 따라서 손상된 호흡기 상피세포의 밀착연접이 적작약 추출물에 의해 개선됨을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Dongguk University Gyeongju Campus Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Composition comprising extract of Paeoniae Radix rubra for preventing, treating or improving respiratory inflammatory disease <130> BPN211006-P1 <150> KR 10-2021-0102926 <151> 2021-08-05 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH F <400> 1 tgggctacac tgagcaccag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH R <400> 2 gggtgtcgct gttgaagtca 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC5AC F <400> 3 ctgtgaaggt ggctgaccaa ga 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC5AC R <400> 4 aaggtgtagt aggtgccgtc gaa 23 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC5B F <400> 5 cacatccacc cttccaac 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC5B R <400> 6 ggctcattgt cgtctctg 18 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b F <400> 7 aaacagatga agtgctcctt ccagg 25 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b R <400> 8 tggagaacac cacttgttgc tcca 24 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8 F <400> 9 ctttcagaga cagcagag 18 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-8 R <400> 10 ctaagttctt tagcactcc 19

Claims (6)

  1. 적작약 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 적작약 추출물은 적작약 뿌리를 70 내지 100% 에탄올로 열수 추출하여 수득한 것인 약학 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 적작약 추출물은 뮤신의 과다생성을 억제하는 것인 약학 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 적작약 추출물은 손상된 호흡기 상피세포에서 ERK pathway에 관여하여 염증반응 및 밀착연접을 개선하는 것인 약학 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 호흡기 염증 질환은 천식, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 기관지 확장증, 편도선염, 인후염, 폐렴, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 낭포성 섬유증, 및 폐섬유화증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 약학 조성물.
  6. 적작약 추출물을 포함하는 호흡기 염증 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
KR1020210167428A 2021-08-05 2021-11-29 적작약 추출물을 포함하는 호흡기 염증 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 KR20230022384A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102197445B1 (ko) 2019-01-24 2020-12-31 충남대학교산학협력단 생약 조합 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기성 염증 질환 예방 및 치료용 조성물
KR102249916B1 (ko) 2019-04-09 2021-05-10 아레즈 주식회사 진세노사이드 Rg2, Rg4, Rg6, Rh4 및 Rh1 혼합물(RGX 365)을 유효성분으로 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

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