JP2015514439A - 大きい標的化ベクターによるヌクレアーゼ媒介標的化 - Google Patents

Abstract

標的ゲノム遺伝子座またはその近傍における一本鎖切断または二本鎖切断によって促進される相同組換えを使用することによって、標的ゲノム遺伝子座において、１つまたは複数の標的化された遺伝子改変を作製するための組成物および方法が提供される。操作されたヌクレアーゼを使用して、原核細胞または真核細胞におけるＬＴＶＥＣと標的ゲノム遺伝子座との間の相同組換えの効率を促進するための組成物および方法もまた、提供される。

Description

本出願は、２０１２年４月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／６３８，２６７号の優先権の利益を請求し、その全体が参照によって本開示に組み込まれる。

標的ゲノム遺伝子座において相同組換えを達成するための、ヌクレアーゼおよび標的化ベクター（例えば、大きい標的化ベクター、「ＬＴＶＥＣ」）を含むＤＮＡ構築物。標的ゲノム遺伝子座またはその近傍における一本鎖切断または二本鎖切断によって促進される相同組換えを介して、標的化された遺伝子改変を作製するための組成物および方法。操作されたヌクレアーゼを使用して原核細胞または真核細胞におけるＬＴＶＥＣと標的ゲノム遺伝子座との間の相同組換えの効率を促進するための組成物および方法。

ゲノム遺伝子座において特定の核酸配列を付加、欠失または置換するように特に設計された標的化ベクターを使用する相同組換えは、非ヒト動物における所望のゲノム改変を達成するための一般的なアプローチである。標的ゲノム遺伝子座またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を導入するように特に操作されたヌクレアーゼが、その標的ゲノム遺伝子座における相同組換えの効率を増強するために、標的化ベクターと一緒に使用され得る。

相同組換えを介したゲノム改変の分野は、過去２０年間にわたってかなり進歩したが、げっ歯類ゲノムの大きい部分が大きいヒトゲノム断片で置換される場合などの多くの状況では、非常に大きい標的化ベクターＬＴＶＥＣを使用して許容可能な標的化頻度を達成すること、またはある特定の細胞型、例えば、線維芽細胞もしくは他の体細胞を標的化することには、なお困難が存在したままである。ＬＴＶＥＣを使用して真核生物ゲノムの大きいゲノム遺伝子座を改変するためのさらなる改善された方法の必要性が、当該分野に存在する。

対象のゲノム遺伝子座における大きい核酸配列の効率的な欠失、付加（例えば、挿入）および／または置換を可能にする、ヌクレアーゼ剤と組み合わせて大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を使用して対象のゲノム遺伝子座を改変するための組成物および方法が提供される。

細菌相同組換え（ＢＨＲ）を介してＬＴＶＥＣおよびヌクレアーゼ剤を使用して原核細胞において哺乳動物の標的ゲノム遺伝子座を改変するための組成物および方法が提供され、このＢＨＲは、ヌクレアーゼ剤によって創出される、標的ゲノム遺伝子座またはその近傍における一本鎖切断または二本鎖切断によって促進される。ＬＴＶＥＣと、発現の際に標的部位またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を導入することが可能なヌクレアーゼ剤とを含む原核細胞が提供される。本明細書に記載される種々のＬＴＶＥＣおよびヌクレアーゼを使用することによって、組換え誘導の原核細胞において、外因性核酸配列、例えば、相同なまたはオルソロガスなヒトゲノム核酸配列によって非ヒト動物の大きいゲノム遺伝子座を置換するための組成物および方法が提供される。

種々の多能性哺乳動物細胞においてＬＴＶＥＣおよびヌクレアーゼ剤を使用して対象のゲノム遺伝子座を改変するための組成物および方法が提供される。本明細書に記載される種々のＬＴＶＥＣおよびヌクレアーゼを使用することによって、非ヒト動物の多能性細胞において、外因性核酸配列、例えば、相同なまたはオルソロガスなヒトゲノム核酸配列によって非ヒト動物の大きいゲノム遺伝子座を置換するための組成物および方法が提供される。

本明細書に記載される種々のＬＴＶＥＣおよびヌクレアーゼ剤を含む非ヒト動物の多能性細胞が提供される。

本明細書に記載される１つまたは複数の標的化された遺伝子改変を含む遺伝子改変された非ヒト動物を生成するための組成物および方法が提供される。

一態様では、標的遺伝子座に対する相同性アームを含む大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、標的遺伝子座またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を作製するヌクレアーゼ剤をコードする核酸配列とを含む、原核細胞が提供される。

一実施形態では、この原核細胞は、細菌相同組換え（ＢＨＲ）を媒介するリコンビナーゼを発現することが可能である。一実施形態では、この原核細胞は、組換えコンピテント株のＥ．ｃｏｌｉである。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約５０ｋｂから約３００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約５０ｋｂから約７５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約７５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１００ｋｂから１２５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１２５ｋｂから約１５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１５０ｋｂから約１７５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１７５ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２００ｋｂから約２２５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２２５ｋｂから約２５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２５０ｋｂから約２７５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２７５ｋｂから約３００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、標的化ベクターの相同性アームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリーまたはＰ１ファージライブラリーから誘導される。一実施形態では、これらの相同性アームは、従来の方法を使用しては標的不能な非ヒト動物のゲノム遺伝子座から誘導される。一実施形態では、これらの相同性アームは、合成ＤＮＡから誘導される。

一実施形態では、上流相同性アームおよび下流相同性アームの総計は、少なくとも１０ｋｂである。一実施形態では、この上流相同性アームは、約５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この下流相同性アームは、約５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約５ｋｂから約１０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１０ｋｂから約２０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約２０ｋｂから約３０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約３０ｋｂから約４０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約４０ｋｂから約５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約５０ｋｂから約６０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約６０ｋｂから約７０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約７０ｋｂから約８０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約８０ｋｂから約９０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約９０ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１００ｋｂから約１１０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１１０ｋｂから約１２０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１９０ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、選択カセットを含む。一実施形態では、この選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含み、この核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、このプロモーターは、原核細胞において活性である。一実施形態では、このプロモーターは、原核細胞および真核細胞の両方において活性である。一実施形態では、この選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）ならびにそれらの組合せから選択される。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約５ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲のインサート核酸を含む。一実施形態では、このインサート核酸は、約５ｋｂから約１０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１０ｋｂから約２０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約２０ｋｂから約３０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約３０ｋｂから約４０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約４０ｋｂから約５０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約６０ｋｂから約７０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約８０ｋｂから約９０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約９０ｋｂから約１００ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１００ｋｂから約１１０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１９０ｋｂから約２００ｋｂまでである。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、部位特異的組換え標的配列に隣接した核酸を含むインサート核酸を含む。一実施形態では、この核酸はゲノム核酸を含む。一実施形態では、このゲノム核酸は、マウス、ヒトまたはそれらの組合せから誘導される。一実施形態では、この部位特異的組換え標的配列は、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘおよびそれらの組合せからなる群より選択される。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、条件的対立遺伝子を含むインサート核酸を含む。一実施形態では、この条件的対立遺伝子は、その全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されるような、多機能性対立遺伝子である。一実施形態では、この条件的対立遺伝子は、以下を含む：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス配向の発動配列、およびセンス配向またはアンチセンス配向の薬物選択カセット；（ｂ）アンチセンス配向の、対象のヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（ＮＳＩ）および反転モジュールにより条件的（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｂｙ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ）（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロンおよび反転可能なジーントラップ様モジュールを利用する；例えば、その全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照のこと）；ならびに（ｃ）第１のリコンビナーゼへの曝露の際に組み換わって、（ｉ）発動配列およびＤＳＣを欠きかつ（ｉｉ）センス配向でＮＳＩを含有しアンチセンス配向でＣＯＩＮを含有する条件的対立遺伝子を形成する、組換え可能な単位。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、選択カセットを含むインサート核酸を含む。一実施形態では、この選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含み、この核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、このプロモーターは、原核細胞において活性である。一実施形態では、この核酸は、原核細胞および真核細胞の両方において活性である。一実施形態では、この選択カセットは、部位特異的組換え標的配列に隣接している。一実施形態では、この選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）ならびにそれらの組合せから選択される。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、プロモーターに作動可能に連結したレポーター遺伝子を含むインサート核酸を含み、このレポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼおよびそれらの組合せからなる群より選択されるレポータータンパク質をコードする。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、内因性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、外因性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、特異的細胞型において発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、組織特異的様式で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、発生段階特異的様式で発現される。

一態様では、真核細胞のゲノム内の標的遺伝子座に対する相同性アームを含む大きい標的化ベクターと、標的遺伝子座またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を作製するヌクレアーゼ剤をコードする核酸配列とを含む、真核細胞が提供される。

一実施形態では、この真核細胞は、多能性細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、非ヒトＥＳ細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。一実施形態では、この誘導多能性（ｉＰＳ）細胞は、線維芽細胞から誘導される。一実施形態では、この誘導多能性（ｉＰＳ）細胞は、ヒト線維芽細胞から誘導される。一実施形態では、この多能性細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。一実施形態では、この多能性細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。一実施形態では、この多能性細胞は、胚盤葉上層幹細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、発生的に制限された前駆細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、げっ歯類多能性細胞である。一実施形態では、このげっ歯類多能性細胞は、ラット多能性細胞である。一実施形態では、このラット多能性細胞は、ラットＥＳ細胞である。一実施形態では、このげっ歯類多能性細胞は、マウス多能性細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。

一実施形態では、この真核細胞は、不死化マウス細胞または不死化ラット細胞である。一実施形態では、この真核細胞は、不死化ヒト細胞である。一実施形態では、この真核細胞は、ヒト線維芽細胞である。一実施形態では、この真核細胞は、がん細胞である。一実施形態では、この真核細胞は、ヒトがん細胞である。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約５０ｋｂから約３００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約５０ｋｂから約７５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約７５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１００ｋｂから１２５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１２５ｋｂから約１５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１５０ｋｂから約１７５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１７５ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２００ｋｂから約２２５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２２５ｋｂから約２５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２５０ｋｂから約２７５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２７５ｋｂから約３００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、標的化ベクターの相同性アームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリーまたはＰ１ファージライブラリーから誘導される。一実施形態では、これらの相同性アームは、従来の方法を使用しては標的不能な非ヒト動物のゲノム遺伝子座から誘導される。一実施形態では、これらの相同性アームは、合成ＤＮＡから誘導される。

一実施形態では、上流相同性アームおよび下流相同性アームの総計は、少なくとも１０ｋｂである。一実施形態では、この上流相同性アームは、約５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この下流相同性アームは、約５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約５ｋｂから約１０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１０ｋｂから約２０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約２０ｋｂから約３０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約３０ｋｂから約４０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約４０ｋｂから約５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約５０ｋｂから約６０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約６０ｋｂから約７０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約７０ｋｂから約８０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約８０ｋｂから約９０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約９０ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１００ｋｂから約１１０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１１０ｋｂから約１２０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１９０ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、選択カセットを含む。一実施形態では、この選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含み、この核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、このプロモーターは、原核細胞において活性である。一実施形態では、このプロモーターは、原核細胞および真核細胞の両方において活性である。一実施形態では、この選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）ならびにそれらの組合せから選択される。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約５ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲のインサート核酸を含む。一実施形態では、このインサート核酸は、約５ｋｂから約１０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１０ｋｂから約２０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約２０ｋｂから約３０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約３０ｋｂから約４０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約４０ｋｂから約５０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約６０ｋｂから約７０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約８０ｋｂから約９０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約９０ｋｂから約１００ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１００ｋｂから約１１０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１９０ｋｂから約２００ｋｂまでである。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、部位特異的組換え標的配列に隣接した核酸を含むインサート核酸を含む。一実施形態では、この核酸はゲノム核酸を含む。一実施形態では、このゲノム核酸は、マウス、ヒトまたはそれらの組合せから誘導される。一実施形態では、この部位特異的組換え標的配列は、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘおよびそれらの組合せからなる群より選択される。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、条件的対立遺伝子を含むインサート核酸を含む。一実施形態では、この条件的対立遺伝子は、その全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されるような、多機能性対立遺伝子である。一実施形態では、この条件的対立遺伝子は、以下を含む：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス配向の発動配列、およびセンス配向またはアンチセンス配向の薬物選択カセット；（ｂ）アンチセンス配向の、対象のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）および反転モジュールにより条件的（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロンおよび反転可能なジーントラップ様モジュールを利用する；例えば、その全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照のこと）；ならびに（ｃ）第１のリコンビナーゼへの曝露の際に組み換わって、（ｉ）発動配列およびＤＳＣを欠きかつ（ｉｉ）センス配向でＮＳＩを含有しアンチセンス配向でＣＯＩＮを含有する条件的対立遺伝子を形成する、組換え可能な単位。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、選択カセットを含むインサート核酸を含む。一実施形態では、この選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含み、この核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、このプロモーターは、原核細胞において活性である。一実施形態では、この核酸は、原核細胞および真核細胞の両方において活性である。一実施形態では、この選択カセットは、部位特異的組換え標的配列に隣接している。一実施形態では、この選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）ならびにそれらの組合せから選択される。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、プロモーターに作動可能に連結したレポーター遺伝子を含むインサート核酸を含み、このレポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼおよびそれらの組合せからなる群より選択されるレポータータンパク質をコードする。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、内因性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、外因性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、特異的細胞型において発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、組織特異的様式で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、発生段階特異的様式で発現される。

一態様では、原核細胞において細菌相同組換え（ＢＨＲ）を介して哺乳動物細胞の標的ゲノム遺伝子座を改変する方法が提供され、この方法は、
（ａ）哺乳動物の標的ゲノム遺伝子座を含む原核細胞中に、以下：
（ｉ）第１の上流相同性アームおよび第１の下流相同性アームに隣接したインサート核酸を含む標的化ベクター、および
（ｉｉ）標的ゲノム遺伝子座またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を作製するヌクレアーゼ剤、
を導入するステップ、ならびに
（ｂ）インサート核酸を含む標的化された原核細胞を選択するステップ、
を含み、
この原核細胞は、ＢＨＲを媒介するリコンビナーゼを発現することが可能である。

一実施形態では、この標的ゲノム遺伝子座は、ＦｃＥＲ１ａ遺伝子座、ＴＬＲ４遺伝子座、ＰＲＬＲ遺伝子座、Ｎｏｔｃｈ４遺伝子座、Ａｃｃｎ２遺伝子座、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、ＴＲＰＡ１遺伝子座、ＦｏｌＨ１遺伝子座、ＬＲＰ５遺伝子座およびＥＲＢＢ４遺伝子座から選択される。

一実施形態では、この標的ゲノム遺伝子座は、第２の上流相同性アームおよび第２の下流相同性アームを含む大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）中に存在する。一実施形態では、第２の上流相同性アームおよび第２の下流相同性アームの総計は、少なくとも１０ｋｂである。一実施形態では、この第２の上流相同性アームは、約５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の下流相同性アームは、約５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約５ｋｂから約１０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１０ｋｂから約２０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約２０ｋｂから約３０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約３０ｋｂから約４０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約４０ｋｂから約５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約５０ｋｂから約６０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約６０ｋｂから約７０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約７０ｋｂから約８０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約８０ｋｂから約９０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約９０ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１００ｋｂから約１１０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１１０ｋｂから約１２０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この第２の上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１９０ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、この哺乳動物はヒトであり、標的化は、ｅｘ ｖｉｖｏヒト細胞の標的化である。一実施形態では、この哺乳動物は、げっ歯類である。一実施形態では、このげっ歯類は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。

一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターと一緒に導入される。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、一定期間にわたって標的化ベクターとは別々に導入される。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターの導入前に導入される。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、標的化ベクターの導入後に導入される。

一実施形態では、標的化ベクターとヌクレアーゼ剤との併用は、標的化ベクター単独の使用と比較して、増加した標的化効率を生じさせる。一実施形態では、標的化ベクターがヌクレアーゼ剤と併せて使用される場合、この標的化ベクターの標的化効率は、標的化ベクターが単独で使用される場合と比較して、少なくとも２倍増加される。一実施形態では、標的化ベクターがヌクレアーゼ剤と併せて使用される場合、この標的化ベクターの標的化効率は、標的化ベクターが単独で使用される場合と比較して、少なくとも３倍増加される。一実施形態では、標的化ベクターがヌクレアーゼ剤と併せて使用される場合、この標的化ベクターの標的化効率は、標的化ベクターが単独で使用される場合と比較して、少なくとも４倍増加される。

一実施形態では、この原核細胞は、組換えコンピテント株のＥ．ｃｏｌｉである。一実施形態では、この原核細胞は、リコンビナーゼをコードする核酸を含む。一実施形態では、この原核細胞は、リコンビナーゼをコードする核酸を含まず、リコンビナーゼをコードする核酸が、原核細胞中に導入される。一実施形態では、この核酸は、リコンビナーゼをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む。一実施形態では、リコンビナーゼをコードするこの核酸は、ｐＡＢＧである。一実施形態では、このリコンビナーゼは、誘導性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このリコンビナーゼの発現は、アラビノースによって制御される。

一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現構築物であり、この核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、このプロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。一実施形態では、このプロモーターは、誘導性プロモーターである。一実施形態では、このプロモーターは、原核細胞において活性である。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。

一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一実施形態では、このＺＦＮの各モノマーは、３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは、３ｂｐの下位部位に結合する。一実施形態では、このＺＦＮは、独立ヌクレアーゼに作動可能に連結したジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。一実施形態では、この独立エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮを含み、この第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結しており、この第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮは、約６ｂｐから約４０ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、このＦｏｋＩヌクレアーゼは、二量体化して、二本鎖切断を作製する。

一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。一実施形態では、このＴＡＬＥＮの各モノマーは、１２〜２５のＴＡＬリピートを含み、各ＴＡＬリピートは、１ｂｐの下位部位に結合する。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、独立ヌクレアーゼに作動可能に連結したＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。一実施形態では、この独立ヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、この第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結しており、この第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、約６ｂｐから約４０ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、このＦｏｋＩヌクレアーゼは、二量体化して、標的配列において二本鎖切断を作製する。

一実施形態では、このヌクレアーゼの各モノマーは、少なくとも９ヌクレオチドの標的配列を認識する。一実施形態では、この標的配列は、約９から約１２ヌクレオチド長までである。一実施形態では、この標的配列は、約１２から約１５ヌクレオチド長までである。一実施形態では、この標的配列は、約１５から約１８ヌクレオチド長までである。一実施形態では、この標的配列は、約１８から約２１ヌクレオチド長までである。

一実施形態では、ヌクレアーゼ剤の標的配列は、イントロン中に位置付けられる。一実施形態では、この標的配列は、エクソン中に位置付けられる。一実施形態では、この標的配列は、プロモーター中に位置付けられる。一実施形態では、この標的配列は、非タンパク質コード領域中に位置付けられる。一実施形態では、この非タンパク質コード領域は、調節領域である。一実施形態では、この標的配列は、プロモーター調節領域中に位置付けられる。一実施形態では、この標的配列は、エンハンサー領域中に位置付けられる。

一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。一実施形態では、このメガヌクレアーゼは、１２から４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識する。一実施形態では、このメガヌクレアーゼは、ゲノム中の１つの完全に一致した標的配列を認識する。一実施形態では、このメガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。一実施形態では、このホーミングヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼである。一実施形態では、このＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−Ｄｍｏｌから選択される。

一実施形態では、この標的化ベクターは、大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約５０ｋｂから約３００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約５０ｋｂから約７５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約７５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１００ｋｂから１２５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１２５ｋｂから約１５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１５０ｋｂから約１７５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１７５ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２００ｋｂから約２２５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２２５ｋｂから約２５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２５０ｋｂから約２７５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２７５ｋｂから約３００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、標的化ベクターの相同性アームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリーまたはＰ１ファージライブラリーから誘導される。一実施形態では、これらの相同性アームは、従来の方法を使用しては標的不能な非ヒト動物のゲノム遺伝子座から誘導される。一実施形態では、これらの相同性アームは、合成ＤＮＡから誘導される。

一実施形態では、上流相同性アームおよび下流相同性アームの総計は、少なくとも１０ｋｂである。一実施形態では、この上流相同性アームは、約５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この下流相同性アームは、約５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約５ｋｂから約１０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１０ｋｂから約２０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約２０ｋｂから約３０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約３０ｋｂから約４０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約４０ｋｂから約５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約５０ｋｂから約６０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約６０ｋｂから約７０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約７０ｋｂから約８０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約８０ｋｂから約９０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約９０ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１００ｋｂから約１１０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１１０ｋｂから約１２０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１９０ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、この標的化ベクターは、選択カセットを含む。一実施形態では、この選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含み、この核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、このプロモーターは、原核細胞において活性である。一実施形態では、このプロモーターは、原核細胞および真核細胞の両方において活性である。一実施形態では、この選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）ならびにそれらの組合せから選択される。

一実施形態では、このインサート核酸は、約５ｋｂから約２００ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約５ｋｂから約１０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１０ｋｂから約２０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約２０ｋｂから約３０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約３０ｋｂから約４０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約４０ｋｂから約５０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約６０ｋｂから約７０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約８０ｋｂから約９０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約９０ｋｂから約１００ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１００ｋｂから約１１０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１９０ｋｂから約２００ｋｂまでである。

一実施形態では、このインサート核酸は、部位特異的組換え標的配列に隣接した核酸を含む。一実施形態では、この核酸はゲノム核酸を含む。一実施形態では、このゲノム核酸は、マウス、ヒトまたはそれらの組合せから誘導される。一実施形態では、この部位特異的組換え標的配列は、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘおよびそれらの組合せからなる群より選択される。

一実施形態では、このインサート核酸は、条件的対立遺伝子を含む。一実施形態では、この条件的対立遺伝子は、その全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されるような、多機能性対立遺伝子である。一実施形態では、この条件的対立遺伝子は、以下を含む：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス配向の発動配列、およびセンス配向またはアンチセンス配向の薬物選択カセット；（ｂ）アンチセンス配向の、対象のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）および反転モジュールにより条件的（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロンおよび反転可能なジーントラップ様モジュールを利用する；例えば、その全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照のこと）；ならびに（ｃ）第１のリコンビナーゼへの曝露の際に組み換わって、（ｉ）発動配列およびＤＳＣを欠きかつ（ｉｉ）センス配向でＮＳＩを含有しアンチセンス配向でＣＯＩＮを含有する条件的対立遺伝子を形成する、組換え可能な単位。

一実施形態では、このインサート核酸は、選択カセットを含む。一実施形態では、この選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含み、この核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、このプロモーターは、原核細胞において活性である。一実施形態では、この核酸は、原核細胞および真核細胞の両方において活性である。一実施形態では、この選択カセットは、部位特異的組換え標的配列に隣接している。一実施形態では、この選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）ならびにそれらの組合せから選択される。

一実施形態では、このインサート核酸は、プロモーターに作動可能に連結したレポーター遺伝子を含み、このレポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼおよびそれらの組合せからなる群より選択されるレポータータンパク質をコードする。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、内因性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、外因性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、特異的細胞型において発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、組織特異的様式で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、発生段階特異的様式で発現される。

一実施形態では、標的ゲノム遺伝子座中へのインサート核酸の組込みは、本明細書に記載される１つまたは複数の遺伝子改変を導入する。一実施形態では、この遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失である。一実施形態では、この遺伝子改変は、標的ゲノム遺伝子座中への外因性核酸配列の付加である。一実施形態では、この遺伝子改変は、標的ゲノム遺伝子座における、外因性核酸配列による内因性核酸配列の置換である。一実施形態では、この外因性核酸配列は、非マウス核酸配列である。一実施形態では、この外因性核酸配列は、ヒト核酸配列である。一実施形態では、この遺伝子改変は、ノックアウト、欠失、挿入、置換（「ノックイン」）、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップまたはそれらの組合せである。

一実施形態では、このインサート核酸は、マウス核酸配列に対して相同である。一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト核酸である。一実施形態では、このインサート核酸は、ゲノム核酸の断片である。一実施形態では、このゲノム核酸は、マウスゲノム核酸、ヒトゲノム核酸またはそれらの組合せである。一実施形態では、このインサート核酸は、上記のように、約５ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、このインサート核酸は、マウス核酸配列に対してオルソロガスである。一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト核酸である。一実施形態では、このインサート核酸は、ゲノム核酸の断片である。一実施形態では、このゲノム核酸は、マウスゲノム核酸、ヒトゲノム核酸またはそれらの組合せである。一実施形態では、このインサート核酸は、上記のように、約５ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、このインサート核酸は、神経系、骨格系、消化器系、循環器系、筋肉系、呼吸器系、心血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系またはそれらの組合せにおいて発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態では、このインサート核酸は、骨髄または骨髄由来細胞において発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態では、このインサート核酸は、脾臓細胞において発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態では、このゲノム遺伝子座は、マウスゲノム核酸配列、ヒトゲノム核酸配列またはそれらの組合せを含む。一実施形態では、この核酸は、Ｂ細胞において発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態では、この核酸は、未熟Ｂ細胞において発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態では、この核酸は、成熟Ｂ細胞において発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。

一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む。

一実施形態では、このゲノム核酸配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態では、この免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列もしくはヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列、またはそれらの組合せである。一実施形態では、この免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびそれらの組合せから選択される。一実施形態では、この重鎖定常領域核酸配列は、Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３を含む。一実施形態では、このゲノム核酸配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態では、この免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列もしくはヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列、またはそれらの組合せである。一実施形態では、この免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびそれらの組合せから選択される。一実施形態では、この重鎖定常領域核酸配列は、Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３を含む。

一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む。一実施形態では、このゲノム核酸配列は、再編成されていないヒトλおよび／またはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態では、このゲノム核酸配列は、再編成されたヒトλおよび／またはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態では、この再編成されていないまたは再編成されたλおよび／またはκ軽鎖可変領域核酸配列は、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウス、ラットまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している。

一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト核酸配列を含む。一実施形態では、このヒト核酸配列は、細胞外タンパク質をコードする。一実施形態では、このヒト核酸配列は、受容体に対するリガンドをコードする。一実施形態では、このリガンドは、サイトカインである。一実施形態では、このサイトカインは、ＣＣＬ、ＣＸＣＬ、ＣＸ３ＣＬおよびＸＣＬから選択されるケモカインである。一実施形態では、このサイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である。一実施形態では、このサイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）である。一実施形態では、このインターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５およびＩＬ−３６から選択される。一実施形態では、このインターロイキンは、ＩＬ−２である。一実施形態では、このヒトゲノム核酸配列は、細胞質タンパク質をコードする。一実施形態では、このヒトゲノム核酸配列は、膜タンパク質をコードする。一実施形態では、この膜タンパク質は、受容体である。一実施形態では、この受容体は、サイトカイン受容体である。一実施形態では、このサイトカイン受容体は、インターロイキン受容体である。一実施形態では、このインターロイキン受容体は、インターロイキン２受容体アルファである。一実施形態では、このインターロイキン受容体は、インターロイキン２受容体ベータである。一実施形態では、このインターロイキン受容体は、インターロイキン２受容体ガンマである。一実施形態では、このヒトゲノム核酸配列は、核タンパク質をコードする。一実施形態では、この核タンパク質は、核受容体である。

一実施形態では、このインサート核酸は、コード配列中に遺伝子改変を含む。一実施形態では、この遺伝子改変は、コード配列の欠失変異を含む。一実施形態では、この遺伝子改変は、２つの内因性コード配列の融合を含む。

一実施形態では、このインサート核酸は、変異体ヒトタンパク質をコードするヒト核酸配列を含む。一実施形態では、この変異体ヒトタンパク質は、変更された結合特徴、変更された局在、変更された発現および／または変更された発現パターンを特徴とする。一実施形態では、このヒト核酸配列は、少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、神経学的疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、心血管疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、腎臓疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、筋肉疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、血液疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、がん原因遺伝子の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、免疫系疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、優性対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、劣性対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子を含む。

一実施形態では、このインサート核酸は、調節配列を含む。一実施形態では、この調節配列は、プロモーター配列である。一実施形態では、この調節配列は、エンハンサー配列である。一実施形態では、この調節配列は、転写リプレッサー結合配列である。一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト核酸配列を含み、このヒト核酸配列は、非タンパク質コード配列の欠失を含むが、タンパク質コード配列の欠失は含まない。一実施形態では、この非タンパク質コード配列の欠失は、調節配列の欠失を含む。一実施形態では、この調節エレメントの欠失は、プロモーター配列の欠失を含む。一実施形態では、この調節エレメントの欠失は、エンハンサー配列の欠失を含む。

一態様では、哺乳動物細胞において標的ゲノム遺伝子座を改変する方法が提供され、この方法は、哺乳動物細胞中に、以下：（ｉ）標的ゲノム遺伝子座またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を作製するヌクレアーゼ剤、および（ｉｉ）上流相同性アームおよび下流相同性アームに隣接したインサート核酸を含む大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）、を導入するステップを含む。

一実施形態では、この哺乳動物細胞は、多能性細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、非ヒトＥＳ細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。一実施形態では、この誘導多能性（ｉＰＳ）細胞は、線維芽細胞から誘導される。一実施形態では、この誘導多能性（ｉＰＳ）細胞は、ヒト線維芽細胞から誘導される。一実施形態では、この多能性細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。一実施形態では、この多能性細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。一実施形態では、この多能性細胞は、胚盤葉上層幹細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、発生的に制限された前駆細胞である。

一実施形態では、この多能性細胞は、げっ歯類多能性細胞である。一実施形態では、このげっ歯類多能性細胞は、ラット多能性細胞である。一実施形態では、このラット多能性細胞は、ラットＥＳ細胞である。一実施形態では、このげっ歯類多能性細胞は、マウス多能性細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。

一実施形態では、この哺乳動物細胞は、不死化マウス細胞または不死化ラット細胞である。一実施形態では、この哺乳動物細胞は、不死化ヒト細胞である。一実施形態では、この哺乳動物細胞は、ヒト線維芽細胞である。一実施形態では、この哺乳動物細胞は、がん細胞である。一実施形態では、この哺乳動物細胞は、ヒトがん細胞である。

一実施形態では、この哺乳動物細胞は、疾患を有する患者から単離されたヒト細胞である。一実施形態では、このヒト細胞は、変異体タンパク質をコードするヒト核酸配列を含む。一実施形態では、この変異体ヒトタンパク質は、変更された結合特徴、変更された局在、変更された発現および／または変更された発現パターンを特徴とする。一実施形態では、このヒト核酸配列は、少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む。一実施形態では、このヒト核酸配列は、少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、神経学的疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、心血管疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、腎臓疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、筋肉疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、血液疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、がん原因遺伝子の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、免疫系疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、優性対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、劣性対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子を含む。

一実施形態では、この標的ゲノム遺伝子座は、ＦｃＥＲ１ａ遺伝子座、ＴＬＲ４遺伝子座、ＰＲＬＲ遺伝子座、Ｎｏｔｃｈ４遺伝子座、Ａｃｃｎ２遺伝子座、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、ＴＲＰＡ１遺伝子座、ＦｏｌＨ１遺伝子座、ＬＲＰ５遺伝子座およびＥＲＢＢ４遺伝子座から選択される。

一実施形態では、この標的ゲノム遺伝子座は、ヒトゲノム配列を含む。一実施形態では、この標的ゲノム遺伝子座は、非ヒト動物のゲノム核酸配列を含む。一実施形態では、この非ヒト動物は、げっ歯類である。一実施形態では、このげっ歯類は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。

一実施形態では、標的ゲノム遺伝子座に位置付けられる上記少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子が、インサート核酸で置換される。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子の置換は、ノックアウト、欠失、挿入、置換（「ノックイン」）、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップまたはそれらの組合せによって媒介される。

一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と一緒に導入される。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、一定期間にわたってＬＴＶＥＣとは別々に導入される。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、ＬＴＶＥＣの導入前に導入される。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、ＬＴＶＥＣの導入後に導入される。

一実施形態では、ＬＴＶＥＣとヌクレアーゼ剤との併用は、ＬＴＶＥＣ単独の使用と比較して、増加した標的化効率を生じさせる。一実施形態では、ＬＴＶＥＣがヌクレアーゼ剤と併せて使用される場合、このＬＴＶＥＣの標的化効率は、ＬＴＶＥＣが単独で使用される場合と比較して、少なくとも２倍増加される。一実施形態では、ＬＴＶＥＣがヌクレアーゼ剤と併せて使用される場合、このＬＴＶＥＣの標的化効率は、ＬＴＶＥＣが単独で使用される場合と比較して、少なくとも３倍増加される。一実施形態では、ＬＴＶＥＣがヌクレアーゼ剤と併せて使用される場合、このＬＴＶＥＣの標的化効率は、ＬＴＶＥＣが単独で使用される場合と比較して、少なくとも４倍増加される。

一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現構築物であり、この核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、このプロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。一実施形態では、このプロモーターは、誘導性プロモーターである。一実施形態では、このプロモーターは、哺乳動物細胞において活性である。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。

一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一実施形態では、このＺＦＮの各モノマーは、３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは、３ｂｐの下位部位に結合する。一実施形態では、このＺＦＮは、独立ヌクレアーゼに作動可能に連結したジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。一実施形態では、この独立エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮを含み、この第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結しており、この第１のＺＦＮおよび第２のＺＦＮは、約６ｂｐから約４０ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、このＦｏｋＩヌクレアーゼは、二量体化して、二本鎖切断を作製する。

一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。一実施形態では、このＴＡＬＥＮの各モノマーは、１２〜２５のＴＡＬリピートを含み、各ＴＡＬリピートは、１ｂｐの下位部位に結合する。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、独立ヌクレアーゼに作動可能に連結したＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。一実施形態では、この独立ヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、この第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結しており、この第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインおよび第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、約６ｂｐから約４０ｂｐの切断部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、このＦｏｋＩヌクレアーゼは、二量体化して、二本鎖切断を作製する。

一実施形態では、このヌクレアーゼの各モノマーは、少なくとも９ヌクレオチドの標的配列を認識する。一実施形態では、この標的配列は、約９から約１２ヌクレオチド長までである。一実施形態では、この標的配列は、約１２から約１５ヌクレオチド長までである。一実施形態では、この標的配列は、約１５から約１８ヌクレオチド長までである。一実施形態では、この標的配列は、約１８から約２１ヌクレオチド長までである。

一実施形態では、ヌクレアーゼ剤の標的核酸配列は、イントロン中に位置付けられる。一実施形態では、この標的核酸配列は、エクソン中に位置付けられる。一実施形態では、この標的核酸配列は、プロモーター中に位置付けられる。一実施形態では、この標的核酸配列は、非タンパク質コード領域中に位置付けられる。一実施形態では、この非タンパク質コード領域は、調節領域である。一実施形態では、この標的核酸配列は、プロモーター調節領域中に位置付けられる。一実施形態では、この標的核酸配列は、エンハンサー領域中に位置付けられる。

一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。一実施形態では、このメガヌクレアーゼは、１２から４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識する。一実施形態では、このメガヌクレアーゼは、ゲノム中の１つの完全に一致した標的配列を認識する。一実施形態では、このメガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。一実施形態では、このホーミングヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼである。一実施形態では、このＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−Ｄｍｏｌから選択される。

一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約５０ｋｂから約３００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約５０ｋｂから約７５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約７５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１００ｋｂから１２５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１２５ｋｂから約１５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１５０ｋｂから約１７５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約１７５ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２００ｋｂから約２２５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２２５ｋｂから約２５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２５０ｋｂから約２７５ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、このＬＴＶＥＣは、約２７５ｋｂから約３００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、ＬＴＶＥＣの相同性アームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリーまたはＰ１ファージライブラリーから誘導される。一実施形態では、これらの相同性アームは、従来の方法を使用しては標的不能な非ヒト動物のゲノム遺伝子座から誘導される。一実施形態では、これらの相同性アームは、合成ＤＮＡから誘導される。

一実施形態では、上流相同性アームおよび下流相同性アームの総計は、少なくとも１０ｋｂである。一実施形態では、この上流相同性アームは、約５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この下流相同性アームは、約５ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約５ｋｂから約１０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１０ｋｂから約２０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約２０ｋｂから約３０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約３０ｋｂから約４０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約４０ｋｂから約５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約５０ｋｂから約６０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約６０ｋｂから約７０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約７０ｋｂから約８０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約８０ｋｂから約９０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約９０ｋｂから約１００ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１００ｋｂから約１１０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１１０ｋｂから約１２０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂまでの範囲である。一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、約１９０ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、この標的化ベクターは、選択カセットを含む。一実施形態では、この選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含み、この核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、このプロモーターは、哺乳動物細胞において活性である。一実施形態では、このプロモーターは、原核細胞および真核細胞の両方において活性である。一実施形態では、この選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）ならびにそれらの組合せから選択される。

一実施形態では、このインサート核酸は、約５ｋｂから約２００ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約５ｋｂから約１０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１０ｋｂから約２０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約２０ｋｂから約３０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約３０ｋｂから約４０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約４０ｋｂから約５０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約６０ｋｂから約７０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約８０ｋｂから約９０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約９０ｋｂから約１００ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１００ｋｂから約１１０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂまでである。一実施形態では、このインサート核酸は、約１９０ｋｂから約２００ｋｂまでである。

一実施形態では、このインサート核酸は、部位特異的組換え標的配列に隣接した核酸を含む。一実施形態では、この核酸はゲノム核酸を含む。一実施形態では、このゲノム核酸は、マウス、ヒトまたはそれらの組合せから誘導される。一実施形態では、この部位特異的組換え標的配列は、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘおよびそれらの組合せからなる群より選択される。

一実施形態では、このインサート核酸は、条件的対立遺伝子を含む。一実施形態では、この条件的対立遺伝子は、その全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されるような、多機能性対立遺伝子である。一実施形態では、この条件的対立遺伝子は、以下を含む：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス配向の発動配列、およびセンス配向またはアンチセンス配向の薬物選択カセット；（ｂ）アンチセンス配向の、対象のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）および反転モジュールにより条件的（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロンおよび反転可能なジーントラップ様モジュールを利用する；例えば、その全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照のこと）；ならびに（ｃ）第１のリコンビナーゼへの曝露の際に組み換わって、（ｉ）発動配列およびＤＳＣを欠きかつ（ｉｉ）センス配向でＮＳＩを含有しアンチセンス配向でＣＯＩＮを含有する条件的対立遺伝子を形成する、組換え可能な単位。

一実施形態では、このインサート核酸は、選択カセットを含む。一実施形態では、この選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含み、この核酸配列は、プロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、このプロモーターは、哺乳動物細胞において活性である。一実施形態では、この核酸は、真核細胞において活性である。一実施形態では、この選択カセットは、部位特異的組換え標的配列に隣接している。一実施形態では、この選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）ならびにそれらの組合せから選択される。

一実施形態では、このインサート核酸は、プロモーターに作動可能に連結したレポーター遺伝子を含み、このレポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼおよびそれらの組合せからなる群より選択されるレポータータンパク質をコードする。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、内因性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、外因性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、特異的細胞型において発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、組織特異的様式で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、発生段階特異的様式で発現される。

一実施形態では、標的ゲノム遺伝子座中へのインサート核酸の組込みは、本明細書に記載される１つまたは複数の遺伝子改変を導入する。一実施形態では、この遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失である。一実施形態では、この遺伝子改変は、標的ゲノム遺伝子座中への外因性核酸配列の付加である。一実施形態では、この遺伝子改変は、標的ゲノム遺伝子座における、外因性核酸配列による内因性核酸配列の置換である。一実施形態では、この外因性核酸配列は、非マウス核酸配列である。一実施形態では、この外因性核酸配列は、ヒト核酸配列である。一実施形態では、この遺伝子改変は、ノックアウト、欠失、挿入、置換（「ノックイン」）、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップまたはそれらの組合せである。

一実施形態では、このインサート核酸は、マウス核酸配列に対して相同である。一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト核酸である。一実施形態では、このインサート核酸は、ゲノム核酸の断片である。一実施形態では、このゲノム核酸は、マウスゲノム核酸、ヒトゲノム核酸またはそれらの組合せである。一実施形態では、このインサート核酸は、上記のように、約５ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、このインサート核酸は、マウス核酸配列に対してオルソロガスである。一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト核酸である。一実施形態では、このインサート核酸は、ゲノム核酸の断片である。一実施形態では、このゲノム核酸は、マウスゲノム核酸、ヒトゲノム核酸またはそれらの組合せである。一実施形態では、このインサート核酸は、上記のように、約５ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、このインサート核酸は、神経系、骨格系、消化器系、循環器系、筋肉系、呼吸器系、心血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系またはそれらの組合せにおいて発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態では、このインサート核酸は、骨髄または骨髄由来細胞において発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態では、このインサート核酸は、脾臓細胞において発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態では、このゲノム遺伝子座は、マウスゲノム核酸配列、ヒトゲノム核酸配列またはそれらの組合せを含む。一実施形態では、この核酸は、Ｂ細胞において発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態では、この核酸は、未熟Ｂ細胞において発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。一実施形態では、この核酸は、成熟Ｂ細胞において発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座を含む。

一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む。

一実施形態では、このゲノム核酸配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態では、この免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列もしくはヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列、またはそれらの組合せである。一実施形態では、この免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびそれらの組合せから選択される。一実施形態では、この重鎖定常領域核酸配列は、Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３を含む。一実施形態では、このゲノム核酸配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態では、この免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列もしくはヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列、またはそれらの組合せである。一実施形態では、この免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびそれらの組合せから選択される。一実施形態では、この重鎖定常領域核酸配列は、Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３を含む。

一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む。一実施形態では、このゲノム核酸配列は、再編成されていないヒトλおよび／またはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態では、このゲノム核酸配列は、再編成されたヒトλおよび／またはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態では、この再編成されていないまたは再編成されたλおよび／またはκ軽鎖可変領域核酸配列は、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している。

一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト核酸配列を含む。一実施形態では、このヒト核酸配列は、細胞外タンパク質をコードする。一実施形態では、このヒト核酸配列は、受容体に対するリガンドをコードする。一実施形態では、このリガンドは、サイトカインである。一実施形態では、このサイトカインは、ＣＣＬ、ＣＸＣＬ、ＣＸ３ＣＬおよびＸＣＬから選択されるケモカインである。一実施形態では、このサイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である。一実施形態では、このサイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）である。一実施形態では、このインターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５およびＩＬ−３６から選択される。一実施形態では、このインターロイキンは、ＩＬ−２である。一実施形態では、このヒトゲノム核酸配列は、細胞質タンパク質をコードする。一実施形態では、このヒトゲノム核酸配列は、膜タンパク質をコードする。一実施形態では、この膜タンパク質は、受容体である。一実施形態では、この受容体は、サイトカイン受容体である。一実施形態では、このサイトカイン受容体は、インターロイキン受容体である。一実施形態では、このインターロイキン受容体は、インターロイキン２受容体アルファである。一実施形態では、このインターロイキン受容体は、インターロイキン２受容体ベータである。一実施形態では、このインターロイキン受容体は、インターロイキン２受容体ガンマである。一実施形態では、このヒトゲノム核酸配列は、核タンパク質をコードする。一実施形態では、この核タンパク質は、核受容体である。

一実施形態では、このインサート核酸は、コード配列中に遺伝子改変を含む。一実施形態では、この遺伝子改変は、コード配列の欠失変異を含む。一実施形態では、この遺伝子改変は、２つの内因性コード配列の融合を含む。

一実施形態では、このインサート核酸は、変異体ヒトタンパク質をコードするヒト核酸配列を含む。一実施形態では、この変異体ヒトタンパク質は、変更された結合特徴、変更された局在、変更された発現および／または変更された発現パターンを特徴とする。一実施形態では、このヒト核酸配列は、少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、神経学的疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、心血管疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、腎臓疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、筋肉疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、血液疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、がん原因遺伝子の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、免疫系疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、優性対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、劣性対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子を含む。

一実施形態では、このインサート核酸は、調節配列を含む。一実施形態では、この調節配列は、プロモーター配列である。一実施形態では、この調節配列は、エンハンサー配列である。一実施形態では、この調節配列は、転写リプレッサー結合配列である。一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト核酸配列を含み、このヒト核酸配列は、非タンパク質コード配列の欠失を含むが、タンパク質コード配列の欠失は含まない。一実施形態では、この非タンパク質コード配列の欠失は、調節配列の欠失を含む。一実施形態では、この調節エレメントの欠失は、プロモーター配列の欠失を含む。一実施形態では、この調節エレメントの欠失は、エンハンサー配列の欠失を含む。

一態様では、本明細書に記載される方法を用いて作製された哺乳動物細胞が提供される。一実施形態では、この哺乳動物細胞は、標的ゲノム遺伝子座において本明細書に記載される１つまたは複数の遺伝子改変を含むインサート核酸を含む。

一実施形態では、この哺乳動物細胞は、多能性細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。一実施形態では、この誘導多能性（ｉＰＳ）細胞は、線維芽細胞から誘導される。一実施形態では、この誘導多能性（ｉＰＳ）細胞は、ヒト線維芽細胞から誘導される。一実施形態では、この多能性細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。一実施形態では、この多能性細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。一実施形態では、この多能性細胞は、胚盤葉上層幹細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、発生的に制限された前駆細胞である。

一実施形態では、この多能性細胞は、マウス多能性細胞である。一実施形態では、この多能性細胞は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞である。

一実施形態では、この哺乳動物細胞は、不死化マウス細胞または不死化ラット細胞である。一実施形態では、この哺乳動物細胞は、不死化ヒト細胞である。一実施形態では、この哺乳動物細胞は、ヒト線維芽細胞である。一実施形態では、この哺乳動物細胞は、がん細胞である。一実施形態では、この哺乳動物細胞は、ヒトがん細胞である。

一実施形態では、この標的ゲノム遺伝子座は、ＦｃＥＲ１ａ遺伝子座、ＴＬＲ４遺伝子座、ＰＲＬＲ遺伝子座、Ｎｏｔｃｈ４遺伝子座、Ａｃｃｎ２遺伝子座、Ａｄａｍｔｓ５遺伝子座、ＴＲＰＡ１遺伝子座、ＦｏｌＨ１遺伝子座、ＬＲＰ５遺伝子座およびＥＲＢＢ４遺伝子座から選択される。

一実施形態では、この標的ゲノム遺伝子座は、本明細書に記載される１つまたは複数の遺伝子改変を含む。一実施形態では、この遺伝子改変は、内因性核酸配列の欠失である。一実施形態では、この遺伝子改変は、標的ゲノム遺伝子座中への外因性核酸配列の付加である。一実施形態では、この遺伝子改変は、標的ゲノム遺伝子座における、外因性核酸配列による内因性核酸配列の置換である。一実施形態では、この外因性核酸配列は、非マウス核酸配列である。一実施形態では、この外因性核酸配列は、ヒト核酸配列である。一実施形態では、この標的ゲノム遺伝子座は、ノックアウト、欠失、挿入、置換（「ノックイン」）、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップおよびそれらの組合せから選択される改変を含む。

一実施形態では、この標的ゲノム遺伝子座は、マウス核酸配列に対して相同なインサート核酸を含む。一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト核酸である。一実施形態では、このインサート核酸は、ゲノム核酸の断片である。一実施形態では、このゲノム核酸は、マウスゲノム核酸、ヒトゲノム核酸またはそれらの組合せである。一実施形態では、このインサート核酸は、上記のように、約５ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、この標的ゲノム遺伝子座は、マウス核酸配列に対してオルソロガスなインサート核酸を含む。一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト核酸である。一実施形態では、このインサート核酸は、ゲノム核酸の断片である。一実施形態では、このゲノム核酸は、マウスゲノム核酸、ヒトゲノム核酸またはそれらの組合せである。一実施形態では、このインサート核酸は、上記のように、約５ｋｂから約２００ｋｂまでの範囲である。

一実施形態では、この標的ゲノム遺伝子座は、条件的対立遺伝子を含む。一実施形態では、この条件的対立遺伝子は、その全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されるような、多機能性対立遺伝子である。一実施形態では、この条件的対立遺伝子は、以下を含む：（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス配向の発動配列、およびセンス配向またはアンチセンス配向の薬物選択カセット；（ｂ）アンチセンス配向の、対象のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）および反転モジュールにより条件的（ＣＯＩＮ、エクソン分割イントロンおよび反転可能なジーントラップ様モジュールを利用する；例えば、その全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照のこと）；ならびに（ｃ）第１のリコンビナーゼへの曝露の際に組み換わって、（ｉ）発動配列およびＤＳＣを欠きかつ（ｉｉ）センス配向でＮＳＩを含有しアンチセンス配向でＣＯＩＮを含有する条件的対立遺伝子を形成する、組換え可能な単位。

一実施形態では、このインサート核酸は、プロモーターに作動可能に連結したレポーター遺伝子を含み、このレポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼおよびそれらの組合せからなる群より選択されるレポータータンパク質をコードする。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、内因性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、外因性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、特異的細胞型において発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、組織特異的様式で発現される。一実施形態では、このレポーター遺伝子は、発生段階特異的様式で発現される。

一実施形態では、このインサート核酸は、神経系、骨格系、消化器系、循環器系、筋肉系、呼吸器系、心血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系またはそれらの組合せにおいて発現されるタンパク質をコードするヒト核酸配列を含む。一実施形態では、このヒト核酸配列は、骨髄または骨髄由来細胞において発現されるタンパク質をコードする。一実施形態では、マウスＥＳ細胞のゲノムは、脾臓細胞において発現されるタンパク質をコードするヒトゲノム遺伝子座を含む。一実施形態では、このヒト核酸は、Ｂ細胞において発現されるタンパク質をコードする。一実施形態では、このヒト核酸は、未熟Ｂ細胞において発現されるタンパク質をコードする。一実施形態では、このヒト核酸は、成熟Ｂ細胞において発現されるタンパク質をコードする。

一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列をコードするヒト核酸配列を含む。一実施形態では、このヒト核酸配列は、再編成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態では、この再編成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列またはそれらの組合せに作動可能に連結している。一実施形態では、この免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびそれらの組合せから選択される。一実施形態では、この重鎖定常領域核酸配列は、Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３を含む。一実施形態では、このヒト核酸配列は、再編成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態では、このヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列またはそれらの組合せに作動可能に連結している。一実施形態では、この免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびそれらの組合せから選択される。一実施形態では、この重鎖定常領域核酸配列は、Ｃ_Ｈ１−ヒンジ−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３を含む。

一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードするヒト核酸配列を含む。一実施形態では、このヒト核酸配列は、再編成されていないヒトλおよび／またはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態では、このヒト核酸配列は、再編成されたヒトλおよび／またはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む。一実施形態では、この再編成されていないλおよび／またはκ軽鎖可変領域核酸配列は、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。

一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト核酸配列を含む。一実施形態では、このヒト核酸配列は、細胞外タンパク質をコードする。一実施形態では、このヒト核酸配列は、受容体に対するリガンドをコードする。一実施形態では、このリガンドは、サイトカインである。一実施形態では、このサイトカインは、ＣＣＬ、ＣＸＣＬ、ＣＸ３ＣＬおよびＸＣＬから選択されるケモカインである。一実施形態では、このサイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である。一実施形態では、このサイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）である。一実施形態では、このインターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５およびＩＬ−３６から選択される。一実施形態では、このインターロイキンは、ＩＬ−２である。一実施形態では、このヒトゲノム核酸配列は、細胞質タンパク質をコードする。一実施形態では、このヒトゲノム核酸配列は、膜タンパク質をコードする。一実施形態では、この膜タンパク質は、受容体である。一実施形態では、この受容体は、サイトカイン受容体である。一実施形態では、このサイトカイン受容体は、インターロイキン受容体である。一実施形態では、このインターロイキン受容体は、インターロイキン２受容体アルファである。一実施形態では、このインターロイキン受容体は、インターロイキン２受容体ベータである。一実施形態では、このインターロイキン受容体は、インターロイキン２受容体ガンマである。一実施形態では、このヒトゲノム核酸配列は、核タンパク質をコードする。一実施形態では、この核タンパク質は、核受容体である。

一実施形態では、このインサート核酸は、コード配列中に遺伝子改変を含む。一実施形態では、この遺伝子改変は、コード配列の欠失変異を含む。一実施形態では、この遺伝子改変は、２つの内因性コード配列の融合を含む。

一実施形態では、このインサート核酸は、変異体ヒトタンパク質をコードするヒト核酸配列を含む。一実施形態では、この変異体ヒトタンパク質は、変更された結合特徴、変更された局在、変更された発現および／または変更された発現パターンを特徴とする。一実施形態では、このヒト核酸配列は、少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、神経学的疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、心血管疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、腎臓疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、筋肉疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、血液疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、がん原因遺伝子の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、免疫系疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、優性対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、劣性対立遺伝子である。一実施形態では、このヒト疾患対立遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子を含む。

一実施形態では、このインサート核酸は、調節配列を含む。一実施形態では、この調節配列は、プロモーター配列である。一実施形態では、この調節配列は、エンハンサー配列である。一実施形態では、この調節配列は、転写リプレッサー結合配列である。一実施形態では、このインサート核酸は、ヒト核酸配列を含み、このヒト核酸配列は、非タンパク質コード配列の欠失を含むが、タンパク質コード配列の欠失は含まない。一実施形態では、この非タンパク質コード配列の欠失は、調節配列の欠失を含む。一実施形態では、この調節エレメントの欠失は、プロモーター配列の欠失を含む。一実施形態では、この調節エレメントの欠失は、エンハンサー配列の欠失を含む。

一態様では、その生殖系列中に本明細書に記載される１つまたは複数の遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する方法が提供され、この方法は以下を含む：

（ａ）大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）と、対象のゲノム遺伝子座またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を生成するヌクレアーゼ剤とを使用して、原核細胞において非ヒト動物の対象のゲノム遺伝子座を改変するステップであって、このＬＴＶＥＣは、上流相同性アームおよび下流相同性アームに隣接したインサート核酸を含み、この原核細胞は、リコンビナーゼを発現することが可能である、ステップ；

（ｂ）遺伝子改変されたＬＴＶＥＣを含む改変された原核細胞を選択するステップ；

（ｃ）遺伝子改変されたＬＴＶＥＣを単離するステップ；

（ｄ）非ヒト動物の多能性細胞中に遺伝子改変されたＬＴＶＥＣを導入して、対象のゲノム遺伝子座中にインサート核酸を含む遺伝子改変された多能性細胞を生成するステップ；

（ｅ）遺伝子改変された多能性細胞を選択するステップ；

（ｆ）プレ桑実胚期における非ヒト動物の宿主胚中に、遺伝子改変された多能性細胞を導入するステップ；ならびに

（ｇ）遺伝子改変された多能性細胞を含む宿主胚を代理母に移植して、遺伝子改変された多能性細胞から誘導されたＦ０世代を生成するステップ。

一実施形態では、この非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、この哺乳動物は、げっ歯類である。一実施形態では、このげっ歯類は、マウス、ラットおよびハムスターから選択される。一実施形態では、この非ヒト動物はマウスであり、この多能性細胞はマウスＥＳ細胞である。一実施形態では、この非ヒト動物はラットであり、この多能性細胞はラットＥＳ細胞である。

一実施形態では、この標的ゲノム遺伝子座は、本明細書に記載される１つまたは複数の遺伝子改変を含む。

一実施形態では、単離するステップ（ｃ）は、遺伝子改変されたＬＴＶＥＣを線状化するステップ（ｃ）’をさらに含む。

一実施形態では、導入するステップ（ｄ）は、多能性細胞中に本明細書に記載されるヌクレアーゼ剤を導入するステップ（ｄ）’をさらに含む。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一実施形態では、このヌクレアーゼ剤は、転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。

一実施形態では、選択するステップ（ｂ）および／または（ｅ）は、原核細胞または多能性細胞に、本明細書に記載される選択可能な薬剤を適用することによって実行される。

一実施形態では、選択するステップ（ｂ）および／または（ｅ）は、本明細書に記載される対立遺伝子の改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｅｌｅ）（ＭＯＡ）アッセイを介して実行される。

図１は、マウスＩｌ２ｒｇ遺伝子上のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）切断部位を示す図である。この図の縮尺は比例させなかった。下のパネル中の四角で囲んだ配列は、ＺＦＮ標的配列を示す。

本発明は、記載された特定の方法および実験条件に限定されないが、それは、かかる方法および条件が変動し得るからである。本発明の範囲は、特許請求の範囲によって規定されるので、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、限定することを意図しないこともまた理解すべきである。

特に規定しない限り、本明細書で使用される全ての用語および語句は、その用語または語句が使用される文脈から相容れないことが明らかに示されるまたは明らかに見て取れる場合を除き、その用語および語句が当該分野で獲得している意味を含む。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施および試験において使用され得るが、特定の方法および材料がここで記載されている。言及される全ての刊行物は、参照によって本明細書に組み込まれる。
定義

用語「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」には、本明細書で使用する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏで未分化増殖が可能であり、胚中への導入の際に発生中の胚の任意の組織に寄与することが可能な、胚由来の全能性細胞または多能性細胞が含まれる。用語「多能性細胞」には、本明細書で使用する場合、１つよりも多い分化した細胞型へと発生する能力を有する未分化細胞が含まれる。

免疫グロブリン核酸配列に言及した用語「生殖系列」は、子孫に受け継がれ得る核酸配列を含む。

語句「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」には、任意の生物由来の、免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン重鎖配列が含まれる。重鎖可変ドメインは、特に示さない限り、３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにそれらの組合せが含まれる。典型的な重鎖は、可変ドメインの後ろに（Ｎ末端からＣ末端へと）、Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片には、細胞から発現および分泌することが可能で、少なくとも１つのＣＤＲを含む、エピトープを特異的に認識することが可能な（例えば、マイクロモル濃度、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲のＫ_Ｄでエピトープを認識する）断片が含まれる。重鎖可変ドメインは、生殖系列中に存在するＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈセグメントのレパートリーから誘導されるＶ_Ｈ、Ｄ_ＨおよびＪ_Ｈセグメントを一般に含む可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる。種々の生物についてのＶ、ＤおよびＪ重鎖セグメントの配列、位置および術語体系は、ＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ」においてワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上のインターネットを介してアクセス可能なＩＭＧＴデータベース中で見出すことができる。

語句「軽鎖」には、任意の生物由来の免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に示さない限り、ヒトカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖ならびにＶｐｒｅＢ、ならびに代替軽鎖が含まれる。軽鎖可変ドメインは、特に示さない限り、典型的には、３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。一般に、全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へとＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメインと、軽鎖定常領域アミノ酸配列とを含む。軽鎖可変ドメインは、生殖系列中に存在する軽鎖ＶおよびＪ遺伝子セグメントのレパートリーから誘導される軽鎖Ｖ_Ｌおよび軽鎖Ｊ_Ｌ遺伝子セグメントを一般に含む軽鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる。種々の生物についての軽鎖ＶおよびＪ遺伝子セグメントの配列、位置および術語体系は、ＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ」においてワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）上のインターネットを介してアクセス可能なＩＭＧＴデータベース中で見出すことができる。軽鎖には、例えば、それらが現れるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される第１のエピトープまたは第２のエピトープのいずれにも選択的に結合しない軽鎖が含まれる。軽鎖には、それらが現れるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される１つもしくは複数のエピトープを結合および認識する軽鎖、または重鎖がかかるエピトープを結合および認識するのを補助する軽鎖もまた含まれる。

用語「相同な核酸」には、本明細書で使用する場合、公知の参照配列と同一または実質的に類似した、いずれかの核酸配列が含まれる。一実施形態では、用語「相同な核酸」は、公知の参照配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはさらには１００％同一なＤＮＡまたはＲＮＡ配列を特徴付けるために使用される。

用語「オルソロガスな核酸」には、本明細書で使用する場合、別の種における公知の参照配列と機能的に等価な、１つの種由来の核酸配列が含まれる。

用語「大きい標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」には、本明細書で使用する場合、真核細胞における相同標的化を実施するために意図される他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きなクローニングされたゲノム核酸の断片から誘導される、真核細胞のための大きい標的化ベクターが含まれる。ＬＴＶＥＣのサイズは大きすぎて、サザンブロッティングおよびロングレンジ（例えば、１ｋｂ〜５ｋｂ）ＰＣＲなどの従来のアッセイによる標的化事象のスクリーニングができない。ＬＴＶＥＣの例には、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）から誘導されたベクターが含まれるが、これらに限定されない。

用語「対立遺伝子の改変」または「ＭＯＡ」には、ゲノム中の遺伝子（複数可）または染色体遺伝子座（複数可）の１つの対立遺伝子の正確なＤＮＡ配列の改変が含まれる。「対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）」の例には、単一ヌクレオチドほどの小ささの欠失、置換もしくは挿入、または対象の遺伝子（複数可）もしくは染色体遺伝子座（複数可）に及ぶ多数キロ塩基の欠失、ならびにこれら両極端の間の任意のおよび全ての可能な改変が含まれるが、これらに限定されない。

用語「ヌクレアーゼ」には、本明細書で使用する場合、核酸配列中の中断、例えば、二本鎖ＤＮＡ配列中の一本鎖切断または二本鎖切断を誘導する薬剤が含まれる。ヌクレアーゼには、予め選択された配列または特異的配列に結合し、この予め選択された配列または特異的配列またはその近傍において切るヌクレアーゼ、例えば、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼおよび操作されたＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが含まれる。ヌクレアーゼは、ＺＦＮおよびＴＡＬエフェクターヌクレアーゼに限定されず、改善された標的化効率を達成するためにＬＴＶＥＣと共に使用するのに適した任意のヌクレアーゼであり得る。非限定的な例には、予め選択された配列または特異的配列において切る、他のジンクフィンガーベースのヌクレアーゼおよび操作されたメガヌクレアーゼが含まれる。

本発明との使用に適したＴＡＬエフェクターヌクレアーゼには、当該分野で公知の任意のＴＡＬヌクレアーゼが含まれる。適切なＴＡＬヌクレアーゼの例および適切なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２３９３１５（Ａ１）号、同第２０１１／０２６９２３４（Ａ１）号、同第２０１１／０１４５９４０（Ａ１）号、同第２００３／０２３２４１０（Ａ１）号、同第２００５／０２０８４８９（Ａ１）号、同第２００５／００２６１５７（Ａ１）号、同第２００５／００６４４７４（Ａ１）号、同第２００６／０１８８９８７（Ａ１）号および同第２００６／００６３２３１（Ａ１）号（各々、本明細書で参照により組み込まれる）に開示されている。種々の実施形態では、例えば対象のゲノム中の標的核酸配列またはその近傍において切るＴＡＬエフェクターヌクレアーゼが操作され、この標的核酸配列は、ＬＴＶＥＣによって改変される配列またはその近傍に存在する。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、１つのエンドヌクレアーゼドメインおよび１つまたは複数のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質であり、この１つまたは複数のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、予め選択された核酸配列または特異的核酸配列を認識する配列を含む。本発明との使用に適したＴＡＬヌクレアーゼには、本明細書に記載されるＬＴＶＥＣによって改変される標的核酸配列またはその近傍に結合するように特異的に設計されたＴＡＬヌクレアーゼが含まれる。

語句「作動可能に連結した」には、作動可能に連結した成分が意図した様式で機能する関係性が含まれる。一例では、タンパク質をコードする核酸配列は、適切な転写調節を保持するように、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結し得る。一例では、免疫グロブリン可変領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列は、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の配列への配列間の適切な組換えを可能にするように、免疫グロブリン定常領域の核酸配列に作動可能に連結し得る。

用語「プロモーター」および「プロモーター調節エレメント」などには、本明細書で使用する場合、その遺伝子の発現を制御する、核酸断片または遺伝子内のヌクレオチド配列エレメントが含まれる。

用語「組換え部位」には、本明細書で使用する場合、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換え事象の基質として機能し得るヌクレオチド配列が含まれる。

用語「部位特異的リコンビナーゼ」には、本明細書で使用する場合、「組換え部位」間の組換えを促進し得る１群の酵素が含まれ、これら２つの組換え部位は、単一の核酸分子内または別々の核酸分子上に、物理的に分離されている。「部位特異的リコンビナーゼ」の例には、Ｃｒｅ、ＦｌｐおよびＤｒｅリコンビナーゼが含まれるが、これらに限定されない。

ＬＴＶＥＣおよびヌクレアーゼ剤を使用したゲノム遺伝子座の改変

非ヒト動物の種々のゲノム遺伝子座を標的化することにおいては進展がなされてきたが、従来の標的化戦略で標的化できない多くのゲノム遺伝子座または細胞型が未だ存在する。失敗の理由は異なり得るが、本明細書で使用する場合、従来の標的化方法によって、全く首尾よく標的化されないまたは不適切にもしくは顕著に低い効率で標的化されるかのいずれかの、遺伝子座または細胞が含まれる。従来の標的化方法には、従来の標的化ベクターを使用した相同組換えを使用する標的化が含まれる。標的化が困難な遺伝子座には、ＬＴＶＥＣ単独、即ち、組換え誘導の一本鎖切断もしくは二本鎖切断の形態での補助の非存在下でさえも標的化できない遺伝子座、または組換え誘導の一本鎖切断もしくは二本鎖切断の非存在下で不適切にもしくは低い効率でＬＴＶＥＣで標的化された遺伝子座が含まれる。

大きい標的化ベクター即ちＬＴＶＥＣと併せて、組換え誘導の一本鎖切断または二本鎖切断を形成することが可能なヌクレアーゼ剤を使用して核酸配列を標的化するための組成物および方法が提供され、この標的化された核酸配列（または標的化された核酸配列の近傍の配列）が、ＬＴＶＥＣによって改変される。これらの組成物および方法は、ＬＴＶＥＣ単独を使用した場合であっても従来の標的化戦略を使用して改変することが困難または不可能なゲノム核酸配列を改変するために有用である。

種々の態様では、標的核酸、例えばゲノム中の遺伝子座に対する改変を作製するためにＬＴＶＥＣを使用するための組成物および方法が提供され、この標的核酸は、ＬＴＶＥＣの配列によって（標的核酸とＬＴＶＥＣとの相同組換えにより）改変される標的配列を含み、一本鎖切断または二本鎖切断は、標的配列またはその近傍において標的核酸中に作製される。

標的核酸またはその近傍における一本鎖切断または二本鎖切断の存在は、種々の実施形態では、ＬＴＶＥＣと標的核酸との間の組換えの効率および／または頻度を増加させる。一実施形態では、この組換えは、相同組換えである。別の実施形態では、この組換えは、非相同な末端連結による挿入である。種々の実施形態では、一本鎖切断または二本鎖切断の存在下での標的ゲノム遺伝子座におけるＬＴＶＥＣ配列の標的化効率は、一本鎖切断または二本鎖切断の非存在下よりも、少なくとも約２倍高い、少なくとも約３倍高い、少なくとも約４倍高い（例えば、一本鎖切断または二本鎖切断を作製する添加されたヌクレアーゼの非存在下だが、同じＬＴＶＥＣと、同じ標的配列を含む同じ標的核酸とを使用する）。

本発明との使用に適したＬＴＶＥＣおよびそれらを作製する方法は、例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号、同第７，１０５，３４８号およびＷＯ２００２／０３６７８９（ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５３７５）中に記載されている。

マウスＥＳ細胞などのマウス多能性細胞中にＬＴＶＥＣを導入することに関する実施形態を広く議論してきたが、種々の哺乳動物細胞型中にＬＴＶＥＣを導入する他の方法もまた、本明細書に提供される。かかる哺乳動物細胞には、本明細書に開示される方法に従って遺伝子改変され得る任意の哺乳動物細胞が含まれ、例えば、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、シカ細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ニワトリ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、フェレット細胞、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）細胞などが含まれる。一部の実施形態では、遺伝子改変可能な適切な多能性細胞が容易に入手できない哺乳動物について、体細胞を多能性細胞へと再プログラミングするために、例えば、体細胞中への、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８およびＧｌｉｓ１が含まれるがこれらに限定されない多能性誘導因子の組合せの導入を介した、他の方法が使用される。

一実施形態では、この上流相同性アームおよび下流相同性アームは、標的化されたゲノムと同じゲノム由来である。一実施形態では、これらの相同性アームは、関連のゲノム由来であり、例えば、標的化されたゲノムは、第１の株のマウスゲノムであり、標的化アームは第２の株のマウスゲノム由来であり、この第１の株と第２の株とは異なっている。一実施形態では、これらの標的化アームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリーまたはＰ１ファージライブラリーから誘導される。一実施形態では、これらの相同性アームは、合成ＤＮＡから誘導される。一実施形態では、これらの相同性アームは、従来の方法を使用しては標的化できない遺伝子から誘導される。特定の実施形態では、これらの相同性アームは、従来の標的化技術を使用しては標的化できない遺伝子由来であるか、またはヌクレアーゼ剤によって誘導される一本鎖切断もしくは二本鎖切断の非存在下では不正確にのみもしくは顕著に低い効率でのみ標的化できる遺伝子由来である。

種々の実施形態では、標的化された改変の同定を促進するために、ハイスループットの定量的アッセイ、即ち、対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイが使用される。本明細書に記載されるＭＯＡアッセイは、遺伝子改変後の親染色体における改変された対立遺伝子（複数可）の大規模スクリーニングを可能にする。このＭＯＡアッセイは、定量的ＰＣＲ、例えば、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が含まれるがこれに限定されない種々の分析技法を介して実行され得る。例えば、リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび標的化されない参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを含む。さらに、このプライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含む。定量的アッセイは、蛍光媒介ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されたプローブ（複数可）に対する定量的ハイブリダイゼーション、Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、ＭＭＰアッセイ（登録商標）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、およびＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ技術が含まれるがこれらに限定されない種々の分析技法を介しても実行され得る（例えば、その全体が本明細書で参照により組み込まれるＵＳ２００５／０１４４６５５を参照のこと）。

一部の実施形態では、本明細書に記載される標的ゲノム遺伝子座の種々の遺伝子改変は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術を使用して細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡから誘導されたＬＴＶＥＣを使用して、細菌細胞において一連の相同組換え反応（ＢＨＲ）によって実行され得る（例えば、その全体が本明細書で参照により組み込まれる米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ， Ｄ． Ｍ．ら（２００３年）、Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照のこと）。

一部の実施形態では、本明細書に記載される種々の遺伝子改変を含む標的化されたマウスＥＳ細胞がドナーＥＳ細胞として使用され、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を介して、プレ桑実胚期のマウス胚、例えば、８細胞期のマウス胚中に導入される（例えば、全てその全体が本明細書で参照により組み込まれるＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４およびＵＳ２００８−００７８０００Ａ１を参照のこと）。遺伝子改変されたＥＳ細胞を含むマウス胚は、胚盤胞期までインキュベートされ、次いで、代理母中に移植されて、Ｆ０マウスを生成する。遺伝子改変されたゲノム遺伝子座を保有するマウスは、本明細書に記載される対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイを介して同定され得る。遺伝子改変されたＥＳ細胞から誘導される得られたＦ０世代のマウスは、野生型マウスと交雑されて、Ｆ１世代の子孫を得る。特異的プライマーおよび／またはプローブを用いた遺伝子型決定の後、遺伝子改変されたゲノム遺伝子座についてヘテロ接合性のＦ１の子が互いに交雑されて、遺伝子改変されたゲノム遺伝子座についてホモ接合性のマウスを生成する。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形の言及を含むことに留意すべきである。本明細書で使用した全ての技術用語および科学用語は、同じ意味を有する。

本明細書で議論される刊行物は、本出願の出願日前の開示に関してのみ提供される。本明細書のいずれの内容も、記載された発明に、以前の発明によってかかる刊行物に先行する資格が与えられないことの告白と解釈すべきではない。さらに、提供された公開の日付は、実際の公開日とは異なる可能性があり、独立して確認する必要があり得る。

記載された発明は、その精神または本質的特質から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得、従って、上記明細書ではなく添付の特許請求の範囲に対する言及が、本発明の範囲を示すとしてなされるべきである。

以下の実施例は、本発明を作製および使用する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を制限する意図も、以下の実験が全てであることまたは実施された唯一の実験であることを示す意図もない。使用した数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを確実にするための試みがなされてきたが、いくらかの実験誤差および偏差を考慮すべきである。特に示さない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセルシウス度であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
（実施例１）
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）により増強されたＬＴＶＥＣの標的化

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）による遺伝子中の二本鎖切断の誘導がＬＴＶＥＣ（大きいＢＡＣベースの標的化ベクター）による同じ遺伝子の標的化を増強できるかどうかを試験するために、Ｉｌ２ｒｇ遺伝子を標的化するＬＴＶＥＣおよびＺＦＮ対の各半分をコードするプラスミドを用いた、Ｆ１Ｈ４ ＥＳ細胞中への３つのエレクトロポレーションを、以下の組合せで実施した：（１）１．５μｇのＩｌ２ｒｇ ＬＴＶＥＣ単独；（２）２０μｇのＩｌ２ｒｇ ＺＦＮ−１＋２０μｇのＩｌ２ｒｇ ＬＴＶＥＣ ＺＦＮ−２＋１．５μｇのＩｌ２ｒｇ ＬＴＶＥＣ；および（３）２０μｇのＩｌ２ｒｇ ＺＦＮ−１＋２０μｇのＩｌ２ｒｇ ＺＦＮ−２、ＬＴＶＥＣなし。

本明細書で使用したＺＦＮ−１およびＺＦＮ−２は、（１）６ｂｐの切断部位によって分離された標的配列の各鎖中の２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン；および（２）二量体化し、標的部位において二本鎖切断を作製するＦｏｋＩヌクレアーゼ、を含有するように設計した。より具体的には、ＺＦＮ−１のジンクフィンガードメインを、Ｉｌ２ｒｇ遺伝子中のエクソン１のセンス鎖中の５’−ＡＧＣＴＣＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣ−３’（配列番号１）を認識するように設計し；ＺＦＮ−２のジンクフィンガードメインを、エクソン１のアンチセンス鎖中の５’−ＧＴＣＴＴＣＡＴＴＣＧＣＡＣＴ−３’（配列番号２）を認識するように設計した。

ＬＴＶＥＣ（ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ ＭＡＩＤ ５０５７Ｌ１）は、ＩＬ−２受容体ガンマ鎖のコード配列の全てを含むＩｌ２ｒｇ遺伝子のおよそ３，０００塩基対（３ｋｂ）を欠失し、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼを発現する選択カセットで内因性配列を置換するように、設計した。ＬＴＶＥＣ ５０５７Ｌ１は、市販のＢＡＣライブラリー（ＢＡＣ ＥＳ Ｒｅｌｅａｓｅ ２；Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）から単離された親ＢＡＣクローン２９０ｏ１５から誘導され、約９０ｋｂ（相同性アーム１）および約８ｋｂ（相同性アーム２）を有する２つの大きい相同性アームを含有する。

エレクトロポレーション（１）および（２）について、ハイグロマイシンＢ耐性コロニーを単離した。エレクトロポレーション（３）について、薬物選択なしにコロニーを形成させた。コロニーを、各エレクトロポレーションから取り上げ、９６ウェルプレート中で培養し、その後、ＬＴＶＥＣによるＩｌ２ｒｇ遺伝子の正確な標的化によって創出された３ｋｂの欠失を検出するように設計された対立遺伝子の喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ａｌｌｅｌｅ）（ＬＯＡ）アッセイによって、標的化事象についてスクリーニングした。ＬＯＡアッセイを使用して、エクソン１中のＺＦＮによって誘導された切断事象もまた検出した。

表３に示されるように、標的遺伝子中の部位を切断するように設計されたＺＦＮをコードするプラスミドを、同じ遺伝子を標的化するＬＴＶＥＣと組み合わせた場合（ＥＰ＃２）、標的化効率の顕著な増強（記載された実験においておよそ約４倍の増加）が、ＬＴＶＥＣ単独（ＥＰ＃１）と比較して達成された。

記載された発明を、その特定の実施形態を参照して記載してきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなしに、種々の変化がなされ得、等価物が置換され得ることが、当業者に理解されるべきである。さらに、多くの改変が、記載された発明の目的の精神および範囲に対して、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスステップまたはステップを採用するためになされ得る。全てのかかる改変は、本明細書に添付される特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

Claims (64)

1. 哺乳動物細胞において標的ゲノム遺伝子座を改変する方法であって、
   （ａ）哺乳動物細胞中に、以下：
   （ｉ）標的ゲノム遺伝子座またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を作製するヌクレアーゼ剤、および
   （ｉｉ）上流相同性アームおよび下流相同性アームに隣接したインサート核酸を含む大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）、
   を導入するステップ；ならびに
   （ｂ）該標的ゲノム遺伝子座中に前記インサート核酸を含む標的化された哺乳動物細胞を選択するステップ、
   を含む、方法。
2. 前記哺乳動物細胞が多能性細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記哺乳動物細胞が誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１に記載の方法。
4. 前記多能性細胞がマウス胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項２に記載の方法。
5. 前記多能性細胞が造血幹細胞である、請求項２に記載の方法。
6. 前記多能性細胞が神経幹細胞である、請求項２に記載の方法。
7. 前記哺乳動物細胞がヒト線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
8. 前記哺乳動物細胞が、疾患を有する患者から単離されたヒト細胞であり、該ヒト細胞が、そのゲノム中に少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、前記ゲノム中の前記少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を置換する、請求項８に記載の方法。
10. 前記ＬＴＶＥＣと前記ヌクレアーゼ剤との併用が、前記ＬＴＶＥＣ単独の使用と比較して、増加した標的化効率を生じさせる、請求項１に記載の方法。
11. 前記ＬＴＶＥＣの前記標的化効率が、前記ＬＴＶＥＣ単独の使用と比較して、少なくとも２倍増加される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現構築物であり、前記核酸が、前記哺乳動物細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結している、請求項１に記載の方法。
13. 前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
14. 前記ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記ヌクレアーゼが転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項１２に記載の方法。
16. 前記ヌクレアーゼがメガヌクレアーゼである、請求項１２に記載の方法。
17. 前記ヌクレアーゼ剤の標的配列が、前記標的ゲノム遺伝子座中のイントロン、エクソン、プロモーター、プロモーター調節領域またはエンハンサー領域中に位置付けられる、請求項１に記載の方法。
18. 前記上流相同性アームおよび前記下流相同性アームの総計が少なくとも１０ｋｂである、請求項１に記載の方法。
19. 前記インサート核酸が、約５ｋｂから３００ｋｂまでの範囲の長さである、請求項１に記載の方法。
20. 前記インサート核酸が選択カセットを含む、請求項１に記載の方法。
21. 前記インサート核酸がレポーター遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
22. 前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、前記標的ゲノム遺伝子座における内因性遺伝子の欠失を生じさせる、請求項１に記載の方法。
23. 前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加を生じさせる、請求項１に記載の方法。
24. 前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップまたはそれらの組合せを生じさせる、請求項１に記載の方法。
25. 前記インサート核酸が、ヒト核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
26. 前記インサート核酸が、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列またはそれらの組合せである、請求項２６に記載の方法。
28. 前記免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列が、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびそれらの組合せから選択される、請求項２６に記載の方法。
29. 前記インサート核酸が、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されていないヒトλまたはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
30. 前記インサート核酸が、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されたヒトλまたはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
31. 選択するステップ（ｂ）が、対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイを介して実行される、請求項１に記載の方法。
32. 前記インサート核酸が、前記哺乳動物細胞のゲノム中の核酸配列に対して相同な核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
33. 前記インサート核酸が、前記哺乳動物細胞のゲノム中の核酸配列に対してオルソロガスな核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
34. 前記インサート核酸が、異なる種由来の核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
35. 前記標的化された哺乳動物細胞が、そのゲノム中に、約５ｋｂから約３００ｋｂまでの範囲の前記インサート核酸を含む、請求項１に記載の方法。
36. 原核細胞において細菌相同組換え（ＢＨＲ）を介して哺乳動物の標的ゲノム遺伝子座を改変する方法であって、
    （ａ）哺乳動物の標的ゲノム遺伝子座を含む原核細胞中に、以下：
    （ｉ）第１の上流相同性アームおよび第１の下流相同性アームに隣接したインサート核酸を含む標的化ベクター、および
    （ｉｉ）前記標的ゲノム遺伝子座またはその近傍において一本鎖切断または二本鎖切断を作製するヌクレアーゼ剤、
    を導入するステップ、ならびに
    （ｂ）前記インサート核酸を含む標的化された原核細胞を選択するステップ、
    を含み、
    ここで、前記標的ゲノム遺伝子座は、第２の上流相同性アームおよび第２の下流相同性アームを含む大きい標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）中に存在し、
    前記原核細胞が、前記ＢＨＲを媒介するリコンビナーゼを発現することが可能である、方法。
37. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３６に記載の方法。
38. 前記哺乳動物がげっ歯類である、請求項３６に記載の方法。
39. 前記げっ歯類が、マウス、ラットまたはハムスターである、請求項３８に記載の方法。
40. 前記標的化ベクターと前記ヌクレアーゼ剤との併用が、前記標的化ベクター単独の使用と比較して、増加した標的化効率を生じさせる、請求項３６に記載の方法。
41. 前記標的化効率が、前記標的化ベクター単独の使用と比較して、少なくとも２倍増加される、請求項４０に記載の方法。
42. 前記原核細胞が、組換えコンピテント株のＥ．ｃｏｌｉである、請求項３６に記載の方法。
43. 前記原核細胞が、前記リコンビナーゼをコードする核酸を含む、請求項３６に記載の方法。
44. 前記原核細胞が、前記リコンビナーゼをコードする核酸を含まず、前記リコンビナーゼをコードする該核酸が、前記原核細胞中に導入される、請求項３６に記載の方法。
45. 前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現構築物であり、該核酸が、前記原核細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結している、請求項３６に記載の方法。
46. 前記ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、請求項３６に記載の方法。
47. 前記ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、請求項４５に記載の方法。
48. 前記ヌクレアーゼが転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項４５に記載の方法。
49. 前記ヌクレアーゼがメガヌクレアーゼである、請求項４５に記載の方法。
50. 前記ヌクレアーゼ剤の標的配列が、前記標的ゲノム遺伝子座中のイントロン、エクソン、プロモーター、プロモーター調節領域またはエンハンサー領域中に位置付けられる、請求項３６に記載の方法。
51. 前記第２の上流相同性アームおよび前記第２の下流相同性アームの総計が少なくとも１０ｋｂである、請求項３６に記載の方法。
52. 前記インサート核酸が、約５ｋｂから３００ｋｂまでの範囲の長さである、請求項３６に記載の方法。
53. 前記インサート核酸が選択カセットを含む、請求項３６に記載の方法。
54. 前記インサート核酸がレポーター遺伝子を含む、請求項３６に記載の方法。
55. 前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、前記標的ゲノム遺伝子座における内因性遺伝子の欠失を生じさせる、請求項３６に記載の方法。
56. 前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、前記標的ゲノム遺伝子座における外因性配列の付加を生じさせる、請求項３６に記載の方法。
57. 前記標的ゲノム遺伝子座中への前記インサート核酸の組込みが、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップまたはそれらの組合せを生じさせる、請求項３６に記載の方法。
58. 前記インサート核酸が、ヒト核酸配列である、請求項３６に記載の方法。
59. 前記インサート核酸が、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列を含む、請求項５８に記載の方法。
60. 前記免疫グロブリン重鎖定常領域配列が、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域配列、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列またはそれらの組合せである、請求項５９に記載の方法。
61. 前記免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列が、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３およびそれらの組合せから選択される、請求項５９に記載の方法。
62. 前記インサート核酸が、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されていないヒトλまたはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
63. 前記インサート核酸が、λ軽鎖定常領域核酸配列およびκ軽鎖定常領域核酸配列から選択されるマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した再編成されたヒトλまたはκ軽鎖可変領域核酸配列を含む、請求項３６に記載の方法。
64. 選択するステップ（ｂ）が、対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）アッセイを介して実行される、請求項３６に記載の方法。

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