KR20150008848A - 건조된 생물학적 물질을 안정화시키는 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 건조시 생물 약제의 활성 손실을 최소화하고, 확장된 보존 기간을 갖는 건조된 제형을 제공하기 위한 목적으로 생물 약제의 건조된 제형을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 생물 약제에 부가적으로, 적어도 하나의 아미노산, 폴리올 및 금속염을 포함하는 수용액을 건조하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 상기 아미노산은 글루타메이트이며, 상기 폴리올은 소르비톨이며, 그리고 또한 선택적으로 만니톨이며, 그리고 상기 금속염은 마그네슘염이다. 상기 용액은 진공 건조 또는 동결 건조에 의해 건조된다. 상기 방법은 특히 백신용으로 사용되는 폴리오바이러스 또는 호흡기 세포융합 바이러스와 같은 바이러스의 건조된 제형을 제조하는데 유용하다. 또한 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 건조된 제형 및 예를 들어, 백신과 같은 약제로서의 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

건조된 생물학적 물질을 안정화시키는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR STABILIZING DRIED BIOLOGICAL MATERIALS}

본 발명은 건조된 생물학적 물질을 안정화시키고 보존하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 생물학적 물질은 백신, 특히 바이러스 백신과 같이, 동결건조되거나 진공-건조된 생물 약제의 조제용 물질을 포함한다. 따라서, 본 발명은 생물 약제의 제조 및 배합 분야 및 백신학 분야에 관한 것이다.

생물학적 화합물은 보통 손상되기 쉽고 취약한 점을 감안하면, 생물학적 화합물의 장기 보관은 특별한 도전을 제기한다. 생물학적 화합물을 분리, 정제 및 비-냉장 조건에서, 특히 실온 또는 그 이상의 온도에서 단기간 보다 더 이상 용액으로 보관할 수 있도록, 액체 환경에서, 용액 또는 서스펜션에서 충분히 안정한 것은 거의 없다.

생물 약제의 안정성을 향상시키는 한가지 방법은 이들을 건조 상태로 전환하는 것이다[17]. 상업적으로 그리고 현실적으로, 건조 형태로 생물 약제로 보관하는 것은 막대한 이점을 갖는다. 성공적으로 건조된 제제, 물질 및 조직은 이들의 증가된 보관 수명에도 불구하고 감소된 중량을 가지며 감소된 보관 공간을 필요로 한다. 이는 3개월 내지 2년 내의 사용을 위한 최종 다량의 백신에서와 같이, 최종 산물에 대한 용도뿐만 아니라, 종자소집단(seedlots), 벌크 또는 최종소집단(final lots)을 비축하기 위한 용도이다. 건조된 물질의 실온 보관은, 저온 보관 옵션에 비해 훨씬 비용 효율적이며 이에 따라 수반되는 비용도 훨씬 비용 효율적이다. 또한, 분말의 폐 전달, 코팅된 또는 용해 미세침에 의한 피부 전달, 분말 또는 용해성 니들에 의한 비경구 전달을 포함하는 여러 전달 경로는 제형의 정교한 방식에 따라 달라진다. 분무 건조,진공 건조, 공기-건조 코팅, 포옴-건조를 포함하여, 건조된 생물학적 화합물을 제조하는 여러 기술이 존재한다. 가장 오래되고 일반적으로 사용되는 기술중 하나는 냉동건조라고도 불리는 동결-건조이다. 장기간 동안 동결-건조는 과학이라기 보다는 오히려 기술로서 보여졌으며, 이는 과학적 접근 및 연구를 저해하였다.

고형 생물 약제를 제조하기 위한 가장 일반적으로 사용되는 방법은 동결-건조이다. 이 공정은 동결 단계 후 2개의 건조 단계가 후속하는 것으로 이루어져 있으며, 1차 건조는 동결된 물이 승화에 의해 제거되고, 2차 건조는 비-동결된 '바인딩된(bound)' 물이 제거된다. 동결 또는 건조 응력은 생물 약제의 열역학적 안정성을 변경할 수 있으며, 단백질 언폴딩을 유도하거나 촉진할 수 있다. 언폴딩은 생물 약제의 비가역적 변성을 일으킬 수 있으나, 또한 건조 상태에서 보관 안정성을 감소시킬 수 있다[19]. 안정한 동결 건조물을 위해, 안정화제 및/또는 증량제로 제공되는 부형제가 사용된다. 당, 폴리머, 아미노산 및 계면활성제와 같은 다른 화합물들은 동결 건조 및 후속적 보관 중에 생물 약제의 안정성 향상시키는 것으로 나타났다[18, 20]. 문헌으로, 동결, 건조 및 후속적 보관 중에 부형제가 단백질 및 백신과 같은 생물 약제를 얼마나 보호하는 것으로 여겨지는지 기재되어 있다. 다양한 안정화제의 냉동 및 동결보호 메커니즘을 이해하는 것은 안정한 동결건조된 백신을 위한 합리적인 제형화 및 공정 디자인의 개발에 중요하다[21].

냉동 중에, 생물 약제의 물리적 환경은 단백질성 생물 약제의 무결성에 영향을 주는 응력의 발달을 일으키는 것을 극적으로 변화시킨다. 냉동 중에 노출되는 생물 약제에 대하여 가장 결정적인 응력은 저온, 동결 농축 및 얼음의 형성이다[18, 19, 21, 22]. 냉 변성(cold denaturation)은 온도 저하의 결과로써 이에 의해 생물 약제가 이들의 치밀한 폴딩된 구조를 잃게 되는 현상이다. 현재 냉 변성에 대해 받아들여지는 설명은 보다 차가운 온도에서 물과 비극성기 사이의 접촉 자유 에너지의 변화에 기초하며, 이는 소수성 상호 작용을 약화시켜 이에 따라 생물 약제 구조를 무너뜨린다[19, 20, 23]. 얼음 형성으로 인해, 모든 용질의 농도는 냉동 중에 극적으로 증가한다. 이온 강도, 용질의 결정화 및 상 분리와 같은 농도와 관련된 모든 변화는 잠재적으로 생물 약제를 불안정화시킬 수 있다[21].

제형의 초기 상대적 조성 및 pH는 냉동 응력에 의한 생물 약제의 악화를 피할 수 있다. 예를 들어, 냉동 전에 다른 부형제에 비해 상대적으로 제형 내 생물 약제 농도를 증가시키는 것은 동결-융해 중에 생물 약제의 안정성을 증가시키는 것으로 다수의 생물 약제에서 발견되었다[24]. 마찬가지로, 용액에서 생물 약제에 대해 최적인 초기 pH는 동결-융해 후에 본래의 생물 약제의 최대 회수율을 제공할 것이다[20].

이러한 모든 인자들의 최적화 후에도, 다수의 생물 약제들은 여전히 동결-융해 후에 변성된다. 따라서, 단백질/생물 약제 변성을 최소화하기 위해 첨가제들이 요구된다. 매우 상이한 화학 부류에서 비롯된 다양한 부형제들은 냉동보호를 제공할 수 있다. '용질 배제 가설(solute exclusion hypothesis)'에 따르면, 냉동보호제는 수용액에서 생물 약제의 표면과 접촉시 우선적으로 존재하지 않는 것으로 나타났다[24]. 다양한 생물 약제의 존재하에서 용질 배제의 열역학적 현상은 염, 아미노산, 메틸아민, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리올, 계면활성제 및 당과 같은 다양한 부형제에 대해 조사되었다[19, 21, 24, 25].

'유리화 가설(vitrification hypothesis)'은 널리 알려진 운동 역학적 메커니즘이다. 이 메커니즘에 따르면, 동결 농축 및 온도 저하는 모두 점도를 증가시키고, 이동성을 감소시키고 모든 동력학적 공정을 느리게 한다. 시스템이 유리질 상태에 이를 때, 유리 내의 모든 분자들은 물리적으로(예, 변성, 응집) 그리고 화학적으로(예, 산화, 가수분해, 탈아미드화) 고정되고, 생물 약제 분해의 속도 상수는 감소된다[19, 26].

냉동 중에 형성되는 얼음-물 계면은 표면 변성을 일으킬 수 있다. 계면활성제의 첨가는 생물 약제 용액의 표면 장력을 감소시켜, 이에 따라 생물 약제 흡착 및 응집을 감소시킬 수 있다[25, 27].

폴리머는 제형의 유리전이온도를 증가시킴으로써, 그리고 이당류와 같은 소 안정화 첨가제의 결정화를 억제함으로써 생물 약제를 안정화시킬 수 있다[18, 22]. 아미노산은 또한 완충염 결정화의 속도 및 정도를 감소시켜, 이에 따라 pH 변화를 억제시켜 냉동 변성으로부터 생물 약제를 보호할 수 있다[18].

수용액에서, 생물 약제는 완전히 수화되며, 이는 생물 약제가 생물 약제 표면을 덮으며 (수소결합에 의해) 이와 상호작용하는 물 단층을 갖는 것을 의미한다[28]. 건조는 수화 겉층의 일부를 제거하며, 이는 생물 약제의 네이티브 상태를 붕괴시켜 변성이 일으킬 수 있다. 건조 중에 변성을 억제하기 위해 보호제가 요구된다. 이러한 보호제의 중요한 안정화 메커니즘은 '물 치환 가설(water substitution hypothesis)'로 불리운다[18-20, 29]. 수크로즈 및 트레할로즈와 같은 당류, 폴리올[20, 30] 및 아미노산[31]은 건조된 생물 약제와 수소 결합을 형성할 수 있다. 이에 따라, 이들은 수화 겉층이 제거될 경우에 물 대체물로 작용할 수 있다. 상기 '유리화 가설'로 설명되는, 비정질 유리의 형성은 또한 주요 보호 메커니즘이다.

물 치환 및 유리 형성에 부가적으로, 다수의 부형제, 특히 폴리머는 고무(액체성) 상태와 유리질(고체성) 상태 사이의 전이 온도로 정의되는 유리 전이 온도(Tg)를 증가시킴으로써 생물 약제를 안정화시킬 수 있다. 일반적으로, Tg가 높을 수 록, 유리에서 분자 이동성(예, 생물 약제, 안정화 화합물, 산소 및 물의 이동)은 낮아지며, 건조 및 후속적인 보관 중에 보다 안정한 생물 약제 형성이 이루어진다[18, 22]. 건조 중에 생물 약제의 안정화에 포함되며 다당류 및 다른 폴리머에 적용가능한 또 다른 메커니즘은, 건조 중에 생물 약제를 안정화시키는 작은 부형제들의 용질 농축 중에 결정화의 저해이다.

생물 약제 표면 대신에 벌크 환경에 대한 이들의 선호성(앞서 '용질 배제'라 칭하여짐)에 기인하여, 일부 부형제들은 증량제로 작용할 수 있으며, 이는 일부 부형제들이 최종 케이크(final cake)에 대한 기계적 지지를 제공하며, 제품 정밀성을 향상시키며, 건조 중에 제품 붕괴를 억제함을 의미한다. 만니톨 및 글리신은, 이들의 무독성, 고 용해성 및 고 공융 온도 때문에, 종종 증량제로 사용된다[18, 25, 32]. 대부분의 아미노산은 잠재적인 증량제이며, 또한 쉽게 결정화된다[33].

만일 생물 약제가 건조 공정 중에 안정한 경우에, 건조 상태에서 장기 보관이 종종 실현 가능하다. 일반적으로, 건조 공정 자체는 생물 약제에 대부분 유해함에도 불구하고, 건조된 생물 약제는 적절히 제형화되지 않는 경우에 보관 중에 이들의 구조 또는 효능을 여전히 잃을 수 있다. 응집은 보관 중에 생물 약제에 대한 주된 물리적 불안정성이다. 탈아미드화, 산화 및 가수분해와 같은 다른 화학적 분해가 또한 보관 중에 일어날 수 있으나, 이러한 변화는 생물 약제의 활성에 반드시 영향을 주는 것은 아니며, 변형된 잔기(들)의 위치에 따라 달라진다. 글루코즈 및 수크로즈와 같은 환원당은 생물 약제 내의 리신 및 아르기닌 잔기와 반응하여 메일라드 반응(Maillard reaction), 갈변 반응을 통해 탄수화물 부가 생성물을 형성할 수 있으며, 이는 보관 중에 동결-건조된 생물 약제의 현저한 활성 손실을 일으킬 수 있다.

보관 온도는 고체 상태에서 생물 약제의 안정성을 영향을 미치는 가장 중요한 인자 중 하나이다. 장기 보관 안정성에 영향을 미치는 다른 인자는 제형의 유리 전이 온도(Tg), 제형의 pH 및 건조 후 잔류 수분 함량이다. 건조된 제형의 수분 함량은 마개 수분 방출, 비결정 부형제의 결정화 또는 부형제 수화물로부터 수분 방출을 포함하는 여러 인자들에 기인하여 보관 중에 현저히 변할 수 있다. 건조 중에 생물 약제를 안정화하는데 사용되는 부형제는 이들의 양이 제형에 적절히 사용되지 않을 경우에 고체 상태에서 생물 약제를 불안정하게 만들 수 있다. 또한, 결정질 상태는 유리질 상태에 비해 열역학적으로 더 안정하기 때문에, 보관 중에 비결정 부형제의 결정화 위험이 존재한다[39]. 많은 당류 및 폴리올은 결정화되는 경향을 갖지만, 이는 제형 내 이들의 상대적인 양, 보관 온도 및 상대 습도에 의해 강하게 영향을 받는다[18, 40]. 또한, 여러 부형제의 상대적 조성 및 폴리머와 같은 비-결정화 안정화제의 존재는 부형제의 결정화를 억제할 수 있다.

장기 보관 중에 건조 상태에서 생물 약제에 대한 안정화 메커니즘은 비결정질 유리 상태의 형성, 물 치환 및 부형제와 생물 약제 사이의 수소 결합을 포함하여 리오프로텍션(lyoprotection)에 대한 것과 유사하다[41]. 이러한 메커니즘의 조합은 고체 상태에서 최대 생물 약제 안정화를 필요로 한다[18, 42]. 동결 건조된 산물의 최종 품질은 완충제, 증량제 및 안정화제를 포함하는 부형제의 선택 및 동결 건조 공정에 의해 결정된다.

소아마비는 주로 어린 아이들에게 걸리는 고 감염성 질병이다. 폴리오바이러스의 3가지 혈청형(타입 1, 타입 2 또는 타입 3) 중 어느 하나에 의해 야기된 질병은 특정한 치료제를 갖고 있지 않으나, 예방접종을 통해 예방될 수 있다. 현재, 경구용 소아마비 백신(Sabin OPV)은 소아마비의 세계적 박멸에 분투하기 위해 선택된 백신이다. 그러나, 주요 문제는 마비를 일으킬 수 있는 형태, 소위 백신 관련 마비성 소아마비(VAPP)로 전환되는 OPV의 능력이다. 생 약독화 폴리오바이러스의 영구적 사용의 다른 위험은 백신-유래 폴리오바이러스(VDPV)로의 복귀이다[1]. 서양 국가에서, 불활성화 살크(Salk) 소아마비 백신(IPV)의 사용은 VAPP 및 순환 VDPV의 위험을 제거하기 위한 현재의 바람직한 방법이다. IPV는 세계적 박멸 프로그램의 지속을 위해 가장 적절한 것으로 여겨진다[1-3].

세계적인 소아마비 박멸을 달성하기 위해, (향상된) IPV는 효과적이고, 저렴하고, 제조하기에 안전하고, 그리고 투여하기에 용이하여야 한다[4]. 개발도상국에서 현재 IPV의 실행 가능성은 제한되어 있다. 그 이유는 IPV가 OPV에 비해 더 비싸며, 주사를 통해서만 투여되기 때문이다[1, 3, 5]. IPV의 비용을 제한하기 위해, WHO 및 RIVM은 개발도상국들에게 기술 이전을 위한 비영리적인 IPV를 개발하고 있다. 제조 중에 야생형 살크 소아마비 바이러스의 봉쇄는 특히 개발도상국에서 문제가 될 수 있기 때문에, 새로운 백신은 OPV 스트레인, 사빈(Sabin)(sIPV)에 기초할 것이며, 또한 이를 위한 제조 비용은 덜 비싼 것으로 예상된다. 비용을 더 감소시키기 위해, RIVM은 보조제 및/또는 다른 면역화 경로를 이용하여 투여량을 줄이는 것을 나타내는 sIPV 제형을 개발중이다[6].

변형적인 전달 방법 및 향상된 백신 제형은 백신 전달을 보다 용이하고 안전하게 하는 가능성을 갖기 때문에[7, 8], 현재 여러 변형적인 백신 전달 방법이 개발중이다.

다양한 불활성 폴리오 혈청형들 사이에 열 안정성의 차이가 있으며, 타입 1이 가장 취약하다. 어느 보존제의 존재하에서, 타입 1은 4℃에서 2년간 보관 후 서서히 악화되나, 타입 2 및 3는 다년간 효능을 유지한다. D-항원 함량은 24℃에서 20일 후에 현저히 저하되며, 32℃에서 동일한 기간에 노출 후에는 검출이 불가능하다. 이와 대조적으로, 타입 2에 대해서는 이러한 온도에서 D-항원성의 현저한 변화가 없다. 타입 3는 24℃에서 20일간 안정하게 유지되나, 32℃에서 D-항원 함량은 현저히 저하된다[9].

IPV의 세 가지 모든 혈청형은, 2-페녹시-에탄올과 함께 보존되고 알루미늄 히드록시드에 흡착된 DT-폴리오 백신에서 이루어진 관찰에 기초하여, 혼합 백신으로 편입되고 1년 내지 4년 이상 범위의 기간 동안 4℃에서 보관될 경우, 만족스러운 유지를 나타낸다[9, 10]. 보다 긴 보관은 특히 타입 1에 대한 항원성의 감소를 일으켰다[9]. 독립형 백신으로서 IPV는 4℃에서 4년간 그리고 25℃에서 1개월간 안정하다[10]. 37℃에서 1-2일 후에 타입 1의 효능의 현저한 손실이 있으며, 2주 후에 타입 2 및 3의 효능의 현저한 손실이 있다[11, 12]. 또한, 냉동은 IPV의 효능에 부정적인 영향을 주며, 이는 D-항원 구조의 손실과 관련된다[12].

소아마비 박멸 후에, 소아마비 백신의 비축량은 (OPV 중단 후에도) 순환 VDPV에 의해 야기되거나 또는 생물학 무기를 이용한 테러 행위 공격에 의해 야기되는 새로운 소아마비 아웃브레이크의 잠재적 위험을 예측하는데 요구된다[13-15]. 최적의 백신 비축량을 얻기 위해, 다양한 문제가 고려될 필요가 있다. 연장된 만료 시간은 비축 비용을 감소시키기 때문에 저장 수명은 중요한 세부 사항이다[16]. 다년간 백신의 효능을 보장하기 위해, IPV와 같은 백신의 저장 수명은 연장될 필요가 있다. 따라서, 생물 약제의 저장 수명을 연장하는 개선된 제형이 요구되며, 이러한 제형을 바람직하게는 건조 형태로 제조하는 개선된 방법이 요구된다.

제1견지로, 본 발명은 생물 약제, 아미노산, 폴리올, 금속염 및 물을 포함하는 용액을 건조하는 것을 포함하는, 건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 본 발명의 방법에서, 상기 용액은 필수적으로 ml 당 1pg - 10g의 생물 약제, 0.01-20%(w/v)의 아미노산, 0.5-20%(w/v)의 폴리올, 0.005-10%(w/v)의 금속염 및 물로 구성된다. 보다 바람직하게, 아미노산은 글루타메이트, 아르기네이트, 히스티딘, 아스파라긴, 글리신 또는 이의 혼합물이며; 폴리올은 소르비톨, 만니톨, 만노즈, 말티톨 또는 이의 혼합물이며; 그리고 금속염은 Mg⁺⁺, Ca⁺⁺ 또는 Li⁺ 또는 이의 혼합물이며, 여기서 Cl^- 또는 SO₄ ^{2 -} 염 또는 이의 혼합물이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 글루타메이트는 바람직하게 모노소듐 글루타메이트(monosodium glutamate)의 형태로 용액에 용해된다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현에서, 상기 용액은 필수적으로 ml 당 1pg - 10g의 생물 약제, 5-20%(w/v)의 소르비톨, 0.5-20%(w/v)의 모노소듐 글루타메이트, 2-10%(w/v)의 마그네슘염, 바람직하게 MgCl₂ 및/또는 MgSO₄, 및 선택적으로 5-20%(w/v) 만니톨로 구성된다.

본 발명의 방법에서, 상기 용액은 바람직하게 약학적으로 허용되는 버퍼를 포함하며, 중성 pH로 완충된다. 또한, 상기 용액은 진공 건조 또는 동결 건조에 의해 건조되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 상기 생물 약제는 바람직하게 단백질성 물질을 포함하는 제제이다. 보다 바람직하게, 상기 생물 약제는 바이러스, 바람직하게 엔테로바이러스(Enterovirus) 또는 뉴모바이러스(pneumovirus)이다. 보다 바람직하게, 상기 생물 약제는 혈청형 1, 2 및 3의 폴리오바이러스, 바람직하게는 혈청형 1, 2 및 3의 불활성화 폴리오바이러스이거나, 또는 여기서 상기 생물 약제는 인간 또는 소의 RSV이다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현에서, 건조된 제형은, 건조 후 재구성시, 건조 전에 상기 용액에 존재하는 상기 생물 약제의 활성의 적어도 50%를 보유한다. 본 발명의 방법의 또 다른 구현으로, 건조될 용액은 하나 이상의 다른 생물 약제를 포함하며, 그리고 여기서 상기 다른 생물 약제에 대한 활성 손실의 차이는 50%미만이며, 이에 따라 활성의 최고 손실을 갖는 생물 약제의 보유 활성도는 100%로 설정된 최저 손실을 갖는 생물 약제의 보유 활성도의 퍼센트로 표현된다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현에서, 건조된 제형은 45℃에서 적어도 1주일간 보관 후에 재구성시, 건조 전에 상기 용액에 존재하는 상기 생물 약제의 활성의 적어도 50%를 보유한다. 본 발명의 방법의 또 다른 구현으로, 건조된 제형은 하나 이상의 다른 생물 약제를 포함하며, 그리고 여기서 상기 다른 약제에 대한 활성 손실의 차이는 바람직하게 50% 미만이며, 이에 따라 활성의 최고 손실을 갖는 생물 약제의 보유 활성도는 100%로 설정된 최저 손실을 갖는 생물 약제의 보유 활성도의 퍼센트로 표현된다.

제2견지로, 본 발명은 본 발명에 따른 어느 방법으로 획득가능한 생물 약제의 건조된 제형에 관한 것이다.

제3견지로, 본 발명은 약제로서 사용되는 본 발명에 따른 제형에 관한 것으로, 바람직하게는 감염성 질병 또는 종양에 대하여 (개체에서) 면역 반응을 유도하는 약제로서 사용되는 본 발명에 따른 제형에 관한 것이다.

도 1 혈청형 1, 2 및 3 IPV-제형의 동결 건조 직후 D-항원 회수(실험 A). 수크로즈(SUC), 트레할로즈(TREH), 만니톨(MAN), 덱스트란(DEX) 및 소듐 클로라이드(NaCl)의 안정화 효과를 시험하였다.
도 2 10%의 만니톨 및 0% 덱스트란을 함유하는 IPV-제형의 동결 건조 직후 상기 3 혈청타입의 D-항원 회수 퍼센트를 나타내는 반응 표면 플롯.
도 3 혈청형 1, 2 및 3 IPV-제형의 동결 건조 직후 D-항원 회수(실험 B). 수크로즈(SUC), 트레할로즈(TREH), 모노소듐 글루타메이트(MSG), 히드록시에틸 전분(HES) 및 소듐 클로라이드의 안정화 효과를 시험하였다.
도 4 진공 건조(V), 느린 동결 속도를 이용한 동결 건조(L) 및 빠른 동결 속도를 이용한 동결 건조(S) 직후 D-항원 회수. 안정화제를 첨가하지 않은 IPV 백신(음성 대조구)과 비교한 수크로즈 및 트레할로즈의 안정화 효과를 조사하였다.
도 5 표기된 바와 같은 혈청형 1, 2 및 3 IPV-제형의 동결 건조 직후 D-항원 회수(실험 C)
도 6 혈청형 1, 2 및 3 IPV-제형의 동결 건조 직후 D-항원 회수(실험 D). 모든 제형은 5% 소르비톨 및 125mM NaCl을 함유하였으며, 그리고 D11-D16을 제외하고, 5% 펩톤 및 표기된 바와 같이 더 함유하였다.
도 7 표기된 바와 같은 동결 건조 혈청형 1, 2 및 3 IPV-제형의 가속화된 안정성 시험(실험 D)(45℃에서 1주 배양 후 D-항원 회수에 의해 측정됨).
도 8 표기된 바와 같은 혈청형 1, 2 및 3 IPV-제형의 동결 건조 직후 D-항원 회수(실험 E). 소르비톨(SOR), 수크로즈(SUC), 만니톨(MAN), 모노소듐 글루타메이트(MSG), 펩톤(PEP) 및 MgCl₂의 안정화 효과를 빠른 동결 속도(패널 A) 및 느린 동결 속도(패널 B)를 이용하여 시험하였다.
도 9 45℃에서 1주 배양 후 그리고 빠른 동결 속도(패널 A) 및 느린 동결 속도(패널 B)를 이용하여 시험된, 표기된 바와 같은 동결 건조된 혈청형 1, 2 및 3 IPV-제형의 안정성(실험 E). 동결 건조 직후에 가장 유망한 제형들만을 나타내었다.
도 10 혈청형 1, 2 및 3 IPV-제형의 동결 건조 직후 D-항원 회수(실험 F, n=3). 펩톤의 안정화 효과는 10% 소르비톨, 10% MSG 및 5% MgCl₂를 함유하며 10% 만니톨이 첨가되거나 첨가되지 않은 IPV-제형에서 조사되었다. 모든 제형들은 동결 건조 공정의 건조 단계 전에 신속 동결되었다.
도 11 45℃에서 1주 배양 후 동결 건조된 혈청형 1, 2 및 3 IPV-제형의 안정성(실험 F, n=3). 이 실험은 펩톤 또는 단일 아미노산 첨가로 가속화된 안정성을 갖는 동안에, 10% 소르비톨, 10% MSG 및 5% MgCl₂를 함유하며 10% 만니톨이 첨가되거나 첨가되지 않은 IPV-제형을 향상시키는 것이 가능한지 조사한다.
도 12 표기된 바와 같은 다른 버퍼 성분을 함유하는 혈청형 1, 2 및 3 IPV 제형의 동결 건조 직후 D-항원 회수(실험 G). 패널 A, B, C 및 D에 표기된 4 제형들은 모두 10% 소르비톨, 10% MSG를 함유하였으며, 그리고 10mM McIlvaine, 10mM 시트레이트, 10mM 히스티딘, 10mM HEPES 및 10mM 포스페이트 버퍼로 시험되었다. 대조구 제형은 투석되지 않았다.
도 13 표기된 바와 같은 다른 버퍼 성분을 함유한 동결 건조된 혈청형 1, 2 및 3 IPV-제형의 동결 건조 및 45℃에서 1주간 후속적인 보관 후의 안정성(실험 G). 10% 소르비톨, 10% MSG 및 MgCl₂을 함유하며, 만니톨을 함유하지 않거나 함유하며, 펩톤을 함유하기 않거나 함유하는 4가지 제형을 10mM McIlvaine, 10mM 시트레이트, 10mM 히스티딘, 10mM HEPES 및 10mM 포스페이트 버퍼와 함께 시험하였다. 대조구 제형은 투석되지 않았으며, 표기된 바와 같은 부형제들을 함유하는 McIlvaine 버퍼로 희석하였다.
도 14 진공 건조(V), 느린 동결 속도로 동결 건조(L) 및 빠른 동결 속도로 동결 건조(S) 직후에 D-항원 회수. 여러 가지 제형의 안정화 효과를 안정화제를 첨가하지 않은 IPV 백신(음성 대조구) 및 수크로즈 또는 트레할로즈 제형화된 IPV와 비교하였다.
도 15 표기된 바와 같은 혈청형 1, 2 및 3 IPV-제형의 동결 건조 직후 D-항원 회수.
도 16 동결 건조 및 45℃에서 1주간 후속적인 보관 후 표기된 바와 같은 혈청형 1, 2 및 3의 안정성(D-항원 회수율로 측정됨).

제1견지로, 본 발명은 생물 약제의 건조된 제형을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 적어도 2가지의 향상: 1) 제형의 건조시 (그리고 바람직하게는 건조된 제형의 후속적인 재구성시) 생물 약제의 활성도 손실 최소화; 및 2) 안정성, 즉, 생물 약제의 건조된 제형의 저장 수명의 증가, 즉, 건조된 제형의 보관시 생물 약제의 활성도 손실 최소화를 달성하는데 목적이 있다. 상기 방법은 바람직하게 생물 약제; 및 아미노산, 폴리올 및 금속염 중 하나 이상을 포함하는 수용액을 건조하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법에서, 건조될 용액은 a) 본 명세서에 하기에 지정되고 그리고 본 명세서에 하기에 명시된 농도의 생물 약제; b) 본 명세서에 하기에 지정되고 그리고 본 명세서에 하기에 명시된 농도의 아미노산; c) 본 명세서에 하기에 지정되고 그리고 본 명세서에 하기에 명시된 농도의 폴리올; d) 본 명세서에 하기에 지정되고 그리고 본 명세서에 하기에 명시된 농도의 금속염; e) 물; 선택적으로, f) 본 명세서에 하기에 지정되고, 본 명세서에 하기에 명시된 농도로 그리고 본 명세서에 하기에 명시된 pH의 버퍼; 및 선택적으로, g) 본 명세서에 하기에 지정되고 그리고 본 명세서에 하기에 명시된 농도의 추가 성분들을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다.

생물 약제

"생물 약제(biopharmaceutical agent)"는 본 명세서에서, 포유류에 적용시, 특히 인간 환자에 적용시, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 형태로 적용시, 생리학적으로 활성적인, 생물학적 제제를 칭한다. 생물학적 제제는 바람직하게 세포에 의해 생성되거나 또는 세포로부터 획득가능한 제제이나, 세포로부터 획득가능한 제제의 합성 복제물 및 세포로부터 획득가능한 화학적으로 변형된 제제가 상기 용어 생물학적 제제에 포함된다. 생물학적 제제는 단백질계 제제, 즉 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드와 같은 단백질성 물질을 포함하는 제제일 수 있다. 생물학적 제제는 예를 들어, DNA, RNA 또는 핵산 유사체와 같은 핵산을 더 포함하거나 또는 이로 구성될 수 있다.

바람직한 생물 약제는 바이러스 또는 비리온이며, 바람직하게는 포유류에 감염되는 바이러스, 바람직하게는 인간에 감염되는 바이러스이다. 바이러스는 엔벨로프 바이러스일 수 있으나, 바람직하게는 논-엔벨로프 바이러스이다. 본 명세서에 사용된 용어 '바이러스'는 이들이 자연적으로 발생하는 와일드 타입 바이러스(예, 자연적 분리물)뿐만 아니라, '인공(man-made)' 약독화, 돌연변이 및 결함 바이러스를 포함한다. 또한, 용어 '바이러스'는 재조합 바이러스, 즉, 예를 들어 하나 이상의 바이러스 유전자(의 일부)가 결핍된 결함 바이러스 및 바이러스 게놈의 일부가 하나 이상의 관심있는 유전자(들)로 대체된 유전자 치료 벡터와 같이 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작된 바이러스를 포함한다. 바람직한 바이러스는 피코르나바이러스(Picornavirus), 보다 바람직하게 폴리오바이러스, 코삭키바이러스(Coxsackievirus), 에코바이러스(echovirus) 및 리노바이러스(rhinovirus)와 같은 엔테로바이러스(Enterovirus)이다. 가장 바람직하게, 바이러스는 폴리오바이러스이다. 폴리오바이러스는 약독화된 폴리오바이러스일 수 있으나, 바람직하게는 불활성화된 폴리오바이러스(IPV)이다. 폴리오바이러스는 또한 불활성화 약독화된 폴리오바이러스일 수 있다. 생물 약제는 폴리오 바이러스 혈청형 1, 2 및 3 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 바람직하게 상기 생물 약제는 3가지 모든 폴리오 바이러스 혈청형 1, 2 및 3을 포함한다. 혈청형 1 폴리오바이러스의 적절한 스트레인은 이에 한정하는 것은 아니나, Sabin 1, Mahoney, Brunhilde, CHAT 및 Cox 스트레인 중 하나 이상을 포함한다. 혈청형 2 폴리오바이러스의 적절한 스트레인은 이에 한정하는 것은 아니나, Sabin 2, MEF-1 및 Lansing 스트레인 중 하나 이상을 포함한다. 혈청형 3 폴리오바이러스의 적절한 스트레인은 이에 한정하는 것은 아니나, Sabin 3, Saukett H 및 G, 및 Leon 스트레인 중 하나 이상을 포함한다. 바람직한 구현으로, 생물 약제는 예를 들어 타입 1에 대해 불활성화 폴리오 바이러스 Mahoney 스트레인, 타입 2에 대해 불활성화 폴리오 바이러스 MEF-1 스트레인 및 타입 3에 대해 불활성화 폴리오 바이러스 Saukett 스트레인을 함유하는 Salk-IPV, 또는 불활성화 폴리오 바이러스 Sabin-1, -2 및 -3 스트레인을 함유하는 sIPV와 같은 3가 불활성화 폴리오 백신이다. 백신에 안전한 사용을 위해 폴리오 바이러스 스트레인을 불활성화하는 방법은 이 기술분야에 잘 알려져 있으며, 그리고 예를 들어 포르말린 또는 베타-프로피오락톤을 이용한 불활성화를 포함한다(참조 예, Jonges et al., 2010, J. Clin. Microbiol. 48:928-940).

또 다른 구현으로, 생물 약제는 뉴모바이러스의 바이러스 또는 비리온이다. 뉴모바이러스는 바람직하게 호흡기 세포융합 바이러스(RSV, Respiratory Syncytial Virus), 보다 바람직하게 인간 또는 소 RSV이다. 인간 RSV는 서브그룹 A 또는 B 바이러스일 수 있으며, 바람직하게는 임상적 분리주이며, 보다 바람직하게는 시험관내에서 광범위하게 패시지되지(바람직하게는 10, 8, 6 또는 5회 미만) 않은 분리주이다. 바람직하게 (인간 또는 소) RSV 바이러스는 WO 2005/061698호 및 Widjojoatmodjo et al. (2010, Virol. J., 7:114)에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 이의 바이러스 게놈내에 돌연변이를 가져 그 바이러스 게놈은 RSV ΔG 및 RSV ΔG+G 비리온과 같은 기능적 G 부착 단백질을 암호화하지 않는, 결실되거나 불활성화된 G 부착 단백질 유전자를 갖는 바이러스 게놈을 포함하는 바이러스이다.

생물 약제는 바람직하게 건조될 용액에 ml 당 1 x 10⁰ 내지 1 x 10²⁵ 생 및/또는 사 또는 불활성화 파티클 범위의 양으로 존재한다. 생 파티클의 수는 예를 들어, 플라크 포밍 유니트 세포 배양 또는 조직 배양 50% 감염 도즈(CCID₅₀ 또는 TCID₅₀) 및 제제의 타이터를 측정하게에 적절한 다른 바이러스학적 어세이에 의해 검출될 수 있다. 사 또는 불활성화 파티클의 수는 예를 들어, 단백질 어세이와 같은 항원의 양을 정량하는 어세이, 또는 혈구응집 유니트 또는 폴리오 D-항원 유니트를 검출하는 어세이를 이용하여 검출될 수 있다. 바람직하게 생물 약제는 상기 용액에 ml 당 적어도 1 x 10¹, 1 x 10², 1 x 10³, 1 x 10³, 1 x 10⁴, 1 x 10⁵, 1 x 10⁶, 1 x 10⁷, 1 x 10⁸, 1 x 10⁹ 또는 1 x 10¹⁰ 생 및/또는 사 또는 불활성화 파티클 및/또는 ml 당 최고 1 x 10²⁴, 1 x 10²³, 1 x 10²², 1 x 10²¹, 1 x 10²⁰, 1 x 10¹⁹, 1 x 10¹⁸, 1 x 10¹⁷, 1 x 10¹⁶, 1 x 10¹⁵ 또는 1 x 10¹⁴ 생 및/또는 사 또는 불활성화 파티클의 양으로 존재한다.

건조될 용액에서 생물 약제의 양은 또한 용액의 ml 당 생물 약제의 중량으로 표현될 수 있다. 바람직하게, 생물 약제는 1pg/ml 내지 10g/ml 범위의 중량/ml로 존재한다. 보다 바람직하게, 생물 약제는 용액에 적어도 10^-11, 10^-10, 10^-9, 10^-8, 10^-7, 10^-6, 10^-5, 10^-4 g/ml 의 양으로 그리고/또는 최고 10^-3, 10^-2, 10^-1, 또는 10⁰ g/ml의 양으로 존재한다. 용액에서 생물 약제의 중량은 예를 들어, 단백질 어세이를 포함하는 당해 기술분야에 알려진 수단에 의해 검출될 수 있다. 이에 따라 생물 약제의 상기 언급된 중량은 또한, 적절한 단백질 어세이에서 검출될 ml 당 그람 단백질로 표현될 수 있다(예, Bradford assay; Zor and Selinger,1996, Anal. Biochem. 236: 302-308).

생물 약제가 폴리오바이러스인 바람직한 구현에서, 용액내에 폴리오바이러스의 양은 적어도 0.01, 0.1, 1.0 또는 10 DU/ml 이며, 그리고 최고 10,000, 1,000 또는 100 DU/ml이며, 여기서 1 DU는 Westdijk 등[6]에 의해 기재된 바와 같이 정의되고 QC-ELISA로 검출된다. 생물 약제가 다가 폴리오바이러스(백신)를 포함하는 구현에서, 각 폴리오 바이러스 혈청형은 적어도 0.01, 0.1, 1.0 또는 10 DU/ml 내지 최고 10,000, 1,000 또는 100 DU/ml의 양으로 존재하는 것으로 이해된다.

생물 약제가 RSV인 바람직한 구현으로, 용액내의 RSV의 양은 적어도 1 x 10¹, 1 x 10², 1 x 10³, 1 x 10³, 1 x 10⁴ TCID₅₀/ml이며, 그리고 최고 1 x 10²⁵, 1 x 10²⁰, 1 x 10¹⁵, 1 x 10¹², 1 x 10¹⁰ 또는 1 x 10⁹ TCID₅₀/ml이며, RSV에 대한 TCID₅₀은 Widjojoatmodjo 등(2010, Virol. J., 7:114)에 의해 기재된 바와 같이 정의되고 검출된다.

아미노산

건조될 용액내의 아미노산은 약학적으로 허용되는 어느 D- 또는 L-아미노산일 수 있다. 이러한 아미노산은 20 표준 '프로테이노제닉(proteinogenic)' 또는 '천연' 아미노산(히스티딘, 알라닌, 이소루신, 아르기닌, 루신, 아스파라긴, 리신, 아스파트산, 메티오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 글루타민, 트립토판, 글리신, 발린, 프롤린, 티로신 및 세린)뿐만 아니라, 예를 들어 오르니틴, 시트룰린, 셀레노시스테인, 타우린 및 피롤리신과 같은 비-천연 아미노산을 포함한다. 바람직하게, 건조될 용액내의 아미노산은 글루타메이트, 글루타민, 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴, 리신, 루신 및 글리신 중 하나 이상이며, 보다 바람직하게 글루타메이트, 아르기닌 및 히스티딘 중 하나 이상이다. 이에 따라, 건조될 용액은 아미노산들의 혼합물을 포함할 수 있다. 건조될 용액내의 아미노산(들)은 광학 D- 또는 L-이성질체 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 바람직하게 상기 아미노산(들)은 L-이성질체이다.

바람직한 구현으로, 건조될 용액내의 아미노산은 L-글루타메이트, L-아르기닌 및 L-히스티딘 중 하나 이상이다. 또한, L-글루타메이트는 Na-글루타메이트, 펩톤, 비동물 펩톤, 식물성 펩톤의 형태일 수 있다. 또한, L-아르기닌은 폴리-L-아르기닌, 펩톤, 비동물 펩톤, 식물성 펩톤의 형태일 수 있다. 또한, L-히스티딘은 Na-히스티딘의 형태일 수 있다. 또한, L-리신은 폴리-L-리신의 형태일 수 있다.

특히 바람직한 구현으로, 건조될 용액내의 아미노산은 글루타메이트를 포함한다. 글루타메이트는 소듐 글루타메이트, 포타슘 글루타메이트, 암모늄 글루타메이트, 칼슘 디글루타메이트, 마그네슘 디글루타메이트 및 글루탐산 중 하나 이상일 수 있다. 보다 바람직하게, 글루타메이트는 모노소듐 글루타메이트(MSG)의 형태로 용액에 용해된다.

아미노산(들)은 바람직하게 건조될 용액에 0.01-20%(w/v)(즉, 용액의 체적 당 중량 퍼센트)의 범위내 농도로 존재한다. 따라서, 바람직하게, 아미노산(들)은 건조될 용액에 적어도 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 8.0, 9.0 또는 9.5%(w/v), 또는 그 이상의 농도로 존재하며, 그리고/또는 아미노산(들)은 건조될 용액에 20.0, 17.5, 15.0, 12.5, 11.0 또는 10.5%(w/v) 이하 또는 미만의 농도로 존재한다. 가장 바람직하게 아미노산(들)은 약 10%(w/v)의 농도로 건조될 용액에 존재한다.

폴리올

건조될 용액에서 폴리올은 바람직하게 당 또는 당 알코올이다. 바람직한 당은 수크로즈, 트레할로즈, 만노즈 및 덱스트란을 포함한다. 바람직한 당 알코올은 소르비톨, 만니톨 및 말티톨을 포함한다. 바람직하게, 건조될 용액은 소르비톨, 만노즈, 만니톨 및 말티톨 중 적어도 하나 이상, 보다 바람직하게는 소르비톨, 만노즈 및 만니톨 중 적어도 하나 이상, 보다 바람직하게는 소르비톨 및 만니톨 중 적어도 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 가장 바람직하게, 건조될 용액은 폴리올로서 적어도 소르비톨을 포함하며, 선택적으로 만니톨과 함께 소르비톨을 포함한다.

일 구현으로, 폴리올(들)은 바람직하게 건조될 용액에 0.1-20%(w/v)(즉, 용액의 체적 당 중량 퍼센트)의 범위내 농도로 존재한다. 따라서, 바람직하게, 폴리올(들)은 건조될 용액에 적어도 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 8.0, 9.0 또는 9.5%(w/v), 또는 그 이상의 농도로 존재하며, 그리고/또는 폴리올(들)은 건조될 용액에 20.0, 17.5, 15.0, 12.5, 11.0 또는 10.5%(w/v) 이하 또는 미만의 농도로 존재한다. 가장 바람직하게 이러한 구현에서 폴리올(들)은 약 10%(w/v)의 농도로 건조될 용액에 존재한다. 이러한 구현에서 농도는 예를 들어, 소르비톨이 폴리올로서 사용되는 경우에 적절하다.

또 다른 구현으로, 폴리올(들)은 바람직하게 0.1-40%(w/v)(즉, 용액의 체적 당 중량 퍼센트)의 범위내 농도로 건조될 용액에 존재한다. 따라서, 바람직하게, 폴리올(들)은 건조될 용액에 적어도 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 12.5, 15.0, 18.0, 19.0 또는 19.5%(w/v), 또는 그 이상의 농도로 존재하며, 그리고/또는 폴리올(들)은 건조될 용액에 50.0, 40.0, 35.0, 30.0, 25.0, 22.5, 21.0 또는 20.5%(w/v) 이하 또는 미만의 농도로 존재한다. 가장 바람직하게 이러한 구현에서 폴리올(들)은 약 40%(w/v)의 농도로 건조될 용액에 존재한다. 이러한 구현에서 농도는 예를 들어, 소르비톨 및 만니톨과 같이 두 가지 다른 폴리올이 사용되는 경우에 적절하다. 이러한 경우에, 두 폴리올 사이의 중량비는 예를 들어, 1:50, 1:20, 1:10, 1:5 및 1:2를 포함하는 1:100 내지 1:1 범위일 수 있다.

금속염

건조될 용액에 용해되는 금속염은 이가 또는 일가 금속 양이온의 어느 약학적으로 허용되는 염일 수 있다. 바람직한 이가 양이온은 Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ 및 Zn⁺⁺이며, 이 중에서 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺가 보다 바람직하며, 이 중에서 Mg⁺⁺가 가장 바람직하다. 바람직한 일가 양이온은 Li⁺, Na⁺ 및 K⁺이며, 이 중에서 Li⁺, Na⁺가 보다 바람직하며, 이 중에서 Li⁺가 가장 바람직하다. 금속염에서 상대 음이온(counter-anion)은 바람직하게 아미노산이 아니며, 바람직하게 글루타메이트 또는 아스파테이트가 아니다. 보다 바람직하게, 금속염에서 상대 음이온은 무기 음이온이다. 바람직한 (무기) 음이온성 반대이온은 Cl^-, SO₄ ^{2 -} 및 CO₃ ^{2 -}이며, 이 중에서 Cl^- 및 SO₄ ^{2 -}가 보다 바람직하며, 이 중에서 Cl^-가 가장 바람직하다. 상기 용액은 상기 금속염들 중 하나 이상의 혼합물을 포함할 수 있다.

금속염(들)은 바람직하게 0.005-10%(w/v)(즉, 용액의 체적 당 중량 퍼센트)의 범위내 농도로 건조될 용액에 존재한다. 따라서, 바람직하게, 금속염(들)은 건조될 용액에 적어도 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 또는 4.5%(w/v) 또는 그 이상의 농도로 존재하며, 그리고/또는 금속염(들)은 10.0, 8.0, 7.0, 6.0, 또는 5.5%(w/v) 이하 또는 미만의 농도로 건조될 용액에 존재한다. 가장 바람직하게 금속염(들)은 약 5%(w/v)의 농도로 건조될 용액에 존재한다.

건조될 용액내에 아미노산이 예를 들어, MSG와 같은 아미노산의 금속염 형태로 용해되는 경우에, 아미노산 금속염은 금속염(들)의 중량 퍼센트에 포함되지 않으나, 아미노산(들)의 중량 퍼센트에 포함되며, 이에 따라 금속 상대 양이온의 중량은 아미노산의 중량에 포함되는 것으로 이해된다.

버퍼

건조될 용액은 바람직하게, 6.0-8.0 또는 6.5-7.5 범위의 pH 또는 약 7.0의 pH와 같이 중성 pH를 갖는다. 건조될 용액은 바람직하게 pH를 상기 나타낸 값으로 유지하기 위한 버퍼를 포함한다. 원칙적으로, 어느 약학적으로 허용되는 버퍼, 바람직하게는 상기 나타낸 pH 값의 범위내에서 효과적인 완충 능력을 갖는 버퍼가 건조될 용액에 사용될 수 있다. 상기 버퍼는 바람직하게 0.5-100mM의 범위, 보다 바람직하게 1-50mM의 범위, 그리고 가장 바람직하게 약 10mM과 같은 2-20mM의 범위의 농도로 존재한다.

건조될 용액에 사용하기에 적절한 버퍼는 McIlvaine 버퍼(참조 실시예), 시트레이트 버퍼, 포스페이트 버퍼, HEPES 버퍼 및 히스티딘 버퍼를 포함한다.

물

건조될 용액을 제조하는데 사용되는 물은 바람직하게 초순수 물이며, 바람직하게는 주사용 물과 같은 피로겐-프리 물이다.

본 발명의 건조될 용액에서 성분들(예, 부형제들)의 농도는 일반적으로 본 명세서에서 용액의 체적당 중량 퍼센트(w/v)로 표현된다. 이는 용질(예, 부형제) 대 용매의 관계를 총 용액의 리터당 용질의 그람으로 표현한 것으로 이해된다. 예를 들어, 1L의 용액에서 50g의 글루코즈는 5% w/v 용액으로 간주된다.

바람직한 구현으로, 건조될 용액은 본 명세서에서 상기 정의한 바와 같은 양으로 생물 약제, 5-20% (w/v) 소르비톨, 5-20% (w/v) 모노소듐 글루타메이트, 2-10%(w/v)의 마그네슘염, 바람직하게 MgCl₂, 및/또는 MgSO₄, 선택적으로 5-20%(w/v) 만니톨, 그리고 선택적으로 본 명세서에 나타낸 바와 같이 중성 pH에서 상기 용액을 완충하는 2-50mM의 약학적으로 허용되는 버퍼로 필수적으로 구성된다.

건조

본 발명의 방법에서, 생물 약제를 포함하는 수용액은 건조된다. 어느 알려진 건조 방법이 사용될 수 있다. 건조 방법은 예를 들어, 분무 건조, 공기 건조, 코팅, 포옴-건조, 데시케이션(desiccation), 진공 건조, 진공/동결 건조 또는 동결 건조일 수 있으며, 이들은 모두 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 구현으로, 건조 방법은 진공 건조 또는 동결 건조이며, 이 중에서 동결 건조 또는 냉동 건조가 보다 바람직하다.

동결 건조 공정의 일 구현으로, 건조될 용액은 바람직하게 우선 -50℃, -40℃, -30℃, -20℃ 또는 -10℃ 이하의 초기 동결 건조 또는 보존 온도로 냉동된다. 바람직한 초기 보존 온도는 -50℃ 또는 -40℃ 이하이다. 건조될 용액은 상기한 바와 같은 초기 보존 온도를 갖는 보존으로 상기 용액(을 포함하는 용기/바이얼)을 즉시 배치함으로써 일차 냉동될 수 있다. 변형적으로, 건조될 용액은 예를 들어 2, 4 또는 6℃와 같이 0℃ 이상의 온도를 갖는 보존으로 상기 용액(을 포함하는 용기/바이얼)을 배치한 다음, 온도를 저하시킴으로써, 바람직하게는 분당 약 0.5, 1 또는 2℃의 속도로 온도를 저하시킴으로써 상기 용액을 상기한 바와 같은 초기 동결 건조 온도로 서서히 냉동시킴으로써 서서히 냉동될 수 있다. 건조될 용액은 100마이크로바 이하의 압력으로 제공될 수 있다. 설정 압력에 도달하면, 보존 온도는 보다 더 높은 온도로 증가될 수 있다. 보존 온도는 예를 들어, 분당 0.5, 1 또는 2℃의 속도로 초기 동결 건조 온도보다 5, 10 또는 15℃ 높은 온도로 증가될 수 있다. 일차 건조 단계는 바람직하게, 챔버에서 압력 증가가 측정되지 않을 경우에 종결된다. 바람직하게, 이 순간에 보존 온도는 예를 들어, 분당 0.01, 0.02 또는 0.05℃의 속도로 예를 들어, 5, 10, 15, 20 또는 25℃로 증가될 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 단계에서 이와 같이 증가될 수 있다. 2차 건조 단계 중에, 온도는 바람직하게 압력 증가가 검출되지 않을 때까지 그 값으로 유지된다. 바람직한 동결 건조 공정은 본 명세서에서 실시예에 기재된다.

진공-건조 공정의 일 구현으로, 건조될 용액은 바람직하게, 실온과 같은 약 5-25℃ 범위의 온도로 또는 보다 바람직하게는 약 15℃와 같은 약 10-20℃ 범위의 온도로 존재한다. 그 다음, 압력은 1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.05mbar 미만의 압력으로 감소된다. 용액의 동결을 억제하기위해, 감소된 압력하에서 건조될 용액의 온도는 0℃ 이하이지만 상기 용액의 공융 온도 이상인 온도로 감소될 수 있다. 챔버에서 압력 상승이 측정되지 않을 경우에, 용액의 온도는 예를 들어, 분당 0.01, 0.02 또는 0.05℃의 속도로, 예를 들어, 5, 10, 15, 20 또는 25℃로 증가될 수 있으며, 선택적으로 하나 이상의 단계에서 이와 같이 증가될 수 있다. 온도는 바람직하게 압력 증가가 검출되지 않을 때까지 그 값으로 유지된다. 바람직한 진공 건조 공정은 본 명세서에서 실시예에 기재된다.

제2견지로, 본 발명은 상기한 바와 같은 본 발명에 따른 방법으로 획득가능하거나 획득되는 생물 약제의 건조 또는 건조된 제형에 관한 것이다.

생물 약제의 건조된 제형을 제조하기 위한 본 발명의 방법은 바람직하게, 제형의 건조시 생물 약제의 활성의 손실을 최소화하는 것을 목적으로 한다. 바람직하게, 본 발명의 방법뿐만 아니라 제형 자체 또한, 본 발명의 방법으로 획득가능한 건조된 제형의 후속적인 보관시 생물 약제의 활성의 손실을 최소화하는 것을 목적으로 한다. 이에 따라, 본 발명의 방법은 바람직하게, 생물 약제의 안정한 제형, 즉, 바람직하게는 냉장 조건(예, 2-10℃)하에서, 실온(예, 18-25℃)에서, 또는 열대 지방에서 발생할 수 있는 상승된 온도(예, 32-45℃)에서도 장기 또는 연장된 저장 수명을 갖는 제형을 제조하는 방법이다.

생물 약제의 활성의 손실 또는 불활성화는 화학적 경로(산화, 가수분해 또는 효소 작용)뿐만 아니라, 물리적 경로(변성, 응집, 겔화)에 기인한 활성 손실 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 바람직하게, 생물 약제의 활성 손실은 허용 수준을 초과하지 않는다. 즉, 건조 및/또는 후속적인 보관 후에, 적어도 그 생물 약제의 의도된 상업적 치료 및/또는 진단 적용에 충분한 생물학적 활성 또는 생존활성의 수준 및/또는 본래 기능 또는 구조의 수준이 유지된다.

생물 약제의 특성에 따라 달라지나, 통상의 기술자는 생물 약제의 활성을 평가하는데 어떠한 어세이가 사용되는지 알 것이다. 생물 약제의 활성은, 예를 들어, 활성 생 바이러스의 경우에서와 같이 이의 생존활성으로 표현되거나, 또는 활성은 통상의 기술자에게 알려진 적절한 어세이로 측정될 수 있는 효소적 활성 또는 생물학적 활성으로 표현될 수 있다. 다른 예로, 생물 약제의 활성은 생물 약제의 물리적 및 화학적 무결성과 관련될 수 있으며, 생물 약제의 구조 및/또는 기능을 평가함으로써 검출될 수 있다. 항원 구조는 바람직하게 ELISA 또는 Biacor 분석에 의해 평가된다. 2차 및 3차 구조는 바람직하게 UV-, 형광, 푸리에 변환 적외선(FTIR, Fourier Transformed Infra Red) 및/또는 원편광 2색성(Circular Dichroism) 분광학에 의해 평가된다. 면역원성은 바람직하게 동물 모델(예, 쥐, 래트, 코튼 래트, 페럿 또는 토끼)을 이용한 생체내 시험 분석에 의해 평가된다. 토끼가 예를 들어, 폴리오 바이러스에 바람직한 모델이며, 코튼 래트가 RSV에 바람직한 모델이다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현으로, (건조될) 용액의 건조는 건조 후 재수화시(바람직하게는 즉시) 건조된 제형이 건조 전에 용액에 존재하는 생물학적 활성의 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95%를 보유하도록 한다. 하나 이상의 생물 약제가 제형에 존재하는 경우에, 다른 생물 약제에 대한 활성의 손실 차이는 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 미만이며, 이에 따라 활성의 최고 손실을 갖는 생물 약제의 보유 활성도는 100%로 설정된 최저 손실을 갖는 생물 약제의 보유 활성도의 퍼센트로 표현된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현으로, 건조된 제형은 45℃에서 적어도 1주일간 보관 후 및 건조된 제형의 재수화시에, 건조 건에 용액에 존재하는 생물학적 활성의 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95%를 보유한다. 하나 이상의 생물 약제가 제형에 존재하는 경우에, 다른 생물 약제에 대한 활성의 손실 차이는 바람직하게 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 미만이며, 이에 따라 활성의 최고 손실을 갖는 생물 약제의 보유 활성도는 100%로 설정된 최저 손실을 갖는 생물 약제의 보유 활성도의 퍼센트로 표현된다. 바람직하게, 또한, 37℃ 또는 45℃에서 보관 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주 또는 그 이상 후에 상기한 바와 같이 보관 후에 보유된 활성의 퍼센트를 나타낸다.

제3견지로, 본 발명은, 약제로서 사용되는 것으로 본 명세서에서 상술한 바와 같은 본 발명에 따른 방법으로 획득가능하거나 획득되는 생물 약제의 제형에 관한 것이다. 약제로서 사용하기 위해, 제형은 건조된 제형으로 사용되거나 또는 예를 들어, 상기한 바와 같이 물을 사용하여 건조된 제형을 용해함으로써 재구성될 수 있다. 제형은 바람직하게, 이의 본래 체적, 즉, 건조 전 체적으로 재구성된다. 바람직하게, 제형은 감염성 질병 또는 종양에 대하여 (개체에서) 면역 반응을 유도하기 위한 제형이다. 본 발명의 제형이 투여되는 개체 또는 대상은 인간일 수 있으나, 또한 예를 들어, 포유류, 새, 가축, 가금류, 캐틀, 소를 포함하는 사육동물 또는 애완동물과 같은 동물일 수 있다. 보다 바람직하게, 제형은 감염성 질병 또는 종양에 대한 예방접종을 위한 제형이다. 이에 따라, 제형은 바람직하게 감염성 질병 또는 종양의 예방 또는 치료를 위한 제형이다. 또 다른 구현으로, 본 발명은 본 명세서에 상술한 바와 같은 본 발명의 방법에 따라 획득가능하거나 또는 획득되는 제형을 면역 반응을 유도하는 약제의 제조용, 감염성 질병 또는 종양에 대한 예방접종용 및/또는 감염성 질병 또는 종양의 예방 또는 치료용으로 사용하는 용도에 관한 것이다. 또 다른 구현으로, 본 발명은 감염원 또는 종양에 대한 면역반응의 유도가 요구되는 대상에게 유효량의 제형을 투여함으로써 감염원 또는 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 면역 반응은 바람직하게 생물 약제 내의 항원에 대해 유도된다. 항원은 바람직하게 감염성 질병을 일으키는 병원체의 항원 또는 종양의 항원, 또는 상기 병원체 또는 상기 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 항원이다. 병원체는 바람직하게 본 명세서에서 상기 정의된 바와 같은 바이러스이다. 본 발명의 제형은 비강내, 비경구, 근육내, 피하 및/또는 경피 경로를 통해 재구성하거나 또는 재구성하지 않고 투여될 수 있다.

본 명세서 및 청구범위에서, 동사 "포함하다" 및 이의 동사활용형은 그 문자에 후속하는 아이템이 포함되나, 특별히 언급되지 않은 아이템이 배제되지 않는 것을 의미하는 비한정적 견지로 사용된다. 또한, 부정관사 "하나의(a 또는 an)"로 수식되는 구성 요소에 대한 언급은 정황상 분명히 하나가 존재하거나 단지 하나의 구성 요소가 존재하는 것이 요구되는 경우를 제외하고, 하나 이상의 구성 요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다. 부정관사 "하나의(a 또는 an)"는 따라서 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.

본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌참조는 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.

하기 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 어느 방식으로 한정하려는 의도는 아니다.

실시예

1. 재료 및 방법

1.1 재료

불활성화된, 타입 1에 대한 Mahoney 스트레인, 타입 2에 대한 MEF 및 타입 3에 대한 Saukett를 함유하는 3가 불활성화 폴리오 백신(Salk-IPV)을 RIVM-Vaccinology의 프로세스 개발부(Bilthoven, Netherlands)로부터 획득하였다. Salk-IPV 3가 벌크(10x)를 10배 농축 40-8-32 DU/단일 인간 투여량(1ml)으로 제형화하였다. 본 시험에 사용된 IPV 05-126B 벌크의 농도는 Westdijk 등[6]에 의해 기술된 QC-ELISA를 이용하여 411-90-314 DU에서 측정하였다.

부형제들 수크로즈, D-소르비톨, D-트레할로즈 디하이드레이트, D-글루코즈 모노하이드레이트, 만니톨, L-글루타믹 모노소듐염 모노하이드레이트(본 명세서에서 글루타메이트, 소듐 글루타메이트, 모노소듐 글루타메이트 또는 MSG라 칭함), 미오-이노시톨, D-라피노즈, 히드록시 에틸 전분, 글리신, L-프롤린, L-루신, 칼슘클로라이드 디하이드레이트, 말티톨, 마그네슘클로라이드 헥사하이드레이트, 리튬 클로라이드 및 오발부민을 Sigma(St. Louis, MO)로부터 모두 구입하였다. 펩톤(식물성), 덱스트란(6kDa, Leuconostoc ssp), L--히스티딘, L-알라닌, 아연 클로라이드, 칼슘 락토비오네이트 모노하이드레이트를 Fluka(Buchs, Switzerland)로부터 구입하였다. 락티톨(Lacty®-M)을 Purac Biochem(Gorinchem, Netherlands), L-아르기닌(EP, 비동물성 기원) 및 Tween80을 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구입하였으며, 폴리비닐피롤리돈 25(PVP, 29kDa)를 Serva Feinbiochemica GmbH(Heidelberg, Germany)에서 구입하였으며, Sol-U-Pro, 가수분해 포신 젤라틴을 Dynagel Inc.(Calumet City, IL)로부터 구입하였으며, 그리고 피콜(Ficoll)을 Pharmacia(Uppsala, Sweden)으로부터 구입하였다. 버퍼 성분으로서, Merck로부터 구입한 소듐 디하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트(NaH₂PO4), 소듐 클로라이드(NaCl), 포타슘 디하이드로겐 포스페이트(KH₂PO₄) 및 EDTA를 사용하였다. 트리소듐 시트레이트 디하이드레이트, 시트르산 및 HEPES를 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구입하였으며, 그리고 디소듐 하이드로겐 포스페이트 디하이드레이트(Na₂HPO₄)를 Fluka(Buchs, Switzerland)로부터 구입하였다. 모든 부형제들은 시약 품질 또는 더 높은 등급의 것으로 사용하였다.

10mM McIlvaine 버퍼를 제조하기 위해, 1:6의 비로 10mM 시트르산을 10mM Na₂HPO₄에 첨가하고 pH 값을 7.0으로 조절하였다. 10mM 시트레이트 버퍼를 위해, 성분 트리소듐시트레이트 디하이드레이트(10mM) 및 시트르산(10mM)을 pH 7.0에 이를 때까지 함께 혼합하였다. pH 7.0의 10mM 포스페이트 버퍼는 10mM KH₂PO₄ 및 10mM Na₂HPO₄로 구성되었다. 10mM HEPES 및 10mM 히스티딘 버퍼를 상기 버퍼 성분들의 무게를 달고 용해한 다음에 HCl 및/또는 NaOH를 이용하여 pH 값 7.0으로 조절하여 제조하였다.

1.2 방법

1.2.1 투석

달리 표기하지 않는 한, 3가 IPV 벌크 물질을 10kDa 분자량 컷-오프, 저-바인딩 재생 셀룰로즈 멤브레인 투석 카세트(Slide-A-Lyzer®, Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL)를 사용하여 10mM McIlvaine 버퍼(pH 7.0)에 대해 투석하여 IPV 벌크의 버퍼 성분(M199 배지)을 대체하였다.

1.2.2 건조될 용액

모든 부형제들은 표기된 최종 농도의 2배 농도로 McIlvaine 버퍼에 용해되었다. 투석된 IPV를 시험될 제형과 동등하게 혼합하였다. 후속적으로 2ml 유리 주입 바이얼(Muller + Muller, Holzminden, Germany)을 0.2ml의 IPV-부형제 혼합물로 채우고, 13mm 사전 건조된(90℃에서 오버나이트) 러버 스토퍼(타입 V9250, Helvoet Pharma, Alken, Belgium)가 함께 제공되었다.

1.2.3 동결 건조 및 진공 건조 공정

동결 건조를 위해, 충진되고 반이 닫힌 바이얼을 -50℃의 보존 온도(빠른 동결) 또는 4℃의 보존 온도에서 1℃/분의 속도로 온도를 저하시켜 -50℃로 동결되는(느린 동결) Leybold GT4 동결 건조기 또는 Zirbus 파일럿/래보래토리 동결 건조기 서브리매이터 2-3-3에 적재하였다. 바이얼을 -50℃의 온도에서 2시간 동안 유지하였다. 1차 건조 단계를 위해, 보존 온도를 0.1℃/분으로 -45℃로 증가시킨 다음, 0.02℃/분으로 -40℃로 증가시킨 다음, 42시간 동안 배양하였다. 2차 건조 단계는 0.02℃/분으로 10℃로 증가시킨 다음, 10℃에서 8시간 배양하였다. 그 후, 보존 온도를 0.02℃/분으로 25℃로 증가시켰다.

진공 건조를 위해, 충진되고 반이 닫힌 바이얼을 15℃의 보존 온도의 Zirbus 동결 건조기 서브리매이터 2-3-3에 적재하고, 그 온도로 10분간 유지하였다. 챔버 압력은 다양한 속도로(1mbar/분, 0.3mbar/분, 0.1mbar/분) 15분의 램핑 단계에서 1mbar까지 감소되었으며, 25mbar 챔버 압력에서 출발하였다. 온도를 제형의 동결을 일으키지 않는(제형의 공융 온도 이상의 제품 온도), 0.05mbar로 1시간 동안 그리고 0.03mbar에서 1시간 동안 -10℃까지 감소시켰다. 후속적으로, 보존 온도를 0.05℃/분으로 30℃로 증가시켰다. 사이클의 마지막에, 바이얼을 진공하에서 닫고, 알루미늄 뚜껑으로 밀봉하고 분석하기 전까지 4℃에 보관하였다. 진공 건조 공정 코스 중에 보존 온도 및 챔버 압력의 예를 표 1에 나타내었다.

	Tshelf (℃)	기간 (min)	압력 (mbar)
FT01	15	10	-
D01	15	15	25
D02	15	15	10
D03	15	15	5
D04	15	15	3
D05	15	15	1
D06	-10	60	0.05
D07	-10	60	0.03
D08	-5	120	0.03
D09	5	120	0.03
D10	10	120	0.03
P01	20	240	-
P02	30	240	-
P03	4	60	-

1.2.4 D-항원 ELISA

폴리스티렌 96-웰 마이크로타이터 플래이트를 혈청형-특이 소 항-소아마비 혈청(RIVM, Bilthoven, The Netherlands)으로 실온에서 밤새 코팅하였다. PBS에 담긴 0.1% Tween20(세정 버퍼)으로 세정한 후, 2배 희석액의 IPV 레퍼런스 스탠다드 및 어세이버퍼(0.5% Protifar 및 0.1% Tween20을 함유한 PBS)에 희석된 단일 희석액의 IPV-제형을 첨가하였다(2개로 100㎕/well). 플래이트를 온화한 교반하에 37℃에서 30분간 배양하고, 광범위하게 세정하고, 혈청형-특이 모노클로날 마우스 항체(mab 3-4-E4(타입 1), 3-14-4(타입 2), 1-12-9(타입 3), 모두 RIVM(Bilthoven, Netherlands)로부터 구입함)와 HRP-표지 항-마우스 IgG(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)의 혼합물을 첨가하였다. 후속적으로, 플래이트를 온화한 교반하에서 37℃에서 30분간 배양하였다. 플래이트를 광범위하게 세정하고, ELISA HighLight 신호 제제(signal reagent)(Zomerbloemen BV, Zeist, Netherlands)를 첨가하고, 광도계를 이용하여 10-15분간 화학발광을 측정하였다(Berthold Centro LB960).

1.2.5 수분-함량 분석

수분 함량은 Karl Fischer 전량 적정장치(Model CA-06 Moisture meter, Mitsubishi)를 이용하여 특정하였다. Karl Fischer 방법에 의한 수분 잔류 측정의 원리는 요오드와 아황산은 물의 존재하에서만 반응한다는 사실에 기초한다. 시료의 무게를 재고, 그 다음 Karl Fischer 시약, Hydranal Coulomat A(Fluka, Buchs, Switzerland)에서 재구성하였다. 재구성된 시료를 주사기로 모으고 적정 용기에 주사하였다. 각 바이얼을 3회 측정하였다. 빈 바이얼의 무게를 재고, 수분 함량을 적정 장치에 의해 측정된 수분 함량, 바이얼내의 동결 건조된 산물의 중량, 상기 시약의 재구성 용량, 적정 용량 및 공백 적정(blank titration)의 수분 함량에 기초하여 측정하였다.

1.2.6 시차 주사 열량 측정법( DSC )

제형의 열역학 행동은 시차 주사 열량 측정법(DSC)에 의해 측정하였으며, 이는 물질내의 상 전이와 관련된 온도 및 열 흐름을 시간과 온도의 함수로서 측정하는 방법이다. 동결 건조된 제형을 알루미늄 DSC 팬에 채우고, 시차 주사 열량 측정기(DSC Q100, TA Instruments)에서 조절된 온도 프래그램에 적용하였다. 시료를 20℃/분의 속도로 0℃에서 150℃로 가열하고, 질소 가스로(50ml/분) 퍼지하였다. 유리 전이 온도(Tg)는 소프트웨어(Universal Analysis 2000, TA Instruments)를 이용하여 열 흐름 곡선에서 불연속의 중간점으로서 측정되었다.

2. 결과

2.1 동결 건조 중 다양한 IPV 서브타입의 안정화

1차 실험(실험 A)으로, 4가지의 잘 알려진 안정화 당류/폴리올(수크로즈, 트레할로즈, 만니톨 및 덱스트란)뿐만 아니라, 소듐 클로라이드를 이에 대한 안정화 잠재력에 대해 평가하였다(도 1). 시험은 IPV의 동결 건조에 대하여 최적의 제형을 얻기 위한 실험 접근방법의 디자인으로 설정되었다.

다양한 IPV-제형을 상술한 바와 같이(섹션 1.2.3) 동결 건조하였다. 출발 용량으로서 동량의 물을 첨가하여 동결 건조된 케이크를 재구성하고, D-항원 회수율을 ELISA에 의해(섹션 1.2.4) 측정하였다. 회수율은 동결 건조 전에 측정된 액체 제형내의 D-항원 함량의 퍼센트로 나타내었다.

어떠한 첨가제를 함유하지 않고, IPV와 McIlvaine 버퍼가 1:1로 희석된 3가 IPV 제형은 동결 건조 후에 모든 혈청형에 대해 <10%의 회수율을 나타내었다(도 1; A1). 타입 2 IPV는 ±80%의 최대 D-항원 회수율로 모든 제형에서 가장 안정한 혈청형인 것으로 나타났다. 덱스트란은 동결 건조된 IPV 제형, 특히 타입 1 및 3의 D-항원 회수율에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 혈청형 1, 2 및 3에 대하여, 각각 ±55%, ±85% 및 ±50%의 최대 회수율을 갖는 최상의 결과가 만니톨과 함께 수크로즈 및/또는 트레할로즈를 함유하는 제형들(도 1; 제형 A3, A4, A12 및 A16)에서 획득되었다. NaCl의 첨가는 동결 건조 후에 IPV의 회수율에 긍정적인 영향을 주지 못하였다.

이러한 1차 파일롯 실험은 각 IPV 혈청형이 이의 각 안정화제를 선호하는 3가 소아마비 백신의 동결 건조의 복합성을 분명히 보여준다. 10% 만니톨 타입 1 및 타입 3을 함유한 제형은 트레할로즈를 함유하지 않은 고농도 수크로즈의 존재를 선호하였으나, 타입 2는 수크로즈를 함유하지 않은 고농도의 트레할로즈를 선호하였다(도 2).

다음 실험(실험 B)에서, 글루타메이트, 사카라이드 및 폴리머의 혼합물의 안정화 잠재력을 조사하였다. 부형제들 수크로즈, 트레할로즈, 모노소듐 글루타메이트(MSG), 히드록시에틸 전분(HES) 및 NaCl의 다양한 조합을 조사하였다. 이당류, 수크로즈 및/또는 트레할로즈와 함께 MSG에 기초한 제형을 이용한 3가 IPV이 동결 건조는 3가지 혈청형에 대해 각각, 50-60%, 70-95% 및 50-65%의 D-항원 회수율을 나타내었다(도 3; 제형 B4, B7, B9, B12, B13). 단지 8% HES 또는 63mM NaCl에 기초한 제형은 동결 건조 중에 IPV를 보호하지 못하였다(도 3; B5 및 B10). 수크로즈를 함유한 제형에 NaCl의 첨가는 동결 건조 후에 D-항원 회수율의 5-10% 증가를 나타내었다(도 3; B2 및 B16).

2.2 건조 공정 및 제형의 효과

다음으로, 건조 공정에 관하여 생물 약제의 건조를 위해 사용된 전형적인 제형의 시험 결과를 나타내었다. 3가 IPV를 함유하는 제형은 진공 건조(동결 없이 건조하는 방법), 신속한 동결 단계를 이용한 동결 건조(50℃의 사전 냉각된 보존 온도에 산물을 직접 놓음) 및 느린 동결 단계를 이용한 동결 건조(4℃의 보존 온도에 산물을 놓고, -50℃로 동결함)에 의해 건조하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 예를 들어, 수크로즈 또는 트레할로즈에 기초한 스탠다드 제형은 진공 건조시 부분적으로 IPV를 보호한다. 그러나, 이러한 제형들은 동결 건조시에는 보호를 제공하지 못한다.

2.3 부형제의 스크리닝

다음 실험으로(실험 C), 일부 아미노산, 단백질/펩타이드 또는 다른 안정화제와 함께 소르비톨, 만니톨, 수크로즈 및/또는 MSG를 함유하는 다양한 제형들을 시험하였다(표 2). 동결 건조된 IPV-제형에서 염의 영향을 조사하기 위해, C-제형들은 또한 125mM NaCl을 첨가하여 시험하였다. NaCl이 D-항원 회수율에 미치는 영향은 명확히 관찰되지 않았다(데이터 생략). 동결 건조 직후 항원성 결과에 대한 처음 관찰에 의하면, 5% 소르비톨, 5% 펩톤 및 1% 리튬 클로라이드(LiCl)를 함유하는 제형 C13은 모든 혈청형, 타입 1, 2 및 3에 대해 각각, ±85%, ±100% 및 ±85%의 최고 회수율을 나타내었음이 분명하였다(도 5). 1.8% MgCl₂에서 LiCl-화합물의 대체는 상기 3가지 혈청형에 대해 D-항원 회수율의 ±5%, ±20% 및 15% 감소를 초래하였다. 그러나, 이러한 제형들은 상대적으로 높은 잔류 수분 함량, MgCl₂-함유 제형에 대해 2.1% 및 LiCl을 함유하는 제형에 대해 6.2%를 나타내었다. 수크로즈, 트레할로즈 및 아미노산 글리신 및 리신을 함유하는 제형에 매우 소량의 계면활성제 Tween 80의 첨가는 D-항원 회수율을 5-15% 증가시켰다(도 5; C8, C9). 소르비톨, 만니톨 및 MSG에 기초한 제형들(C2, C3, C4 및 C7)은 타입 1, 2 및 3에 대해 각각, 65%, 80% 및 70% 이상의 회수율을 나타내었다.

본 시험에서, 소르비톨, 펩톤 및 염 LiCl 또는 MgCl₂의 조합은 IPV의 동결 건조 직후에 D-항원 회수율에 긍정적인 효과를 미치는 것으로 보였다. 또 다른 주목할만한 제형은 소르비톨, 만니톨 및 MSG의 혼합물이며, 이는 MSG와 함께 폴리올의 존재는 동결 건조 중에 IPV를 안정화시키는 것을 보여주었다.

동결 건조된 제형들의 유전 전이 온도를 측정하였으나(표 2), D-항원 회수율과 분명한 상관성을 나타내지 않았다. 오발부민 및 펩톤을 함유하는 제형은 최고의 유리 전이 온도를 나타내었다.

동결 건조된 IPV-제형의 조성물(실험 C). 잔류 수분 함량(RMC)을 Karl Fischer에 의해 측정하고, 건조된 케이크의 Tg를 DSC에 의해 측정하였다.

	SOR	MAN	SUC	MSG	당류/ 폴리올	아미노산	단백질	기타	RMC (%)	T g (℃)
C1	-	-	-	-	-	-	-	-	3.6	n.d.
C2	7%	7%	-	2%	-	2% 글리신	7% 오발부민	-	0.3	37.2
C3	7%	7%	-	2%	-	2% 글리신	7% 오발부민	1 mM EDTA	n.d.	38.3
C4	7%	7%	-	2%	-	2% 글리신	-	-	1.9	53.5
C5	-	-	3%	-	3% 덱스트란 3% 미오-이노시톨	-	3% 오발부민	-	1.1	54.9
C6	5%	5%	5%	-	-	2% 글리신 3% Lysine 3% L-Arg	-	-	1.0	37.1
C7	5%	5%	5%	3%	-	2% 글리신 3% 리신	-	-	3.3	37.2
C8	-	-	5%	-	5% 트레할로즈	3% 리신 3% Alanine	-	-	0.5	32.3
C9	-	-	5%	-	5% 트레할로즈	3% 리신 3% Alanine	-	0.01% Tween80	0.5	34.1
C10	-	-	5%	-	-	3% 리신 3% Alanine	-	3% Ca-락토바이오네이트	1.0	31.2
C11	-	-	5%	-	-	3% 리신 3% 알라닌	3% Rec. 젤라틴	-	0.3	35.7
C12	5%	-	-	-	-	-	5% 펩톤	1.8% MgCl2	2.1	44.7
C13	5%	-	-	-	-	-	5% 펩톤	1% LiCl	6.2	n.d.
C14	-	-	5%	-	5% 트레할로즈	-	5% 펩톤	-	0.5	35.6

이러한 발견에 기초하여, 새로운 스크리닝 실험(실험 D)을 디자인하였다. 가장 유망되는 회수율은 소르비톨, 펩톤 및 Mg 또는 Li-클로라이드에 기초한 제형들로 관찰되었기 때문에, 10% 소르비톨, 5% 펩톤 및 125mM NaCl에 기초한 실험을 디자인하였다. 오발부민은 동물성 기원이어서 사람에게 사용하기 위한 백신에서 바람직하지 않은 부형제이므로 제외하였다. 여러 부형제들의 IPV 안정화 메커니즘에서 보다 많은 통찰을 얻기 위해, 10% 소르비톨, 5% 펩톤 및 125mM NaCl을 함유하는 제형들을 당류/폴리올, 아미노산(5% 펩톤 대신), 염 또는 계면활성제나 단백질과 같은 다른 안정화제와 혼합하였다. 소르비톨, NaCl 및 1% 히스티딘을 함유한 제형은 동결-건조 공정 직후에 90-100%의 회수율을 나타내었다(도 6; D11). 초기에 관찰된 바와 같이, MgCl₂-함유 제형은 동결 건조 중에 상서로운 안정화 능력을 나타내었으며, 이는 칼슘클로라이드(CaCl₂)- 및 리튬 클로라이드(LiCl)-함유 IPV 제형과 유사하였다(도 6; D17-19). 스크리닝 단계 중에, 안정한 동결 건조 산물을 제공할 뿐만 아니라 고온에서 후속적인 보관 후에도 안정성을 제공하는 이들의 능력을 갖는 부형제들을 선별하기 위해 가속화된 안정성을 평가하였다.

2.4 가속화된 안정성 시험

일부 제형이, 동결 건조 직후, 45℃에서 1주 배양 후, 수용가능한 D-항원 회수율을 나타내었음에도 불구하고, 이들 4 제형들의 D-항원 회수율은 혈청형 1, 2 및 3에 대해 각각, 30%, 60% 및 10% 이하까지 저하되었다(도 7). 5% 미오-이노시톨을 함유한 제형은 45℃에서 배양 후에 최고 회수율을 나타내었으나, 여전히 상기 3가지 혈청형에 대해서 ±40%, 10% 및 30%의 감소가 관찰되었으며, 여기서 또한 IPV 타입 2가 가장 안정한 혈청형인 것으로 나타났다(도 7; D5). 45℃에서 1주 보관시, 1% 락티톨을 함유하는 제형은 혈청형 2에 대해 10%미만의 D-항원 회수율을 나타내었으며, 불행하게도 혈청형 1 및 3은 >30%의 감소를 나타내었다(도 7; D7).

소르비톨, 만니톨, MSG 및 펩톤과 MgCl₂의 안정화 잠재력의 조합을 더욱 조사하기 위해, 새로운 디자인의 실험 셋업을 수행하여 동결 건조 후 다양한 부형제들 및 D-항원 회수율 간의 관계를 검출하였다. 하기 변수들이 실험 E에 포함되었다: 0/10% 소르비톨, 0/10% 수크로즈, 0/10% 만니톨, 0/10% MSG, 0/5% 펩톤 및/또는 0/5% MgCl_2. 그리고 본 실험에서 동결 속도를 측정하였다. 느린 동결은, 바이얼이 4℃의 선반에 놓여지고, 후속적으로 0.1℃/분의 속도로 -50℃까지 냉각되는 것을 의미하며, 빠른 동결은 바이얼이 -50℃의 사전-냉각된 선반에 직접 놓여지는 것을 의미한다. 그 결과를 빠른 동결 속도에 대해 도 8a에, 그리고 느린 동결 속도에 대해서는 도 8b에 나타내었다.

동결 건조 후 D-항원 회수율에 대해 우선 관찰한 결과, 당류/폴리올과 함께 MSG 및 MgCl₂를 함유하는 빠른 동결 제형은 모든 혈청형에 대해 ±80 - 90%의 최고 회수율을 나타내었다(도 8a; E22-24, E29-32). 느린 동결 시료와 관련하여, MgCl₂-함유 제형은 타입 1 및 3에 대해 75 - 90%의 회수율을 나타내었다(도 8b; E54-57, E63-66). 그러나, 혈청형 2에 대해서는 펩톤과 함께 당류(들)이 함유된 제형만이 ±70%의 회수율을 나타내었다(도 8b, E43-48). 실험의 재현성의 나타내기 위해, 제형 H33 및 H66은 3회 시험되었으며, 모든 혈청형에 대해 <10%의 표준편차를 나타내었다. 동결 건조 직후(도 8) 또는 45℃에서 1주 배양 후에(도 9), 이러한 두 제형의 D-항원 회수율의 비교로부터, 동결 속도는 이러한 IPV 제형에 현저히 회수율에 영향을 미치지 않는 것이 명확하다.

실험 E는 "모데(Modde)" 소프트웨어(Umetrics)를 이용한 '실험 디자인(Design of Experiment)'에 기초하여 설정되었다. 동결 건조 후 D-항원의 회수율과 더불어 동결 건조 및 37℃ 또는 45℃에서 후속적인 보관 후 회수율이 상기 실험 디자인에서 아웃풋으로 사용되었다. 제형의 함수로서 아웃풋은 조절되었고, Modde를 이용하여 모델에 놓여졌다. 이는 어떠한 제형 파라미터가 동결 건조 및 보관 후 회수율에 영향을 미쳤는지 보여주었다(데이터 생략).

각각의 바이러스 혈청형에 대한 가장 중요한 제형 파라미터를 표 3 - 5에 정리하였다.

표 3	타입 1의 D-항원의 회수율
제형 파라미터	동결 건조 후 %	37℃에서 보관 후 %	45℃에서 보관 후 %
MSG	9	10	7
소르비톨	8	6	4
MgCl2	7	6	3
펩톤		6	4
만니톨	4	6
MSG* MgCl2			4

표 4	타입 2의 D-항원의 회수율
제형 파라미터	동결 건조 후 %	37℃에서 보관 후 %	45℃에서 보관 후 %
MSG	7	9	9
소르비톨	7	7	5
MgCl2
펩톤		10	10
만니톨	3	4	4
수크로즈			2

표 5	타입 3의 D-항원의 회수율
제형 파라미터	동결 건조 후 %	37℃에서 보관 후 %	45℃에서 보관 후 %
MSG	14	10	10
소르비톨	8	7	7
MgCl2	4	4	4
펩톤	4	12	12
만니톨	6	5	5
수크로즈	4	1	1
MSG* MgCl2		5	5

2.5 펩톤의 치환

펩톤은 45℃에서 후속적인 보관 중에 동결 건조된 IPV를 안정화시키는 것으로 보였기 때문에, 10% 소르비톨, 5% MSG 및 5% MgCl₂를 함유한 제형 및 10% 만니톨과 혼합된 동일한 제형에서 펩톤의 역할을 조사하기 위한 실험을 수행하였다. 소르비톨, MSG 및 MgCl₂를 함유하는 제형에 10% 만니톨을 첨가한 경우에 유의한 차이가 발견되지 않았다. 5% 펩톤 첨가는 두 제형 모두의 항원성에 영향을 주지 않았다(도 10).

단일 아미노산의 첨가가 동결 건조된 IPV의 후속적인 보관 중에 펩톤의 안정화 역할을 대체할 수 있는지 알아내기 위해, 소르비톨, MSG 및 MgCl₂를 함유하며 만니톨이 첨가되거나 첨가되지 않은 제형에 아미노산을 첨가하였다. 45℃에서 1주 배양 후, 펩톤이나 첨가된 아미노산 중 어느 것도 10% 소르비톨, 10% MSG 및 5% MgCl₂를 함유하는 대조구 제형과 비교하여 D-항원 회수율의 향상된 안정성을 나타내지 않았다(도 11, F1.0-F1.5). 만니톨의 존재하에서, 펩톤의 안정화 능력은 단지 타입 3에 대해서만 나타났으나, D-항원 회수율은 대조구 시료와 비교하여 ±15% 향상되었다. 그러나, 유의하게 감소된 회수율(p<0.001)이 타입 1에 대해 발견되었으며, 유의하진 않으나 타입 2 또한 ±10% 더 낮은 회수율을 나타내었다(도 11; F2.0, F2.1). 소르비톨, MSG 및 MgCl₂를 함유하는 모든 제형에 대해서, D-항원 함량의 ±10% 감소가 타입 2에 대해 나타났으며, 여기서 만니톨의 첨가는 가속화된 안정성 중에 타입 2에 안정한 것으로 발견되었다. 아르기닌은 소르비톨, MSG, MgCl₂ 및 만니톨을 함유한 제형에서(도 11, F2.3) 안정화 잠재력을 갖는 것으로 보였으며, 45℃에서 배양 후 타입 1 및 3에 대해 D-항원 회수율이 각각 ±15% 및 ±30% 감소한 것으로 나타났다. 이는 아르기닌 대신에 펩톤을 함유한 거의 동일한 제형에 의한 안정화와 비교할만 하였다(도 11, F2.1).

펩톤과 같은 규정되지 않은 부형제는 인간 백신에 바람직하지 않기 때문에, 보관 중에 IPV를 안정화할 수 있는 펩톤에 대한 가능한 대체물이 조사되었다. 질량 분석법 및 HPLC에 의한 분석은 펩톤에 존재하는 가장 풍부한 아미노산을 나타내었다(데이터 생략). 소르비톨, MSG 및 MgCl₂를 함유하는 제형에 여러 가지 단일 아미노산들의 첨가는 대조구 제형과 비교시 45℃에서 안정성을 향상시키지 못하였다. 펩톤은 소르비톨, MSG, MgCl₂ 및 만니톨을 함유하는 제형에서 혈청형 3을 안정화하는 것으로 나타났으며, 아르기닌은 혈청형 1 및 3 모두의 안정성을 향상시킬 수 있다. 혈청형 2는 가속화된 안정성 중에 대조구 제형에서 이미 D-항원 회수율의 완전한 유지를 나타내었다. 펩톤의 정확한 조성은 검출하기 어려우나, 비가수분해된 펩톤과 화학적 가수분해된 펩톤을 이용한 역상 HPLC에 의한 아미노산 정량화는 펩톤이 단일 아미노산 및 펩타이드 모두로 구성되었으나, 펩톤의 90%w/w 이상은 정의되지 않은 채로 남아있다. 펩톤은 조사된 IPV-제형의 유리 전이 온도를 증가시키는 것으로 보이기 때문에, 펩톤을 수크로즈 또는 트레할로즈와 같은 고 Tg를 갖는 부형제로 대체하는 것이 가능할 수 있다.

소르비톨, MSG 및 MgCl₂를 함유하며 만니톨이 첨가되거나 첨가되지 않은 IPV-제형의 유리 전이 온도(Tg' 및 Tg)를 DSC에 의해 측정하였다. 이러한 제형의 유리 전이에 미치는 펩톤의 영향을 조사하였다. 단일 측정값을 나타내었다.

	10% 소르비톨 + 10% MSG + 5% MgCl 2		10% 소르비톨 + 10% MSG + 5% MgCl 2 + 10% 만니톨
	T g ' ℃)	T g (℃)	T g ' (℃)	T g (℃)
대조구	-47.9	35.2	-44.4	38.8
+ 5% 펩톤	-44.1	39.8	-42.8	48.7

앞선 실험은 펩톤에 대하여 가치있는 대체물을 생성하지 못하였으며, 소르비톨, MSG, MgCl₂를 함유하며, 만니톨이 첨가되거나 첨가되지 않은 제형들은 가속화된 안정성 시험 후에도 최상의 결과를 제공하는 것으로 나타났다. 이 시험 중에 모든 제형들은 McIlvaine 버퍼로 제조되었으며, 이는 IPV의 동결 건조에 적절한 버퍼로 알려져 있다[52]. 제형을 더욱 최적화하기 위해, 생물 약제의 동결 건조에 자주 사용되는 버퍼를 이용하여 버퍼 스크리닝을 수행하였다. 각 버퍼에서 IPV 뱃치는 투석에 의해 제조하였으며, 투석하지 않은 IPV를 대조구로 하였다.

소르비톨, MSG 및 MgCl₂를 함유한 제형은 동결 건조 직후에 상기 3 혈청형에 대해 ±95%, ±85% 및 90%의 회수율을 나타내었다(도 12a; G1.0-G1.5). 펩톤의 첨가 후, 타입 1 및 3의 D-항원 회수율은 10-15% 저하되었으며, 타입 2는 펩톤을 함유하지 않은 제형과 비교하여 유사한 회수율을 나타내었다(도 12b). McIlvaine 버퍼는 다른 버퍼 성분과 비교하여 혈청형 2에 대해 10-15% 더 낮은 회수율을 나타내었다. 히스티딘 버퍼는 소르비톨, MSG 및 MgCl₂를 함유한 IPV 제형의 동결 건조 후에, IPV의 D-항원 수율을 증가시키는 것으로 나타났다(타입 1 및 3에 대해 >95%의 회수율; 도 12a, G1.3). 동결 건조 후, 포스페이트 버퍼를 이용한 경우에 타입 2에 대해 88%의 D-항원 회수율에 이르렀으며, McIlvaine 버퍼에서는 타입 2에 대해 73% 회수율을 나타내었다(도 12a, G1.5).

소르비톨, MSG, MgCl₂를 함유하며 펩톤이 첨가되지 않은 제형에 만니톨의 첨가는, 타입 2에 대해 85-100%의 회수율이 관찰되었기 때문에, 혈청형 2가 동결 건조 중에 제형에서 만니톨의 존재를 선호하는 것으로 나타났다(도 12C). 소르비톨, MSG, MgCl₂ 및 만니톨을 함유하는 IPV-제형에 있어서, 타입 1에 대해 80-90%의 회수율이, 그리고 타입 3에 대해 ±80%의 회수율이 관찰되었다. 펩톤의 첨가는 타입 1 및 3의 회수율에서 ±10% 감소를 나타냈으며, 동결 건조 후 타입 2에 대하여 유사한 D-항원 함량을 나타내었다(도 12d).

2.6 버퍼 성분의 영향

가속화된 안정성 실험은 사용된 버퍼들 간의 제형-의존적 차이를 나타내었다. 대조구 제형은 동결 건조 직후에 높은 회수율을 나타내었으나, 45℃에서 1주 배향 후에, 펩톤-결핍 대조구 제형은 혈청형 1, 2 및 3에 대해 각각, ±40%, ±50% 및 <15%의 회수율을 나타내었다(도 13; G1.0 및 G3.0). 대조구 제형에 있어서, 펩톤은 타입 3가 45℃에서 보관 후에 만니톨을 함유하지 않거나 함유한 제형에 대해 각각 >90% 및 80%를 나타낸 것 대신에, D-항원 회수율이 ±25% 및 ±15%의 감소를 나타낸 경우에 타입 1 및 2의 분명한 안정성 향상을 나타내었다(도 13; G2.0 및 G4.0). 소르비톨, MSG 및 MgCl₂를 함유하는 제형에 있어서, 최고 회수율은 HEPES 버퍼에서, 동결 건조 및 보관 후에 상기 3 혈청형에 대해 ±80%, ±85% 및 ±60%의 D-항원 함량이 관찰되었다. 이는 타입 1, 2 및 3에 대한 가속화된 안정성 시험 중에 D-항원 회수율이 각각 단지 10%, 0% 및 30% 감소를 나타내었음을 의미한다. 단지 타입 3에 대해서만 시트레이트 버퍼를 이용하여 보다 우수한 결과, ±20%의 감소가 관찰되었으며, 79%의 회수율을 유지하였다(도 13a; G1.2). 펩톤의 첨가는 펩톤이 첨가되지 않은 것만 제외하고는 동일한 제형 및 버퍼와 비교하여 모든 혈청형에서 총 15-25% 보다 낮은 회수율을 나타내었다(도 13a). 소르비톨, MSG, MgCl₂ 및 만니톨을 함유한 제형에 펩톤을 첨가한 경우에 분명히 향상된 안정성을 나타내었다. 펩톤이 첨가되지 않은 다른 버퍼 제형은 ±55%, ±75% 및 ±45%의 최대 회수율을 나타내었으며, 펩톤이 첨가된 동일한 버퍼는 ±50%, ±80% 및 ±55%의 회수율을 나타내었다(도 13b). 부형제 소르비톨, MSG, MgCl₂, 만니톨 및 펩톤을 함유하는 포스페이트 버퍼에 기초한 제형은 45℃에서 배양 후 타입 1에 대해 ±30% 그리고 타입 2에 대해서는 단지 ±10%의 감소된 회수율로서 가장 안정한 제형인 것으로 나타났다.

2.7 건조 방법과 관계없는 안정화에 적절한 제형

도 14는 소르비톨을 함유하는 제형만이 다양한 건조 방법에 의해 야기되는 응력에 저항적일 수 있음을 보여준다. 이는 또한 MSG 및 MgCl₂(특히 타입 3)의 포함에 의해 더욱 향상될 수 있으며, 이는 트레할로즈 또는 수크로즈와 함께 진공 건조하는 것과 상당하거나 또는 더 높은 회수율을 제공하는 제형을 형성한다. 초기 결과로부터(실험 E), 소르비톨, MSG 및 MgCl₂에 기초한 제형들은 가속화된 안정성 시험 후에 최상의 회수율을 갖는 것으로 결론지었다.

2.8 펩톤이 첨가되지 않은 제형

상기 실험에서 본 발명자들이 발견한 펩톤이 첨가되지 않은 보다 우수한 제형 중 하나는 10% 소르비톨 + 10% MSG + 5% MgCl₂를 함유하는 제형이다. 추가 실험에서, 이 제형에서 주된 부형제들 중 어떤 것이 영향을 미쳤는지 평가하였다. 그 결과를 수크로즈 및 트레할로즈에 기초한 2개의 스탠다드 제형과 비교하였다. 동결 건조 직후의 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15로부터, 주로 소르비톨이 동결 건조 직후에, 특히 서브타입 1 및 2에 대해 IPV의 회수율에 책임이 있는 것으로 결론지었다. MSG와 MgCl₂의 조합은 상기 3 IPV 서브타입의 현저한 안정화를 나타낸다. 소르비톨 단독에 비하여, 소르비톨, MSG 및 MgCl₂의 조합이 동결 건조 후에, 특히 타입 3에 대해 최상의 회수율을 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같은 가속화된 안정성 평가시, 대부분의 제형들은 상당한 회수율 감소를 나타내었으며, 또한 소르비톨만 함유하는 제형도 마찬가지였다. 그러나, 10% 소르비톨 + 10% MSG + 5% MgCl₂(만니톨 함유/무함유)를 함유하는 제형은 45℃에서 1주간 보관 후에 높은 회수율을 나타내었다.

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약어

BCG - Bacillus Calmette-Guerin

DoE - Design of Experiments

DSC - Differential Scanning Calorimetry

DU/D-Ag - D-Unit/D-antigenicity

ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

HES - Hydroxyethyl starch

HRP - Horseradish peroxidase

IgG - Immunoglobulin G

IPV - Inactivated Polio Vaccine

MAN - Mannitol

MS - Mass Spectrometry

MSG - Mono-Sodium Glutamate

OPV - Oral Polio Vaccine

PEP - Peptone

QC - Quality Control (department at RIVM)

RIVM - National Institute for Public Health and Environment

RMC - Residual Moisture Content

RP-HPLC - Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography

sIPV - Sabin Inactivated Polio Vaccine (based on Sabin strains)

SOR - Sorbitol

SUC - Sucrose

T_g - Glass transition temperature

TREH - Trehalose

VAPP - Vaccine Associated Paralytic Poliomyelitis

VDPV - Vaccine Derived Poliovirus

WHO - World Health Organisation

Claims (15)

1. 생물 약제, 아미노산, 폴리올, 금속염 및 물을 포함하는 용액을 건조하는 것을 포함하는, 건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 용액은 필수적으로 ml 당 1pg - 10g의 생물 약제, 0.01-20%(w/v)의 아미노산, 0.5-20%(w/v)의 폴리올, 0.005-10%(w/v)의 금속염 및 물로 구성되는, 건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   a) 상기 아미노산은 글루타메이트, 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴, 리신, 루신, 글리신 또는 이의 혼합물이며;
   b) 폴리올은 소르비톨, 만니톨, 만노즈, 말티톨 또는 이의 혼합물이며;
   c) 금속염은 Mg⁺⁺, Ca⁺⁺ 또는 Li⁺의 염 또는 이의 혼합물이며, 바람직하게는 Cl^- 또는 SO₄ ^{2 -} 염 또는 이의 혼합물인,
   건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 글루타메이트는 모노소듐 글루타메이트의 형태로 용액에 용해되며, 그리고/또는 상기 아르기닌은 폴리-L-아르기닌의 형태로 존재하며, 그리고/또는 상기 리신은 폴리-L-리신의 형태로 존재하는,
   건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 용액은 필수적으로 ml 당 1pg - 10g의 생물 약제, 5-20%(w/v)의 소르비톨, 5-20%(w/v)의 모노소듐 글루타메이트, 2-10%(w/v)의 마그네슘염, 바람직하게 MgCl₂ 및/또는 MgSO₄, 및 선택적으로 5-20%(w/v) 만니톨로 구성되는,
   건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 용액은 약학적으로 허용되는 버퍼를 포함하며, 중성 pH로 완충되는,
   건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 용액은 공기 건조, 진공 건조, 분무 건조 또는 동결 건조에 의해 건조되는,
   건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
   
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 생물 약제는 단백질성 물질을 포함하는 제제이며, 바람직하게 상기 생물 약제는 엔테로바이러스(Enterovirus) 또는 뉴모바이러스(Pneumovirus)와 같은 바이러스인,
   건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 생물 약제는 혈청형 1, 2 및 3의 폴리오바이러스를 포함하며, 바람직하게는 혈청형 1, 2 및 3의 불활성화 폴리오바이러스를 포함하거나, 또는 여기서 상기 생물 약제는 인간 또는 소 RSV이며, 바람직하게는 결실되거나 불활성화된 G 부착 단백질 유전자를 갖는 바이러스 게놈을 포함하는 RSV인,
   건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
   
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 건조된 제형은, 건조 후 재구성시, 건조 전 상기 용액에 존재하는 생물 약제의 활성의 적어도 50%를 보유하는,
    건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    건조될 용액은 하나 이상의 다른 생물 약제를 포함하며, 그리고 여기서 다른 생물 약제에 대한 활성 손실의 차이는 바람직하게 50% 미만이며, 이에 따라 활성의 최고 손실을 갖는 생물 약제의 보유 활성도는 100%로 설정된 최저 손실을 갖는 생물 약제의 보유 활성도의 퍼센트로 표현되는,
    건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
    
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    건조된 제형은 45℃에서 적어도 1주일간 보관 후에 재구성시, 건조 전에 상기 용액에 존재하는 상기 생물 약제의 활성의 적어도 50%를 보유하는,
    건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
    
13. 제12항에 있어서,
    건조된 제형은 하나 이상의 다른 생물 약제를 포함하며, 그리고 여기서 상기 다른 약제에 대한 활성 손실의 차이는 바람직하게 50% 미만이며, 이에 따라 활성의 최고 손실을 갖는 생물 약제의 보유 활성도는 100%로 설정된 최저 손실을 갖는 생물 약제의 보유 활성도의 퍼센트로 표현되는,
    건조된 제형의 생물 약제를 제조하는 방법.
    
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 획득가능한 생물 약제의 제형.
    
15. 제14항에 있어서, 감염성 질병 또는 종양에 대해 개체에서 면역 반응을 유도하는, 생물 약제의 제형.
    

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