KR20160096906A - 라세믹 트레오닌으로부터 d-트레오닌 및 호모알라닌을 순차적으로 생산하는 방법 - Google Patents

라세믹 트레오닌으로부터 d-트레오닌 및 호모알라닌을 순차적으로 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생효소를 이용하여 D-트레오닌을 간단히 제조하는 방법을 제공하면서, 동시에 D-트레오닌과 함께 생성된 2-옥소부티레이트로부터 호모알라닌을 고수율로 생산하는 방법을 제공하고는 방법에 관한 것이다.

Description

라세믹 트레오닌으로부터 D-트레오닌 및 호모알라닌을 순차적으로 생산하는 방법{METHOD OF PRODUCING D-THREONINE AND HOMOALANINE FROM RACEMIC THREONINE}
본 발명은 라세믹 트레오닌으로부터 D-트레오닌 및 호모알라닌을 순차적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
비천연 아미노산인 D-트레오닌, L-호모알라닌 및 D-호모알라닌은 의약제 및 농약제의 키랄 빌딩 블록으로 중요하게 사용된다. 발효에 의해 간단히 생산될 수 있는 천연아미노산과 달리 비천연 아미노산은 미생물의 천연 대사 산물이 아니기 때문에 생체 촉매 또는 화학 촉매를 이용한 제조방법이 연구되어 왔다. 트레오닌의 경우 그 혼합물은 크로토닉산으로부터 화학적인 방법으로 쉽게 합성될 수 있지만 (Org . Synth ., 1940, 20, 101-103), 분자내 키랄 중심이 2개로 4종류의 입체이성질체를 가지므로 그 혼합물로부터 각각의 순수한 트레오닌을 얻는데 어려움이 있다.
공지 문헌 (J. Am . Chem . Soc ., 1949, 71(7), 2541-2542)에는 브루신(Brucine)을 이용하여 DL-트레오닌을 D-트레오닌과 L-트레오닌으로 화학적으로 분리하는 방법이 개시되어 있는데, 여러 단계를 반복적으로 거치기 때문에 분리에 비용이 많이 들고 수득률 또한 43.4%로 낮다는 문제점이 있다.
미국 특허 제 5,552,318호에는 라이페이즈를 이용하여 라세믹 아미노산 에스테르로부터 D-아미노산 에스테르를 얻은 후 이를 화학적으로 가수분해하여 D-아미노산을 생산하는 법이 개시되어 있지만, D-트레오닌의 경우 수득률이 31.6%, 거울상순도가 27.1% 정도로 상업성이 낮다는 문제점이 있다.
공지 문헌 (Adv . Synth . Catal ., 2007, 349, 1349-1352)에는 포스파테이즈를 이용하여 O-포스포-DL-트레오닌으로부터 동역학적 분할을 통해 D-트레오닌을 생산하는 방법이 개시되어 있는데, 먼저 DL-트레오닌을 O-포스포-DL-트레오닌으로 변형시켜주어야 하는 추가적인 단계가 필요하고 수득률 또한 30% 정도로 낮기 때문에 상업적으로 사용하기에는 문제가 있다.
대한민국 특허 제 10-1446551호에는 (2RS)-알킬카르보닐아미노-3-옥소-부티르산 알킬에스테르로부터 효소환원법을 통해 (2RS)-알킬카르보닐아미노-(3S)-히드록시-부티르산 알킬에스테르를 얻은 후 이를 탈보호시켜 D-트레오닌 및 L-알로-트레오닌의 혼합물을 얻는 방법이 개시되어 있는데, 기질로 사용되는 (2RS)-알킬카르보닐아미노-3-옥소-부티르산 알킬에스테르를 화학적인 방법을 통해 따로 합성해야 한다는 점, 또 순수한 D-트레오닌 또는 L-알로-트레오닌을 얻기 위해서는 생성물 혼합물을 추가적으로 분리해야 하는 단계가 필요하다는 단점이 있다.
L-트레오닌 디하이드라테이즈 (L-threonine dehydratase)는 L-트레오닌을 2-옥소부티레이트와 암모니아로 전환하여 주는 효소로 L-이소류신 등의 천연아미노산 생산에 중요한 생물학적 역할을 담당한다. 하지만 L-트레오닌 디하이드라테이즈를 사용하여 라세믹 트레오닌의 동역학적 분할을 수행하고 이를 통해 D-트레오닌 을 생산하는 사례는 보고된 바가 없다.
대한민국 등록특허공보 제 10-1446551호 미국 특허공개공보 제 5,552,318호
Org. Synth., 1940, 20, 101-103 J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(7), 2541-2542 Adv. Synth. Catal., 2007, 349, 1349-1352
상기와 같은 문제점을 해결하고자, 본 발명의 목적은 생효소를 이용하여 D-트레오닌을 간단히 제조하는 방법을 제공하면서, 동시에 D-트레오닌과 함께 생성된 2-옥소부티레이트로부터 호모알라닌을 고수율로 생산하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 DL-트레오닌으로부터 D-트레오닌 및 호모알라닌을 순차적으로 생산하는 방법에 관한 것으로서, 다음 단계를 포함한다:
(a) DL-트레오닌으로부터 L-트레오닌 디하이드라테이즈를 이용하여 키네틱 레졸루션에 의하여 D-트레오닌 및 2-옥소부티레이트를 생산하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 2-옥소부티레이트로부터 (S)-/(R)-선택적인 오메가트랜스아미네이즈를 이용하여 광학적으로 순수한 L-/D-호모알라닌을 생산하는 단계.
본 발명의 방법에 의하여 L-트레오닌 디하이드라테이즈 효소를 이용하여 라세믹 트레오닌으로부터 단일 단계로 순수한 D-트레오닌을 고수율로 생산할 수 있음과 동시에, 부산물인 2-옥소부티레이트로부터 오메가트랜스아미네이즈를 이용하여 광학적으로 순수한 호모알라닌을 생산할 수 있다. 상술한 D-트레오닌 및 호모알라닌은 의료용 제제로서 광범위하게 사용되는 비천연아미노산으로서 활용도가 매우 높다.
도 1은 L-트레오닌의 기질 저해를 보여주는 그래프이다.
도 2는 D-트레오닌의 기질 저해를 보여주는 그래프이다.
도 3은 DL-트레오닌의 동력학적 분할을 보여주는 그래프이다.
도 4는 오메가트랜스아미나제에 의하여 D-호모알라닌의 생산을 보여주는 그래프이다.
이하 본 발명을 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 구체예는 DL-트레오닌으로부터 D-트레오닌과 호모알라닌을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 다음 단계를 포함한다:
(a) DL-트레오닌으로부터 L-트레오닌 디하이드라테이즈를 이용하여 동역학적 분할을 통해 D-트레오닌 및 2-옥소부티레이트를 생산하는 단계; 및
(b) 상기 2-옥소부티레이트로부터 (S)- 또는 (R)-선택적인 오메가트랜스아미네이즈를 이용하여 광학적으로 순수한 L- 또는 D-호모알라닌을 생산하는 단계.
상기 생산 방법은 아래 반응식 1에 의하여 표시될 수 있다:
[반응식 1]
Figure pat00001
상기 R1 및 R2는 알킬, 아릴 및 아릴알킬기로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되며, 바람직하게는, 이소프로필아민, 알파-메틸벤질아민 또는 벤질아민일 수 있다.
상기 L-트레오닌 디하이드라테이즈(L-threonine dehydratase)는 L-트레오닌을 기질로 하여 2-옥소부티레이트와 암모니아를 생성물로 하는 효소이다. L-트레오닌 디하이드라테이즈는 L-트레오닌에 대한 광학선택성이 매우 높다. 따라서 상기 반응을 통하여 라세믹 트레오닌에서 L-트레오닌은 2-옥소부티레이트와 암모니아로 전환되고, L-트레오닌 디하이드라테이즈와 반응하지 않는 D-트레오닌은 그대로 남게 됨으로써 이를 광학적으로 순수하게 얻을 수 있다. 라세믹 트레오닌에 L-트레오닌 디하이드라테이즈를 투입하여 광학분할을 통해 D-트레오닌을 얻고자 하는 시도는 아직 보고된 예가 없으며, 이번 연구는 L-트레오닌 디하이드라테이즈를 이용하여 광학적으로 순수한 D-트레오닌을 얻을 수 있다는 최초의 실시예이다.
오메가트랜스아미네이즈는 1차 아민과 같은 아미노 공여체로부터 아미노 그룹을 받아 아미노 수용체로 전달하여주는 반응을 하는 효소이다. 상기 L-트레오닌 디하이드라테이즈 반응이 종결된 후 광학적으로 순수한 D-트레오닌을 반응액으로부터 분리하면, 반응물에는 부산물로서 2-옥소부티레이트가 남아있게 된다. 여기에 (S)- 또는 (R)-선택적 오메가트랜스아미네이즈 및 이소프로필아민, 알파-메틸벤질아민 또는 벤질아민과 같은 아미노공여체를 투입하면 2-옥소부티레이트가 L- 또는 D-호모알라닌으로 전환된다.
[실시예]
실시예 1 : Escherichia coli 로부터 트레오닌 디하이드라테이즈를 암호화하는 DNA 및 벡터 DNA 로 이루어진 재조합 DNA 의 제조
Escherichia coli을 LB 배지(펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, pH 7)에서 37℃ 12시간 배양한 후 단일 콜로니로부터 트레오닌디하이드라테이즈를 발현하는 유전자를 콜로니 PCR을 통해 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET21a(+)에 Nde1, Xho1 제한효소와 라이게이즈를 이용하여 삽입하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 [표 1]과 같다.
[표 1]
Figure pat00002

실시예 2 : 오크로박트럼앤트로피( Ochrobactrum anthropi )로부터 (S)-선택적 오메가트랜스아미네이즈를 암호화하는 DNA 및 벡터 DNA 로 이루어진 재조합 DNA 의 제조
오크로박트럼앤트로피(Ochrobactrum anthropi)을 LB 배지 (펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, pH 7)에서 37℃ 12시간 배양한 후 싱글 콜로니로부터 오메가트랜스아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성하였으며, 이를 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nco1, Xho1 제한효소와 라이게이즈를 이용하여 삽입하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 [표 2]와 같다.
[표 2]
Figure pat00003

실시예 3: 아스로박터 종( Arthrobacter sp .)으로부터 (R)-선택적 오메가트랜스아미나제를 암호화하는 DNA 및 벡터 DNA 로 이루어진 재조합 DNA 의 제조
아스로박터 종(Arthrobacter sp.) 유래의 (R)-선택적 오메가트랜스아미나제 유전자 서열(NCBI gene ID: 115385557)을 pGEM-T vector에 합성하여 플라스미드로부터 오메가트랜스아미나제를 발현하는 유전자를 합성하였으며, 이를 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nco1, Xho1 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 [표 3]과 같다.
[표 3]
Figure pat00004

실시예 4 : 형질 전환 균주로부터 효소의 과발현 및 정제
상기 실시예 1에서 수득된 플라스미드를 사용하여 Escherichia coli BL21(DE3)를 형질전환시켰다. 암피실린을 함유하는 LB 배지 1 L에서 배양시킨 후, IPTG(최종 농도 0.1 mM)를 현탁도(OD) 0.4에서 첨가하였다. 이후 6시간 이상 37℃에서 배양한 후 10000×g 4℃에서 20분간 원심분리하여 트레오닌 디하이드라테이즈가 과발현된 세균세포를 얻었다. 일부 실험에서는 이를 빙냉시키면서 초음파 처리를 한 다음 17000×g 4℃에서 30분간 원심 분리하여 상층액을 추출액으로 수득하여 사용하였다.
상기 실시예 2 및 실시예 3 에서 수득된 플라스미드를 사용하여 Escherichia coli BL21(DE3)를 형질전환시켰다. 가나마이신을 함유하는 LB 배지 1 L에서 배양시킨 후, IPTG(최종 농도 0.1 mM)를 현탁도(OD) 0.4에서 첨가하였다. 이후 6시간 이상 37℃에서 배양한 후 10000×g 4℃에서 20분간 원심분리하여 세균세포를 얻어 15 mL 리서스펜션 버퍼 (50 mM Tris-HCl, 50 mM 염화칼슘, 1 mM β-mercaptoethanol, 0.1 mM PMSF, 20 μM PLP, pH 7)로 현탁시켰다. 이를 빙냉시키면서 초음파 처리를 한 다음 17000×g 4℃에서 30분간 원심 분리하여 상층액을 조추출액으로 수득하였다. 이 추출액을 친화성 크로마토그래피를 이용하여 원하는 오메가트랜스아미나제 정제하여 효소 용액을 얻었다.
실시예 5 : 과발현된 트레오닌 디하이드라테이즈를 포함한 세균세포 또는 그것의 조추출액의 활성측정 및 농도결정
효소의 활성 및 농도 결정은 37℃에서 50 mM potassium phosphate 버퍼 pH 7에서 수행되었다. 상기 실시예 4에서 얻어진 트레오닌 디하이드라테이즈가 과발현된 세균세포 또는 조추출액의 디하이드라테이즈 활성 측정을 위한 효소반응은 반응시작 10분 후 반응 용액 50 μL에 5 N HCl 10 μL를 넣어 멈추었다. 상기 실시예 4에서 얻어진 1 unit의 과발현된 트레오닌 디하이드라테이즈를 포함한 세균세포 또는 그것의 조추출액의 활성은 50 mM L-트레오닌에서 1분 동안 2-옥소부티레이트 1 μmole이 생기는 것을 의미한다. 활성 측정을 위하여 생성된 2-옥소부티레이트를 HPLC를 이용하여 측정한다.
실시예 6 : HPLC 분석
아미노산의 농도분석과 광학순도를 구하기 위하여 키랄 아미노산은 Marfey? reagent를 이용하여 유도체화 한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 일반적인 Marfey? reagent 유도체화 과정은 1 M 소디움바이카르보네이트 18 μL, DMSO 50 μL, 14 mM Marfey? reagent 10 μL, 아미노산 샘플 22 μL(Marfey? reagent:아미노산 분자비>1.4)를 섞은 후 40 ℃에서 8 시간 반응한 후 차게 하여 20 μL의 1 M 염산을 섞어주었다. 이 용액을 C18 컬럼과 HPLC를 이용하여 유속 1 mL/min, 온도 30 ℃ 그리고 340 nm에서 UV 측정기를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 하기 [표 4]에 나타내었다.
[표 4]
Figure pat00005
키토산의 농도분석은 Bio-Rad® AmineX HPX-87H 컬럼과 HPLC를 이용하여 이동상 H2SO4(pH 2), 유속 0.5 mL/min, 온도 40 ℃ 그리고 210 nm에서 UV 측정기를 이용하여 분석하였다.
실시예 7 : 과발현된 트레오닌 디하이드라테이즈를 포함한 세균세포 또는 그것의 조추출액의 L-트레오닌 또는 D-트레오닌에 대한 기질저해 효과 조사
상기 실시예 4에서 얻어진 트레오닌 디하이드라테이즈가 과발현된 세균세포 또는 조추출액의 L-트레오닌 또는 D-트레오닌에 대한 기질저해 효과를 조사하였다. 반응성이 있는 거울상 이성질체 트레오닌에 대한 기질저해를 측정하기 위하여 10-400 mM L-트레오닌, 50 mM phosphate 버퍼 pH 7, 37℃ 조건에서 0.2 mg-dcw/mL의 트레오닌 디하이드라테이즈가 과발현된 세균세포 또는 0.02 mg/mL의 트레오닌 디하이드라테이즈가 과발현된 세균세포의 조추출액을 첨가하여 10 분간 반응하여 2-옥소부티레이트를 HPLC로 특정하였고 그 결과를 하기 [도 1] 에 나타내었다.
반응성이 없는 거울상 이성질체 트레오닌에 대한 기질저해를 측정하기 위하여 50 mM L-트레오닌, 0-250 mM D-트레오닌, 50 mM phosphate 버퍼 pH 7, 37℃ 조건에서 0.2 mg-dcw/mL의 트레오닌 디하이드라테이즈가 과발현된 세균세포 또는 0.02 mg/mL의 트레오닌 디하이드라테이즈가 과발현된 세균세포의 조추출액을 첨가하여 10 분간 반응하여 2-옥소부티레이트를 HPLC로 특정하였고 그 결과를 하기 [도 2]에 나타내었다.
실시예 8 : 과발현된 트레오닌 디하이드라테이즈를 포함한 세균세포를 이용한 광학 활성 트레오닌의 동역학적 분할( kinetic resolution )에의 초기 기질농도의 효과 조사
상기 실시예 4에서 얻어진 과발현된 트레오닌 디하이드라테이즈를 포함한 세균세포를 이용하여 0.5-1.5 M DL-트레오닌을 기질로 사용하여 반응을 수행하였다. 0.5-1.5 M DL-트레오닌, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7, 37℃ 조건에서 Escherichia coli 유래의 트레오닌 디하이드라테이즈가 과발현된 세균세포 8.5 mg-dcw/mL를 첨가하여 시간에 따라 트레오닌의 양을 L-트레오닌과 D-트레오닌으로 나누어서 각각 측정하였으며, 이의 enantiomeric excess (ee)를 구하였다. 그 결과 0.5 M DL-트레오닌을 넣어준 경우 3시간의 반응 만에 99% 이상의 enatiomeric excess로 D-트레오닌을 얻을 수 있었으나 1 M 또는 1.5 M DL-트레오닌을 넣어준 경우에는 24시간의 반응에도 각각 96% 또는 63%의 enatiomeric excess의 D-트레오닌을 얻을 수 있었다. 이의 결과를 하기 [도 3]에 나타내었다.
실시예 9 : 과발현된 트레오닌 디하이드라테이즈를 포함한 세균세포를 이용한 광학 활성 트레오닌의 동역학적 분할( kinetic resolution )의 예비 규모 반응
상기 실시예 4에서 얻어진 과발현된 트레오닌 디하이드라테이즈를 포함한 세균세포를 이용하여 50 mM DL-트레오닌(3 g, 25.2 mmole)을 기질로 사용하여 50 mL의 예비 규모 반응을 수행하였다. 50 mM DL-트레오닌(3 g, 25.2 mmole), 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7, 37℃, 50 mL 조건에서 Escherichia coli 유래의 트레오닌 디하이드라테이즈가 과발현된 세균세포 8.5 mg-dcw/mL (42.5 mg-dcw, 50 mL)를 첨가하여 시간에 따라 트레오닌의 양을 L-트레오닌과 D-트레오닌으로 나누어서 각각 측정하였고 구해진 enantiomeric excess (ee)가 99%를 초과했을 때 반응 혼합물에서 D-트레오닌을 분리 및 정제하였다.
실시예 10 : 반응 혼합물에서의 생성물 분리 및 정제
상기 실시예 9에서 얻어진 반응 혼합물을 원심분리하여 세균세포가 제거된 상층액을 얻었다. 얻어진 상층액에 5 N HCl을 첨가하여 pH를 조정하여 단백질을 침전시켰고 유리-프릿 필터 깔대기를 통해 혼합물을 여과해서 단백질 침전물을 제거했다. 여과액을 Dowex 50WX8 양이온-교환 수지(40 g)로 충전된 유리 컬럼에 로딩하고, 이어서 0.1 N HCl(50 mL)와 물(50 mL)로 세척하여 통과액을 얻었고, 컬럼을 10% 암모니아 용액 150 mL로 용출시켰다. 용출액 분획들을 모아서 50 ℃ 및 0.1 bar에서 1.36 g (수득률 90.5%)의 고체를 얻었다. 정제된 고체를 물에 녹이고 HPLC로 분석하여 enantiomeric excess 99.4%의 D-트레오닌이 얻어진 것을 확인하였다.
실시예 11 : 통과액을 이용한 L- 또는 D-호모알라닌의 생산
상기 실시예 4에서 정제된 오메가트랜스아미나제를 이용하여 상기 실시예 10에서 얻어진 통과액으로부터 L- 또는 D-호모알라닌을 합성하였다. 상기 실시예 10에서 얻어진 통과액에 5 N NaOH를 첨가하여 pH를 7로 조정하였고 HPLC로 분석하여 통과액의 2-옥소부티레이트의 양을 측정하여 기질로 사용하였다. 50 mM 2-옥소부티레이트(상기 실시예 10의 통과액), 100 mM 이소프로필아민, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7, 37℃ 조건에서 Ochrobactrum anthropi 유래의 (S)-선택적 오메가트랜스아미나제 5 mg/mL 또는 Arthrobacter sp. 유래의 (R)-선택적 오메가트랜스아미나제 6 mg/mL를 첨가하여 시간에 따라 호모알라닌의 양을 L-호모알라닌과 D-호모알라닌으로 나누어서 각각 측정하였으며, 이의 enantiomeric excess (ee)를 구하였다. 그 결과 (S)-선택적 오메가트랜스아미나제를 넣어준 경우 9시간의 반응 만에 전환율 93.2%, enatiomeric excess 99.9% 이상으로 L-호모알라닌을 얻을 수 있었고, (R)-선택적 오메가트랜스아미나제를 넣어준 경우 12시간의 반응 만에 전환율 89.4%, enatiomeric excess 99.9% 이상으로 D-호모알라닌을 얻을 수 있었다. 이의 결과를 하기 [도 4]에 나타내었다.

Claims (4)

  1. (a) L-트레오닌 디하이드라테이즈를 이용한 키네틱 레졸루션을 통해 DL-트레오닌으로부터 D-트레오닌 및 2-옥소부티레이트를 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 2-옥소부티레이트로부터 (S) 또는 (R)-선택적인 오메가트랜스아미네이즈를 이용하여 광학적으로 순수한 L-/D-호모알라닌을 생산하는 단계를 포함하는, 아래 반응식 1에 의하여 나타내는 DL-트레오닌으로부터 D-트레오닌 및 호모알라닌을 순차적으로 생산하는 방법.
    [반응식 1]
    Figure pat00006



    상기 R1 및 R2는 알킬, 아릴 및 아릴알킬기로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R1 및 R2 는 이소프로필아민, 알파-메틸벤질아민 또는 벤질아민인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 생산된 D-트레오닌의 광학 순도는 90 % 이상인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 생산된 호모알라닌의 광학 순도는 90 % 이상인 방법.


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