KR20150037875A - 이사부코나졸 또는 라부코나졸의 제조 방법 - Google Patents

이사부코나졸 또는 라부코나졸의 제조 방법 Download PDF

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    • A61P31/10—Antimycotics

Abstract

본 발명은, 케톤과 2-할로아연 프로피온산염 에스테르 간 레포르마츠키 반응, 그 이후에 행하여지는 분할 단계, 바람직하게는 에스테라아제 효소가 이용되는 효소 분할 단계를 포함하는, 부분 입체 이성체 및 거울상 이성체 풍부화 트리아졸 화합물인 이사부코나졸 및 라부코나졸의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

이사부코나졸 또는 라부코나졸의 제조 방법{PROCESS FOR THE MANUFACTURE OF ISAVUCONAZOLE OR RAVUCONAZOLE}
본 발명은 이사부코나졸 또는 라부코나졸에 대한 부분 입체 이성체 및 거울상 이성체 풍부화 에스테르의 중간체의 제조 방법에 관한 것이다.
이사부코나졸 및 라부코나졸은 트리아졸계 항진균 화합물이다. 이사부코나졸 및 라부코나졸의 제조 방법은 특허 WO 제99/45008호, WO 제2007/062542호 및 WO 제03/002498호(Basilea)에 개시되었다. WO 제2011/042827호에는 거울상 이성체적으로 순수한 항진균 아졸, 예를 들어 라부코나졸 및 이사부코나졸의 제조 방법이 개시되어 있는데, 이 방법에서는 거울상 순수한 키랄 산을 첨가한 다음, 원하는 부분 입체 이성체를 수집한 후, 염기 또는 이온 교환 수지를 이용한 처리에 의해 염을 원하는 화합물의 거울상 이성체적으로 순수한 형태로 전환함에 의한, 라세미 혼합물의 고전적인 분할이 수행된다. 이와 같은 고전적 분할을 사용할 때의 단점들로서는, 키랄 보조제가 화학 양론적 양에 가까운 양으로 적용될 필요가 있다는 점과, 이러한 비교적 많은 양의 키랄 시약을 회수하고, 염을 거울상 순수한 유리 생성물로 전환하는 추가의 공정 단계들이 필요하다는 점이 있다.
그러므로 본 발명의 목적은 이사부코나졸 또는 라부코나졸을 높은 부분 입체 이성체 과량(d.e.) 및 거울상 이성체 과량(e.e.)으로 제조하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본원에 정의된 "거울상 이성체 풍부화(enantiomerically enriched)"은 용어 "광학 활성"과 동일한 것으로서, 화합물의 거울상 이성체들 중 하나가 나머지 거울상 이성체들에 비하여 과량으로 존재하는 것을 의미한다. 이러한 과량은 이하에서 "거울상 이성체 과량(enantiomeric excess)" 또는 e.e.(예를 들어, 키랄 GC 또는 HPLC 분석법에 의해 측정됨)라고 칭하여질 것이다. 거울상 이성체 과량, 즉 e.e.는, 거울상 이성체들의 양 사이의 차를 거울상 이성체들의 양의 합으로 나눈 값에 100을 곱하여 백분율로 표현될 수 있는 값과 동일하다.
"부분 입체 이성체 풍부화(diastereomerically enriched)"란, 화합물의 부분 입체 이성체들 중 하나가 나머지 부분 입체 이성체들에 비하여 과량으로 존재하는 것을 의미한다. 이러한 과량은 이하에서 "부분 입체 이성체 과량(diastereomeric excess)" 또는 d.e.라고 칭하여질 것이다. 이와 유사하게, 부분 입체 이성체 과량, 즉 d.e.는, 부분 입체 이성체들의 양 사이의 차를 부분 입체 이성체들의 양의 합으로 나눈 값에 100을 곱하여 백분율로 표현될 수 있는 값과 동일하다.
이제 본 발명은 화학식 I에 따른 부분 입체 이성체 풍부화 화합물의 제조 방법에 관한 것으로서,
[화학식 I]
Figure pct00001
(상기 식에서, R1 및 R2는 각각 플루오르화물 또는 수소이고, R1이 플루오르화물일 때 R2는 수소이고, R2가 플루오르화물일 때 R1은 수소이며, R은 C1-C12알킬, C5-C12아릴 또는 C6-C11아랄킬임)
상기 방법은
(i) 용매의 존재 하,
이 용매의 비등점 미만의 온도에서,
화학식 II에 따른 2-할로아연 프로피온산염 에스테르를 제조하는 단계,
[화학식 II]
Figure pct00002
(상기 식에서, X는 브롬화물, 요오드화물 또는 염화물임)
(ii) 화학식 III에 따른 케톤을 도입하는 단계,
[화학식 III]
Figure pct00003
;
(iii) 용매의 존재 하, 과량의 아연이 제거된 조건 하에서, 화학식 II에 따른 2-할로아연 프로피온산염 에스테르와, 화학식 III에 따른 케톤 간 레포르마츠키 반응(Reformatsky reaction)을 진행하여, 화학식 I에 따른 에스테르의 원하는 (2R,3R)/(2S,3S)-부분 입체 이성체들을 침전시키는 단계
를 포함하고, 단계 (i)과 단계 (ii)가 수행되는 순서는 서로 바뀔 수 있다.
더 구체적으로, 본 발명은 화학식 I에 따른 3-하이드록시-2-메틸-4-[1,2,4]트리아졸-1-일-3-페닐-부티르산 에스테르 유도체의 부분 입체 이성체의 혼합물(상응하는 (2R,3R)/(2S,3S) 라세미체가 농축된 것)의 제조 방법에 관한 것으로서,
[화학식 I]
Figure pct00004
;
Figure pct00005
;
(상기 식에서, R1 및 R2는 각각 플루오르화물 또는 수소로서, R1이 플루오르화물일 때 R2는 수소이고, R2가 플루오르화물일 때 R1은 수소이며, R은 C1-C12알킬, C5-C12아릴 또는 C6-C11아랄킬임)
상기 방법은
(i) 용매의 존재 하,
이 용매의 비등점 미만의 온도에서,
화학식 II에 따른 2-할로아연 프로피온산염 에스테르를 제조하는 단계,
[화학식 II]
Figure pct00006
(ii) 화학식 III에 따른 케톤을 도입하는 단계,
[화학식 III]
Figure pct00007
(iii) 용매의 존재 하에서, 화학식 II에 따른 2-할로아연 프로피온산염 에스테르와, 화학식 III에 따른 케톤 간 레포르마츠키 반응을 진행하고, 생성된 반응 혼합물에 마지막 시약을 첨가하고 나서 이 혼합물을 교반하거나 교반하지 않으면서 0.5시간 초과, 바람직하게는 2시간 초과 동안 방치하여 생성된 반응 혼합물이 침전물을 형성하도록 하며, 상기 침전물은 화학식 I에 따른 라세미 (2R,3R)/(2S,3S) 에스테르가 풍부화된 것인 단계, 및
상기 침전물을 분리하는 단계
를 포함하고, 단계 (i)과 단계 (ii)가 수행되는 순서는 서로 바뀔 수 있으며, 과량의 아연은 상기 침전물의 형성 전에 제거된다.
놀랍게도, 이러한 레포르마츠키류 반응은 부분 입체 이성체 풍부화 이사부코나졸과 라부코나졸을 생성한다. 선행 기술의 방법과는 대조적으로, 본 발명에 따른 방법은 간단한 반응물과 반응 조건들을 필요로 하고, 원하는 이성체를 고수율로 전달한다.
EP 제0199474호에서, 레포르마츠키 반응은 트리아졸 화합물 제조에 적용되었다. 이러한 화합물이 라세미 혼합물의 형태로서 얻어질 수 있으며, 이러한 혼합물은 당업계에 공지된 방법들에 의해 개별 이성체들로 분리될 수 있다고 개시되어 있었다. 그러나, 레포르마츠키 반응으로 얻어진 라세미 에스테르의 성공적인 효소 분할(enzymatic resolution)은 에스테르가 높은 부분 입체 이성체 순도로, 비용 효율적으로 생산되면서 확장 가능(scalable)할 것을 필요로 한다. 본 출원의 비교예 B에서도 입증된 바와 같이, EP 제0199474호에 개시된 바와 같은 레포르마츠키 반응으로부터 얻어진 에스테르는 이러한 요구 조건을 충족하지 않는다. 놀랍게도 본 발명자들은, 본 발명에 따라 레포르마츠키 시약인 2-할로아연 프로피온산염 에스테르가 용매의 비등점 미만의 온도에서 얻어진 후 침전되도록 하는 레포르마츠키 반응으로, 에스테르(I)의 원하는 부분 입체 이성체가 단일 단계에서 매우 높은 d.e.(97% 초과)로 직접 얻어질 수 있다는 것을 발견하였다.
라세미 에스테르(I)의 대안적 제조 방법으로서는 유기 리튬 염을 사용하는 결합 반응이 있다. 예를 들어, WO 제9217474호는, -70℃에서 케톤(III)(R2는 F임)에 대한 에틸 프로피온산염의 리튬 디이소프로필아미드(LDA) 매개 결합을 통하여 에스테르(I)(R2는 F임)를 제조하는 방법을 개시한다. 반응에서 형성된 2가지 부분 입체 이성체들(d.e.는 보고되지 않음)을 분리하는 데 컬럼 크로마토그래피가 적용되었으나, 이 컬럼 크로마토그래피는 대규모 생산에서 비효율적이고 비용도 많이 드는 정제 방법인 것으로 간주되고 있다. 본 출원인의 회사 내부 제조시에서도 유사한 결과들이 얻어졌는데(비교예 A 참조): LDA의 존재 하 -78℃에서 에틸 프로피온산염이 케톤(III)(R1은 F임)과 결합될 때, 원하는 에스테르(I)(R1은 F임)가 수율 61%로 분리되었는데, 이때 부분 입체 이성체 과량(d.e.)은 29%로 적었다. 그러므로,
a) 작은 부분 입체 선택성과 이에 따른 낮은 반응 수율;
b) 반응 후 d.e.를 증가시키는 비용 효율적이고 확장 가능한 방법의 부재; 및
c) 고 비용과 연관된 저온에서 무수 조건의 사용
의 관점에서 보았을 때, 강염기, 예를 들어 LDA(LiHMDS 등)를 수반하는 결합 반응은 일반 구조식 I의 에스테르들이 이 반응과 관련된 분야에서 산업상 사용되지 못하게 한다.
본 발명에 따른 방법의 레포르마츠키 반응 후에 측정된 부분 입체 이성체 과량은 50% 내지 60% d.e.로 다양하다. 침전 후 생성물은 97% 내지 99.9% d.e. 사이에서 다양한, 부분 입체 이성체 과량으로 분리된다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (iii) 이후에 얻어지는 생성물은 임의의 공지된 방법, 예를 들어 에스테르의 비누화, 및 얻어진 산 혼합물과, 광학적으로 순수한 염기, 예를 들어 1-페닐에틸아민 또는 2-아미노-1-부탄올의 반응 후 에스테르 혼합물의 부분 입체 이성체 결정화, 또는 키랄 HPLC에 따라서 분할될 수 있다.
그러나, 에스테라아제 효소를 이용한 (2R,3R)/(2S,3S) 에스테르(I)의 후속 효소 분할은, 이사부코나졸 또는 라부코나졸이 d.e. 99% 초과 및 e.e. 99% 초과로 생산되기에 특히 매력적인, 산업상 확장 가능한 경로를 실현시키므로, 상기 후속 효소 분할은 바람직하다. 이러한 화합물 군은 지난 30여년 동안 제약 산업에서 관심의 중심에 있었음에도 불구하고, 그리고 효소 분할은 제약 공정에서 달리 빈번하게 사용되는 기술임에도 불구하고, 상기된 바와 같은 효소 분할 접근법은 트리아졸계 항진균제(에 대한 중간체들)에 사용되었다는 것에 대해서는 보고된 바 없었다. 또한 가장 최근의 해당 분야 특허 출원(WO 제2011/042827호)(발명의 주요 주제로서 "분할 단계"를 포함함)은 고전적 분할만을 개시하고 있을 뿐, 효소 분할은 개시하고 있지 않다. 아마도 트리아졸계 항진균제의 비교적 까다로운 입체적 특성들은, 일반적으로 상기 트리아졸계 항진균제 자체가 효소에 대한 도전적인 기질이 되도록 만든다. 이러한 유형의 기질에 적당한 효소를 찾는 것은 분명히 쉬운 일이 아니다. 실제로, 본 발명에 따른 방법에 대하여 200가지 초과의 가수 분해 효소를 스크리닝하였으며, 단지 한 가지 종류의 효소 군(즉, 에스테라아제)만이 일반식 I의 에스테르에 대한 활성뿐만 아니라 선택성 둘 다를 제공하였다.
요약하면, 항진균제인 이사부코나졸과 라부코나졸의 산업적인 제조는 부분 입체 선택성뿐만 아니라 거울상 선택성 둘 다를 도입하기 위한 효율적이고도 확장 가능한 방법들을 필요로 한다. 본원에 보고된, 효소 분할 방법과 병행되는 부분 입체 선택성 레포르마츠키-침전 프로토콜은 상기 부분 입체 선택성과 거울상 선택성 둘 다를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 화학식 I은 이사부코나졸에 대한 에스테르 중간체를 나타낸다. 화학식 I에서 R1이 플루오르화물이고 R2가 수소일 때, 이사부코나졸에 대한 에스테르 중간체가 나타내어진다. 화학식 I에서 R1이 수소이고 R2가 플루오르화물일 때, 라부코나졸에 대한 에스테르 중간체가 나타내어진다.
화학식 II에 따른 2-할로아연 프로피온산염 에스테르에서 R은 분지형 또는 비분지형 C1-C12알킬, C5-C12아릴 또는 C6-C11아랄킬, 바람직하게는 분지형 또는 비분지형 C1-C8알킬 또는 C5-C8아릴, 더 바람직하게는 분지형 또는 비분지형 C1-C4알킬일 수 있다. 분지형 또는 비분지형 C1-C4알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸 중 임의의 하나일 수 있다. 아릴 2-할로아연 프로피온산염 에스테르에 관한 예로서는 페놀 2-할로아연 프로피온산염 에스테르가 있다. 바람직하게, R은 메틸 또는 에틸이고, 더 바람직하게 R은 에틸이다.
화학식 II에 따른 2-할로아연 프로피온산염 에스테르에서 X는 브롬화물, 요오드화물 또는 염화물 중 임의의 하나일 수 있다. 더 바람직하게 X는 브롬화물이다.
본 발명의 구체예에서, 화학식 II에서 R은 에틸이고, 화학식 II에서 X는 브롬화물이다.
본 발명에 따른 레포르마츠키 반응, 더 구체적으로는 2-할로아연 프로피온산염 에스테르의 제조에 적용되는 온도는 기껏해야 낮은데, 즉 -30℃로부터, 적용되는 용매의 대기압에서의 비등점 사이에서 다양할 수 있다. 적어도 온도는 대기압에서의 용매의 비등점 미만이다. 예를 들어 에스테르 및, 이 에스테르와 함께 유리되는 아연 염(반응을 저해함)과의 동종 결합(homocoupling)으로 말미암아, 더 높은 온도에서는 레포르마츠키 시약의 형성이 저해되며, 이로써 반응물의 완전한 전환이 방해되고 침전에 영향을 미치게 된다. 바람직하게, 온도는 -30℃ 내지 85℃이고, 더 바람직하게는 -10℃ 내지 40℃이며, 가장 바람직하게는 -10℃ 내지 10℃이다. 훨씬 더 바람직하게, 온도는 0℃에 가까우며, 예를 들어 -2℃ 내지 2℃이다.
따라서, 본 발명에 따른 방법의 단계 (i)에 적용되는 온도는 -30℃로부터, 적용되는 용매의 대기압에서의 비등점 사이에서 다양할 수 있다. 바람직하게, 단계 (i)의 온도는 대기압에서 용매의 비등점 미만이다. 더 바람직하게, 단계 (i)의 온도는 -30℃ 내지 85℃이고, 훨씬 더 바람직하게는 -10℃ 내지 40℃이며, 가장 바람직하게는 -10℃ 내지 10℃이다. 훨신 더 바람직하게, 단계 (i)의 온도는 0℃에 가까우며, 예를 들어 -2℃ 내지 2℃이다.
뿐만 아니라, 본 발명에 따른 방법의 단계 (iii)에 적용되는 온도는, 바람직하게 -30℃로부터, 적용되는 용매의 대기압에서의 비등점 사이에서 다양할 수 있다. 더 바람직하게, 단계 (iii)의 온도는 대기압에서의 용매의 비등점 미만이다. 훨씬 더 바람직하게, 단계 (iii)의 온도는 -30℃ 내지 85℃이고, 가장 바람직하게는 -10℃ 내지 40℃이며, 훨씬 더 바람직하게는 10℃ 내지 30℃이다. 훨씬 더 바람직하게, 단계 (iii)의 온도는 실온, 예를 들어 15℃ 내지 25℃이다.
본 발명의 방법의 단계 (i)과 (iii)에 적용되는 용매는 반 양성자성 용매이다. 바람직하게, 용매는 극성 비양자성 용매이다. 대안적으로, 무극성 비양자성 용매가 극성 비양자성 용매와 함께 사용된다. 적당한 용매로서는 테트라하이드로푸란, 2-메틸-테트라하이드로푸란, tert-부틸메틸에테르, 디이소프로필에테르, 디에틸에테르, 아세토니트릴, 아세트산에틸, 디클로로메탄 또는 톨루엔이 있다. 본 발명의 방법의 단계 (i) 및 (iii)에서 바람직한 용매로서는 독립적으로 테트라하이드로푸란과 2-메틸테트라하이드로푸란이다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (i) 및 (iii)에 적용되는 용매들은 동일하거나 상이할 수 있다. 더 바람직하게, 본 발명에 따른 방법의 단계 (i) 및 (iii)에 적용되는 용매는 동일하다. 단계 (i) 및 (iii)에서 훨씬 더 바람직한 용매는 테트라하이드로푸란 또는 2-메틸-테트라하이드로푸란이다.
2-할로아연 프로피온산염 에스테르는 2-할로 프로피온산염 에스테르와 금속 아연 사이의 반응을 통하여 얻어질 수 있다. 아연의 활성화는 문헌[Furstner, Chapter 14, The Reformatsky reaction in Organozinc Reagents, Knochel and Jones, Oxford University Press, p287-305, 1999]에 기술되어 있다. 본 발명에 따른 방법에 적용되는 아연은, 유리하게 아연의 산 또는 요오드 처리에 의해, 또는 아연 염의 환원 처리에 의해 활성화될 수 있다. 아연 염의 환원 처리는, 예를 들어 리튬, 나트륨, 칼륨 또는 디이소부틸알루미늄 수소화물을 이용하여 이루어질 수 있다.
더욱이 본 발명에 따른 방법에 적용되는 금속 아연의 입도는 가능한 한 작은 것이 바람직하다. 입자가 작을수록 표면적이 커지므로, 반응 중 상호 작용들을 향상시킨다. 바람직하게, 아연 입자는 지름이 50 ㎛ 미만이고, 더 바람직하게는 10 ㎛ 미만이며, 훨씬 더 바람직하게는 5 ㎛ 미만이다. 이러한 크기의 아연 입자들은 종종 아연 가루(zinc dust)라 칭하여진다. 본 발명에 따른 방법에서 아연은 종종 용매와 함께 현탁액으로서 존재한다. 이 현탁액은 레포르마츠키 반응 동안 교반될 수 있다.
2-할로 프로피온산염 에스테르와 금속 아연 사이의 반응에 있어서, 아연은 2-할로 프로피온산염에 대하여 1몰당량 내지 3몰당량, 바람직하게는 2-할로 프로피온산염에 대하여 1몰당량 내지 2몰당량, 더 바람직하게는 2-할로 프로피온산염에 대하여 1몰당량 내지 1.2몰당량으로 적용된다.
대안적으로, 화학식 II에 따른 2-할로아연 프로피온산염 에스테르는, 적당한 금속 촉매의 존재 하에서 2-할로 프로피온산염 에스테르와 디알킬 아연 시약의 반응을 통해 얻어질 수 있다. 예를 들어 문헌[Yang et al in Tetrahedron: Asymmetry (2007, 18, 949-962)]에 기술된 바와 같이 디에틸 아연과 니켈(II) 아세탈아세토네이트가 사용될 수 있다.
본 반응에 따른 방법의 단계 (iii)에서는 무수 조건이 바람직하다. 이와 같은 조건들은, 예를 들어 질소나 아르곤을 적용함으로써 비활성 대기 하에서 작업함으로써 얻어질 수 있다. 본 발명에 따른 비활성 대기 중에는 가능한 한 적은 물이 존재한다. 대기는 본 발명에 따른 화학 합성에서 비 반응성이라는 점에서 비활성이다.
본 발명에 따른 방법에서, 화학식 II에 따른 에스테르의 제조 단계(단계 (i))와, 화학식 III에 따른 케톤의 첨가 단계(단계 (ii))의 순서는 서로 바뀔 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 케톤은, 2-할로 프로피온산염 에스테르가 아연과 반응하여 레포르마츠키 시약(WO 제2009035684호)을 형성한 후에 첨가되었다. 대안적으로, 케톤은 이미 존재하며, 추후에 2-할로아연 프로피온산염 에스테르를 제조하기 위한 반응물들이 첨가된다(바르비에 조건(Barbier condition)). 단계 (i)의 종료 후 침전이 시작되기 전에 과량의 아연은 제거된다. 과량의 아연의 제거는 여과함으로써 수행될 수 있다.
레포르마츠키 반응 후, 화학식 I에 따른 에스테르의 원하는 부분 입체 이성체가 침전되게 할 수 있다. 에스테르가 침전될 수 있도록 하는 요인들 중 하나는, 반응 혼합물을 임의의 기간 동안 방치하는 것이다. 바람직하게 반응물은 마지막 시약의 첨가 후 12시간 초과 동안, 더 바람직하게는 6시간 초과 동안, 훨씬 더 바람직하게는 2시간 초과 동안, 그리고 가장 바람직하게는 0.5시간 초과 동안 방치된다. 대기 시간 동안, 반응 혼합물의 교반은 이전 단계에서와 같이 수행될 수 있다. 침전은, 이전 단계에서 얻어진, 원하는 부분 입체 이성체를 함유하는 침전물의 소량 첨가에 의해 향상될 수 있다. 뿐만 아니라 비양자성 무극성 용매, 예를 들어 tert-부틸메틸에테르 또는 n-헵탄의 첨가에 의해 침전은 촉진될 수 있고, 수율은 개선될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (iii)에서 얻어진 침전물은 여과를 통해 분리된다. 추후 에스테르(I)의 원하는 부분 입체 이성체는 유기 용매, 예를 들어 아세트산에틸로의 추출에 의해 얻어진다. 유리하게 본 추출 과정은 산성 수용액을 이용한 처리를 포함한다. 선택적으로, 에스테르(I)를 함유하는 유기 용액은 농축되어 고체로 된 후, 후속 효소 분할 단계에 도입된다.
분할에 사용되는 에스테라아제 효소가, 에스테라아제 활성을 가지며 서열 번호 4에 나타낸 아미노산 서열 또는 아미노산 동일성이 90% 이상인 이의 상동체를 포함하는 분리된 폴리펩티드인, 본 발명에 따른 방법이 특히 바람직하다.
서열 번호 4:
MGQPASPPVVDTAQGRVLGKYVSLEGLAQPVAVFLGVPFAKPPLGSLRFAPPQPAEPWSFVKNTTSYPPMCCQEPIGGQMLSDLFTNRKERLIPEFSEDCLYLNIYTPADLTKRGRLPVMVWIHGGGLVVGGASTYDGLALAAHENVVVVAIQYRLGIWGFFSTGDEHSRGNWGHLDQVAALHWVQENIANFGGDPGSVTIFGESAGGESVSVLVLSPLAKNLFHRAISESGVAFTAG L VRKDMKAAAKQIAVLAGCKTTTSAVFVHCLRQKSEDELLDLTLKMKFFALDLHGDPRESHPFLTTVVDGVLLPKMPEEILAEKDFNTVPYIVGINKQEFGWLLPTMMGFPLSEGKLDQKTATSLLWKSYPIANIPEELTPVATDKYLGGTDDPVKKKDLFLDLMGDVVFGVPSVTVARQHRDAGAPTYMYEFQYRPSFSSDKKPKTVIGDHGDEIFSVFGFPLLKGDAPEEEVSLSKTVMKFWANFARSGNPNGEGLPHWPMYDQEEGYLQIGVNTQAAKRLKGEEVAFWNDLLSKEAAKKPPKIKHAEL
서열 번호 4에 나타낸 에스테라아제와 이의 상동체는 WO 제2009/004039호 및 WO 제2010/122175호에 기술되어 있다.
바람직하게, 상기 에스테라아제 효소는, 서열 번호 4의 서열과의 동일성이 95% 이상, 더 바람직하게는 서열 번호 4의 서열과의 동일성이 더욱 바람직하게 97% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 서열 번호 4의 서열과의 동일성이 98% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 서열 번호 4의 서열과의 동일성이 99% 초과이다.
에스테라아제 효소가, 에스테라아제 활성을 가지며 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열 또는 아미노산 동일성이 90% 이상인 이의 상동체를 포함하고, 이 상동체는 상기 서열의 239번 위치 또는 이에 상응하는 위치에 아미노산으로서 발린을 함유하는 분리된 폴리펩티드인, 본 발명에 따른 방법이 훨씬 더 바람직하다.
서열 번호 2:
MGQPASPPVVDTAQGRVLGKYVSLEGLAQPVAVFLGVPFAKPPLGSLRFAPPQPAEPWSFVKNTTSYPPMCCQEPIGGQMLSDLFTNRKERLIPEFSEDCLYLNIYTPADLTKRGRLPVMVWIHGGGLVVGGASTYDGLALAAHENVVVVAIQYRLGIWGFFSTGDEHSRGNWGHLDQVAALHWVQENIANFGGDPGSVTIFGESAGGESVSVLVLSPLAKNLFHRAISESGVAFTAG V VRKDMKAAAKQIAVLAGCKTTTSAVFVHCLRQKSEDELLDLTLKMKFFALDLHGDPRESHPFLTTVVDGVLLPKMPEEILAEKDFNTVPYIVGINKQEFGWLLPTMMGFPLSEGKLDQKTATSLLWKSYPIANIPEELTPVATDKYLGGTDDPVKKKDLFLDLMGDVVFGVPSVTVARQHRDAGAPTYMYEFQYRPSFSSDKKPKTVIGDHGDEIFSVFGFPLLKGDAPEEEVSLSKTVMKFWANFARSGNPNGEGLPHWPMYDQEEGYLQIGVNTQAAKRLKGEEVAFWNDLLSKEAAKKPPKIKHAEL
상기 서열의 239번 위치에서 루신을 발린으로 대체하는 것에 의한 서열 번호 4의 에스테라아제 효소의 돌연 변이(APLE)는 WO 제2010/122175호로부터 공지되어 있다.
알려진 바와 같이, 아미노산의 번호 매김은 해당 단백질이 기원하는 종에 의존적이다. 번호 매김은 또한 결실이나 삽입의 결과로 변할 수도 있다. 그러나 서열들이 어떻게 정렬되는지는 당업자에게 알려져 있다. 따라서, 본 출원을 위해서 어구 "또는 이에 상응하는"은, 번호가 서열 번호 2의 239번 위치와 동일한 경우를 제외한 아미노산 위치를 기술하는데 사용된다.
바람직하게, 에스테라아제 효소는 서열 번호 2의 서열과의 동일성이 95% 이상이고, 더 바람직하게는 서열 번호 2의 서열과의 동일성이 97% 이상이며, 훨씬 더 바람직하게는 서열 번호 2의 서열과의 동일성이 98% 이상이고, 가장 바람직하게는 서열 번호 2의 서열과의 동일성이 99% 초과이다.
본 카테고리에 속하는 효소는 대부분 돼지 간 에스테라아제 또는 이의 변이체이다. 그러므로 하나의 구체예에서, 본 발명은 또한 단계 (iv)의 효소 분할이 돼지 간 에스테라아제 또는 이의 변이체, 특히 서열 번호 2 또는 4의 에스테라아제 효소, 가장 바람직하게는 서열 번호 2의 에스테라아제 효소에 의해 수행되는, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
본 출원에 있어서, "(기준 서열의) 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 90% 이상인 에스테라아제"란, 해당 단백질이 아미노산 서열을 가지는 각각의 기준 서열의 상동체로서, 서열 정렬 툴, 예를 들어 BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast), ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2) 또는 Align Plus 5(Scientific & Educational Software, Cary,　NC, USA)로 실행되는 서열 정렬시 측정된, 기준 서열의 아미노산 서열에 대하여 90% 이상 동일한 서열임을 의미한다.
본 출원을 위해서, 용어 "상동체"은 또한 유전 암호의 축퇴성으로 인해 다른 핵산 서열과 상이하되, 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산 서열(폴리뉴클레오티드 서열)을 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 서열 동일성 또는 유사성은 서열들을 비교함으로써 결정되는, 2개 이상의 폴리펩티드 서열들 또는 2개 이상의 핵산 서열들 간 관계로서 정의된다. 보통 서열 동일성 또는 유사성은 서열의 전체 길이에 대해서 비교되지만, 또한 서로 정렬되고 있는 서열들의 일부에 대해서만 비교될 수도 있다. 당업계에서 "동일성" 또는 "유사성"은 또한 경우에 따라서 폴리펩티드 서열들 또는 핵산 서열들 간 매치 여부에 의해 결정되는, 상기 서열들 간 서열 관련성의 정도를 의미한다. 검정 대상 서열들 간 가장 많이 매치되는 부분을 얻어내기 위하여 동일성 또는 유사성을 측정하는 바람직한 방법이 고안된다. 본 발명의 내용 중 2개의 서열들 간 동일성과 유사성을 측정하는데 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법으로서는, NCBI 및 기타 다른 공급원(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, MD, USA)으로부터 공중이 입수할 수 있는 BLASTP 및 BLASTN(Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 1990, 215, 403-410을 포함한다. BLASTP를 사용하는 폴리펩티드 서열 비교에 바람직한 매개 변수들로서는 갭 개방 수치(gap open) 10.0, 갭 연장 수치(gap extend) 0.5 및 Blosum 62 매트릭스가 있다. BLASTN을 사용하는 핵산 서열 비교에 바람직한 매개 변수들로서는 갭 개방 수치 10.0, 갭 연장 수치 0.5, DNA 전 매트릭스(DNA full matrix)(DNA 동일성 매트릭스)가 있다.
본 발명에 따른 효소 분할에 있어서 반응을 최적화하기 위해서는 몇 가지 반응 매개 변수들, 예를 들어 용매, 보조 용매, pH, 온도 및 기질 농도에 변화를 가할 수 있다.
일반적으로 용매는 물과 수혼화성 용매, 예를 들어 알코올, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 tert-부탄올의 혼합물, 또는 물과 디옥산, 테트라하이드로푸란, 아세톤 또는 설폭시화디메틸의 혼합물, 또는 물의 2상계, 그리고 수 비혼화성 용매, 예를 들어 방향족 화합물, 예를 들어 톨루엔 또는 자일렌, 알칸, 예를 들어 n-헥산, n-헵탄 또는 사이클로헥산, 또는 에테르, 예를 들어 디이소프로필에테르 또는 메틸 tert-부틸에테르의 2상계일 수 있다.
예를 들어 2-메틸테트라하이드로푸란이 사용되었을 때에는 전환이 관찰되지 않았으므로, 본 발명에 따른 효소 분할에 있어서 보조 용매의 성질은 중요한 역할을 담당한다. 바람직하게 보조 용매로서는 tert-부탄올, 아세트산 tert-부틸, 메틸이소부틸케톤 또는 톨루엔이 사용된다. 더 바람직하게, 톨루엔은 효소 분할용 보조 용매로서 사용된다.
효소 활성에 대한 pH의 영향력은 중요하지 않다. 반응 용액의 pH는 4 내지 11, 바람직하게는 6 내지 9이다. 그러나 더 바람직하게 본 발명에 따른 효소 분할의 최적 pH는 7.5 내지 8의 범위에 있다.
본 발명의 전환을 위한 반응 온도는 보통 0℃ 내지 90℃, 바람직하게는 10℃ 내지 60℃이다. 본 발명에 따른 효소 분할 반응은 고온에서 더 신속하게 진행된다. 그러나, 효소 활성은 37℃에서 시간이 경과함에 따라서 감소한다. 그러므로, 효소 분할 반응 동안의 온도는 28℃ 내지 37℃인 것이 더 바람직하다.
효소 분할에 대한 기질의 농도는 0.1중량% 내지 50중량%, 바람직하게는 1중량% 내지 25중량%, 더 바람직하게는 2중량% 내지 10중량%로 다양할 수 있다. 가장 바람직하게, 기질의 농도는 4중량% 내지 6중량%이다.
본 발명에 따른 에스테라아제는 임의의 형태로 사용될 수 있다. 에스테라아제는, 예를 들어 분산액, 용액 또는 고정된 형태로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라 에스테라아제는, 예를 들어 미정제 효소, 시판중인 효소, 시판중인 제조물로부터 추가로 정제된 효소, 공지된 정제 방법들의 병행법에 의해 자체의 공급원으로부터 얻어진 효소, (선택적으로 투과 및/또는 고정된) 전 세포로서, 필요한 에스테라아제 활성을 본래부터 가지거나 유전자 변형을 통해서 가지게 된 전 세포, 또는 이와 같은 활성을 가지는 세포의 용해물로서 사용될 수 있다.
효소 분할 단계 이후, 통상의 방법들, 예를 들어 추출, 결정화, 컬럼 크로마토그래피 및/또는 증류에 의해 생성물 분리가 일어날 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 단계 (iv) 이후에 얻어진 에스테르는 당업계에 공지된 방법들, 예를 들어 암모니아를 이용한 처리를 통하여 상응하는 아미드로 전환될 수 있다. 이후, 상기 아미드는, 예를 들어 WO 제03/002498호에 개시된 바와 같은 공지된 방법을 통하여 이사부코나졸 또는 라부코나졸로 추가로 전환된다. 아미드는 상응하는 시안화물로 탈수될 수 있고, 이 시안화물은, 예를 들어 황화물 염, 예를 들어 황화암모늄이 이용되는 반응을 통하여 이에 상응하는 티오아미드로 전환될 수 있으며, 마지막으로 티오아미드는, 적당히 치환된 4-시아노아세토페논 시약, 예를 들어 α-브로모-4-시아노아세토페논이 이용되는 반응을 통해 이사부코나졸 또는 라부코나졸로 전환될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 방법에 따른 바람직한 특징들 및/또는 상이한 구체예들의 가능한 모든 조합들에 관한 것이다.
[발명을 실시하기 위한 구체적 내용]
본 발명은 이하 실시예들을 참고로 하였을 때 더욱 명백해질 것이지만, 이와 같은 실시예들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
실시예
에스테르(I)의 부분 입체 이성체 과량이 GC에 의해 측정됨: HP-5 컬럼(30 m×0.32 ㎜×0.25 ㎛); 처음 온도: 50℃, 0분, 20℃/분으로 150℃까지, 150℃에서 0분; 10℃/분으로 190℃까지, 190℃에서 2분; 20℃/분으로 300℃까지, 300℃에서 0분; 체류 시간: 2.06분: 에틸 프로피온산염; 3.25분: 에틸 2-브로모프로피온산염; 9.17분: 케톤 II(R1 = F); 12.82분: RS/SR-에스테르 I; 12.90분: RR/SS-에스테르 I
RR/SS-에스테르 I의 1H-NMR(CDCl3, 300 MHz) δ= 1.04 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 3.30 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.25 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.60 (d, J = 14.1 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 14.4 Hz), 6.95 (m, 2H), 7.20 (m, 1H), 7.75 (s, 1H), 8.11 (s, 1H) ppm.
RS/SR-에스테르 I의 1H-NMR(CDCl3, 300 MHz) δ= 0.98 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.41 (d, J = 7.2 Hz, 3H), 3.37 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 3.95 (m, 2H), 4.61 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 4.83 (d, J = 14.1 Hz), 6.97 (m, 3H), 7.71 (s, 1H), 8.08 (s, 1H) ppm.
비교예 A: 유기 리튬 결합에 의한 라세미 에스테르(I)의 제조
a) 테트라하이드로푸란(THF) 중 리튬-디이소프로필아미드(LDA)의 스톡 용액의 제조:
디이소프로필아민(716 ㎎, 7.1 mmol, 1.05당량)을 무수 THF(21.3 ㎖) 중에 용해하고, 생성된 용액을 질소 대기 하에서 -78℃로 냉각하였다. 그 다음, 여기에 n-BuLi(n-헵탄 중 2.7 M 용액, 2.5 ㎖, 6.7 mmol, 1.0당량)를 15분에 걸쳐 적하 방식으로 첨가하였으며, 이 반응 혼합물을 -78℃에서 15분 더 교반하였다. 이후, 상기 용액을 0℃로 가온하고, 이를 30분 동안 교반하고 나서, 스톡 용액을 다시 -78℃로 냉각하였다.
b) 결합 반응:
이렇게 얻어진 LDA-용액(3.66 ㎖, 0.98 mmol, 1.1당량)을 쉬렝크 용기로 옮기고, 에틸 프로피온산염(100 ㎎, 0.98 mmol, 1.1당량)을 질소 대기 하 -78℃에서 적하 방식으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 -78℃에서 30분 동안 교반한 다음, THF(3.66 ㎖) 중 1-(2,5-디플루오로페닐)-2-(1H-1,2,4-트리아졸-1-일)에탄온(200 ㎎, 0.90 mmol, 1.0당량)을 적하 방식으로 15분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 2시간 동안 교반한 다음, 아세트산으로 급랭한 후, 실온으로 가온하였다. 이 혼합물을 포화 수성 NH4Cl과 아세트산에틸로 희석하였다. 수성층을 아세트산에틸로 추출하고(×2), 합하여진 유기층들을 브라인으로 세정하고, 건조하였으며(Na2SO4), 여과하고 진공 중에서 농축하여, 원하는 RR/SS 부분 입체 이성체에 유리한 라세미 에스테르 I을 부분 입체 이성체 과량 29%로 함유하는 황색의 오일을 제공하였다. 컬럼 크로마토그래피(n-헵탄/EtOAc/MeOH 60/40/5 v/v/v)로 추가 정제하여, RR/SS 부분 입체 이성체(연한 황색 고체)와 RS/SR 부분 입체 이성체(회백색 고체)를 전체 합한 수득량 179 ㎎(0.55 mmol, 61%)으로 제공하였다.
비교예 B: 이미 존재하는 케톤을 이용하는(바르비에 조건), 고온에서 단계 (i), (ii) 및 (iii)에 따른 레포르마츠키 반응
냉각 장치가 장착된 2목 플라스크를 아연(1.1 g, 17 mmol, 3.8당량)으로 채운 후, 핫건(hotgun)을 사용하여 진공 중에서 가열하였다(질소-진공 주기 3회). 그 다음, THF(60 ㎖)를 첨가하고 나서, 염화트리메틸실릴(0.15 ㎖)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 질소 대기 하 실온에서 15분 동안 교반한 후, THF(30 ㎖) 중 케톤 III(R1 = F, 1.0 g, 4.5 mmol, 1.0당량) 용액을 첨가하였다. 그 다δ음 반응 혼합물을 66℃로 가열하고 나서, 가열원을 제거하였다. 이후, THF(20 ㎖) 중 에틸 2-브로모프로피온산염(0.87 ㎖, 1.2 g, 6.7 mmol, 1.5당량) 용액을 10분에 걸쳐 적가하였다. 그 다음, 반응 혼합물을 66℃에서 1.5시간 동안 교반한 후, 이를 실온으로 냉각하였다. 포화 염화암모늄 수용액(100 ㎖)을 첨가하여 반응물을 급랭하였으며, 메틸tert부틸 에테르(MTBE, 100 ㎖)로 희석하였다. 층들이 분리되었으며, 수성층을 MTBE로 추출하였다(2×100 ㎖). 합하여진 유기층들을 브라인(100 ㎖)으로 세정하고, 건조하였으며(Na2SO4), 여과하고 진공 중에서 농축하여, 라세미 에스테르 I을 함유하는 황색의 오일(1.4 g)을 제공하였다. 1H-NMR-분석 및 GC-분석 결과는, 원하는 RR/SS 부분 입체 이성체에 유리한 에스테르 I의 d.e.가 60%이고 케톤 III(R1 = F)의 전환율이 80%임을 나타내었다. 생성물을 추가로 정제하지 않았다.
실시예 1: 저온에서 레포르마츠키 시약을 미리 제조한 후 케톤을 첨가하는, 단계 (iii)에 따른 레포르마츠키 반응
a) 레포르마츠키 시약의 스톡 용액의 제조:
질소 대기 하에서 2목 플라스크를 아연(5.8 g, 89 mmol, 2.0당량)과 무수 THF(101 ㎖)로 채우고 나서, 염화트리메틸실릴(TMSCl, 1.12 ㎖)을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 실온에서 30분 동안 교반한 후, 0℃로 냉각시켰다. 그 다음, 상기 현탁액에 에틸 2-브로모프로피온산염(5.8 ㎖, 8.1 g, 44.7 mmol, 1.0당량)을 30분에 걸쳐 적하 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 15분 더 교반하고 나서, 질소 대기 하에서 여과하여 쉬렝크 용기에 담은 후, 잔류하는 아연을 제거하였다.
케톤 III(R1 = F, 1.0 g, 4.5 mmol, 1.0당량)을 쉬렝크 용기에 채우고, 질소 대기 하에서 무수 THF(10 ㎖)를 첨가하였다. 생성된 용액에 미리 준비한 레포르마츠키 시약의 스톡 용액 20 ㎖(상기 참조, 8.36 mmol, 1.9당량)를 교반하면서 30분에 걸쳐 실온에서 적하 방식으로 첨가하였다. 첨가를 마친 후, 생성된 반응 혼합물을 질소 대기 하에서 36시간 동안 교반하였다(투명 용액이 생성됨). GC-분석 결과는, 원하는 RR/SS 부분 입체 이성체에 유리한 에스테르 I(R1 = F)이, 케톤 III(R1 = F)을 기준으로 하여 전환율 80% 및 d.e. 60%로 형성되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 진공 중에서 용적 10 ㎖로 농축한 다음, 고체의 형성이 관찰될 때까지 n-헵탄을 첨가하였다. 생성된 현탁액을 16시간 동안 교반한 다음, 고체를 여과를 통해 분리하였다. 그 다음, 고체를 수성 HCl(pH=1) 및 아세트산에틸의 혼합물 중에 용해하여, 투명한 2상계가 생성되었다. 상들이 분리되었으며, 수성층을 아세트산에틸로 추출하였다(×2). 합하여진 유기층들을 물과 브라인으로 세정하고, 건조하였으며(Na2SO4), 여과하고 진공 중에서 농축하여, 라세미 RR/SS 에스테르 I(R1 = F)을 연한 황색 고체로서 제공하였다(GC에 의해 측정된 d.e.는 99% 초과임).
실시예 2: 케톤을 첨가하기 전 아연이 제거되는, 단계 (iii)에 따른 레포르마츠키 반응
아연(11.7 g, 179 mmol, 4.0당량)을 THF(200 ㎖) 중에 현탁하고, 250 ㎖들이 3목 플라스크 내에서 질소 대기 하 TMSCl(2.25 ㎖)의 존재 하에서 30분 동안 주위 온도에서 교반하였다. 그 다음, 현탁액을 0℃로 냉각하고, 45분에 걸쳐 시린지 펌프를 통해 에틸 2-브로모프로피온산염(11.6 ㎖, 89.6 mmol, 2.0당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 15분 더 교반한 다음(GC로 확인한 전환율 = 100%), 현탁액을 질소 기류 하에서 캐뉼러를 통해 유리 필터로 여과하여 반응 용기(500 ㎖들이, 3목 플라스크)에 담았다. 그 다음, THF(130 ㎖) 중 케톤 III(R1 = F, 10 g, 44.8 mmol, 1.0당량) 용액을, 실온에서 1시간에 걸쳐 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 72시간 더 교반하였는데, 이때 고체가 형성되었다. 현탁액을 여과하고, 회백색 고체를 EtOAc 중에 현탁하고 나서, 투명한 2상계가 얻어질 때까지 물과 수성 HCl을 첨가하여 용해하였다(pH 1). 층들이 분리되었으며, 수성층을 EtOAc로 추출하였다(×2). 합하여진 유기층들을 물과 브라인으로 세정하고, 건조하였으며(Na2SO4), 여과하고 진공 중에서 농축하여, 라세미 RR/SS 에스테르 I(R1 = F, 8.8 g, 27 mmol, 60%)을 연한 황색 고체로서 제공하였다(GC에 의해 측정된 d.e.는 99% 초과임). 이 여과물을 대상으로 동일한 수성 조건 하에서 반응을 완결(work-up)시켰다. GC 분석 결과는, 잔류하던 케톤이 (원치않는 RS/SR 부분 입체 이성체에 유리한) 여과물 및 라세미 에스테르 I(d.e.= -25%)에 존재함을 나타내었다.
실시예 3: 케톤이 첨가된 후 침전이 개시되기 전 아연이 제거되는, 단계 (iii)에 의한 레포르마츠키 반응
아연(98 g, 1.5 mol, 4.0당량)을 THF(1.7 ℓ) 중에 현탁하고, 질소 대기 하 TMSCl(18.7 ㎖)의 존재 하에서 30분 동안 주위 온도에서 기계적으로 교반하였다. 그 다음, 현탁액을 0℃로 냉각하고, 1시간에 걸쳐 시린지 펌프를 통해 에틸 2-브로모프로피온산염(96.6 ㎖, 744 mmol, 2.0당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반한 다음(GC로 확인한 전환율 = 100%), THF(830 ㎖) 중 케톤 III(R1 = F, 83 g, 372 mmol, 1.0당량)의 용액을 실온에서 20분에 걸쳐 첨가하였다. 이 혼합물을 15분 더 교반한 다음(GC로 확인한 전환율 = 90% 초과), 셀라이트로 여과하였다. 반응 혼합물의 d.e.가 GC에 의해 60%인 것으로 측정되었다. 반응 혼합물을 교반하고, 5시간 경과 후에 현탁액이 생성되기 시작하였다. 현탁액을 88시간 동안 교반하였는데, 이때 (원치 않는 RS/SR 부분 입체 이성체에 유리한) 모액의 d.e.는 -10%로 감소하였다. 현탁액을 여과하고, 회백색 고체를 MTBE로 세정하였다(2×125 ㎖). 그 다음, 고체를 EtOAc(2.1 ℓ) 중에 현탁하고, 투명한 2상계가 얻어질 때까지 물(1.25 ℓ)과 수성 HCl(10%w/w; 76 g)을 첨가하여 용해하였다(pH 1.3). 층들이 분리되었으며, 유기층을 수성 HCl(1.1 ℓ, pH1.1), 수성 NaHCO3(0.60 g NaHCO3 함유, 500 ㎖), 물(2×250 ㎖) 및 브라인(250 ㎖)으로 세정하였다. 그 다음, 유기층을 건조하였으며(Na2SO4), 여과하고 진공 중에서 농축하여, 라세미 RR/SS-에스테르 I(54 g, 167 mmol, 45%)을 d.e. 97%로 제공하였다.
실시예 4: 단계 (iv)에 따른 효소 분할
인산칼륨 완충 용액(500 ㎖, 50 mM, pH 7.8)에, 서열 번호 1의 에스테라아제(10 g, 서열 번호 2의 에스테라아제를 암호화하는 서열 번호 1의 재조합 에스테라아제 유전자를 발현하는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 전세포; WO 제2010/122175호에 기술된 바와 같이 제조)를 함유하는 현탁액(100 ㎖)을 첨가하였다. pH를 7.8로 맞춘 후, 톨루엔(400 ㎖) 중 라세미 RR/SS 에스테르 I(R1 = F, 40 g, 123 mmol, d.e. 97%)의 용액을 첨가하였다. NaOH(1 M, aq.)를 이용하는 적정을 통해 pH를 7.8로 유지하면서, 생성된 혼합물을 28℃에서 교반하였다. HPLC에 의한 분석 결과는, 22시간 경과 후 R,R-에스테르 I의 e.e.가 98.5%임을 나타내었다. 26시간 경과 후 이하에 기술된 바와 같이 반응을 완결시켰다. S/C-비율이 2:1 및 3:1인 반응 둘 다를 20시간 이내에 종결 처리(finishing)하였으며; R,R-에스테르 I의 e.e.는 99% 초과였음을 주목한다.
서열 번호 1:
GCCAACGATGATGGGATTTCCTCTTTCCGAGGGAAAGTTGGATCAAAAGACGGCTACGTCACTTTTGTGGAAGTCCTACCCAATTGCCAACATTCCTGAAGAGTTGACCCCAGTTGCTACCGATAAGTATTTAGGAGGAACAGATGATCCTGTCAAAAAGAAAGATTTGTTTTTGGATCTGATGGGAGACGTTGTTTTCGGCGTCCCATCAGTTACGGTTGCTCGTCAGCATAGGGACGCAGGAGCTCCAACTTACATGTATGAGTTCCAATATCGTCCATCTTTTTCATCGGATAAGAAACCTAAGACGGTTATTGGAGATCATGGAGACGAAATTTTTTCCGTCTTCGGCTTCCCATTGCTCAAAGGTGACGCTCCAGAGGAAGAAGTCAGTCTTTCTAAGACGGTTATGAAATTTTGGGCTAACTTCGCCCGTAGTGGAAACCCTAATGGAGAAGGATTGCCTCACTGGCCGATGTACGATCAAGAGGAGGGATACCTTCAAATTGGTGTCAACACTCAAGCAGCTAAGAGGTTGAAAGGCGAGGAGGTTGCTTTTTGGAACGACCTGTTGTCCAAGGAAGCAGCAAAGAAGCCACCTAAGATAAAGCACGCCGAATTGTAA
완결:
디칼라이트 4208(20 g)을 반응 혼합물에 첨가하고, 생성된 현탁액을 5분 동안 교반하였다. 그 다음, 혼합물을 예비 코팅된 (디칼라이트 4108) 유리 필터로 여과하였다. 필터 케이크를 톨루엔으로 세정하고(2×200 ㎖), 합하여진 여과물을 분리하였다. 이 단계에서 톨루엔 층은 약간 유화되어서, 예비 코팅된 필터를 통한 2차 여과를 수행하였다. 생성된 2상 여과물을 분리하였으며, 수성층을 앞서 얻은 수성상에 첨가하였다. 그 다음, 합하여진 수성층들을 톨루엔(250 ㎖)으로 추출하여, 완전히 유화된 유기상을 제공하였다. 톨루엔 층을 예비 코팅된 필터로 2회 여과하였는데, 이때 투명한 2상계를 얻었다. 층들이 분리되었으며, 합하여진 유기층들을 수성 NaHCO3(100 ㎖, 5중량%)로 세정하였다. 마지막으로, 유기층을 진공 중에서 농축하여 회백색 고체로서 R,R-에스테르 I을 제공하였다.
이와 같이 획득된 프로토콜을 사용하여, 라세미 RR/SS-에스테르 I(d.e. 97%) 210 g은 각각 출발 물질을 40 g 내지 45 g 함유하는 5개의 회분으로 전환되었다. 거울상 순수한 에스테르 R,R-에스테르 I(d.e. 95%; e.e 99.5% 초과)이 수율 48%(101 g, 311 mmol)로 분리되었다.
분석:
에스테르 I의 e.e.의 측정은 키랄 HPLC로 수행하였다. 라세미 RR/SS-에스테르 I의 거울상 이성체들과 이에 상응하는 카복실산의 거울상 이성체들을 분리하는 방법 하나가 개발되었다:
컬럼 다이셀(Daicel) AD, 2×50×4.6 ㎜ ID, 입도: 10 ㎛, 용리액: 헵탄/MeOH/EtOH 95:2.1:2.9 v/v/v + 0.05% 트리플루오로아세트산 + 0.05% 디에틸아민; 전개 시간: 15분, 압력: 10 bar, 유속: 1.8 ㎖/분, 온도: 20℃, 210 ㎚에서 UV 검출. 체류 시간: SS-거울상 이성체 I: 2.15분; SS-거울상 이성체 카복실산: 3.02분; RR-거울상 이성체 카복실산: 4.31분; RR-거울상 이성체 I: 8.21분.
에스테르 I과 카복실산 둘 다의 농도를 HPLC에 의해 측정하여 전환 여부를 확인하였다:
컬럼 하이퍼실(Hypersil) BDS-3, 250×4.6 ㎜ ID, 입도, 5 ㎛, 용리액 A: 밀리-Q(Milli-Q) 중 0.15% 포름산 및 0.025% 트리에틸아민; 용리액 B: 아세토니트릴 중 0.15% 포름산 및 0.025% 트리에틸아민, A:B 구배 = 10분에 걸쳐 95:5(v/v)에서 5:95(5:95에서 5분 동안 유지), 그 다음 3분에 걸쳐 95:5(95:5에서 5분 동안 유지)(t = 23분). 유속: 1.0 ㎖/분, 온도: 40℃, 210 ㎚에서 UV 검출. 체류 시간: 카복실산: 9.55분; 에스테르 I: 12.35분.
실시예 5: 효소 스크리닝
200개 이상의 하이드롤라제 효소들(리파제, 에스테라아제, 프로테아제)의 에스테르 I 가수 분해에 대한 스크리닝에 있어서, 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 중 각각의 효소 225 ㎕씩을, tert-부탄올 중에 용해된 에스테르 I 2 ㎎(최종 부피 250 ㎕)과 함께, 마게가 씌워진 유리 바이알 내에서 항온 처리하였으며, IKA KS 130 진탕기(독일 슈타우펜 소재, IKA) 상 400 rpm으로 28℃에서 항온 처리하였다. 밤새 항온 처리한 후, 각각의 바이알에 0.5 M 인산 40 ㎕를 첨가한 후, 메틸tert-부틸에테르(MTBE) 710 ㎕로 희석하고, JS-5.3 로터가 장착된 아반티(Avanti) J-20XPI 원심 분리기(네덜란드 붸르텐 소재, 벡맨 쿨터(Beckman Coulter)) 내에서 3500 rpm으로 20분 동안 원심 분리하였다.
잔류하는 에스테르와 생성된 카복실산 둘 다의 거울상 이성체 과량(e.e)을 (전술된 바와 같이) HPLC로 측정하였다. 상기 2개의 물질의 e.e. 값들을 비교함으로써 전환율을 산정하였다:
전환율 = [e.e 에스테르 / (e.e. 에스테르 + e.e. 카복실산)] × 100%
상기 큰 규모의 하이드롤라제 집합 중 오로지 8개의 재조합 돼지 간 에스테라아제만이 에스테르 I의 원치않는 거울상 이성체를 우선적으로 가수 분해할 수 있었다(표 1).
효소 스크리닝 결과
에스테라아제 e.e. 에스테르 I e.e. 산 전환율
[서열 번호] % % %
2 92.1 94 50
4 69.6 94 42
6 18.6 97 16
8 10.3 99 9
10 78.4 74 51
12 15.1 64 19
본 실시예는 몇몇 재조합 돼지 간 에스테라아제가 에스테르 I을 거울상 선택적으로 가수 분해함을 나타낸다. 서열 번호 4, 6, 8, 10 또는 12를 나타내는 에스테라아제 효소는, 각각 WO 제2009/004093호 및 WO 제2010/122175호에 기술된 바에 따라서 상기 에스테라아제를 암호화하는 서열 번호 3, 5, 7, 9 또는 11의 재조합 에스테라아제 유전자를 발현하는 에스케리치아 콜라이 세포를 사용하여 제조될 수 있다.
실시예 6: 제조합 돼지 간 에스테라아제의 재검정
처음의 효소 스크리닝 결과를 바탕으로, 효소 5개를 250 ㎎ 규모로 재검정하기 위해 선택하였다. 효소의 선택은 에스테르 I에 대한 활성과 선택성을 바탕으로 수행하였다. 각각의 개별 반응을 위하여 에스테르 I 250 ㎎을 tert-부탄올 1 ㎖ 중에 용해하였다. 그 다음, 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 5 ㎖와 무세포 추출물 4 ㎖(각각의 과발현된 재조합 돼지 간 에스테라아제 함유함)를 메트롬 718 STAT 타이트리노스(Metrohm 718 STAT Titrinos)(네덜란드 스키담 소재, 메트롬) 내에서 에스테르 I 1 ㎎당 총 단백질 1 ㎎의 효소/기질 비율로 첨가하였다. 1 M NaOH를 이용하여 pH를 7.5로 일정하게 유지하였다. 규칙적인 시점에서 샘플들을 대상으로, 잔류하는 에스테르와 생성된 카복실산 둘 다의 거울상 이성체 과량(e.e.)에 대해 분석하였다(전술된 바와 같이 HPLC에 의해 측정함). 전환율은, 상기 2개의 e.e. 값들을 비교하여 산정하였다. 그 결과는 표 2에 제공되어 있다.
돼지 간 에스테라아제 촉매 가수 분해 반응에 의한 에스테르 I의, 이에 상응하는 카복실산으로의 전환율 및 e.e. (-: 측정되지 않음)
서열 번호 2 서열 번호 4
시간 e.e.
에스테르 I		 e.e. 산 전환율 e.e. 에스테르 I e.e. 산 전환율
(h) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
1 - - - 2.6 80.3 3.1
2 32.5 99.9 24.5 3.9 90.0 4.1
3 50.7 99.7 33.7 5.7 91.8 5.9
5 99.5 99.6 50.0 8.3 92.0 8.3
7 99.3 99.9 49.9 14.1 91.6 13.3
23 99.9 99.9 50.0 27.6 92.4 23.0
서열 번호 6 서열 번호 8
시간 e.e.
에스테르 I		 e.e. 산 전환율 e.e.
에스테르 I		 e.e. 산 전환율
(h) (%) (%) (%) (%) (%) (%)
1 -0.5 99.9 0.5 1.2 99.9 1.2
3 1.2 99.9 1.2 1.5 83.2 1.8
5 2.5 96.9 2.5 1.0 99.9 1.0
7 3.3 96.6 3.3 2.3 99.9 2.3
23 12.7 92.9 12.0 5.9 99.3 5.6
서열 번호 10
시간 e.e.
에스테르 I		 e.e. 산 전환율
(h) (%) (%) (%)
1 5.7 98.8 5.4
2 9.0 98.2 8.4
5 13.5 99.9 11.9
7 17.2 94.8 15.4
개별 에스테라아제 반응의 거울상 선택도(E)는 생성된 카복실산의 전환율과 e.e.로부터 하기 식에 따라서 산정하였으며, 그 결과는 표 3에 제공되어 있다.
E = ln((1-(전환율/100)×(1+(e.e.산/100))))/ln((1-(전환율/100)×(1-(e.e.산/100))))
돼지 간 에스테라아제 촉매 가수 분해에 의한 에스테르 I의 거울상 선택도
에스테라아제 거울상 선택도
[서열 번호] E
2 > 500
4 30
6 30
8 > 200
10 45
전환율이 50%이고, 5시간 경과 후 에스테르 I에 대한 e.e.가 99.5%이며, 거울상 선택도 E가 500 초과로 우수한, 서열 번호 2의 재조합 돼지 간 에스테라아제가 가장 좋은 후보 효소인 것으로 확인되었다.
실시예 7: 돼지 간 에스테라아제 반응에 대한 용매들의 영향력
유기 용매들의, 돼지 간 에스테라아제(서열 번호 2)에 의한 에스테르 I 가수 분해에 미치는 영향력을, 서열 번호 1의 유전자를 발현하는 재조합 이.콜라이 세포(WO 제2010/122175호에 기술된 바와 같이 생산됨)를 사용하여 조사하였다. 에스테르 I 0.5 g에, 50 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.8) 7.5 ㎖, 서열 번호 1의 에스테라아제를 함유하는 습윤 재조합 이.콜라이 세포 0.1 g(50 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.8) 1 ㎖ 중) 및 유기 용매 2.5 ㎖를 28℃에서 첨가하였다. 별도의 반응들에, 톨루엔, 메틸-이소부틸케톤, 아세트산tert-부틸 또는 2-메틸-테트라하이드로푸란을 유기 용매로서 첨가하였다. 대조군으로서 유기 용매 대신에 50 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.8) 2.5 ㎖를 첨가하였다.
1 M NaOH를 사용하여 pH를 7.8로 일정하게 유지하였다. 규칙적인 시점에서 샘플들을 대상으로, 잔류하는 에스테르와 생성된 카복실산 둘 다의 거울상 이성체 과량(e.e.)에 대해 분석하였다(전술된 바와 같이 HPLC에 의해 측정함). 전환율은, (전술된 바와 같이) 상기 2개의 e.e. 값들을 비교하여 산정하였다. 그 결과는 표 4에 제공되어 있다.
유기 용매들이 서열 번호 2의 재조합 돼지 간 에스테라아제에 의한 R,R/S,S-에스테르 I의 가수 분해에 미치는 영향력
용매 무첨가 시간 e.e 산 e.e.
에스테르 I 		전환율
(h) (%) (%) (%)
2 4.6 94 4.7
3 6.8 98.3 6.5
4 7.6 98.2 7.2
7 12.2 97.1 11.2
　 22 40.5 98.4 29.2
톨루엔 시간 e.e 산 e.e.
에스테르 I 		전환율
(h) (%) (%) (%)
2 10.1 98.0 9.3
3 15.8 98.0 13.9
4 21.7 98.0 18.1
7 37.1 98.0 27.5
　 22 99.3 99.2 50.0
아세트산 tert -부틸 시간 e.e 산 e.e.
에스테르 I 		전환율
(h) (%) (%) (%)
2 5.0 95.6 5.0
4 9.0 97.4 8.4
6 15.1 97.9 13.4
　 28.5 68.2 97.4 41.2
메틸-이소부틸케톤 시간 e.e 산 e.e.
에스테르 I 		전환율
(h) (%) (%) (%)
2 5.0 85.0 5.2
7.5 5.3 95.0 5.6
　 24 16.4 95.0 14.7
용매인 아세트산tert-부틸과, 특히 톨루엔은 에스테르 I 가수 분해율에 확연히 긍정적인 영향을 미쳤다. 22시간 경과 후, 톨루엔을 이용하였을 때 에스테르 I은 전환율 50.0% 및 e.e. 99.2%로 얻어졌다.
SEQUENCE LISTINGS <110> Basilea Pharmaceutica AG <120> Process for the manufacture of Isavuconazole and Ravuconazole <130> WH/P41139EPPC <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1650 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> gene PLE variant SEQ ID No. 2, codon optimized <220> <221> CDS <222> (1)..(1650) <223> PLE variant <400> 1 atg gga caa cca gct tcg ccg cct gtc gtt gat acc gct caa gga cga 48 Met Gly Gln Pro Ala Ser Pro Pro Val Val Asp Thr Ala Gln Gly Arg 1 5 10 15 gtc ttg ggt aag tac gtc tct tta gag gga ttg gca caa ccg gtt gct 96 Val Leu Gly Lys Tyr Val Ser Leu Glu Gly Leu Ala Gln Pro Val Ala 20 25 30 gtc ttc ttg gga gtc cct ttt gct aag cca cct ctt gga tct ttg agg 144 Val Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Lys Pro Pro Leu Gly Ser Leu Arg 35 40 45 ttt gcc ccg ccg caa cca gca gag cca tgg tct ttc gtt aag aac act 192 Phe Ala Pro Pro Gln Pro Ala Glu Pro Trp Ser Phe Val Lys Asn Thr 50 55 60 act tcc tac cct cca atg tgt tgt caa gaa cca atc gga gga caa atg 240 Thr Ser Tyr Pro Pro Met Cys Cys Gln Glu Pro Ile Gly Gly Gln Met 65 70 75 80 ctt tca gac cta ttc act aac aga aag gaa agg ctt atc ccg gag ttc 288 Leu Ser Asp Leu Phe Thr Asn Arg Lys Glu Arg Leu Ile Pro Glu Phe 85 90 95 tct gag gat tgc ctt tac cta aat att tac act cct gcc gat ttg aca 336 Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Thr 100 105 110 aag agg ggt agg ttg ccg gtt atg gtt tgg att cat gga gga ggt ttg 384 Lys Arg Gly Arg Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Leu 115 120 125 gtt gtt ggc gga gca tcc act tat gac gga ttg gct ctt gcc gcg cac 432 Val Val Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Ala Leu Ala Ala His 130 135 140 gag aac gtt gtt gtt gtt gct att caa tac cgt ttg ggt att tgg gga 480 Glu Asn Val Val Val Val Ala Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ile Trp Gly 145 150 155 160 ttt ttc tcc aca gga gat gag cat tcc cgt gga aac tgg ggc cat tta 528 Phe Phe Ser Thr Gly Asp Glu His Ser Arg Gly Asn Trp Gly His Leu 165 170 175 gat caa gtt gct gca ttg cat tgg gtc caa gaa aac att gct aac ttc 576 Asp Gln Val Ala Ala Leu His Trp Val Gln Glu Asn Ile Ala Asn Phe 180 185 190 gga ggt gat cca ggt tct gtt act att ttc gga gaa tca gca ggc gga 624 Gly Gly Asp Pro Gly Ser Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly 195 200 205 gag agt gtc tct gta ttg gtt tta tca cca tta gct aag aac ctt ttt 672 Glu Ser Val Ser Val Leu Val Leu Ser Pro Leu Ala Lys Asn Leu Phe 210 215 220 cat cgt gct att tcc gaa agt ggt gtt gct ttt acc gcc ggt gtg gtc 720 His Arg Ala Ile Ser Glu Ser Gly Val Ala Phe Thr Ala Gly Val Val 225 230 235 240 agg aag gat atg aag gcc gca gcc aag cag atc gct gtc ctt gca gga 768 Arg Lys Asp Met Lys Ala Ala Ala Lys Gln Ile Ala Val Leu Ala Gly 245 250 255 tgc aaa act act act tcg gca gtc ttc gtg cat tgt ttg cgt caa aag 816 Cys Lys Thr Thr Thr Ser Ala Val Phe Val His Cys Leu Arg Gln Lys 260 265 270 tcg gaa gat gaa ctt tta gac ctc acg ttg aag atg aaa ttc ttt gcc 864 Ser Glu Asp Glu Leu Leu Asp Leu Thr Leu Lys Met Lys Phe Phe Ala 275 280 285 ctt gac tta cac gga gat cca agg gaa tct cac cct ttt ttg acc act 912 Leu Asp Leu His Gly Asp Pro Arg Glu Ser His Pro Phe Leu Thr Thr 290 295 300 gtt gtt gac gga gtt ttg ttg cct aag atg cct gag gaa atc ttg gcc 960 Val Val Asp Gly Val Leu Leu Pro Lys Met Pro Glu Glu Ile Leu Ala 305 310 315 320 gag aag gac ttt aac acc gtc cca tac att gtt gga att aac aag cag 1008 Glu Lys Asp Phe Asn Thr Val Pro Tyr Ile Val Gly Ile Asn Lys Gln 325 330 335 gag ttc gga tgg ctt ttg cca acg atg atg gga ttt cct ctt tcc gag 1056 Glu Phe Gly Trp Leu Leu Pro Thr Met Met Gly Phe Pro Leu Ser Glu 340 345 350 gga aag ttg gat caa aag acg gct acg tca ctt ttg tgg aag tcc tac 1104 Gly Lys Leu Asp Gln Lys Thr Ala Thr Ser Leu Leu Trp Lys Ser Tyr 355 360 365 cca att gcc aac att cct gaa gag ttg acc cca gtt gct acc gat aag 1152 Pro Ile Ala Asn Ile Pro Glu Glu Leu Thr Pro Val Ala Thr Asp Lys 370 375 380 tat tta gga gga aca gat gat cct gtc aaa aag aaa gat ttg ttt ttg 1200 Tyr Leu Gly Gly Thr Asp Asp Pro Val Lys Lys Lys Asp Leu Phe Leu 385 390 395 400 gat ctg atg gga gac gtt gtt ttc ggc gtc cca tca gtt acg gtt gct 1248 Asp Leu Met Gly Asp Val Val Phe Gly Val Pro Ser Val Thr Val Ala 405 410 415 cgt cag cat agg gac gca gga gct cca act tac atg tat gag ttc caa 1296 Arg Gln His Arg Asp Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Met Tyr Glu Phe Gln 420 425 430 tat cgt cca tct ttt tca tcg gat aag aaa cct aag acg gtt att gga 1344 Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Ser Asp Lys Lys Pro Lys Thr Val Ile Gly 435 440 445 gat cat gga gac gaa att ttt tcc gtc ttc ggc ttc cca ttg ctc aaa 1392 Asp His Gly Asp Glu Ile Phe Ser Val Phe Gly Phe Pro Leu Leu Lys 450 455 460 ggt gac gct cca gag gaa gaa gtc agt ctt tct aag acg gtt atg aaa 1440 Gly Asp Ala Pro Glu Glu Glu Val Ser Leu Ser Lys Thr Val Met Lys 465 470 475 480 ttt tgg gct aac ttc gcc cgt agt gga aac cct aat gga gaa gga ttg 1488 Phe Trp Ala Asn Phe Ala Arg Ser Gly Asn Pro Asn Gly Glu Gly Leu 485 490 495 cct cac tgg ccg atg tac gat caa gag gag gga tac ctt caa att ggt 1536 Pro His Trp Pro Met Tyr Asp Gln Glu Glu Gly Tyr Leu Gln Ile Gly 500 505 510 gtc aac act caa gca gct aag agg ttg aaa ggc gag gag gtt gct ttt 1584 Val Asn Thr Gln Ala Ala Lys Arg Leu Lys Gly Glu Glu Val Ala Phe 515 520 525 tgg aac gac ctg ttg tcc aag gaa gca gca aag aag cca cct aag ata 1632 Trp Asn Asp Leu Leu Ser Lys Glu Ala Ala Lys Lys Pro Pro Lys Ile 530 535 540 aag cac gcc gaa ttg taa 1650 Lys His Ala Glu Leu 545 <210> 2 <211> 549 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Gly Gln Pro Ala Ser Pro Pro Val Val Asp Thr Ala Gln Gly Arg 1 5 10 15 Val Leu Gly Lys Tyr Val Ser Leu Glu Gly Leu Ala Gln Pro Val Ala 20 25 30 Val Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Lys Pro Pro Leu Gly Ser Leu Arg 35 40 45 Phe Ala Pro Pro Gln Pro Ala Glu Pro Trp Ser Phe Val Lys Asn Thr 50 55 60 Thr Ser Tyr Pro Pro Met Cys Cys Gln Glu Pro Ile Gly Gly Gln Met 65 70 75 80 Leu Ser Asp Leu Phe Thr Asn Arg Lys Glu Arg Leu Ile Pro Glu Phe 85 90 95 Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Thr 100 105 110 Lys Arg Gly Arg Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Leu 115 120 125 Val Val Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Ala Leu Ala Ala His 130 135 140 Glu Asn Val Val Val Val Ala Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ile Trp Gly 145 150 155 160 Phe Phe Ser Thr Gly Asp Glu His Ser Arg Gly Asn Trp Gly His Leu 165 170 175 Asp Gln Val Ala Ala Leu His Trp Val Gln Glu Asn Ile Ala Asn Phe 180 185 190 Gly Gly Asp Pro Gly Ser Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly 195 200 205 Glu Ser Val Ser Val Leu Val Leu Ser Pro Leu Ala Lys Asn Leu Phe 210 215 220 His Arg Ala Ile Ser Glu Ser Gly Val Ala Phe Thr Ala Gly Val Val 225 230 235 240 Arg Lys Asp Met Lys Ala Ala Ala Lys Gln Ile Ala Val Leu Ala Gly 245 250 255 Cys Lys Thr Thr Thr Ser Ala Val Phe Val His Cys Leu Arg Gln Lys 260 265 270 Ser Glu Asp Glu Leu Leu Asp Leu Thr Leu Lys Met Lys Phe Phe Ala 275 280 285 Leu Asp Leu His Gly Asp Pro Arg Glu Ser His Pro Phe Leu Thr Thr 290 295 300 Val Val Asp Gly Val Leu Leu Pro Lys Met Pro Glu Glu Ile Leu Ala 305 310 315 320 Glu Lys Asp Phe Asn Thr Val Pro Tyr Ile Val Gly Ile Asn Lys Gln 325 330 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Thr Ala Thr Ser Leu Leu Trp Lys Ser Tyr 355 360 365 cca att gcc aac att cct gaa gag ttg acc cca gtt gct acc gat aag 1152 Pro Ile Ala Asn Ile Pro Glu Glu Leu Thr Pro Val Ala Thr Asp Lys 370 375 380 tat tta gga gga aca gat gat cct gtc aaa aag aaa gat ttg ttt ttg 1200 Tyr Leu Gly Gly Thr Asp Asp Pro Val Lys Lys Lys Asp Leu Phe Leu 385 390 395 400 gat ctg atg gga gac gtt gtt ttc ggc gtc cca tca gtt acg gtt gct 1248 Asp Leu Met Gly Asp Val Val Phe Gly Val Pro Ser Val Thr Val Ala 405 410 415 cgt cag cat agg gac gca gga gct cca act tac atg tat gag ttc caa 1296 Arg Gln His Arg Asp Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Met Tyr Glu Phe Gln 420 425 430 tat cgt cca tct ttt tca tcg gat aag aaa cct aag acg gtt att gga 1344 Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Ser Asp Lys Lys Pro Lys Thr Val Ile Gly 435 440 445 gat cat gga gac gaa att ttt tcc gtc ttc ggc ttc cca ttg ctc aaa 1392 Asp His Gly Asp Glu Ile Phe Ser Val Phe Gly Phe Pro Leu Leu Lys 450 455 460 ggt gac gct cca gag gaa gaa gtc agt ctt tct aag acg gtt atg aaa 1440 Gly 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Gly Ile Trp Gly 145 150 155 160 ttt ttc tcc aca gga gat gag cat tcc cgt gga aac tgg ggc cat tta 528 Phe Phe Ser Thr Gly Asp Glu His Ser Arg Gly Asn Trp Gly His Leu 165 170 175 gat caa gtt gct gca ttg cat tgg gtc caa gaa aac att gct aac ttc 576 Asp Gln Val Ala Ala Leu His Trp Val Gln Glu Asn Ile Ala Asn Phe 180 185 190 gga ggt gat cca ggt tct gtt act att ttc gga gaa tca gca ggc gga 624 Gly Gly Asp Pro Gly Ser Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly 195 200 205 gag agt gtc tct gta ttg gtt tta tca cca tta gct aag aac ctt ttt 672 Glu Ser Val Ser Val Leu Val Leu Ser Pro Leu Ala Lys Asn Leu Phe 210 215 220 cat cgt gct att tcc gaa agt ggt gtt gct ttt acc gcc ggt ttg gtc 720 His Arg Ala Ile Ser Glu Ser Gly Val Ala Phe Thr Ala Gly Leu Val 225 230 235 240 agg aag gat atg aag gcc gca gcc aag cag atc gct gtc ctt gca gga 768 Arg Lys Asp Met Lys Ala Ala Ala Lys Gln Ile Ala Val Leu Ala Gly 245 250 255 tgc aaa act act act tcg gca gtc ttc gtg cat tgt ttg cgt caa aag 816 Cys Lys Thr Thr Thr Ser Ala Val Phe Val His Cys Leu Arg Gln Lys 260 265 270 tcg gaa gat gaa ctt tta gac ctc acg ttg aag atg aaa ttc ctg acc 864 Ser Glu Asp Glu Leu Leu Asp Leu Thr Leu Lys Met Lys Phe Leu Thr 275 280 285 ctt gac ttt cac gga gat caa agg gaa tct cac cct ttt ttg ccg act 912 Leu Asp Phe His Gly Asp Gln Arg Glu Ser His Pro Phe Leu Pro Thr 290 295 300 gtt gtt gac gga gtt ttg ttg cct aag atg cct gag gaa atc ttg gcc 960 Val Val Asp Gly Val Leu Leu Pro Lys Met Pro Glu Glu Ile Leu Ala 305 310 315 320 gag aag gac ttt aac acc gtc cca tac att gtt gga att aac aag cag 1008 Glu Lys Asp Phe Asn Thr Val Pro Tyr Ile Val Gly Ile Asn Lys Gln 325 330 335 gag ttc gga tgg ctt ttg cca acg atg atg gga ttt cct ctt tcc gag 1056 Glu Phe Gly Trp Leu Leu Pro Thr Met Met Gly Phe Pro Leu Ser Glu 340 345 350 gga aag ttg gat caa aag acg gct acg tca ctt ttg tgg aag tcc tac 1104 Gly Lys Leu Asp Gln Lys Thr Ala Thr Ser Leu Leu Trp Lys Ser Tyr 355 360 365 cca att gcc aac att cct gaa gag ttg acc cca gtt gct acc gat aag 1152 Pro Ile Ala Asn Ile Pro Glu Glu Leu Thr Pro Val Ala Thr Asp Lys 370 375 380 tat tta gga gga aca gat gat cct gtc aaa aag aaa gat ttg ttt ttg 1200 Tyr Leu Gly Gly Thr Asp Asp Pro Val Lys Lys Lys Asp Leu Phe Leu 385 390 395 400 gat ctg atg gga gac gtt gtt ttc ggc gtc cca tca gtt acg gtt gct 1248 Asp Leu Met Gly Asp Val Val Phe Gly Val Pro Ser Val Thr Val Ala 405 410 415 cgt cag cat agg gac gca gga gct cca act tac atg tat gag ttc caa 1296 Arg Gln His Arg Asp Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Met Tyr Glu Phe Gln 420 425 430 tat cgt cca tct ttt tca tcg gat aag aaa cct aag acg gtt att gga 1344 Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Ser Asp Lys Lys Pro Lys Thr Val Ile Gly 435 440 445 gat cat gga gac gaa att ttt tcc gtc ttc ggc ttc cca ttg ctc aaa 1392 Asp His Gly Asp Glu Ile Phe Ser Val Phe Gly Phe Pro Leu Leu Lys 450 455 460 ggt gac gct cca gag gaa gaa gtc agt ctt tct aag acg gtt atg aaa 1440 Gly Asp Ala Pro Glu Glu Glu Val Ser Leu Ser Lys Thr Val Met Lys 465 470 475 480 ttt tgg gct aac ttc gcc cgt agt gga aac cct aat gga gaa gga ttg 1488 Phe Trp Ala Asn Phe Ala Arg Ser Gly Asn Pro Asn Gly Glu Gly Leu 485 490 495 cct cac tgg ccg atg tac gat caa gag gag gga tac ctt caa att ggt 1536 Pro His Trp Pro Met Tyr Asp Gln Glu Glu Gly Tyr Leu Gln Ile Gly 500 505 510 gtc aac act caa gca gct aag agg ttg aaa ggc gag gag gtt gct ttt 1584 Val Asn Thr Gln Ala Ala Lys Arg Leu Lys Gly Glu Glu Val Ala Phe 515 520 525 tgg aac gac ctg ttg tcc aag gaa gca gca aag aag cca cct aag ata 1632 Trp Asn Asp Leu Leu Ser Lys Glu Ala Ala Lys Lys Pro Pro Lys Ile 530 535 540 aag cac gcc gaa ttg taa 1650 Lys His Ala Glu Leu 545 <210> 12 <211> 549 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Met Gly Gln Pro Ala Ser Pro Pro Val Val Asp Thr Ala Gln Gly Arg 1 5 10 15 Val Leu Gly Lys Tyr Val Ser Leu Glu Gly Leu Ala Gln Pro Val Ala 20 25 30 Val Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Lys Pro Pro Leu Gly Ser Leu Arg 35 40 45 Phe Ala Pro Pro Gln Pro Ala Glu Pro Trp Ser Phe Val Lys Asn Thr 50 55 60 Thr Ser Tyr Pro Pro Met Cys Cys Gln Glu Pro Ile Gly Gly Gln Met 65 70 75 80 Leu Ser Asp Leu Phe Thr Asn Arg Lys Glu Arg Leu Ile Pro Glu Phe 85 90 95 Ser Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Thr 100 105 110 Lys Arg Gly Arg Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Leu 115 120 125 Val Val Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Ala Leu Ala Ala His 130 135 140 Glu Asn Val Val Val Val Ala Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ile Trp Gly 145 150 155 160 Phe Phe Ser Thr Gly Asp Glu His Ser Arg Gly Asn Trp Gly His Leu 165 170 175 Asp Gln Val Ala Ala Leu His Trp Val Gln Glu Asn Ile Ala Asn Phe 180 185 190 Gly Gly Asp Pro Gly Ser Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly 195 200 205 Glu Ser Val Ser Val Leu Val Leu Ser Pro Leu Ala Lys Asn Leu Phe 210 215 220 His Arg Ala Ile Ser Glu Ser Gly Val Ala Phe Thr Ala Gly Leu Val 225 230 235 240 Arg Lys Asp Met Lys Ala Ala Ala Lys Gln Ile Ala Val Leu Ala Gly 245 250 255 Cys Lys Thr Thr Thr Ser Ala Val Phe Val His Cys Leu Arg Gln Lys 260 265 270 Ser Glu Asp Glu Leu Leu Asp Leu Thr Leu Lys Met Lys Phe Leu Thr 275 280 285 Leu Asp Phe His Gly Asp Gln Arg Glu Ser His Pro Phe Leu Pro Thr 290 295 300 Val Val Asp Gly Val Leu Leu Pro Lys Met Pro Glu Glu Ile Leu Ala 305 310 315 320 Glu Lys Asp Phe Asn Thr Val Pro Tyr Ile Val Gly Ile Asn Lys Gln 325 330 335 Glu Phe Gly Trp Leu Leu Pro Thr Met Met Gly Phe Pro Leu Ser Glu 340 345 350 Gly Lys Leu Asp Gln Lys Thr Ala Thr Ser Leu Leu Trp Lys Ser Tyr 355 360 365 Pro Ile Ala Asn Ile Pro Glu Glu Leu Thr Pro Val Ala Thr Asp Lys 370 375 380 Tyr Leu Gly Gly Thr Asp Asp Pro Val Lys Lys Lys Asp Leu Phe Leu 385 390 395 400 Asp Leu Met Gly Asp Val Val Phe Gly Val Pro Ser Val Thr Val Ala 405 410 415 Arg Gln His Arg Asp Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Met Tyr Glu Phe Gln 420 425 430 Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Ser Asp Lys Lys Pro Lys Thr Val Ile Gly 435 440 445 Asp His Gly Asp Glu Ile Phe Ser Val Phe Gly Phe Pro Leu Leu Lys 450 455 460 Gly Asp Ala Pro Glu Glu Glu Val Ser Leu Ser Lys Thr Val Met Lys 465 470 475 480 Phe Trp Ala Asn Phe Ala Arg Ser Gly Asn Pro Asn Gly Glu Gly Leu 485 490 495 Pro His Trp Pro Met Tyr Asp Gln Glu Glu Gly Tyr Leu Gln Ile Gly 500 505 510 Val Asn Thr Gln Ala Ala Lys Arg Leu Lys Gly Glu Glu Val Ala Phe 515 520 525 Trp Asn Asp Leu Leu Ser Lys Glu Ala Ala Lys Lys Pro Pro Lys Ile 530 535 540 Lys His Ala Glu Leu 545

Claims (23)

  1. 화학식 I에 따른 3-하이드록시-2-메틸-4-[1,2,4]트리아졸-1-일-3-페닐-부티르산 에스테르 유도체의 부분 입체 이성체의 혼합물로서, 상응하는 (2R,3R)/(2S,3S) 라세미체가 풍부화된 것의 제조 방법으로서,
    [화학식 I]
    Figure pct00008
    ;
    Figure pct00009
    ;
    (상기 식에서, R1 및 R2는 각각 플루오르화물 또는 수소로서, R1이 플루오르화물일 때 R2는 수소이고, R2가 플루오르화물일 때 R1은 수소이며, R은 C1-C12알킬, C5-C12아릴 또는 C6-C11아랄킬임)
    (i) 용매의 존재 하,
    이 용매의 비등점 미만의 온도에서,
    화학식 II에 따른 2-할로아연 프로피온산염 에스테르를 제조하는 단계,
    [화학식 II]
    Figure pct00010

    (상기 식에서, X는 브롬화물, 요오드화물 또는 염화물임)
    (ii) 화학식 III에 따른 케톤을 도입하는 단계,
    [화학식 III]
    Figure pct00011

    (iii) 용매의 존재 하에서, 화학식 II에 따른 2-할로아연 프로피온산염 에스테르와, 화학식 III에 따른 케톤 간 레포르마츠키 반응을 진행하고, 생성된 반응 혼합물에 마지막 시약을 첨가하고 나서 이 혼합물을 교반하거나 교반하지 않으면서 0.5시간 초과, 바람직하게는 2시간 초과 동안 방치하여 생성된 반응 혼합물이 침전물을 형성하도록 하며, 상기 침전물은 화학식 I에 따른 라세미 (2R,3R)/(2S,3S) 에스테르가 풍부화된 것인 단계, 및
    상기 침전물을 분리하는 단계
    를 포함하며, 단계 (i)과 단계 (ii)가 수행되는 순서는 서로 바뀔 수 있으며, 과량의 아연은 상기 침전물의 형성 전에 제거되는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 I 중 R1은 플루오르화물이고, R2는 수소인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 II에서 R은 에틸이고/이거나, 화학식 II에서 X는 브롬화물인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단계 (i)의 온도는 -10℃ 내지 40℃인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 온도는 -10℃ 내지 10℃인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단계 (iii)의 온도는 용매의 비등점 미만인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (i)은 단계 (ii) 전에 수행되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단계 (i) 및/또는 단계 (iii)의 용매는 극성 비양자성 용매인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 용매는 테트라하이드로푸란, 2-메틸-테트라하이드로푸란, tert부틸메틸에테르, 디이소프로필에테르, 디에틸에테르, 아세토니트릴, 아세트산에틸, 디클로로메탄 또는 톨루엔인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단계 (i)의 2-할로아연 프로피온산염 에스테르는, 2-할로프로피온산염 에스테르와 금속 아연의 반응을 통해 얻어지는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    (iv) 화학식 I의 에스테르의 원하는 (2R,3R) 거울상 이성체가 풍부화된 생성물을 얻기 위하여, 단계 (iii)에서 얻어진 침전물을 유기 용매에 용해 및/또는 추출하고, 상기 용액 중 (2R,3R)/(2S,3S) 부분 입체 이성체를 분할하는 단계
    가 후속되는 방법.
    Figure pct00012

    (R,R-에스테르 I)
  12. 제11항에 있어서, 상기 화학식 I에 따른 에스테르의 부분 입체 이성체의 효소 분할(enzymatic resolution)은 에스테라아제 효소를 사용하여 수행되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 에스테라아제 효소는 에스테라아제 활성을 가지며 서열 번호 4에 나타낸 아미노산 서열 또는 아미노산 동일성이 95% 이상, 바람직하게는 98% 이상인 이의 상동체를 포함하는 분리된 폴리펩티드인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 에스테라아제 효소는 에스테라아제 활성을 가지며 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열 또는 아미노산 동일성이 95% 이상인 이의 상동체를 포함하고, 이 상동체는 239번 위치 또는 이에 상응하는 위치에 아미노산으로서 발린을 포함하는 분리된 폴리펩티드인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 상동체는 아미노산 동일성이 98% 이상, 바람직하게는 99% 이상이고, 서열 번호 2에 따른 아미노산 서열의 239번 위치 또는 이에 상응하는 상동체 서열의 위치에 아미노산으로서 발린을 포함하는 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 에스테라아제 활성을 가지는 분리된 폴리펩티드는 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 에스테라아제 활성을 가지는 분리된 폴리펩티드는 서열 번호 2에 나타낸 아미노산 서열인 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, tert-부탄올, 아세트산tert-부틸, 메틸이소부틸케톤 및 톨루엔으로부터 선택된 유기 보조 용매가 효소 분할에 사용되는 방법.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단계 (iv)에서 얻어진 화학식 I의 에스테르의 원하는 (2R,3R) 거울상 이성체가 풍부화된 생성물을, 암모니아를 이용한 처리를 통해 상응하는 아미드로 전환하는 단계가 후속되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상응하는 시안화물로 아미드를 탈수시키는 단계가 후속되는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 시안화물을 상응하는 티오아미드로 전환한 다음, 선택적으로, 상기 티오아미드의 페닐부가 2,5-디플루오로 치환되었거나 라부코나졸일 때, 상기 티오아미드의 페닐부가 2,4-디플루오로 치환되었을 때, 알파-케토 치환된 4-시아노아세토페논 시약과의 반응을 통하여 상기 티오아미드를 이사부코나졸로 추가로 전환하는 방법.
  22. GC에 의해 측정되는 부분 입체 이성체 과량 97% 내지 99.9%, 바람직하게는 99% 내지 99.9%로 (2R,3R)/(2S,3S) 에스테르의 라세미 혼합물을 포함하는, 화학식 I의 3-하이드록시-2-메틸-4-[1,2,4]트리아졸-1-일-3-페닐-부티르산 에스테르 부분 입체 이성체들의 혼합물.
    [화학식 I]
    Figure pct00013
    ;
    Figure pct00014
    ;
    (상기 식에서, R1 및 R2는 각각 플루오르 또는 수소로서, R1이 플루오르일 때 R2는 수소이고, R2가 플루오르일 때 R1은 수소이며, R은 C1-C12알킬, C5-C12아릴 또는 C6-C11아랄킬임)
  23. 화학식 I에 따른 (2R,3R)-3-하이드록시-2-메틸-4-[1,2,4]트리아졸-1-일-3-페닐-부티르산 에스테르 유도체.
    Figure pct00015

    (R,R-에스테르 I)
    (상기 식에서, R은 C1-C12알킬 또는 C5-C12아릴이고,
    R1은 플루오르이며,
    R2는 수소임)
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