KR20150045447A - 재조합 미생물 및 이에 대한 용도 - Google Patents

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Abstract

씨. 오토에타노게눔(C. autoethanogenum) 내의 입체특이적 효소는 아세톤 및/또는 프로피온알데하이드로의 라세미 프로판다이올의 전환을 허용한다. 거울상이성체 출발 물질은 상이한 생성물을 생성시킨다. 원하는 경우, 생성물은 환원되어 알코올을 형성할 수 있다. 반응을 다양한 숙주 세포에서 수행할 수 있어서, 다양한 물질이 탄소원 및/또는 에너지원으로서 사용될 수 있다.

Description

재조합 미생물 및 이에 대한 용도{RECOMBINANT MICROORGANISMS AND USES THEREFOR}
본 발명은 프로판-1,2-다이올을 프로판-2-온 및 프로판알로 전환시키는 효소 반응 및 기질의 세균 발효에 의해 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 포함하는 생성물을 생성하는 공정에 관한 것이다.
현재까지, 대부분의 화학물질, 예컨대, 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올, 프로필렌 또는 아이소뷰틸렌은 석유화학 자원으로부터 유도된다. 원유의 세계 매장량 감소 및 개발도상국의 수요 증가로 인해, 오일 공급 및 수요에 대한 압박이 증가할 것이고, 대안적인 바이오 기반 화학물질이 개발 중에 있다. 당 또는 셀룰로스계 공급원료를 생성하기 위해 식량 작물 또는 비식량 작물을 사용하는 생화학물질의 현재의 생성은 토지 이용도, 식량 안보, 및 공급 변동성 및 환경적인 문제와 관련된 문제점을 가질 수 있다.
프로판-2-온은 연간 수요량이 미국에서 1년간 200만 메트릭톤인 중요한 용매이다. 프로판-2-올은 1년간 300만 메트릭톤의 용량으로 산업 공정을 위해 또는 코팅을 위한 용매로서 사용된다. 1-프로판올은 약물 및 화장품의 제조에서 중요하고, 대체 연료로 생각된다. 아이소뷰틸렌은 수많은 화학물질에 대한 화학 빌딩 블록 및 중요한 전구체이다. 아이소뷰틸렌의 전세계 요구량은 1년간 1000만 메트릭톤(metric ton)을 초과하고 이의 시장 가치가 250억 미국 달러인 것으로 예상되었다.
CO 및/또는 CO 및 수소(H2)로 주로 이루어진 가스를 다양한 연료 및 화학물질로 전환시키는 데 촉매 공정이 이용될 수 있다고 오랫동안 인식되어 왔다. 그러나, 미생물이 이 가스를 연료 및 화학물질로 전환시키는 데 또한 이용될 수 있다. 이 생물학적 공정은, 일반적으로 화학 반응보다 느리지만, 촉매 공정에 비해 더 높은 특이성, 더 높은 수율, 더 낮은 에너지 비용 및 더 높은 내피독성을 포함하는 몇몇 이점을 갖는다.
CO는 유기 물질, 예컨대 석탄 또는 오일 및 오일 유도 생성물의 불완전 연소의 주요한 자유 에너지 풍부 부산물이다. 예를 들면, 호주의 철강 산업은 1년간 500,000톤이 넘는 CO를 생성하고 대기로 배출하는 것으로 보고되었다.
유일한 탄소원으로서 CO에서 성장하는 미생물의 능력은 독립영양 성장의 아세틸 조효소 A(아세틸 CoA) 생화학 경로(또한 우즈-리운그달(Woods-Ljungdahl) 경로로 공지됨)를 이용하는 유기체의 특성이다. 일산화탄소영양(carboxydotrophic), 광합성, 메탄생성 및 초산생성 유기체를 포함하는 다수의 혐기성 유기체는 CO를 다양한 최종 생성물, 즉 CO2, H2, 메탄, n-뷰탄올, 아세테이트 및 에탄올로 대사시키는 것으로 나타났다. 유일한 탄소원으로서 CO를 사용할 때, 모든 이 유기체는 이 최종 생성물 중 적어도 2종을 생성한다.
일부 미생물, 예컨대 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 또는 클로스트리듐 베이저링키(Clostridium beijerinckii)는 뷰탄올 발효(ABE 또는 IBE 발효) 동안 주요 부산물로서 프로판-2-온 또는 프로판-2-올을 생성하는 것으로 공지되어 있는 반면(George et al. 1983), 프로판-1-올은 효모 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)에 의한 발효의 부산물이다(Hazelwood et al. 2008). 그러나, 모든 이 유기체는 당 또는 전분 기반 기질에 의존한다. 초산생성 유기체, 예컨대 밀접히 연관된 미생물 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 씨. 리운그달리(C. ljungdahlii) 및 씨. 라그스달레이(C. ragsdalei)는 유일한 에너지원 및 탄소원으로서 CO 또는 CO2/H2 함유 가스에서 화학 독립 영양으로 성장할 수 있고, 아세테이트, 에탄올, 뷰탄올 또는 2,3-뷰탄다이올과 같은 생성물을 합성하지만, 프로판-2-온도 프로판-2-올도 합성하지 못한다(Munasinghe and Khanal 2010). 프로판-2-올로의 프로판-2-온의 환원이 초산생성 종에서 나타나지만, 기초하는 원칙은 알려져 있지 않다(Ramachandriya et al. 2011).
본 발명의 목적은 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올 또는 이들의 전구체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 특히 프로판-1,2-다이올을 프로판-2-온 및 프로판알로 전환시키는 효소 반응 및 (특히 CO를 포함하는 기질의) 세균 발효에 의한 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올의 생산 방법, 및 이 방법에서 사용되는 재조합 미생물을 제공한다.
제1 양상에서, 본 발명은 일 유형의 다이올 데하이드라타제 효소(diol dehydratase enzyme)에 의해 촉매화되는, 프로판-1,2-다이올을 프로판-2-온 및 프로판알로 전환시키는 효소 반응을 제공한다.
특정한 일 실시형태에서, 미생물의 존재 하에 프로판-1,2-다이올을 포함하는 기질을 발효시키는 단계를 포함하는 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생산하는 방법이 제공된다.
특정한 일 실시형태에서, 미생물은 하나 이상의 다른 생성물을 생성한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 다른 생성물은 에탄올, 뷰탄올 및/또는 뷰탄다이올이다.
일 실시형태에서, 미생물은 일산화탄소영양 미생물이다.
특정한 일 실시형태에서, 일산화탄소영양 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리운그달리, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 카복시디보란스(Clostridium carboxidivorans), 클로스트리듐 드라케이(Clostridium drakei), 클로스트리듐 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes), 클로스트리듐 아세티쿰(Clostridium aceticum), 클로스트리듐 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리듐 마그눔(Clostridium magnum), 부티리박테륨 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 아세토박테륨 우디(Acetobacterium woodii), 알칼리바쿨룸 바치이(Alkalibaculum bacchii), 블라우티아 프로덕타(Blautia producta), 유박테륨 리모숨(Eubacterium limosum), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica), 무렐라 써마우토트로피카(Moorella thermautotrophica), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides), 옥소박터 프페니기(Oxobacter pfennigii) 및 써모아나에로박터 키우비(Thermoanaerobacter kiuvi)이다.
일 실시형태에서, 미생물은 본 명세서에서 하기 정의된 재조합 미생물이다.
일 실시형태에서, 미생물은 속 에스체리치아(Escherichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 클로스트리듐, 바실러스(Bacillus), 락토코커스(Lactococcus), 자이모모나스(Zymomonas), 코리네박테륨(Corynebacterium), 피치아(Pichia), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 트리코데르마(Trichoderma), 아세토박테륨(Acetobacterium), 랄스토니아(Ralstonia), 쿠프라비도르 살모넬라(Cupravidor Salmonella), 클레브시엘라(Klebsiella), 파에니바실러스(Paenibacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 락토바실러스(Lactobacillus), 로도코커스(Rhodococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 알칼리게너스(Alkaligenes), 브레비박테륨(Brevibacterium), 메틸로박테륨(Methylobacterium), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로사이스티스(Methylocystis), 메틸로시누스(Methylosinus)로부터 선택된다.
특정한 일 실시형태에서, 미생물은 이. 콜라이(E. coli), 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰, 씨. 베이저링키, 씨. 사카르부티리쿰(C. saccharbutyricum), 씨. 사카로퍼부틸아세토니쿰(C. saccharoperbutylacetonicum), 씨. 부티리쿰(C. butyricum), 씨. 다이올리스(C. diolis), 씨. 클루이베리(C. kluyveri), 씨. 파스테리아늄(C. pasterianium), 씨. 노비(C. novyi), 씨. 디피실(C. difficile), 씨. 써모셀룸(C. thermocellum), 씨. 셀룰롤리티쿰(C. cellulolyticum), 씨. 셀룰로보란스(C. cellulovorans), 씨. 피토페르멘탄스(C. phytofermentans), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 코리네박테리아 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 메틸로박테리아 엑스토르?스(Methylobacterium extorquens)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은,
a. 당, 전분, 셀룰로스, 바이오매스 가수분해물, 합성가스 및/또는 글라이세롤을 포함하는 기질을 하나 이상의 미생물의 배양물을 포함하는 기질을 포함하는 생물반응기에 제공하는 호기성 또는 혐기성 발효 단계;
b. 프로판-1,2-다이올을 기질에 제공하는 단계; 및
c. 생물반응기에서 배양물을 혐기성으로 발효시켜 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하는 단계를 포함한다.
특정한 일 실시형태에서, 상기 방법은,
a. CO를 포함하는 기질을 하나 이상의 일산화탄소영양 미생물의 배양물을 포함하는 기질을 포함하는 생물반응기에 제공하는 단계;
b. 프로판-1,2-다이올을 기질에 제공하는 단계; 및
c. 생물반응기에서 배양물을 혐기성으로 발효시켜 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하는 단계를 포함한다.
특정한 일 실시형태에서, 상기 방법은,
a. 산업 공정의 결과로서 생성된 CO 함유 가스를 포획하는 단계; 및
b. CO 함유 가스를 혐기성 발효시켜 하나 이상의 일산화탄소영양 미생물 및 프로판-1,2-다이올을 포함하는 기질에서 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 방법은,
a. 당, 전분, 셀룰로스, 바이오매스 가수분해물, 합성가스 및/또는 글라이세롤을 포함하는 기질을 하나 이상의 미생물의 배양물을 포함하는 기질을 포함하는 생물반응기에 제공하는 호기성 또는 혐기성 발효 단계;
b. 하나 이상의 미생물로 프로판-1,2-다이올을 생성하는 단계; 및
c. 하나 이상의 미생물이 프로판-1,2-다이올을 전환시키고 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하는 단계를 포함한다.
방법 양상의 특정한 실시형태에서, 발효는 수성 배양 배지에서 발생한다.
일 실시형태에서, 프로판-1,2-다이올은 (R)-프로판-1,2-다이올이고, 생성물은 프로판-2-온 및/또는 프로판-2-올이다.
일 실시형태에서, 프로판-1,2-다이올은 (S)-프로판-1,2-다이올이고, 생성물은 프로판알 및/또는 프로판-1-올이다.
바람직하게는, 기질은 CO를 포함한다. 바람직하게는, 기질은 CO를 포함하는 가스 기질이다. 일 실시형태에서, 기질은 산업용 폐가스를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 가스는 제강소용 폐가스 또는 합성가스이다.
일 실시형태에서, 기질은 통상적으로 주요한 비율의 CO, 예컨대 적어도 약 20용적% 내지 약 100용적%의 CO, 20용적% 내지 70용적%의 CO, 30용적% 내지 60용적%의 CO 및 40용적% 내지 55용적%의 CO를 포함할 것이다. 특정한 실시형태에서, 기질은 약 25용적% 또는 약 30용적% 또는 약 35용적% 또는 약 40용적% 또는 약 45용적% 또는 약 50용적%의 CO 또는 약 55용적%의 CO 또는 약 60용적%의 CO를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 발효 브로스(fermentation broth)로부터 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올 및 임의로 하나 이상의 다른 생성물을 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 프로판-1,2-다이올은 기질에 대한 미생물의 도입 전에, 이것과 동시에 또는 이것 후에 발효 기질에 첨가된다.
일 실시형태에서, CO 및/또는 발효 브로스의 다른 성분은 프로판-1,2-다이올의 도입 전에, 이것과 동시에 또는 이것 후에 기질에 첨가될 수 있다.
일 실시형태에서, 기질에 존재하는 프로판-1,2-다이올은 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하는 일산화탄소영양 미생물에 의해 생성된다. 일 실시형태에서, 프로판-1,2-다이올은 동일한 생물반응기 또는 상이한 생물반응기에서 생성될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 프로판-1,2-다이올은 동일한 생물반응기 또는 상이한 생물반응기에서 상이한 미생물에 의해 생성된다.
재조합 미생물
제2 양상에서, 본 발명은 모 미생물에 존재하지 않는 하나 이상의 외인성 다이올 데하이드라타제 효소(본 명세서에서 외인성 효소로 칭해질 수 있음)를 발현하도록 변형된 재조합 미생물을 제공한다.
제3 양상에서, 본 발명은 모 미생물에 존재하는 하나 이상의 내인성 다이올 데하이드라타제 효소(본 명세서에서 내인성 효소로 칭해질 수 있음)를 과발현하도록 변형된 미생물을 제공한다.
제4 양상에서, 본 발명은 모 미생물에 존재하는 하나 이상의 내인성 다이올 데하이드라타제 효소(본 명세서에서 내인성 효소로 칭해질 수 있음)의 변이체를 발현하도록 변형된 미생물을 제공한다.
제2, 제3 또는 제4 양상의 실시형태에서, 미생물은 모 미생물에 의해 생성된 것보다 더 높은 수율의 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 성취할 수 있는 데 적합하다.
제2, 제3 또는 제4 양상의 실시형태에서, 미생물은 모 미생물에 의해 생성된 것보다 빠른 속도로 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하는 데 적합하다.
제2 양상의 일 실시형태에서, 다이올 데하이드라타제 효소.
특정한 실시형태에서, 다이올 데하이드라타제 효소는 클로스트리듐 오토에타노게눔 또는 씨. 리운그달리(EC 4.1.2.28)로부터의 다이올 데하이드라타제, 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 확인 특성을 갖는다.
특정한 실시형태에서, 다이올 데하이드라타제 효소는 클레브시엘라 옥시토카 또는 케이. 뉴모니아에(EC 4.1.2.30)로부터의 프로판다이올 데하이드라타제, 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체의 확인 특성을 갖는다.
제2 양상의 일 실시형태에서, 신규한 다이올 데하이드라타제 효소 및 액티바제 효소(activase enzyme)는 서열 번호 1 및 2(씨. 오토에타노게눔의 효소) 및 YP_003779353 및 YP_003779354(씨. 리운그달리의 효소), 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에 정의된 바와 같다.
제2 양상의 일 실시형태에서, 신규한 다이올 데하이드라타제 효소 및 이의 액티바제 효소는 서열 번호 3 및 4(씨. 오토에타노게눔로부터의 유전자) 및 CLJU_c11830; 9444800 및 CLJU_c11831; 9444801(씨. 리운그달리의 유전자), 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에 정의된 핵산 서열에 의해 코딩된다.
제3 양상의 일 실시형태에서, 클레브시엘라의 다이올 데하이드라타제 효소를 포함하는 3개의 아단위는 YP_002236780, YP_002236781, YP_002236782(케이. 뉴모니아) 및 1DIO_A, 1DIO_B, 1DIO_C(케이. 옥시토카), 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에 정의되어 있다.
제3 양상의 일 실시형태에서, 클레브시엘라의 3개의 다이올 데하이드라타제 효소 아단위는 GI:206575748, GI:206575749, GI:206575750(케이. 뉴모니아) 및 GI:868006, GI:868007, GI:868008_(케이. 옥시토카), 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에 정의된 핵산에 의해 코딩된다.
제2 또는 제3 양상의 특정한 실시형태에서, 재조합 미생물은 내인성 효소의 발현이 모 미생물에서 동일한 효소의 발현에 비해 약화되거나 넉아웃되도록 변형된다.
일 실시형태에서, 발현이 약화되거나 넉아웃된 효소는 알코올 데하이드로게나제 효소이다. 특정한 실시형태에서, 2차 알코올 데하이드로게나제 효소는 서열 번호 5(씨. 오토에타노게눔) 및 ADK15544.1(씨. 리운그달리)에 정의되거나, 이의 기능적으로 동등한 변이체이다. 추가의 실시형태에서, 2차 알코올 데하이드로게나제 효소는 서열 번호 6(씨. 오토에타노게눔) 및 CLJU_c24860; GI:300435777(씨. 리운그달리)에 정의된 핵산에 의해 코딩된다.
추가의 실시형태에서, 재조합 유기체는 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올 이외에 또는 이것 대신에 프로판알 및/또는 프로판-2-온을 생성한다.
일 실시형태에서, 미생물은 하나 이상의 내인성 핵산의 발현을 증가시키는 데 적합한 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 하나 이상의 내인성 핵산은 본 명세서에서 상기 언급된 다이올 데하이드라타제를 코딩한다.
일 실시형태에서, 발현을 증가시키는 데 적합한 하나 이상의 외인성 핵산은 조절 구성요소이다. 일 실시형태에서, 조절 구성요소는 프로모터이다. 일 실시형태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일 실시형태에서, 프로모터는 우즈-리운그달 유전자 클러스터, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 프로모터, Rnf 복합 오페론 프로모터, ATP 신타제 오페론 프로모터 및 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 재조합 미생물은 메틸글리옥살 신타제(mgsA); 메틸글리옥살 환원효소(ydjG); 2차 알코올 데하이드로게나제(gldA/budC); 락트알데하이드 환원효소/1차 알코올 데하이드로게나제(fucO)(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 프로판-1,2-다이올을 생성하기 위한 하나 이상의 외인성 효소를 발현하는 데 추가로 적합하다. 추가의 양상에서, 미생물은 프로판-1,2-다이올 생합성 경로에서 하나 이상의 내인성 효소를 과발현하는 데 적합하다.
일 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 핵산은 본 명세서에서 상기 언급된 다이올 데하이드라타제 효소를 코딩하는, 핵산 작제물 또는 벡터, 특정한 일 실시형태에서, 플라스미드이다.
일 실시형태에서, 외인성 핵산은 발현 플라스미드이다.
특정한 일 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리운그달리, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 카복시디보란스, 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 스카톨로게네스, 클로스트리듐 아세티쿰, 클로스트리듐 포르미코아세티쿰, 클로스트리듐 마그눔, 부티리박테륨 메틸로트로피쿰, 아세토박테륨 우디, 알칼리바쿨룸 바치이, 블라우티아 프로덕타, 유박테륨 리모숨, 무렐라 써모아세티카, 무렐라 써마우토트로피카, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스파에로이데스, 옥소박터 프페니기 및 써모아나에로박터 키우비를 포함하는 일산화탄소영양 박테리아의 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔 또는 클로스트리듐 리운그달리이다. 특정한 일 실시형태에서, 미생물은 균주 DSM10061의 유도체인 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693이다. 다른 특정한 실시형태에서, 미생물은 클로스트리듐 리운그달리 DSM13528(또는 ATCC55383)이다.
일 실시형태에서, 모 미생물은 에스체리치아 콜라이 또는 락토코커스 락티스이다.
(씨. 오토에타노게눔 및 씨. 리운그달리로부터의 ) 단리된 핵산
제4 양상에서, 본 발명은 다이올 데하이드라타제를 코딩하는 핵산을 제공하고, 핵산은 일산화탄소영양 미생물로부터 단리된다.
제4 양상의 추가의 실시형태에서, 일산화탄소영양 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔 또는 클로스트리듐 리운그달리이다. 특정한 일 실시형태에서, 미생물은 균주 DSM10061. 씨. 오토에타노게눔의 유도체인 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693이다.
제4 양상의 추가의 실시형태에서, 미생물에서 발현될 때, 다이올 데하이드라타제를 코딩하는 핵산은 CO 및 프로판-1,2-다이올을 포함하는 기질의 발효에 의해 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올의 생성의 수율 및/또는 속도의 증가를 수월하게 한다.
제4 양상의 일 실시형태에서, 다이올 데하이드라타제를 코딩하는 핵산은 서열 번호 1 및 2이거나, 이의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 실시형태에서, 핵산은 미생물에서 발현될 때 CO 및 프로판-1,2-다이올을 포함하는 기질의 발효에 의해 미생물이 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하게 하는 본 명세서에서 상기 정의된 본 발명의 하나 이상의 효소를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정한 일 실시형태에서, 본 발명은 미생물에서 발현될 때 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 미생물이 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하게 하는 2개의 효소를 코딩하는 핵산을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 프로모터는 이의 제어 하에 유전자의 구성적 발현을 허용한다. 특정한 실시형태에서, 우즈-리운그달 클러스터 프로모터를 사용한다. 다른 특정한 실시형태에서, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 프로모터, Rnf 복합 오페론 프로모터, ATP 신타제 오페론 프로모터 또는 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터를 사용한다. 특정한 일 실시형태에서, 프로모터는 씨. 오토에타노게눔 유래이다.
제5 양상에서, 본 발명은 제4 양상의 하나 이상의 핵산을 포함하는 핵산 작제물 또는 벡터를 제공한다.
특정한 일 실시형태에서, 핵산 작제물 또는 벡터는 발현 작제물 또는 벡터이다. 특정한 일 실시형태에서, 발현 작제물 또는 벡터는 플라스미드이다.
제6 양상에서, 본 발명은 제4 양상의 임의의 하나 이상의 핵산 또는 제5 양상의 벡터 또는 작제물을 포함하는 숙주 유기체를 제공한다.
제7 양상에서, 본 발명은 본 발명의 제4 양상에서 언급된 발현 작제물 또는 벡터, 및 메틸화 작제물 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 본 발명의 제2 양상에 따라 재조합 미생물을 생성할 수 있다.
특정한 일 실시형태에서, 발현 작제물/벡터 및/또는 메틸화 작제물/벡터는 플라스미드이다.
제8 양상에서, 본 발명은 제1 양상의 방법에 의해 생성될 때 프로판-1-올, 프로판-2-올, 프로판알 및/또는 프로판-2-온을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 미생물이 CO 및 프로판-1-2-다이올을 포함하는 기질의 발효에 의해 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하거나, 일산화탄소영양 초산생성 모 미생물과 비교하여 증가한 양의 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올, 및 임의로 하나 이상의 다른 생성물을 생성하도록 하나 이상의 핵산의 도입에 의해 이 모 미생물을 형질전환하는 단계를 포함하는 본 발명의 제2 양상 또는 제3 양상의 미생물의 생성 방법을 제공하고, 여기서 모 미생물은 CO를 포함하는 기질의 발효에 의해 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성할 수 없거나, 재조합 미생물보다 낮은 수준으로 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성한다.
특정한 일 실시형태에서, 모 미생물은 메틸글리옥살 신타제(mgsA); 메틸글리옥살 환원효소(ydjG); 2차 알코올 데하이드로게나제(gldA/budC); 락트알데하이드 환원효소/1차 알코올 데하이드로게나제(fucO)(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 프로판-1,2-다이올의 생합성을 위한 하나 이상의 효소를 발현하는 데 적합한 하나 이상의 외인성 핵산을 도입함으로써 형질전환된다. 추가의 실시형태에서, 모 미생물은 프로판-1,2-다이올 생합성 경로에서 하나 이상의 효소를 발현하는 데 적합한 하나 이상의 외인성 핵산을 도입함으로써 추가로 형질전환된다. 추가의 실시형태에서, 모 미생물은 프로판-1,2-다이올 생합성 경로에서 하나 이상의 효소를 발현하는 데 적합한 하나 이상의 내인성 핵산을 발현하거나 과발현함으로써 추가로 형질전환된다. 일 실시형태에서, 모 미생물은 모 미생물에서 자연에서 존재하는 프로판-1,2-다이올 경로에서 하나 이상의 내인성 효소를 과발현하는 데 적합한 하나 이상의 핵산으로 형질전환된다.
소정의 실시형태에서, 하나 이상의 효소는 본 명세서에서 상기 기재된 바와 같다.
본 발명은 또한 광범위하게 본원의 명세서에 언급되거나 표시된 부품, 구성요소 및 특징으로, 개별적으로 또는 총제적으로, 2개 이상의 상기 부품, 구성요소 또는 특징의 임의의 또는 모든 조합으로 이루어지는 것으로 언급될 수 있고, 본 발명이 관련한 분야에서 공지된 등가물을 갖는 구체적인 정수가 본 명세서에 언급된 경우, 이러한 공지된 등가물은 개별적으로 기재된 것처럼 본 명세서에 포함된 것으로 간주된다.
모든 양상에서 고려되어야 하는 본 발명의 이들 및 다른 양상은 첨부된 도면을 참조하여 오직 예의 방식으로 제공된 하기 설명으로부터 명확할 것이다.
도 1: 프로판-1,2-다이올로부터의 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올의 입체특이적 생성을 나타내는 반응 경로.
도 2: A - 프로판-1,2-다이올, B - (S)-프로판-1,2-다이올 및 C - (R)-프로판-1,2-다이올로부터의 생성물 프로판알, 프로판-1-올, 프로판-2-올 및 에탄올의 생성을 나타내는 HPLC 크로마토그램. 프로판-2-온은 A 및 C에서 부산물이지만, 프로판-2-올 피크에 의해 모호하다. 추가의 분석은 상이한 가스 크로마토그래피 방법을 이용하여 별도로 프로판-2-온을 용출시킨다.
도 3. 씨. 오토에타노게눔의 배양물 위의 두부간격의 가스 크로마토그램은 프로판-2-온 및 프로판-2-올의 보유 시간을 강조한다. 프로판-1,2-다이올이 첨가되지 않은 배양물, A; 및 (R)-프로판-2-올이 첨가된 배양물, B.
도 4: 씨. 리운그달리의 배양물로부터의 HPLC 크로마토그램. 프로판-1,2-다이올이 첨가되지 않은 배양물, A는 프로판-1-올 또는 프로판-2-올을 나타내지 않고; (R)-프로판-2-올이 첨가된 배양물, B는 프로판-1-올 및 프로판-2-올의 생성을 나타낸다.
도 5: 씨. 라그스달레이의 배양물로부터의 HPLC 크로마토그램. 프로판-1,2-다이올이 첨가되지 않은 배양물, A; 및 (R)-프로판-2-올이 첨가된 배양물, B는 프로판-1-올 또는 프로판-2-올로의 프로판-1,2-다이올의 전환을 나타내지 않는다.
도 6: 씨. 카복시디보란스의 배양물로부터의 HPLC 크로마토그램. 프로판-1,2-다이올이 첨가되지 않은 배양물, A는 프로판-1-올 또는 프로판-2-올을 나타내지 않고; (R)-프로판-2-올이 첨가된 배양물, B는 남은 프로판-1,2-다이올을 나타내지 않고 프로판-2-올이 아닌 오직 프로판-1-올의 생성을 나타낸다.
도 7: pMTL83155-pddABC를 보유하는 씨. 오토에타노게눔(막대는 실선 윤곽임); 및 야생형 씨. 오토에타노게눔(막대는 파선 윤곽임)에서 프로판-1,2-다이올로부터의 프로판올 생성. 오차 막대는 3개의 복제물의 표준 편차를 나타낸다.
도 8: BLAST 조사로부터의 가장 연관된 효소와의 씨. 오토에타노게눔의 다이올 데하이드라타제의 정렬의 개관. 회색 막대는 씨. 오토에타노게눔 기준 서열에 대한 식별을 나타내고, 흑색 구역은 미스매치를 나타내고, 흰색 구역은 갭을 나타낸다. 씨. 오토에타노게눔 및 씨. 리운그달리에만 존재하는 도메인은 박스에 강조되어 있다.
도 9: 씨. 부티리쿰의 배양물로부터의 HPLC 크로마토그램. 접종 시의 배양물, A는 글라이세롤 및 프로판-1,2-다이올을 나타낸다. 성장 48시간 후의 배양물, B는 일부 남은 프로판-1,2-다이올 및 생성된 프로판-1-올을 나타낸다.
도 10: 프라이머 Og84f 및 Og85r을 사용한 다이올 데하이드라타제 유전자에서의 그룹 II 인트론 삽입의 PCR 확인. 클라리쓰로마이신 선택 후의 8개의 클론을 무작위로 스크리닝하였다.
도 11: 성장 1주 후의 불활화 다이올 데하이드라타제를 갖는 씨. 오토에타노게눔 클로스트론(ClosTron) 돌연변이체의 배양물로부터의 HPLC 크로마토그램. 프로판-1,2-다이올이 첨가되지 않은 배양물, A; 및 (R)-프로판-2-올이 첨가된 배양물, B는 프로판-1-올 또는 프로판-2-올로의 프로판-1,2-다이올의 전환을 나타내지 않는다.
도 12. 4g의 L-1 프로판-1,2-다이올의 존재 하의 성장 48시간 후의 pTrc-dhaB1B2(A) 및 pTrc99A(B)를 보유하는 이. 콜라이로부터의 배양 브로스의 HPLC 크로마토그램.
프로판-2-온 및 프로판-2-올의 모든 공지된 생합성 경로는 중간체 아세토아세틸-CoA 및 아세토아세테이트를 통해 아세틸-CoA로부터 시작한다. 여기서, 본 발명자들은 글라이세르알데하이드-3-포스페이트 또는 피루베이트로부터 락트알데하이드 및 프로판-1,2-다이올(Berrios-Rivera, San, and Bennett 2003; Jain and Yan 2011)을 통해 프로판-2-온 및 프로판-2-올로의 대안적인 경로를 제시한다. 본 발명자들은 본 명세서에서 프로판-1,2-다이올을 프로판-2-온 및 프로판알로 입체특이적으로 전환시킬 수 있는 효소를 기술한다. 이후, 이 생성물은 프로판-2-올 및 프로판-1-올로 추가로 전환될 수 있다. 프로판알로의 프로판-1,2-다이올의 전환은 클레브시엘라 뉴모니아로부터의 다른 효소에 의해 기재되어 있지만(Jain and Yan 2011), 그러나 이 효소는 이를 프로판알 및 또한 프로판-2-온 둘 다로 전환시킬 수 없다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 태생적으로 또는 임의의 네이티브 프로판-1,2-다이올 생성 숙주 유기체에서 이 효소를 포함할 수 있는 초산생성 세포에서 또는 이. 콜라이 또는 사카로마이세스 세레비시아에에 기재된 바와 같은 프로판-1,2-다이올 생성을 위해 변형된 조작된 세포에서 프로판-2-온/프로판-2-올 및/또는 프로판알/프로판-1-올의 선택적 생성을 위한 효소 및 과정을 기술한다(Berrios-Rivera, San, and Bennett 2003; Jain and Yan 2011). 이 반응은 또한 프로판-2-온으로부터 생산될 수 있는, 전구체 프로판-2-온, 프로판-2-올, 프로판알, 프로판-1-올로부터의 다른 상품, 예를 들면 아이소뷰틸렌의 제조를 허용한다(van Leeuwen et al. 2012)(WO2011032934). 신규한 다이올 데하이드라타제를 사용한 본 발명의 다른 이점은 효소 기전의 성질에 있다. 다이올 데하이드라타제는 비가역 반응을 촉매화하여, 생성물이 재사용될 수 없으므로 효과적인 생산을 위한 동역학적 조절 구성요소가 합성 경로를 설계할 때 중요한 고려사항이 되게 허용한다(Bar-Even et al. 2012; Bond-Watts, Bellerose, and Chang 2011).
하기는 일반 조건으로 제공된 본 발명의 바람직한 실시형태를 포함하는 본 발명의 설명이다. 본 발명은 본 발명을 지지하는 실험 데이터, 본 발명의 다양한 양상의 구체적인 예 및 본 발명의 실행 수단을 제공하는 본 명세서에서 하기 표제 "실시예" 하에 제공된 개시내용으로부터 추가로 설명된다.
정의
본 명세서에서 언급되는, "발효 브로스"는 적어도 영양소 배지 및 박테리아 세포를 포함하는 배양 배지이다.
본 명세서에서 언급되는, "셔틀 미생물"은 메틸트랜스퍼라제 효소가 발현되는 미생물이고, 목적 미생물과 구별된다.
본 명세서에서 언급되는, "목적 미생물"은 발현 작제물/벡터에 포함된 유전자가 발현되는 미생물이고, 셔틀 미생물과 구별된다.
용어 "효율을 증가시키는", "효율 증가" 등은, 발효 과정과 관련하여 사용될 때, 발효를 촉매화하는 미생물의 성장 속도, 증가한 생성물 농도에서의 성장 및/또는 생성물 생성 속도, 소비된 기질의 용적당 생성된 원하는 생성물의 용적, 원하는 생성물의 생성 속도 또는 생성 수준, 및 발효의 다른 부산물과 비교하여 생성된 원하는 생성물의 상대 비율 중 하나 이상의 증가를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
구절 "일산화탄소를 포함하는 기질" 및 유사 용어는 일산화탄소가 예를 들면 성장 및/또는 발효를 위해 박테리아의 하나 이상의 균주에 이용 가능한 임의의 기질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
구절 "일산화탄소를 포함하는 가스 기질" 및 유사 구절 및 용어는 일정 수준의 일산화탄소를 포함하는 임의의 가스를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 기질은 적어도 약 20용적% 내지 약 100용적%의 CO, 20용적% 내지 70용적%의 CO, 30용적% 내지 60용적%의 CO 및 40용적% 내지 55용적%의 CO를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 기질은 약 25용적% 또는 약 30용적% 또는 약 35용적% 또는 약 40용적% 또는 약 45용적% 또는 약 50용적%의 CO 또는 약 55용적%의 CO 또는 약 60용적%의 CO를 포함한다.
구절 "단리된" 및 유사 용어는 집단의 다른 구성원으로부터 제거된 집단의 구성원을 의미한다. 통상적으로, 집단은 혼합 집단이고 단리된 구성원은 단집단 또는 동종 집단의 구성원이다. 상기 용어는 미생물, 단백질, 핵산 등을 기술하기 위해 사용될 수 있다.
구절 "재조합" 및 유사 용어는 함께 연결된 상이한 개체, 상이한 종 또는 상이한 속의 부분을 포함하는 핵산, 단백질 또는 미생물을 의미한다. 통상적으로, 재조합 DNA의 기법을 이용하여 이것이 수행되어, 복합 핵산이 형성된다. 예를 들면, 복합 단백질을 만들기 위해 복합 핵산을 사용할 수 있다. 융합 단백질을 만들기 위해 이를 사용할 수 있다. 복합 핵산을 유지시키고 복제하고 임의로 단백질, 임의로 복합 단백질을 발현하는 미생물을 형질변환시키도록 이를 사용할 수 있다.
용어 "입체특이적" 및 유사 용어는 거울상이성체를 구별하여 인식하고 거울상이성체와의 상이한 반응을 촉매화하는 효소를 의미한다. 따라서, 오직 하나의 거울상이성체가 반응할 수 있거나, 각각의 거울상이성체는 구별되는 생성물을 생성할 수 있다.
기질이 임의의 수소를 포함하는 것이 필요하지 않지만, H2의 존재는 본 발명의 방법에 따른 생성물 형성에 해롭지 않아야 한다. 특정한 실시형태에서, 수소의 존재는 알코올 생성의 전체 효율을 개선한다. 예를 들면, 특정한 실시형태에서, 기질은 대략 2:1 또는 1:1 또는 1:2의 H2:CO 비를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 기질은 약 30용적% 이하의 H2, 20용적% 이하의 H2, 약 15용적% 이하의 H2 또는 약 10용적% 이하의 H2를 포함한다. 다른 실시형태에서, 기질 스트림은 낮은 농도, 예를 들면, 5% 미만 또는 4% 미만 또는 3% 미만 또는 2% 미만 또는 1% 미만의 H2를 포함하거나 수소를 실질적으로 포함하지 않는다. 기질은 또한 약간의 CO2, 예를 들면, 예컨대 약 1용적% 내지 약 80용적%의 CO2 또는 1용적% 내지 약 30용적%의 CO2를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 기질은 약 20용적% 이하의 CO2를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 기질은 약 15용적% 이하의 CO2, 약 10용적% 이하의 CO2, 약 5용적% 이하의 CO2를 포함하거나 CO2를 실질적으로 포함하지 않는다.
하기하는 설명에서, 본 발명의 실시형태는 "CO를 포함하는 가스 기질"을 전달하고 발효시키는 측면에서 기술되어 있다. 그러나, 가스 기질이 대안적인 형태로 제공될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, CO를 포함하는 가스 기질은 액체 중에 용해된 채 제공될 수 있다. 본질적으로, 액체는 일산화탄소 함유 가스로 포화되고, 이후 이 액체는 생물반응기에 첨가된다. 이는 표준 방법론을 이용하여 성취될 수 있다. 예의 방식으로, 마이크로버블 분산액 생성기(Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology 101권, 3호 / 2002년 10월)를 사용할 수 있다. 추가의 예의 방식으로, CO를 포함하는 가스 기질은 고체 지지체에 흡착될 수 있다. 이러한 대안적인 방법은 용어 "CO를 포함하는 기질" 등의 사용에 의해 포함된다.
본 발명의 특정한 실시형태에서, CO 함유 가스 기질은 상업용 배기 가스 또는 폐가스이다. "산업용 폐가스 또는 배기 가스"는 산업 공정에 의해 생성된 CO를 포함하는 임의의 가스를 포함하고 철 금속 제품 제조, 비철 제품 제조, 석유 정제 공정, 석탄의 기화, 바이오매스의 기화, 전력 생산, 카본 블랙 제조 및 코크스 제조의 결과로서 생성된 가스를 포함하는 것으로 광범위하게 취해질 수 있다. 추가의 예는 본 명세서의 어딘가에 제공될 수 있다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 구절 "발효하는", "발효 과정" 또는 "발효 반응" 등은 공정의 성장 단계 및 생성물 생합성 단계 둘 다를 포함하도록 의도된다. 본 명세서에 추가로 기재된 바대로, 몇몇 실시형태에서 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 그러므로, 발효 반응에 대한 금속 또는 조성물의 첨가는 이 반응기 중 어느 하나 또는 둘 다에 대한 첨가를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "생물반응기"는 연속 교반 탱크 반응기(Continuous Stirred Tank Reactor: CSTR), 부동화 세포 반응기(Immobilized Cell Reactor: ICR), 삼상층 반응기(Trickle Bed Reactor: TBR), 버블 칼럼, 가스 리프트 발효기, 정적 혼합기, 또는 가스-액체 접촉에 적합한 다른 용기 또는 다른 장치를 포함하는, 하나 이상의 용기 및/또는 탑 또는 배관 배열로 이루어진 발효 장치를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 생물반응기는 제1 성장 반응기 및 제2 발효 반응기를 포함할 수 있다. 그러므로, 생물반응기 또는 발효 반응에 대한 기질의 첨가를 언급할 때, 적절한 경우 이 반응기 중 어느 하나 또는 둘 다에 대한 첨가를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"외인성 핵산"은 이것이 도입된 미생물의 외부에서 생긴 핵산이다. 외인성 핵산은 (예를 들면, 재조합 미생물이 유래한 모 미생물에서) 이것이 도입되고자 하는 미생물, 이것이 도입되고자 하는 유기체와 다른 미생물의 균주 또는 종(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 적절한 소스로부터 유래할 수 있거나, 이것은 인공적으로 또는 재조합으로 생성될 수 있다. 핵산이 미생물의 상이한 종 유래이고 상이한 서열을 갖는 경우, 이것은 이종(heterologous)이다. 일 실시형태에서, 외인성 핵산은 이것이 도입되고자 하는 미생물 내에 천연 존재하는 핵산 서열을 나타내고, 이것은 (예를 들면, 발현을 증가시키기 위해 서열(예를 들면, 유전자)의 카피수를 증가시킴으로써 또는 강한 또는 구성적 프로모터를 도입함으로써) 특정한 유전자의 발현을 증가시키거나 이를 과발현시키도록 도입된다. 다른 실시형태에서, 외인성 핵산은 이것이 도입되고자 하는 미생물 내에 천연 존재하지 않는 핵산 서열을 나타내고, (예를 들면, 조절 구성요소, 예컨대 프로모터의 도입의 경우에) 미생물 내에 천연 존재하지 않는 생성물의 발현 또는 미생물에 네이티브인 유전자의 발현 증가를 허용한다. 외인성 핵산은 이것이 도입되고자 하는 미생물의 게놈에 통합되거나 염색체 외 상태로 있도록 적합할 수 있다.
"외인성"은 또한 단백질을 의미하도록 사용될 수 있다. 이는 재조합 미생물이 유래한 모 미생물에 존재하지 않는 단백질을 의미한다.
재조합 미생물 및 핵산 또는 단백질과 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "내인성"은 재조합 미생물이 유래한 모 미생물에 존재하는 임의의 핵산 또는 단백질을 의미한다.
달리 언급되지 않은 한, 본 명세서에서 언급되는 "프로판-1,2-다이올"은 2개의 거울상이성체인 (R)-프로판-1,2-다이올 및 (S)-프로판-1,2-다이올의 라세미 혼합물을 의미한다. 달리 언급되지 않은 한, 본 명세서에서 언급되는 "프로판올"은 2개의 이성체인 프로판-1-올 및 프로판-2-올의 혼합물을 의미한다. 본 명세서에 언급된 반응의 생성물이 프로판-1-올 또는 프로판-2-올을 포함하는 경우, 당해 분야의 당업자는 상응하는 중간체인 프로판알 및 프로판-2-온이 추가로 또는 대안적으로 생산될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 독립 생성물로서의 중간체 알데하이드 또는 케톤 화합물의 단리는 몇몇 상황에서 바람직할 수 있고, 적절한 경우, 이러한 알데하이드 및 케톤 생성물은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에 구체적으로 예시된 서열과 서열이 다른 핵산이 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 한, 이 핵산을 사용하여 본 발명을 실행할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 경우, 이는 코딩된 단백질 또는 펩타이드가 실질적으로 동일한 기능을 갖는다는 것을 의미한다. 프로모터 서열을 나타내는 핵산 서열의 경우, 변이체 서열은 하나 이상의 유전자의 발현을 촉진하는 능력을 가질 것이다. 이러한 핵산은 본 명세서에서 "기능적으로 동등한 변이체"로 칭해질 수 있다. 예의 방식으로, 핵산의 기능적으로 동등한 변이체는 대립유전자 변이체, 유전자의 단편, 돌연변이(결실, 삽입, 뉴클레오타이드 치환 등)를 포함하는 유전자 및/또는 다형 등을 포함한다. 다른 미생물로부터의 상동성 유전자는 또한 본 명세서에 구체적으로 예시된 서열의 기능적으로 동등한 변이체의 예로서 생각될 수 있다. 이는 클로스트리듐 오토에타노게눔, 씨. 리운그달리, 씨. 노비(이의 상세내용은 웹사이트, 예컨대 젠뱅크(Genbank) 또는 NCBI에서 공중에게 이용 가능함)와 같은 종에서의 상동성 유전자를 포함한다. 구절 "기능적으로 동등한 변이체"는 또한 특정한 유기체에 대한 코돈 최적화의 결과로서 서열이 변하는 핵산을 포함하도록 취해져야 한다. 본 명세서에서의 핵산의 "기능적으로 동등한 변이체"는 바람직하게는 확인된 핵산과 적어도 대략 70%, 바람직하게는 대략 80%, 더 바람직하게는 대략 85%, 바람직하게는 대략 90%, 바람직하게는 대략 95% 이상의 핵산 서열 동일성을 가질 것이다.
본 명세서에 구체적으로 예시된 아미노산 서열과 서열이 다른 폴리펩타이드를 사용하여 본 발명을 실행할 수 있는 것으로 또한 이해되어야 한다. 이 변이체는 본 명세서에서 "기능적으로 동등한 변이체"라 칭해질 수 있다. 단백질 또는 펩타이드의 기능적으로 동등한 변이체는 확인된 단백질 또는 펩타이드와 적어도 40%, 바람직하게는 50%, 바람직하게는 60%, 바람직하게는 70%, 바람직하게는 75%, 바람직하게는 80%, 바람직하게는 85%, 바람직하게는 90%, 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 동일성을 공유하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하고, 관심 있는 펩타이드 또는 단백질과 실질적으로 동일한 기능을 갖는다. 이러한 변이체는 이의 범위 내에 단백질 또는 펩타이드의 단편을 포함하고, 단편은 폴리펩타이드의 절두된 형태를 포함하고, 결실은 1개 내지 5개, 내지 10개, 내지 15개, 내지 20개, 내지 25개의 아미노산일 수 있고, 폴리펩타이드의 어느 한 말단에서 1번 잔기로부터 25번 잔기로 연장할 수 있고, 결실은 그 구역 내의 임의의 길이를 가질 수 있거나; 특이적 촉매 기능 및 활성, 또는 기질 또는 보조인자의 결합을 부여하는, 단백질의 내부 위치 또는 특이적 도메인에 있을 수 있다. 본 명세서에서의 특이적 폴리펩타이드의 기능적으로 동등한 변이체는 예를 들면 상기 문단에서 예시된 바와 같은 박테리아의 다른 종에서 상동성 유전자에 의해 발현된 폴리펩타이드를 포함하도록 또한 취해져야 한다.
본 명세서에 사용되는 "실질적으로 동일한 기능"은 핵산 또는 폴리펩타이드가 이것의 변이체인 핵산 또는 폴리펩타이드의 기능을 수행할 수 있다는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들면, 본 발명의 효소의 변이체는 그 효소와 동일한 반응을 촉매화할 것이다. 그러나, 변이체가 이것의 변이체인 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 활성 수준을 갖는다는 것을 의미하도록 이것이 취해져서는 안 된다.
당해 분야의 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 기능적으로 동등한 변이체가 이것의 변이체인 핵산 또는 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 기능을 갖는지를 평가할 수 있다. 그러나, 예의 방식으로, 다이올 데하이드라타제 활성을 시험하는 검정은 실시예 부문에 기재되어 있고, HPLC 방법을 이용하여 또는 2,4-다이나이트로페닐하이드라진을 유도체화함으로써 평가될 수 있다(Toraya et al. 1977).
"과발현한다", "과발현" 및 유사 용어 및 구절은, 본 발명과 관련하여 사용될 때, 동일한 조건 하에 모 미생물의 단백질(핵산을 포함)의 발현 수준과 비교하여 하나 이상의 단백질의 임의의 발현(이를 코딩하는 하나 이상의 핵산의 발현을 포함)의 증가를 포함하도록 광범위하게 취해져야 한다. 단백질(또는 핵산)이 임의의 특정한 수준으로 발현된다는 것을 의미하도록 이것이 취해져서는 안 된다.
본 명세서에서 언급되는 "약화된 발현"은 모 미생물에서의 발현에 비해 감소한 핵산 또는 단백질의 발현을 의미한다. 약화된 발현은 또한 결코 발현되지 않은 핵산 또는 단백질을 의미하는 "0"의 발현을 포함한다. "0"의 발현은 RNA 침묵, 발현 과정의 변형(예를 들면, 프로모터 기능의 파괴) 또는 게놈으로부터 효소를 코딩하는 핵산의 완전 또는 부분 제거(즉, "넉아웃")를 포함하는 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 성취될 수 있다.
"모 미생물"은 본 발명의 미생물이 유래한 미생물이다. 본 발명의 미생물은 임의의 방법, 예컨대 인공 또는 자연 선택, 돌연변이 또는 유전자 재조합에 의해 유래될 수 있다. 모 미생물은 자연에 발생하는 것(즉, 야생형 미생물) 또는 이전에 변형되었지만 본 발명의 대상인 하나 이상의 효소를 발현하거나 과발현하지 않는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 미생물은 모 미생물에서 발현되거나 과발현되지 않은 하나 이상의 효소를 발현하거나 과발현하도록 변형될 수 있다.
용어 핵산 "작제물" 또는 "벡터" 및 유사 용어는 세포로 유전 물질을 전달하기 위한 비히클로서 사용하는 데 적합한 임의의 핵산(DNA 및 RNA를 포함)을 포함하도록 광범위하게 취해져야 한다. 상기 용어는 플라스미드, 바이러스(박테리오파지를 포함), 코스미드 및 인공 염색체를 포함하도록 취해져야 한다. 작제물 또는 벡터는 하나 이상의 조절 구성요소, 복제 기원, 다중클로닝 자리 및/또는 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다. 특정한 일 실시형태에서, 작제물 또는 벡터는 작제물 또는 벡터에 의해 코딩된 하나 이상의 유전자의 발현을 허용하는 데 적합한다. 핵산 작제물 또는 벡터는 네이키드 핵산, 및 세포로의 전달을 수월하게 하는 하나 이상의 물질과 제제화된 핵산(예를 들면, 리포솜 접합 핵산, 핵산이 포함된 유기체)을 포함한다.
개시내용
본 발명자들은 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올이 CO 및 프로판-1,2-다이올을 포함하는 기질의 존재 하에 있을 때 일산화탄소영양 미생물에 의해 생성될 수 있다는 것을 발견하였다. 미생물에 의한 프로판-1,2-다이올의 라세미 혼합물로부터의 프로판-2-온 및/또는 프로판-및/또는 프로판-2-올의 생성은 이전에 결코 밝혀지지 않았다. 추가의 실험 이후, 본 발명자들은 (R)-프로판-1,2-다이올을 포함하는 기질의 발효가 프로판-2-온 및/또는 프로판-2-올을 우선적으로 생성하고, (S)-프로판-1,2-다이올을 포함하는 기질의 발효가 프로판알 및/또는 프로판-1-올을 우선적으로 생성한다는 것을 밝혀냈다. 본 발명자들은 일산화탄소영양 미생물이 도 1에 도시된 바대로 반응이 진행되면서 프로판-1,2-다이올의 입체특이적 탈수를 촉매화하여 ((S) 거울상이성체로부터) 프로판알을 형성하거나 ((R) 거울상이성체로부터) 프로판-2-온을 형성한다고 생각한다. 이 반응을 촉매화하는 다이올 데하이드라타제가 확인되고 단리되었다. 본 발명자들은 이 화합물이 이후 내인성 알코올 데하이드로게나제(들)의 작용에 의해 상응하는 알코올 프로판-1-올 또는 프로판-2-올로 전환된다고 생각한다. 2차 알코올 데하이드로게나제는 프로판-2-온을 프로판-2-올로 전환시키는 것으로 확인되고 입증되었다. 확인된 효소는 생성물 또는 중간체로서 프로판-1,2-다이올을 생성하거나 이렇게 하도록 조작된 임의의 재조합 유기체에서 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올의 형성에 사용될 수 있다(Jain and Yan 2011). 이 반응은 또한 전구체인 프로판-2-온, 프로판-2-올, 프로판알, 프로판-1-올로부터 생산될 수 있는 예를 들면 아이소뷰틸렌과 같은 다른 상품의 제조를 허용한다(van Leeuwen et al. 2012).
본 발명은 본 명세서에 정의된 일산화탄소영양 미생물을 이용하여 CO 및 프로판-1,2-다이올을 포함하는 기질을 발효시키는 단계를 포함하는 세균 발효에 의한 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올 및 임의로 하나 이상의 다른 생성물의 생산 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 산업 공정으로부터 전체 대기 탄소 배출을 감소시키도록 이용될 수 있다.
본 발명은 당 기반 기질로부터 바이오연료, 예컨대 프로판올을 생산하는 것의 이점을 가질 수 있고, 산업 공정으로부터의 일산화탄소를 포함하는 폐가스를 이용하는 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및 프로판-2-올의 제조를 위한 대안적인 수단을 제공한다.
프로판-1,2-다이올은 당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 발효 기질에 첨가될 수 있다. 예의 방식으로, 프로판-1,2-다이올은 기질에 대한 미생물의 도입 전에, 이것과 동시에 또는 이것 후에 기질에 첨가될 수 있다. 추가로, 발효 브로스의 CO 및/또는 다른 성분은 프로판-1,2-다이올의 도입 전에, 이것과 동시에 또는 이것 후에 기질에 첨가될 수 있다.
기질에 존재하는 프로판-1,2-다이올은 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하는 일산화탄소영양 미생물에 의해 생성될 수 있고, 프로판-1,2-다이올의 생성은 동일한 생물반응기 또는 상이한 생물반응기에 있을 수 있다. 추가의 실시형태에서, 프로판-1,2-다이올은 동일한 생물반응기 또는 상이한 생물반응기에서 상이한 미생물에 의해 생성된다.
특정한 실시형태에서, 미생물은 또한 하나 이상의 다른 생성물, 예를 들면 에탄올, 뷰탄올 및/또는 뷰탄다이올을 생성한다. 에탄올 동시생성이 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올의 생성 이외에 관찰된다는 것을 도 2에서 볼 수 있다.
바람직하게는, 발효는 본 명세서에 정의된 본 발명의 재조합 미생물을 이용하여 적어도 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하기 위해 생물반응기에서 기질을 혐기성으로 발효시키는 단계를 포함한다.
재조합 미생물
본 발명자들은 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올의 생성을 위한 재조합 유기체 및 이의 사용 방법을 조작하였다. 재조합 일산화탄소영양 미생물은 외인성 다이올 데하이드라타제 효소를 발현하고, 모 미생물에 의해 생성된 것보다 프로판-1,2-다이올로부터의 더 높은 수율의 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 성취할 수 있다. 프로판-1,2-다이올로부터 생성된 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올의 비율은 또한 이러한 방식으로 조절될 수 있다. 미생물은 또한 모 미생물에 의해 생성된 것보다 빠른 속도로 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성한다.
도 1로부터 볼 수 있는 것처럼, 다이올 데하이드라타제 효소는 상응하는 케톤/알데하이드, 즉 각각 프로판-2-온 또는 프로판알로의 (R) 및/또는 (S) 프로판-1,2-다이올의 반응을 촉매화한다. 본 명세서에서 프로판-1,2-다이올로부터 생성된 프로판올을 참조할 수 있지만, 당해 분야의 당업자는 상응하는 알데하이드/케톤 중간체를 통해 이러한 생성이 있을 수 있을 것이라고 이해할 것이다. 추가의 조사를 통해, 본 발명자들은 이 알데하이드가 미생물에 의해 발현된 하나 이상의 내인성 알코올 데하이드로게나제 효소에 의해 상응하는 알코올로 환원된다고 것을 입증하였다. 하나 이상의 알코올 데하이드로게나제 효소가 프로판올 생성물의 반응 속도 및/또는 반응 수율을 증가시키도록 과발현될 수 있다는 것이 고안된다. 대안적으로, 하나 이상의 알코올 데하이드로게나제의 발현은 알코올의 생성을 감소시키고 상응하는 알데하이드의 생성을 증가시키도록 약화될 수 있다.
본 발명의 미생물에서 사용되는 효소 및 기능적 변이체는 박테리아의 상이한 속 및 종, 또는 다른 유기체를 포함하는 임의의 적절한 소스로부터 유래할 수 있다. 그러나, 일 실시형태에서, 다이올 데하이드라타제는 클레브시엘라 뉴모니아에 또는 케이. 옥시토카(EC 4.1.2.30)로부터 유래한 것 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체이다. 일 실시형태에서, 다이올 데하이드라타제 효소(3개의 아단위)는 YP_002236780, YP_002236781, YP_002236782, 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에서 정의된 바와 같다. 특정한 실시형태에서, 다이올 데하이드라타제는 다이올 데하이드라타제 유전자 GI:206575748, GI:206575749, GI:206575750(클레브시엘라 뉴모니아) 및 GI:868006, GI:868007, GI:868008(클레브시엘라 옥시토카)에 의해 코딩된다.
본 발명자들은 일산화탄소영양 미생물에서 이전에 기재되지 않은 다이올 데하이드라타제 효소(서열 번호 3)를 확인하였다. 일 실시형태에서, 본 발명은 모 미생물에 존재하는 하나 이상의 다이올 데하이드라타제 효소(예를 들면, 서열 번호 3 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체)를 과발현하는 데 적합한 일산화탄소영양 미생물을 제공한다. 특정한 일 실시형태에서, 내인성 다이올 데하이드라타제 효소는 서열 번호 4에 정의된 핵산, 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체에 의해 코딩된다.
일 실시형태에서, 재조합 유기체는 약화된 발현을 나타내거나 넉아웃된 효소를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 효소는 알코올 데하이드로게나제 효소이고, 재조합 유기체는 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올 이외에 또는 이것 대신에 프로판알 및/또는 프로판-2-온을 생성한다. 특정한 실시형태에서, 알코올 데하이드로게나제 효소는 서열 번호 5에 정의되어 있거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다. 추가의 실시형태에서, 알코올 데하이드로게나제 효소는 서열 번호 6에 정의된 핵산에 의해 코딩된다.
일 실시형태에서, 미생물은 하나 이상의 내인성 핵산의 발현을 증가시키는 데 적합한 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 하나 이상의 내인성 핵산은 본 명세서에서 상기 언급된 다이올 데하이드라타제를 코딩한다.
일 실시형태에서, 미생물은 메틸글리옥살 신타제(mgsA); 메틸글리옥살 환원효소(ydjG); 2차 알코올 데하이드로게나제(gldA/budC); 락트알데하이드 환원효소/1차 알코올 데하이드로게나제(fucO)(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 프로판-1,2-다이올의 생합성에 관여하는 하나 이상의 외인성 효소를 발현하는 데 추가로 적합하다. 추가의 양상에서, 미생물은 프로판-1,2-다이올 생합성 경로에서 하나 이상의 내인성 효소를 과발현하는 데 적합하다.
본 발명자들은 클로스트리듐 오토에타노게눔에서의 본 발명의 효율을 입증하였지만, 본 발명자들은 본 발명이 본 명세서에 추가로 기재된 더 넓은 군의 일산화탄소영양 초산생성 미생물에 적용 가능하다는 것을 고려한다.
미생물은 예를 들면 (예를 들면, 유전자의 발현을 추진시키는 더 강한 또는 구성적 프로모터를 도입함으로써) 내인성 유전자의 발현의 증가, 효소를 발현하도록 코딩하거나 적합한 외인성 핵산의 도입에 의한 특정한 효소를 코딩하는 유전자의 카피수의 증가, 또는 모 미생물 내에 천연 존재하지 않은 효소를 발현하도록 코딩하거나 적합한 외인성 핵산의 도입을 포함하는 임의의 수의 재조합 방법에 의해 하나 이상의 효소를 발현하거나 과발현하는 데 적합할 수 있다.
일 실시형태에서, 미생물은 모 미생물에 네이티브인 하나 이상의 핵산의 발현을 증가시키는 데 적합한 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하고, 하나 이상의 핵산은 본 명세서에서 상기 언급된 하나 이상의 효소를 코딩한다. 일 실시형태에서, 발현의 증가에 적합한 하나 이상의 외인성 핵산은 조절 구성요소이다. 일 실시형태에서, 조절 구성요소는 프로모터이다. 일 실시형태에서, 프로모터는 적절한 발효 조건 하에 바람직하게는 고도로 활성인 구성적 프로모터이다. 유도성 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 프로모터는 우즈-리운그달 유전자 클러스터, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 프로모터, Rnf 복합 오페론 프로모터, ATP 신타제 오페론 프로모터 또는 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된다. 당해 분야의 당업자는 적절한 발효 조건 하에 발현, 바람직하게는 높은 수준의 발현을 지시할 수 있는 다른 프로모터가 예시된 실시형태에 대한 대안으로서 효과적이라는 것을 이해할 것이다.
미생물은 하나 이상의 외인성 핵산을 포함할 수 있다. 모 미생물을 2개 이상의 유전자 구성요소(예컨대, 유전자 또는 조절 구성요소(예를 들면, 프로모터))로 형질전환시키는 것이 바람직한 경우, 이들은 하나 이상의 외인성 핵산에 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 미생물에 의해 발현되거나 과발현되는 하나 이상의 외인성 핵산은 임의의 조합의 본 명세서에서 상기 언급된 하나 이상의 효소를 코딩하는, 핵산 작제물 또는 벡터, 특정한 일 실시형태에서, 플라스미드이다.
본 발명의 핵산은 모 미생물의 형질전환 시 염색체 외 있을 수 있거나, 모 미생물의 게놈으로 통합될 수 있다. 따라서, 이것은 염색체 외 작제물의 통합(예를 들면, 상동성 재조합 및 숙주 게놈으로의 표적화된 통합을 허용하는 구역) 또는 이의 발현 및 복제(예를 들면, 복제 기원, 프로모터 및 다른 조절 구성요소 또는 서열)를 보조하는 데 적합한 추가의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 상기 언급된 하나 이상의 효소를 코딩하는 외인성 핵산은 외인성 핵산에 의해 코딩된 하나 이상의 효소의 발현을 촉진하는 데 적합한 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 프로모터는 적절한 발효 조건 하에 바람직하게는 고도로 활성인 구성적 프로모터이다. 유도성 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 프로모터는 우즈-리운그달 유전자 클러스터, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 프로모터, Rnf 복합 오페론 프로모터, ATP 신타제 오페론 프로모터 및 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된다. 당해 분야의 당업자는 적절한 발효 조건 하에 발현, 바람직하게는 높은 수준의 발현을 지시할 수 있는 다른 프로모터가 예시된 실시형태에 대한 대안으로서 효과적이라는 것을 이해할 것이다.
일 실시형태에서, 외인성 핵산은 발현 플라스미드이다.
특정한 일 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔, 클로스트리듐 리운그달리, 클로스트리듐 라그스달레이, 클로스트리듐 카복시디보란스, 클로스트리듐 드라케이, 클로스트리듐 스카톨로게네스, 클로스트리듐 아세티쿰, 클로스트리듐 포르미코아세티쿰, 클로스트리듐 마그눔, 부티리박테륨 메틸로트로피쿰, 아세토박테륨 우디, 알칼리바쿨룸 바치이, 블라우티아 프로덕타, 유박테륨 리모숨, 무렐라 써모아세티카, 무렐라 써마우토트로피카, 스포로무사 오바타, 스포로무사 실바세티카, 스포로무사 스파에로이데스, 옥소박터 프페니기 및 써모아나에로박터 키우비를 포함하는 일산화탄소영양 초산생성 박테리아의 군으로부터 선택된다.
특정한 일 실시형태에서, 모 미생물은 씨. 오토에타노게눔, 씨. 리운그달리 및 씨. 라그스달레이 종을 포함하는 에탄올생성, 초산생성 클로스트리디아 및 관련 단리물의 클러스터로부터 선택된다. 이것은 균주 씨. 오토에타노게눔 JAI-1T(DSM10061)(Abrini, Naveau and Nyns 1994), 씨. 오토에타노게눔 LBS1560(DSM19630)(WO/2009/064200), 씨. 오토에타노게눔 LBS1561(DSM23693), 씨. 리운그달리 PETCT(DSM13528 = ATCC 55383)(Tanner, Miller and Yang 1993), 씨. 리운그달리 ERI-2(ATCC 55380)(미국 특허 제5,593,886호), 씨. 리운그달리 C-01(ATCC 55988)(미국 특허 제6,368,819호), 씨. 리운그달리 O-52(ATCC 55989)(미국 특허 제6,368,819호), 씨. 라그스달레이 P11T(ATCC BAA-622)(WO 2008/028055), 관련 단리물, 예컨대 "씨. 코스카티(C. coskatii)"(US 20110229947) 및 "클로스트리듐 종"(Tyurin and Kiriukhin 2012), 또는 돌연변이된 균주, 예컨대 씨. 리운그달리 OTA-1(Tirado-Acevedo O. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium ljungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이들 균주들은 클로스트리듐 rRNA 클러스터 I 내에 서브클러스터를 형성하고, 이들의 16S rRNA 유전자는 약 30%의 유사한 낮은 GC 함량으로 99% 초과로 동일하다. 그러나, DNA-DNA 재회합 및 DNA 지문분석 실험은 이들 균주들이 구별되는 종에 속한다는 것을 나타낸다(WO 2008/028055).
이 클러스터의 모든 종은 유사한 형태 및 크기(대수로 성장하는 세포는 0.5 내지 0.7 x 3-5㎛임)를 갖고, 중온성(30℃ 내지 37℃의 최적 성장 온도) 및 엄격한 혐기성 생물이다(Abrini, Naveau, and Nyns 1994; Tanner, Miller, and Yang 1993)(WO 2008/028055). 더구나, 이들은 모두 동일한 주요 계통발생 특징, 예컨대 동일한 pH 범위(pH 4-7.5, 최적 초기 pH는 5.5-6임), 유사한 성장 속도로 CO 함유 가스에서 강한 독립영양 성장, 및 소정의 조건 하에 형성된 주요 발효 최종 생성물로서의 에탄올과 아세트산 및 소량의 2,3-뷰탄다이올과 락트산을 갖는 유사한 대사 프로필을 공유한다(Abrini, Naveau, and Nyns 1994; Kopke et al. 2011; Tanner, Miller, and Yang 1993)(WO 2008/028055). 모든 3개의 종에 의해 또한 인돌 생성이 관찰되었다. 그러나, 종은 다양한 당(예를 들면, 람노스, 아라비노스), 산(예를 들면, 글루코네이트, 시트레이트), 아미노산(예를 들면, 아르기닌, 히스티딘) 또는 다른 기질(예를 들면, 베타인, 뷰탄올)의 기질 이용에서 구별된다. 더구나, 일부 종은 소정의 비타민(예를 들면, 티아민, 비오틴)에 영양요구주인 것으로 밝혀졌고, 다른 것은 그렇지 않다. 가스 흡수를 담당하는 우즈-리운그달 경로 유전자의 조직 및 수는 핵산 및 아미노산 서열의 차이에도 불구하고 모든 종에서 동일한 것으로 밝혀졌다(Kopke et al. 2011).
일 실시형태에서, 모 균주는 이의 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 CO를 사용한다.
일 실시형태에서, 모 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔 또는 클로스트리듐 리운그달리이다. 특정한 일 실시형태에서, 미생물은 균주 DSM10061. 씨. 오토에타노게눔의 유도체인 클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693이다. 다른 특정한 실시형태에서, 미생물은 클로스트리듐 리운그달리 DSM13528(또는 ATCC55383)이다.
핵산
(씨. 오토에타노게눔 및 씨. 리운그달리로부터 확인된) 단리된 핵산
본 발명자들은 2개의 일산화탄소영양 아세토젠 씨. 오토에타노게눔 및 씨. 리운그달리에서 다이올 데하이드라타제를 코딩하는 핵산을 확인하였다. 핵산은 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올로의 프로판-1,2-다이올의 전환을 촉매화하는 다이올 데하이드라타제를 코딩한다.
일 실시형태에서, 다이올 데하이드라타제를 코딩하는 핵산은 서열 번호 1-2(씨. 오토에타노게눔) 및 CLJU_c11830; 9444800 및 CLJU_c11831; 9444801(씨. 리운그달리)에서 정의되거나 이들의 기능적으로 동등한 변이체이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 프로모터는 이의 제어 하에 유전자의 구성적 발현을 허용한다. 당해 분야의 당업자는 본 발명에서 사용되는 프로모터를 용이하게 이해할 것이다. 바람직하게는, 프로모터는 적절한 발효 조건 하에 높은 수준의 발현을 지시할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 우즈-리운그달 클러스터 프로모터를 사용한다. 다른 특정한 실시형태에서, 피루베이트:페레독신 산화환원효소 프로모터, Rnf 복합 오페론 프로모터, ATP 신타제 오페론 프로모터 또는 포스포트랜스아세틸라제/아세테이트 키나제 오페론 프로모터를 사용한다. 특정한 일 실시형태에서, 프로모터는 씨. 오토에타노게눔 유래이다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 미생물을 생성하는 데 사용되는 하나 이상의 핵산 또는 본 발명의 하나 이상의 핵산을 포함하는 핵산 작제물을 제공한다.
일 실시형태에서, 핵산은 미생물에서 발현될 때 CO 함유 기질의 발효에 의해 미생물이 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하게 하는 본 명세서에서 상기 정의된 본 발명의 하나 이상의 효소를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정한 일 실시형태에서, 본 발명은 미생물에서 발현될 때 CO 함유 기질의 발효에 의해 미생물이 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 생성하게 하는 2개의 효소를 코딩하는 핵산을 제공한다. 특정한 실시형태에서, 2개의 효소는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 다이올 데하이드라타제 및 알코올 데하이드로게나제이다.
본 명세서에 기재된 효소를 코딩하는 예시적인 아미노산 서열 및 핵산 서열은 본 명세서에서 제공되거나 본 명세서에서 상기 언급된 젠뱅크로부터 얻어질 수 있다. 그러나, 당업자는 젠뱅크 및 다른 데이터베이스에서 본 명세서에 포함된 정보와 관련한, 효소를 코딩하는 대안적인 핵산 서열 또는 이의 기능적으로 동등한 변이체, 및 유전자 코드를 용이하게 이해할 것이다.
본 발명은 또한 제1 양상의 방법에 의해 생성된 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 제공한다.
일 실시형태에서, 핵산은 핵산 작제물 또는 벡터이다. 특정한 일 실시형태에서, 핵산 작제물 또는 벡터는 발현 작제물 또는 벡터이지만, 다른 작제물 및 벡터, 예컨대 클로닝에 사용된 것은 본 발명에 의해 포괄된다. 특정한 일 실시형태에서, 발현 작제물 또는 벡터는 플라스미드이다.
본 발명의 발현 작제물/벡터가 프로모터 이외의 임의의 수의 조절 구성요소, 및 원하는 경우 추가의 단백질의 발현에 적합한 추가의 유전자를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 일 실시형태에서, 발현 작제물/벡터는 1개의 프로모터를 포함한다. 다른 실시형태에서, 발현 작제물/벡터는 2개 이상의 프로모터를 포함한다. 특정한 일 실시형태에서, 발현 작제물/벡터는 각각의 유전자가 발현되게 하는 1개의 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, 발현 작제물/벡터는 하나 이상의 리보솜 결합 자리, 바람직하게는 각각의 유전자가 발현되게 하는 리보솜 결합 자리를 포함한다.
당해 분야의 당업자는 본 명세서에 기재된 핵산 서열 및 작제물/벡터 서열은 표준 링커 뉴클레오타이드, 예컨대 리보솜 결합 자리 및/또는 제한 자리에 필요한 것을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 링커 서열은 필요한 대로 해석되어서는 안 되고, 정의된 서열에 제한을 제공하지 않는다.
본 발명의 발현 작제물/벡터를 포함하는, 핵산 및 핵산 작제물은 당해 분야의 임의의 수의 기법 표준을 이용하여 작제될 수 있다. 예를 들면, 화학 합성 또는 재조합 기법을 이용할 수 있다. 이러한 기법은 예를 들면 문헌[Sambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)]에 기재되어 있다. 추가의 예시적인 기법은 본 명세서에서 하기 실시예 부분에 기재되어 있다. 본질적으로, 각각의 유전자 및 조절 구성요소는 서로 작동적으로 연결되어, 유전자는 원하는 단백질을 형성하도록 발현될 수 있다. 본 발명에서 사용하는 데 적합한 벡터는 당해 분야의 당업자에 의해 이해될 것이다. 그러나, 예의 방식으로, 하기 벡터가 적합할 수 있다: pMTL80000 벡터, pIMP1, pJIR750 및 본 명세서에서 하기 실시예 부문에 예시된 플라스미드.
본 발명의 핵산이 RNA, DNA 또는 cDNA를 포함하는 임의의 적절한 형태일 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 핵산을 포함하는, 숙주 유기체, 특히 바이러스, 박테리아 및 효모를 포함하는 미생물을 제공한다.
미생물의 생성 방법
하나 이상의 외인성 핵산은 네이키드 핵산으로서 모 미생물에 전달되거나 형질전환 과정을 수월하게 하는 하나 이상의 물질(예를 들면, 리포솜 접합 핵산, 핵산이 포함된 유기체)과 제제화될 수 있다. 하나 이상의 핵산은 적절한 바대로 DNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 제한 억제제는 소정의 실시형태에서 사용될 수 있다; 예를 들면 문헌[Murray, N.E. et al. (2000) Microbial. Molec. Biol. Rev. 64, 412]을 참조한다.
본 발명의 미생물은 재조합 미생물을 생성하기 위해 당해 분야에 공지된 임의의 수의 기법을 이용하여 모 미생물 및 하나 이상의 외인성 핵산으로부터 생산될 수 있다. 오직 예의 방식으로, 형질전환(형질유도 또는 형질감염을 포함)은 전기천공, 초음파처리, 폴리에틸렌 글라이콜 매개 형질전환, 화학 또는 천연 능력, 원형질체 형질전환, 프로파지 유도 또는 접합에 의해 성취될 수 있다. 적합한 형질전환 기법은 예를 들면 문헌[Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989]에 기재되어 있다.
전기천공은 씨. 리운그달리(Kopke et al. 2010)(PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), 씨. 오토에타노게눔(PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905), 씨. 아세티쿰(Schiel-Bengelsdorf and Peter Durre 2012) 또는 아세토박테륨 우디(Stratz et al. 1994)로서 몇몇 일산화탄소영양 아세토젠에 대해 기재되어 있고, 많은 클로스트리디아, 예컨대 씨. 아세토부틸리쿰(Mermelstein et al., 1992, Biotechnology, 10, 190-195), 씨. 셀룰롤리티쿰(Jennert et al., 2000, Microbiology, 146: 3071-3080) 또는 씨. 써모셀룸(Tyurin et al., 2004, Appl . Environ . Microbiol . 70: 883-890)에서 사용되는 표준 방법이다. 프로파지 유도는 씨. 스카톨로게네스의 경우에 또한 일산화탄소영양 아세토젠에 대해 입증되었고(Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University), 접합은 클로스트리듐 디피실(Herbert et al., 2003, FEMS Microbiol. Lett. 229: 103-110) 또는 씨. 아세토부틸리쿰(Williams et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 819-826)을 포함하는 많은 클로스트리디아에 대한 선택의 방법으로서 기재되어 있고, 일산화탄소영양 아세토젠에 대한 유사한 방식으로 이용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 형질전환하고자 하는 미생물에서 활성인 제한 시스템으로 인해, 미생물로 도입하고자 하는 핵산을 메틸화하는 것이 필요하다. 이는 하기 기재된 것을 포함하는 다양한 기법을 이용하여 수행될 수 있고 본 명세서에서 하기 실시예 부문에 추가로 예시되어 있다.
예의 방식으로, 일 실시형태에서, 본 발명의 재조합 미생물은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다:
(i) 본 명세서에 기재된 발현 작제물/벡터 및 (ii) 메틸트랜스퍼라제 유전자를 포함하는 메틸화 작제물/벡터의 셔틀 미생물로의 도입 단계;
메틸트랜스퍼라제 유전자의 발현 단계;
셔틀 미생물로부터의 하나 이상의 작제물/벡터의 단리 단계; 및
목적 미생물로의 하나 이상의 작제물/벡터의 도입 단계.
일 실시형태에서, 단계 B의 메틸트랜스퍼라제 유전자는 구성적으로 발현된다. 다른 실시형태에서, 단계 B의 메틸트랜스퍼라제 유전자의 발현은 유도된다.
셔틀 미생물은 발현 작제물/벡터를 구성하는 핵산 서열의 메틸화를 수월하게 하는 미생물, 바람직하게는 제한 네가티브 미생물이다. 특정한 실시형태에서, 셔틀 미생물은 제한 네가티브 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스 또는 락토코커스 락티스이다.
메틸화 작제물/벡터는 메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
발현 작제물/벡터 및 메틸화 작제물/벡터가 셔틀 미생물로 도입되면, 메틸화 작제물/벡터에 존재하는 메틸트랜스퍼라제 유전자가 유도된다. 본 발명의 특정한 일 실시형태에서, 메틸화 작제물/벡터가 유도성 lac 프로모터를 포함하고 락토스 또는 이의 유사체, 더 바람직하게는 아이소프로필-β-D-티오-갈락토사이드(IPTG)의 첨가에 의해 유도되더라도, 유도는 임의의 적합한 프로모터 시스템에 의할 수 있다. 다른 적합한 프로모터는 ara, tet 또는 T7 시스템을 포함한다. 본 발명의 추가의 실시형태에서, 메틸화 작제물/벡터 프로모터는 구성적 프로모터이다.
특정한 실시형태에서, 메틸화 작제물/벡터는 셔틀 미생물의 실체에 특이적인 복제 기원을 가져서, 메틸화 작제물/벡터에 존재하는 임의의 유전자는 셔틀 미생물에서 발현된다. 바람직하게는, 발현 작제물/벡터는 목적 미생물의 실체에 특이적인 복제 기원을 가져서, 발현 작제물/벡터에 존재하는 임의의 유전자는 목적 미생물에서 발현된다.
메틸트랜스퍼라제 효소의 발현은 발현 작제물/벡터에 존재하는 유전자의 메틸화를 발생시킨다. 발현 작제물/벡터는 이후 다수의 공지된 방법 중 임의의 하나에 따라 셔틀 미생물로부터 단리될 수 있다. 오직 예의 방식으로, 발현 작제물/벡터를 단리하기 위해 본 명세서에서 하기 기재된 실시예 부문에 기재된 방법론을 이용할 수 있다.
특정한 일 실시형태에서, 작제물/벡터는 둘 다 동시에 단리된다.
발현 작제물/벡터는 임의의 수의 공지된 방법을 이용하여 목적 미생물로 도입될 수 있다. 그러나, 예의 방식으로, 본 명세서에서 하기 기재된 실시예 부문에 기재된 방법론을 이용할 수 있다. 발현 작제물/벡터가 메틸화되므로, 발현 작제물/벡터에 존재하는 핵산 서열은 목적 미생물로 편입되고 성공적으로 발현될 수 있다.
메틸트랜스퍼라제 유전자는 셔틀 미생물로 도입되거나 과발현될 수 있는 것으로 고안된다. 따라서, 일 실시형태에서, 생성된 메틸트랜스퍼라제 효소는 공지된 방법을 이용하여 수집되고 발현 플라스미드를 메틸화하기 위해 실험실내 사용될 수 있다. 발현 작제물/벡터는 이후 발현을 위해 목적 미생물로 도입될 수 있다. 다른 실시형태에서, 메틸트랜스퍼라제 유전자가 셔틀 미생물의 게놈으로 도입된 후, 셔틀 미생물로 발현 작제물/벡터가 도입되고, 셔틀 미생물로부터 하나 이상의 작제물/벡터가 단리되고, 이후 목적 미생물로 발현 작제물/벡터가 도입된다.
상기 정의된 발현 작제물/벡터 및 메틸화 작제물/벡터가 중요한 조성물을 제공하도록 조합될 수 있는 것으로 고안된다. 이러한 조성물은 본 발명의 재조합 미생물을 생성하기 위한 제한 장벽 기전을 피하는 데 특정한 유용성을 갖는다.
특정한 일 실시형태에서, 발현 작제물/벡터 및/또는 메틸화 작제물/벡터는 플라스미드이다.
당해 분야의 당업자는 본 발명의 미생물을 생성하는 데 사용되는 다수의 적합한 메틸트랜스퍼라제를 이해할 것이다. 그러나, 예의 방식으로 바실러스 서브틸리스 파지 ΦT1 메틸트랜스퍼라제 및 본 명세서에서 하기 실시예에 기재된 메틸트랜스퍼라제를 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 메틸트랜스퍼라제는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖거나 이의 기능적으로 동등한 변이체이다. 적합한 메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산은 원하는 메틸트랜스퍼라제의 서열 및 유전자 코드와 관련하여 용이하게 이해될 것이다. 일 실시형태에서, 메틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산은 본 명세서에서 하기 실시예에 기재된 바와 같다(예를 들면, 서열 번호 8의 핵산 또는 이것은 이의 기능적으로 동등한 변이체임).
메틸트랜스퍼라제 유전자의 발현을 허용하는 데 적합한 임의의 수의 작제물/벡터는 메틸화 작제물/벡터를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 예의 방식으로, 본 명세서에서 하기 실시예 부문에 기재된 플라스미드를 사용할 수 있다.
생산 방법
본 발명의 실시형태에서, 미생물에 의해 발효된 가스 기질은 CO 함유 가스 기질이다. 가스 기질은 산업 공정의 부산물로서 또는 일부 다른 소스, 예컨대 자동차 배기 가스로부터 얻은 CO 함유 폐가스일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 산업 공정은 철 금속 생성물 제조, 예컨대 제강소, 비철 생성물 제조, 석유 정제 공정, 석탄의 기화, 전력 생산, 카본 블랙 제조, 암모니아 제조, 메탄올 제조 및 코크스 제조로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 실시형태에서, CO 함유 가스는 임의의 편리한 방법을 이용하여 대기로 방출되기 전에 산업 공정으로부터 포획될 수 있다. CO는 합성가스(일산화탄소 및 수소를 포함하는 가스)의 성분일 수 있다. 산업 공정으로부터 생성된 CO는 보통 연소하여 CO2를 생성하고, 따라서 본 발명은 CO2 온실 가스 방출을 감소시키고 바이오연료를 생산하는 데 특정한 유용성을 갖는다. 가스 CO 함유 기질의 조성에 따라, 이를 발효로 도입하기 전에 임의의 원치않는 불순물, 예컨대 분진 입자를 제거하기 위해 이를 처리하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 예를 들면, 가스 기질은 공지된 방법에 의해 여과되거나 스크러빙될 수 있다.
박테리아의 성장 및 생성물의 생산이 일어나도록, CO 함유 기질 가스 이외에, 적합한 액체 영양소 배지가 생물반응기에 공급될 필요가 있는 것으로 이해될 것이다.
방법 양상의 특정한 실시형태에서, 발효는 수성 배양 배지 중에 발생한다. 방법 양상의 특정한 실시형태에서, 기질의 발효는 생물반응기에서 발생한다.
기질 및 배지는 연속식, 회분식 또는 유가식 방식으로 생물반응기로 공급될 수 있다. 영양소 배지는 사용된 미생물의 성장을 허용하기에 충분한 비타민 및 미네랄을 포함할 것이다. CO를 사용하는 발효에 적합한 혐기성 배지는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 적합한 배지는 비에벨(Biebel)의 문헌(2001)에 기재되어 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 배지는 본 명세서에서 하기 실시예 부문에 기재되어 있다.
발효는 바람직하게는 바이오연료의 생산이 일어나게 하는 적절한 발효 조건 하에 수행되어야 한다. 고려되어야 하는 반응 조건은 압력, 온도, 가스 유속, 액체 유속, 배지 pH, 배지 산화환원 전위, 교반 속도(연속식 교반 탱크 반응기를 사용하는 경우), 접종원 수준, 액상에서 CO가 제한이 되지 않게 보장하는 최대 가스 기질 농도 및 생성물 억제를 피하기 위한 최대 생성물 농도를 포함한다.
또한, 기질 스트림의 CO 농도(또는 가스 기질에서의 CO 분압)를 증가시키고 따라서 CO가 기질인 발효 반응의 효율을 증가시키기 것이 대개 바람직하다. 증가된 압력에서의 조작은 기상으로부터 액상으로의 CO 전달의 상당한 속도 증가를 허용하고, 여기서 이것은 발효의 생성을 위한 탄소원으로서 미생물에 의해 흡수될 수 있다. 이것은 결국 생물반응기가 대기압보다는 승압에서 유지될 때 보유 시간(유입 가스 유속으로 나눈 생물반응기 내의 액체 용적으로 정의됨)이 감소할 수 있다는 것을 의미한다. 최적 반응 조건은 사용된 본 발명의 미생물에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 그러나, 일반적으로, 상압보다 높은 압력에서 발효를 수행하는 것이 바람직하다. 또한, 소정의 CO 전환율이 부분적으로 기질 보유 시간의 함수이고 결국 원하는 보유 시간의 성취가 필요한 생물반응기 용적을 지시하므로, 가압 시스템의 사용은 필요한 생물반응기 용적 및 결과적으로 발효 설비의 자본 비용을 크게 감소시킬 수 있다. 미국 특허 제5,593,886호에 제공된 예에 따르면, 반응기 용적은 반응기 조작 압력의 증가에 선형 비례하여 감소할 수 있고, 즉 압력 10기압에서 조작되는 생물반응기는 압력 1기압에서 조작되는 것의 용적의 불과 10분의 1일 필요가 있다.
예의 방식으로, 승압에서의 에탄올로의 가스 발효를 수행하는 것의 이익이 기재되어 있다. 예를 들면, WO 02/08438은 각각 150g/ℓ/일 및 369g/ℓ/일의 에탄올 생산성을 발생시키는 30psig 및 75psig의 압력 하에 수행되는 에탄올로의 가스 발효를 기술한다. 그러나, 대기압에서 유사한 배지 및 유입 가스 조성물을 사용하여 수행된 예의 발효는 1일 1리터당 10배 내지 20배 미만의 에탄올을 생산하는 것으로 밝혀졌다.
CO 함유 가스 기질의 도입 속도가 액상에서의 CO의 농도가 제한이 되지 않도록 보장하도록 하는 것이 또한 유리할 수 있다. 이는 CO 제한 조건의 결과가 하나 이상의 생성물이 배양에 의해 소비된다는 것일 수 있기 때문이다.
발효 반응을 공급하기 위해 사용된 가스 스트림의 조성은 이 반응의 효율 및/또는 비용에 상당한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, O2는 혐기성 발효 과정의 효율을 감소시킬 수 있다. 발효 전의 또는 후의 발효 과정의 단계에서 원치않거나 불필요한 가스의 공정처리는 이러한 단계에 대한 부담을 증가시킬 수 있다(예를 들면, 가스 스트림이 생물반응기에 진입하기 전에 압축되는 경우, 발효에 필요하지 않은 가스를 압축하기 위해 불필요한 에너지가 사용될 수 있다). 따라서, 원치않는 성분을 제거하고 바람직한 성분의 농도를 증가시키기 위해 기질 스트림, 특히 산업 소스로부터 유래한 기질 스트림을 처리하는 것이 바람직할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 박테리아의 배양물은 수성 배양 배지 내에 유지된다. 바람직하게는, 수성 배양 배지는 최소 혐기성 세균 성장 배지이다. 적합한 배지는 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 미국 특허 제5,173,429호 및 제5,593,886호 및 WO 02/08438에 기재되어 있고, 본 명세서에서 하기 실시예 부문에 기재되어 있다.
프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올, 또는 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올을 포함하는 혼합 스트림 및/또는 하나 이상의 다른 생성물은 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 분별 증류 또는 증발, 투석증발, 가스 스트리핑 및 예를 들면 액체-액체 추출을 포함하는 추출 발효에 의해 발효 브로스로부터 회수될 수 있다. 생성물은 또한 이것이 상 분리에 의해 추출될 수 있는 배지로 확산하거나 분비될 수 있다.
본 발명의 소정의 바람직한 실시형태에서, 프로판알, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및/또는 프로판-2-올 및 하나 이상의 생성물은, 생물반응기로부터 브로스의 일부를 연속하여 제거하고, (편리하게는 여과에 의해) 브로스로부터 세균 세포를 분리하고, 브로스로부터 하나 이상의 생성물을 회수함으로써 발효 브로스로부터 회수된다. 알코올은 예를 들면 증류에 의해 편리하게 회수될 수 있다. 프로판-2-온은 예를 들면 증류에 의해 회수될 수 있다. 생성된 임의의 산은 예를 들면 활성탄에서의 흡착에 의해 회수될 수 있다. 분리된 세균 세포는 바람직하게는 발효 생물반응기로 반환된다. 임의의 알코올(들) 및 산(들)이 제거된 후 남은 세포 비함유 여과액은 또한 바람직하게는 발효 생물반응기로 반환된다. 추가의 영양소(예컨대, B 비타민)는 세포 비함유 여과액이 생물반응기로 반환되기 전에 영양소 배지를 보충하기 위해 이 여과액에 첨가될 수 있다.
또한, 브로스의 pH가 활성탄에 대한 아세트산의 흡착을 증대시키기 위해 상기 기재된 바대로 조정된 경우, pH는 생물반응기로 반환되기 전에 발효 생물반응기 내의 브로스와 유사한 pH로 재조정되어야 한다.
실시예
본 발명은 하기 비제한적인 예를 참조하여 더 자세히 기재될 것이다.
미생물 및 성장 조건
클로스트리듐 오토에타노게눔 DSM23693, 씨. 카복시디보란스 DSM15243 및 씨. 리운그달리 DSM13528 및 씨. 부티리쿰 DSM 10702를 DSMZ(독일 미생물 및 세포 배양 협회(The German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(독일 브라운슈벡 38124 인호펜슈트라쎄 7 B))로부터 구입하였다. 씨. 오토에타노게눔 DSM23693은 씨. 오토에타노게눔 DSM10061의 유도체이다.
이. 콜라이를 호기성 조건 및 혐기성 조건 둘 다 하에 배양하였고, 모든 다른 균주를 프럭토스(종속영양 성장)를 갖는 혈청 병에서의 50㎖의 용적의 액체 배지 또는 두부 간격(독립영양 성장)에서의 30psi의 CO 함유 제강소 가스(뉴질랜드 스틸(New Zealand Steel)(뉴질랜드 글렌브룩) 부지로부터 수집; 조성: 44%의 CO, 32%의 N2, 22%의 CO2, 2%의 H2)에서 혐기성으로 엄격하게 성장시켰다.
배지를 표 2 내지 표 4에 제공된 제제에 따라 표준 혐기성 기법(Hungate RE: A roll tube method for cultivation of strict anaerobes, in Norris JR and Ribbons DW (eds.), Methods in Microbiology, vol. 3B. Academic Press, New York, 1969: 117-132; Wolfe RS: Microbial formation of methane. Adv Microb Physiol 1971, 6: 107-146)을 이용하여 제조하였다. 고체 배지의 경우, 1.2%의 박터(Bactor) 한천(BD, Frankton Lakes, NJ 07417, USA)을 첨가하였다.
모든 균주는 37℃에서 성장시켰다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
기재된 바대로, 프로판-1,2-다이올을 접종 시 5g의 L-1의 최종 농도로 첨가하고, 배양물이 40시간 동안 성장한 후 최종 대사물 분석을 수행하였다.
대사물의 분석
단백질 및 다른 세포 잔류물을 제거하기 위해, 400㎕의 샘플을 100㎕의 2%(w/v)의 5-설포살리실산과 혼합하고, 14,000 x g에서 3분 동안 원심분리하여 침전된 잔류물을 분리하였다. 이후, 10㎕의 상청액을 분석을 위해 HPLC에 주입하였다. 35℃(굴절률 검출기)에서 조작되는 RID 및 35℃에서 유지된 아미넥스(Aminex) HPX-87H 칼럼(300 x 7.8㎜, 입경 9㎛)이 장착된 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 2,3-뷰탄다이올, 2-뷰탄올 및 다른 대사물의 HPLC 분석을 수행하였다. 0.6㎖/분의 유속으로 이동상으로서 약간 산성화된 물(0.005M의 H2SO4)을 사용하였다. 2,3-뷰탄다이올의 구별을 위해, 35℃(굴절률 검출기)에서 조작되는 RID 및 60℃에서 유지된 알테크(Alltech) IOA-2000 오가닉 액시드(Organic acid) 칼럼(150 x 6.5㎜, 입경 8㎛)이 장착된 애질런트 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 HPLC 분석을 수행하였다. 0.25㎖/분의 유속으로 이동상으로서 약간 산성화된 물(0.005M의 H2SO4)을 사용하였다.
슈펠코(Supelco) PDMS 100 1㎝ 섬유, 알테크 EC-1000(30m x 0.25㎜ x 0.25㎛) 칼럼 및 불꽃 이온화 검출기(FID)가 구비된 애질런트 6890N 헤드스페이스 GC를 사용하여 프로판-2-온, 프로판-2-올 및 다른 대사물의 GC 분석을 수행하였다. 5㎖의 샘플을 훈게이트(Hungate) 관에 옮기고, 수 욕 내에서 40℃로 가열하고, 정확히 5분 동안 섬유에 노출시켰다. 주입기를 250℃에서 유지시키고, 1㎖/분의 일정한 흐름의 헬륨을 운반 가스로서 사용하였다. 오븐 프로그램은 5분 동안 40℃이고, 이후 200℃까지 10℃/분의 증가이다. 이후, 온도는 50℃/분의 속도로 220℃로 더 증가하고, 이후 5분이 이 온도에 유지된 후, 온도가 50℃/분의 속도로 40℃로 감소하고, 이후 최종 1분이 유지되었다. FID를 구성 가스로서 40㎖/분의 수소, 450㎖/분의 공기 및 15㎖/분의 질소로 250℃에서 유지시켰다.
프로판-2-온, 프로판-2-올, 프로판알 , 프로판-1-올로의 프로판-1,2- 다이올의 반응의 확인
프로판-1,2-다이올(라세미)을 접종 시 씨. 오토에타노게눔의 배양물에 첨가하였다. 성장 2일 후, 프로판-1,2-다이올은 놀랍게도 도 2에 도시된 바대로 프로판-1-올 및 프로판-2-올로 전환된 것으로 밝혀졌다. (S)-프로판-1,2-다이올을 배양물에 첨가할 때, 이것이 프로판-1-올로 전환되고, 프로판알인 중간체를 볼 수 있다(도 2). (R)-프로판-1,2-다이올이 배양물에 첨가할 때, 이것이 프로판-2-올로 전환된다(도 2). 이용된 HPLC 방법은 프로판-2-올 및 프로판-2-온을 분리할 수 없지만, GC에 의해 중간체 프로판-2-온의 존재를 볼 수 있다(도 3).
프로판알로의 프로판-1,2-다이올의 전환은 몇몇 다이올 데하이드라타제 효소에 대해 기재되어 있다. 클레브시엘라 뉴모니아 또는 케이. 옥시토카의 예에서처럼 B12 의존적 (프로판)다이올 데하이드라타제 유형(EC 4.2.1.28)(Toraya T, Shirakashi T, Kosuga T 1976) 및 클로스트리듐 글리콜리쿰 또는 씨. 부티리쿰의 예에서처럼 B-12 독립적 글라이세롤/다이올 데하이드라타제 유형(EC 4.1.2.30)(Brien et al. 2004; Hartmanis and Stadtman 1986)의 2가지 유형의 이전에 기재된 다이올 데하이드라타제 효소가 존재한다(표 1).
Figure pct00005
그러나, 프로판-2-온 및 프로판-2-올로의 프로판-1,2-다이올의 전환이 결코 관찰되지 않았고, 이 반응을 촉매화하는 효소가 이전에 공지되어 있지 않다. 또한 프로판-1,2-다이올의 입체특이적 전환이 기재되어 있지 않다. 본 발명자들은 도 1에 도시된 바대로 프로판-2-온과 프로판-2-올 및/또는 프로판알 및 프로판-1-올로의 프로판-1,2-다이올의 입체특이적 반응을 여기서 확인하였다. 이 이론에 구속됨이 없이, 본 발명자들은 씨. 오토에타노게눔의 신규한 다이올 데하이드라타제가 (R)-프로판-1,2-다이올을 프로판-2-온으로 입체특이적으로 전환시키고 (S)-프로판-1,2-다이올을 프로판-2-올로 입체특이적으로 전환시킨다고 생각한다.
이후, 프로판-2-올로의 프로판-2-온 전환은 이전에 미국 특허 출원 US 제13/403,972호 및 US 제13/459,211호에 기재된 바대로 1차:2차 알코올 데하이드로게나제(서열 번호 5 및 6)에 의해 촉매화된다. 이러한 효소의 1차 기능은 많은 다른 1차 알코올 데하이드로게나제 및 비특이적 에탄올 데하이드로게나제로서 프로판-1-올로의 프로판알의 환원을 또한 촉매화할 수 있다(Ismaiel et al. 1993).
다이올 데하이드라타제 유전자의 확인
씨. 오토에타노게눔의 게놈에서의 조사는 아미노산 수준에서 씨. 부티리쿰(ABX65443 및 ABX65444)의 B12 독립적 글라이세롤 데하이드라타제에 낮은 상동성(각각 식별자 = 503/844(59%), 양성 = 626/844(74%), 갭 = 63/844(7%), 식별자 = 125/257(49%), 양성 = 181/257(70%), 갭 = 0/257(0%))을 갖는 유전자(서열 번호 3 및 4)를 확인하였다.
이 효소는 클로스트론 시스템을 이용하여 씨. 오토에타노게눔에서 넉아웃되어(Heap et al. 2007), 프로판-1,2-다이올을 이용하고 임의의 프로판-2-온, 프로판-2-올, 프로판알 또는 프로판-1-올을 형성할 수 없는 균주를 생성시켜, 이 효소가 프로판-2-온 및 프로판알로의 프로판-1,2-다이올의 입체특이적 전환을 담당하는 신규한 다이올 데하이드라타제라는 것을 입증한다.
유전자의 센스 가닥에서 2052번 염기와 2053번 염기 사이에 그룹 II 인트론 표적 자리를 확인하고 pMTL007C-E2 벡터에서 화학적으로 합성된 인트론 표적화 구역(서열 번호 13)을 설계하기 위해 ClosTron.com에서 호출된 페루트카(Perutka) 알고리즘을 이용하였다. pMTL007C-E2-pfl-1136-2052!2053s인 최종 벡터는 표적 자기로의 삽입 시 항생제 클라리쓰로마이신에 내성을 부여하는 레트로-전위-활성화 ermB 마커(RAM)를 함유한다.
pMTL007C-E2-pfl-1136-2052!2053s 플라스미드를 상기 기재된 바대로 씨. 오토에타노게눔으로 도입하였다. 15마이그/㎖의 티암페니콜을 갖는 PETC-MES 한천에서의 단일 콜로니의 스트리크를 순차적으로 만들고, 8개의 콜로니를 표적 유전자에서 그룹 II 인트론 삽입 자리를 플랭킹하는 프라이머 Og84f(서열 번호 14) 및 Of85r(서열 번호 15) 및 맥시머(Maxime) PCR 프레믹스 키트(PreMix Kit)를 사용하여 PCR에 의해 그룹 II 인트론 삽입에 대해 무작위로 스크리닝하였다. 16s rDNA를 프라이머 fD1(서열 번호 16) 및 rP2(서열 번호 17) 및 맥시머 PCR 프레믹스 키트를 사용하여 또한 PCR 증폭시켰다. 316bp의 PCR 생성물은 비변형된 야생형 유전자형을 나타내고, 약 2kb의 PCR 생성물은 표적 유전자에서 그룹 II 인트론의 삽입을 나타낸다. 모든 8개의 클론은 약 2kb의 PCR 생성물의 증폭에 의해 보이는 것처럼 유전자 파괴에 대해 양성인 것으로 나타났다(도 10). 추가로, 클론-4(서열 번호 18 및 19) 및 클론-7(서열 번호 20 및 21)로부터의 PCR 생성물의 서열분석은 PCR 생성물이 RAM 카세트를 갖는 그룹 II 인트론 표적화 단편이라는 것을 확인시켜주었다. 클론-4(서열 번호 22 및 23) 및 클론-7(서열 번호 24 및 25)의 16s rDNA PCR 생성물이 또한 서열 검증되어, 2개의 클론이 씨. 오토에타노게눔이라는 것을 확인시켜주었다. 이 결과는 씨. 오토에타노게눔에서의 추정상 다이올 데하이드라타제 유전자의 파괴를 확인시켜주었다. 클론 4를 프로판-1,2-다이올의 존재 하에 성장에 의해 시험하였고, 이 균주는 프로판-1,2-다이올을 이용하고 임의의 프로판-2-온, 프로판-2-올 또는 프로판-1-올을 형성할 수 없어서(도 11), 이 효소가 프로판-2-온 및 프로판알로의 프로판-1,2-다이올의 입체특이적 전환을 담당하는 신규한 다이올 데하이드라타제라는 것을 입증한다.
유사한 유전자(CLJU_c11830; 9444800 및 CLJU_c11831; 9444801) 및 효소(YP_003779353 및 YP_003779354)는 각각 99%(1의 미스매치) 및 100%의 동일성으로 씨. 리운그달리에 오직 존재한다. 각각의 유전자 및 효소는 다이올 데하이드라타제로서가 아니라 피루베이트:포르메이트 리사세(lysase)로 설명된다. 다이올 데하이드라타제 효소(서열 번호 1)의 BLAST 결과는 도 8에서 개관의 표 2에 기재되어 있다(흑색 막대는 표준품 씨. 오토에타노게눔 다이올 데하이드라타제의 아미노산 서열에 대한 미스매치이고, 흰색 구역은 갭을 나타냄). 임의의 다른 효소, 예컨대 씨. 부티리쿰으로부터 공지된 것에서가 아니라 씨. 리운그달리에 오직 존재하는 효소의 596번 위치와 656번 위치(서열 번호 9) 사이에 특이적 도메인이 있고, 효소의 나머지는 우수한 상동성을 공유한다는 것을 볼 수 있다. 이 이론에 구속됨이 없이, 본 발명자들은 이 단백질 도메인이 프로판-2-온 및 프로판알로의 프로판-1,2-다이올의 전환을 허용할 수 있다고 생각한다.
오직 씨. 오토에타노게눔 및 씨. 리운그달리의 다이올 데하이드라타제가 프로판-1,2-다이올로부터 프로판-2-온 및 프로판알로의 이 신규한 반응을 촉매화할 수 있는지를 시험하기 위해, 씨. 오토에타노게눔 및 씨. 리운그달리와 몇몇 특징을 공유하는 밀접히 연관된 씨. 라그스달레이와 같은 다른 일산화탄소영양 유기체(Kopke et al. 2011)(WO 2008/028055) 및 유기체, 예컨대 관련 다이올 데하이드라타제를 갖는 씨. 부티리쿰을 5g/ℓ의 프로판-1,2-다이올의 라세믹스 혼합물의 존재 하에 성장시켰다(표 3). 글라이세롤/다이올 데하이드라타제 유전자가 발현되는지를 보장하기 위해, 씨. 부티리쿰을 글라이세롤의 존재 하에 성장시켰다.
Figure pct00006
클로스트리듐 리운그달리 세포는 실제로 동일한 효소 및 또한 2차 알코올 데하이드로게나제가 존재하므로 라세미 프로판-1,2-다이올을 프로판-1-올 및 프로판-2-올로 전환시킬 수 있었다(도 4). 그러나, 클로스트리듐 라그스달레이는 라세미 프로판-1,2-다이올의 전환 또는 소비를 나타내지 않았다(도 5). 클로스트리듐 카복시디보란스는 모든 라세미 프로판-1,2-다이올을 소비하였지만, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올이 아니라 프로판-1-올만을 생성하였다(도 6). 클로스트리듐 부티리쿰은 또한 라세미 프로판-1,2-다이올을 프로판-1-올로 전환시키고(도 9), 이는 문헌(Brien et al. 2004)에 기재된 결과를 확인시켜준다. 클로스트리듐 카복시디보란스의 경우, 프로판-1,2-다이올의 전환이 이전에 관찰되지 않았지만, 클로스트리듐 카복시디보란스는 클레브시엘라 옥시토카로부터의 비타민 B-12 독립적 효소에 상동성인 데하이드라타제에 대한 유전자를 갖는다.
상기 기재된 바대로, 씨. 오토에타노게눔의 다이올 데하이드라타제 효소는 입체특이적이어서, 프로판-1,2-다이올의 (S) 형태 및 (R) 형태를 상이한 생성물로 전환시켰다. 씨. 부티리쿰의 배양물을 프로판-1,2-다이올의 상이한 입체이성체와 성장시켜 이것이 유사한 입체특이성을 갖는지를 결정하였다. 프로판-1,2-다이올; 라세미, (R) 또는 (S)를 접종 시 1g의 L-1(13mM)에서 첨가하였다. 40시간 후, (S)-프로판-1,2-다이올을 갖는 배양물은 모든 다이올을 프로판-1-올로 전환시켰다. 라세미 프로판-1,2-다이올을 갖는 배양물은 약 64%를 프로판-1-올(8.3mM)로 전환시켰다. (R)-프로판-1,2-다이올을 갖는 배양물은 약 19%를 프로판-1-올(2.5 mM)로 전환시켰다(표 4).
Figure pct00007
씨. 부티리쿰에서 프로판-1,2-올의 전환을 담당하는 효소는 (R)-이성체보다 높은 속도로 (S)-이성체를 전환시키는 것으로 보이지만, 이성체 둘 다는 프로판-1-알로 전환되고 프로판-1-올로 환원되었다. 이는 씨. 부티리쿰의 효소가 동종 다이올 데하이드라타제이고, 씨. 오토에타노게눔의 효소로서 입체특이적 전환을 할 수 없다는 것을 입증한다. 이성체는 어느 것도 씨. 오토에타노게눔의 배양물에서 관찰되는 것처럼 씨. 부티리쿰 효소에 의해 프로판-2-온으로 탈수되지 않는다.
전환율을 증가시키는 씨. 오토에타노게눔에서의 이종 다이올 데하이드라타제의 발현
포스포트랜스아세틸라제-아세테이트 키나제 오페론(Ppta-ack)의 프로모터 구역을 프라이머 Ppta-ack-NotI-F(서열 번호 10: GAGCGGCCGCAATATGATATTTATGTCC) 및 Ppta-ack-NdeI-R(서열 번호 11: TTCCATATGTTTCATGTTCATTTCCTCC)을 사용하여 증폭시키고, NotI 및 NdeI 제한 자리를 사용하여 이. 콜라이-클로스트리듐 셔틀 벡터 pMTL83151(FJ797647.1)로 클로닝하여(Heap et al. 2009), 플라스미드 pMTL83155를 생성하였다. pddABC인 클레브시엘라 옥시토카로부터의 다이올 데하이드라타제를 코딩하는 유전자를 코돈 최적화하고(서열 번호 12) 합성하였다. 이후, 합성된 pddABC 오페론을 제한 효소 NdeI 및 EcoRI를 사용하여 pMTL83155로 서브클로닝하였다.
pMTL83155-pddABC인 플라스미드를 사용하여 상기 기재된 방법을 이용하여 씨. 오토에타노게눔을 형질전환하였다. 생육을 YTF-한천에서 수행하고, 이때 세포를 플레이트로부터 긁어내고 0.5㎖의 PBS 중에 현탁시키고 15㎍ ㎖-1의 티암페니콜을 포함하는 YTF-한천(8g/ℓ의 트립톤, 5g/ℓ의 효모 추출물, 2g/ℓ의 NaCl, 2.5g/ℓ의 프럭토스 및 7.5g/ℓ의 한천(pH 5.8))에 분포시키고 30psi의 리얼 밀 가스(Real Mill Gas) 중에 37℃에서 항온처리하였다. 단일 콜로니를 15㎍ ㎖-1의 티암페니콜을 포함하는 PETC-MES-한천에서 재스트리킹한 후, 15㎍ ㎖-1의 티암페니콜 및 0.5%의 프럭토스를 포함하는 PETC-MES-한천에서 재스트리킹하였다. 다수의 콜로니를 프럭토스를 갖는 플레이트로부터 선별하고, 30psi의 리얼 밀 가스를 갖는 발치(Balch) 관에서 0.5%의 프럭토스를 갖는 3㎖의 PETC-MES 중에 성장시켰다. 플라스미드의 존재는 PCR에 의해 검증되었다.
pMTL83155-pddABC를 보유하는 씨. 오토에타노게눔을 프로판-1,2-다이올의 존재 하에 성장시킬 때, 플라스미드가 없는 샘플에서보다 프로판-1-올이 더 많이 생성되었다. 형질전환 균주는 또한 야생형보다 프로판-2-올을 더 적게 생성하였다(도 7). 이 데이터는 형질전환 균주가 야생형 씨. 오토에타노게눔에서보다 빠른 속도로 프로판-1,2-다이올을 프로판-1-올로 전환시킨다는 것을 나타낸다.
다이올 데하이드라타제 활성화제 효소
씨. 부티리쿰으로부터의 다이올 데하이드라타제는 S-아데노실메티오닌의 환원성 개열을 통해 라디칼을 생성하는 활성화제 효소를 요하는 글라이실 라디칼 효소인 것으로 이해된다(Raynaud et al 2003, O'brien et al 2004). 유사한 글라이실 라디칼 화학을 갖는 다른 동종 효소, 예컨대 피루베이트 포르메이트-리아제 및 혐기성 리보뉴클레오타이드 환원효소는 유사한 구조 및 활성화제 효소를 갖는다(Atta et al, 2010). 씨. 부티리쿰 다이올 데하이드라타제에 59%의 동일성을 갖는 씨. 오토에타노게눔으로부터의 다이올 데하이드라타제(서열 번호 1)는 유사한 구조를 갖고 프로판-1,2-다이올의 탈수에 대한 유사한 화학을 수행하는 것으로 이해된다. 씨. 오토에타노게눔에서의 활성화제 효소(서열 번호 2)를 코딩하는 유전자(서열 번호 4)는 씨. 부티리쿰에서 및 이. 콜라이에서의 피루베이트 포르메이트-리아제에 대한 유전자에서 관찰되는 것처럼 다이올 데하이드라타제의 바로 하류에 있다.
이. 콜라이에서 다이올 데하이드라타제 및 활성화제 효소의 기능적 발현
신규한 활성을 담당하는 유전자의 식별을 확인하고 대안적인 숙주에서 이 효소 기능을 입증하기 위해, 씨. 오토에타노게눔의 다이올 데하이드라타제(서열 번호 1) 및 활성화제 효소(서열 번호 2)를 코딩하는 유전자는 발현되고 이. 콜라이에서 기능하는 것으로 입증되었다. 유전자(서열 번호 3-4)는 이. 콜라이(서열 번호 26)에 최적화된 코돈으로 합성되고 플라스미드 pTrc99A(Amersham Pharmacia)에서 오페론에서 발현되었다.
에스체리치아 콜라이 JM109는 작제된 플라스미드(pTrc-dhaB1B2) 및 대조군으로서의 pTrc99A로 형질전환되었다. LB에서 성장한 밤샘 배양물을 사용하여 0.2㎎/㎖의 황산철암모늄 12수화물로 보충되고 60mM의 프로판-1,2-다이올(R, S 또는 라세미)을 포함하는 2X-YT를 접종하였다. 37℃에서의 호기성 성장 4시간 후, 아이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드를 1mM의 최종 농도로 첨가하여 다이올 데하이드라타제의 발현을 유도하고 관을 캡핑하였다. 이후, 배양물을 30℃에서 성장시켰다. 48시간 후, 프로판-1,2-다이올 및 생성물의 농도를 HPLC에 의해 측정하였다(표 5). 라세미 프로판-1,2-다이올의 경우에, 기질의 농도를 34mM으로 감소시켜 각각 9.2mM 및 14.7mM의 아세톤(프로판-2-온) 및 프로판-1-올을 생성시켰다(도 12). 에스체리치아 콜라이는 2차 알코올 데하이드로게나제가 결여되어 씨. 오토에타노게눔에서 발생하는 것처럼 프로판-2-온을 프로판-2-올로 환원시켰다. 프로판-2-온은 이것이 이용된 HPLC 방법에서 유사한 보유 시간을 갖는 프로판-2-올이 아니라는 것을 보장하도록 GC에 의해 검증되었다.
Figure pct00008
이는 씨. 오토에타노게눔의 이종 다이올 데하이드라타제 오페론을 발현하는 재조합 이. 콜라이에서 프로판-2-온 및 1-프로판올로의 프로판-1,2-다이올의 성공적인 전환을 나타낸다.
이. 콜라이에 의한 프로판-1,2-다이올의 생성을 위한 경로가 이전에 기재되어 있다(Jain and Yan 2011). 씨. 오토에타노게눔의 다이올 데하이드라타제 오페론과 조합된 이 경로의 발현은 아세톤의 생성을 허용한다. (미국 특허 출원 US 제13/403,972호 및 US 13/459,211호에 기재된 바대로) 2차 알코올 데하이드로게나제 유전자는 아이소프로판올 생성을 위해 동시발현될 수 있고, 문헌(van Leeuwen et al. 2012)(WO2011032934)에 기재된 동시발현 유전자는 아이소뷰틸렌 생성을 허용한다.
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상기 및 하기 인용된, 있다면, 모든 출원, 특허 및 공보의 전체 개시내용은 참조문헌으로 본 명세서에 의해 포함된다. 그러나, 본 명세서에서의 임의의 출원, 특허 및 공보에 대한 참조문헌은, 이들이 세계의 어떠한 나라에서 유효한 선행 기술을 구성하거나 일반 상식의 일부를 형성한다는 승인 또는 임의의 제안 형태로 취해지지 않고, 취해져서는 안 된다.
본 명세서 및 하기하는 임의의 청구항에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다", "포함하는" 등은 배타적인 것과 반대로 포괄적 의미로, 즉 "포함하지만, 이들로 제한되지는 않는"으로 해석되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> LanzaTech New Zealand Limited <120> RECOMBINANT MICROORGANISMS AND USES THEREFOR <130> WO2014/036152 <140> PCT/US2013/057103 <141> 2013-08-28 <150> US 61/694,104 <151> 2012-08-28 <150> US 61/720,224 <151> 2012-10-30 <160> 26 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 854 <212> PRT <213> Clostridium autoethanogenum <400> 1 Met Asn Asp Val Leu Asn Lys Leu Tyr Thr Ala Asn Gln Ser Lys Arg 1 5 10 15 Ile Glu Lys Leu Thr Asn Asp Leu Tyr Ser Val Thr Pro Glu Ile Glu 20 25 30 Ala Gln Arg Ala Val Leu Ile Thr Glu Ser Phe Lys Glu Thr Glu Ala 35 40 45 Tyr Pro Met Ile Ile Arg Arg Ala Lys Ala Leu Glu Lys Ile Leu Asn 50 55 60 Glu Met Asp Ile Val Ile Arg Asp Glu Glu Leu Ile Val Gly Asn Leu 65 70 75 80 Thr Lys Lys Pro Arg Ala Ala Ser Ile Phe Pro Glu Phe Ser Asn Lys 85 90 95 Trp Leu Leu Glu Glu Phe Asp Thr Leu Ala Lys Arg Thr Gly Asp Val 100 105 110 Phe Leu Ile Ser Glu Asp Val Lys Ser Gln Leu Arg Glu Val Phe Lys 115 120 125 Tyr Trp Asp Gly Lys Thr Thr Asn Glu Leu Ala Thr Glu Tyr Met 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ttcgcgatta ctagcaactc caacttcatg taggcgagtt tcagcctgca 180 atccgaactg ggggcagttt ttgaggtttg ctccaccttg cggtcttgct tctctctgta 240 ctgcccattg tagcacgtgt gttgccctgg acataagggg catgatgatt tgacgtcatc 300 cccaccttcc tccgcgttaa ccgcggcagt cttgctagag tgctcaayta awtgttagca 360 actaacaaca ggggttgcgc tcgttgcagg acttaaccta acatctcacg acacgagctg 420 acgacaaccw tgcaccacct gtwtccctgc cccgaagggy ttctcttatc tctaagatat 480 tcagggtatg tcaagtccag gtaaggttct tcgcgttgct tcraattaaa ccacatgctc 540 cgctgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttta atcttgcgat cgtacttccc 600 aggcggagta cttattgtgt twactgcgkc acaraaggrg tcgatacctc ctacayctag 660 tactcatcgt ttacggcgtg kactaccakg gtatctaatc ctgtttgctm cccaykcttt 720 cktgccwcak cgtcwrttac rktcmaakaa tcsccttygc cwctggtgtt ttccwaatct 780 ctaskkwtty ackgsamwyt agsaattcct tytcctcycc cgymcyctar atatccyrtt 840 tgaatgcagt gmcmwgrtaa mcccggkatt mmawctytmt taatt 885 <210> 24 <211> 1005 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum <400> 24 agcagggcar gcctwacacm tkasaakycs krwssmggka gccgtaagct tggatcccgg 60 gaygacgggt gagtaacrsg kgggtraccw acsycrrrga gggggatagc ctcccsaawg 120 ggakattaat accscataat aatcagtttt cwcatggaga ctgwtttaaa ggagtaatcc 180 gytttgagat ggacccgcgg cgcattagct wkttggtagg gtaacggcct accmaggcga 240 ckatgcgtag ccgacctgas agggtgatcg gccacwttgg aactgasaga ckgtccasac 300 tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaakgggc gaaagcctga tgcascaacg 360 ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggattgt aaagctctgt ctttggggac gatratgacg 420 gtaccsaagg aggargccmc ggstaactac gkgccascmk ccgcggtaat acgtasgtgg 480 cgagcgttgt ccggaattac tgggcgtaaa gagtgcgtag gcggatattt aagtgagatg 540 tgaaataccc gggcttaacc ygggywctgc atttcaaact ggatatctag agtgcgggag 600 aggagaatgg aattcctagt gtagcggtga aatgcgtaka sattakgaag aacaccaktg 660 gcgaaggcga ttytctggac cgtractgay gctgakgcac gaaagcgtgg gtakcaaaca 720 ggattagata cyctggtagt ccacrccgta aacgatgagt actkggtgta ggaggtwtcg 780 accccttmtg tgccgcakta aacacwataa ktactccgcc tggaawgtac gatcgcaakw 840 twaaawctca arggakttga cgggggcscg cwcwagcakc ggagcawgtk gkttaattys 900 arcwcgyraa samcttacct ggamytkacw wmcctkmatw yttwaraswt agwgyrscct 960 tsrggsaggg awrrwkksgt gtrtgttsck cakwycgtyt rtaag 1005 <210> 25 <211> 1117 <212> DNA <213> Clostridium autoethanogenum <400> 25 cccgcwgycr tagcykyskm kwckwagkyr wckragmcrr gatcaarctc tgttgtcgac 60 raattcggac tmtcakggtg wgacgggsgg kgtgwacaak gcccgggaac gtattcaccg 120 cgacattctg attcgcgatt actagcaact ccaacttcat gtaggcgagt ttcagcctgc 180 aatccgaact gggggcagtt tttgaggttt gctccacctt gcggtcttgc ttctctctgt 240 actgcccatt gtagcacgtg tgttgccctg gacataaggg gcatgatgat ttgacgtcat 300 ccccaccttc ctccgcgtta accgcggcag tcttgctaga gtgctcaact aaatgttagc 360 aactaacaac aggggttgcg ctcgttgcag gacttaacct aacatctcac gacacgagct 420 gacgacaacc atgcaccacc tgtatccctg ccccgaaggg yttctcttat ctctaarata 480 ttcagggtat gtcaagtcca ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcraattaa accacatgct 540 ccgctgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttt aatcttgcga tcgtacttcc 600 caggcggagt acttattgtg tttactgcgg cacagaaggg gtcgatacct cytacaccta 660 gtactcatcg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct acccacgctt 720 tcgtgcctca kcgtcagtta cggtccagag aatcgccttc gccactggtg ttcttcctaa 780 tctctacgca tttmaccgct acactaggaw tycmttctcc tctcccgcac tctagatatc 840 yagtttkaaa tgcagtgccc gggttaagcc cgggtatttc acatctcact waatatccgc 900 ctacgcactc kttmcgccca gtaatyccga macgctcgcm yctacgtatt acgcggytgc 960 tgcacgtagt tagccgkgct tyctcttggg tmccgtmmtt ayskycccaa kamagagctt 1020 tacaatckga aacyttcttm wytcmksmgs gtgctgmtag cttygycwtg kgcaawatcc 1080 mmtgcgccyy cgatgakytg rwctgyctma ktyaagt 1117 <210> 26 <211> 3566 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C. autoethanogenum diol dehydratase operon codon optimized for E. coli <400> 26 atttcacaca ggaaacagac catgaatgac gtgctgaata aactgtatac cgccaatcag 60 agcaaacgca ttgaaaaact gaccaacgat ctgtatagcg tgacaccgga aattgaagca 120 cagcgtgcag ttctgattac cgaaagcttt aaagaaaccg aagcctaccc gatgattatt 180 cgtcgtgcaa aagcactgga aaaaatcctg aacgaaatgg atattgtgat ccgtgatgaa 240 gaactgattg ttggcaatct gaccaaaaaa ccgcgtgcag caagcatttt 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gcacatacca aactgccgca gccgagcatt agcattcgtg catggaataa aacaccggat 1200 gaactgctgc tgaaagcagc agaagttacc cgtctgggtc tgggtatgcc tgcctattat 1260 aacgatgaag ttattattcc gagcctgacc agccgtggtc tgaccctgga agatgcacgt 1320 gattatggta ttattggttg tgttgaaccg cagaaaggtg gcaaaaccga aggttggcat 1380 gatgcagcct ttttcaatat tgttaaagtg ctggaaatca ccatcaacaa cggtatggat 1440 aacggtaaac aaattggtct gcgcaccggt gattttacca gctttaccag ttttgagaaa 1500 ctgttcgatg cctacaaact gcagatggaa tattttgtga aactgctggt gaatgccgat 1560 aattcagttg atctggcaca tggtgaacgt gcaccgctgc cgtttctgag cagcatggca 1620 gatgattgta ttgcacgtgg taaaagcctg caagaaggtg gcgcacatta taactttacc 1680 ggtccgcagg gtgttggtgt tgcaaatgca gcagatagcc tggaagccat caaaaaactg 1740 gtgttcgagg acaaaaaaat caccctgcag gatctgaaaa atgccctgga taccaatttt 1800 ggcgagtgca aaaaaaaccc gattagcgaa ctggccaata gcattaatga agtgggtgat 1860 atgaaaggcc tgactccgga aaccattctg aaagttatcg aaaaactgct gagcgaagag 1920 aaaaaaacca gtctggaagg tctggaaccg ggtaaagata tcaatctggg tagctatggt 1980 aacaaagaaa gcattcgtca gatgctgctg aatcgtgcac cgaaatttgg caatgatatt 2040 gatgaagttg atgacctggc acgtgaagca gcactgattt attgtaacga agtggaaaag 2100 tataccaatc cgcgtaatgg ccagtttcag cctggtctgt atccggttag cgcaaatgtt 2160 ccgatgggta gccagaccgg tgcaactccg gatggtcgta aagccggtga accgctggca 2220 gatggtgtta gtccggtgag tggccgtgat gccatgggtc cgaccgcagc agcaaatagc 2280 gttgcaaaaa ttgatcattg caaagccagc aatggcaccc tgtttaacca gaaatttcat 2340 ccgagcgcac tggaaggcca gacaggtctg cagaatctgt caagcctggt tcgtaccttc 2400 tttgatgaga aaggtctgca tgttcagttt aatgttgtta gccgtgaaac cctgctggat 2460 gcacagaaaa atccggaaaa ttatcgcaat ctggttgttc gtgttgcagg ttatagcgca 2520 cattttacct cactggataa aagcattcag gacgatatta tcaaacgcac cgaacacacc 2580 ttttaaagct ttttatagga ggaaaagtta tgctgaacta ccaggtgaac ctggataaaa 2640 aaggcatcat ctttgatatc cagcgcttta gcgttcatga tggtccgggt attcgtacca 2700 ttgttttttt caaaggttgt ccgctgagct gtcgttggtg tagcaatccg gaatcacagt 2760 gtatggaacc gcaggtaatg tttattccgt caaaatgcat tggctgcaaa aaatgttatg 2820 aggtgtgcag caatggtgcc atcgatttta atctgccgag ccgtgttgat cagaataaat 2880 gtgttaaatg cggcaaatgc gtggaaaatt gttatgccgg tgcactgaat ctggcaggta 2940 atacccgtac cgttaaagag ctgctgctgg aactgaaaaa agacaacatc tattatcgtc 3000 gtagcggtgg tggtattacc ctgagtggtg gtgaagttac cgcacagccg gaatttgcag 3060 aggaactgct gaaaggttgt aaacagaatg gctggcatac cgcaattgaa accgcagcat 3120 ttaccagcca gagcgttctg gaacgtatgc tgccgtggct ggatctggtt atgctggata 3180 ttaaacatat ggacgccaac aaacacctgg aatataccgg taaaccgaac gaactgatcc 3240 tgcaaaatgc aaaactgatt gcacagtttg gtgttcagct gattatccgt gttccggtga 3300 ttcctggtgt taatagtgat gaaaacaata ttcgtgccac cgccaatttt gcaaccagcc 3360 tgaaaagcgt gaaagaactg catctgctgc cgtatcatcg tctgggtgaa aacaaatatg 3420 aatatctggg ccacgattac atcatgaaag gactgcagcc tccgacaaaa gaagaaatca 3480 ataaactgaa agaactggtg gaagaatgcg gtctgatttg taaagtgggt ggcattgatt 3540 aaagcttggc tgttttggcg gatgag 3566

Claims (33)

  1. 이종, 입체특이적 다이올 데하이드라타제 효소(heterologous, stereospecific diol dehydratase enzyme)를 포함하는, 단리된 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소는 클로스트리듐 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) 다이올 데하이드라타제인, 단리된 재조합 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 효소는 클로스트리듐 리운그달리(Clostridium ljungdahlii) 다이올 데하이드라타제인, 단리된 재조합 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효소는 클로스트리듐 오토에타노게눔 다이올 데하이드라타제와 적어도 80% 동일한, 단리된 재조합 미생물.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 프로판-2-온을 프로판-2-올로 전환시키지 않는, 단리된 재조합 미생물.
  6. 제1항 또는 제4항에 있어서, 프로판알을 프로판-1-올로 전환시키지 않는, 단리된 재조합 미생물.
  7. 제1항 또는 제4항에 있어서, 일산화탄소영양 초산생성 박테리아(carboxydotrophic acetogenic bacterium)인, 단리된 재조합 미생물.
  8. 입체특이적 다이올 데하이드라타제 효소를 포함하는 단리된 미생물로서, 야생형 클로스트리듐 오토에타노게눔 또는 클로스트리듐 리운그달리보다 상기 효소 활성을 더 많이 발현하도록 유전자 변형된, 단리된 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 효소를 코딩하는 유전자의 야생형 평균 카피수보다 상기 유전자의 더 높은 평균 카피수를 갖도록 유전자 변형된, 단리된 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 더 높은 평균 카피수는 2 이상인, 단리된 미생물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 더 높은 평균 카피수는 3 이상인, 단리된 미생물.
  12. 제8항에 있어서, 입체특이적 다이올 데하이드라타제 효소 액티바제(activase)를 코딩하는 유전자의 야생형 평균 카피수보다 상기 유전자의 더 높은 평균 카피수를 갖도록 유전자 변형된, 단리된 미생물.
  13. 프로판-1,2-다이올을 포함하는 발효 브로스(fermentation broth) 중에 제1 미생물을 배양하여, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 단계를 포함하는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 프로판-1,2-다이올은 상기 발효 브로스 내에서 인시츄(in situ)로 생산되는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 프로판-1,2-다이올은 상기 제1 미생물에 의해 생산되는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 프로판-1,2-다이올은 제2 미생물에 의해 생산되는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 제1 미생물은 클로스트리듐 오토에타노게눔인, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 제1 미생물은 클로스트리듐 리운그달리인, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 제1 미생물은 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli)인, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 제1 미생물은 일산화탄소영양 초산생성 박테리아인, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  21. 제13항에 있어서, 상기 발효 브로스는 일산화탄소(CO)를 포함하는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  22. 제13항에 있어서, 상기 발효 브로스는 합성가스, 산업용 폐가스, 제강소용 폐가스로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 에너지원을 포함하는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  23. 제13항에 있어서, 상기 발효 브로스는 당, 전분, 셀룰로스, 바이오매스 가수분해물 및 글라이세롤로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 에너지원을 포함하는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  24. 제13항에 있어서, 상기 발효 브로스로부터 프로피온알데하이드, 프로판-2-온, 프로판-1-올 및 프로판-2-올로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 생성물을 회수하는 단계를 더 포함하는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  25. 제13항에 있어서, 상기 발효 브로스는 주로 프로판-1,2-다이올의 (R) 거울상이성체를 포함하는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  26. 제13항에 있어서, 상기 발효 브로스는 주로 프로판-1,2-다이올의 (L) 거울상이성체를 포함하는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  27. 제13항에 있어서, 상기 미생물은 프로판-1-올에 비해 프로판-2-올을 주로 생산하는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  28. 제13항에 있어서, 상기 미생물은 프로판-2-올에 비해 프로판-1-올을 주로 생산하는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  29. 제13항에 있어서, 상기 미생물은 프로판-2-온에 비해 프로피온알데하이드를 주로 생산하는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  30. 제13항에 있어서, 상기 미생물은 프로피온알데하이드에 비해 프로판-2-온을 주로 생산하는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  31. 제13항에 있어서, 상기 미생물은 프로판-2-온을 프로판-2-올로 전환시키지 않는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  32. 제13항에 있어서, 상기 미생물은 프로판-2-온을 프로판-2-올로 전환시키는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
  33. 제13항에 있어서, 상기 발효 브로스는 적어도 1g/ℓ의 프로판-1,2-다이올을 포함하는, 프로판-2-온 또는 프로판-2-올 중 적어도 하나를 생산하는 방법.
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