KR20150006421A - 미세조류에 의해 생성된 스쿠알렌의 정련방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물유기체의 발효에 의해 생성된 스쿠알렌이 매우 풍부한 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 본 방법은 추출 환류를 이용한 다단 역류 분별분리관 내 초임계 CO₂ 추출, 및 짧은 경로 분자 증류를 포함하는 군으로부터 선택되는 정제 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

미세조류에 의해 생성된 스쿠알렌의 정련방법{METHOD FOR REFINING SQUALENE PRODUCED BY MICROALGAE}

본 발명은 미생물유기체, 더 구체적으로는 미세조류, 훨씬 더 구체적으로는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales sp) 과의 미세조류로부터 시작하는 발효에 의해 생성된 스쿠알렌을 정련하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 의미에서, "트라우스토키트리알레스 과의 미세조류"는 스키조키트리움(Schizochytrium sp .), 아우란티오키트리움(Aurantiochytrium sp .) 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium sp .) 종에 속하는 미세조류를 의미한다.

스쿠알렌은 모든 고등 유기체에 존재하는 지질이며, 스테로이드 호르몬(동물과 식물 둘 다) 및 일부 비타민(예컨대, D 비타민)의 공통된 전구체이다.

이는 다수의 세포막에 존재하며, 이에 의하여 세포막에 유동성을 제공한다.

이 불포화된 선형의 탄화수소는 화학식이 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥센인 C₃₀H₅₀의 30개 탄소 원자 및 50개 수소 원자를 지니는 이소프레노이드이며, 즉 이는 모두 트랜스 형태인 6개의 이소프렌 단위로 이루어진다.

모든 테르펜과 같이, 이는 이소펜틸 파이로포스페이트로부터 형성되는데, 이는 다이메틸알릴 파이로포스페이트와 결합되어 게라닐 파이로포스페이트를 연속적으로 공급한 다음 파르네실 파이로포스페이트를 공급하고, 이들의 2개 분자는 NADPH에 의한 환원 후 축합되어 스쿠알렌 신타제의 작용 하에서 스쿠알렌을 형성한다.

식물 및 수많은 미생물유기체에서, 이 경로는 카로테노이드 색소, 및 라텍스 중의 테르펜의 엽록체 전구체인 피토엔을 야기하는 기타 다른 대사 경로와 함께 공존한다.

말단 이중 결합 상에서 에폭시화된 스쿠알렌 및 그것의 유도체는, 현저하게 위치선택적 및 입체선택적으로 전문화된 효소(사이클라제) 때문에, 상당한 구조적 다양성의 폴리사이클릭 트리테르펜, 즉 진핵생물에서 호펜 및 디플로프테롤 및 원생동물에서 테트라하이마놀(펜타사이클릭 트리페르펜); 효모, 진균 및 포유류에서 라노스테롤 및 식물에서 사이클로아르테놀(테트라사이클릭 트리페르펜)으로 전환되는 특성을 가진다.

스쿠알렌의 적용

스쿠알렌은 특히 일본에서 식품 보충제로서 오랫동안 사용되어 왔다.

게다가, 일본인 화학자 미츠마루 츠지모토는 1906년에 스쿠알렌을 발견하였고, 1916년에 그것의 구조를 결정하였다.

이는 천연 의약에서 다수의 유리한 특성을 지니는 효과적인 항산화제인 것으로 고려된다.

산화되지 않아서, 산패되지 않는 스쿠알렌의 수소화된 유도체인 스쿠알란을 사용하는 것이 더 흔하지만, 스쿠알렌의 통상적인 용도는 화장료를 포함한다.

스쿠알렌이 고순도이며, 면역계를 자극하는 애주번트(adjuvant)와 조합될 때, 스쿠알렌은 특정 백신에서 사용되었고, 여전히 사용되고 있으며, "수중유" 에멀전 형태에서 스쿠알렌은 계면활성제로서 작용하고, 따라서 백신의 반응을 증가시킨다.

이는 H5N1 및 H1N1과 같은 출현 바이러스를 표적화하는 실험 백신에서, 특히 계절 인플루엔자의 항원과 병용하여, 1997년 이래로 투여된 2천 2백만인분의 조성물(FLUAD^®의 용량 당 10 mg의 비율로 MF59)에서 백신접종 후 심각한 반응 없이 사용된다.

애주번트, 스쿠알렌 또는 알루미늄 염(1926년 이래로 사용함)의 첨가는 현재 불활성화 또는 아단위 백신, 즉 면역계가 적절한 방어 기작을 사용하게 할 수 있는 신호를 함유하지 않는 특정 백신을 위해 필요하다.

스쿠알렌는 양호한 보호를 보장하기 위해 반복된 주사에 대한 필요를 회피한다.

스쿠알렌의 이런 용도는 고순도의 스쿠알렌을 생성하기 위한 안전한 방법을 가지도록 당업자의 결정을 강화한다.

게다가, 이 품질은 의학 분야에서 적용의 기타 다른 경로를 개방할 수 있다.

따라서 스쿠알렌과 뉴클레오시드 유사체의 화학적 결합은 장래에 특정 암의 치료에서 또는 HIV 유형의 바이러스 질병에서 상당한 진보를 구성한다.

스쿠알렌의 다양한 공급원

스쿠알렌은 통상적으로 심해 상어 간으로부터 추출된다.

그러나, 간은 수많은 독성 화합물, 예컨대 중금속(수은을 포함함) 및 기타 다른 지용성 독소를 축적한다.

독물학적 연구는 화장료에서 사용되는 농도에서, 스쿠알렌 및 그것의 수소화된 형태인 스쿠알란은 독성이 없으며, 인간 피부에 대해 자극적이거나 또는 민감하게 하지 않는다는 것을 나타내었다.

그러나, 스쿠알렌의 순도 수준은 의학 분야에서 특히 백신에 대한 애주번트로서 사용될 때 필수적이다.

그러므로, 불순물(미량의 금속, 특히 수은 및 기타 다른 독소)이 없는 고품질의 스쿠알렌을 가지는 것이 절대적으로 필수적이다.

상어 간으로부터 스쿠알렌을 추출하는 것 이외의, 스쿠알렌의 생성을 위한 몇몇 경로는 문헌에서 제안된다.

제1 대안으로서, 이는 올리브 오일, 팜 오일, 및 기타 다른 곡물 오일 또는 아마란스, 종자, 쌀겨 및 밀배아로부터 유래된 오일로부터 단리될 수 있다.

그러나, 여기서 주된 문제점은 스쿠알렌이 이들로부터 대략 0.1중량% 내지 0.7중량%의 매우 소량으로 추출되며, 매우 다수의 힘들고 비싼 정제 단계를 필요로 한다는 것이다.

제2 대안으로서, 스쿠알렌의 제1 생성 방법은 미생물유기체로부터, 더 구체적으로는 천연 효모 또는 재조합 효모, 특히 사카로마이세스 유형(Saccharomyces type)으로부터 제안되었다.

따라서, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)는 스쿠알렌을 생성할 수 있지만, 매우 소량, 즉 대략 0.041 mg/g의 바이오매스로 생성할 수 있는 것으로 알려져 있다(BHATTACHARJEE, P. et al., 2001, World J. Microb . Biotechnol., 17, pp 811-816).

그러므로 생성을 위한 이들 능력의 최적화는 유전적 재조합에 의해 시도되었다.

그러나, 특허출원 WO 제2010/023551호에서 의학 분야용으로 제시된 바와 같이(백신용 애주번트로서 97% 초과 순도의 스쿠알렌의 생성), 이런 제1 대안은 스쿠알렌을 과생성하는(건조 세포의 15중량% 초과로) 재조합 효모가 이용가능할 경우에만, 산업적으로 적용될 수 있다.

이제, 이들 재조합 세포를 얻는 것은 스쿠알렌 생합성 경로의 자극 및 스쿠알렌 이화작용 경로의 저해를 야기하는 분자 생물학의 도구를 사용함으로써 수많은 힘들며, 길고 복잡한 대사공학 단계의 적용을 필요로 한다.

사실, 상기 특허출원 WO 제2010/023551호에서 더욱 상기되는 바와 같이, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제, 파이로포스포메발로네이트 데카복실라제, 이소펜테닐 파이로포스페이트 이소머라제, HMGR(3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 환원효소), 및 스쿠알렌 합성효소를 포함하는 다수의 유전자가 스쿠알렌의 생합성에 수반된다.

이화작용 경로에 대해, 스쿠알렌의 에르고스테롤로의 전환에 수반된 수많은 효소에 대해 암호화하는 유전자는 스쿠알렌 에폭시다제(ERG1), 라노스테롤 합성효소, C14-디메틸라제, d14-환원효소, C4-메틸옥시다제, C4-데카복실라제(ERG26), 3-케토환원효소, C24-메틸트랜스퍼라제, C8-이소머라제, C5-불포화효소, d22-불포화효소 및 d24-환원효소를 포함한다.

게다가, 기타 다른 이화작용 효소, 즉 LEU2([베타]-이소프로필말레이트 탈수소효소), 옥시도스쿠알렌 사이클라제, 자이모스테롤-24-메틸트랜스퍼라제 및 에르고스타-5,7,24(28)-트라이엔올-22-탈수소효소가 또한 고려되어야 한다.

상어 간으로부터의 추출 방법에 대한 제3의 대안으로서, 미세조류, 특히 트라우스토키트리알레스 과(트라우스토키트리움, 아우란티오키트리움 및 스키조키트리움 속을 포함함), 더 구체적으로는 스키조키트리움 만그로베이(Schizochytrium mangrovei) 또는 스키조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum)으로부터 스쿠알렌 생성을 위한 유망한 방법이 제안되었다.

게다가, 이들 미세조류는 종속영양 조건(광 없이; 탄소 함유 공급원으로서 글루코스의 공급)에서 스쿠알렌을 생성하고, 따라서 미생물유기체 발효의 당업자에 의해 용이하게 조작될 수 있다.

그러나, 트라우스토키트리알레스 과의 이들 미세조류에서, 스쿠알렌은 관심대상의 기타 다른 지질 화합물, 예컨대 도코사헥사엔산(또는 DHA), ω3 패밀리의 다불포화 지방산의 부산물이다.

따라서 스쿠알렌은 특히 상업적 DHA의 오일의 감화불가능한(unsaponifiable) 분획 성분(카로테노이드 및 스테롤 제외) 중 하나로서 기재된 것으로 보인다.

비교를 위해, 스키조키트리움 만그로베이의 FB1 균주는 0.017%의 스쿠알렌에 대하여, 세포의 6.2% 건조중량의 비율로 DHA를 생성한다.

따라서, 스쿠알렌을 자연적으로 생성하는 이들 미생물유기체는 소량으로, 즉

- 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) ACEM 6063에 대해 바이오매스 대략 0.1 mg/g(문헌[LEWIS et al., Mar . Biotechnol ., 2001, pp 439-447] 참조),

- 스키조키트리움 만그로베이 FB1에 대해 바이오매스 대략 0.162 mg/g(문헌[JIANG et al., J. Agric . Food Chem ., 2004, 52, pp 1196-1200] 참조)

을 생성한다.

그러나, 발효에 의한 생성의 최적화를 통해, 본 분야의 전문가들은 대략 하기의 생성에서 성공하였다:

- 트라우스토키트리드 ACEM 6063의 바이오매스 g당 스쿠알렌 1 mg 내지 1.2 mg(문헌[QIAN Li et al., J. Agric . Food Chem ., 2009, 57, 4267-4272] 또는 [LEWIS et al., Mar . Biotechnol ., 20 01, 3, 439-447] 참조).

- 스키조키트리움의 바이오매스 g 당 스쿠알렌 0.72 mg(문헌[G. CHEN et al., New Biotechnology , 20 10, 27-4, pp 382-389]참조).

- 아우란티오키트리움 만그로베이(Aurantiochytrium mangrovei) FB31의 바이오매스 g당 스쿠알렌 0.53 mg(문헌[K. W. FAN et al., World J. Microbiol . Biotechnol., 2010 , 26-3, pp 1303-1309] 참조).

- 스키조키트리움 만그로베이의 바이오매스 g 당 스쿠알렌 1.17 ± 0.6 mg(문헌[C-J YUE and Y. JIANG, Process Biochemistry , 2009, 44, 923-927] 참조).

본 출원인은 또한 트라우스토키트리알레스 과의 미세조류에 의한 스쿠알렌의 생성에서의 추가적인 개선에 기여하였는데, 본 분야에서의 문헌에서 이전에 도달되지 못한 수준으로 스쿠알렌을, 즉 바이오매스 100 g 당 적어도 8 g의 스쿠알렌을 생성하기 위한 방법을 제공한다(프랑스 특허출원에서 실험 하에).

따라서, 트라우스토키트리알레스 과의 미세조류는 이제 주목할만한 양으로 스쿠알렌을 생성할 수 있게 하지만, 식품, 화장료 및 특히 의학적 필요조건을 충족시키기 위해 스쿠알렌을 정련할 필요가 여전히 있다.

스쿠알렌의 특정의 다수의 정제 방법이 문헌에서 제안되지만, 이들 방법은 당업자에 의해 스쿠알렌 생성의 통상적인 공급원(동물, 식물 또는 효모 유형의 미생물유기체)에 적합하게 된다.

4가지 주요 기술, 즉

- 결정화,

- 크로마토그래피,

- 증류 또는

- 초임계 유체(예컨대, 초임계 CO₂)를 사용하는 추출

이 대체로 단독으로 또는 조합으로 사용된다.

이하에 설명할 바와 같이, 2가지 마지막에 언급한 기술이 가장 자주 접하는 것이다.

식물성 유래의 스쿠알렌의 정제를 위해, 예를 들어 미국특허출원 제2003/130532호에서, 식물성 오일이 수성-알코올 용액으로 전환되는 적어도 1회의 비누화 단계, 클로로-1-부탄과 같은 유기 용매를 이용한 수성-알코올 용액의 역류 추출 단계, 공동 생산된 스테롤 및/또는 트리테르펜 알코올의 결정화 및 최종적으로 증류에 의한 스쿠알렌의 단리 단계를 포함하는, 식물성 오일로부터 감화불가능한 물질을 추출하는 방법이 청구된다.

바람직하게, 처리된 식물성 오일은 아보카도 오일 또는 대두 오일이다.

국제특허출원 WO 제2010/004193호에서, 또한 식물로부터 시작하여, 유기 용매의 사용을 회피하기 위해, 예를 들어 스테롤, 비타민 E, 스쿠알렌 및 식물성 오일의 탈취로부터의 증류물로부터 기타 다른 탄화수소를 추출하는 것에 대해 전반적인 방법이 기재되어 있다.

유리 지방산의 에스테르화 후, 그 다음에 조합된 지방산(글리세라이드 및 스테라이드)의 동일한 "짧은" 알코올에 의한 에스테르교환, 3회의 연속적 증류는 탄화수소, 다음에 알킬 에스테르 및 최종적으로 가장 무거운 알킬 에스테르와 함께 스쿠알렌을 연속적으로 회수할 수 있게 한다.

따라서 제3 증류물은 스쿠알렌(제1 분획으로부터 단리될 것임)과 잔여 탄화수소의 제2 분획의 생성을 위한 역할을 한다.

제3 증류물로부터의 잔사는 스테롤 및 비타민 E의 생성을 위한 역할을 할 것이다.

그러므로 본 방법은 어떤 석유 유래의 용매 없이 4가지의 감화불가능 물질 각각을 추출하고, 자연적인 물리적 및 화학적 방법에 의해 얻어지는 생성물의 표지를 요구하는 것을 가능하게 한다.

그러나, 상기 주목한 바와 같이, 식물성 스쿠알렌의 이런 추출방법은 여전히 독성 용매의 사용 때문에 또는 매력적이지 않은 가격 때문에 산업적 규모로 추정하는 것이 어려운 방법이다.

사카로마이세스 세레비시애 유형의 미생물유기체에 의해 생성된 스쿠알렌의 정제를 위한 방법에 관해, 통상적으로 그것들은 용매 추출 방법을 사용한다.

세포 용해 후 회수된 지질에 대해 메탄올/클로로포름(2:1)을 이용한 제1 추출 단계 후에 크로마토그래피 단계가 수행된다.

그것에 대해, 예를 들어 문헌[BHATTACHARJEE and SINGHAL, World Journal of Microbiology and Biotechnology , 2003, 19-6, pp 605-608]의 논문에 기재된 바와 같은 유기 용매의 사용을 최소화하기 위해 초임계 CO₂를 이용한 추출이 종종 바람직하다.

또한 특히 식물성 유래의 스쿠알렌을 추출하기 위해 본 기술의 적용을 기재하는 수많은 논문 또는 특허가 있다(예컨대, 팜 오일 유래 일본특허출원 제2005/087998호 또는 올리브 오일 유래 미국특허출원 제2004/0015033호).

국제특허출원 WO 제94/026683호는 올리브 오일 잔사로부터 스쿠알렌을 생성하기 위한 방법 및 장치를 제시한다.

본 방법은 다음의 4단계, 즉 비누화, 크래킹, 지방산의 에스테르화 및 초임계 유체를 이용한 추출을 포함한다.

그러나, 초임계 유체를 이용한 추출을 위해, 사전에 금속 촉매를 이용한 에스테르화된 생성물이 사용되고, 그 다음에 이는 가변 온도를 지니는 구역을 구비한 고압 추출탑 내로 분사된다.

이들 방법 및 장치는 90% 초과의 순도를 지니는 시판가능한 스쿠알렌을 얻는 것을 가능하게 하지만, 매력적인 비용에서 산업적 규모로 추정하는 것은 어렵다.

매우 소수의 문헌은 미세조류에 의해 생성된 스쿠알렌을 정련하기 위한 바람직한 방법을 기재한다.

본 발명자들은, 예를 들어 문헌[Journal of Chromatography , 2003, 994, 37-43]에서 공개된 LU 등의 과학 논문을 찾을 수 있는데, 이는 트라우스토키트리움 ATCC 26185에 의해 생성된 스쿠알렌의 분취 분리 및 정제를 위한 고속 역류 크로마토그래피의 장점을 극찬한다.

이들 저자에 따르면, 이 기술은 더 통상적인 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)보다 훨씬 더 효율적인 방법을 제안하는 장점을 가지는데, 그것이 고체 지지체 없이 단일 액체/액체 크로마토그래피 분할을 제안하기 때문이다(따라서 상기 고체 지지체 상에서 비가역적 흡착에 의한 재료 손실이 없음).

그러나, 이 논문에서 상세하게 기재하는 바와 같이, 이 방법은 단지 연구실 규모에서 생각될 수 있고, 게다가 메탄올/클로로포름을 이용한 예비 추출 단계를 필요로 한다.

기술 상태에서, 초임계 유체를 이용한 추출에 대한 일부 예비 작업은 보트리오콕커스 브라우니(Botryococcus braunii), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus) 또는 토루라스포라 델브루키(Torulaspora delbrueckii)에 대해 착수되었다.

그러나, 추천된 작동 조건은 또한 산업적 규모로 옮기는 것이 어렵다.

본 출원인이 알고 있는 한도에서는, 초임계 유체 또는 분자 증류 유형 기술을 사용하여 미세조류로부터 생성된 스쿠알렌을 정련하는데 산업적 적용에 적합한, 실제로 당업자가 접근가능한 효율적인 방법은 없다.

미세조류에 의해 생성된 스쿠알렌을 정련하기 위한 효율적인 방법을 개발하기 위한 열망으로, 본 출원인은 자체 연구에 착수하였고, 초임계 유체를 이용하고 분자 증류에 의한 추출을 위한 기법에 적합하게 하는 것에 성공하여 95% 초과, 바람직하게는 97% 초과, 또는 심지어 대략 100%의 스쿠알렌 수준을 보장하였다.

이 순도 수준은 이렇게 얻은 스쿠알렌을 의학 분야에서 사용할 수 있게 할 뿐만 아니라 화장료 적용을 위해 스쿠알렌의 스쿠알란으로 용이한 수소화를 예상할 수 있게 한다.

그러므로 본 발명은 미생물유기체의 발효에 의해 생성된 스쿠알렌 함량이 높은 조성물의 제조방법에 관한 것이며, 이는 추출 환류를 이용한 역류에서 작동하는 다단 분별분리관 내 초임계 CO₂를 이용한 추출, 및 소위 "짧은 경로(short-path)" 분자 증류로 이루어진 군으로부터 선택되는 정제 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

미생물유기체는 바람직하게 트라우스토키트리알레스 과에 속하는 미세조류이며, 훨씬 더 바람직하게는 스키조키트리움, 아우란티오키트리움 및 트라우스토키트리움 종에 속하는 미세조류이다.

본 발명의 의미에서, "스쿠알렌 함량이 높은 조성물"은 스쿠알렌 함량이 95중량% 초과, 바람직하게는 97중량% 초과, 훨씬 더 바람직하게는 대략 100중량%를 갖는 조성물을 의미한다.

초임계 CO ₂ 를 이용한 2회 연속적 추출 단계의 실행.

본 발명에 따른 방법의 이런 제1 바람직한 실시형태에서, 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이 수행된다:

1) 트라우스토키트리알레스 과에 속하는 미세조류의 바이오매스를 준비하는 단계,

2) 바이오매스를 처리하여 적어도 10 중량%의 스쿠알렌, 바람직하게는 적어도 15 중량%의 스쿠알렌을 함유하는 조질의 오일을 얻는 단계,

3) 이렇게 얻은 조질의 오일을 추출 환류를 이용한 역류에서 작동하는 다단 분별분리관 내 초임계 압력에서 유체와의 접촉에 의해 분별하여 스쿠알렌 함량이 70% 내지 75%인 추출물 및 스쿠알렌이 1.5% 미만인 라피네이트를 생성하는 단계,

4) 이렇게 얻은 추출물을 단계 3)에서와 같은 추출 환류를 이용한 역류에서 작동하는 동일한 다단 분별분리관 내 초임계 압력에서 유체와 접촉시켜 95중량% 내지 99중량%의 스쿠알렌 함량을 얻는 단계,

5) 이렇게 얻은 스쿠알렌 조성물을 수집하는 단계.

이런 제1의 바람직한 실시형태의 제1 단계는 트라우스토키트리알레스 과에 속하는 미세조류의 바이오매스를 준비하는 단계로 이루어진다.

트라우스토키트리알레스 과에 속하는 미세조류로서, 예를 들어 다음의 상업적 균주가 이용가능하다:

- 스키조키트리움(ATCC 20888 참조),

- 아우란티오키트리움(ATCC PRA 276 참조).

게다가, 본 출원인은 또한 프랑스에서 No. CNCM I-4469 하에 파스퇴르연구소(Institut Pasteur)의 [미생물유기체 배양물의 국립협회(National Collection of Cultures of Microorganisms)]에 2011년 4월 14일에 기탁되고, 또한 중국에서 중국화인민공화국 No. M 209118 하에 우한 430072에 소재한 우한 유니버시티의 중국 균주 보존 기관(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION)에 기탁된 스키조키트리움을 자체 생성 균주로 가진다.

종속영양 조건에서 배양을 수행한다. 대체로, 배양 단계는 균주를 되살리기 위한 사전배양 단계, 그 다음에 배양 단계 또는 적절한 발효 단계를 포함한다. 이 최종 언급한 단계는 관심 대상의 지질 화합물의 생성 단계에 대응한다.

이들 미세조류의 배양 조건은 해당 분야에 잘 공지되어 있다.

예를 들어, 문헌[New Biotechnology , 2010, 27-4, pp 382-389]에서의 G. CHEN의 논문에서, 다음의 연속적 단계를 포함하는 방법이 발견된다:

- 글루코스, 글루탐산 모노나트륨, 효모 추출물 및 다양한 미량원소를 포함하는 한천 영양 배지 상에서 유지한 균주로부터 시작하는 단계,

- pH 6, 25℃의 온도에서 오비탈 교반기 상의 삼각 플라스크에서 사전배양을 수행하여 되살린 바이오매스를 얻는 단계,

- 다른 일련의 삼각 플라스크에, 사전배양에서 사용한 것과 동일한 배양 배지와 함께, 선행 단계에서 얻은 바이오매스 약 0.5%(v/v)를 씨딩하고, 25℃에서 온도를 유지하는 단계.

이런 제1의 바람직한 실시형태의 제2 단계는 바이오매스를 처리하여 적어도 10중량%의 스쿠알렌, 바람직하게는 적어도 15중량%의 스쿠알렌을 함유하는 조질의 오일을 얻는 단계로 이루어진다.

이들 처리는 나아가 당업자에 의해 공지된 어떤 방법에 의해 수행될 수 있고, 적어도 10중량%의 스쿠알렌 함량은 상기 기재한 균주 CNCM I-4469로부터 얻을 수 있다.

이하에 제공하는 실시예에서 기재할 바와 같이, 본 출원인은 하기 단계를 추천한다:

- 탈염수를 이용하여 바이오매스를 건조물질 함량 6% 내지 12%, 바람직하게는 건조물질 함량 10% 내지 12%로 조절하는 단계,

- 이렇게 얻은 바이오매스를 알칼라제 유형의 효소를 사용하여 처리하여 상기 미세조류의 세포벽을 파괴하는 단계,

- 5%(v/v) 초과, 바람직하게는 약 10%(v/v)에서 (수중유 에멀전의 형태로) 반응 혼합물에 에탄올을 첨가하는 단계,

- 이렇게 얻은 반응 혼합물을 원심분리시켜 수성상으로부터 오일을 분리시키는 단계,

- 스쿠알렌이 풍부한 유성의 상부 상을 회수하는 단계.

이 농축물은 스쿠알렌 함량이 적어도 10중량%, 바람직하게는 적어도 15중량%인 것으로 이해된다.

이런 제1의 바람직한 실시형태의 제3 단계는 이렇게 얻은 조질의 오일을 추출 환류를 이용한 역류에서 작동하는 다단 분별분리관 내 초임계 압력에서 유체와 접촉에 의해 분별하여 스쿠알렌 함량이 70% 내지 75%인 추출물 및 스쿠알렌이 1.5% 미만인 라피네이트를 생성하는 단계로 이루어진다.

본 출원인이 알고 있는 한도에서, 추출 환류를 이용한 역류에서 작동하는 다단 분별분리관을 사용하는 스쿠알렌의 이런 특정 추출 형태는 일반적으로 미생물유기체의 발효에 의해 생성된 스쿠알렌에 대해, 및 특히 트라우스토키트리알레스 과에 속하는 미세조류 유형의 미생물유기체에 대해 결코 활용된 적이 없었다.

따라서 본 출원인은 초임계 압력에서 이산화탄소 중에서 오일의 지질을 구성하는 트리글리세라이드와 스쿠알렌(비극성 탄화수소) 간의 큰 용해도 차이(스쿠알렌은 트리글리세라이드보다 훨씬 더 가용성임)를 이용하였다.

이 목적을 위해, 본 출원인은 추출 환류를 이용한 역류에서 작동하는 다단 분별분리관의 사용을 발견하였으며(칼럼은 규칙 충전물(structured packing)을 구비하였음), 이는 예상치 못하게 출발 오일에 비해 우수한 수율로 고순도의 스쿠알렌을 획득할 수 있게 하였다.

당업자는 초임계 압력에서 유체를 이용한 추출이 매우 고품질의 추출물을 야기한다는 것을 안다.

초임계 압력에서 유체를 사용하는 방법의 주된 이점 중 하나는 수많은 간행물에서 그리고 프랑스 특허 제2584618호에서 특정의 중요한 실행 양태에 대해 기재된 바와 같이 용매(유체)와, 추출물 및 용질간의 분리를 수행하는 것의 용이함이다.

초임계 유체의 기타 다른 중요한 이점 중 하나는 혼합물의 성분에 대한 그것의 "융통성 있는" 선택성이다.

이 매우 높은 선택성은 초임계 유치의 특정 특성, 및 특히 초임계 압력에서 이산화탄소의 특성과 관련되며, 용해력(solvent power)은 유체의 압력 및 온도를 변화시킴으로써 정교하게 제어될 수 있다.

본 출원인은 "온화한" 조건이 가장 선택적이라는 것을 확인하였는데, 이는 용매가 자체의 용해력이 감소됨에 따라 점점 더 선택적으로 되기 때문이다.

따라서, 본 출원인은 용매의 용매력을 증가시키는 공용매를 첨가하기보다는 바람직하게는 순수한 이산화탄소를 사용하는 것을 추천한다.

게다가, 10 MPa 내지 50 MPa, 바람직하게는 15 MPa 내지 25 MPa의 작동 압력, 및 40℃ 내지 80℃의 온도가 선택된다.

초임계 압력에서 유체는 펌프에 의해 고압에서 펌핑되고, 열 교환기에서 원하는 온도로 상승된 후 일정하게 유지된 유속으로 칼럼의 하부에 주입되고, 질량 유량계 상에 디스플레이된다.

공급물은 부문 1과 2, 또는 2와 3, 또는 3과 4 사이에 규칙 충전물을 지니는 칼럼의 중간에서 고압 펌프를 통해 주입되고, 일정하게 유지된 유속에서 칼럼의 하부로부터 계측되며, 질량 유량계 상에 디스플레이된다.

추출물이 가득한 유체는 칼럼의 상부에서 이탈하며, 그 다음에 유체의 압력이 6 MPa로 부분적으로 줄어들고, 특히 직렬로 장착된 사이클론 분리기를 포함하는 몇몇 분리 단계로 보내지며, 사이클론 분리기의 몸체는 재킷 내 물의 순환에 의해 가열된다.

액체 추출물은 이들 분리기의 하부에서 회수되는 반면, 그 다음에 기체 상태의 유체는 통상적으로 0℃ 내지 5℃로 냉각시킨 응축기에서 응축, 외부 저장 탱크로부터의 신선한 유체를 이용한 공급에 의해 액체 수준이 일정하게 유지되는 완충 플라스크 내 중간체 저장, 고압에서 펌핑 및 원하는 온도로 가열하는 것으로 재순환된다.

라피네이트는 레벨 센서에 의해 제어된 확장 밸브를 통해 칼럼의 하부에서 회수되고, 따라서 칼럼의 더 낮은 부분에서 오일-유체 계면을 유지하며, 칼럼 내 분별에 유해한 압력 동요를 회피하기 위해, 이 라피네이트는 직렬인 2개의 침강 탱크에서 수집되고, 처음의 압력은 칼럼에서 우세한 압력 보다 낮은 약 1 MPa 내지 4 MPa 미만의 값으로 유지된다.

따라서 이들 탱크는 라피네이트 중에 용해된 유체의 최소 손실에 의한 동요 없이 라피네이트를 회수한다.

본 출원인에 의해 나타내어진 바와 같이, 분리하는 유체와 액체 공급물 사이의 다단 역류 접촉의 사용은 사용한 유체의 이런 선택성을 최상으로 이용할 수 있게 한다.

게다가, 추출 환류는 분별 작동의 전반적인 선택성에서의 개선에 대해 주목할 만한 기여를 한다.

여기서 추출 환류가 만들어지며, 칼럼의 직경이 한편으로는 공급물과 접촉되는 유체와 다른 한편으로는 몇몇 독립적 부문으로 분할되는 재킷에서 순환하는 뜨거운 물 간의 벽에 양호한 열 전달을 가능하게 할 때, 칼럼에 따른 열 구배를 설정함으로써 조심해서 제어하여 이 구배가 적용되게 한다.

사실, 임계 압력(즉, 7.4 MPa) 내지 30 MPa의 범위에 있는 구역에서 고정된 초임계 압력에서 이산화탄소 중 대부분의 유기 화합물의 용해도는, 온도가 증가될 때 감소되며, 따라서 유체가 오일과 함께 역류에서 칼럼에서 상승할 때, 유체는 가열될 수 있고, 따라서 추출물 일부의 탈혼합 및 오일과 혼합된 유체의 환류를 야기한다.

200 mm 초과 직경을 지니는 칼럼이 사용된다면, 벽으로의 열 전달은 불충분하게 되며, 외부 추출물 환류를 사용하는 것이 바람직하고, 추출물의 일부는 칼럼을 이탈한 유체의 부분적 감압에 의해 칼럼의 상부에서 분리되며, 그 다음에 액체 추출물의 이런 분획은 펌프에 의해 재압축되고, 칼럼 상부에서 주입된다.

게다가, 초임계 압력에서 유체는 액체의 열 및 물질 이동보다 훨씬 더 양호한 우수한 열 및 물질 이동의 특성을 가지는데, 이는 관찰된 우수한 선택성에 기여한다.

이런 제1의 바람직한 실시형태의 제4 단계는 이렇게 얻어진 추출물을 단계 3)에서와 같이 추출 환류를 이용한 역류에서 작동하는 다단 분별분리관 내 초임계 압력에서 유체와 접촉시켜 95중량% 내지 99중량%의 스쿠알렌 함량을 얻는 단계로 이루어진다.

스쿠알렌 풍부화의 이런 단계는 선행 단계의 조건과 유사한 조건에서 수행되지만, 압력 및 온도 조건은 약간 상이하다.

따라서, 작동 압력은 10 MPa 내지 30 MPa, 여기서 바람직하게는 10 MPa 내지 20 MPa에서 선택되며, 온도는 40℃ 내지 80℃에서 선택된다.

이런 제1의 바람직한 실시형태의 제5 단계는 최종적으로 이렇게 얻은 스쿠알렌 조성물을 수집하는 단계로 이루어진다.

이하에 제공되는 실시예에서 설명할 바와 같이, 이렇게 정제된 조성물은 스쿠알렌 함량이 97% 이상일 수 있다.

분자 증류의 적용

본 발명에 따른 방법의 제2의 바람직한 실시형태에서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이 수행된다:

1) 트라우스토키트리알레스 과에 속하는 미세조류의 바이오매스를 준비하는 단계,

2) 바이오매스를 처리하여 적어도 10중량%의 스쿠알렌, 바람직하게는 적어도 15중량%의 스쿠알렌을 함유하는 조질의 오일을 얻는 단계,

3) 선택적으로 이렇게 얻은 조질의 오일을 탈검, 탈산, 표백 및 탈취 단계의 순서에 의해 정련하는 단계,

4) 소위 "짧은 경로" 분자 증류에 의해 스쿠알렌을 추출하여 60중량% 초과, 바람직하게는 80중량% 초과의 스쿠알렌 함량을 갖는 가벼운 분획을 얻는 단계,

5) 이 가벼운 분획을 비누화, 2상 분리, 세척, 표백 및 탈취 단계의 순서에 의해 정련하여, 스쿠알렌 함량이 95% 내지 100%인 라피네이트를 얻는 단계,

6) 이렇게 얻은 스쿠알렌 조성물을 수집하는 단계.

본 발명에 따른 방법의 이런 제2의 바람직한 실시형태의 제1 및 제2 단계는 상기 제시한 제1의 바람직한 실시형태의 제1 및 제2 단계와 동일하다.

이렇게 얻은 조질의 오일은 글리세라이드(대부분 트리글리세라이드), 감화불가능 물질(대부분 스쿠알렌) 및 선택적으로 부수적 비율의 유리 지방산 및 인지질로 이루어진다.

이 조질의 오일은 분자 증류에 의한 스쿠알렌의 추출 전 거친 정련 단계를 거칠 수 있다.

다음의 단계 중 하나 이상이 고려될 수 있다:

- 탈검: 산 배지 중에서 침전에 의해 인지질의 제거를 가능하게 함;

- 탈산: 염기의 사용에 의해 유리 지방산의 중화를 제공함;

- 표백: 통상적으로 활성탄을 이용하여 수행됨;

- 탈취: 진공 증류, 소위 증기 "스트리핑"에 의함.

이들 정련 단계는 식물성 오일의 정련에서 흔히 사용되는 단계이다.

본 발명에 따른 방법의 이런 제2의 바람직한 실시형태의 제4 단계는 소위 "짧은 경로" 분자 증류에 의해 스쿠알렌을 추출하여 스쿠알렌 함량이 60중량% 초과, 바람직하게는 80중량% 초과인 가벼운 분획을 얻는 단계로 이루어진다.

선택적으로 정련된 조질의 오일의 스쿠알렌은 분자 증류에 의해 추출된다.

0.1 mbar 미만인 고진공을 위해, 스쿠알렌의 비등점은 대략 200℃다.

이런 고진공은 온도를 제한하는 것을 가능하게 하고, 따라서 스쿠알렌의 분해/중합의 위험을 제한한다.

게다가, 체류시간은 1분 미만으로 매우 짧게 유지된다.

이런 압력-온도-접촉 시간 계획에서, 트리글리세라이드 분획(고분자량)은 휘발성이 아니다.

따라서, 본 출원인은 이들 조건에서 소위 "짧은 경로" 분자 증류가 대부분 트리글리세라이드 및 스쿠알렌인 이들 2가지의 분획을 분리하는데 특히 적합한 기술이라는 것을 발견하였다.

본 출원인에 의해 추천되는 작동 조건은 다음과 같다.

질소 삽입 공급 탱크로부터, 오일은 25℃ 내지 100℃ 범위에서 자동온도 조절이 있는 제1 서킷(circuit)을 통해 탈기기로 펌핑된다(미량의 물 및 용매의 제거).

탈기기 배출구에서, 오일은 50℃ 내지 150℃의 온도 범위에서 자동온도 조절이 있는 서킷을 통해 ("짧은 경로") 증발 챔버로 펌핑된다.

증발기의 온도는 150℃ 내지 250℃의 범위에서 조절된다.

응축기는 0℃ 내지 50℃의 온도 범위에서 제어된다.

증발 챔버에서 압력은 10^-2 mbar 내지 10^-4 mbar의 범위에서 조절된다.

대부분 스쿠알렌을 함유하는 증류물 및 대부분 트리글리세라이드를 함유하는 잔사는 삽입된 저장 탱크로 수집 순환을 통해 전달된다.

증류물의 가벼운 분획 중에서의 스쿠알렌 함량은 60중량% 초과, 바람직하게는 80중량% 초과이다.

본 발명에 따른 방법의 이런 제2의 바람직한 실시형태의 제5 단계는 이 가벼운 분획을 비누화, 2상 분리, 세척, 표백 및 탈취 단계의 순서에 의해 정련하여, 스쿠알렌 함량이 95% 내지 100%인 라피네이트를 얻는 단계로 이루어진다.

증류 동안 가능하게 비말 동반된 잔여 글리세라이드를 가수분해할 뿐만 아니라 에스테르화된 스테롤을 가수분해하기 위해 비누화는 사전에 수행된다.

그 다음에 유리 형태인(더 극성임) 에스테르화된 스테롤은 다음 단계 동안 더 용이하게 제거될 것이다.

비누화는 약 80℃의 온도에서 0.5시간 내지 2시간의 시간 동안 에탄올성 칼리(potash)를 이용하여 수행된다.

냉각시킨 후, 비누화로부터 생성된 2상의 혼합물은 그 다음에 디캔팅 또는 원심분리에 의해 분리될 수 있다.

에멀전화는 분리를 더 복잡하게 만들 가능성이 있으며, 그 다음에 물을 첨가하는 것은 분리를 용이하게 할 수 있다.

에탄올성 상은 유리 지방산뿐만 아니라 일부의 생성된 극성 불순물을 농축시킨다. 유성상은 스쿠알렌을 농축시킨다.

비누화가 물에 의해 세척된 후 스쿠알렌 상은 분리된다.

몇몇 연속적 세척이 수행될 수 있다.

제1 세척 주기(들) 동안 잔여 비누화 불순물을 비말 동반하기 위해 염기성 물(칼리 또는 소다로 처리함)이 사용될 수 있다.

세척은 물을 이용한 세척으로부터의 상청액이 중성 pH에 있을 때 완료된다.

각 주기 간에, 상들(세척수와 스쿠알렌)은 디캔팅 또는 원심분리에 의해 분리된다.

이 단계에서, 스쿠알렌 분획은 일부 스테롤뿐만 아니라 잔여 글리세라이드(모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드)로부터 정제된다.

추가적인 표백 단계는 노르스름한 착색을 감소시키기 위해 이 단계에서 수행될 수 있다.

이 표백 단계는 식물성 오일 정련에서 통상적으로 사용되는 표백과 유사하게 활성탄 상에서 수행된다.

스쿠알렌 분획의 정련은 탈취 단계로 종결된다.

탈취는 0.5시간 내지 1시간의 시간 동안 진공 하에 뜨거운(150℃ 내지 200℃) 증기 "스트리핑"에 의해 수행된다.

이렇게 정제된 스쿠알렌은 제어된 분위기 하에(이상적으로는 질소에 의해 비활성화됨) 저장된다.

항산화제의 첨가는 이 분획의 안정화를 위해 바람직할 수 있다.

본 발명은 또한 화장료, 제약 및 의학 분야에서 본 발명에 따른 방법을 수행함으로써 얻어진 스쿠알렌 조성물의 사용에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 방법을 수행함으로써 얻어진 고순도 스쿠알렌 조성물의 수소화에 의한 스쿠알란이 풍부한 조성물의 제조방법뿐만 아니라 화장료 분야에서 본 스쿠알란 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 이하에 제공된 실시예로부터 더 양호하게 이해될 것이며, 이는 예시의 목적을 위해 공급되고, 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1. 20리터 발효기에서 트라우스토키트리알레스 과에 속하는 미세조류의 발효에 의한 적어도 10 중량%의 스쿠알렌을 함유하는 오일의 제조

본 실시예는 본 출원인이 소유하는 미세조류 스키조키트리움(프랑스에서 No. CNCM I-4469 하에 파스퇴르연구소의 [미생물유기체 배양물의 국립협회]에 2011년 4월 14일에 기탁됨)의 발효에 의해 생성된 스쿠알렌이 풍부한 오일을 추출하기 위한 방법을 예시한다.

20리터 반응기에서 적절한 배양/생성 단계 전에 2가지의 연속적 예비 사전배양 단계에서 발효를 수행하였다.

이들 실험을 위해, 제1 사전배양 배지에서 비타민의 첨가를 제공하였지만, 제2 사전배양 배지에서 및 생성에서는 선택적이었다.

그 다음에 사전배양 배지는 다음의 표 I 및 표 II에서 제시한 조성물을 가졌다.

[표 I]

[표 II]

대체로, Clerol "FBA3107" 소포제를 1 ml/l로 사용하였다. 선택적으로, 50 mg/l의 페니실린 G "나트륨 염"을 사용하여 오염 박테리아의 성장을 방지하였다.

배지의 나머지와 별개로 글루코스를 KH₂PO₄를 이용하여 멸균시켰고, 따라서 침전물(암모늄-포스페이트-마그네슘)의 형성을 회피하였다. 멸균 여과시킨 후 비타민의 혼합물 및 미량원소를 첨가하였다. 배양/생성 배지의 조성이 이하의 표 III에 제공되어 있다.

[표 III]

비타민의 혼합물과 미량원소의 조성을 다음의 표 IV 및 표 V에 제공되어 있다.

[표 IV]

[표 V]

사전배양 조건

제1 사전배양을 배플(baffle)을 구비한 500 ml 삼각 플라스크에서 수행하였고, 이것에 COGNIS GmbH Dueseldorf 사에 의해 시판되는 CLEAROL FBA 3107 소포제 한 방울을 첨가하였다.

배양 배지를 그것의 구성성분의 완전한 용해 후 여과시켰고, 선택적으로 0.25 mg/l의 속도로 페니실린 G "나트륨 염"을 보충하였다.

페트리 접시에서 배양시킨 미세조류의 콜로니를 취함으로써 접종을 수행하였다(1회 10 ㎕ 루프의 속도로).

28℃의 온도에서 100 rpm에서 교반하면서(오비탈 교반기 상에서) 24시간 내지 36시간 접종하였다.

바이오매스를 디캔트함에 따라(또는 벽에 부착함에 따라), 본 발명자들은 삼각 플라스크를 잘 교반시킨 후 3 ml 내지 5 ml를 조심스럽게 취하였다.

제2 사전배양을 위해, 배플 및 배관을 구비한 2리터 삼각 플라스크를 사용하였다.

한 방울의 소포제 및 효모 추출물을 100 ml의 물에 첨가하였다.

배지의 모든 구성성분을 300 ml의 탈염수 중에 용해시킨 후, 여과시켰다. 페니실린 G "나트륨 염"을 선택적으로 첨가할 수 있었고, 사전에 삼각 플라스크에서 멸균 전에 한 방울의 소포제를 첨가할 수 있었다.

그 다음에 제1 사전배양물 3 ml 내지 5 ml로 씨딩을 수행하였다.

28℃에서 추가 24시간 내지 36시간 동안, 100 rpm에서 교반시킨면서 인큐베이션을 수행하였다.

20리터 반응기에서의 생성

20리터 반응기에서 다음과 같이 적절한 배양을 수행하였다.

- 침전물의 형성을 회피하기 위해 반응기에서 일부분에 대해, 그리고 별개로 나머지 부분에 대해 배지를 멸균화,

- 0.5% v/v의 속도로 배양 배지의 제2 사전배양 후에 생성된 바이오매스로 씨딩 수행,

- 30℃에서 배양을 유지함.

- 산소의 이동 속도를 35mmol/l/h 내지 40mmol/l/h로 고정시킴,

- 0.2 VVM 내지 0.3 VVM에서 통기,

- 초기 pH > 5.5,

- 글루코스 농도를 15 g/l 내지 70 g/l로 유지하기 위해, 일단 농도가 20%보다 크면 글루코스를 공급.

다음의 표 IV는 본 출원인의 스키조키트리움에 의해 얻은 결과를 나타낸다.

[표 IV]

바이오매스 회수

바이오매스를 발효기로부터 제거하였고, 바이오매스의 원심분리(5000 g에서 5분) 및 희석(1/3 V펠렛/V물의 속도로)에 의해 일련의 2 농도 연속으로 사이의 가용성 물질로부터 세척하였다.

전체 조질의 건조 물질에 대한 건조 세포 농도는 95%이다.

그 다음에 건조 물질은 증류수를 이용하여 12%로 조절된다.

스쿠알렌이 풍부한 조질 오일의 획득

세척한 바이오매스를 마린 프로펠러 및 배플을 구비한 2리터 발효기 유형의 실험실 반응기(예컨대 Interscience 사에 의해 시판되는 것)에서 교반시킨다.

이 시스템은 생성된 세포 용해물의 에멀전화를 제한할 수 있게 하는 한편, 용해효소의 작용에 필수적인 양호한 혼합을 허용한다.

온도를 60℃로 조절하고, pH는 소다를 이용하여 약 8로 제어한다.

이들 조건은 1%/s 수준으로 첨가한 알칼라제(Alcalase) 효소(Novozymes)의 활성에 대해 최적이다.

용해 시간을 4시간으로 고정한다.

용해 후, 10%의 에탄올(V_에탄올/V_용해물)을 반응 혼합물(수중유 에멀전)에 첨가하고, 이를 추가 15분 동안 교반시킨다.

용해물을 12000 g에서 5분 동안 원심분리시킨다. 따라서 표면에서 상분리된 스쿠알렌을 함유하는 오일을 추출한다.

실시예 2: 1 m ³ 발효기에서 트라우스토키트리알레스 과에 속하는 미세조류의 발효에 의해 적어도 10중량%의 스쿠알렌을 함유하는 오일의 제조

1 m³ 발효기에서 수행한 생성으로부터 시작하여(실시예 1에서의 조건과 유사한 발효 조건), Flottweg S3E Sedicanteur(청징기)를 공급하는 SEEPEX 용적형 펌프에 의해 바이오매스를 발효기로부터 추출한다.

이 방법에서, 바이오매스를 200 g/l로 농축시킨다.

탈탄산수를 지니는 1 m³ 탱크에서 농축물을 희석시키고(1 물의 용적/농축물의 용적), 그 다음에 앞서 기재한 것과 동일한 작업에 의해 다시 농축시켜 620 kg의 바이오매스를 얻어서 세척하고, 110 g/l로 농축시킨다.

바이오매스를 1 m³ 탱크 내 150 rpm에서 교반시키고, 60℃로 가열한다.

그 다음에 45% 칼리를 이용하여 pH를 8로 조절한다.

NOVO 제의 효소 알칼라제 2.4 L FG를 1%(/건조 바이오매스) 수준으로 첨가한다. 용해 파라미터를 6시간 동안 유지한다.

용해 품질을 광학현미경으로 및 샘플의 원심분리(2분, 10000 g)에 의해 모니터링한다.

용해 후, 60 l의 에탄올(~10% 용적/용적)을 교반시키면서 60℃에서 유지한 탱크에 첨가한다.

실시예 1과 동일한 방법에서, 그 다음에 온도를 다시 80℃로 상승시킨 다음, 3개의 배출구를 지니는 농축기 모드로 구성된 ALPHA LAVAL CLARA 20 원심분리 유닛 상에서 원심분리를 수행한다.

이 구성은 고체/액체/액체 유형의 3상 혼합물의 분리에 특히 적합하다.

9600 rev/분에서의 회전은 약 10 000 g에 도달할 수 있게 한다.

세포 용해물의 공급물은 100 l/h 내지 400 l/h의 유속에서 용적형 펌프를 사용하여 제공된다.

무거운 상과 가벼운 상 간의 계면은 무거운 상 배출구에서 역압을 제어함으로써 대체된다.

자동 슬라임제거(auto-desliming)의 빈도를 2분 내지 15분의 빈도로 조절한다.

따라서 스쿠알렌이 풍부한 조질의 오일 13 kg을 50% 초과의 수율로 회수한다.

실시예 3: 분자 증류에 의한 스쿠알렌의 추출

21.8%의 스쿠알렌을 함유하는 조질의 오일을 실시예 2에 따라 제조한 미세조류의 바이오매스로부터의 추출에 의해 얻는다.

질소 삽입된 공급 탱크로부터, 8 kg의 오일을 120℃의 온도에서 탈기기에 3.5 kg/h로 펌핑한다.

탈기기 배출구에서, 오일은 85℃에서 유지한 서킷을 통해 ("짧은 경로") 증발 챔버를 통과한다. 증발기의 온도를 220℃로 조절한다.

응축기를 20℃의 온도로 조절한다. 증발 챔버에서 최대 진공을 생성한다(< 10^-3 mbar).

스쿠알렌을 함유하는 증류물 및 트리글리세라이드를 함유하는 잔사를 비활성 저장 탱크로 수집 서킷을 통해 전달한다. 이 단계에서, 약 1.5 kg의 증류물 및 6 kg의 잔사를 회수한다.

증류물 중의 스쿠알렌 함량(NMR 분석에 기반한 중량 백분율)은 94%이다.

잔사의 스쿠알렌 함량은 2% 미만이다.

정련 작업 순서를 여기서 상기 기재한 바와 같은 분자 증류에 의해 추출한 10 g의 스쿠알렌 샘플로부터 시작하여 수행한다.

1/2(m_오일/m_{에탄올성 칼리})의 비를 유지하는 칼리(2 N)를 에탄올 용매(9/1(m_에탄올/m_물)의 비)와 함께 함유하는 배지에서 비누화 작업을 수행한다.

비누화 배지를 80℃에서 환류 하에 45분 동안 유지한다.

따라서 유리 지방산의 함량은 0.29로부터 3.1로 증가된다(g_{올레산 당량}/%g_오일).

이들 유리 지방산은 에스테르화된 스테롤의 가수분해로부터 부분적으로 유래된다.

부분적으로 에멀전화된 비누화 혼합물의 2상을 원심분리에 의해 분리시킨다(25000 g에서 10분).

추출한 유성상(스쿠알렌)에 소량의 칼리의 첨가와 함께 물로 세척한다(3/1(m_물/m_오일)의 비).

중성 pH에서 상청액이 얻어질 때까지 깨끗한 물로 세척을 반복한다.

25000 g에서 10분 동안 원심분리에 의해 각 세척 단계 간의 분리를 수행한다.

이 단계에서 7 g의 스쿠알렌을 70% 수율로 얻는다.

비누화에 의해 정제한 분획을 교반시키면서 활성탄(5%/오일)을 이용하여 표백시킨 다음, 활성탄을 0.2㎛에서 여과에 의해 분리시킨다.

탈취의 최종 단계를 180℃에서 진공 하에 30분 동안 증기 스트리핑에 의해 수행한다.

이렇게 얻은 정제한 스쿠알렌은 순도가 거의 98%이다.

NMR 분석의 분해능은 정확한 값의 순도가 얻어지게 하지는 않지만, 불순물의 제거 비율이 약 75%에서 평가되게 한다.

실시예 4. 초임계 CO ₂ 를 이용한 2 연속 추출 단계를 수행하는 것에 의한 스쿠알렌의 정련

이는 실시예 1 및 실시예 2와 가까운 작동 조건에서 10 m³ 발효기에서 배양시킨 스키조키트리움 조류로부터 생성된 15% 초과의 스쿠알렌을 함유하는 200리터의 오일을 사용하였다.

이 오일은 더 구체적으로 주로 하기 지방산을 지니는 트리글리세라이드를 함유하며:

- C14, C16 단쇄를 27%,

- C20 및 특히 C22 장쇄를 43%

게다가 이 다량의 감화불가능 물질은 본질적으로 스쿠알렌(~15.5%)으로 이루어진다.

본 목적은 한편으로는 95% 초과로 정제된 스쿠알렌을 얻는 것이고, 다른 한편으로는 스쿠알렌이 제거된 오일을 얻는 것이다.

그러므로 본 발명에 따라 사용한 분별방법은 따라서 하기와 같이 요약될 수 있는 2단계를 포함한다:

- 단계 1: 조질의 오일을 초임계 압력에서 유체와의 접촉에 의해 분별하여 스쿠알렌이 풍부한 추출물 및 스쿠알렌이 없는 라피네이트를 수득하는 단계;

- 단계 2: 초임계 압력에서 유체와의 접촉에 의해, 단계 1에서 얻은 추출물의 분별에 의해 스쿠알렌을 정제하는 단계.

이 분별은 오일의 지질을 구성하는 트리글리세라이드와 스쿠알렌(비극성 탄화수소) 간의 큰 용해도 차이(스쿠알렌은 트리글리세라이드보다 훨씬 더 가용성임)에 기반한다.

두 분별 단계를 내부 추출 환류를 이용한 역류에서 작동하는 충전 분별분리관에서 수행한다.

사용한 분별 유닛은 내부 직경이 125 mm이고, 높이가 8 m(2 m의 4개 부문에서 온도 구배를 설정하도록 함)인 역류 분별분리관을 구비한다.

이 칼럼은 고성능 충전물(Sulzer BX 유형)로 충전시킨다. 이 유닛은 완전히 자동화되며, 연속적 작업을 제공한다.

단계 1: 스쿠알렌을 추출하기 위한 조질의 오일의 처리

오일을 부문 3과 부문 4 사이의 칼럼에 공급하고 칼럼의 하부로부터 계측한다. 공정 파라미터는 다음의 표 V에 제시되어 있다.

[표 V]

따라서 스쿠알렌을 상대적으로 고농도로 추출물 중에서 회수한다.

조질 오일의 처리는 대부분의 스쿠알렌을 추출하는 것을 가능하게 하였다.

단계 2: 스쿠알렌의 정제:

스쿠알렌의 초임계 분별을 조질의 오일에 대해 사용한 조건과 유사하지만, 다음의 표 VI에 나타낸 바와 같은 압력 및 온도가 약간 상이한 조건에서 다시 한번 수행한다.

[표 V]

초임계 CO₂를 이용한 2 연속 추출 단계를 사용하는 이 방법은 스쿠알렌 함량이 97%인 조성물을 얻는 것을 보장할 수 있게 한다.

Claims (14)

1. 미생물유기체의 발효에 의해 생성된 스쿠알렌 함량이 높은 조성물의 제조방법으로서, 추출 환류를 이용한 역류에서 작동하는 다단 분별분리관 내 초임계 CO₂를 이용한 추출, 및 소위 "짧은 경로(short-path)" 분자 증류로 이루어진 군으로부터 선택되는 정제 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 미생물유기체는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales sp.) 과에 속하는 미세조류인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 트라우스토키트리알레스 과에 속하는 미세조류는 스키조키트리움(Schizochytrium sp .), 아우란티오키트리움(Aurantiochytrium sp.) 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium sp .) 종의 미세조류인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
   1) 트라우스토키트리알레스 과에 속하는 미세조류의 바이오매스를 준비하는 단계,
   2) 바이오매스를 처리하여 적어도 10 중량%의 스쿠알렌, 바람직하게는 적어도 15 중량%의 스쿠알렌을 함유하는 조질의 오일을 얻는 단계,
   3) 이렇게 얻은 조질의 오일을 추출 환류를 이용한 역류에서 작동하는 다단 분별분리관 내 초임계 압력에서 유체와의 접촉에 의해 분별하여 스쿠알렌 함량이 70% 내지 75%인 추출물 및 스쿠알렌이 1.5% 미만인 라피네이트를 생성하는 단계,
   4) 이렇게 얻은 추출물을 단계 3)에서와 같은 추출 환류를 이용한 역류에서 작동하는 동일한 다단 분별분리관 내 초임계 압력에서 유체와 접촉시켜 95중량% 내지 99중량%의 스쿠알렌 함량을 얻는 단계,
   5) 이렇게 얻은 스쿠알렌 조성물을 수집하는 단계.
5. 제4항에 있어서, 역류에서 작동하는 다단 분별분리관은 규칙 충전물(structured packing)을 지니는 칼럼인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 단계 3)에서 사용된 초임계 압력에서 유체는 10 MPa 내지 50 MPa, 바람직하게는 15 MPa 내지 25 MPa의 압력으로, 그리고 40℃ 내지 80℃의 온도로 상승되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 4)에서 사용된 초임계 압력에서 유체는 10 MPa 내지 30 MPa, 바람직하게는 10 MPa 내지 20 MPa의 압력으로, 그리고 40℃ 내지 80℃의 온도로 상승되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 초임계 압력에서 유체는 순수한 이산화탄소인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
   1) 트라우스토키트리알레스 과에 속하는 미세조류의 바이오매스를 준비하는 단계,
   2) 바이오매스를 처리하여 적어도 10중량%의 스쿠알렌, 바람직하게는 적어도 15중량%의 스쿠알렌을 함유하는 조질의 오일을 얻는 단계,
   3) 선택적으로 이렇게 얻은 조질의 오일을 탈검, 탈산, 표백 및 탈취 단계의 순서에 의해 정련하는 단계,
   4) 소위 "짧은 경로" 분자 증류에 의해 스쿠알렌을 추출하여 60중량% 초과, 바람직하게는 80중량% 초과의 스쿠알렌 함량을 갖는 가벼운 분획을 얻는 단계,
   5) 이 가벼운 분획을 비누화, 2상 분리, 세척, 표백 및 탈취 단계의 순서에 의해 정련하여, 스쿠알렌 함량이 95% 내지 100%인 라피네이트를 얻는 단계,
   6) 이렇게 얻은 스쿠알렌 조성물을 수집하는 단계.
10. 제9항에 있어서, 분자 증류의 단계 4)는 고진공 하에 0.1 mbar 미만의 값에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, "짧은 경로"는 1분 미만의 시간 동안 접촉하는 것을 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 화장료, 제약 및 의학 분야에서 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 의해 얻은 스쿠알렌 조성물의 용도.
13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항을 수행함으로써 얻은 고순도 스쿠알렌 조성물의 수소화에 의해 스쿠알란이 풍부한 조성물을 제조하는 방법.
14. 화장료 분야에서의 제13항의 스쿠알란 조성물의 용도.