BR112014026294B1 - Método para modificar um lócus genômico alvo em uma célula tronco embrionária (es) de camundongo - Google Patents
Método para modificar um lócus genômico alvo em uma célula tronco embrionária (es) de camundongo Download PDFInfo
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Abstract
método para modificar um locus genômico alvo. composições e métodos são fornecidos para fabricar uma ou mais modificações genéticas alvejadas em um lócus genômico alvo utilizando-se a recombinação homóloga facilitada pela ruptura do filamento único ou duplo no lócus genômico alvo ou próximo. composições e métodos para promover eficiência de recombinação homóloga entre um ltvec e um lócus genômico alvo em células procarióticas ou eucarióticas usando nucleases engendradas também são fornecidos.
Description
[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. No. 61/638.267 depositado em 25 de abril de 2012, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0002] As nucleases e construções de DNA, incluindo vetores de alvejamento (por exemplo, vetores de alvejamento grandes, “LTVEC”) para se obter recombinação homóloga em um lócus genômico alvo. Composições e métodos para fabricar uma modificação genética alvejada** por intermédio da recombinação homóloga que é facilitada por uma ruptura de filamento único ou duplo em um lócus genômico alvo ou próximo. Composições e métodos para promover eficiência da recombinação homóloga entre um LTVEC e um lócus genômico alvo em células procarióticas ou eucarióticas utilizando nucleases engendradas.
[0003] A recombinação homóloga usando vetores de alvejamento que são especificamente planejados para adicionar, deletar, ou substituir uma sequência de ácido nucléico particular em um lócus genômico é um método popular para se obter uma modificação genômica desejada em animais não humanos. Uma nuclease que é especificamente engendrada para introduzir uma ruptura de filamento único ou duplo em um lócus genômico alvo ou próximo pode ser usada junto com um vetor de alvejamento para intensificar a eficiência da recombinação homóloga no lócus genômico alvo.
[0004] Embora a técnica da modificação de genoma através da recombinação homóloga tenha avançado consideravelmente durante as duas últimas décadas, dificuldades ainda permanecem com a obtenção de uma frequência de alvejamento aceitável usando vetores de alvejamento muito grandes, LTVECs, em muitas circunstâncias, por exemplo, quando uma porção grande de um genoma de roedor é substituída com um fragmento genômico grande, ou dificuldades para alvejar certos tipos de célula, por exemplo, fibroblastos ou outras células somáticas. Existe uma necessidade na técnica quanto a métodos adicionais e melhorados para modificar locais genômicos grandes de um genoma eucariótico usando LTVECs.
[0005] As composições e métodos são fornecidos para modificar um lócus genômico de interesse usando um vetor de alvejamento grande (LTVEC) em combinação com um agente de nuclease, que permite deleção, adição (por exemplo, inserção), e/ou substituição eficiente de uma sequência de ácido nucléico grande no lócus genômico de interesse.
[0006] As composições e métodos são fornecidos para modificar um lócus genômico alvo de um mamífero em uma célula procariótica usando um LTVEC e um agente de nuclease por intermédio da recombinação homóloga bacteriana (BHR), em que a BHR é facilitada por uma clivagem do filamento único ou duplo no lócus genômico alvo ou próximo criado pelo agente de nuclease. As células procarióticas são fornecidas compreendendo um LTVEC e um agente de nuclease que, na expressão, é capaz de introduzir uma clivagem de filamento único ou duplo em um sítio alvo ou próximo. As composições e métodos são fornecidos para substituir um lócus genômico grande de um animal não humano com uma sequência de ácido nucléico exógena, por exemplo, sequências de ácido nucléico genômicas humanas homólogas ou ortólogas, em uma célula procariótica recombinogênica utilizando-se os vários LTVECs e nucleases como aqui descritos.
[0007] Composições e métodos são fornecidos para modificar um lócus genômico de interesse usando um LTVEC e um agente de nuclease em várias células de mamífero pluripotentes. Composições e métodos são fornecidos para substituir um lócus genômico grande de um animal não humano com sequência de ácido nucléico exógena, por exemplo, sequências de ácido nucléico genômicas humanas homólogas ou ortólogas, em uma célula pluripotente do animal não humano utilizando-se os vários LTVECs e nucleases como aqui descritos.
[0008] As células pluripotentes de um animal não humano são fornecidas compreendendo vários LTVECs e agentes de nuclease aqui descritos.
[0009] Composições e métodos são fornecidos para gerar um animal não humano geneticamente modificado compreendendo uma ou mais modificações genéticas alvejadas como aqui descritas.
[00010] Em um aspecto, uma célula procariótica é fornecida, compreendendo um vetor de alvejamento grande (LTVEC) que compreende ramificações de homologia direcionadas a um lócus alvo, e uma sequência de ácido nucléico que codifica um agente de nuclease que cause uma ruptura de filamento único ou duplo no lócus alvo ou próximo.
[00011] Em uma forma de realização, a célula procariótica é capaz de expressar uma recombinase que medeia a recombinação homóloga bacteriana (BHR). Em uma forma de realização, a célula procariótica é uma cepa competente em recombinação da E. coli.
[00012] Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 50 kb a cerca de 300 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 50 kb a cerca de 75 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 75 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 100 kb a 125 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 125 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 150 kb a cerca de 175 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 175 kb a cerca de 200 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 200 kb a cerca de 225 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 225 kb a cerca de 250 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 250 kb a cerca de 275 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 275 kb a cerca de 300 kb.
[00013] Em uma forma de realização, as ramificações de homologia do vetor de alvejamento são derivadas de uma biblioteca BAC, uma biblioteca de cosmídeo, ou uma biblioteca de fago P1. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia são derivadas de um lócus genômico do animal não humano que não é alvejável usando um método convencional. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia são derivadas de um DNA sintético.
[00014] Em uma forma de realização, uma soma total da ramificação de homologia a montante e da ramificação de homologia a jusante é de pelo menos 10 kb. Em uma forma de realização, a ramificação de homologia a montante varia de cerca de 5 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, a ramificação de homologia a jusante varia de cerca de 5 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 50 kb a cerca de 60 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 70 kb a cerca de 80 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 110 kb a cerca de 120 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb.
[00015] Em uma forma de realização, o LTVEC compreende um cassete de seleção. Em uma forma de realização, o cassete de seleção compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um marcador de seleção, em que a sequência de ácido nucléico é operavelmente ligada a um promotor. Em uma forma de realização, o promotor é ativo em uma célula procariótica. Em uma forma de realização, o promotor é ativo tanto em células procarióticas quanto em eucarióticas. Em uma forma de realização, o marcador de seleção é selecionado de neomicina fosfotransferase (neor), hidromicina B fosfotransferase (hygr), puromicina-N-acetiltransferase (puror), blasticidina S desaminase (bsrr), xantina/guanina fosforibosil transferase (gpt), e timidina cinase do vírus simples do herpes (HSV-k), e uma combinação dos mesmos.
[00016] Em uma forma de realização, o LTVEC compreende um ácido nucléico inserido que varia de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb.
[00017] Em uma forma de realização, o LTVEC compreende um ácido nucléico inserido que compreende um ácido nucléico flanqueado com sequências alvo com recombinação específica de sítio. Em uma forma de realização, o ácido nucléico compreende um ácido nucléico genômico. Em uma forma de realização, o ácido nucléico genômico é derivado de um camundongo, um ser humano, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, as sequências alvo com recombinação específica de sítio são selecionadas do grupo que consiste de loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox, e uma combinação dos mesmos.
[00018] Em uma forma de realização, o LTVEC compreende um ácido nucléico inserido compreendendo um alelo condicional. Em uma forma de realização, o alelo condicional é um alelo multifuncional, como descrito na US 2011/0104799, que é incorporado por referência em sua totalidade. Em uma forma de realização, o alelo condicional compreende: (a) uma sequência atuante na orientação de sentido com respeito à transcrição de um gene alvo, e um cassete de seleção de medicamento na orientação de sentido ou de antissentido; (b) na orientação de antissentido uma sequência de nucleotídeo de interesse (NSI) e uma condicional pelo módulo de inversão (COIN, que utiliza um íntron que separa exon e um módulo igual a genetrap invertível; ver, por exemplo, a US 2011/0104799, que é incorporada por referência em sua totalidade); e (c) unidades recombináveis que recombinam-se na exposição a uma primeira recombinase para formar um alelo condicional que (i) carece da sequência atuante e da DSC, e (ii) contém a NSI na orientação de sentido e a COIN na orientação de antissentido.
[00019] Em uma forma de realização, o LTVEC compreende um ácido nucléico inserido que compreende um cassete de seleção. Em uma forma de realização, o cassete de seleção compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um marcador de seleção, em que a sequência de ácido nucléico é operavelmente ligada a um promotor. Em uma forma de realização, o promotor é ativo em uma célula procariótica. Em uma forma de realização, o ácido nucléico é ativo tanto em células procarióticas quanto em eucarióticas. Em uma forma de realização, o cassete de seleção é flanqueado com sequências alvo com recombinação específica de sítio. Em uma forma de realização, o marcador de seleção é selecionado de neomicina fosfotransferase (neon), hidromicina B fosfotransferase (hygr), puromicina-N-acetiltransferase (puror), blasticidina S desaminase (bsrr), xantina/guanina fosforibosil transferase (gpt), e timidina cinase do vírus simples do herpes (HSV-k), e uma combinação dos mesmos.
[00020] Em uma forma de realização, o LTVEC compreende um ácido nucléico inserido que compreende um gene repórter operavelmente ligado a um promotor, em que o gene repórter codifica uma proteína repórter selecionada do grupo que consiste de LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarela intensificada (EYFP), Emerald, proteína fluorescente verde intensificada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente ciano (CFP), Cerulean, T-Sapphire, Luciferase, fosfatase alcalina, e uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor indutível. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor endógeno. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor exógeno. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em um tipo de célula específico. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em uma maneira específica de tecido. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em um maneira específica de estágio desenvolvimental.
[00021] Em um aspecto, uma célula eucariótica é fornecida, compreendendo um vetor de alvejamento grande que compreende ramificações de homologia direcionadas a um lócus alvo dentro do genoma da célula eucariótica, e uma sequência de ácido nucléico que codifica um agente de nuclease que cause uma ruptura do filamento único ou duplo no lócus alvo ou próximo.
[00022] Em uma forma de realização, a célula eucariótica é uma célula pluripotente. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco embrionária (ES). Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula ES não humana. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco pluripotente induzida (iPS). Em uma forma de realização, a célula tronco pluripotente induzida (iPS) é derivada de um fibroblasto. Em uma forma de realização, a célula tronco pluripotente induzida (iPS) é derivada de um fibroblasto humano. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco hematopoiética (HSC). Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco neuronal (NSC). Em uma forma de realização, a célula pluripotente é um célula tronco epiblástica. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula progenitora desenvolvimentalmente restringida. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula pluripotente de roedor. Em uma forma de realização, a célula pluripotente de roedor é uma célula pluripotente de rato. Em uma forma de realização, a célula pluripotente de rato é uma célula ES de rato. Em uma forma de realização, a célula pluripotente de roedor é uma célula pluripotente de camundongo. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco embrionária (ES) de camundongo.
[00023] Em uma forma de realização, a célula eucariótica é uma célula imortalizada de camundongo ou rato. Em uma forma de realização, a célula eucariótica é uma célula humana imortalizada. Em uma forma de realização, a célula eucariótica é um fibroblasto humano. Em uma forma de realização, a célula eucariótica é uma célula cancerosa. Em uma forma de realização, a célula eucariótica é uma célula cancerosa humana.
[00024] Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 50 kb a cerca de 300 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 50 kb a cerca de 75 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 75 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 100 kb a 125 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 125 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 150 kb a cerca de 175 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 175 kb a cerca de 200 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 200 kb a cerca de 225 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 225 kb a cerca de 250 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 250 kb a cerca de 275 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 275 kb a cerca de 300 kb.
[00025] Em uma forma de realização, as ramificações de homologia do vetor de alvejamento são derivadas de uma biblioteca BAC, uma biblioteca de cosmídeo, ou uma biblioteca de fago P1. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia são derivadas de um lócus genômico do animal não humano que não é alvejável usando um método convencional. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia são derivadas de um DNA sintético.
[00026] Em uma forma de realização, uma soma total da ramificação de homologia a montante e da ramificação de homologia a jusante é de pelo menos 10 kb. Em uma forma de realização, a ramificação de homologia a montante varia de cerca de 5 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, da ramificação de homologia a jusante varia de cerca de 5 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 50 kb a cerca de 60 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 70 kb a cerca de 80 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 110 kb a cerca de 120 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb.
[00027] Em uma forma de realização, o LTVEC compreende um cassete de seleção. Em uma forma de realização, o cassete de seleção compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um marcador de seleção, em que a sequência de ácido nucléico é operavelmente ligada a um promotor. Em uma forma de realização, o promotor é ativo em uma célula procariótica. Em uma forma de realização, o promotor é ativo tanto em células procarióticas quanto em eucarióticas. Em uma forma de realização, o marcador de seleção é selecionado de neomicina fosfotransferase (neon), hidromicina B fosfotransferase (hygr), puromicina-N-acetiltransferase (puror), blasticidina S desaminase (bsrr), xantina/guanina fosforibosil transferase (gpt), e timidina cinase do vírus simples do herpes (HSV-k), e uma combinação dos mesmos.
[00028] Em uma forma de realização, o LTVEC compreende um ácido nucléico inserido que varia de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb.
[00029] Em uma forma de realização, o LTVEC compreende um ácido nucléico inserido compreendendo um ácido nucléico flanqueado com sequências alvo com recombinação específica de sítio. Em uma forma de realização, o ácido nucléico compreende um ácido nucléico genômico. Em uma forma de realização, o ácido nucléico genômico é derivado de um camundongo, um ser humano, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, as sequências alvo com recombinação específica de sítio são selecionadas do grupo que consiste de loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox, e uma combinação das mesmas.
[00030] Em uma forma de realização, o LTVEC compreende um ácido nucléico inserido compreendendo um alelo condicional. Em uma forma de realização, o alelo condicional é um alelo multifuncional, como descrito na US 2011/0104799, que é incorporado por referência em sua totalidade. Em uma forma de realização, o alelo condicional compreende: (a) uma sequência atuante na orientação de sentido com respeito à transcrição de um gene alvo, e um cassete de seleção de medicamento na orientação de sentido ou de antissentido; (b) na orientação de antissentido uma sequência de nucleotídeo de interesse (NSI) e uma condicional pelo módulo de inversão (COIN, que utiliza um íntron que separa exon e um módulo igual a genetrap invertível; ver, por exemplo, a US 2011/0104799, que é incorporada por referência em sua totalidade); e (c) unidades recombináveis que recombinam-se na exposição a uma primeira recombinase para formar um alelo condicional que (i) carece da sequência atuante e da DSC, e (ii) contém a NSI na orientação de sentido e a COIN na orientação de antissentido.
[00031] Em uma forma de realização, o LTVEC compreende um ácido nucléico inserido compreendendo um cassete de seleção. Em uma forma de realização, o cassete de seleção compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um marcador de seleção, em que a sequência de ácido nucléico é operavelmente ligada a um promotor. Em uma forma de realização, o promotor é ativo em uma célula procariótica. Em uma forma de realização, o ácido nucléico é ativo tanto em células procarióticas quanto em eucarióticas. Em uma forma de realização, o cassete de seleção é flanqueado com sequências alvo com recombinação específica de sítio. Em uma forma de realização, o marcador de seleção é selecionado de neomicina fosfotransferase (neon), hidromicina B fosfotransferase (hygr), puromicina-N-acetiltransferase (puror), blasticidina S desaminase (bsrr), xantina/guanina fosforibosil transferase (gpt), e timidina cinase do vírus simples do herpes (HSV-k), e uma combinação dos mesmos.
[00032] Em uma forma de realização, o LTVEC compreende um ácido nucléico inserido compreendendo um gene repórter operavelmente ligado a um promotor, em que o gene repórter codifica uma proteína repórter selecionada do grupo que consiste de LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarela intensificada (EYFP), Emerald, proteína fluorescente verde intensificada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente ciano (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferase, fosfatase alcalina, e uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor indutível. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor endógeno. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor exógeno. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em um tipo de célula específico. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em uma maneira específica de tecido. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em uma maneira específica de estágio desenvolvimental.
[00033] Em um aspecto, um método para modificar um lócus genômico alvo de uma célula de mamífero por intermédio da recombinação homóloga bacteriana (BHR) em uma célula procariótica é fornecido, compreendendo: (a) introduzir em uma célula procariótica compreendendo um lócus genômico alvo de um mamífero: (i) um vetor de alvejamento compreendendo um ácido nucléico inserido flanqueado com uma primeira ramificação de homologia a montante e uma primeira ramificação de homologia a jusante, e (ii) um agente de nuclease que cause uma ruptura de filamento único ou duplo no lócus genômico alvo ou próximo, e (i) selecionar uma célula procariótica alvejada compreendendo o ácido nucléico inserido, em que a célula procariótica é capaz de expressar uma recombinase que medeia a BHR.
[00034] Em uma forma de realização, o lócus genômico alvo é selecionado de um lócus FcER1a, um lócus TLR4, um lócus PRLR, um lócus Notch4, um lócus Accn2, um lócus Adamts5, um lócus TRPA1, lócus FolH1, um lócus LRP5, e um lócus ERBB4.
[00035] Em uma forma de realização, o lócus genômico alvo está presente em um vetor de alvejamento grande (LTVEC) compreendendo uma segunda ramificação de homologia a montante e uma segunda ramificação de homologia a jusante. Em uma forma de realização, uma soma total da segunda ramificação de homologia a montante e da segunda ramificação de homologia a jusante é de pelo menos 10 kb. Em uma forma de realização, a segunda ramificação de homologia a montante varia de cerca de 5 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, a segunda ramificação de homologia a jusante varia de cerca de 5 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 50 kb a cerca de 60 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 70 kb a cerca de 80 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 110 kb a cerca de 120 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante secundárias variam de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb.
[00036] Em uma forma de realização, o mamífero é um ser humano e o alvejamento é de uma célula humana ex vivo. Em uma forma de realização, o mamífero é um roedor. Em uma forma de realização, o roedor é selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster.
[00037] Em uma forma de realização, o agente de nuclease é introduzido junto com o vetor de alvejamento. Em uma forma de realização, o agente de nuclease é introduzido separadamente do vetor de alvejamento em um período de tempo. Em uma forma de realização, o agente de nuclease é introduzido antes da introdução do vetor de alvejamento. Em uma forma de realização, o agente de nuclease é introduzido a seguir da introdução do vetor de alvejamento.
[00038] Em uma forma de realização, o uso combinado do vetor de alvejamento com o agente de nuclease resulta em uma eficiência de alvejamento aumentada comparada ao uso do vetor de alvejamento sozinho. Em uma forma de realização, quando o vetor de alvejamento é usado em conjunção com o agente de nuclease, a eficiência de alvejamento do vetor de alvejamento é aumentada pelo menos em duas vezes comparada com quando o vetor de alvejamento é usado sozinho. Em uma forma de realização, quando o vetor de alvejamento é usado em conjunção com o agente de nuclease, a eficiência de alvejamento do vetor de alvejamento é aumentada pelo menos em três vezes comparada com quando o vetor de alvejamento é usado sozinho. Em uma forma de realização, quando o vetor de alvejamento é usado em conjunção com o agente de nuclease, a eficiência de alvejamento do vetor de alvejamento é aumentada pelo menos em quatro vezes comparada com quando o vetor de alvejamento é usado sozinho.
[00039] Em uma forma de realização, a célula procariótica é uma cepa competente em recombinação da E. coli. Em uma forma de realização, a célula procariótica compreende um ácido nucléico que codifica a recombinase. Em uma forma de realização, a célula procariótica não compreende o ácido nucléico que codifica a recombinase, e o ácido nucléico que codifica a recombinase é introduzido na célula procariótica. Em uma forma de realização, o ácido nucléico compreende um DNA ou um mRNA que codifica a recombinase. Em uma forma de realização o ácido nucléico que codifica a recombinase é pABG. Em uma forma de realização, a recombinase é expressada sob o controle de um promotor indutível. Em uma forma de realização, a expressão da recombinase é controlada pela arabinose.
[00040] Em uma forma de realização, o agente de nuclease é uma construção de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucléico que codifica uma nuclease, em que a sequência de ácido nucléico é operavelmente ligada a um promotor. Em uma forma de realização, o promotor é um promotor constitutivamente ativo. Em uma forma de realização, o promotor é um promotor indutível. Em uma forma de realização, o promotor é ativo na célula procariótica. Em uma forma de realização, o agente de nuclease é um mRNA que codifica uma endonuclease.
[00041] Em uma forma de realização, o agente de nuclease é uma nuclease dedo de zinco (ZFN). Em uma forma de realização, cada monômero da ZFN compreende 3 ou mais domínios de ligação de DNA com base no dedo de zinco, em que cada domínio de ligação de DNA com base no dedo de zinco se liga a um subsítio de 3 pares de base. Em uma forma de realização, a ZFN é uma proteína quimérica compreendendo um domínio de ligação de DNA com base no dedo de zinco operavelmente ligada a uma nuclease independente. Em uma forma de realização, a endonuclease independente é uma endonuclease Fokl. Em uma forma de realização, o agente de nuclease compreende uma primeira ZFN e uma segunda ZFN, em que cada uma da primeira ZFN e da segunda ZFN é operavelmente ligada a uma nuclease Fokl, em que a primeira e a segunda ZFN reconhecem duas sequências de DNA alvo contíguas em cada filamento da sequência de DNA alvo separada em cerca de 6 pares de base a cerca de 40 pares do sítio de clivagem base, e em que as nucleases Fokl dimerizam e fazem uma ruptura de filamento duplo.
[00042] Em uma forma de realização, o agente de nuclease é uma Nuclease Efetora Igual ao Ativador de Transcrição (TALEN). Em uma forma de realização, cada monômero da TALEN compreende de 12 a 25 repetições TAL, em que cada repetição TAL liga um subsítio de 1 par de base. Em uma forma de realização, o agente de nuclease é uma proteína quimérica compreendendo um domínio de ligação de DNA com base na repetição TAL operavelmente ligado a uma nuclease independente. Em uma forma de realização, a nuclease independente é uma endonuclease Fokl. Em uma forma de realização, o agente de nuclease compreende um primeiro domínio de ligação de DNA com base na repetição TAL e um segundo domínio de ligação de DNA com base na repetição TAL, em que cada um do primeiro e do segundo domínios de ligação de DNA com base na repetição TAL é operavelmente ligado a uma nuclease Fokl, em que o primeiro e o segundo domínios de ligação de DNA com base na repetição TAL reconhecem duas sequências de DNA alvo contíguas em cada filamento da sequência de DNA alvo separadas em cerca de 6 pares de base a cerca de 40 pares do sítio de clivagem base, e em que as nucleases Fokl dimerizam e realizam uma ruptura de filamento duplo em uma sequência alvo.
[00043] Em uma forma de realização, cada monômero da nuclease reconhece uma sequência alvo de pelo menos 9 nucleotídeos. Em uma forma de realização, a sequência alvo é de cerca de 9 a cerca de 12 nucleotídeos no comprimento. Em uma forma de realização, a sequência alvo é de cerca de 12 a cerca de 15 nucleotídeos no comprimento. Em uma forma de realização, a sequência alvo é de cerca de 15 a cerca de 18 nucleotídeos no comprimento. Em uma forma de realização, a sequência alvo é de cerca de 18 a cerca de 21 nucleotídeos no comprimento.
[00044] Em uma forma de realização, uma sequência alvo do agente de nuclease está localizada em um íntron. Em uma forma de realização, a sequência alvo está localizada em um exon. Em uma forma de realização, a sequência alvo está localizada em um promotor. Em uma forma de realização, a sequência alvo está em uma região não codificadora de proteína. Em uma forma de realização, a região não codificadora de proteína é uma região reguladora. Em uma forma de realização, a sequência alvo está localizada em uma região reguladora de promotor. Em uma forma de realização, a sequência alvo está localizada em uma região intensificadora.
[00045] Em uma forma de realização, o agente de nuclease é uma meganuclease. Em uma forma de realização, a meganuclease reconhece sequências de DNA de filamento duplo de 12 a 40 pares de base. Em uma forma de realização, a meganuclease reconhece uma sequência alvo perfeitamente emparelhada no genoma. Em uma forma de realização, a meganuclease é uma nuclease residente. Em uma forma de realização, a nuclease residente é uma família LAGLIDADG de nuclease residente. Em uma forma de realização, a família LAGLIDADG de nuclease residente é selecionada de I-Scel, I-Crel, e I-Dmol.
[00046] Em uma forma de realização, o vetor de alvejamento é um vetor de alvejamento grande (LTVEC).
[00047] Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 50 kb a cerca de 300 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 50 kb a cerca de 75 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 75 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 100 kb a 125 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 125 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 150 kb a cerca de 175 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 175 kb a cerca de 200 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 200 kb a cerca de 225 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 225 kb a cerca de 250 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 250 kb a cerca de 275 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 275 kb a cerca de 300 kb.
[00048] Em uma forma de realização, as ramificações de homologia do vetor de alvejamento são derivadas de uma biblioteca BAC, uma biblioteca de cosmídeo, ou uma biblioteca de fago P1. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia são derivadas de um lócus genômico do animal não humano que não é alvejável usando um método convencional. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia são derivadas de um DNA sintético.
[00049] Em uma forma de realização, uma soma total da ramificação de homologia a montante e da ramificação de homologia a jusante é de pelo menos 10 kb. Em uma forma de realização, a ramificação de homologia a montante varia de cerca de 5 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, da ramificação de homologia a jusante varia de cerca de 5 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 50 kb a cerca de 60 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 70 kb a cerca de 80 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 110 kb a cerca de 120 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb.
[00050] Em uma forma de realização, o vetor de alvejamento compreende um cassete de seleção. Em uma forma de realização, o cassete de seleção compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um marcador de seleção, em que a sequência de ácido nucléico é operavelmente ligada a um promotor. Em uma forma de realização, o promotor é ativo em uma célula procariótica. Em uma forma de realização, o promotor é ativo tanto em células procarióticas quanto em eucarióticas. Em uma forma de realização, o marcador de seleção é selecionado de neomicina fosfotransferase (neor), hidromicina B fosfotransferase (hygr), puromicina-N-acetiltransferase (puror), blasticidina S desaminase (bsrr), xantina/guanina fosforibosil transferase (gpt), e timidina cinase do vírus simples do herpes (HSV-k), e uma combinação dos mesmos.
[00051] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb.
[00052] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um ácido nucléico flanqueado com sequências alvo com recombinação específica de sítio. Em uma forma de realização, o ácido nucléico compreende um ácido nucléico genômico. Em uma forma de realização, o ácido nucléico genômico é derivado de um camundongo, um ser humano, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, as sequências alvo com recombinação específica de sítio são selecionadas do grupo que consiste de loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox, e uma combinação dos mesmos.
[00053] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um alelo condicional. Em uma forma de realização, o alelo condicional é um alelo multifuncional, como descrito na US 2011/0104799, que é incorporada por referência em sua totalidade. Em uma forma de realização, o alelo condicional compreende: (a) uma sequência atuante na orientação de sentido com respeito à transcrição de um gene alvo, e um cassete de seleção de medicamento na orientação de sentido ou de antissentido; (b) na orientação de antissentido uma sequência de nucleotídeo de interesse (NSI) e uma condicional pelo módulo de inversão (COIN, que utiliza um íntron que separa exon e um módulo igual a genetrap invertível; ver, por exemplo, a US 2011/0104799, que é incorporada por referência em sua totalidade); e (c) unidades recombináveis que recombinam-se na exposição a uma primeira recombinase para formar um alelo condicional que (i) carece da sequência atuante e da DSC, e (ii) contém a NSI na orientação de sentido e a COIN na orientação de antissentido.
[00054] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um cassete de seleção. Em uma forma de realização, o cassete de seleção compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um marcador de seleção, em que a sequência de ácido nucléico é operavelmente ligada a um promotor. Em uma forma de realização, o promotor é ativo em uma célula procariótica. Em uma forma de realização, o ácido nucléico é ativo tanto em células procarióticas quanto em eucarióticas. Em uma forma de realização, o cassete de seleção é flanqueado com sequências alvo com recombinação específica de sítio. Em uma forma de realização, o marcador de seleção é selecionado de neomicina fosfotransferase (neon), hidromicina B fosfotransferase (hygr), puromicina-N-acetiltransferase (puror), blasticidina S desaminase (bsrr), xantina/guanina fosforibosil transferase (gpt), e timidina cinase do vírus simples do herpes (HSV-k), e uma combinação dos mesmos.
[00055] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um gene repórter operavelmente ligado a um promotor, em que o gene repórter codifica uma proteína repórter selecionada do grupo que consiste de LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarela intensificada (EYFP), Emerald, proteína fluorescente verde intensificada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente ciano (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferase, fosfatase alcalina, e uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor indutível. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor endógeno. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor exógeno. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em um tipo de célula específico. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em uma maneira específica de tecido. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em uma maneira específica de estágio desenvolvimental.
[00056] Em uma forma de realização, a integração do ácido nucléico inserido no lócus genômico alvo introduz uma ou mais modificações genéticas como aqui descritas. Em uma forma de realização, a modificação genética é uma deleção de uma sequência de ácido nucléico endógena. Em uma forma de realização, a modificação genética é uma adição de uma sequência de ácido nucléico exógena no lócus genômico alvo. Em uma forma de realização, a modificação genética é uma substituição de uma sequência de ácido nucléico endógena com uma sequência de ácido nucléico exógena no lócus genômico alvo. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico exógena é uma sequência de ácido nucléico que não de camundongo. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico exógena é uma sequência de ácido nucléico de ser humano. Em uma forma de realização, a modificação genética é um silenciamento, uma deleção, uma inserção, uma substituição (“knock-in”), uma mutação pontual, uma troca de domínio, uma troca de exon, uma troca de íntron, uma troca de sequência reguladora, uma troca de gene, ou uma combinação dos mesmos.
[00057] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é homólogo a uma sequência de ácido nucléico de camundongo. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é um ácido nucléico de ser humano. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é um fragmento de um ácido nucléico genômico. Em uma forma de realização, o ácido nucléico genômico é um ácido nucléico genômico de camundongo, um ácido nucléico genômico de ser humano, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido varia de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb como descrito acima.
[00058] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é ortólogo a uma sequência de ácido nucléico de camundongo. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é um ácido nucléico de ser humano. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é um fragmento de um ácido nucléico genômico. Em uma forma de realização, o ácido nucléico genômico é um ácido nucléico genômico de camundongo, um ácido nucléico genômico de ser humano, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido varia de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb como descrito acima.
[00059] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um lócus genômico que codifica uma proteína expressada no sistema nervoso, no sistema esqueletal, no sistema digestivo, no sistema circulatório, no sistema muscular, no sistema respiratório, no sistema cardiovascular, no sistema linfático, no sistema endócrino, no sistema urinário, no sistema reprodutivo, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um lócus genômico que codifica uma proteína expressada em uma medula óssea ou uma célula derivada da medula óssea. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um lócus genômico que codifica uma proteína expressada em uma célula de baço. Em uma forma de realização, o lócus genômico compreende uma sequência de ácido nucléico genômica de camundongo, uma sequência de ácido nucléico genômica de ser humano, ou uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, o ácido nucléico compreende um lócus genômico que codifica uma proteína expressada em uma célula B. Em uma forma de realização, o ácido nucléico compreende um lócus genômico que codifica uma proteína expressada em uma célula B imatura. Em uma forma de realização, o ácido nucléico compreende um lócus genômico que codifica uma proteína expressada em uma célula B madura.
[00060] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico genômica que codifica uma sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana.
[00061] Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico genômica compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana não rearranjada operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo ou sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina humana, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é selecionada de uma CH1, uma dobradiça, uma CH2, uma CH3, e uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante de cadeia pesada compreende uma CH1-dobradiça-CH2-CH3. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico genômica compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana rearranjada operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo ou uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina de ser humano, ou uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é selecionada de uma CH1, uma dobradiça, uma CH2, uma CH3, e uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante de cadeia pesada compreende uma CH1-dobradiça-CH2-CH3.
[00062] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico genômica que codifica uma sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve da imunoglobulina humana. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico genômica compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável de cadeia leve X e/ou K humana não rearranjada. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico genômica compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável de cadeia leve X e/ou k humana rearranjada. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região variável de cadeia leve X e/ou k humana não rearranjada ou rearranjada é operavelmente ligada a um sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve da imunoglobulina de camundongo, rato, ou ser humano selecionada de uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve X e uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve k.
[00063] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico humana. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana codifica uma proteína extracelular. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana codifica um ligando para um receptor. Em uma forma de realização, o ligando é uma citocina. Em uma forma de realização, a citocina é uma quimiocina selecionada de CCL, CXCL, CX3CL, e XCL. Em uma forma de realização, a citocina é um fator de necrose de tumor (TNF). Em uma forma de realização, a citocina é uma interleucina (IL). Em uma forma de realização, a interleucina é selecionada de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL- 20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL- 31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, e IL-36. Em uma forma de realização, a interleucina é IL-2. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana genômica codifica uma proteína citoplásmica. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana genômica codifica uma proteína de membrana. Em uma forma de realização, a proteína de membrana é um receptor. Em uma forma de realização, o receptor é um receptor de citocina. Em uma forma de realização, o receptor de citocina é um receptor de interleucina. Em uma forma de realização, o receptor de interleucina é um receptor alfa da interleucina 2. Em uma forma de realização, o receptor de interleucina é um receptor beta da interleucina 2. Em uma forma de realização, o receptor de interleucina é um receptor gama da interleucina 2. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana genômica codifica uma proteína nuclear. Em uma forma de realização, a proteína nuclear é um receptor nuclear.
[00064] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma modificação genética em uma sequência codificadora. Em uma forma de realização, a modificação genética compreende uma mutação de deleção de uma sequência codificadora. Em uma forma de realização, a modificação genética compreende uma fusão de duas sequências codificadoras endógenas.
[00065] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico humana que codifica uma proteína humana mutante. Em uma forma de realização, a proteína humana mutante é caracterizada por uma característica de ligação alterada, localização alterada, expressão alterada, e/ou padrão de expressão alterada. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana compreende pelo menos um alelo de doença humana. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença neurológica. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença cardiovascular. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença renal. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença muscular. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença do sangue. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de um gene que causa câncer. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença do sistema imune. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo dominante. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo recessivo. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana compreende um alelo de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP).
[00066] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência reguladora. Em uma forma de realização, a sequência reguladora é uma sequência promotora. Em uma forma de realização, a sequência reguladora é uma sequência intensificadora. Em uma forma de realização, a sequência reguladora é uma sequência de ligação de repressor transcricional. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico humana, em que a sequência de ácido nucléico humana compreende uma deleção de uma sequência codificadora que não proteína, mas não compreende uma deleção de uma sequência codificadora de proteína. Em uma forma de realização, a deleção da sequência codificadora que não proteína compreende uma deleção de uma sequência reguladora. Em uma forma de realização, a deleção do elemento regulador compreende uma deleção de uma sequência promotora. Em uma forma de realização, a deleção do elemento regulador compreende uma deleção de uma sequência intensificadora.
[00067] Em um aspecto, um método para modificar um lócus genômico alvo em uma célula de mamífero é fornecido, compreendendo introduzir em uma célula de mamífero: (i) um agente de nuclease que cause uma ruptura do filamento único ou duplo no lócus genômico alvo ou próximo, e (ii) um vetor de alvejamento grande (LTVEC) compreendendo um ácido nucléico inserido flanqueado com uma ramificação de homologia a montante e uma ramificação de homologia a jusante.
[00068] Em uma forma de realização, a célula de mamífero é uma célula pluripotente. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco embrionária (ES). Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula ES não humana. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco pluripotente induzida (iPS). Em uma forma de realização, a célula tronco pluripotente induzida (iPS) é derivada de um fibroblasto. Em uma forma de realização, a célula tronco pluripotente induzida (iPS) é derivada de um fibroblasto humano. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco hematopoiética (HSC). Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco neuronal (NSC). Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco epiblástica. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é um célula progenitora desenvolvimentalmente restringida.
[00069] Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula pluripotente de roedor. Em uma forma de realização, a célula pluripotente de roedor é uma célula pluripotente de rato. Em uma forma de realização, a célula pluripotente de rato é uma célula ES de rato. Em uma forma de realização, a célula pluripotente de roedor é uma célula pluripotente de camundongo. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco embrionária (ES) de camundongo.
[00070] Em uma forma de realização, a célula de mamífero é uma célula imortalizada de camundongo ou rato. Em uma forma de realização, a célula de mamífero é uma célula humana imortalizada. Em uma forma de realização, a célula de mamífero é um fibroblasto humano. Em uma forma de realização, a célula de mamífero é uma célula cancerosa. Em uma forma de realização, a célula de mamífero é uma célula cancerosa humana.
[00071] Em uma forma de realização, a célula de mamífero é uma célula de ser humano isolada de um paciente tendo uma doença. Em uma forma de realização, a célula humana compreende uma sequência de ácido nucléico humana que codifica uma proteína mutante. Em uma forma de realização, a proteína humana mutante é caracterizada por uma característica de ligação alterada, localização alterada, expressão alterada, e/ou padrão de expressão alterado. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana compreende pelo menos um alelo de doença humana. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana compreende pelo menos um alelo de doença humana. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença neurológica. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença cardiovascular. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença renal. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença muscular. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença do sangue. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de um gene que causa câncer. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença do sistema imune. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo dominante. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo recessivo. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana compreende um alelo de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP).
[00072] Em uma forma de realização, o lócus genômico alvo é selecionado de um lócus FcER1a, um lócus TLR4, um lócus PRLR, um lócus Notch4, um lócus Accn2, um lócus Adamts5, um lócus TRPA1, lócus FolH1, um lócus LRP5, e um lócus ERBB4.
[00073] Em uma forma de realização, o lócus genômico alvo compreende uma sequência genômica humana. Em uma forma de realização, o lócus genômico alvo compreende uma sequência de ácido nucléico genômica de animal não humano. Em uma forma de realização, o animal não humano é um roedor. Em uma forma de realização, o roedor é selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster.
[00074] Em uma forma de realização, o pelo menos um alelo de doença humana descrito acima que está localizado no lócus genômico alvo é substituído com o ácido nucléico inserido. Em uma forma de realização, a substituição do alelo de doença humana é mediado por um silenciamento, uma deleção, uma inserção, uma substituição (“knock-in”), uma troca de domínio, uma troca de exon, uma troca de íntron, uma troca de sequência reguladora, uma troca de gene, ou uma combinação dos mesmos.
[00075] Em uma forma de realização, o agente de nuclease é introduzido junto com o vetor de alvejamento grande (LTVEC). Em uma forma de realização, o agente de nuclease é introduzido separadamente do LTVEC em um período de tempo. Em uma forma de realização, o agente de nuclease é introduzido antes da introdução do LTVEC. Em uma forma de realização, o agente de nuclease é introduzido a seguir da introdução do LTVEC.
[00076] Em uma forma de realização, o uso combinado do LTVEC com o agente de nuclease resulta em uma eficiência de alvejamento aumentada comparada com o uso do LTVEC sozinho. Em uma forma de realização, quando o LTVEC é usado em conjunção com o agente de nuclease, a eficiência de alvejamento do LTVEC é aumentada pelo menos em duas vezes comparada a quando o LTVEC é usado sozinho. Em uma forma de realização, quando o LTVEC é usado em conjunção com o agente de nuclease, a eficiência de alvejamento do LTVEC é aumentada pelo menos em três vezes comparada a quando o LTVEC é usado sozinho. Em uma forma de realização, quando o LTVEC é usado em conjunção com o agente de nuclease, a eficiência de alvejamento do LTVEC é aumentada pelo menos em quatro vezes comparada a quando o LTVEC é usado sozinho.
[00077] Em uma forma de realização, o agente de nuclease é uma construção de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucléico que codifica uma nuclease, em que a sequência de ácido nucléico é operavelmente ligada a um promotor. Em uma forma de realização, o promotor é um promotor constitutivamente ativo. Em uma forma de realização, o promotor é um promotor indutível. Em uma forma de realização, o promotor é ativo na célula de mamífero. Em uma forma de realização, o agente de nuclease é um mRNA que codifica uma endonuclease.
[00078] Em uma forma de realização, o agente de nuclease é uma nuclease dedo de zinco (ZFN). Em uma forma de realização, cada monômero da ZFN compreende 3 ou mais domínios de ligação de DNA com base no dedo de zinco, em que cada domínio de ligação de DNA com base no dedo de zinco se liga a um subsítio de 3 pares de base. Em uma forma de realização, a ZFN é uma proteína quimérica compreendendo um domínio de ligação de DNA com base no dedo de zinco operavelmente ligada a uma nuclease independente. Em uma forma de realização, a endonuclease independente é uma endonuclease Fokl. Em uma forma de realização, o agente de nuclease compreende uma primeira ZFN e uma segunda ZFN, em que cada uma da primeira ZFN e da segunda ZFN é operavelmente ligada a uma nuclease Fokl, em que a primeira e a segunda ZFN reconhecem duas sequências de DNA alvo contíguas em cada filamento da sequência de DNA alvo separadas em cerca de 6 pares de base a cerca de 40 pares do sítio de clivagem base, e em que as nucleases Fokl dimerizam e realizam uma ruptura de filamento duplo.
[00079] Em uma forma de realização, o agente de nuclease é uma Nuclease Efetora Igual ao Ativador de Transcrição (TALEN). Em uma forma de realização, cada monômero da TALEN compreende de 12 a 25 repetições TAL, em que cada repetição TAL liga um subsítio de l par de base. Em uma forma de realização, o agente de nuclease é uma proteína quimérica compreendendo um domínio de ligação de DNA com base na repetição TAL operavelmente ligada a uma nuclease independente. Em uma forma de realização, a nuclease independente é uma endonuclease Fokl. Em uma forma de realização, o agente de nuclease compreende um primeiro domínio de ligação de DNA com base na repetição TAL e um segundo domínio de ligação de DNA com base na repetição TAL, em que cada um do primeiro e do segundo domínios de ligação de DNA com base na repetição TAL é operavelmente ligada a uma nuclease Fokl, em que o primeiro e o segundo domínios de ligação de DNA com base na repetição TAL reconhecem duas sequências de DNA alvo contíguas em cada filamento da sequência de DNA alvo separada em cerca de 6 pares de base a cerca de 40 pares do sítio de clivagem base, e em que as nucleases Fokl dimerizam e realizam uma ruptura de filamento duplo.
[00080] Em uma forma de realização, cada monômero da nuclease reconhece uma sequência alvo de pelo menos 9 nucleotídeos. Em uma forma de realização, a sequência alvo é de cerca de 9 a cerca de 12 nucleotídeos no comprimento. Em uma forma de realização, a sequência alvo é de cerca de 12 a cerca de 15 nucleotídeos no comprimento. Em uma forma de realização, a sequência alvo é de cerca de 15 a cerca de 18 nucleotídeos no comprimento. Em uma forma de realização, a sequência alvo é de cerca de 18 a cerca de 21 nucleotídeos no comprimento.
[00081] Em uma forma de realização, uma sequência alvo de ácido nucléico do agente de nuclease está localizada em um íntron. Em uma forma de realização, a sequência alvo de ácido nucléico está localizada em um exon. Em uma forma de realização, a sequência alvo de ácido nucléico está localizada em um promotor. Em uma forma de realização, a sequência alvo de ácido nucléico está em uma região não codificadora de proteína. Em uma forma de realização, a região não codificadora de proteína é uma região reguladora. Em uma forma de realização, a sequência alvo de ácido nucléico está localizada em uma região reguladora de promotor. Em uma forma de realização, a sequência alvo de ácido nucléico está localizada em uma região intensificadora.
[00082] Em uma forma de realização, o agente de nuclease é uma meganuclease. Em uma forma de realização, a meganuclease reconhece sequências de DNA de filamento duplo de 12 a 40 pares de base. Em uma forma de realização, a meganuclease reconhece uma sequência alvo perfeitamente emparelhada no genoma. Em uma forma de realização, a meganuclease é uma nuclease residente. Em uma forma de realização, a nuclease residente é uma família LAGLIDADG da nuclease residente. Em uma forma de realização, a família LAGLIDADG da nuclease residente é selecionada de I-Scel, I-Crel, e I-Dmol.
[00083] Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 50 kb a cerca de 300 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 50 kb a cerca de 75 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 75 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 100 kb a 125 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 125 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 150 kb a cerca de 175 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 175 kb a cerca de 200 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 200 kb a cerca de 225 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 225 kb a cerca de 250 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 250 kb a cerca de 275 kb. Em uma forma de realização, o LTVEC varia de cerca de 275 kb a cerca de 300 kb.
[00084] Em uma forma de realização, as ramificações de homologia do LTVEC são derivadas de uma biblioteca BAC, uma biblioteca de cosmídeo, ou uma biblioteca de fago P1. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia são derivadas de um lócus genômico do animal não humano que não é alvejável usando um método convencional. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia são derivadas de um DNA sintético.
[00085] Em uma forma de realização, uma soma total da ramificação de homologia a montante e da ramificação de homologia a jusante é de pelo menos 10 kb. Em uma forma de realização, a ramificação de homologia a montante varia de cerca de 5 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, a ramificação de homologia a jusante varia de cerca de 5 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 50 kb a cerca de 60 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 70 kb a cerca de 80 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 110 kb a cerca de 120 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante variam de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb.
[00086] Em uma forma de realização, o vetor de alvejamento compreende um cassete de seleção. Em uma forma de realização, o cassete de seleção compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um marcador de seleção, em que a sequência de ácido nucléico é operavelmente ligada a um promotor. Em uma forma de realização, o promotor é ativo em uma célula de mamífero. Em uma forma de realização, o promotor é ativo tanto em células procarióticas quanto em eucarióticas. Em uma forma de realização, o marcador de seleção é selecionado de neomicina fosfotransferase (neon), hidromicina B fosfotransferase (hygr), puromicina-N-acetiltransferase (puror), blasticidina S desaminase (bsrr), xantina/guanina fosforibosil transferase (gpt), e timidina cinase do vírus simples do herpes (HSV-k), e uma combinação dos mesmos.
[00087] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 5 kb a cerca de 10 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 20 kb a cerca de 30 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 30 kb a cerca de 40 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 40 kb a cerca de 50 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 60 kb a cerca de 70 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 80 kb a cerca de 90 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 90 kb a cerca de 100 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 100 kb a cerca de 110 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 120 kb a cerca de 130 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 130 kb a cerca de 140 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 140 kb a cerca de 150 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 150 kb a cerca de 160 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 160 kb a cerca de 170 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 170 kb a cerca de 180 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 180 kb a cerca de 190 kb. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é de cerca de 190 kb a cerca de 200 kb.
[00088] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um ácido nucléico flanqueado com sequências alvo com recombinação específica de sítio. Em uma forma de realização, o ácido nucléico compreende um ácido nucléico genômico. Em uma forma de realização, o ácido nucléico genômico é derivado de um camundongo, de um ser humano, ou de uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, as sequências alvo com recombinação específica de sítio são selecionadas do grupo que consiste de loxP, lox511, lox2272, tox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox, e uma combinação das mesmas.
[00089] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um alelo condicional. Em uma forma de realização, o alelo condicional é um alelo multifuncional, como descrito na US 2011/0104799, que é incorporada por referência em sua totalidade. Em uma forma de realização, o alelo condicional compreende: (a) uma sequência atuante na orientação de sentido com respeito à transcrição de um gene alvo, e um cassete de seleção de medicamento na orientação de sentido ou de antissentido; (b) na orientação de antissentido uma sequência de nucleotídeo de interesse (NSI) e um condicional pelo módulo de inversão (COIN, que utiliza um íntron que separa exon e um módulo igual a genetrap invertível; ver, por exemplo, a US 2011/0104799, que é incorporada por referência em sua totalidade); e (c) unidades recombináveis que recombinam-se na exposição a uma primeira recombinase para formar um alelo condicional que (i) carece da sequência atuante e da DSC, e (ii) contém a NSI na orientação de sentido e a COIN na orientação de antissentido.
[00090] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um cassete de seleção. Em uma forma de realização, o cassete de seleção compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica um marcador de seleção, em que a sequência de ácido nucléico é operavelmente ligada a um promotor. Em uma forma de realização, o promotor é ativo em uma célula de mamífero. Em uma forma de realização, o ácido nucléico é ativo em uma célula eucariótica. Em uma forma de realização, o cassete de seleção é flanqueado com sequências alvo com recombinação específica de sítio. Em uma forma de realização, o marcador de seleção é selecionado da neomicina fosfotransferase (neor), hidromicina B fosfotransferase (hygr), puromicina-N-acetiltransferase (puror), blasticidina S desaminase (bse), xantina/ guanina fosforibosil transferase (gpt), e timidina cinase do vírus simples do herpes (HSV-k), e uma combinação dos mesmos.
[00091] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um gene repórter operavelmente ligado a um promotor, em que o gene repórter codifica uma proteína repórter selecionada do grupo que consiste de LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarela intensificada (EYFP), Emerald, proteína fluorescente verde intensificada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente ciano (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferase, fosfatase alcalina, e uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor indutível. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor endógeno. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor exógeno. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em um tipo de célula específico. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em uma maneira específica de tecido. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em uma maneira específica de estágio desenvolvimental.
[00092] Em uma forma de realização, a integração do ácido nucléico inserido no lócus genômico alvo introduz uma ou mais modificações genéticas como aqui descritas. Em uma forma de realização, a modificação genética é uma deleção de uma sequência de ácido nucléico endógena. Em uma forma de realização, a modificação genética é uma adição de uma sequência de ácido nucléico exógena no lócus genômico alvo. Em uma forma de realização, a modificação genética é uma substituição de uma sequência de ácido nucléico endógena com uma sequência de ácido nucléico exógena no lócus genômico alvo. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico exógena é uma sequência de ácido nucléico que não de camundongo. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico exógena é uma sequência de ácido nucléico humana. Em uma forma de realização, a modificação genética é um silenciamento, uma deleção, uma inserção, uma substituição (“knock-in”), uma mutação pontual, uma troca de domínio, uma troca de exon, uma troca de íntron, uma troca de sequência reguladora, uma troca de gene, ou uma combinação dos mesmos.
[00093] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é homólogo a uma sequência de ácido nucléico de camundongo. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é um ácido nucléico de ser humano. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é um fragmento de um ácido nucléico genômico. Em uma forma de realização, o ácido nucléico genômico é um ácido nucléico genômico de camundongo, um ácido nucléico genômico de ser humano, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido varia de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb como descrito acima.
[00094] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é ortólogo a uma sequência de ácido nucléico de camundongo. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é um ácido nucléico de ser humano. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é um fragmento de um ácido nucléico genômico. Em uma forma de realização, o ácido nucléico genômico é um ácido nucléico genômico de camundongo, um ácido nucléico genômico de ser humano, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido varia de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb como descrito acima.
[00095] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um lócus genômico que codifica uma proteína expressada no sistema nervoso, no sistema esqueletal, no sistema digestivo, no sistema circulatório, no sistema muscular, no sistema respiratório, no sistema cardiovascular, no sistema linfático, no sistema endócrino, no sistema urinário, no sistema reprodutivo, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um lócus genômico que codifica uma proteína expressada em uma medula óssea ou uma célula derivada da medula óssea. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um lócus genômico que codifica uma proteína expressada em uma célula de baço. Em uma forma de realização, o lócus genômico compreende uma sequência de ácido nucléico genômica de camundongo, uma sequência de ácido nucléico genômica de ser humano, ou uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, o ácido nucléico compreende um lócus genômico que codifica uma proteína expressada em uma célula B. Em uma forma de realização, o ácido nucléico compreende um lócus genômico que codifica uma proteína expressada em uma célula B imatura. Em uma forma de realização, o ácido nucléico compreende um lócus genômico que codifica uma proteína expressada em uma célula B madura.
[00096] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico genômica que codifica uma sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana.
[00097] Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico genômica compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana não rearranjada operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo ou sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina humana, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é selecionada de uma CH1, uma dobradiça, uma CH2, uma CH3, e uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante de cadeia pesada compreende uma CH1-dobradiça-CH2-CH3. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico genômica compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana rearranjada operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo ou uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina humana, ou uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é selecionada de uma CH1, uma dobradiça, uma CH2, uma CH3, e uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante de cadeia pesada compreende uma CH1-dobradiça-CH2-CH3.
[00098] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico genômica que codifica uma sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve da imunoglobulina humana. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico genômica compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável de cadeia leve X e/ou K humana não rearranjada. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico genômica compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável de cadeia leve X e/ou k humana rearranjada. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região variável de cadeia leve X e/ou k humana não rearranjada ou rearranjada é operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve da imunoglobulina de camundongo ou ser humano selecionada de uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve X e uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve K.
[00099] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico humana. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana codifica uma proteína extracelular. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana codifica um ligando para um receptor. Em uma forma de realização, o ligando é uma citocina. Em uma forma de realização, a citocina é uma quimiocina selecionada de CCL, CXCL, CX3CL, e XCL. Em uma forma de realização, a citocina é um fator de necrose de tumor (TNF). Em uma forma de realização, a citocina é uma interleucina (IL). Em uma forma de realização, a interleucina é selecionada de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL- 20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL- 31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, e IL-36. Em uma forma de realização, a interleucina é IL-2. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana genômica codifica uma proteína citoplásmica. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana genômica codifica uma proteína de membrana. Em uma forma de realização, a proteína de membrana é um receptor. Em uma forma de realização, o receptor é um receptor de citocina. Em uma forma de realização, o receptor de citocina é um receptor de interleucina. Em uma forma de realização, o receptor de interleucina é um receptor alfa da interleucina 2. Em uma forma de realização, o receptor de interleucina é um receptor beta da interleucina 2. Em uma forma de realização, o receptor de interleucina é um receptor gama da interleucina 2. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana genômica codifica uma proteína nuclear. Em uma forma de realização, a proteína nuclear é um receptor nuclear.
[000100] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma modificação genética em uma sequência codificadora. Em uma forma de realização, a modificação genética compreende uma mutação de deleção de uma sequência codificadora. Em uma forma de realização, a modificação genética compreende uma fusão de duas sequências codificadoras endógenas.
[000101] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico humana que codifica uma proteína humana mutante. Em uma forma de realização, a proteína humana mutante é caracterizada por uma característica de ligação alterada, localização alterada, expressão alterada, e/ou padrão de expressão alterada. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana compreende pelo menos um alelo de doença humana. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença neurológica. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença cardiovascular. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença renal. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença muscular. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença do sangue. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de um gene que causa câncer. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença do sistema imune. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo dominante. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo recessivo. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana compreende um alelo de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP).
[000102] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência reguladora.
[000103] Em uma forma de realização, a sequência reguladora é uma sequência promotora. Em uma forma de realização, a sequência reguladora é uma sequência intensificadora. Em uma forma de realização, a sequência reguladora é uma sequência de ligação de repressor transcricional. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico humana, em que a sequência de ácido nucléico humana compreende uma deleção de uma sequência codificadora que não proteína, mas não compreende uma deleção de uma sequência codificadora de proteína. Em uma forma de realização, a deleção da sequência codificadora que não proteína compreende uma deleção de uma sequência reguladora. Em uma forma de realização, a deleção do elemento regulador compreende uma deleção de uma sequência promotora. Em uma forma de realização, a deleção do elemento regulador compreende uma deleção de uma sequência intensificadora.
[000104] Em um aspecto, uma célula de mamífero fabricada com um método como aqui descrito é fornecida. Em uma forma de realização, a célula de mamífero compreende um ácido nucléico inserido compreendendo uma ou mais modificações genéticas como aqui descritas em um lócus genômico alvo.
[000105] Em uma forma de realização, a célula de mamífero é uma célula pluripotente. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco embrionária (ES). Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco pluripotente induzida (iPS). Em uma forma de realização, a célula tronco pluripotente induzida (iPS) é derivada de um fibroblasto. Em uma forma de realização, a célula tronco pluripotente induzida (iPS) é derivada de um fibroblasto humano. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco hematopoiética (HSC). Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco neuronal (NSC). Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco epiblástica. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula progenitora desenvolvimentalmente restringida.
[000106] Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula pluripotente de camundongo. Em uma forma de realização, a célula pluripotente é uma célula tronco embrionária (ES) de camundongo.
[000107] Em uma forma de realização, a célula de mamífero é uma célula imortalizada de camundongo ou rato. Em uma forma de realização, a célula de mamífero é uma célula humana imortalizada. Em uma forma de realização, a célula de mamífero é um fibroblasto humano. Em uma forma de realização, a célula de mamífero é uma célula cancerosa. Em uma forma de realização, a célula de mamífero é uma célula cancerosa humana.
[000108] Em uma forma de realização, o lócus genômico alvo é selecionado de um lócus FcER1a, um lócus TLR4, um lócus PRLR, um lócus Notch4, um lócus Accn2, um lócus Adamts5, um lócus TRPA1, lócus FolH1, um lócus LRP5, e um lócus ERBB4.
[000109] Em uma forma de realização, o lócus genômico alvo compreende uma ou mais modificações genéticas como aqui descritas. Em uma forma de realização, a modificação genética é uma deleção de uma sequência de ácido nucléico endógena. Em uma forma de realização, a modificação genética é uma adição de uma sequência de ácido nucléico exógena no lócus genômico alvo. Em uma forma de realização, a modificação genética é uma substituição de uma sequência de ácido nucléico endógena com uma sequência de ácido nucléico exógena no lócus genômico alvo. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico exógena é uma sequência de ácido nucléico que não de camundongo. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico exógena é uma sequência de ácido nucléico de ser humano. Em uma forma de realização, o lócus genômico alvo compreende uma modificação selecionada de um silenciamento, uma deleção, uma inserção, uma substituição (“knock-in”), uma troca de domínio, uma troca de exon, uma troca de íntron, uma troca de sequência reguladora, uma troca de gene, e uma combinação dos mesmos.
[000110] Em uma forma de realização, o lócus genômico alvo compreende um ácido nucléico inserido que é homólogo a uma sequência de ácido nucléico de camundongo. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é um ácido nucléico de ser humano. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é um fragmento de um ácido nucléico genômico. Em uma forma de realização, o ácido nucléico genômico é um ácido nucléico genômico de camundongo, um ácido nucléico genômico de ser humano, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido varia de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb como descrito acima.
[000111] Em uma forma de realização, o lócus genômico alvo compreende um ácido nucléico inserido que é ortólogo a uma sequência de ácido nucléico de camundongo. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é um ácido nucléico de ser humano. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido é um fragmento de um ácido nucléico genômico. Em uma forma de realização, o ácido nucléico genômico é um ácido nucléico genômico de camundongo, um ácido nucléico genômico de ser humano, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido varia de cerca de 5 kb a cerca de 200 kb como descrito acima.
[000112] Em uma forma de realização, o lócus genômico alvo compreende um alelo condicional. Em uma forma de realização, o alelo condicional é um alelo multifuncional, como descrito na US 2011/0104799, que é incorporada por referência em sua totalidade. Em uma forma de realização, o alelo condicional compreende: (a) uma sequência atuante na orientação de sentido com respeito à transcrição de um gene alvo, e um cassete de seleção de medicamento na orientação de sentido ou de antissentido; (b) na orientação de antissentido uma sequência de nucleotídeo de interesse (NSI) e uma condicional pelo módulo de inversão (COIN, que utiliza um íntron que separa exon e um módulo igual a genetrap invertível; ver, por exemplo, a US 2011/0104799, que é incorporada por referência em sua totalidade); e (c) unidades recombináveis que recombinam-se na exposição a uma primeira recombinase para formar um alelo condicional que (i) carece da sequência atuante e da DSC, e (ii) contém a NSI na orientação de sentido e a COIN na orientação de antissentido.
[000113] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende um gene repórter operavelmente ligado a um promotor, em que o gene repórter codifica uma proteína repórter selecionada do grupo que consiste de LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarela intensificada (EYFP), Emerald, proteína fluorescente verde intensificada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente ciano (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferase, fosfatase alcalina, e uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor indutível.
[000114] Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor endógeno. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado sob um controle de um promotor exógeno. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em um tipo de célula específico. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em uma maneira específica de tecido. Em uma forma de realização, o gene repórter é expressado em uma maneira específica de estágio desenvolvimental.
[000115] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico humana que codifica uma proteína expressada no sistema nervoso, no sistema esqueletal, no sistema digestivo, no sistema circulatório, no sistema muscular, no sistema respiratório, no sistema cardiovascular, no sistema linfático, no sistema endócrino, no sistema urinário, no sistema reprodutivo, ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana codifica uma proteína expressada em uma medula óssea ou uma célula derivada da medula óssea. Em uma forma de realização, o genoma da célula ES de camundongo compreende um lócus genômico de ser humano que codifica uma proteína expressada em uma célula de baço. Em uma forma de realização, o ácido nucléico humano codifica uma proteína expressada em uma célula B. Em uma forma de realização, o ácido nucléico humano codifica uma proteína expressada em uma célula B imatura. Em uma forma de realização, o ácido nucléico humano codifica uma proteína expressada em uma célula B madura.
[000116] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico humana que codifica uma sequência de aminoácido da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana não rearranjada. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana não rearranjada é operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo, uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina humana, ou uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é selecionada de uma CH1, uma dobradiça, uma CH2, uma CH3, e uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante de cadeia pesada compreende uma CH1- dobradiça-CH2-CH3. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana rearranjada. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana está operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo, uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina humana, ou uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é selecionada de uma CH1, uma dobradiça, uma CH2, uma CH3, e uma combinação das mesmas. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região constante de cadeia pesada compreende uma CH1-dobradiça- CH2- CH3.
[000117] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico humana que codifica uma sequência de aminoácido da região variável da cadeia leve da imunoglobulina humana. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável de cadeia leve X e/ou K humana não rearranjada. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável da cadeia leve X e/ou k humana rearranjada. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico da região variável da cadeia leve X e/ou k não rearranjada está operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve da imunoglobulina de camundongo ou ser humano selecionada de uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve X e uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve k.
[000118] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico humana. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana codifica uma proteína extracelular. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana codifica um ligando para um receptor. Em uma forma de realização, o ligando é uma citocina. Em uma forma de realização, a citocina é uma quimiocina selecionada de CCL, CXCL, CX3CL, e XCL. Em uma forma de realização, a citocina é um fator de necrose de tumor (TNF). Em uma forma de realização, a citocina é uma interleucina (IL). Em uma forma de realização, a interleucina é selecionada de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, 1L-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL- 20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL- 31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, e IL-36. Em uma forma de realização, a interleucina é IL-2. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana genômica codifica uma proteína citoplásmica. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana genômica codifica uma proteína de membrana. Em uma forma de realização, a proteína de membrana é um receptor. Em uma forma de realização, o receptor é um receptor de citocina. Em uma forma de realização, o receptor de citocina é um receptor de interleucina. Em uma forma de realização, o receptor de interleucina é um receptor alfa da interleucina 2. Em uma forma de realização, o receptor de interleucina é um receptor beta da interleucina 2. Em uma forma de realização, o receptor de interleucina é um receptor gama da interleucina 2. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana genômica codifica uma proteína nuclear. Em uma forma de realização, a proteína nuclear é um receptor nuclear.
[000119] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma modificação genética em uma sequência codificadora. Em uma forma de realização, a modificação genética compreende uma mutação de deleção de uma sequência codificadora. Em uma forma de realização, a modificação genética compreende uma fusão de duas sequências codificadoras endógenas.
[000120] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico humana que codifica uma proteína humana mutante. Em uma forma de realização, a proteína humana mutante é caracterizada por uma característica de ligação alterada, localização alterada, expressão alterada, e/ou padrão de expressão alterada. Em uma forma de realização, a sequência de ácido nucléico humana compreende pelo menos um alelo de doença humana. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença neurológica. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença cardiovascular. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença renal. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença muscular. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença do sangue. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de um gene que causa câncer. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo de uma doença do sistema imune. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo dominante. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana é um alelo recessivo. Em uma forma de realização, o alelo de doença humana compreende um alelo de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP).
[000121] Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência reguladora.
[000122] Em uma forma de realização, a sequência reguladora é uma sequência promotora. Em uma forma de realização, a sequência reguladora é uma sequência intensificadora. Em uma forma de realização, a sequência reguladora é uma sequência de ligação de repressor transcricional. Em uma forma de realização, o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico humana, em que a sequência de ácido nucléico humana compreende uma deleção de uma sequência codificadora que não proteína, mas não compreende uma deleção de uma sequência codificadora de proteína. Em uma forma de realização, a deleção da sequência codificadora que não proteína compreende uma deleção de uma sequência reguladora. Em uma forma de realização, a deleção do elemento regulador compreende uma deleção de uma sequência promotora. Em uma forma de realização, a deleção do elemento regulador compreende uma deleção de uma sequência intensificadora.
[000123] Em um aspecto, um método para fabricar um animal não humano compreendendo na sua linha germinativa uma ou mais modificações genéticas como aqui descritas é fornecido, compreendendo: (a) modificar um lócus genômico de interesse de um animal não humano em uma célula procariótica utilizando um vetor de alvejamento grande (LTVEC) e um agente de nuclease que gera uma ruptura de filamento único ou duplo no lócus genômico de interesse ou próximo, em que o LTVEC compreende um ácido nucléico inserido flanqueado com as ramificações de homologia a montante e a jusante, e a célula procariótica é capaz de expressar uma recombinase; (b) selecionar uma célula procariótica modificada compreendendo um LTVEC geneticamente modificado; (c) isolar o LTVEC geneticamente modificado; (d) introduzir o LTVEC geneticamente modificado em uma célula pluripotente do animal não humano para gerar uma célula pluripotente geneticamente modificada compreendendo o ácido nucléico inserido no lócus genômico de interesse; (e) selecionar a célula pluripotente geneticamente modificada; (f) introduzir a célula pluripotente geneticamente modificada em um embrião hospedeiro do animal não humano em um estágio pré-mórula; e (g) implantar o embrião hospedeiro que compreende a célula pluripotente geneticamente modificada em uma mãe substituta para gerar uma geração F0 derivada da célula pluripotente geneticamente modificada.
[000124] Em uma forma de realização, o animal não humano é um mamífero. Em uma forma de realização, o mamífero é um roedor. Em uma forma de realização, o roedor é selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster. Em uma forma de realização, o animal não humano é um camundongo, e a célula pluripotente é uma célula ES de camundongo. Em uma forma de realização, o animal não humano é um rato, e a célula pluripotente é uma célula ES de rato.
[000125] Em uma forma de realização, o lócus genômico alvo compreende uma ou mais modificações genéticas como aqui descritas.
[000126] Em uma forma de realização, a etapa de isolação (c) compreende ainda (c)’ linearizar o LTVEC geneticamente modificado.
[000127] Em uma forma de realização, a etapa de introdução (d) compreende ainda (d)’ introduzir um agente de nuclease como aqui descrito na célula pluripotente. Em uma forma de realização, o agente de nuclease é uma nuclease dedo de zinco (ZFN). Em uma forma de realização, o agente de nuclease é uma Nuclease Efetora Igual ao Ativador de Transcrição (TALEN).
[000128] Em uma forma de realização, as etapas de seleção (b) e/ou (e) são realizadas aplicando-se um agente selecionável como aqui descrito à célula procariótica ou à célula pluripotente.
[000129] Em uma forma de realização, as etapas de seleção (b) e/ou (e) são realizadas por intermédio de um ensaio de modificação de alelo (MOA) como aqui descrito.
[000130] A FIG. 1 ilustra o sítio de clivagem da Nuclease Dedo de Zinco (ZFN) no gene 112rg de camundongo. A figura não está proporcionalmente e, escala. As sequências em caixa no painel de fundo representam as sequências alvo ZFN.
[000131] Esta invenção não é limitada aos métodos particulares, e condições experimentais descritas, visto que tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada é apenas para o propósito de descrever as formas de realização particulares, e não é intencionada a ser limitante, visto que o escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações.
[000132] A menos que de outro modo definido, todos os termos e frases aqui usados incluem os significados que os termos e as frases conquistaram na técnica, a menos que o contrário seja claramente indicado ou claramente evidente a partir do contexto no qual o termo ou frase são usados. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos podem ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais particulares são agora descritos. Todas as publicações mencionados são por meio deste incorporado por referência.
[000133] Os termos “célula tronco embrionária” ou “célula ES” como aqui usados incluem um célula totipotente ou pluripotente derivada de embrião que é capaz de proliferação não diferenciada in vitro, e é capaz de contribuir com qualquer tecido do embrião em desenvolvimento na introdução em um embrião. O termo “célula pluripotente” como aqui usado inclui uma célula não diferenciada que possui a capacidade para desenvolver em mais do que um tipo de célula diferenciada.
[000134] O termo “linha germinativa” em referência a uma sequência de ácido nucléico da imunoglobulina inclui uma sequência de ácido nucléico que pode ser passada para a progênie.
[000135] A frase “cadeia pesada,” ou “cadeia pesada da imunoglobulina” inclui uma sequência de cadeia pesada da imunoglobulina, incluindo a sequência da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina, de qualquer organismo. Os domínios variáveis de cadeia pesada incluem três CDRs de cadeia pesada e quatro regiões de armação (FR), a menos que de outro modo especificado. Fragmentos das cadeias pesadas incluem CDRs, CDRs e FRs, e combinações dos mesmos. Uma cadeia pesada típica tem, a seguir do domínio variável (do terminal N para o terminal C), um domínio CH1, uma dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3. Um fragmento funcional de uma cadeia pesada inclui um fragmento que é capaz de especificamente reconhecer um epítopo (por exemplo, reconhecer o epítopo com um KD na faixa micromolar, nanomolar, ou picomolar), que é capaz de expressão e secreção a partir de uma célula, e que compreende pelo menos uma CDR. Os domínios variáveis de cadeia pesada são codificados pela sequência de nucleotídeo da região variável, que no geral compreende segmentos VH, DH, e JH derivados de um repertório de segmentos VH, DH, e JH presentes na linha germinativa. As sequências, localizações e nomenclatura para os segmentos de cadeia pesada V, D, e J para os vários organismos podem ser encontrados na base de dados IMGT, que é acessível por intermédio da internet na world wide web (www) na URL “imgt.org.”
[000136] A frase “cadeia leve” inclui uma sequência da cadeia leve da imunoglobulina de qualquer organismo, e a menos que de outro modo especificado inclui as cadeias leves capa (K) e lambda (X) humanas e um VpreB, assim como cadeias leves substitutas. Os domínios variáveis de cadeia leve tipicamente incluem três CDRs de cadeia leve e quatro FRs, a menos que de outro modo especificado. No geral, uma cadeia leve de tamanho natural inclui, do terminal amino para o terminal carboxila, um domínio variável que inclui FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, e uma sequência de aminoácido da região constante de cadeia leve. Os domínios variáveis de cadeia leve são codificados pela sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve, que no geral compreende os segmentos de gene da cadeia leve VL e cadeia leve JL, derivados de um repertório dos segmentos de gene V e J da cadeia leve presentes na linha germinativa. Sequências, localizações e nomenclatura para os segmentos de gene V e J da cadeia leve para os vários organismos podem ser encontrados na base de dados IMGT, que é acessível por intermédio da internet na world wide web (www) na URL “imgt.org.” as cadeias leves incluem aquelas, por exemplo, que não se ligam seletivamente a um primeiro ou um segundo epítopo seletivamente ligado pela proteína de ligação de epítopo na qual eles aparecem. As cadeias leves também incluem aquelas que ligam e reconhecem, ou auxiliam a cadeia pesada com ligação e reconhecimento, de um ou mais epítopos seletivamente ligados pela proteína de ligação de epítopo na qual eles aparecem.
[000137] O termo “ácido nucléico homólogo” como aqui usado inclui uma sequência de ácido nucléico que é idêntica ou substancialmente similar a uma sequência de referência conhecida. Em uma forma de realização, o termo “ácido nucléico homólogo” é usado para caracterizar uma sequência de DNA ou RNA sendo pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou ainda 100 % idêntica a uma sequência de referência conhecida.
[000138] O termo “ácido nucléico ortólogo” como aqui usado inclui uma sequência de ácido nucléico de uma espécie que é funcionalmente equivalente a uma sequência de referência conhecida em uma outra espécie.
[000139] O termo “vetor de alvejamento grande” ou “LTVEC” como aqui usado inclui vetores de alvejamento grandes para células eucarióticas que são derivadas de fragmentos de ácido nucléico genômico clonado maior do que aqueles tipicamente usados por outros métodos intencionados a realizar alvejamento homólogo nas células eucarióticas. O tamanho do LTVEC é muito grande para permitir a triagem de eventos de alvejamento pelos ensaios convencionais, por exemplo, southern blotting e PCR de faixa longa (por exemplo, l kb a 5 kb). Os exemplos do LTVEC, incluem, mas não são limitados aos, vetores derivados de um cromossoma artificial bacteriano (BAC) e um cromossoma artificial de levedura (YAC).
[000140] Os termos “modificação de alelo” ou “MOA” incluem a modificação da sequência de DNA exata de um alelo de um gene(s) ou lócus (locais) cromossômico(s) em um genoma. Os exemplos de “modificação de alelo (MOA)” incluem, mas não são limitados a, deleções, substituições, ou inserções de tão pouco quanto um único nucleotídeo ou deleções de muitas quilobases que se estendem através de um gene(s) ou lócus (locais) cromossômico(s) de interesse, assim como quaisquer e todas as modificações possíveis entre estes dois extremos.
[000141] O termo “nuclease” como aqui usado inclui um agente que induz uma ruptura em uma sequência de ácido nucléico, por exemplo, uma ruptura de filamento único ou duplo em uma sequência de DNA de filamento duplo. As nucleases incluem aquelas que se ligam a uma sequência pré- selecionadas ou específicas e cortam na sequência pré-selecionada ou específica ou próximo, por exemplo, Nucleases Dedo de Zinco engendradas e nucleases efetoras TAL engendradas. As nucleases não são limitadas às nucleases efetoras ZFN e TAL, mas podem ser qualquer nuclease adequada para o uso com um LTVEC para se obter eficiência de alvejamento melhorada. Os exemplos não limitantes incluem outras nucleases com base no dedo de zinco e meganucleases engendradas que cortam nas sequências pré- selecionadas ou específicas.
[000142] As nucleases efetoras TAL adequadas para o uso com a invenção incluem quaisquer nucleases TAL conhecidas na técnica. Os exemplos de nucleases TAL adequadas, e métodos para preparar nucleases TAL adequadas, são divulgadas, por exemplo, nos Pedidos de Patente US Nos. 2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A1, 2005/0208489 A1, 2005/0026157 A1, 2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1, e 2006/0063231 A1 (cada um por meio deste incorporado por referência). Em várias formas de realização, as nucleases efetoras TAL são engendradas de modo que cortem em uma sequência alvo de ácido nucléico ou próximo, por exemplo, em um genoma de interesse, em que a sequência alvo de ácido nucléico está em uma sequência a ser modificada por um LTVEC ou próximo. As nucleases efetoras TAL são proteínas que compreendem um domínio de endonuclease e um ou mais domínios de ligação de DNA efetores TAL, em que o um ou mais domínios de ligação de DNA efetores TAL compreendem uma sequência que reconhece uma sequência de ácido nucléico pré-selecionada ou específica. As nucleases TAL adequadas para uso com a invenção incluem aquelas que são especificamente planejadas para ligar nas sequências de ácido nucléico alvos a serem modificadas pelos LTVECs como aqui descrito ou próximo.
[000143] A frase “operavelmente ligada” inclui uma relação em que os componentes operavelmente ligados funcionam na sua maneira pretendida. Em um caso, uma sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína pode ser operavelmente ligada às sequências reguladoras (por exemplo, sequência promotora, intensificadora, silenciadora, etc.) de modo a reter a regulagem transcricional apropriada. Em um caso, uma sequência de ácido nucléico de uma região variável da imunoglobulina (ou segmentos V(D)J) pode ser operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucléico de uma região constante da imunoglobulina de modo a permitir a recombinação apropriada entre as sequências em uma sequência de cadeia pesada ou leve da imunoglobulina.
[000144] Os termos “promotor” e “elemento regulador promotor”, e os semelhantes, como aqui usados incluem um elemento de sequência de nucleotídeo dentro de um fragmento de ácido nucléico ou gene que controla a expressão deste gene.
[000145] O termo “sítio de recombinação” como aqui usado inclui uma sequência de nucleotídeo que é reconhecida por uma recombinase específica de sítio e que pode servir como um substrato para um evento de recombinação.
[000146] O termo “recombinase específica de sítio” como aqui usado inclui um grupo de enzimas que podem facilitar a recombinação entre os “sítios de recombinação” onde os dois sítios de recombinação são fisicamente separados dentro de uma única molécula de ácido nucléico ou em moléculas de ácido nucléico separadas. Os exemplos de “recombinase específica de sítio” incluem, mas não são limitados, as recombinases Cre, Flp, e Dre.
[000147] Embora progresso tenha sido feito no alvejamento de vários locais genômicos de animais não humanos, permanecem ainda muitos locais genômicos ou tipos de célula que não podem ser alvejadas com estratégias de alvejamento convencionais. As razões para a falha podem variar, mas, como aqui usadas, incluem locais ou células que não são de modo algum alvejadas com êxito, ou são alvejadas incorretamente ou em uma eficiência significantemente baixa pelos métodos de alvejamento convencionais. Os métodos de alvejamento convencionais incluem o alvejamento que usa a recombinação homóloga utilizando vetores de alvejamento convencionais. Os locais que são difíceis de alvejar incluem locais que não podem ser alvejados mesmo com os LTVECs sozinhos, isto é, na ausência de auxílio na forma de uma ruptura de filamento único ou duplo recombinogênica, ou que são alvejados com LTVECs incorretamente ou em uma eficiência baixa na ausência da ruptura de filamento único ou duplo recombinogênica.
[000148] As composições e métodos são fornecidos para alvejar sequências de ácido nucléico que utilizam um agente de nuclease capaz de formar uma ruptura de filamento único ou duplo recombinogênica, em conjunção com um vetor de alvejamento grande, ou LTVEC, em que a sequência de ácido nucléico alvejada (ou uma sequência próxima à sequência de ácido nucléico alvejada) é modificada pelo LTVEC. As composições e métodos são úteis para modificar as sequências de ácido nucléico genômicas que são difíceis ou impossíveis de modificar usando as estratégias de alvejamento convencionais, mesmo quando do uso de LTVECs sozinhos.
[000149] Em vários aspectos, composições e métodos são fornecidos para utilizar um LTVEC para realizar uma modificação a um ácido nucléico alvo, por exemplo, um lócus em um genoma, em que o ácido nucléico alvo compreende uma sequência alvo que deva ser modificada por uma sequência do LTVEC (pela recombinação homóloga do ácido nucléico alvo com o LTVEC), em que uma ruptura de filamento único ou duplo é feita no ácido nucléico alvo na sequência alvo ou próximo.
[000150] A presença de uma ruptura de filamento único ou duplo no ácido nucléico alvo ou próximo, em várias formas de realização, aumenta a eficiência e/ou frequência de recombinação entre um LTVEC e um ácido nucléico alvo. Em uma forma de realização a recombinação é a recombinação homóloga. Em uma outra forma de realização a recombinação é uma inserção pela união de extremidade não homóloga. Em várias formas de realização, na presença da ruptura de filamento único ou duplo, a eficiência de alvejamento de uma sequência de LTVEC no lócus genômico alvo é de pelo menos cerca de 2 vezes mais alta, pelo menos cerca de 3 vezes mais alta, pelo menos cerca de 4 vezes mais alta do que na ausência da ruptura de filamento único ou duplo (usando, por exemplo, o mesmo LTVEC e o mesmo ácido nucléico alvo compreendendo a mesma sequência alvo mas na ausência de uma nuclease adicionada que causa a ruptura de filamento único ou duplo).
[000151] Os LTVECs adequados para o uso com a invenção, e métodos para fabricar os mesmos, são descritos, por exemplo, nas Pats. US Nos. 6.586.251, 6.596.541, 7.105.348, e WO 2002/036789 (PCT/US01/45375).
[000152] Embora as formas de realização direcionadas para introduzir um LTVEC em uma célula pluripotente de camundongo, por exemplo, uma célula ES de camundongo, estejam extensivamente debatidas, outros métodos que introduzem um LTVEC em uma variedade de tipos de célula de mamífero também são aqui fornecidos. Tais células de mamífero incluem quaisquer células de mamífero que possam ser geneticamente modificadas de acordo com o método como aqui divulgado, incluindo, por exemplo, uma célula de camundongo, uma célula de rato, uma célula de coelho, uma célula de porco, uma célula bovino, uma célula de cervo, uma célula de ovelha, uma célula de cabra, uma célula de galinha, uma célula de gato, uma célula de cachorro, uma célula de furão, uma célula de primata (por exemplo, sagui, macaco rhesus), e os semelhantes. Em algumas formas de realização, para aqueles mamíferos para os quais células pluripotentes geneticamente modificáveis adequadas não são facilmente disponíveis, outros métodos são utilizados de modo a reprogramar células somáticas em células pluripotentes, por exemplo, por intermédio da introdução nas células somáticas de uma combinação de fatores que induzem a pluripotência, incluindo, mas não limitados a, Oct3/4, Sox2, KLF4, Myc, Nanog, LIN28, e Glis1.
[000153] Em uma forma de realização, as ramificações de homologia a montante e a jusante são do mesmo genoma como o genoma alvejado. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia são de um genoma relacionado, por exemplo, o genoma alvejado é um genoma de camundongo de uma primeira cepa, e as ramificações de alvejamento são de um genoma de camundongo de uma segunda cepa, em que a primeira cepa e a segunda cepa são diferentes. Em uma forma de realização, as ramificações de alvejamento são derivadas de uma biblioteca de BAC, uma biblioteca de cosmídeo, ou uma biblioteca de fago P1. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia são derivadas de um DNA sintético. Em uma forma de realização, as ramificações de homologia são derivadas de um gene que não é alvejável usando os métodos convencionais. Em uma forma de realização específica, as ramificações de homologia são de um gene que não pode ser alvejado usando a tecnologia de alvejamento convencional, ou pode ser alvejado apenas incorretamente ou apenas com eficiência significantemente baixa, na ausência de uma ruptura de filamento único ou duplo induzida por um agente de nuclease.
[000154] Em várias formas de realização, de modo a facilitar a identificação da modificação alvejada, um ensaio quantitativo de alto rendimento, a saber, ensaio de modificação de alelo (MOA), é utilizado. O ensaio de MOA aqui descrito permite uma triagem em larga escala de um alelo(s) modificado(s) em um cromossoma precursor a seguir de uma modificação genética. O ensaio MOA pode ser realizado por intermédio de várias técnicas analíticas, incluindo, mas não limitadas a, uma PCR quantitativa, por exemplo, uma PCR em tempo real (qPCR). Por exemplo, a PCR em tempo real compreende um primeiro conjunto de iniciador que reconhece o lócus alvo e um segundo conjunto de iniciador que reconhece um lócus de referência não alvejado. Além disso, o conjunto de iniciador compreende uma sonda fluorescente que reconhece a sequência amplificada. O ensaio quantitativo também pode ser realizado por intermédio de uma variedade de técnicas analíticas, incluindo, mas não limitadas, a hibridização in situ mediada pela fluorescência (FISH), hibridização genômica comparativa, amplificação de DNA isotérmica, hibridização quantitativa a uma sonda(s) imobilizada(s), Invader Probes®, MMP assays®, TaqMan® Molecular Beacon, e tecnologia de sonda Eclipse®. (Ver, por exemplo, a US2005/0144655, aqui incorporada por referência em sua totalidade).
[000155] Em algumas formas de realização, várias modificações genéticas dos locais genômicos alvo aqui descritas podem ser realizadas por uma série de reações de recombinação homóloga (BHR) em células bacterianas usando um LTVEC derivado do DNA de cromossoma artificial bacteriano (BAC) usando a tecnologia de engendramento genético VELOCIGENE® (ver, por exemplo, a Pat. US No. 6.586.251 e Valenzuela, D. M. et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6): 652-659, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades).
[000156] Em algumas formas de realização, as células ES de camundongo alvejadas compreendendo várias modificações genéticas como aqui descritas são usadas como células ES doadoras e introduzidas em um embrião de camundongo no estágio pré-mórula, por exemplo, um embrião de camundongo no estágio de 8 células, por intermédio do método VELOCIMOUSE® (ver, por exemplo, US 7.576.259, US 7.659.442, US 7.294.754, e US 2008-0078000 A1, todas as quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades). O embrião de camundongo compreendendo as células ES geneticamente modificadas é incubado até o estágio de blastócisto e depois implantadas em uma mãe substituta para produzir um camundongo F0. Os camundongos que carregam o lócus genômico geneticamente modificado podem ser identificados por intermédio do ensaio de modificação de alelo (MOA) como aqui descrito. O camundongo da geração F0 resultante derivado as células ES geneticamente modificadas é cruzado a um camundongo do tipo selvagem para se obter a descendência da geração F1. A seguir da genotipagem com iniciadores e/ou sondas específicos, os filhotes F1 que são heterozigotos para o lócus genômico geneticamente modificados são cruzados entre si para produzir camundongos que são homozigotos para o lócus genômico geneticamente modificado.
[000157] Deve ser mencionado que como aqui usado e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um(a)”, “e”, e “o(a)” incluem referências plurais a menos que o contexto claramente declare de outro modo. Todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado.
[000158] As publicações aqui debatidas são fornecidas unicamente para a sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção descrita não seja designada antedatar tal publicação em virtude da invenção anterior. Além disso, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais, que podem necessitar ser independentemente confirmadas.
[000159] A invenção descrita pode ser expressada em outras formas específicas sem divergir do seu espírito ou atributos essenciais e, consequentemente, referência deve ser feita às reivindicações anexas, ao invés de ao relatório descritivo precedente, como indicando o escopo da invenção.
[000160] Os exemplos que seguem são desenvolvidos de modo a prover aqueles de habilidade comum na técnica com uma divulgação e descrição completas de como realizar e usar a presente invenção, e não são intencionados a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção nem são intencionados a representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão com respeito aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns erros e desvios experimentais devem ser levados em conta. A menos que de outro modo indicado, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio ponderado, a temperatura é em graus Centígrados, e a pressão está na atmosférica ou próxima.
[000161] De modo a testar se a indução de uma ruptura de filamento duplo em um gene por uma Nuclease Dedo de Zinco (ZFN) intensificaria o alvejamento do mesmo gene por um LTVEC (um vetor de alvejamento com base em BAC grande), três eletroporações foram realizadas em células ES H4 F1 com um LTVEC alvejando o gene 112rg e plasmídeos que codificam cada metade de um par de ZFN nas combinações que seguem: (1) 1,5 μg de LTVEC de 112rg sozinho; (2) 20 μg de ZFN-1 de 112rg + 20 μg de LTVEC ZFN-2 de 112rg + 1,5 μg de LTVEC de 112rg; e (3) 20 μg de ZFN-1 de 112rg + 20 μg de ZFN-2 de 112rg sem LTVEC.
[000162] ZFN-1 e ZFN-2 aqui usados foram planejados para conter (1) domínios de ligação de DNA dedo de zinco que reconhecem duas sequências de DNA alvo contíguas em cada filamento da sequência alvo separada por um sítio de clivagem com 6 pares de base; e (2) nucleases Fokl que dimerizam e realizam uma ruptura de filamento duplo no sítio alvo. Mais especificamente, o domínio de dedo de zinco de ZFN-1 foi planejado para reconhecer 5’- AGCTCCAAGGTCCTC-3’ (SEQ ID NO: 1) no filamento de sentido do exon 1; e o domínio de dedo de zinco de ZFN-2 foi planejado para reconhecer 5’- GTCTTCATTCGCACT-3’ (SEQ ID NO: 2) no filamento de antissentido do exon 1 no gene 112rg.
[000163] O LTVEC (VelociGene MAID 5057L1) foi planejado para deletar aproximadamente 3.000 pares de base (3 kb) do gene 112rg, incluindo toda a sequência codificadora para a cadeia gama do receptor de IL-2 e para substituir a sequência endógena com um cassete de seleção que expressa a hidromicina fosfotransferase, que comunica a resistência à hidromicina B. LTVEC 5057L1 é derivado do clone BAC precursor 290o15 isolado de uma biblioteca de BAC comercialmente disponível (BAC ES Release 2; Incyte Genomics) e contém duas ramificações de homologia grandes com cerca de 90 kb (ramificação de homologia 1) e cerca de 8 kb (ramificação de homologia 2).
[000164] Para as eletroporações (1) e (2), as colônias resistentes à hidromicina B foram isoladas. Para a eletroporação (3), as colônias foram permitidas formar sem seleção de medicamento. As colônias foram escolhidas de cada eletroporação e cultivadas em placas de 96 reservatórios, seguido pela triagem quanto aos eventos de alvejamento pelos ensaios de perda de alelo (LOA) planejados para detectar a deleção de 3 kb criada pelo alvejamento correto do gene 112rg pelo LTVEC. Os ensaios LOA também foram usados para detectar eventos de clivagem induzidos pelo ZFN no exon 1. Tabela 1. Ensaios de LOA para a deleção de 3 kb alvejada
Tabela 2. Ensaio de LOA para a clivagem de ZFN
Tabela 3. Comparação da Eficiência de alvejamento de LTVECs
[000165] Como mostrado na Tabela 3, quando plasmídeos que codificam um ZFN planejado para clivar um sítio em um gene alvo foram combinados com um LTVEC que alveja o mesmo gene (EP #2), uma intensificação significante (aproximadamente de cerca de 4 vezes de aumento no experimento descrito) da eficiência de alvejamento foi obtido comparado ao LTVEC sozinho (EP #1).
[000166] Embora a invenção descrita tenha sido descrita com referência às suas formas de realização específicas, deve ser entendido por aqueles habilitados na técnica que várias mudanças podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem divergir do verdadeiro espírito e escopo da invenção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adotar uma situação, material, composição de matéria, processo, etapa ou etapas de processo particulares, para o espírito e escopo objetos da invenção descrita. Todas de tais modificações são intencionadas a estarem dentro do escopo das reivindicações anexa a este.
Claims (14)
1. Método para modificar um lócus genômico alvo em uma célula tronco embrionária (ES) de camundongo, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir em uma célula ES de camundongo: (i) uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) que causa uma ruptura do filamento único ou duplo em um lócus genômico alvo ou próximo; e (ii) um vetor de alvejamento grande (LTVEC) compreendendo um ácido nucléico inserido flanqueado por uma ramificação de homologia a montante e uma ramificação de homologia a jusante, em que o ácido nucléico inserido varia de 5 kb a 30 kb de comprimento, e a soma total de ramificações de homologia a montante e a jusante é de pelo menos 10 kb em comprimento; e (b) selecionar uma célula ES de camundongo alvejada compreendendo o ácido nucléico inserido no lócus genômico alvo, em que a integração do ácido nucléico inserido no lócus genômico alvo resulta em substituição de uma sequência de ácido nucléico endógena no lócus genômico alvo pelo ácido nucléico inserido.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o uso combinado do LTVEC com a ZFN resulta em uma eficiência de alvejamento aumentada quando comparada ao uso do LTVEC sozinho, opcionalmente em que a eficiência de alvejamento é aumentada em pelo menos duas vezes quando comparada ao uso do LTVEC sozinho.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: (I) a ZFN é uma construção de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucléico que codifica uma proteína ZNF, e em que o ácido nucléico está operavelmente ligado a um promotor ativo na célula ES de camundongo; ou (II) a ZFN é um mRNA que codifica uma proteína ZFN.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que uma sequência alvo da ZFN está localizada em um íntron, um exon, um promotor, uma região reguladora de promotor, ou uma região intensificadora no lócus genômico alvo.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico inserido compreende um cassete de seleção, um gene repórter, uma sequência de ácido nucléico humano ou um alelo condicional.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana não rearranjada operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina, opcionalmente em que a sequência da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é uma sequência da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo, uma sequência da região constante de cadeia pesada da imunoglobulina humana ou uma combinação das mesmas, e opcionalmente em que a sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina é selecionada de uma CH1, uma dobradiça, uma CH2, uma CH3, e uma combinação das mesmas.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável da cadeia leve X ou K humana não rearranjada operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve da imunoglobulina de camundongo ou ser humano selecionada de uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve X e uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve K.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico da região variável de cadeia leve X ou k humana rearranjada operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve da imunoglobulina de camundongo ou ser humano selecionada de uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve X e uma sequência de ácido nucléico da região constante da cadeia leve k.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que: (I) o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico homóloga à sequência de ácido nucléico substituída no lócus genômico alvo da célula ES decamundongo; (II) o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico ortóloga à sequência de ácido nucleico substituída no lócus genômico alvo da célula ES de camundongo; ou (III) o ácido nucléico inserido compreende uma sequência de ácido nucléico de uma espécie diferente.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a integração do ácido nucléico inserido no lócus genômico alvo resulta em um silenciamento (KNOCKOUT), uma substituição (KNOCK-IN), uma mutação pontual, uma troca de domínio, uma troca de exon, uma troca de íntron, uma troca de sequência reguladora, uma troca de gene, ou uma combinação dos mesmos.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de seleção (b) é realizada por intermédio de uma modificação do ensaio de alelo (MOA).
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que: (I) o LTVEC tem de cerca de 50 kb a cerca de 75 kb, de cerca de 75 kb a cerca de 100 kb, de cerca de 100 kb a cerca de 125 kb, de cerca de 125 kb a cerca de 150 kb, de cerca de 150 kb a cerca de 175 kb, de cerca de 175 kb a cerca de 200 kb, de cerca de 200 kb a cerca de 225 kb, de cerca de 225 kb a cerca de 250 kb, de cerca de 250 kb a cerca de 275 kb, de cerca de 275 kb a cerca de 300 kb; ou (II) a soma total de ramificações de homologia a montante e a jusante é de cerca de 10 kb a cerca de 20 kb, cerca de 20 kb a cerca de 30 kb, cerca de 30 kb a cerca de 40 kb, cerca de 40 kb a cerca de 50 kb, cerca de 50 kb a cerca de 60 kb, cerca de 60 kb a cerca de 70 kb, cerca de 70 kb a cerca de 80 kb, cerca de 80 kb a cerca de 90 kb, cerca de 90 kb a cerca de 100 kb, cerca de 100 kb a cerca de 110 kb, cerca de 110 kb a cerca de 120 kb, cerca de 120 kb a cerca de 130 kb, cerca de 130 kb a cerca de 140 kb, cerca de 140 kb a cerca de 150 kb, cerca de 150 kb a cerca de 160 kb, cerca de 160 kb a cerca de 170 kb, cerca de 170 kb a cerca de 180 kb, cerca de 180 kb a cerca de 190 kb, ou cerca de 190 kb a cerca de 200 kb.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que os braços de homologia a montante e a jusante têm cada um entre 5 kb e 200 kb de comprimento, e em que o LTVEC varia de 50 kb a 300 kb de comprimento.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente: (c) introduzir a célula ES de camundongo modificada em um embrião em estágio de pré-mórula; (d) incubar o embrião até o estágio de blastocisto e implantar o embrião em uma mãe substituta para produzir um camundongo F0; e (e) identificar um camundongo portando o lócus genômico geneticamente modificado.
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| JP6619822B2 (ja) * | 2015-05-29 | 2019-12-11 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子座における破壊を有する非ヒト動物 |
| AU2017336100B2 (en) | 2016-09-30 | 2023-11-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a hexanucleotide repeat expansion in a C9ORF72 locus |
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| BR112020001996A2 (pt) | 2017-07-31 | 2020-08-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | animal não humano, e, métodos para testar e para otimizar a capacidade de uma crispr/cas nuclease de excisar um ácido nucleico genômico in vivo, para testar a recombinação induzida por crispr/cas de um ácido nucleico genômico com um ácido nucleico de doador exógeno in vivo e para otimizar a capacidade de crispr/cas de induzir a recombinação de um ácido nucleico genômico com um ácido nucleico de doador exógeno in vivo. |
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| EP4171215A2 (en) | 2020-06-26 | 2023-05-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ace2 locus |
| DE112022001365T5 (de) | 2021-03-05 | 2024-02-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | In vivo dna zusammenbau und analyse |
| CA3231899A1 (en) | 2021-11-04 | 2023-05-11 | Trevor Stitt | Non-human animals comprising a modified cacng1 locus |
| WO2023108047A1 (en) | 2021-12-08 | 2023-06-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mutant myocilin disease model and uses thereof |
| WO2023122506A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci |
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Family Cites Families (95)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5830729A (en) | 1996-04-18 | 1998-11-03 | Institut Pasteur | I Sce I-induced gene replacement and gene conversion in embryonic stem cells |
| ES2242997T3 (es) | 1997-03-14 | 2005-11-16 | Biogen Idec Inc. | Metodo para integrar genes en sitios especificos en celulas de mamifero por medio de recombinacion homologa y vectores para realizar el mismo. |
| US5830698A (en) * | 1997-03-14 | 1998-11-03 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same |
| CA2354542A1 (en) | 1998-12-31 | 2000-07-06 | The J. David Gladstone Institutes | Transgenic rodents and rodent cell lines expressing hiv co-receptors |
| EP1147209A2 (en) | 1999-02-03 | 2001-10-24 | The Children's Medical Center Corporation | Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site |
| AU776576B2 (en) * | 1999-12-06 | 2004-09-16 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US20050144655A1 (en) * | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US7105348B2 (en) | 2000-10-31 | 2006-09-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US8106255B2 (en) | 2002-01-23 | 2012-01-31 | Dana Carroll | Targeted chromosomal mutagenasis using zinc finger nucleases |
| ATE531796T1 (de) | 2002-03-21 | 2011-11-15 | Sangamo Biosciences Inc | Verfahren und zusammensetzungen zur verwendung von zinkfinger-endonukleasen zur verbesserung der homologen rekombination |
| EP1581610A4 (en) | 2002-09-05 | 2009-05-27 | California Inst Of Techn | USE OF CHIMERIC NUCLEASES TO STIMULATE GENE TARGETING |
| US20030175968A1 (en) | 2002-10-30 | 2003-09-18 | Golic Kent G. | Gene targeting method |
| WO2004063356A2 (en) * | 2003-01-13 | 2004-07-29 | Rao Mahendra S | Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products |
| US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| US8409861B2 (en) | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
| JP4555292B2 (ja) * | 2003-08-08 | 2010-09-29 | サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | 標的化された切断及び組換えの方法及び組成物 |
| AU2005287278B2 (en) | 2004-09-16 | 2011-08-04 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for protein production |
| JP5252922B2 (ja) | 2004-10-19 | 2013-07-31 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 遺伝的改変についてホモ接合性の動物を生み出すための方法 |
| FR2879622B1 (fr) | 2004-12-17 | 2008-02-01 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede in vitro de production d'ovocytes ou d'oeufs presentant une modification genomique ciblee |
| US10022457B2 (en) | 2005-08-05 | 2018-07-17 | Gholam A. Peyman | Methods to regulate polarization and enhance function of cells |
| GB0615327D0 (en) | 2006-03-30 | 2006-09-13 | Univ Edinburgh | Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof |
| JP5514539B2 (ja) | 2006-03-31 | 2014-06-04 | メダレックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | ヒト抗体の調製に用いるためのキメラ抗体を発現するトランスジェニック動物 |
| US7771967B2 (en) | 2006-12-22 | 2010-08-10 | The J. David Gladstone Institutes | Nucleic acid encoding apolipoprotein E-I3 |
| US10155038B2 (en) | 2007-02-02 | 2018-12-18 | Yale University | Cells prepared by transient transfection and methods of use thereof |
| CA2684378C (en) | 2007-04-26 | 2016-11-29 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted integration into the ppp1r12c locus |
| KR102096731B1 (ko) | 2007-06-01 | 2020-04-02 | 오픈 모노클로날 테크놀로지, 인코포레이티드 | 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 |
| CA2734235C (en) | 2008-08-22 | 2019-03-26 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration |
| US20100076057A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
| EP2180058A1 (en) | 2008-10-23 | 2010-04-28 | Cellectis | Meganuclease recombination system |
| WO2010065123A1 (en) | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Genome editing in rats using zinc-finger nucleases |
| US20110239315A1 (en) | 2009-01-12 | 2011-09-29 | Ulla Bonas | Modular dna-binding domains and methods of use |
| WO2010124200A2 (en) | 2009-04-23 | 2010-10-28 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for cancer |
| US8772008B2 (en) | 2009-05-18 | 2014-07-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for increasing nuclease activity |
| WO2011011678A2 (en) | 2009-07-24 | 2011-01-27 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for cytokine-cytokine signaling pathways |
| US20120276537A1 (en) * | 2009-10-28 | 2012-11-01 | Kuehn Ralf | Homologous recombination in the oocyte |
| CA2779858C (en) | 2009-10-29 | 2019-10-29 | Aris N. Economides | Multifunctional alleles |
| US20120315670A1 (en) | 2009-11-02 | 2012-12-13 | Gen9, Inc. | Compositions and Methods for the Regulation of Multiple Genes of Interest in a Cell |
| CA2782596A1 (en) | 2009-12-01 | 2011-06-09 | National Cancer Center | Method for constructing chimeric rat using rat embryonic stem cells |
| ES2696825T3 (es) | 2009-12-10 | 2019-01-18 | Univ Minnesota | Modificación del ADN inducida por el efector TAL |
| EP2516652B1 (en) | 2009-12-21 | 2014-11-05 | Keygene N.V. | Improved techniques for transfecting protoplasts |
| JP2013517774A (ja) | 2010-01-22 | 2013-05-20 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | 遺伝子改変生物における導入遺伝子の切除 |
| CA2788850C (en) * | 2010-02-09 | 2019-06-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules |
| CA2798988C (en) | 2010-05-17 | 2020-03-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof |
| GB201009732D0 (en) * | 2010-06-10 | 2010-07-21 | Gene Bridges Gmbh | Direct cloning |
| CN104711218B (zh) | 2010-06-11 | 2018-09-25 | 瑞泽恩制药公司 | 由xy es细胞制备能育的xy雌性动物 |
| CA3157027A1 (en) | 2010-07-21 | 2012-01-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modification of a t-cell receptor gene |
| WO2012018726A1 (en) * | 2010-08-02 | 2012-02-09 | Cellectis Sa | Method for increasing double-strand break-induced gene targeting |
| WO2012129198A1 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. | Genetically modified rat models for obesity and diabetes |
| US20140304847A1 (en) | 2011-06-07 | 2014-10-09 | Ralf Kühn | Recombination efficiency by inhibition of nhej dna repair |
| CN107858332A (zh) | 2011-10-28 | 2018-03-30 | 瑞泽恩制药公司 | T细胞受体基因修饰小鼠 |
| US9637739B2 (en) | 2012-03-20 | 2017-05-02 | Vilnius University | RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex |
| WO2013141680A1 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Vilnius University | RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX |
| IN2014DN09261A (pt) | 2012-04-25 | 2015-07-10 | Regeneron Pharma | |
| BR112014027813A2 (pt) | 2012-05-07 | 2017-08-08 | Dow Agrosciences Llc | métodos e composições para integração de transgenes direcionada mediada por nuclease |
| EP4289948A3 (en) | 2012-05-25 | 2024-04-17 | The Regents of the University of California | Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription |
| JP6279562B2 (ja) | 2012-06-12 | 2018-02-14 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 条件付きノックアウト対立遺伝子を生成するための方法および組成物 |
| WO2014018423A2 (en) | 2012-07-25 | 2014-01-30 | The Broad Institute, Inc. | Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof |
| JP6517143B2 (ja) | 2012-10-23 | 2019-05-22 | ツールゲン インコーポレイテッド | 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用 |
| US20160017366A1 (en) | 2012-12-06 | 2016-01-21 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Crispr-based genome modification and regulation |
| WO2014093479A1 (en) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | Montana State University | Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation |
| EP2931899A1 (en) | 2012-12-12 | 2015-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof |
| EP2931892B1 (en) | 2012-12-12 | 2018-09-12 | The Broad Institute, Inc. | Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
| PL2784162T3 (pl) | 2012-12-12 | 2016-01-29 | Broad Inst Inc | Opracowanie systemów, metod oraz zoptymalizowanych kompozycji przewodnikowych do manipulacji sekwencyjnej |
| US20140310830A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-10-16 | Feng Zhang | CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| US20140189896A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-07-03 | Feng Zhang | Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| ES2786193T3 (es) | 2012-12-12 | 2020-10-09 | Broad Inst Inc | Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones enzimáticas mejorados para la manipulación de secuencias |
| WO2014093655A2 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation with functional domains |
| PL2921557T3 (pl) | 2012-12-12 | 2017-03-31 | Broad Inst Inc | Projektowanie systemów, sposoby i optymalizowane kompozycje kierujące do manipulacji sekwencją |
| US20140179770A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-26 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications |
| KR20150095861A (ko) | 2012-12-17 | 2015-08-21 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | Rna-가이드된 인간 게놈 조작 |
| CN105025701B (zh) | 2012-12-27 | 2018-09-25 | 凯津公司 | 去除植物中遗传连锁的方法 |
| WO2014127287A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for in vivo tergated mutagenesis |
| BR112015019950B1 (pt) | 2013-02-20 | 2023-02-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc | Método para gerar linhagem de células-tronco embrionárias (es) de rato, e, cultura in vitro |
| WO2014130955A1 (en) | 2013-02-25 | 2014-08-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption |
| JP2016507244A (ja) | 2013-02-27 | 2016-03-10 | ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヒェン・ドイチェス・フォルシュンクスツェントルム・フューア・ゲズントハイト・ウント・ウムベルト（ゲーエムベーハー）Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ ＭｕｅｎｃｈｅｎＤｅｕｔｓｃｈｅｓ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ ｆｕｅｒ Ｇｅｓｕｎｄｈｅｉｔ ｕｎｄ Ｕｍｗｅｌｔ （ＧｍｂＨ） | Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる卵母細胞における遺伝子編集 |
| US10612043B2 (en) | 2013-03-09 | 2020-04-07 | Agilent Technologies, Inc. | Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple CRISPR/cas selections of recombineering events |
| EP3620534B1 (en) | 2013-03-14 | 2021-10-13 | Caribou Biosciences, Inc. | Crispr-cas compositions of nucleic acid-targeting nucleic acids |
| US9234213B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-12 | System Biosciences, Llc | Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems |
| US20140273230A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sigma-Aldrich Co., Llc | Crispr-based genome modification and regulation |
| US20140349400A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-11-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Programmable Modification of DNA |
| JP6346266B2 (ja) | 2013-03-21 | 2018-06-20 | サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド | 操作されたジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼを使用するｔ細胞受容体遺伝子の標的化された破壊 |
| WO2014165825A2 (en) | 2013-04-04 | 2014-10-09 | President And Fellows Of Harvard College | Therapeutic uses of genome editing with crispr/cas systems |
| US20160186208A1 (en) | 2013-04-16 | 2016-06-30 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal |
| HUE040575T2 (hu) | 2013-04-16 | 2019-03-28 | Regeneron Pharma | A patkány genom célzott módosítása |
| WO2014172458A1 (en) | 2013-04-16 | 2014-10-23 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Activating an alternative pathway for homology-directed repair to stimulate targeted gene correction and genome engineering |
| EP2796558A1 (en) | 2013-04-23 | 2014-10-29 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Improved gene targeting and nucleic acid carrier molecule, in particular for use in plants |
| US11306328B2 (en) | 2013-07-26 | 2022-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | Genome engineering |
| AU2014360811B2 (en) | 2013-12-11 | 2017-05-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the targeted modification of a genome |
| HUE049776T2 (hu) | 2014-06-06 | 2020-10-28 | Regeneron Pharma | Módszerek és készítmények egy célzott lókusz módosítására |
| ES2901074T3 (es) | 2014-06-26 | 2022-03-21 | Regeneron Pharma | Métodos y composiciones para modificaciones genéticas objetivo y métodos de uso |
| EP3169773B1 (en) | 2014-07-15 | 2023-07-12 | Juno Therapeutics, Inc. | Engineered cells for adoptive cell therapy |
| AU2015364427B2 (en) | 2014-12-19 | 2021-05-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting |
-
2013
- 2013-04-25 IN IN9261DEN2014 patent/IN2014DN09261A/en unknown
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