KR20150004816A

KR20150004816A - 큰 표적화 벡터를 사용한 뉴클레아제-중재된 표적화

Info

Publication number: KR20150004816A
Application number: KR1020147030262A
Authority: KR
Inventors: 데이빗 프렌데웨이; 보이테크 아워바흐; 데이빗 엠. 발렌주엘라; 죠지 디. 얀코파울로스; 카-만 비너스 레이
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2013-04-25
Publication date: 2015-01-13
Also published as: CN104364380B; SG11201406547YA; WO2013163394A1; US20180037910A1; AU2013251558B2; HK1207396A1; MX2014012994A; JP2015514439A; EP2847335A1; EP2847335B1; KR101904508B1; SG10201702445TA; ES2683071T3; US20130309670A1; RU2645475C2; DK2847335T3; AU2013251558A1; US10301646B2; CN109536526A; CA2869016A1

Abstract

본 발명에서는 표적 게놈 유전자좌에서 또는 그 근처에서 단일 또는 이중-가닥 절단에 의해 용이해진 상동 재조합을 사용함으로써, 표적 게놈 유전자좌에서 하나 또는 그 이상의 표적화된 유전자 변형을 만들기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 또한 본 발명에서는 공학처리된 뉴클레아제를 사용하여 원핵 또는 진핵 세포에서 LTVEC와 표적 게놈 유전자좌 사이의 상동 재조합의 효율을 촉진하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

큰 표적화 벡터를 사용한 뉴클레아제-중재된 표적화{NUCLEASE-MEDIATED TARGETING WITH LARGE TARGETING VECTORS}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2012년 4월 25일에 출원된 미국 임시 출원 번호 61/638,267호의 우선권을 주장하며, 그것의 전체적인 내용은 본원에 참조로 포함된다.

기술분야

본 발명은 표적 게놈 유전자좌에서 상동 재조합을 이루기 위한, 표적화 벡터(예컨대 큰 표적화 벡터, "LTVEC")를 포함한 뉴클레아제 및 DNA 구성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 표적 게놈 유전자좌에서 또는 그 근처에서 단일 또는 이중-가닥 절단에 의해 용이해진 상동 재조합을 통하여 표적화된 유전자 변형을 만들기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 원핵 또는 진핵 세포에서 LTVEC와 표적 게놈 유전자좌 사이의 상동 재조합의 효율을 공학처리된 뉴클레아제를 사용하여 촉진하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

게놈 유전자좌에서 특별한 핵산 서열을 첨가, 결실 또는 대체하기 위해 특이하게 디자인된 표적화 벡터를 사용한 상동 재조합은 비-사람 동물에서 원하는 게놈 변형을 이루기 위한 대중적인 접근법이다. 표적 게놈 유전자좌에 또는 그 근처에 단일 또는 이중-가닥 절단을 도입하기 위해 특이하게 공학처리된 뉴클레아제는 표적화 벡터와 함께 사용될 수 있어서 표적 게놈 유전자좌에서의 상동 재조합의 효율을 증대시킬 수 있다.

지나간 20여년에 걸쳐 상동 재조합을 통한 게놈 변형의 기술분야는 상당히 진전되었지만, 매우 큰 표적화 벡터, LTVEC를 사용하여 허용되는 표적화 빈도를 이루는 것에 있어서는 많은 상황에서, 예를 들면 큰 부분의 설치류 게놈이 사람 게놈의 큰 단편으로 대체될 때 여전히 많은 어려움이 남아있거나, 또는 특정 세포 유형, 예를 들면 섬유아세포 또는 다른 체세포를 표적화하는 데에 어려움이 많이 있다. 따라서 LTVEC를 사용하여 진핵 게놈의 큰 게놈 유전자좌를 변형시키기 위한 추가의 개선된 방법에 대한 요구가 기술분야에 존재한다.

본 발명에는 관심의 게놈 유전자좌에서 큰 핵산 서열의 효과적인 결실, 첨가(예컨대 삽입) 및/또는 대체를 허용하는, 뉴클레아제 제제와 함께 큰 표적화 벡터(LTVEC)를 사용하여 관심의 게놈 유전자좌를 변형시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

본 발명에는 박테리아의 상동 재조합(BHR)을 통하여 LTVEC와 뉴클레아제 제제를 사용하여 원핵 세포에서 포유류의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키기 위한 조성물 및 방법이 제공되는데, 이때 BHR은 뉴클레아제 제제에 의해 생성된 표적 게놈 유전자좌에서 또는 그 근처에서 단일 또는 이중-가닥 절단에 의해 용이해진다. 원핵 세포는 발현될 때 표적 부위에 또는 그 근처에 단일 또는 이중-가닥 절단을 도입할 수 있는 뉴클레아제 제제와 LTVEC를 포함한 채로 제공된다. 본 발명에는 본원에 기술된 것과 같이 다양한 LTVEC와 뉴클레아제를 사용함으로써 재조합성 원핵 세포에서 비-사람 동물의 큰 게놈 유전자좌를 외인성 핵산 서열, 예를 들면 상동성 또는 이종상동성 사람 게놈 핵산 서열로 대체하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

본 발명에는 다양한 다능성 포유류 세포에서 LTVEC와 뉴클레아제 제제를 사용하여 관심의 게놈 유전자좌를 변형시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 또한 본 발명에는 본원에 기술된 것과 같이 다양한 LTVEC와 뉴클레아제를 사용함으로써 비-사람 동물의 다능 세포에서 비-사람 동물의 큰 게놈 유전자좌를 외인성 핵산 서열로 대체하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

비-사람 동물의 다능 세포는 본원에 기술된 다양한 LTVEC와 뉴클레아제 제제를 포함한 채로 제공된다.

본 발명에는 본원에 기술된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 표적화된 유전자 변형을 포함하는 유전자 변형된 비-사람 동물을 제조하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

한 측면으로, 본 발명에는 표적 유전자좌에 대해 지시된 상동성 아암 및 표적 유전자좌에서 또는 그 근처에서 단일- 또는 이중-가닥 절단을 만드는 뉴클레아제 제제를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 큰 표적화 벡터(LTVEC)를 포함하는 원핵 세포가 제공된다.

한 구체예에서, 원핵 세포는 박테리아 상동 재조합(BHR)을 중재하는 재조합효소를 발현할 수 있다. 한 구체예에서, 원핵 세포는 대장균의 재조합-경합 균주이다.

한 구체예에서, LTVEC는 약 50kb 내지 약 300kb 범위에 있다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 50kb 내지 약 75kb이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 75kb 내지 약 100kb이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 100kb 내지 약 125kb이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 125kb 내지 약 150kb이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 150kb 내지 약 175kb이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 175kb 내지 약 200kb이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 200kb 내지 약 225kb이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 225kb 내지 약 250kb이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 250kb 내지 약 275kb이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 275kb 내지 약 300kb이다.

한 구체예에서, 표적화 벡터의 상동성 아암은 BAC 라이브러리, 코스미드 라이브러리 또는 P1 파지 라이브러리로부터 유도된다. 한 구체예에서, 상동성 아암은 종래 방법을 사용하여 단편화될 수 없는 비-사람 동물의 게놈 유전자좌로부터 유도된다. 한 구체예에서, 상동성 아암은 합성 DNA로부터 유도된다.

한 구체예에서, 상류 상동성 아암과 하류 상동성 아암의 총 합은 적어도 10kb이다. 한 구체예에서, 상류 상동성 아암의 범위는 약 5kb부터 약 100kb까지이다. 한 구체예에서, 하류 상동성 아암의 범위는 약 5kb부터 약 100kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 5kb부터 약 10kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 10kb부터 약 20kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 20kb부터 약 30kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 30kb부터 약 40kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 40kb부터 약 50kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 50kb부터 약 60kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 60kb부터 약 70kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 70kb부터 약 80kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 80kb부터 약 90kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 90kb부터 약 100kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 100kb부터 약 110kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 110kb부터 약 120kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 120kb부터 약 130kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 130kb부터 약 140kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 140kb부터 약 150kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 150kb부터 약 160kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 160kb부터 약 170kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 170kb부터 약 180kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 180kb부터 약 190kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 190kb부터 약 200kb까지이다.

한 구체예에서, LTVEC는 선택 카세트를 포함한다. 한 구체예에서, 선택 카세트는 선택 마커를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는데, 그 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 프로모터는 원핵 세포에서 활성이다. 한 구체예에서, 프로모터는 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 활성이다. 한 구체예에서, 선택 마커는 네오마이신 포스포트란스페라제(neo^r), 하이그로마이신 B 포스포트란스페라제(hyg^r), 퓨로마이신-N-아세틸트란스페라제(puro^r), 블라스티시딘 S 탈아민효소(bsr^r), 크산틴/구아닌 포스포리보실 트란스페라제(gpt) 및 단순 포진 바이러스 싸이미딘 키나제(HSV-k) 및 그것들의 조합으로부터 선택된다.

한 구체예에서, LTVEC는 약 5kb 내지 약 200kb 범위의 삽입물 핵산을 포함한다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 5kb부터 약 10kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 10kb부터 약 20kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 20kb부터 약 30kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 30kb부터 약 40kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 40kb부터 약 50kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 60kb부터 약 70kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 80kb부터 약 90kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 90kb부터 약 100kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 100kb부터 약 110kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 120kb부터 약 130kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 130kb부터 약 140kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 140kb부터 약 150kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 150kb부터 약 160kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 160kb부터 약 170kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 170kb부터 약 180kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 180kb부터 약 190kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 약 190kb부터 약 200kb까지이다.

한 구체예에서, LTVEC는 부위-특이적 재조합 표적 서열이 양 옆에 있는 핵산을 포함하는 삽입물 핵산을 포함한다. 한 구체예에서, 핵산은 게놈 핵산을 포함한다. 한 구체예에서, 게놈 핵산은 마우스, 사람 또는 그것들의 조합물로부터 유도된다. 한 구체예에서, 부위-특이적 재조합 표적 서열은 loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox 및 그것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 구체예에서, LTVEC는 조건부 대립유전자를 포함하는 삽입물 핵산을 포함한다. 한 구체예에서, 조건부 대립유전자는 US 2011/0104799에서 기술된 것과 같은 다중기능성 대립유전자이다. 한 구체예에서, 조건부 대립유전자는 (a) 표적 유전자의 전사와 관련하여 센스 방향으로 구동 서열, 및 센스 또는 안티센스 방향으로 약물 선택 카세트; (b) 안티센스 방향으로 관심의 뉴클레오티드 서열(NSI) 및 전환 모듈(COIN, 엑손-분열 인트론 및 전환가능한 유전자 올가미-유사 모듈을 활용한다, 예컨대 US 2011/0104799 참조)에 의한 조건부; 및 (c) 첫 번째 재조합효소에 노출될 때 재조합하여 (i) 구동 서열과 DSC가 결핍되고 (ii) 센스 방향으로 NSI를 함유하고 안티센스 방향으로 COIN을 함유하는 조건부 대립유전자를 형성하는 재조합가능한 유닛을 포함한다.

한 구체예에서, LTVEC는 선택 카세트를 포함하는 삽입물 핵산을 포함한다. 한 구체예에서, 선택 카세트는 선택 마커를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는데, 이때 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 프로모터는 원핵 세포에서 활성이다. 한 구체예에서, 핵산은 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 활성이다. 한 구체예에서, 선택 카세트의 양 옆에는 부위-특이적 재조합 표적 서열이 있다. 한 구체예에서, 선택 마커는 네오마이신 포스포트란스페라제(neo^r), 하이그로마이신 B 포스포트란스페라제(hyg^r), 퓨로마이신-N-아세틸트란스페라제(puro^r), 블라스티시딘 S 탈아민효소(bsr^r), 크산틴/구아닌 포스포리보실 트란스페라제(gpt) 및 단순 포진 바이러스 싸이미딘 키나제(HSV-k) 및 그것들의 조합으로부터 선택된다.

한 구체예에서, LTVEC는 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는 삽입물 핵산을 포함하는데, 그 리포터 유전자는 LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 에메랄드, 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP), CyPet, 시안 형광 단백질(CFP), 세루리안, T-사파이어, 루시페라제, 알칼리 포스파타제 및 그것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 리포터 단백질을 코드화한다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 내인성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 외인성 프로머터의 제어 하에 발현된다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 특이한 세포 유형에서 발현된다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 조직-특이적 방식으로 발현된다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 발달 단계-특이적 방식으로 발현된다.

한 측면으로, 진핵 세포의 게놈 내에서 표적 유전자좌에 대해 지시된 상동성 아암과, 그 표적 유전자좌에서 또는 그 근처에서 단일- 또는 이중-가닥 절단을 이루는 뉴클레아제 제제를 코드화하는 핵산 서열을 포함하고 있는 큰 표적화 벡터를 포함하는 진핵 세포가 제공된다.

한 구체예에서, 진핵 세포는 다능 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 배줄기(ES) 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 비-사람 ES 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 유도된 다능 줄기(iPS) 세포이다. 한 구체예에서, 유도된 다능(iPS) 세포는 섬유아세포로부터 유도된다. 한 구체예에서, 유도된 다능(ipS) 세포는 사람 섬유아세포로부터 유도된다. 한 구체예에서, 다능 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 뉴런 줄기 세포(NSC)이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 낭배 외피 줄기 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 발달상으로 제한된 전구체 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 설치류 다능 세포이다. 한 구체예에서, 설치류 다능 세포는 쥐 다능 세포이다. 한 구체예에서, 쥐 다능 세포는 쥐 ES 세포이다. 한 구체예에서, 설치류 다능 세포는 마우스 다능 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 마우스 배 줄기(ES) 세포이다.

한 구체예에서, 진핵 세포는 불멸화된 마우스 또는 쥐 세포이다. 한 구체예에서, 진핵 세포는 불멸화된 사람 세포이다. 한 구체예에서, 진핵 세포는 사람 섬유아세포이다. 한 구체예에서, 진핵 세포는 암세포이다. 한 구체예에서, 진핵 세포는 사람 암세포이다.

한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 50kb부터 약 300kb까지이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 50kb부터 약 75kb까지이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 75kb부터 약 100kb까지이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 100kb부터 약 125kb까지이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 125kb부터 약 150kb까지이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 150kb부터 약 175kb까지이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 175kb부터 약 200kb까지이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 200kb부터 약 225kb까지이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 225kb부터 약 250kb까지이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 250kb부터 약 275kb까지이다. 한 구체예에서, LTVEC의 범위는 약 275kb부터 약 300kb까지이다.

한 구체예에서, 표적화 벡터의 상동성 아암은 BAC 라이브러리, 코스미드 라이브러리 또는 P1 파지 라이브러리로부터 유도된다. 한 구체예에서, 상동성 아암은 종래 방법을 사용하여서는 표적화될 수 없는 비-사람 동물의 게놈 유전자좌로부터 유도된다. 한 구체예에서, 상동성 아암은 합성 DNA로부터 유도된다.

한 구체예에서, 상류 상동성 아암과 하류 상동성 아암의 총 합은 적어도 10kb이다. 한 구체예에서, 상류 상동성 아암의 범위는 약 5kb부터 약 100kb까지이다. 한 구체예에서, 하류 상동성 아암의 범위는 약 5kb부터 약 100kb까지이다. 한 구체예에서, 하류 및 상류 상동성 아암의 범위는 약 5kb부터 약 10kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 10kb부터 약 20kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 20kb부터 약 30kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 30kb부터 약 40kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 40kb부터 약 50kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 50kb부터 약 60kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 60kb부터 약 70kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 70kb부터 약 80kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 80kb부터 약 90kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 90kb부터 약 100kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 100kb부터 약 110kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 110kb부터 약 120kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 120kb부터 약 130kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 130kb부터 약 140kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 140kb부터 약 150kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 150kb부터 약 160kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 160kb부터 약 170kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 170kb부터 약 180kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 180kb부터 약 190kb까지이다. 한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 190kb부터 약 200kb까지이다.

한 측면으로, 원핵 세포에서 박테리아 상동 재조합(BHR)을 통하여 포유류 세포의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 방법이 제공되는데, 그 방법은

(a) (i) 첫 번째 상류 상동성 아암과 첫 번째 하류 상동성 아암이 양 옆에 있는 삽입물 핵산을 포함하는 표적화 벡터와

(ii) 표적 게놈 유전자좌에 또는 그 근처에 단일 또는 이중-가닥 절단을 만드는 뉴클레아제 제제를

포유류의 표적 게놈 유전자좌를 포함하는 원핵 세포에 도입하는 단계, 및

(b) 삽입물 핵산을 포함하는 표적화된 원핵 세포를 선택하는 단계

로 이루어지며,

이때 원핵 세포는 BHR을 중재하는 재조합효소를 발현할 수 있다.

한 구체예에서, 표적 게놈 유전자좌는 FcER1a 유전자좌, TLR4 유전자좌, PRLR 유전자좌, Notch4 유전자좌, Accn2 유전자좌, Adamts5 유전자좌, TRPA1 유전자좌, FolH1 유전자좌, LRP5 유전자좌 및 ERBB4 유전자좌로부터 선택된다.

한 구체예에서, 표적 게놈 유전자좌는 두 번째 상류 상동성 아암과 두 번째 하류 상동성 아암을 포함하는 큰 표적화 벡터(LTVEC)에 존재한다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 상동성 아암과 두 번째 하류 상동성 아암의 총 합은 적어도 10kb이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 상동성 아암의 범위는 약 5kb부터 약 100kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 하류 상동성 아암의 범위는 약 5kb부터 약 100kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 5kb부터 약 10kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 10kb부터 약 20kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 20kb부터 약 30kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 30kb부터 약 40kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 40kb부터 약 50kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 50kb부터 약 60kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 60kb부터 약 70kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 70kb부터 약 80kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 80kb부터 약 90kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 90kb부터 약 100kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 100kb부터 약 110kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 110kb부터 약 120kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 120kb부터 약 130kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 130kb부터 약 140kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 140kb부터 약 150kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 150kb부터 약 160kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 160kb부터 약 170kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 170kb부터 약 180kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 180kb부터 약 190kb까지이다. 한 구체예에서, 두 번째 상류 및 하류 상동성 아암의 범위는 약 190kb부터 약 200kb까지이다.

한 구체예에서, 포유류는 사람이고 표적화는 생체 외 사람 세포의 표적화이다. 한 구체예에서, 포유류는 설치류이다. 한 구체예에서 설치류는 마우스, 쥐 및 햄스터로부터 선택된다.

한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 표적화 벡터와 함께 도입된다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 일정 시간에 걸쳐서 표적화 벡터와 별도로 도입된다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 표적화 벡터의 도입 전에 도입된다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 표적화 벡터의 도입 후에 도입된다.

한 구체예에서, 표적화 벡터의 뉴클레아제 제제와의 조합된 사용은 표적화 벡터 단독의 사용과 비교하여 증가된 표적화 효율을 초래한다. 한 구체예에서, 표적화 벡터가 뉴클레아제 제제와 함께 사용될 때, 표적화 벡터의 표적화 효율은 표적화 벡터가 단독으로 사용될 때와 비교하여 적어도 2배 증가된다. 한 구체예에서, 표적화벡터가 뉴클레아제 제제와 함께 사용될 때, 표적화 벡터의 표적화 효율은 표적화 벡터가 단독으로 사용될 때와 비교하여 적어도 3배 증가된다. 한 구체예에서, 표적화벡터가 뉴클레아제 제제와 함께 사용될 때, 표적화 벡터의 표적화 효율은 표적화 벡터가 단독으로 사용될 때와 비교하여 적어도 4배 증가된다.

한 구체예에서, 원핵 세포는 대장균의 재조합-경합 균주이다. 한 구체예에서, 원핵 세포는 재조합효소를 코드화하는 핵산을 포함한다. 한 구체예에서, 원핵 세포는 재조합효소를 코드화하는 핵산을 포함하지 않고, 재조합효소를 코드화하는 핵산이 원핵 세포 안에 도입된다. 한 구체예에서, 핵산은 재조합효소를 코드화하는 DNA 또는 mRNA를 포함한다. 한 구체예에서, 재조합효소를 코드화하는 핵산은 pABG이다. 한 구체예에서, 재조합효소는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 한 구체예에서, 재조합효소의 발현은 아라비노스에 의해 제어된다.

한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 뉴클레아제를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구성물이고, 이때 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 프로모터는 본질적으로 활성 프로모터이다. 한 구체예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 한 구체예에서, 프로모터는 원핵 세포에서 활성이다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 엔도뉴클레아제를 코드화하는 mRNA이다.

한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 아연-집게(zinc-finger) 뉴클레아제(ZFN)이다. 한 구체예에서, ZFN의 각 단량체는 3 또는 그 이상의 아연 집게-기초 DNA 결합 도메인을 포함하고, 이때 각 아연 집게-기초 DNA 결합 도메인은 3bp 서브사이트에 결합한다. 한 구체예에서, ZFN은 독립적인 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 아연 집게-기초 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메릭 단백질이다. 한 구체예에서, 독립적인 엔도뉴클레아제는 FokI 엔도뉴클레아제이다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 첫 번째 ZFN과 두 번째 ZFN을 포함하는데, 이때 첫 번째 ZFN과 두 번째 ZFN은 각각 FokI 뉴클레아제에 작동가능하게 연결되고, 첫 번째 및 두 번째 ZFN은 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 약 6bp 내지 약 40bp 절단 부위에 의해 분리된 두 개의 연속적인 표적 DNA 서열을 인지하며, FokI 뉴클레아제는 양 가닥을 이량체화하고 양 가닥을 절단한다.

한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)이다. 한 구체예에서, TALEN의 각 단량체는 12 내지 25개의 TAL 반복부를 포함하는데, 이때 각 TAL 반복부는 1bp 서브사이트에 결합한다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 독립적인 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 TAL 반복부-기초 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메릭 단백질이다. 한 구체예에서, 독립적인 뉴클레아제는 FokI 엔도뉴클레아제이다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 첫 번째 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인과 두 번째 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인을 포함하는데, 이때 첫 번째 및 두 번째 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인의 각각은 FokI 뉴클레아제에 작동가능하게 연결되고, 첫 번째 및 두 번째 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인은 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 약 6bp 내지 약 40bp 절단 부위에 의해 분리된 두 개의 연속적인 표적 DNA 서열을 인지하며, FokI 뉴클레아제는 표적 서열을 이량체화하고 그곳에서 이중 가닥을 절단한다.

한 구체예에서, 뉴클레아제의 각 단량체는 적어도 9개의 뉴클레오티드의 표적 서열을 인지한다. 한 구체예에서, 표적 서열은 약 9 내지 약 12개 길이의 뉴클레오티드이다. 한 구체예에서, 표적 서열은 약 12 내지 약 15개 길이의 뉴클레오티드이다. 한 구체예에서, 표적 서열은 약 15 내지 약 18개 길이의 뉴클레오티드이다. 한 구체예에서, 표적 서열은 약 18 내지 약 21개 길이의 뉴클레오티드이다.

한 구체예에서, 뉴클레아제 제제의 표적 서열은 인트론에 위치한다. 한 구체예에서, 표적 서열은 엑손에 위치한다. 한 구체예에서, 표적 서열은 프로모터에 위치한다. 한 구체예에서, 표적 서열은 비-단백질-코딩 영역에 위치한다. 한 구체예에서, 비-단백질-코딩 영역은 조절 영역이다. 한 구체예에서, 표적 서열은 프로모터 조절 영역에 위치한다. 한 구체예에서, 표적 서열은 인핸서 영역에 위치한다.

한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 메가뉴클레아제이다. 한 구체예에서, 메가뉴클레아제는 12 내지 40 염기쌍의 이중-가닥 DNA 서열을 인지한다. 한 구체예에서, 메가뉴클레아제는 게놈에서 하나의 완벽하게 매치된 표적 서열을 인지한다. 한 구체예에서, 메가뉴클레아제는 귀소성(homing) 뉴클레아제이다. 한 구체예에서, 귀소성 뉴클레아제는 귀소성 뉴클레아제의 LAGLIDADG 패밀리이다. 한 구체예에서, 귀소성 뉴클레아제의 LAGLIDADG 패밀리는 I-SceI, I-CreI 및 I-DmoI로부터 선택된다.

한 구체예에서, 표적화 벡터는 큰 표적화 벡터(LTVEC)이다.

한 구체예에서, 표적화 벡터는 선택 카세트를 포함한다. 한 구체예에서, 선택 카세트는 선택 마커를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는데, 그 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 프로모터는 원핵 세포에서 활성이다. 한 구체예에서, 프로모터는 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 활성이다. 한 구체예에서, 선택 마커는 네오마이신 포스포트란스페라제(neo^r), 하이그로마이신 B 포스포트란스페라제(hyg^r), 퓨로마이신-N-아세틸트란스페라제(puro^r), 블라스티시딘 S 탈아민효소(bsr^r), 크산틴/구아닌 포스포리보실 트란스페라제(gpt) 및 단순 포진 바이러스 싸이미딘 키나제(HSV-k) 및 그것들의 조합으로부터 선택된다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 5kb부터 약 200kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 5kb부터 약 10kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 10kb부터 약 20kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 20kb부터 약 30kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 30kb부터 약 40kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 40kb부터 약 50kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 60kb부터 약 70kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 80kb부터 약 90kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 90kb부터 약 100kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 100kb부터 약 110kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 120kb부터 약 130kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 130kb부터 약 140kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 140kb부터 약 150kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 150kb부터 약 160kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 160kb부터 약 170kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 170kb부터 약 180kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 180kb부터 약 190kb까지이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 약 190kb부터 약 200kb까지이다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산의 양 옆에는 부위-특이적 재조합 표적 서열이 있다. 한 구체예에서, 핵산은 게놈 핵산을 포함한다. 한 구체예에서, 게놈 핵산은 마우스, 사람, 또는 그것들의 조합으로부터 유도된다. 한 구체예에서, 부위-특이적 재조합 표적 서열은 loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox 및 그것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 조건부 대립유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 조건부 대립유전자는 US 2011/0104799에서 기술된 것과 같은 다중기능성 대립유전자이다. 한 구체예에서, 조건부 대립유전자는 (a) 표적 유전자의 전사와 관련하여 센스 방향으로 구동 서열, 및 센스 또는 안티센스 방향으로 약물 선택 카세트; (b) 안티센스 방향으로 관심의 뉴클레오티드 서열(NSI) 및 전환 모듈(COIN, 엑손-분열 인트론 및 전환가능한 유전자 올가미-유사 모듈을 활용한다, 예컨대 US 2011/0104799 참조)에 의한 조건부; 및 (c) 첫 번째 재조합효소에 노출될 때 재조합하여 (i) 구동 서열과 DSC가 결핍되고 (ii) 센스 방향으로 NSI를 함유하고 안티센스 방향으로 COIN을 함유하는 조건부 대립유전자를 형성하는 재조합가능한 유닛을 포함한다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 선택 카세트를 포함한다. 한 구체예에서, 선택 카세트는 선택 마커를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는데, 이때 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 프로모터는 원핵 세포에서 활성이다. 한 구체예에서, 핵산은 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 활성이다. 한 구체예에서, 선택 카세트의 양 옆에는 부위-특이적 재조합 표적 서열이 있다. 한 구체예에서, 선택 마커는 네오마이신 포스포트란스페라제(neo^r), 하이그로마이신 B 포스포트란스페라제(hyg^r), 퓨로마이신-N-아세틸트란스페라제(puro^r), 블라스티시딘 S 탈아민효소(bsr^r), 크산틴/구아닌 포스포리보실 트란스페라제(gpt) 및 단순 포진 바이러스 싸이미딘 키나제(HSV-k) 및 그것들의 조합으로부터 선택된다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 유전자를 포함하는데, 그 리포터 유전자는 LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 에메랄드, 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP), CyPet, 시안 형광 단백질(CFP), 세루리안, T-사파이어, 루시페라제, 알칼리 포스파타제 및 그것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 리포터 단백질을 코드화한다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 유도성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 내인성 프로모터의 제어 하에 발현된다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 외인성 프로머터의 제어 하에 발현된다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 특이한 세포 유형에서 발현된다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 조직-특이적 방식으로 발현된다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 발달 단계-특이적 방식으로 발현된다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산의 표적 게놈 유전자좌 안으로의 통합은 본원에 기술된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 유전자 변형을 도입한다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 내인성 핵산 서열의 결실이다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 외인성 핵산 서열의 표적 게놈 유전자좌 안으로의 첨가이다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 표적 게놈 유전자좌에서 내인성 핵산 서열의 외인성 핵산 서열로의 대체이다. 한 구체예에서, 외인성 핵산 서열은 비-마우스 핵산 서열이다. 한 구체예에서, 외인성 핵산 서열은 사람 핵산 서열이다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 녹아웃, 결실, 삽입, 대체("녹-인(knock-in)"), 점 돌연변이, 도메인 교체, 엑손 교체, 인트론 교체, 조절 서열 교체, 유전자 교체 또는 그것들의 조합이다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 마우스 핵산 서열에 대해 상동성이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 사람 핵산이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 게놈 핵산의 단편이다. 한 구체예에서, 게놈 핵산은 마우스 게놈 핵산, 사람 게놈 핵산 또는 그것들의 조합이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 상기에서 기술된 것과 같이 약 5kb부터 약 200kb까지이다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 마우스 핵산 서열에 대해 이종상동성이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 사람 핵산이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 게놈 핵산의 단편이다. 한 구체예에서, 게놈 핵산은 마우스 게놈 핵산, 사람 게놈 핵산 또는 그것들의 조합이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 상기에서 기술된 것과 같이 약 5kb부터 약 200kb까지이다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 신경계, 골격계, 소화계, 순환계, 근육계, 호흡계, 심혈관계, 림프계, 내분비계, 비뇨계, 생식계 또는 그것들의 조합에서 발현된 단백질을 코드화하는 게놈 유전자좌를 포함한다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 골수 또는 골수-유도 세포에서 발현된 단백질을 코드화하는 게놈 유전자좌를 포함한다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 비장 세포에서 발현된 단백질을 코드화하는 게놈 유전자좌를 포함한다. 한 구체예에서, 게놈 유전자좌는 마우스 게놈 핵산 서열, 사람 게놈 핵산 서열 또는 그것들의 조합을 포함한다. 한 구체예에서, 핵산은 B 세포에서 발현된 단백질을 코드화하는 게놈 유전자좌를 포함한다. 한 구체예에서, 핵산은 미성숙 B 세포에서 발현된 단백질을 코드화하는 게놈 유전자좌를 포함한다. 한 구체예에서, 핵산은 성숙한 B 세포에서 발현된 단백질을 코드화하는 게놈 유전자좌를 포함한다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코드화하는 게놈 핵산 서열을 포함한다.

한 구체예에서, 게놈 핵산 서열은 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열 또는 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열 또는 그것들의 조합이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 C_H1-힌지-C_H2-C_H3를 포함한다. 한 구체예에서, 게놈 핵산 서열은 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열된 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열 또는 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열 또는 그것들의 조합이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 C_H1-힌지-C_H2-C_H3를 포함한다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코드화하는 게놈 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 게놈 핵산 서열은 재배열되지 않은 사람 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 게놈 핵산 서열은 재배열된 사람 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 재배열되지 않은 또는 재배열된 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열은 λ 경쇄 불변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 불변 영역 핵산 서열로부터 선택된 마우스, 쥐 또는 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 사람 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 핵산 서열은 세포외재성 단백질을 코드화한다. 한 구체예에서, 사람 핵산 서열은 수용체에 대한 리간드를 코드화한다. 한 구체예에서, 리간드는 사이토킨이다. 한 구체예에서, 사이토킨은 CCL, CXCL, CX3CL 및 XCL로부터 선택된 케모카인이다. 한 구체예에서, 사이토킨은 종양 괴사 인자(TNF)이다. 한 구체예에서, 사이토킨은 인터류킨(IL)이다. 한 구체예에서, 인터류킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 및 IL-36으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 인터류킨은 IL-2이다. 한 구체예에서, 사람 게놈 핵산 서열은 세포질 단백질을 코드화한다. 한 구체예에서, 사람 게놈 핵산 서열은 막 단백질을 코드화한다. 한 구체예에서, 막 단백질은 수용체이다. 한 구체예에서, 수용체는 사이토킨 수용체이다. 한 구체예에서, 사이토킨 수용체는 인터류킨 수용체이다. 한 구체예에서, 인터류킨 수용체는 인터류킨 2 수용체 알파이다. 한 구체예에서, 인터류킨 수용체는 인터류킨 2 수용체 베타이다. 한 구체예에서, 인터류킨 수용체는 인터류킨 2 수용체 감마이다. 한 구체예에서, 사람 게놈 핵산 서열은 핵 단백질을 코드화한다. 한 구체예에서, 핵 단백질은 핵 수용체이다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 코딩 서열에서 유전자 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 코딩 서열의 결실 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 두 개의 내인성 코딩 서열의 융합을 포함한다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 돌연변이 사람 단백질을 코드화하는 사람 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 돌연변이 사람 단백질은 변경된 결합 특징, 변경된 정위(localization), 변경된 발현 및/또는 변경된 발현 패턴을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 사람 핵산 서열은 적어도 하나의 사람 질병 대립유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 신경질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 심혈관 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 신장 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 근육 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 혈액 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 암-유발 유전자의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 면역계 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 우성 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 열성 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 단일 뉴클레오티드 다형태(SNP) 대립유전자를 포함한다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 조절 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 조절 서열은 프로모터 서열이다. 한 구체예에서, 조절 서열은 인핸서 서열이다. 한 구체예에서, 조절 서열은 전사 억제제-결합 서열이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 사람 핵산 서열을 포함하는데, 이때 사람 핵산 서열은 비-단백질-코딩 서열의 결실을 포함하지만, 단백질-코딩 서열의 결실은 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 비-단백질-코딩 서열의 결실은 조절 서열의 결실을 포함한다. 한 구체예에서, 조절 요소의 결실은 프로모터 서열의 결실을 포함한다. 한 구체예에서, 조절 요소의 결실은 인핸서 서열의 결실을 포함한다.

한 측면으로, 포유류 세포에서 표적 게놈 유전자좌의 변형 방법이 제공되는데, 그 방법은 포유류 세포에 (i) 표적 게놈 유전자좌에서 또는 그 근처에서 단일 또는 이중-가닥 절단을 만드는 뉴클레아제 제제 및 (ii) 양 옆에 상류 상동성 아암 및 하류 상동성 아암을 가지는 삽입물 핵산을 포함하고 있는 큰 표적화 벡터(LTVEC)를 도입하는 것을 포함한다.

한 구체예에서, 포유류 세포는 다능 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 배 줄기(ES) 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 비-사람 ES 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 유도된 다능 줄기(iPS) 세포이다. 한 구체예에서, 유도된 다능(iPS) 세포는 섬유아세포로부터 유도된다. 한 구체예에서, 유도된 다능(ipS) 세포는 사람 섬유아세포로부터 유도된다. 한 구체예에서, 다능 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 뉴런 줄기 세포(NSC)이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 낭배 외피 줄기 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 발달상으로 제한된 전구체 세포이다.

한 구체예에서, 다능 세포는 설치류 다능 세포이다. 한 구체예에서, 설치류 다능 세포는 쥐 다능 세포이다. 한 구체예에서, 쥐 다능 세포는 쥐 ES 세포이다. 한 구체예에서, 설치류 다능 세포는 마우스 다능 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 마우스 배 줄기(ES) 세포이다.

한 구체예에서, 포유류 세포는 불멸화된 마우스 또는 쥐 세포이다. 한 구체예에서, 포유류 세포는 불멸화된 사람 세포이다. 한 구체예에서, 포유류 세포는 사람 섬유아세포이다. 한 구체예에서, 포유류 세포는 암세포이다. 한 구체예에서, 포유류 세포는 사람 암세포이다.

한 구체예에서, 포유류 세포는 질병에 걸린 환자로부터 분리된 사람 세포이다. 한 구체예에서, 사람 세포는 돌연변이 단백질을 코드화하는 사람 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 돌연변이 사람 단백질은 변경된 결합 특징, 변경된 정위, 변경된 발현 및/또는 변경된 발현 패턴을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 사람 핵산 서열은 적어도 하나의 사람 질병 대립유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 신경질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 심혈관 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 신장 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 근육 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 혈액 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 암-유발 유전자의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 면역계 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 우성 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 열성 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 뉴클레오티드 단일 다형태(SNP) 대립유전자를 포함한다.

한 구체예에서, 표적 게놈 유전자좌는 사람 게놈 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 표적 게놈 유전자좌는 비-사람 동물의 게놈 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스, 쥐 및 햄스터로부터 선택된다.

한 구체예에서, 표적 게놈 유전자좌에 위치한 상기에서 기술된 적어도 하나의 사람 질병 대립유전자는 삽입물 핵산으로 대체된다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자의 대체는 녹아웃, 결실, 삽입, 대체("녹-인"), 도메인 교체, 엑손 교체, 인트론 교체, 조절 서열 교체, 유전자 교체 또는 그것들의 조합에 의해 중재된다.

한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 큰 표적화 벡터(LTVEC)와 함께 도입된다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 일정 시간에 걸쳐 LTVEC와 별도로 도입된다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 LTVEC의 도입 전에 도입된다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 LTVEC의 도입 후에 도입된다.

한 구체예에서, LTVEC의 뉴클레아제 제제와의 조합된 사용은 LTVEC 단독의 사용과 비교하여 증가된 표적화 효율을 초래한다. 한 구체예에서, LTVEC가 뉴클레아제 제제와 함께 사용될 때, LTVEC의 표적화 효율은 LTVEC가 단독으로 사용될 때와 비교하여 적어도 2배 증가된다. 한 구체예에서, LTVEC가 뉴클레아제 제제와 함께 사용될 때, LTVEC의 표적화 효율은 LTVEC가 단독으로 사용될 때와 비교하여 적어도 3배 증가된다. 한 구체예에서, LTVEC가 뉴클레아제 제제와 함께 사용될 때, LTVEC의 표적화 효율은 LTVEC가 단독으로 사용될 때와 비교하여 적어도 4배 증가된다.

한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 뉴클레아제를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구성물이고, 이때 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 프로모터는 본질적으로 활성 프로모터이다. 한 구체예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 한 구체예에서, 프로모터는 포유류 세포에서 활성이다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 엔도뉴클레아제를 코드화하는 mRNA이다.

한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 아연-집게 뉴클레아제(ZFN)이다. 한 구체예에서, ZFN의 각 단량체는 3 또는 그 이상의 아연 집게-기초 DNA 결합 도메인을 포함하고, 이때 각 아연 집게-기초 DNA 결합 도메인은 3bp 서브사이트에 결합한다. 한 구체예에서, ZFN은 독립적인 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 아연 집게-기초 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메릭 단백질이다. 한 구체예에서, 독립적인 엔도뉴클레아제는 FokI 엔도뉴클레아제이다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 첫 번째 ZFN과 두 번째 ZFN을 포함하는데, 이때 첫 번째 ZFN과 두 번째 ZFN은 각각 FokI 뉴클레아제에 작동가능하게 연결되며, 첫 번째 및 두 번째 ZFN은 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 약 6bp 내지 약 40bp 절단 부위에 의해 분리된 두 개의 연속적인 표적 DNA 서열을 인지하고, FokI 뉴클레아제는 양 가닥을 이량체화하고 양 가닥을 절단한다.

한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)이다. 한 구체예에서, TALEN의 각 단량체는 12 내지 25개의 TAL 반복부를 포함하며, 이때 각 TAL 반복부는 1bp 서브사이트에 결합한다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 독립적인 뉴클레아제에 작동가능하게 연결된 TAL 반복부-기초 DNA 결합 도메인을 포함하는 키메릭 단백질이다. 한 구체예에서, 독립적인 뉴클레아제는 FokI 엔도뉴클레아제이다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 첫 번째 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인과 두 번째 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인을 포함하고, 이때 첫 번째 및 두 번째 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인은 각각 FokI 뉴클레아제에 작동가능하게 연결되며, 첫 번째 및 두 번째 TAL-반복부-기초 DNA 결합 도메인은 표적 DNA 서열의 각 가닥에서 약 6bp 내지 약 40bp 절단 부위에 의해 분리된 두 개의 연속적인 표적 DNA 서열을 인지하고, FokI 뉴클레아제는 이중 가닥을 이량체화하고 절단한다.

한 구체예에서, 뉴클레아제 제제의 표적 핵산 서열은 인트론에 위치한다. 한 구체예에서, 표적 핵산 서열은 엑손에 위치한다. 한 구체예에서, 표적 핵산 서열은 프로모터에 위치한다. 한 구체예에서, 표적 핵산 서열은 비-단백질-코딩 영역에 위치한다. 한 구체예에서, 비-단백질-코딩 영역은 조절 영역이다. 한 구체예에서, 표적 핵산 서열은 프로모터 조절 영역에 위치한다. 한 구체예에서, 표적 핵산 서열은 인핸서 영역에 위치한다.

한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 메가뉴클레아제이다. 한 구체예에서, 메가뉴클레아제는 12 내지 40 염기쌍의 이중-가닥 DNA 서열을 인지한다. 한 구체예에서, 메가뉴클레아제는 게놈에서 하나의 완벽하게 매치된 표적 서열을 인지한다. 한 구체예에서, 메가뉴클레아제는 귀소성 뉴클레아제이다. 한 구체예에서, 귀소성 뉴클레아제는 귀소성 뉴클레아제의 LAGLIDADG 패밀리이다. 한 구체예에서, 귀소성 뉴클레아제의 LAGLIDADG 패밀리는 I-SceI, I-CreI 및 I-DmoI로부터 선택된다.

한 구체예에서, LTVEC의 상동성 아암은 BAC 라이브러리, 코스미드 라이브러리 또는 P1 파지 라이브러리로부터 유도된다. 한 구체예에서, 상동성 아암은 종래 방법을 사용하여서는 표적화될 수 없는 비-사람 동물의 게놈 유전자좌로부터 유도된다. 한 구체예에서, 상동성 아암은 합성 DNA로부터 유도된다.

한 구체예에서, 표적화 벡터는 선택 카세트를 포함한다. 한 구체예에서, 선택 카세트는 선택 마커를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는데, 그 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 프로모터는 포유류 세포에서 활성이다. 한 구체예에서, 프로모터는 원핵 및 진핵 세포 둘 다에서 활성이다. 한 구체예에서, 선택 마커는 네오마이신 포스포트란스페라제(neo^r), 하이그로마이신 B 포스포트란스페라제(hyg^r), 퓨로마이신-N-아세틸트란스페라제(puro^r), 블라스티시딘 S 탈아민효소(bsr^r), 크산틴/구아닌 포스포리보실 트란스페라제(gpt) 및 단순 포진 바이러스 싸이미딘 키나제(HSV-k) 및 그것들의 조합으로부터 선택된다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 선택 카세트를 포함한다. 한 구체예에서, 선택 카세트는 선택 마커를 코드화하는 핵산 서열을 포함하고, 이때 핵산 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 프로모터는 포유류 세포에서 활성이다. 한 구체예에서, 핵산은 진핵 세포에서 활성이다. 한 구체예에서, 선택 카세트의 양 옆에는 부위-특이적 재조합 표적 서열이 있다. 한 구체예에서, 선택 마커는 네오마이신 포스포트란스페라제(neo^r), 하이그로마이신 B 포스포트란스페라제(hyg^r), 퓨로마이신-N-아세틸트란스페라제(puro^r), 블라스티시딘 S 탈아민효소(bsr^r), 크산틴/구아닌 포스포리보실 트란스페라제(gpt) 및 단순 포진 바이러스 싸이미딘 키나제(HSV-k) 및 그것들의 조합으로부터 선택된다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산의 표적 게놈 유전자좌 안으로의 통합은 본원에 기술된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 유전자 변형을 도입한다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 내인성 핵산 서열의 결실이다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 외인성 핵산 서열의 표적 게놈 유전자좌 안으로의 첨가이다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 표적 게놈 유전자좌에서 내인성 핵산 서열의 외인성 핵산 서열로의 대체이다. 한 구체예에서, 외인성 핵산 서열은 비-마우스 핵산 서열이다. 한 구체예에서, 외인성 핵산 서열은 사람 핵산 서열이다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 녹아웃, 결실, 삽입, 대체("녹-인"), 점 돌연변이, 도메인 교체, 엑손 교체, 인트론 교체, 조절 서열 교체, 유전자 교체 또는 그것들의 조합이다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코드화하는 게놈 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 게놈 핵산 서열은 재배열되지 않은 사람 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 게놈 핵산 서열은 재배열된 사람 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 재배열되지 않은 또는 재배열된 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열은 λ 경쇄 불변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 불변 영역 핵산 서열로부터 선택된 마우스 또는 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 돌연변이 사람 단백질을 코드화하는 사람 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 돌연변이 사람 단백질은 변경된 결합 특징, 변경된 정위, 변경된 발현 및/또는 변경된 발현 패턴을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 사람 핵산 서열은 적어도 하나의 사람 질병 대립유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 신경질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 심혈관 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 신장 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 근육 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 혈액 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 암-유발 유전자의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 면역계 질환의 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 우성 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 열성 대립유전자이다. 한 구체예에서, 사람 질병 대립유전자는 단일 뉴클레오티드 다형태(SNP) 대립유전자를 포함한다.

한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 방법으로 만들어진 포유류 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 포유류 세포는 표적 게놈 유전자좌에서 본원에 기술된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 유전자 변형을 포함하는 삽입물 핵산을 포함한다.

한 구체예에서, 포유류 세포는 다능 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 배 줄기(ES) 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 유도된 다능 줄기(iPS) 세포이다. 한 구체예에서, 유도된 다능(iPS) 세포는 섬유아세포로부터 유도된다. 한 구체예에서, 유도된 다능(ipS) 세포는 사람 섬유아세포로부터 유도된다. 한 구체예에서, 다능 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 뉴런 줄기 세포(NSC)이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 낭배 외피 줄기 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 발달상으로 제한된 전구체 세포이다.

한 구체예에서, 다능 세포는 마우스 다능 세포이다. 한 구체예에서, 다능 세포는 마우스 배 줄기(ES) 세포이다.

한 구체예에서, 표적 게놈 유전자좌는 본원에 기술된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 유전자 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 내인성 핵산 서열의 결실이다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 외인성 핵산 서열의 표적 게놈 유전자좌 안으로의 첨가이다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 표적 게놈 유전자좌에서 내인성 핵산 서열의 외인성 핵산 서열로의 대체이다. 한 구체예에서, 외인성 핵산 서열은 비-마우스 핵산 서열이다. 한 구체예에서, 외인성 핵산 서열은 사람 핵산 서열이다. 한 구체예에서, 표적 게놈 유전자좌는 녹아웃, 결실, 삽입, 대체("녹-인"), 점 돌연변이, 도메인 교체, 엑손 교체, 인트론 교체, 조절 서열 교체, 유전자 교체 또는 그것들의 조합으로부터 선택된 변형을 포함한다.

한 구체예에서, 표적 게놈 유전자좌는 마우스 핵산 서열에 대해 상동성인 삽입물 핵산을 포함한다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 사람 핵산이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 게놈 핵산의 단편이다. 한 구체예에서, 게놈 핵산은 마우스 게놈 핵산, 사람 게놈 핵산 또는 그것들의 조합이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 상기에서 기술된 것과 같이 약 5kb부터 약 200kb까지이다.

한 구체예에서, 표적 게놈 유전자좌는 마우스 핵산 서열에 대해 이종상동성인 삽입물 핵산을 포함한다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 사람 핵산이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산은 게놈 핵산의 단편이다. 한 구체예에서, 게놈 핵산은 마우스 게놈 핵산, 사람 게놈 핵산 또는 그것들의 조합이다. 한 구체예에서, 삽입물 핵산의 범위는 상기에서 기술된 것과 같이 약 5kb부터 약 200kb까지이다.

한 구체예에서, 표적 게놈 유전자좌는 조건부 대립유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 조건부 대립유전자는 US 2011/0104799에서 기술된 것과 같은 다중기능성 대립유전자이다. 한 구체예에서, 조건부 대립유전자는 (a) 표적 유전자의 전사와 관련하여 센스 방향으로 구동 서열, 및 센스 또는 안티센스 방향으로 약물 선택 카세트; (b) 안티센스 방향으로 관심의 뉴클레오티드 서열(NSI) 및 전환 모듈(COIN, 엑손-분열 인트론 및 전환가능한 유전자 올가미-유사 모듈을 활용한다, 예컨대 US 2011/0104799 참조)에 의한 조건부; 및 (c) 첫 번째 재조합효소에 노출될 때 재조합하여 (i) 구동 서열과 DSC가 결핍되고 (ii) 센스 방향으로 NSI를 함유하고 안티센스 방향으로 COIN을 함유하는 조건부 대립유전자를 형성하는 재조합가능한 유닛을 포함한다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 신경계, 골격계, 소화계, 순환계, 근육계, 호흡계, 심혈관계, 림프계, 내분비계, 비뇨계, 생식계 또는 그것들의 조합에서 발현된 단백질을 코드화하는 사람 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 핵산 서열은 골수 또는 골수-유도 세포에서 발현된 단백질을 코드화한다. 한 구체예에서, 마우스 ES 세포의 게놈은 비장 세포에서 발현된 단백질을 코드화하는 사람 게놈 유전자좌를 포함한다. 한 구체예에서, 사람 핵산은 B 세포에서 발현된 단백질을 코드화한다. 한 구체예에서, 사람 핵산은 미성숙 B 세포에서 발현된 단백질을 코드화한다. 한 구체예에서, 사람 핵산은 성숙한 B 세포에서 발현된 단백질을 코드화한다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코드화하는 사람 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 핵산 서열은 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열, 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열 또는 그것들의 조합에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 C_H1-힌지-C_H2-C_H3를 포함한다. 한 구체예에서, 사람 핵산 서열은 재배열된 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열, 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열 또는 그것들의 조합에 작동가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3 및 그것들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 C_H1-힌지-C_H2-C_H3를 포함한다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코드화하는 사람 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 핵산 서열은 재배열되지 않은 사람 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 핵산 서열은 재배열된 사람 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 재배열되지 않은 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열은 λ 경쇄 불변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 불변 영역 핵산 서열로부터 선택된 마우스 또는 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.

한 구체예에서, 삽입물 핵산은 코딩 서열의 유전자 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 코딩 서열의 결실 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 유전자 변형은 두 개의 내인성 코딩 서열의 융합을 포함한다.

한 측면으로, 본원에 기술된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 유전자 변형을 그것의 생식선에 포함하고 있는 비-사람 동물의 제조 방법이 제공되는데, 그 방법은 다음의 단계들로 이루어진다:

(a) 원핵 세포에서 큰 표적화 벡터(LTVEC)와 관심의 게놈 유전자좌 또는 그 근처에서 단일 또는 이중-가닥 절단을 생성하는 뉴클레아제 제제를 사용하여 비-사람 동물의 관심의 게놈 유전자좌를 변형시키는 단계로, 이때 LTVEC는 상류 및 하류 상동성 아암이 양 옆에 있는 삽입물 핵산을 포함하고, 원핵 세포는 재조합효소를 발현할 수 있는 것이 특징이며;

(b) 유전자 변형된 LTVEC를 포함하고 있는 변형된 원핵 세포를 선택하는 단계;

(c) 유전자 변형된 LTVEC를 분리하는 단계;

(d) 유전자 변형된 LTVEC를 비-사람 동물의 다능 세포 안에 도입시켜서 관심의 게놈 유전자좌에 삽입물 핵산을 포함하고 있는 유전자 변형된 다능 세포를 생성시키는 단계;

(e) 유전자 변형된 다능 세포를 선택하는 단계;

(f) 유전자 변형된 다능 세포를 비-사람 동물의 숙주 배에 상실배-전 단계에서 도입하는 단계; 그리고

(g) 유전자 변형된 다능 세포를 포함하고 있는 숙주 배를 대리모(surrogate-mother)에 이식하여 유전자 변형된 다능 세포로부터 유도된 F0 세대를 생성시키는 단계.

한 구체예에서, 비-사람 동물은 포유류이다. 한 구체예에서, 포유류는 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스, 쥐 및 햄스터로부터 선택된다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스이고, 다능 세포는 마우스 ES 세포이다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 쥐이고, 다능 세포는 쥐 ES 세포이다.

한 구체예에서, 표적 게놈 유전자좌는 본원에서 기술된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 유전자 변형을 포함한다.

한 구체예에서, 분리 단계(c)는 추가로 (c') 유전자 변형된 LTVEC를 선형화하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 도입 단계(d)는 추가로 (d') 본원에 기술된 것과 같은 뉴클레아제 제제를 다능 세포 안에 도입시키는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 아연 집게 뉴클레아제(ZFN)이다. 한 구체예에서, 뉴클레아제 제제는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)이다.

한 구체예에서, 선택 단계(b) 및/또는 (e)는 본원에 기술된 것과 같은 선택가능한 제제를 원핵 세포 또는 다능 세포에 적용함으로써 수행된다.

한 구체예에서, 선택 단계(b) 및/또는 (e)는 본원에 기술된 것과 같은 대립유전자의 변형(MOA) 분석을 통해 수행된다.

도 1은 마우스 II2rg 유전자 상의 아연 집게 뉴클레아제(ZFN) 절단 부위를 도시한다. 도면은 비율적으로 규모화되지는 않았다. 아래쪽 패널의 상자 안의 서열은 ZFN 표적 서열을 나타낸다.

본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않으며, 그런 방법 및 조건은 달라질 수 있다. 또한 본원에서 사용된 용어는 특정 구체예를 기술할 목적으로만 제공되며, 제한하려는 의도는 없는데, 왜냐하면, 본 발명의 범주는 청구범위에 의해 규정되기 때문임이 인지되어야 한다.

다르게 규정되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어 및 구절은 그 용어 또는 구절이 사용되는 맥락으로부터 명백하게 반대가 표시되거나 명백하게 드러나지 않는 한 그 용어 및 구절이 기술분야에서 획득한 의미를 포함한다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 어떠한 방법 및 재료든지 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 재료가 아래에서 기술된다. 언급된 모든 출판물은 본원에 참조로 포함된다.

정의

본원에서 사용된 것과 같은 용어 "배 줄기 세포" 또는 "ES 세포"는 시험관 내에서 미분화된 증식을 할 수 있는 배-유도된 분화전능성 또는 다능성 세포를 포함하고, 배 안에 도입될 때 발달하는 배의 어떠한 조직으로도 기여할 수 있다. 본원에서 사용된 것과 같은 용어 "다능 세포"는 하나 이상의 분화된 세포 유형으로 발달할 수 있는 능력을 가지고 있는 미분화된 세포를 포함한다.

면역글로불린 핵산 서열과 관련하여 용어 "생식선"은 자손에게 계대될 수 있는 핵산 서열을 포함한다.

구절 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 어떠한 유기체로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하여, 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 다르게 명시되지 않는 한 세 개의 중쇄 CDR 및 네 개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 중쇄 단편은 CDR, CDR과 FR 및 그것들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인에 이어서(N-말단으로부터 C-말단 쪽으로): C_H1 도메인, 힌지, C_H2 도메인 및 C_H3 도메인을 가진다. 중쇄의 기능성 단편은 에피토프를 특이적으로 인지할 수 있고(예컨대 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 K_D로 에피토프를 인지할 수 있음), 세포로부터 발현되고 분비될 수 있으며, 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 일반적으로 생식선에 존재하는 V_H, D_H 및 J_H 절편의 레퍼토리로부터 유도된 V_H, D_H 및 J_H 절편을 포함하는 가변 영역 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된다. 다양한 유기체에 대하여 V, D 및 J 중쇄 절편에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스에서 찾아볼 수 있고, URL "imgt.org"에서 월드 와이드 웹(www) 상에서 인터넷을 통해 접근할 수 있다.

구절 "경쇄"는 어떠한 유기체로부터의 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하고, 다르게 명시되지 않는 한 사람 카파(κ) 및 람다(λ) 경쇄 및 VpreB, 및 대체 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 전형적으로, 다르게 명시되지 않는 한 세 개의 경쇄 CDR과 네 개의 FR을 포함한다. 일반적으로 전체 길이의 경쇄는 아미노 말단으로부터 카르복실 말단 방향으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 가변 도메인과 경쇄 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 일반적으로 생식선에 존재하는 경쇄 V 및 J 유전자 절편의 레퍼토리로부터 유도된 경쇄 V_L 및 경쇄 J_L 유전자 절편을 포함하는 경쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열에 의해 코드화된다. 다양한 유기체에 대한 경쇄 V 및 J 유전자 절편에 대한 서열, 위치 및 명명법은 IMGT 데이터베이스에서 찾아볼 수 있고, URL "imgt.org"에서 월드 와이드 웹(www) 상에서 인터넷을 통해 접근할 수 있다. 경쇄는 예를 들면 그것들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 첫 번째 또는 두 번째 에피토프 중 어느 하나에 선택적으로 결합하지 않는 것들을 포함한다. 경쇄는 또한 그것들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 하나 또는 그 이상의 에피토프에 결합하고 그것들을 인지함으로써 중쇄와 결합하고, 인지하거나 또는 보조하는 것들을 포함한다.

본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "상동성 핵산"은 공지된 참조 서열에 동일하거나 실질적으로 유사한 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 용어 "상동성 핵산"은 공지된 참조 서열에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 심지어 100% 동일한 DNA 또는 RNA 서열을 특징짓기 위해 사용된다.

본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "이종상동성 핵산"은 다른 종의 공지된 참조 서열에 대해 기능적으로 동등한 한 종으로부터의 핵산 서열을 포함한다.

본원에서 사용되는 것과 같은 용어 "큰 표적화 벡터" 또는 "LTVEC"는 전형적으로 진핵 세포에서 상동성 표적화를 수행하기 위해 의도된 다른 접근법에 의해 사용된 것보다 큰 클론된 게놈 핵산의 단편으로부터 유도된, 진핵 세포에 대한 큰 표적화 벡터를 포함한다. LTVEC의 크기는 종래의 분석, 예를 들면 서던 블롯팅 및 긴-범위(예컨대 1kb 내지 5kb) PCR에 의해서 표적화 사건의 선별을 가능하게 하기에는 너무 크다. LTVEC의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 박테리아 인공 염색체(BAC) 및 효모 인공 염색체(YAC)로부터 유도된 벡터를 들 수 있다.

용어 "대립유전자의 변형" 또는 "MOA"는 게놈의 유전자(들) 또는 염색체 유전자좌(들)의 한 대립유전자의 정확한 DNA 서열의 변형을 포함한다. "대립유전자의 변형(MOA)"의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 단일 뉴클레오티드와 같이 아주 작은 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 삽입 또는 관심의 유전자(들) 또는 염색체 유전자좌(들)에 걸쳐 있는 수 킬로염기쌍의 결실, 뿐만 아니라 이들 두 개의 극단 사이에 있는 모든 가능한 변형을 포함한다.

본원에 사용된 것과 같은 용어 "뉴클레아제"는 핵산 서열에서 절단, 예컨대 이중-가닥 DNA 서열에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유도하는 제제를 포함한다. 뉴클레아제는 사전선택되거나 특이한 서열에 결합하고 그 사전선택되거나 특이한 서열에서 또는 그 근처에서 절단하는 것들, 예를 들면 공학처리된 아연 집게 뉴클레아제 및 공학처리된 TAL 이펙터 뉴클레아제를 포함한다. 뉴클레아제는 ZFN 및 TAL 이펙터 뉴클레아제에 한정되지 않을 뿐 아니라 개선된 표적화 효율을 이루기 위하여 LTVEC와 함께 사용하기에 적당한 어떠한 뉴클레아제라도 될 수 있다. 비-제한적인 실례로는 다른 아연 집게-기초 뉴클레아제 및 사전선택된 또는 특이한 서열에서 절단하는 공학처리된 메가뉴클레아제를 포함한다.

본 발명과 함께 사용하기에 적당한 TAL 이펙터 뉴클레아제는 기술분야에 공지되어 있는 어떠한 TAL 뉴클레아제든지 포함한다. 적당한 TAL 뉴클레아제, 및 적당한 TAL 뉴클레아제의 제조 방법의 실례는 예를 들면 미국 특허 출원 번호 2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A1, 2005/0208489 A1, 2005/0026157 A1, 2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1 및 2006/0063231 A1(각각 본원에 참조로 포함됨)에 개시된다. 다양한 구체예에서, TAL 이펙터 뉴클레아제는 예컨대 관심의 게놈에서 표적 핵산 서열에서 또는 그 근처에서 절단하도록 공학처리되고, 이때 표적 핵산 서열은 LTVEC에 의해 변형될 서열에 또는 그 근처에 있다. TAL 이펙터 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 도메인 및 하나 또는 그 이상의 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질이고, 이때 하나 또는 그 이상의 TAL 이펙터 DNA 결합 도메인은 사전선택된 또는 특이한 핵산 서열을 인지하는 서열을 포함한다. 본 발명과 함께 사용하기에 적당한 TAL 뉴클레아제는 본원에 기술된 것과 같은 LTVEC에 의해 변형될 표적 핵산 서열에서 또는 그 근처에서 결합하도록 특이하게 디자인된 것들을 포함한다.

구절 "작동가능하게 연결된"은 성분들이 그것들의 의도된 방식으로 작동가능하게 연결되어 기능하게 되는 관계를 말한다. 한 가지 경우에, 단백질을 코드화하는 핵산 서열은 조절 서열(예컨대 프로모터, 인핸서, 침묵 서열 등)에 작동가능하게 연결됨으로써 적절한 전사 조절을 보유할 수 있다. 한 가지 경우에, 면역글로불린 가변 영역(또는 V(D)J 절편)의 핵산 서열은 면역글로불린 불변 영역의 핵산 서열에 작동가능하게 연결됨으로써 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 서열 안으로 서열 간의 적절한 재조합이 허용될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "프로모터" 및 "프로모터 조절 요소" 등은 핵산 단편 또는 유전자 내에서 그 유전자의 발현을 조절하는 뉴클레오티드 서열 요소를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "재조합 부위"는 부위-특이적 재조합효소에 의해 인지되고 재조합 사건에 대한 기질로서 작용할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "부위-특이적 재조합효소"는 "재조합 부위들" 사이의 재조합을 용이하게 할 수 있는 효소의 그룹을 나타내고, 이때 두 개의 재조합 부위는 단일 핵산 분자 내에서 또는 별도의 핵산 분자 상에서 물리적으로 떨어져 있다. "부위-특이적 재조합효소"의 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 Cre, Flp 및 Dre 재조합효소가 있다.

LTVEC 및 뉴클레아제 제제를 사용한 게놈 유전자좌의 변형

비-사람 동물의 다양한 게놈 유전자좌를 표적화하는 데 있어서 많은 진전이 이루어지긴 하였지만, 여전히 종래의 표적화 전략을 사용하여 표적화될 수 없는 많은 게놈 유전자좌 또는 세포 유형이 남아 있다. 실패에 대한 이유들은 다양할 수 있지만, 본원에서와 같이, 종래의 표적화 방법에 의해 전혀 성공적으로 표적화되지 않거나, 또는 부적절하게 표적화되거나 또는 상당히 낮은 효율로 표적화되는 유전자좌 또는 세포가 있다. 종래의 표적화 방법은 종래의 표적화 벡터를 사용하는 상동 재조합을 사용하는 표적화를 포함한다. 표적화하기 어려운 유전자좌로는 LTVEC 단독으로도 표적화될 수 없는, 즉 재조합유전성 단일 또는 이중 가닥-절단의 형태로 보조받을 수 없거나, 또는 재조합유전성 단일 또는 이중-가닥 절단의 부재 하에 부적절하게 또는 낮은 효율로 LTVEC로 표적화되는 유전자좌를 포함한다.

큰 표적화 벡터 또는 LTVEC와 함께, 재조합유전성 단일 또는 이중-가닥 절단을 형성할 수 있는 뉴클레아제를 사용하여 핵산 서열을 표적화하기 위한 조성물 및 방법이 제공되는데, 이때 표적화된 핵산 서열(또는 표적화된 핵산 서열 근처에 있는 서열)은 LTVEC에 의해 변형된다. 조성물 및 방법은 종래의 표적화 전략을 사용하여, 심지어 LTVEC를 단독으로 사용할 때조차도 변형이 어렵거나 불가능한 게놈 핵산 서열을 변형하기에 유용하다.

다양한 측면으로, 표적 핵산, 예컨대 게놈의 유전자좌에 변형을 만들기 위하여 LTVEC를 사용하기 위한 조성물 및 방법이 제공되는데, 이때 표적 핵산은 LTVEC의 서열에 의해 변형될(LTVEC를 사용한 표적 핵산의 상동 재조합에 의해) 표적 서열을 포함하고, 단일 또는 이중-가닥 절단은 표적 핵산에서 표적 서열에서 또는 그 근처에서 만들어진다.

다양한 구체예에서, 표적 핵산에서 또는 그 근처에서 단일 또는 이중 가닥 절단의 존재는 LTVEC와 표적 핵산 사이의 재조합의 효율 및/또는 빈도를 증가시킨다. 한 구체예에서, 재조합은 상동 재조합이다. 다른 구체예에서, 재조합은 비-상동성 단부 결합에 의한 삽입이다. 다양한 구체예에서, 단일 또는 이중 가닥 절단이 있을 때 표적 게놈 유전자좌에서의 LTVEC 서열의 표적화 효율은 단일 또는 이중-가닥 절단이 없을 때(예컨대 동일한 LTVEC와 동일한 표적 서열을 포함하고 있는 동일한 표적 핵산을 사용하지만 단일 또는 이중 가닥 절단을 만드는 뉴클레아제가 첨가되지 않는 경우)보다 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배 더 높다.

본 발명과 함께 사용하기에 적당한 LTVEC, 및 그것을 만들기 위한 방법은 예를 들면 미국 특허 제 6,586,251호, 6,596,541호, 7,105,348호 및 WO 2002/036789(PCT/US01/45375)에 기술되어 있다.

LTVEC를 마우스 다능 세포, 예컨대 마우스 ES 세포에 도입하는 것에 관한 구체예들에 대해 집중적으로 논의되었지만, LTVEC를 다양한 포유류 세포 유형에 도입하기 위한 다른 방법들도 본원에 제공된다. 그런 포유류 세포로는 본원에 개시된 것과 같은 방법에 따라 유전자 변형될 수 있는 모든 포유류 세포, 이를테면 예컨대 마우스 세포, 쥐 세포, 토끼 세포, 돼지 세포, 소 세포, 사슴 세포, 양 세포, 염소 세포, 닭 세포, 고양이 세포, 개 세포, 담비 세포, 영장류(예컨대 마모셋, 붉은 털 원숭이) 세포 등을 포함한다. 어떤 구체예에서, 적당한 유전자 변형가능한 다능 세포에 대한 그런 포유류는 쉽게 활용가능하지 않으며, 체세포를 다능 세포 안으로 재프로그래밍하기 위한 다른 방법, 예를 들면 다능성-유도 인자들, 예를 들면, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 Oct3/4, Sox2, KLF4, Myc, Nanog, LIN28 및 Glis1의 조합을 체세포 안으로 도입시키는 것을 통한 방법이 사용된다.

한 구체예에서, 상류 및 하류 상동성 아암은 표적화된 게놈과 동일한 게놈으로부터 유래된다. 한 구체예에서, 상동성 아암은 관련된 게놈으로부터 유래된다. 예를 들어 표적화된 게놈은 첫 번째 균주의 마우스 게놈이고, 표적화 아암은 두 번째 균주의 마우스 게놈으로부터 유래하는데, 이때 첫 번째 균주 및 두 번째 균주는 상이하다. 한 구체예에서, 표적화 아암은 BAC 라이브러리, 코스미드 라이브러리 또는 P1 파지 라이브러리로부터 유래된다. 한 구체예에서, 상동성 아암은 합성 DNA로부터 유도된다. 한 구체예에서, 상동성 아암은 종래 방법을 사용하여 표적화될 수 없는 유전자로부터 유도된다. 특정 구체예에서, 상동성 아암은 종래의 표적화 기술을 사용하여 표적화될 수 없거나, 또는 뉴클레아제 제제에 의해 유도된 단일 또는 이중-가닥 절단이 없을 때 단지 부정확하게 또는 상당히 낮은 효율로 표적화되는 유전자로부터 유래된다.

다양한 구체예에서, 표적화된 변형의 확인을 용이하게 하기 위하여 고출력 정량 분석, 즉 대립유전자의 변형(MOA) 분석이 사용된다. 본원에 기술된 MOA 분석은 유전자 변형 후 원래의 염색체에서 변형된 대립유전자(들)의 대규모 선별을 가능하게 한다. MOA 분석은 다양한 기법, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 정량 PCR, 예컨대 실시간 PCR(qPCR)을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어 실시간 PCR은 표적 유전자좌를 인지하는 첫 번째 프라이머 세트와 비-표적화된 참조 유전자좌를 인지하는 두 번째 프라이머 세트를 포함한다. 또한, 프라이머 세트는 증폭된 서열을 인지하는 형광 프로브를 포함한다. 정량 분석은 또한 다양한 분석 기법, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 형광-중재된 제자리 혼성화(FISH), 비교 게놈 혼성화, 등온성 DNA 증폭, 고정된 프로브(들)에 대한 정량적 혼성화, 침입자 프로브®, MMP 분석®, TaqMan® Molecular Beacon 및 Eclipse^TM 프로브 기법을 통해 수행될 수 있다(예컨대 US2005/144655 참조).

어떤 구체예에서, 본원에 기술된 표적 게놈 유전자좌의 다양한 유전자 변형은 박테리아 세포에서 박테리아 인공 염색체(BAC) DNA로부터 VELOCIGENE® 유전자 공학처리 기술을 사용하여 유도된 LTVEC를 사용하여 일련의 상동 재조합 반응에 의해 수행될 수 있다(예컨대 미국 특허 제 6,586,251호 및 Valenzuela, D.M. et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6):652-659 참조).

어떤 구체예에서, 본원에 기술된 것과 같은 다양한 유전자 변형을 포함하는 표적화된 마우스 ES 세포는 공여 ES 세포로서 사용되어 상실배-전 단계의 마우스 배, 예컨대 8-세포 단계 마우스 배에 VELOCIMOUSE® 방법을 통해 도입된다(예컨대 US 7,576,259, US 7,659,442, US 7,294,754 및 US 2008-0078000 A1 참조). 유전자 변형된 ES 세포를 포함하고 있는 마우스 배는 배반포 단계까지 인큐베이션된 후 대리모에 이식되어 F0 마우스가 생산된다. 유전자 변형된 게놈 유전자좌를 내포한 마우스는 본원에 기술된 것과 같은 대립유전자의 변형(MOA) 분석을 통해 확인될 수 있다. 유전자 변형된 ES 세포로부터 유도된 그 결과의 F0 세대 마우스는 야생형 마우스와 교배되어 F1 세대 자손이 얻어진다. 특이한 프라이머 및/또는 프로브를 사용한 유전자형 분류 후에, 유전자 변형된 게놈 유전자좌에 대해 이형접합성인 F1 새끼들은 상호간에 교배되어 유전자 변형된 게놈 유전자좌에 대해 동형접합성인 마우스들을 생산한다.

본원에서 사용된 것과 같이, 그리고 첨부되는 청구범위에서와 같이, 단일 형태를 지칭하는 표현들은 맥락에서 분명하게 다른 표시가 없는 한 복수의 언급을 포함하는 것으로 주지되어야 한다. 본원에서 사용된 기술적이고 과학적인 모든 용어들은 동일한 의미를 가진다.

본원에서 논의된 출판물들은 본 발명의 출원일 전에 그것들의 개시된 내용에 대해서만 제공된다. 본원에는 기술된 발명이 선행 발명에 의해 그런 출판물보다 앞선 것으로 청구되지 않았음이 인정되는 것으로 간주될 만한 것이 없다. 나아가 제공된 출판물의 공개일은 실제 공개일과 다를 수 있으며, 그것은 독립적으로 확인될 필요가 있다.

기술된 발명은 사상 또는 그것의 본질적인 특징으로부터 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태로 포함될 수 있고, 따라서 참조는 본 발명의 범주를 나타내는 것으로서, 전술한 명세서보다는 오히려 첨부되는 청구범위에 대해 이루어져야 한다.

실시예

다음의 실시예는 본 발명의 완전한 개시내용과 본 발명을 이루고 사용하는 방법에 대한 설명을 기술분야의 숙련자들에게 제공하기 위해 제공되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하거나 아래에 제공되는 실험이 전부의 또는 유일하게 수행된 실험임을 나타내려는 의도가 아니다. 사용된 수(예컨대 양, 온도 등)에 관련하여 정확성을 보장하기 위하여 많은 노력이 기울여졌지만, 일부 실험적 실수와 편차에 대해서는 설명될 것이다. 다른 표시가 없는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.

실시예 1. 아연 집게 뉴클레아제(ZFN)에 의한 증대된 LTVEC 표적화

유전자에서 아연 집게 뉴클레아제(ZFN)에 의한 이중-가닥 절단이 LTVEC(큰 BAC-기초 표적화 벡터)에 의한 동일한 유전자의 표적화를 증대시킬 수 있는지를 시험하기 위하여, II2rg 유전자를 표적화하는 LTVEC와 다음의 조합으로 ZFN 쌍의 각각의 절반을 코드화하는 플라스미드를 사용하여 F1H4 ES 세포 안으로 세 개의 일렉트로포레이션을 수행하였다: (1) 1.5㎍의 II2rg LTVEC 단독; (2) 20㎍의 II2rg ZFN-1 + 20㎍의 II2rg LTVEC ZFN-2 + 1.5㎍의 II2rg LTVEC; 및 (3) 20㎍의 II2rg ZFN-1 + LTVEC가 없는 20㎍의 II2rg ZFN-2.

본원에 사용된 ZFN-1과 ZFN-2를 (1) 표적 서열의 각 가닥에서 6bp의 절단 부위에 의해 분리된 두 개의 연속적인 표적 DNA 서열을 인지하는 아연 집게 DNA 결합 도메인; 및 (2) 표적 부위에서 이중-가닥을 이량체화하고 절단을 만드는 FokI 뉴클레아제를 함유하도록 디자인하였다. 보다 구체적으로, ZFN-1의 아연 집게 도메인을 II2rg 유전자의 엑손 1의 센스 가닥에서 5'-AGCTCCAAGGTCCTC-3'(SEQ ID NO:1)을 인지하도록 디자인하였고; ZFN-2의 아연 집게 도메인을 엑손 1의 안티-센스 가닥에서 5'-GTCTTCATTCGCACT-3'(SEQ ID NO:2)을 인지하도록 디자인하였다.

LTVEC(VelociGene MAID 5057L1)를, IL-2 수용체 감마 사슬에 대한 코딩 서열 전부를 포함하여 II2rg 유전자의 대략 3,000 염기쌍(3kb)을 결실하고, 그 내인성 서열을 하이그로마이신 B에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트란스페라제를 발현하는 선택 카세트로 대체하도록 디자인하였다. LTVEC 5057L1은 상업적으로 활용가능한 BAC 라이브러리(BAC ES Release 2; Incyte Genomics)로부터 분리된 원래의 BAC 클론 290o15로부터 유도하였고, 약 90kb(상동성 아암 1) 및 약 8kb(상동성 아암 2)의 두 개의 큰 상동성 아암을 함유한다.

일렉트로포레이션 (1) 및 (2)를 위해서 하이그로마이신 B-내성 콜로니를 분리하였다. 일렉트로포레이션 (3)을 위해서는 콜로니가 약물 선택 없이 형성되도록 하였다. 각 일렉트로포레이션으로부터 콜로니를 취하여 96-웰 플레이트에 배양한 후, LTVEC에 의한 II2rg 유전자의 정확학 표적화에 의해 생성된 3kb 결실을 검출하도록 디자인된 대립유전자-상실(LOA) 분석에 의해 표적화 사건에 대해 선별하였다. LOA 분석을 또한 엑손 1에서 ZFN에 의해 유도된 절단 사건을 검출하기 위해 사용하였다.

표적화된 3kb 결실에 대한 LOA 분석

5057U2 분석 (인트론 2)
전방 프라이머	5'-GGAGGGTAGCACGGGAAGAAG-3'	SEQ ID NO:3
역 프라이머	5'-GCTGGCTACCCACTTGATTGG-3'	SEQ ID NO:4
TaqMan® 프로브	5'-TCAAGCAGTCTCTCCCAGCTAACCTCCCT-3'	SEQ ID NO:5
5057D2 분석 (인트론 7)
전방 프라이머	5'-CAGGATGTGGCTGACCAAATG-3'	SEQ ID NO:6
역 프라이머	5'-GGCTCCTAATGCCCTGTAGTTTC-3'	SEQ ID NO:7
TaqMan® 프로브	5'-CCGTCTCTCTGCCTAGCCCACCCT-3'	SEQ ID NO:8

ZFN 절단에 대한 LOA 분석

전방 프라이머	5'-CAGCTGCTCCTGCTGAGG-3'	SEQ ID NO:9
역 프라이머	5'-CCTACCAGCTTTGATGTCTTCATTC-3'	SEQ ID NO:10
TaqMan® 프로브	5'-AGCTCCAAGGTCCTCATGTCCAGT-3'	SEQ ID NO:11

LTVEC의 표적화 효율의 비교

EP	LTVEC (㎍)	ZFN-1 (㎍)	ZFN-2 (㎍)	분석된 클론 수	LTVEC에 의해 정확하게 표적화된 클론	표적화 효율(%)	ZFN으로 절단된 클론	ZFN 절단 효율(%)
1	1.5	0	0	26	5	19.2	ND¹	ND¹
2	1.5	20	20	102	76	74.5	7²	6.9
3	0	20	20	192	0	0	6	3.1

¹: 측정되지 않음.

²: LTVEC에 의해 정확하게 표적화되지 않은 클론 중에서

상기 표 3으로부터 알 수 있는 것과 같이, 표적 유전자에서 부위를 절단하도록 디자인된 ZFN을 코드화하는 플라스미드를 동일한 유전자를 표적으로 하는 LTVEC와 조합하였을 때(EP #2), LTVEC 단독(EP #1)과 비교하여 표적화 효율의 상당한 증대(기술된 실험에서 대략 약 4배 증가)가 이루어졌다.

기술된 발명이 발명의 특정 구체예를 참조로 기술되었지만, 기술분야의 숙련자들은 발명의 진정한 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 이루어질 수 있고 동등물이 교체될 수 있다는 것을 인지해야 한다. 또한, 기술된 발명의 객관적인 사상 및 범주에 대해 특별한 상황, 재료, 물질의 조성, 과정, 과정 단계 또는 단계들이 채택될 수 있다. 그런 모든 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Frendewey, David Auerbach, Wojtek Valenzuela, David M. Yancopoulos, George D. Lai, Ka-Man Venus <120> Nuclease-Mediated Targeting With Large Targeting Vectors <130> 57766-443601 <150> 61/638,267 <151> 2012-04-25 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 1 agctccaagg tcctc 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 2 gtcttcattc gcact 15 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 3 ggagggtagc acgggaagaa g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 4 gctggctacc cacttgattg g 21 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 5 tcaagcagtc tctcccagct aacctccct 29 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 6 caggatgtgg ctgaccaaat g 21 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 7 ggctcctaat gccctgtagt ttc 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 8 ccgtctctct gcctagccca ccct 24 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 9 cagctgctcc tgctgagg 18 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 10 cctaccagct ttgatgtctt cattc 25 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 11 agctccaagg tcctcatgtc cagt 24

Claims

포유류 세포에서 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 방법으로서, 그 방법은
(a) (i) 표적 게놈 유전자좌에서 또는 그 근처에서 단일 또는 이중-가닥 절 단을 만드는 뉴클레아제 제제 및
(ii) 상류 상동성 아암 및 하류 상동성 아암이 양 옆에 있는 삽입물 핵 산 서열을 포함하는 큰 표적화 벡터(LTVEC)
를 포유류 세포에 도입하는 단계; 그리고
(b) 표적 게놈 유전자좌에 삽입물 핵산을 포함하는 표적화된 포유류 세포를 선택하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 포유류 세포는 다능 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 포유류 세포는 유도된 다능 줄기(iPS) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 다능 세포는 마우스 배 줄기(ES) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 다능 세포는 조혈 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 다능 세포는 뉴런 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 포유류 세포는 사람 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 포유류 세포는 질병에 걸린 환자로부터 분리된 사람 세포이고, 사람 세포는 그것의 게놈에 적어도 하나의 사람 질병 대립유전자를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 삽입물 핵산의 표적 게놈 유전자좌 안으로의 통합으로 인해 게놈에서 적어도 하나의 사람 질병 대립 유전자가 대체되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, LTVEC와 뉴클레아제 제제와의 조합된 사용은 LTVEC 단독의 사용과 비교하여 증가된 표적화 효율을 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, LTVEC의 표적화 효율은 LTVEC 단독의 사용과 비교하여 적어도 2배 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 뉴클레아제 제제는 뉴클레아제를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구성물이고, 그 핵산은 포유류 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 뉴클레아제 제제는 뉴클레아제를 코드화하는 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 뉴클레아제는 아연 집게 뉴클레아제(ZFN)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 뉴클레아제는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 뉴클레아제는 메가뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 뉴클레아제 제제의 표적 서열은 표적 게놈 유전자좌의 인트론, 엑손, 프로모터, 프로모터 조절 영역 또는 인핸서 영역에 위치한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상류 상동성 아암과 하류 상동성 아암의 총 합은 적어도 10kb인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 삽입물 핵산 범위는 길이가 약 5kb부터 약 300kb까지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 삽입물 핵산은 선택 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 삽입물 핵산은 리포터 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 삽입물 핵산의 표적 게놈 유전자좌 안으로의 통합은 표적 게놈 유전자좌에서 내인성 유전자의 결실을 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 삽입물 핵산의 표적 게놈 유전자좌 안으로의 통합은 표적 게놈 유전자좌에서 외인성 서열의 첨가를 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 삽입물 핵산의 표적 게놈 유전자좌 안으로의 통합은 녹아웃, 녹-인, 점 돌연변이, 도메인 교체, 엑손 교체, 인트론 교체, 조절 서열 교체, 유전자 교체 또는 그것들의 조합을 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 삽입물 핵산은 사람 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 삽입물 핵산은 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열, 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열 또는 그것들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제 26항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3 및 그것들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 삽입물 핵산은 λ 경쇄 불변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 불변 영역 핵산 서열로부터 선택된 마우스 또는 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 사람 λ 또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 삽입물 핵산은 λ 경쇄 불변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 불변 영역 핵산 서열로부터 선택된 마우스 또는 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열된 사람 λ 또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 선택 단계(b)는 대립유전자의 변형(MOA) 분석을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 삽입물 핵산은 포유류 세포의 게놈의 핵산 서열에 대해 상동성인 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 삽입물 핵산은 포유류 세포의 게놈의 핵산 서열에 대해 이종상동성인 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 삽입물 핵산은 상이한 종으로부터의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 표적화된 포유류 세포는 그것의 게놈에 약 5kb 내지 약 300kb 범위의 삽입물 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
원핵 세포에서 박테리아성 상동 재조합(BHR)을 통해 포유류의 표적 게놈 유전자좌를 변형시키는 방법으로서, 그 방법은
(a) (i) 양 옆에 첫 번째 상류 상동성 아암과 첫 번째 하류 상동성 아암이 있는 삽입물 핵산을 포함하는 표적화 벡터, 및
(ii) 표적 게놈 유전자좌에서 또는 그 근처에서 단일 또는 이중-가닥 절 단을 만드는 뉴클레아제 제제
를 포유류의 표적 게놈 유전자좌를 포함하고 있는 원핵 세포 안에 도입하는 단계, 그리고
(b) 삽입물 핵산을 포함하고 있는 표적화된 원핵 세포를 선택하는 단계로 이루어지며,
이때 표적 게놈 유전자좌는 두 번째 상류 상동성 아암과 두 번째 하류 상동성 아암을 포함하는 큰 표적화 벡터(LTVEC)에 존재하고,
상기 원핵 세포는 BHR을 중재하는 재조합효소를 발현할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 포유류는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 포유류는 설치류인 것을 특징으로 하는 방법.
제 38항에 있어서, 설치류는 마우스, 쥐 또는 햄스터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 표적화 벡터와 뉴클레아제 제제와의 조합된 사용은 표적화 벡터 단독의 사용과 비교하여 증가된 표적화 효율을 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 40항에 있어서, 표적화 효율은 표적화 벡터 단독의 사용과 비교하여 적어도 2배 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 원핵 세포는 대장균의 재조합-경합 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 원핵 세포는 재조합효소를 코드화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 원핵 세포는 재조합효소를 코드화하는 핵산을 포함하지 않으며, 재조합효소를 코드화하는 핵산이 원핵 세포 안으로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 뉴클레아제 제제는 뉴클레아제를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구성물이고, 그 핵산은 원핵 세포에서 활성인 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 뉴클레아제 제제는 뉴클레아제를 코드화하는 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 45항에 있어서, 뉴클레아제는 아연 집게 뉴클레아제(ZFN)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 45항에 있어서, 뉴클레아제는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 45항에 있어서, 뉴클레아제는 메가뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 뉴클레아제 제제의 표적 서열은 표적 게놈 유전자좌의 인트론, 엑손, 프로모터, 프로모터 조절 영역 또는 인핸서 영역에 위치한 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 두 번째 상류 상동성 아암과 두 번째 하류 상동성 아암의 총 합은 적어도 10kb인 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 삽입물 핵산의 범위는 길이로 약 5kb 내지 약 300kb인 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 삽입물 핵산은 선택 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 삽입물 핵산은 리포터 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 삽입물 핵산의 표적 게놈 유전자좌 안으로의 통합은 표적 게놈 유전자좌에서 내인성 유전자의 결실을 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 삽입물 핵산의 표적 게놈 유전자좌 안으로의 통합은 표적 게놈 유전자좌에서 외인성 서열의 첨가를 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 삽입물 핵산의 표적 게놈 유전자좌 안으로의 통합은 녹아웃, 녹-인, 점 돌연변이, 도메인 교체, 엑손 교체, 인트론 교체, 조절 서열 교체, 유전자 교체 또는 그것들의 조합을 초래하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 삽입물 핵산은 사람 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
제 58항에 있어서, 삽입물 핵산은 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열, 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열 또는 그것들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제 59항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 C_H1, 힌지, C_H2, C_H3 및 그것들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 삽입물 핵산은 λ 경쇄 불변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 불변 영역 핵산 서열로부터 선택된 마우스 또는 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열되지 않은 사람 λ 또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 삽입물 핵산은 λ 경쇄 불변 영역 핵산 서열 및 κ 경쇄 불변 영역 핵산 서열로부터 선택된 마우스 또는 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 재배열된 사람 λ 또는 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 36항에 있어서, 선택 단계(b)는 대립유전자의 변형(MOA) 분석을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.