KR20140145942A - 항체의 비수성 고농도 점도 감소 현탁 제형 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항체의 비수성 고농도 점도 감소 현탁 제형과 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

Description

항체의 비수성 고농도 점도 감소 현탁 제형{NON-AQUEOUS HIGH CONCENTRATION REDUCED VISCOSITY SUSPENSION FORMULATIONS OF ANTIBODIES}
본 발명은 비수성 고농도 점도 감소 현탁 제형과 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
단클론 항체(monoclonal antibody; mAb)는 다양한 인간 질환, 예를 들어 암, 감염성 질환, 염증 및 자가면역 질환을 치료하기 위한 중요한 단백질-기재의 치료제가 되었다. 현재, 20가지 초과의 단클론 항체 제품이 미국 식품 의약국(Food and Drug Administration)에 의해 승인되었으며, 현재 임상 실험에서 평가되고 있는 모든 생물의약품 중 대략 20%는 단클론 항체이다 (문헌[Daugherty et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 58:686-706, 2006]).
항체는 예를 들어 비경구 경로, 예를 들어 정맥내(IV), 피하(SC) 또는 근육내(IM) 주사를 통하여 투여될 수 있다. SC 또는 IM 경로는 투여 동안 환자 및 의료인(healthcare provider)에 있어서 편리함을 향상시키며 치료 비용을 감소시킨다. 유효하고 약학적으로 허용가능하게 되도록, 비경구 제형은 바람직하게는 살균되고, 안정되고, 시린지로 이용가능하고(syringeable), 주입가능하고, 비자극성이어야 한다. 이들 특성은 주입가능 제형이 개발이 어려운 투여 형태, 특히 단백질 농도가 높은 제형이 되게 하는 제조, 보관 및 사용 요건을 초래한다.
임의의 단백질 치료제와 같이, 항체는 물리적 및 화학적 불안정성, 예를 들어 응집, 변성, 가교결합, 탈아미드화, 이성체화, 산화 및 클립핑(clipping)이 가해진다 (문헌[Wang et al., J. Pharm. Sci. 96:1-26, 2007]). 따라서, 항체 안정성에 결정적인 인자들을 확인하기 위한 제형의 개발은 상업적으로 실행가능한 항체 의약품의 개발에 있어서 가장 중요하다.
SC 또는 IM 주사에 필요한 작은 부피 (전형적으로 0.5 내지 2 mL)는 추가의 제형화 난제를 제기하며, 그 이유는 투약이, 환자에 있어서 치료적 수준을 성취하기 위하여 전형적으로 용량당 100 ㎎ 내지 1 g의 단백질의 고농도 항체 제형을 필요로 하기 때문이다. 고도로 농축된 단백질 제형은 흔히 증가된 단백질 응집, 불량한 안정성 및 증가된 점도로 이어지며, 이는 공정, 제조 및 보관 동안 악영향을 미치게 되며 주입성을 손상시키게 된다 (문헌[Shire et al., J. Pharm. Sci. 93:1390-1402, 2004]).
SC 또는 IM 경로에 의해 투여되는 현재의 상업적 단클론 항체 제품은 대개 응집을 방지하고 안정성을 개선시키기 위하여 만니톨, 수크로스 또는 폴리소르베이트 80과 같은 부형제 또는 계면활성제를 이용하여 수성 완충제, 예를 들어 인산염 또는 L-히스티딘 완충제 중에 제형화된다. 보고된 항체 농도는 수성 제형 중 최대 100 ㎎/mL이다 (문헌[Wang et al., J. Pharm. Sci. 96:1-26, 2007]). 수성 제형의 점도는 염 (미국 특허 제7,666,413호) 또는 유기 또는 무기 산 (미국 특허 제7,740,842호)의 첨가에 의해 감소되었다.
비수성 항체 또는 단백질 제형이 개시되었다. 국제특허 공개 WO2006/071693호에는 점도 향상제(폴리비닐피롤리돈, PVP) 및 용매 (벤질 벤조에이트 (BB) 또는 PEG400)를 갖는 제형 중 최대 100 ㎎/mL의 단클론 항체의 비수성 현탁물이 개시되어 있다. 국제특허 공개 WO2004/089335호에는 PVP, 글리코푸롤 (GF), BB, 벤질 알코올 (BA), 또는 PEG400을 함유하는 약 100 ㎎/mL의 비수성 라이소자임 현탁 제형이 개시되어 있다. 미국 특허 공개 제2008/0226689A1호에는 100 ㎎/mL의 인간 성장 호르몬 (hGH) 단일 상, 3가지 비히클 성분 (중합체, 계면활성제 및 용매)의 비수성 점성 제형이 개시되어 있다. 미국 특허 제6,730,328호에는 단백질 제형용의 낮은 반응성의 비수성, 소수성, 비극성 비히클 (예를 들어 퍼플루오로데칼린)이 개시되어 있다. 이들 제형은 최적인 것이 아니며, 이는 예를 들어 프로세싱, 제조 및 주입을 손상시키는 높은 점도, 제형 중 다수의 비히클 성분의 존재, 및 아직 승인되지 않은 중합체의 사용과 관련된 잠재적인 규제 상의 난제를 갖는다.
따라서, 개선된 고농도 비수성 제형을 개발할 필요가 있다.
<도 1>
도 1. +40℃에서의 1 내지 4주간의 보관에서의 항-TNFα mAb 현탁 제형의 안정성. 각각의 제형에 있어서 항체 농도를 중량% (%(w/w))로 나타낸다.
<도 2>
도 2. 제형의 주입력(N)은 제형 중 점도 감소제의 양이 증가함에 따라 감소한다. 도 2a) BSA 제형; 도 2b) 항-TNFα mAb 제형.
<도 3>
도 3. 주입력 및 점도는 제형 중의 항-TNFα mAb (도 3a 및 도 3b) 및 BSA (도 3c) 농도가 증가함에 따라 증가한다.
<도 4>
도 4. 항-TNFα mAb 제형의 주입력과 점도 사이의 상관 관계. 도 4a) 20%의 항-TNFα mAb를 포함하는 제형; 도 4b) 연구한 모든 항-TNFα mAb 제형.
<도 5>
도 5. 제형 중 단백질 농도 및 입자 크기에의 주입력의 의존성. 비히클: 에틸 올레에이트(EO)/참깨유(SO)/50/50.
<도 6>
도 6. 도 6a) 전단율의 증가는 고농도 단백질 제형들의 점도를 감소시킬 수 있다. 도 6a) 비히클 선택은 전단율에의 점도의 의존성에 영향을 준다. 도 6b) 단백질 농도는 전단율에의 점도의 의존성에 영향을 준다. 항-TNFα mAb EO/SO/50/50 제형들.
<도 7>
도 7. 주입력에 대한 주입 속도의 영향: 도 7a) 제형 중 상이한 농도의 BSA 입자; 도 7b) EO 비히클 중 상이한 크기의 BSA 입자; 도 7c) EO/SO/50/50 중 상이한 농도의 항-TNFα mAb.
<도 8>
도 8. SE-HPLC로 측정할 경우 25℃에서의 CNTO148의 안정성: 도 8a) 스프레이 건조된 제형 및 100 ㎎/mL의 현탁 제형 및 도 8b) 100 ㎎/mL 및 200 ㎎/mL의 현탁 제형. Nt = 산화알루미늄으로 처리되지 않은 현탁물. 표 7에서 Form-1, Form-5 및 Form-7은 실험 SD_1의 스프레이 건조된 제형이다. SO/EO = EO/SO/50/50.
<도 9>
도 9. SE-HPLC로 측정할 경우 40℃에서의 CNTO148의 안정성: 도 9a) 스프레이 건조된 제형 및 100 ㎎/mL의 현탁 제형 및 도 9b) 100 ㎎/mL 및 200 ㎎/mL의 현탁 제형. Nt= 산화알루미늄으로 처리되지 않은 현탁물. 표 7에서 Form-1, Form-5 및 Form-7은 실험 SD_1의 스프레이 건조된 제형이다. SO/EO = EO/SO/50/50. SD = 스프레이 건조.
<도 10>
도 10. 표 7에서 실험 SD_1의 CNTO148의 스프레이 건조된 Form-1 제형 및 Form-1의 100 ㎎/mL의 현탁 제형의 생물활성 (%). SD = 스프레이 건조. SO/EO = EO/SO/50/50.
<도 11>
도 11. 25℃에서 수집한, 표 7에서 실험 SD_1의 CNTO148의 스프레이 건조된 Form-1 제형 및 Form-1의 100 ㎎/mL의 현탁 제형의 원자외선 CD 스캔. SD = 스프레이 건조. SO/EO = EO/SO/50/50.
<도 12>
도 12. 도 12a) 항-TNFα 항체의 중쇄 가변 영역 서열 TVN14 (서열 번호 1), TVN15 (서열 번호 2), TVN148 (서열 번호 3), TVN148B (서열 번호 4), 및 TVN196 (서열 번호 5) 및 도 12b) 항-TNFα 항체의 경쇄 가변 영역 서열 TVN14 (서열 번호 6), TVN15 (서열 번호 6), TVN148 (서열 번호 7), TVN148B (서열 번호 7), 및 TVN196 (서열 번호 7).
[발명의 내용]
본 발명의 일 실시 형태는 소수성 제제(hydrophobic agent) 및 점도 감소제를 포함하는 비히클과; 생물활성 분자를 포함하는 비수성 고농도 현탁 제형이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 참깨유 및 에틸 올레에이트를 포함하는 비히클과; 생물활성 분자를 포함하는 비수성 고농도 현탁 제형이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 소수성 제제를 포함하는 비히클 중에 ≥50 ㎎/㎖의 단백질을 함유하는 제형의 주입력을 약 45 뉴턴(N) 이하로 감소시키는 방법으로서, 이는 28 부피% 이상의 점도 감소제를 소수성 제제를 포함하는 비히클 내에 첨가하는 단계; 또는 입자 크기가 약 2 ㎛ 내지 13 ㎛인 단백질 입자를 이용하여 제형을 제조하는 단계를 포함하며, 여기서, 주입력은 0.5 인치의 26 ½ 게이지 니들을 갖춘, 내경이 0.25 인치인 1 mL 강성 니들 차폐형 유리 시린지를 이용하여 250 ㎜/분의 주입 속도로 측정된다.
본 발명의 다른 실시 형태는 생물활성 분자의 비수성 고농도 현탁 제형의 제조 방법이며, 이는 생물활성 분자를 제공하는 단계; 소수성 제제를 제공하는 단계; 점도 감소제를 제공하는 단계; 소수성 제제 및 점도 감소제를 혼합하여 비히클을 형성하는 단계; 및 생물활성 분자를 형성된 비히클 내에 첨가하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 인용된, 특허 및 특허 출원을 포함하지만 이에 한정되지 않는 모든 간행물은 마치 완전히 개시되는 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 시험 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명을 개시하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 사용될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "소수성 제제"는 친수성-친유성 균형(hydrophilic-lipophilic balance; HLB) 값이 0 내지 13인 물질을 말한다. 예시적인 소수성 제제로는 식물유, 탄소수 8 내지 24의 지방산, 왁스, 생분해성 중합체 및 친양쪽성 물질이 있다. 예시적인 식물유로는 아몬드유, 아니스유, 살구씨유, 낙화생유, 아르간유, 아보카도유, 보리지유(borage oil), 카유풋유(cajuput oil), 카놀라유, 캐러웨이유, 카시아유(cassia oil), 피마자유, 계피유(cinnamon oil), 시트로넬라유, 정향유, 코코넛유, 고수유, 옥수수유, 면실유, 유칼립투스유, 달맞이꽃유, 회향유, 제라늄유, 포도씨유, 헤이즐넛유, 대마유, 호호바유, 쥬니퍼유(juniper oil), 라벤더유, 레몬유, 마카다미아유, 메이스유(mace oil), 멜라루카유(melaleuca oil), 님유(neem oil), 등화유(neroli oil), 니아오울리유(niaouli oil), 육두구유, 올리브유, 오렌지유, 야자유, 야자핵유, 송유, 양귀비씨유, 풀레기움유(pulegium oil), 호박씨유, 평지씨유, 미강유, 로즈힙유(rosehip oil), 로즈메리유, 루유(rue oil), 잇꽃유, 참깨유(SO), 스피어민트유, 대두유, 해바라기유, 타임유(thyme oil), 호두유 또는 맥아유가 있다. 예시적인 지방산으로는 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 리놀레산, 미리스톨레산, 팔미톨레산, 사피엔산, 올레산, α-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 에루스산, 도코사헥사엔산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, 도코사펜타엔산, 및 글리세라이드 (모노글리세라이드; 다이글리세라이드; 트라이글리세라이드) - 사슬 길이가 상이함 - 가 있다. 예시적인 생분해성 중합체로는 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), 폴리락틱-코-글리콜산 (PLGA), 폴리 ε-카프로락톤 (PCL), 폴리오르토에스테르, 폴리하이드록시부티레이트 (PHB), 폴리다이옥사논, 폴리언하이드라이드(polyanhydride), 폴리트라이메틸렌 카르보네이트, 및 폴리포스파젠이 있다. 예시적인 친양쪽성 물질로는 폴리에톡실화 피마자유 또는 이의 유도체 ("폴리에톡실화 피마자유"로 총칭됨), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 폴리에틸렌 옥사이드("PEO")-폴리프로필렌 옥사이드("PPO")-PEO의 블록 공중합체, PPO-PEO-PPO의 블록 공중합체, PEO-PPO의 4작용성 블록 공중합체, 예를 들어 (PEO-PPO)2-(PPO-PEO)2, 또는 PPO-PEO의 4작용성 블록 공중합체, 예를 들어 (PPO-PEO)2-(PEO-PPO)2가 있다. 예시적인 소수성 제제 및 그 특성이 표 1에 예시되어 있다. 점도는 괄호 안에 나타내지 않으면 25℃에서 측정된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "점도"는 유체의 유동 저항성의 척도이다. 점도는 "동점도" 또는 "절대 점도"이다. "동점도"는 중력의 영향 하에서의 유체의 유동 저항(resistive flow)의 척도이다. 동일한 부피의 두 유체를 동일한 모세관 점도계 내에 넣고 중력에 의해 유동시킬 때, 점성 유체는 덜 점성인 유체보다 모세관을 관류하는 데 더 오래 걸린다. 동점도의 크기는 L2/T이며, 여기서, L은 길이이고, T는 시간이다. 일반적으로, 동점도는 센티스토크(cSt) 단위로 표현된다. 국제 단위계(International System of Unit; SI)의 동점도 단위는 ㎟/s이며, 이는 1E-6 ㎡/s (1 cSt)이다. 때때로 "역학 점도" 또는 "단순 점도"로 칭해지는 "절대 점도"는 동점도와 유체 밀도의 곱이다. 절대 점도는 센티푸아즈(cP)의 단위로 표현된다. 절대 점도의 SI 단위는 밀리파스칼-초(mPa-s)이며, 여기서, 1 cP = 1 mPa-s이다. 점도는 예를 들어 주어진 전단율에서 점도계를 사용하여 측정될 수 있다. 또한 점도는 도 4에 나타낸 바와 같이 점도와 주입력의 양의 상관에 의해 평가될 수 있다.
Figure pct00001
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전단율"은 물질을 변형시키는 속도를 의미한다. 고전적인 뉴턴 유체(Newtonian fluid)에 있어서, 점도는 전단율에 의존적이지 않다. 비뉴턴 유체에 있어서, 점도는 전단율이 증가함에 따라 감소하거나 또는 증가하며, 예를 들어, 상기 유체는 각각 "전단 박화성" 또는 "전단 농화성"이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "주입력"은 즈비크/뢸(Zwick/Roell) (모델 2005) 시험 기기 (미국 조지아주 케네소 소재의 즈비크 뢸(Zwick Roell))를 사용하여, 0.5 인치의 26 ½ 게이지 니들을 갖춘, 내경이 0.25 인치인 1 mL 강성 니들 차폐형 유리 시린지를 통하여 250 ㎜/분의 주입 속도로 비히클 또는 제형을 미는 데 필요한, 뉴턴(N) 단위로 측정되는 힘을 의미한다. 예시적인 시린지로는 BD (미국 뉴저지주 소재의 벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니(Becton, Dickinson and Company)) 시린지 (0.5 인치의 26 ½ 게이지 니들을 갖춘, BD 하이팩(Hypak) SCF™ 1 mL 강성 니들 차폐형 사전충전가능 유리 시린지 (제품 표기명: PIR6-001 SCF1MLL 26GA1/2 RNSFM27 EB LTP. 8268589))가 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "주입성"은 주입 동안 게이지 니들을 갖춘 시린지를 통한 비수성 고농도 현탁 제형의 주입 성능을 말한다. 주입성은 주입에 필요한 압력 또는 힘, 유동의 균등성(evenness of flow), 흡입 품질 및 막힘이 없음(freedom from clogging)과 같은 요인을 포함한다. 본 발명의 제형의 주입성은 점도 감소제를 함유하는 제형의 주입력을 점도 감소제가 결여된 것을 제외하고는 동일한 제형과 비교함으로써 평가된다. 점도 감소제를 함유하는 제형의 주입력의 감소는 이 제형의 개선된 주입성을 반영한다. 점도 감소제 함유 제형은 점도 감소제가 결여된 것을 제외하고는 동일한 제형과 비교할 때 주입력이 적어도 10%, 예를 들어 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%만큼 감소될 경우 향상된 주입성을 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "점도 감소제"는 비히클 또는 제형에 존재할 때 점도 감소제가 결여된 비히클 또는 제형의 점도 또는 주입력과 비교하여 비히클 또는 제형의 점도 또는 주입력을 감소시키는 제제를 말한다. 본 발명의 점도 감소 비히클 또는 제형에 존재하는 점도 감소제의 양은 부피 기준으로 소수성 제제 중 점도 감소제가 약 0.2% 내지 99.9%, 예를 들어 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 범위일 수 있다. 일부 예에서, 비히클은 점도 감소제 100%로 이루어질 수 있다. 점도 감소제는 비히클 또는 제형의 점도 또는 주입력을 적어도 10%, 예를 들어 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90%만큼 감소시킬 수 있다. 예시적인 점도 감소제로는 다이에틸 세바케이트, 다이에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르, 에틸 알코올, 에틸 올레에이트(EO), 아이소프로필 알코올(IPA), 아이소프로필 미리스테이트, 리놀레산, 프로피온산, 트라이에틸 시트레이트, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 아이소프로판올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리퍼플루오로에테르, 플루오로탄소 (할로탄, 메톡시플루란, 엔플루란, 아이소플루란, 세보플루란 및 데스플루란 등), 플루오르화 케톤, 퍼플루오로데칼린, 퍼플루오로아크릴레이트, 퍼플루오로메타크릴레이트, 벤질 알코올, 라우릴 알코올, 퍼플루오로데칼린, N-메틸-2-피롤리돈, 글리코푸롤, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 알킬 케톤, 시트르산의 저급 알킬 에스테르, 벤질 벤조에이트, 메틸 벤조에이트, 에틸 벤조에이트, n-프로필 벤조에이트, 아이소프로필 벤조에이트, 부틸 벤조에이트, 아이소부틸 벤조에이트, sec-부틸 벤조에이트, tert-부틸 벤조에이트, 및 아이소아밀벤조에이트가 있다. 예시적인 점도 감소제의 특성이 표 2에 예시되어 있다.
점도 감소제의 첨가가 점도 감소제를 함유하지 않는 상응하는 비히클과 비교하여 비히클의 점도 또는 주입력을 저하시킬 때, 점도 감소제를 함유하는 비히클은 "점도 감소 비히클"이다. 점도 감소 비히클을 포함하는 제형은 "점도 감소 제형"이다. 점도 또는 주입력을 결정 및 측정하는 데 사용되는 방법과는 상관없이, 점도 감소 비히클 또는 제형에 있어서 점도 또는 주입력의 감소 퍼센트는 점도 감소제를 포함하지 않는 동일 비히클 또는 제형과 비교할 때 주어진 전단율에서 대략적으로 동일하게 남아있을 것이다.
용어 "화학적 안정성"은 산화, 탈아미드화 또는 가수분해와 같은 화학적 경로에 의해 생성되는 허용가능한 백분율의 분해 생성물이 형성됨을 의미한다. 제형은, 4℃에서 18개월 후 5% 이하의 분해 생성물이 형성될 경우 화학적으로 안정한 것으로 간주된다.
용어 "물리적 안정성"은 허용가능한 백분율의 응집물 (예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 다른 다량체 응집물)이 생물 활성제에 의해 형성됨을 의미한다. 제형은, 4℃에서 18개월 후 약 5% 이하의 응집물이 형성될 경우 물리적으로 안정한 것으로 간주된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "안정한 제형" 또는 "안정한"은 +4℃에서 18개월의 보관 후, 또는 승온에서 등가의 조건, 예를 들어 +40℃에서의 1개월의 보관 후 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 물리적으로 안정한 생물 활성 분자가 제형 중에 남아있음을 의미한다. 예시적인 안정한 제형으로는 +40℃에서의 1개월의 보관 후, 항체의 98% 이상을 단량체 형태로 유지하는 30%의 항-TNFα mAb EO/SO/50/50 제형이 있다.
Figure pct00002
용어 "생물활성 분자"는 단백질, 항체, 펩티드, 뉴클레오티드 등을 포함한다. 합성에 의해 제조된, 자연적으로 유도된 또는 재조합적으로 제조된 부분(moiety)이 이 용어 내에 포함된다. 생물활성 분자는 생물활성 분자의 유사체, 유도체, 작동제, 길항제 또는 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
용어 "단백질"은 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합에 의해 결합된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 50개 미만의 아미노산의 작은 단백질은 "펩티드"로 지칭될 수도 있다. 또한 단백질은 "폴리펩티드"로 지칭될 수도 있다.
용어 "항체"는 전 항체 및 이의 임의의 단편을 포함한다. 항체 단편은 면역글로불린 분자의 적어도 일부분, 예를 들어 항체 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나로부터의 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR), 가변 영역(V), 불변(C) 영역, 또는 프레임워크 영역(framework region; FR)을 포함한다. 면역글로불린은 중쇄 C 도메인 아미노산 서열에 따라 5가지의 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 정해질 수 있다. IgA 및 IgG는 아이소형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 추가로 하위-분류된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 명확하게 별개인 2개의 유형, 즉 카파(κ) 및 람다(λ) 중 하나로 정해질 수 있다.
항체는 Fab, F(ab'), F(ab')2, scFv, dsFv, 또는 다이아바디(diabody)일 수 있다. 항체는 이량체형, 사량체형 또는 다량체형, 단클론 항체(mAb), 키메라, 인간화 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체 단편의 구조와, 항체 및 이의 단편의 제조 및 사용 기술은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다 (문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY 1987-2001]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989]; 문헌[Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989]; 문헌[Colligan , et al., ed., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY 1994-2001]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, 1997-2001]; 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495-7, 1975]; 문헌[Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86:10029-33, 1989]; 미국 특허 제4,816,567호).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "고농도"는 제형 중 50 ㎎/mL 이상의 생물활성 분자의 최종 농도를 의미한다. 생물활성 분자의 농도는 50 내지 1000 ㎎/mL, 50 내지 500 ㎎/mL, 또는 50 내지 250 ㎎/mL일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비수성"은 비히클이 생리학적 pH(약 7.4)에서 그리고 약 25℃에서 0.1 ㎎/g 미만의 낮은 물 중 용해도를 가짐을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "현탁 제형"은 생물활성 분자가 비히클에 불용성임을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "입자 크기"는 잘 알려진 입자 크기화 기기, 예를 들어 레이저 회절 입자 크기 분석기를 사용하여 결정되는, 제형 중 생물활성 분자 미립자의 평균 직경(D50)을 의미한다.
본 발명은 비경구 투여에 의해 항체와 같은 생물활성 분자를 투여하는 데 사용될 수 있는 비수성 고농도 점도 감소 현탁 제형을 개시한다. 고 단백질 농도 제형에 특징적인 높은 점도는 필요한 용량을 시린지로부터 환자 내로 주입하는 것이 어려워지게 할 수 있다. 본 발명의 제형은 허용가능한 치료적 효능을 성취하는 데 필요한 용량을 제공할 생물활성 분자의 높은 농도를 유지하면서, 제형의 주입력에 의해 측정되는 바와 같이 개선된 주입성을 갖는다. 본 발명의 제형은, 손 장애가 없는 대부분의 의료 전문가 및 환자가 수동 주입을 이용하여 시린지에 가할 수 있는 최대 힘인 45 뉴턴(N)과 동일하거나 또는 그보다 더 작은 주입력을 갖는다. 허용가능한 주입력 수준은 특정 약물 응용 및 제품에서 사용되는 전달 장치에 따라 달라진다. 일부 장치는 다른 것보다 더 큰 주입력을 생성하는 것이 가능할 수 있다.
구체적으로 달리 나타내지 않으면, 제형 중 생물활성 분자의 농도는 중량% (%(w/w))로 나타내며, 비히클 중 점도 감소제의 양은 부피% (%(v/v))로 나타낸다. 비히클 조성물은 점도 감소제 및 소수성 제제의 % 부피비(%(v/v))로서 나타낸다. 예를 들어, EO/SO/50/50은 50 부피%의 에틸 올레에이트(EO) 및 50 부피%의 참깨유(SO)를 갖는 비히클이다.
본 발명의 일 실시 형태는 비수성 고농도 현탁 제형이며, 이는
a. 수성 제제 및 점도 감소제를 포함하는 비히클과;
b. 물활성 분자를 포함한다.
비히클은 소수성 제제 및 점도 감소제 - 액체 형태 - 를 조합함으로써 제조될 수 있으며, 상기 혼합물은 단일 상 물질을 형성하도록 가열된다. 단일 상 물질이 형성되도록 비히클에 포함된 성분들이 조합되었는지를 확인하기 위하여 시차 주사 열량법과 같은 표준 방법이 사용될 수 있다. 예시적인 소수성 제제 및 점도 감소제는 상기에 기재되어 있다. 참깨유를 기재로 하는 예시적인 비히클이 표 4에 예시되어 있다. 참깨유는, 점도 감소제가 선택된 소수성 제제와 혼화가능하기만 하다면, 다른 예시적인 소수성 제제로 대체될 수 있다.
임의의 적합한 입자 형성 방법을 이용하여 본 발명의 제형에 포함되는 미립자형 생물활성 분자를 제공할 수 있다. 예시적인 잘 알려진 방법은 스프레이 건조, 스프레이-동결 건조, 동결건조, 건조(dessication), 과립화, 분쇄, 밀링, 침전, 초임계 유체 기술 또는 균질화 공정을 포함한다. 이들 방법에 의해 제조된 입자는 추가로 와링(Waring) 블렌드에서 분쇄되고, 결정된 메시 크기를 갖는 일련의 체에 통과될 수 있다. 생물활성 분자의 생성된 입자의 크기는 예를 들어 0.2 내지 250 ㎛, 0.2 내지 100 ㎛, 0.2 내지 50 ㎛, 0.2 내지 20 ㎛, 또는 2 내지 13 ㎛일 수 있다. 입자 크기는 잘 알려진 입자 크기화 기기, 예를 들어 레이저 회절 입자 크기 분석기 (맬번 마스터사이저(Malvern Mastersizer) 2000, 맬번)를 이용하여 결정되는, 제형 중 생물활성 분자 미립자의 평균 직경(D50)으로서, 또는 입자를 통과시키지 않는 체 메시의 직경으로서 표현될 수 있다.
생물활성 분자는 순수한 형태로 제공될 수 있거나, 또는 생물활성 분자의 치료적 효능을 간섭하지 않는 부형제를 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 부형제를 사용하여 비수성 제형 중 생물활성 분자의 응집 및 산화를 완화시키거나, 생물활성 분자의 비수성 비히클로부터 사용 환경 내로의 이행을 향상시키거나, 또는 생물활성 분자의 입자로의 형성능을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 부형제로는 예를 들어 탄수화물, 비이온성 계면활성제, 완충제, 염, 산화방지제 및/또는 아미노산, 방부제 등이 있다.
생물활성 분자는 예를 들어 탄수화물, 비이온성 계면활성제, 및 완충제를 부형제로 이용하여 제형화할 수 있다. 예시적인 탄수화물로는 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 덱스트란 및 소르비톨이 있다. 예시적인 비이온성 계면활성제로는 폴리소르베이트 20(PS-20), 폴리소르베이트 80(PS-80), 트리톤(Triton) X-100, 브리즈(Brij)-35, 브리즈-30 및 플루로닉(Pluronic) F127이 있다. 생물활성 분자는, 제형화 공정 및 보관 동안 생물활성 분자의 산화, 탈아미드화, 가수분해, 변성 또는 응집을 방지하고 이의 생물학적 활성을 유지하기 위하여 단백질 입자가 만들어지기 전에 바람직한 pH를 갖는 완충제 중에 제형화될 수 있다. 예시적인 완충제로는 아세트산염 완충제, 시트르산염 완충제, 포름산염 완충제, 히스티딘 완충제, 석신산염 완충제, 인산염 완충제, 탄산염 완충제, 말산염 완충제, HEPPSO 완충제, HEPES 완충제, 붕산염 완충제, 글리신 완충제, 아스파르트산 완충제, 프롤린 완충제 및 트리스(Tris) 완충제가 있다.
제형 중 추가의 부형제는 아미노산을 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산으로는 히스티딘, 아이소류신, 메티오닌, 글리신, 아르기닌, 라이신, L-류신, 트라이-류신, 알라닌, 글루탐산, L-트레오닌, 및 2-페닐아민이 있다.
추가의 부형제는 염을 포함할 수 있다. 예시적인 염으로는 염화나트륨, 염화칼슘 및 염화마그네슘이 있다.
추가의 부형제는 중합체를 포함할 수 있다. 예시적인 중합체로는 폴리비닐피롤리돈(PVP), 덱스트란 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다.
제형 중 부형제의 양은 부형제의 활성 및 제형의 원하는 특성, 예를 들어 스프레이 건조 동안의 입자의 안정성, 최소 산화 및 형성능을 기초로 하여 실험적으로 결정될 수 있다.
생물활성 분자 및 부형제는 용액 내에 용해될 수 있으며, 이는 예를 들어 생물활성 분자의 입자가 생성되도록 동결건조되거나, 스프레이 건조되거나 또는 스프레이 동결 건조된다.
예시적인 생물활성 분자로는 항체 또는 이의 항체 단편이 있다. 예시적인 항체로는 항-종양 괴사 인자-α(TNFα) 항체, 예를 들어 도 12에 나타낸 TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B 및 TNV196이 있으며, 이는 서열 번호 1 (TNV14), 2 (TNV15), 3 (TNV148), 4 (TNV148B) 및 5 (TNV196)에 나타낸 중쇄 가변 영역 서열, 및 서열 번호 6 (TNV14 및 TNV15), 및 7 (TNV148, TNV148B 및 TNV196)에 나타낸 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. TNV148B는 또한 CNTO148로도 명명된다. 다른 예시적인 항-TNFα 항체로는 미국 특허 제6,258,652호에 개시된, 휴미라(HUMIRA)(등록상표) 브랜드의 항-인간 TNFα 항체 (아달리무맙(adalimumab)); CAS 등록 번호: 331731-18-1)가 있다. 항-TNFα 항체 가변 영역들은 임의의 불변 영역, 예를 들어 각각 IgG1 및 κ 타입의 불변 영역에 커플링될 수 있다. 예시적인 IgG1 불변 영역을 서열 번호 8에 나타내며, 예시적인 κ 불변 영역을 서열 번호 9에 나타낸다.
생물활성 분자, 예를 들어 항-종양 괴사 인자-α(TNFα) 항체의 예시적인 제형은 하기 부형제들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 0 내지 3, 0.5 내지 3, 1 내지 3, 또는 1 내지 2의 대략적인 탄수화물:단백질 비의 탄수화물; 0 내지 2 또는 0.3 내지 1.8의 대략적인 아미노산:단백질 비의 아미노산; 단백질에 대한 탄수화물과 아미노산의 합해진 중량의 비가 약 0 내지 3, 0.5 내지 3, 1 내지 3, 또는 1 내지 2인 대략적인 비의 아미노산; 약 0 내지 40 mM, 5 내지 40 mM, 5 내지 20 mM 또는 5 내지 10 mM의 히스티딘 완충제; 약 0 내지 20 mM, 5 내지 20 mM 또는 5 내지 10 mM의 시트르산염 완충제 - 여기서, 부형제:단백질 비는 w/w 비임 - ; 및 약 0 내지 0.1% (%(w/v)), 0.01 내지 0.1% (%(w/v)) 또는 0.01 내지 0.05%의 PS-80 (%(w/v)). pH는 약 5.5로 조정될 수 있다. 예시적인 항-TNFα 항체 제형으로는 32.5 ㎎/㎖의 CNTO148, 10 mM의 히스티딘, 55 ㎎/㎖의 수크로스, 10 ㎎/㎖의 아이소류신, 0.01%의 PS-80 - pH 5.5 - ; 32.5 ㎎/㎖의 CNTO148, 10 mM의 히스티딘, 65 ㎎/㎖의 수크로스, 0.01%의 PS-80 - pH 5.5 - ; 32.5 ㎎/㎖의 CNTO148, 5 mM의 히스티딘/5 mM의 시트르산염, 65 ㎎/㎖의 수크로스, 0.01%의 PS-80 - pH 5.5 - ; 32.5 ㎎/㎖의 CNTO148, 10 mM의 히스티딘, 5 ㎎/㎖의 수크로스, 22.5 ㎎/mL의 만니톨, 0.01%의 PS-80 - pH 5.5 - ; 또는 32.5 ㎎/㎖의 CNTO148, 10 mM의 히스티딘, 55 ㎎/㎖의 트레할로스, 10 ㎎/㎖의 아이소류신, 0.01%의 PS-80 - pH 5.5 - ; 또는 65 ㎎/㎖의 CNTO148, 10 mM의 히스티딘, 55 ㎎/㎖의 수크로스, 0.01%의 PS-80 - pH 5.5 - 을 함유하는 CNTO148 스프레이 건조 제형이 있다. PS-80의 농도는 본 출원 전체에 걸쳐 %(w/v)로 나타낸다. 스프레이 건조 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 예시적인 기술은 하기 실시예 2에 기재되어 있다.
생물활성 분자의 현탁 제형을 생성하기 위하여, 부형제를 포함하거나 또는 포함하지 않는 고체 상태 (예를 들어, 분말, 결정 또는 비결정 상태)의 생물활성 분자의 건조 미립자 물질이 교반에 의해 비히클 내에 분산된다. 제형에 포함되는 미립자형 생물활성 분자의 양은 예를 들어 생물활성 분자의 효력 및 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 생물활성 분자는 제형의 약 0.1% 내지 70% (%(w/w))를 차지할 수 있으며, 이때 비히클은 약 30% 내지 99.9% (%(w/w))를 차지한다. 생물활성 분자는 약 50 ㎎/mL 내지 1000 ㎎/mL, 50 ㎎/mL 내지 500 ㎎/mL, 또는 50 ㎎/mL 내지 250 ㎎/mL의 농도로 비히클 중 현탁물 형태로 존재할 수 있다. 예시적인 제형은 40% (%(w/w))의 항-TNFα mAb 입자로 이루어지며, 상기 입자는 65 ㎎/mL의 항-TNFα mAb, 55 ㎎/mL의 수크로스, 10 mM의 L-히스티딘, 0.01%의 PS-80, pH 5.5 용액 및 60% (%(w/w))의 비히클 - 참깨유 및 에틸 올레에이트 (50:50의 부피비)를 가짐 - 을 스프레이 건조시킴으로써 만들어진다. 생물활성 분자는 이러한 높은 농도로 존재하기 때문에, 비수성 현탁 제형이 낮은 효력을 갖는 생물활성 분자의 전달에 사용될 수 있다. 생물활성 분자는 그의 고체 형태로 유지되기 때문에, 장시간 보관 수명 안정성이 예상된다.
실시예들에 예시된 실시 형태들은 CNTO148 제형을 포함하지만, 다른 항체 및 다른 항-TNFα 항체를 CNTO148 대신 사용하여 예시된 CNTO148 제형과 유사한 특성을 갖는 제형, 예를 들어 높은 안정성 및 우수한 주입성을 갖는 비수성 고농도 점도 감소 현탁 제형을 개발하여 수성 제형과 유사한 생물활성을 유지할 수 있다.
본 발명의 비히클 및 제형의 점도는 유량계와 같은 잘 알려진 유동학적 기기를 이용하여 측정될 수 있다. 비히클 또는 제형의 점도는 예를 들어 25℃에서 200 내지 500 s-1의 전단율의 함수로서 측정될 수 있으며, 이는 AR2000 유량계 (티에이 인스트루먼츠(TA Instruments))를 사용하고, 평균 점도를 측정된 전단율들 사이로 계산하거나 또는 정의된 전단율, 예를 들어 250 s-1의 함수로서 계산함에 의한 것이다. 본 발명의 비히클 및 제형의 점도는 그의 주입력의 측정에 의해 또한 평가될 수 있으며, 상기 주입력은 점도와 양의 상관 관계를 갖는다 (도 4). 주입력은 예컨대, 즈비크/뢸 (모델 2005) 시험 기기 (미국 조지아주 케네소 소재의 즈비크 뢸)를 사용하여, 0.5 인치의 26 ½ 게이지 니들을 갖춘, 내경이 0.25 인치인 1 mL 강성 니들 차폐형 유리 시린지 내로 제조된 제형들을 로딩하고, 주입 속도를 예를 들어 250 ㎜/분으로 설정하고, 피스톤 이동력을 기록함으로써 측정될 수 있다. 예시적인 시린지로는 BD (미국 뉴저지주 소재의 벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니) 시린지 (0.5 인치의 26 ½ 게이지 니들을 갖춘, BD 하이팩 SCF™ 1 mL 강성 니들 차폐형 사전충전가능 유리 시린지 (제품 표기명: PIR6-001 SCF1MLL 26GA1/2 RNSFM27 EB LTP. 8268589))가 있다. 점도 또는 주입력의 감소 퍼센트(%)를 측정하여 본 발명의 제형의 점도 및 주입성에 있어서 점도 감소제의 영향을 평가한다. 예를 들어, 본 발명의 비수성 고농도 단백질 제형은 점도 감소제를 포함하지 않는 제형과 비교할 때 점도가 81% 감소하거나 또는 주입력이 76% 감소할 수 있다.
본 발명의 비수성 고농도 현탁 제형의 점도는 전단율의 변경에 의해 추가로 저하될 수 있으며 따라서 제형의 주입성이 개선될 수 있다. 본 발명의 제형은 전단율에 대한 점도의 의존성의 분석에 의해 그의 뉴턴 또는 비뉴턴 특성에 대하여 분석될 수 있다. 제형의 비뉴턴 특성은 제형 중 점도 감소제의 양 및 단백질 농도에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 제형 중 단백질 농도의 증가는 제형 특성을 비뉴턴 전단 박화로 이동시킬 수 있으며, 따라서 제조 동안의 전단율의 증가는 이들 제형의 점도를 감소시켜 프로세싱을 개선시킬 수 있다. 제형 중 점도 감소제의 양의 증가는 제형 특성을 뉴턴 특성으로 이동시킬 수 있으며, 이 경우, 전단율의 조정은 점도에 영향을 거의 미치지 않거나 또는 전혀 미치지 않는다. 본 발명의 제형의 제조는 점도에 대한 전단율의 영향의 평가 및 전단율을 예를 들어 10 내지 1000 1/s 또는 50 내지 500 1/s로 조정하여 적절한 점도 값을 갖는 제형을 얻는 것을 포함한다.
본 발명의 생물활성 분자의 제형은 수성 제형에 비하여 향상된 안정성을 보이며, +40℃에서의 1개월 동안의 보관 후 안정한 형태의 95% 이상의 생물활성 분자를 유지한다. 제형의 안정성은 잘 알려진 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 단백질 응집의 양은 탁도의 시각적 관찰에 의해, 특정 파장에서 흡광도를 측정함에 의해, 크기 배제 크로마토그래피 (여기서, 단백질의 응집물은 그의 천연 활성 상태의 단백질과 비교하여 상이한 분획으로 용출될 것임), HPLC, 또는 다른 크로마토그래피 방법에 의해 측정될 수 있다. 구조 변화(conformational change)를 측정하는 다른 방법이 사용될 수 있으며, 이는 시차 주사 열량법(DSC)을 이용하여 예를 들어 변성 온도를 결정하거나, 또는 원편광 이색성(circular dichroism; CD)을 사용하는 것을 포함하는데, 상기 원편광 이색성은 단백질의 몰 타원율을 측정한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 참깨유 및 에틸 올레에이트를 포함하는 비히클과; 생물활성 분자를 포함하는 비수성 고농도 현탁 제형이다.
본 발명의 다른 실시 형태는 소수성 제제를 포함하는 비히클 중에 ≥50 ㎎/㎖의 단백질을 함유하는 제형의 주입력을 약 45 뉴턴(N) 이하로 감소시키는 방법으로서, 이는 28 부피% 이상의 점도 감소제를 소수성 제제를 포함하는 비히클 내에 첨가하는 단계; 또는 입자 크기가 약 2 ㎛ 내지 13 ㎛인 단백질 입자를 이용하여 제형을 제조하는 단계를 포함하며, 여기서, 주입력은 0.5 인치의 26 ½ 게이지 니들을 갖춘, 내경이 0.25 인치인 1 mL 강성 니들 차폐형 유리 시린지를 이용하여 250 ㎜/분의 주입 속도로 측정된다.
본 발명의 비수성 고농도 현탁 제형의 주입력을 45 뉴턴(N) 이하로 유지하기 위하여 몇몇 파라미터를 변화시킬 수 있다. 이들 파라미터는 예를 들어 제형 중 점도 감소제의 양, 입자 크기 및 단백질 농도와, 특정한 니들 게이지를 갖는 선택된 시린지에 대하여 사용되는 주입 속도이다. 주입력이 45 N 이하인 제형 중 점도 감소제의 양은 예를 들어 0.2% 내지 99.9%일 수 있으며, 단백질의 양은 1 내지 40% (%(w/w))일 수 있고, 입자 크기는 약 2 ㎛ 내지 13 ㎛일 수 있다. 소수성 제제, 점도 감소제 및 생물활성 분자를 함유하며, 주입력이 45 N 미만인 예시적인 비수성 제형으로는 입자 크기가 약 2 ㎛ 내지 13 ㎛인, 20% (%(w/w)) 이상의 단백질 농도 및 적어도 비히클 중 28%의 EO; EO/SO/28/72, EO/SO/50/50 또는 100% EO 중 20% (%(w/w))의 2 ㎛ BSA 입자 현탁물; EO/SO/50/50, EO/SO/73/30, EO/SO/85/15 또는 100%의 EO 중 20% (%(w/w))의 항-TNFα mAb 현탁물; EO/SO/50/50 중 30% 및 40% (%(w/w))의 항-TNFα mAb 현탁물; EO/SO/50/50 중 40%의 13 ㎛ BSA 입자 현탁물; 주입 속도가 50 ㎜/min인 100% EO 중 50% (%(w/w))의 2 ㎛ BSA 입자 현탁물; 및 주입 속도가 50 내지 250 ㎜/min인 50% (%(w/w))의 13 ㎛ BSA 입자 현탁물을 갖는 제형이 있다.
본 발명의 다른 실시 형태는 생물활성 분자의 비수성 고농도 현탁 제형의 제조 방법이며, 이는 생물활성 분자를 제공하는 단계; 소수성 제제를 제공하는 단계; 점도 감소제를 제공하는 단계; 소수성 제제 및 점도 감소제를 혼합하여 비히클을 형성하는 단계; 및 생물활성 분자를 단계 d.에서 형성한 비히클 내에 50 ㎎/mL 이상의 농도로 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제형은 잘 알려진 방법을 이용하여 시린지 또는 임의의 적합한 소부피 용기 내에 사전 로딩될 수 있으며, 따라서 혼합, 재구성 또는 임의의 추가의 준비 없이 즉시 주사가능하다. 사전 로딩된 시린지 내의 본 발명의 제형은 수동으로 주입되거나 또는 대안적으로 자동 주입기, 예를 들어 자동 주입 펜, 오토인젝터(auto-injector), 패치 펌프를 포함하는 다양한 자동 주입 펌프, 및 무-니들(needle free) 주입 장치에 의해 주입될 수 있다. 본 발명의 제형은 비경구 경로에 의해, 예를 들어 피하(SC) 또는 근육내(IM) 주사에 의해 숙주 내로 도입될 수 있다. 본 제형은 내경이 133 내지 604 마이크로미터의 범위인, 약 0.5 내지 5.1 ㎝ (2 인치) 길이, 20 내지 31 게이지의 니들을 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 즉시 주사가능한 비수성 고농도 현탁 제형은 유리한 국소 내성 (또는 생체 적합성), 낮은 주입력 및 제형 유연성을 가질 수 있다. 즉시 주사가능한 비수성 현탁 제형 중 생물활성 분자의 높은 농도는 생물활성 분자의 분자 구조 및 분자량과 관계 없이 성취될 수 있다.
이제 본 발명을 하기의 구체적인 비제한적 실시예를 참고로 하여 설명할 것이다.
실시예 1
비수성 비히클용 점도 감소제의 스크리닝
점도 감소제를 0.2 부피% 내지 50 부피%의 농도로 참깨유에 첨가하였다. 모든 점도 감소제는 일반적으로 안전한 것으로 인정되는(Generally Recognized As Safe; GRAS) 물질의 것이었다. 상기 혼합물을 폐쇄 20 mL 신틸레이션(scintillation) 바이알 내에 넣고, 30초 동안 와동시키고, 임의의 불혼화성에 대하여 시각적으로 검사하였다. 점도 감소제들 중 일부는 참깨유와 혼화성이 아닌 것으로 밝혀졌으며, 이는 추가로 스크리닝하지 않았다. 표 3은 예시적인 점도 감소제와 참깨유의 혼화성을 나타낸다. Y 및 N은 각각 시험한 점도 감소제가 시험한 농도에서 참깨유와 혼화성이었는지 혼화성이 아니었는지를 나타낸다.
Figure pct00003
일부 점도 감소제, 예를 들어 에틸 올레에이트, 아이소프로판올, 리놀레산, 및 프로피온산은 시험한 농도의 범위에 걸쳐 참깨유와 혼화성인 반면, 프로필렌 글리콜은 전혀 혼화성이 아니었다. 일부 제제는 점도 감소제와 참깨유의 단지 소정의 비에서 참깨유와 혼화성이었다.
비히클 점도의 측정에 있어서, 일단 균질한 용액이 형성되면, 각각의 시험할 비히클 290 μL를 40 ㎜, 1o 아크릴 콘 구성(geometry)을 갖춘 AR2000 유량계 (티에이 인스트루먼츠) 상에 피펫팅하였다.
Figure pct00004
전단 응력을 25℃에서 최대 500 s-1의 전단율의 함수로서 기록하였다. 점도를 소프트웨어로 자동으로 계산하고, 200 s-1과 500 s-1 사이에서 점도의 평균을 기록하였다.
각각의 샘플을 삼중으로 분석하였다. 점도 감소제를 포함하지 않는 참깨유를 대조군으로 사용하였다. 표 4는 생성된 예시적인 비히클의 평균 점도 값을 나타낸다.
생성된 비히클의 점도의 감소는 첨가한 점도 감소제의 부피 또는 중량 분율에 비례하였다. 참깨유 (SO), 에틸 올레에이트 (EO), 에탄올 (EtOH) 및 아이소프로필 알코올 (IPA)이 광고되는 비경구 제품에서 사용되었기 때문에, 이들을 추가의 시험용으로 선택하였다.
실시예 2
비수성 고농도 저점도 제형의 제조
생물활성 분자의 입자의 제조
동결건조:
소 혈청 알부민 (BSA) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 및 인간 항-TNFα 단클론 항체 (mAb)를 pH 6.0의 6.5 mM의 인산나트륨 완충제에 65 ㎎/mL의 단백질 농도로 용해시켰다. 약학적으로 허용가능한 부형제, 예를 들어 수크로스 및 트윈(Tween) 80 (또는 폴리소르베이트 80, PS-80)을, 최종 용액 중 각각 0 내지 9.0% 및 0 내지 0.01% (%(w/v))의 수크로스 및 트윈 80의 농도로 상기 단백질 용액에 선택적으로 첨가하였다. 상기 단백질 용액을 표준 프로토콜을 이용하여 동결건조시켰다.
동결건조시킨 단백질 또는 mAb 분말을 추가로 와링 블렌드에서 분쇄시키고, 결정된 메시 크기를 갖는 일련의 체에 통과시켰다. 분쇄/시징(seizing) 공정에 의해 입자 크기가 0.2 내지 250 ㎛인 단백질 또는 mAb 입자를 생성하였다.
스프레이 건조:
소 혈청 알부민 (BSA) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치) 및 인간 항-TNFα 단클론 항체의 입자를 스프레이 건조 공정을 이용하여 제조하였다. 제형들 (표 5)을 하기 공정 파라미터에서 야마토 미니 스프레이 건조기(Yamato Mini Spray dryer)를 이용하여 스프레이 건조시켰다: 분무 공기: 2 psi, 유입구 온도: 120℃, 흡입기 다이얼: 7.5, 용액 펌프: 2-4, 주 공기 밸브: 40-45 psi. 스프레이 건조된 생물활성 분자 미립자의 평균 직경(D50)을 레이저 회절 입자 크기 분석기 (맬번 마스터사이저 2000, 맬번)로 측정하고, 1 내지 20 ㎛의 크기 범위를 갖는 입자를 얻었다. 예시적인 제제들을 표 5에 나타낸다.
Figure pct00005
비수성 비히클의 제조
참깨유를 산화알루미늄 분말로 세정하여 과산화물 수준을 감소시키고, 그 후 살균, 0.2 ㎛ PTFE 필터를 통하여 여과시켰다. 점도 감소제를 0.2 내지 85 부피% (%(v/v))의 농도로 참깨유에 첨가하거나, 또는 일부의 경우에, 참깨유 없이 사용하였다. 일부 제형에 있어서, 에탄올을 약 0.2 내지 10 부피%로 비히클에 첨가하였다. 상기 혼합물을 폐쇄 용기 내에 넣고, 실온에서 1시간 동안 혼합하여 균질한 용액을 형성하였다. 표 4는 제조한 비수성 비히클을 나타낸다.
제형들의 제조
제조한 비수성 비히클을 동결건조 또는 스프레이 건조에 의해 제조된 생물활성 분자의 입자와 혼합하였다. 스테인리스강 스패튤라 블레이드를 갖춘 교반기를 이용하여 상기 입자를 실온에서 5 내지 30분 동안 50 내지 1000 rpm에서 상기 비히클 내에 블렌딩하였다. 입자 로딩은 약 1 내지 50 중량%였으며, 이는 최종 제형 중 약 10 내지 500 ㎎/mL의 단백질 농도에 이르게 되었다. 균질한 현탁물을 형성한 후, 제형들을 유리 주입 시린지 내에 충전시켰다. 제형들을 냉장 온도(4℃)에서 보관한 후 주입하였다. 표 6은 제조된 제형들을 나타낸다.
실시예 3
비수성 비히클 중 동결건조 생물활성 분자의 안정성
에틸 올레에이트(EO) 또는 중쇄 트라이글리세라이드(MCT; 라브라팩(LABRAFAC)™ 리포파일(Lipophile) WL 1349, 프랑스 소재의 가테포세(
Figure pct00006
))를 2 내지 50 부피%의 농도로 참깨유(SO)에 첨가하였다. 상기 혼합물을 폐쇄 20 mL 신틸레이션 바이알 내에 넣고, 30분 동안 와동시켰다. 완전한 혼합 후, 동결건조 항-TNFα 항체 분말을 3 mL 배큐테이너(vacutainer) 튜브 내에 칭량하여 넣고, 적당량의 비히클을 상기 튜브에 10 또는 20% (%(w/w))의 최종 단백질 함량으로 첨가하였으며, 이는 각각 53.6 또는 107.2 ㎎/mL의 항-TNFα 항체 농도에 상응하였다.
상기 현탁물을 잠시 와동시킴으로써 균질하게 만들고; 그 후 튜브를 밀봉하였다. 상기 현탁물을 37℃에서 보관하였다. 1주 및 4주의 보관 후, 샘플들을 추출하였다.
Figure pct00007
간략하게는, 1 mL의 1:1 혼합물인 -20℃ 사전 냉각 아세톤/다이클로로메탄을 상기 튜브에 첨가하고, 내용물을 4℃에서 20분 동안 진탕기에서 혼합하였다. 튜브를 2900 g에서 4분 동안 스핀하고, 상청액을 제거하였다. 이 추출 공정을 2회 반복하고, 단백질 펠렛을 스피드백(SpeedVac)을 사용하여 2시간 동안 건조시켰다. 상기 펠렛을 이동상 (0.2 M 인산염 완충제, pH 6.8)에 용해시켜 10 ㎎/mL의 작용 농도(working concentration)가 되도록 하였다. 20 μL의 상기 용액을 1 mL/분의 유량으로 애질런트(Agilent) SEC-HPLC 시스템에 주입하였다. 천연 형태, 응집 형태 및 단편화 형태의 항-TNFα 항체를 바이오실(BioSil) SEC250 컬럼 (미국 캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오라드(BioRad))으로 분리하고, 크기 배제 크로마토그래프(SEC)에서 214 및 280 nm 파장에서 모니터링하였다.
항-TNFα 항체 입자를 함유하는 시험 현탁 제형의 보관 안정성을 도 1에 나타내며, 이는 샘플 중에 유지된 단량체 내용물 (예를 들어, 천연 mAb)의 %로서 측정하였다. 대조군으로서, pH 7.4의 PBS 중 항-TNFα mAb를 함유하는 수성 제형을 제조하고, 분석하였다. 각각의 비수성 현탁 제형은 수성 제형과 비교하여 더 높은 안정성을 나타냈으며, 이는 동일한 응력 조건에서 단백질 단량체 함량 면에서 동결건조 단백질 분말과 비견되었다. 점도 감소제 에틸 올레에이트(EO)를 참깨유 내에 첨가하거나 또는 참깨유를 중쇄 트라이글리세라이드(MCT), 예를 들어 라브라팩™ 리포파일 WL 1349 (가테포세)로 대체하는 것은 4주간의 보관 시간 내에서 단백질 안정성에 어떠한 영향도 주지 않았다.
실시예 4
고농도 제형의 주입성은 비히클 조성, 단백질 농도 및 입자 크기에 의해 영향을 받는다.
피스톤 이동력 (예를 들어 주입력)의 측정은 본 발명의 비수성 고농도 현탁 제형의 주입성에 대한 다양한 파라미터의 영향을 측정하기 위한 평가로서 사용하였다.
비히클 조성의 영향
20% (%(w/w))의 BSA 및 20% (%(w/w))의 항-TNFα 항체 제형의 주입성은 즈비크/뢸 (모델 2005) 시험 기기를 이용하여 게이지 니들을 통하여 현탁물을 미는 데 필요한 힘을 측정함으로써 평가하였다. BSA 입자는 물 중 100 ㎎/mL의 BSA를 스프레이 건조시킴으로써 제조하고, 항-TNFα mAb 입자는 65 ㎎/mL의 단백질, 55 ㎎/mL의 수크로스, 10 mM의 L-히스티딘, 0.01%의 PS-80 - pH 5.5 - 을 스프레이 건조시킴으로써 제조하였다. 단백질 제형들은 상기에 기재된 단백질 입자를 부피 기준으로 증가하는 양의 점도 감소제 에틸 올레에이트 (0%, 3%, 9.5%, 17%, 20%, 25%, 28%, 30%, 40%, 50%, 75%, 85%, 또는 100% (%(v/v)))를 함유하는 참깨유와 혼합함으로써 제조하였다. 그 후, 제조된 제형들을 BD (미국 뉴저지주 소재의 벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니) 시린지 (0.5 인치의 26 ½ 게이지 니들을 갖춘, BD 하이팩 SCF™ 1 mL 강성 니들 차폐형 사전충전가능 유리 시린지 (제품 표기명: PIR6-001 SCF1MLL 26GA1/2 RNSFM27 EB LTP. 8268589)) 내에 로딩하였다. 시린지를 대략 0.5 cc의 제형들로 충전시키고, 달리 구체적으로 나타내지 않으면 주입 속도를 대략 250 ㎜/분으로 설정하고, 피스톤 이동력을 기록하였다. 주입 시험을 실온에서 행하였다.
참깨유(SO) 중 증가하는 양의 에틸 올레에이트(EO)는 2 ㎛ 및 13 ㎛ 크기의 단백질 입자의 현탁 제형의 주입력을 유의하게 감소시키고 그에 따라 상기 현탁 제형의 주입성을 향상시켰다. EO/SO/28/72 중 2 ㎛ BSA 입자의 20% (w/w)(200 ㎎/mL) 현탁물의 주입력은 35.3 N이었으며, EO/SO/50/50 중의 것은 21.5 N이었고, 후자는 점도 감소제를 포함하지 않는 참깨유 대조군 (64.65 N)과 비교하여 67% 감소한 것이었다 (도 2a). 100% EO 비히클의 사용은 주입력을 12.1 N으로 추가로 감소시켰다. 주입력의 유사한 감소는 참깨유 중 증가하는 양의 에틸 올레에이트를 포함하는 항-TNFα mAb 제형에서 입증되었다. 예를 들어, EO/SO/50/50 중 3.1 ㎛ 항-TNFα mAb 입자를 포함하는 20% (w/w) (108.6 ㎎/mL) 현탁물의 주입력은 29.5 N으로 감소되었으며, EO/SO/70/30 중의 것은 SO 중 20% (w/w) 항-TNFα mAb의 경우 71.3 N의 주입력으로부터 21.1 N으로 감소되었다 (도 2b). 이 결과는 비히클 중 점도 감소제의 첨가가 주입력의 감소에 의해 비수성 고농도 현탁 제형의 주입성을 유의하게 향상시켰음을 입증한다. 따라서 주입력이 약 45 N 이하인 비수성 고농도 현탁 제형은 참깨유 비히클 함유 제형 중 에틸 올레에이트의 양을 28 부피% 이상이 되도록 증가시킴으로써 제조될 수 있다.
단백질 농도의 영향
주입력은 비수성 현탁 제형 중 단백질 농도에 의해 영향을 받았다. 도 3a는 제형의 주입력에 있어서 증가된 8.2 ㎛ 항-TNFα 입자 항체 농도 (20 내지 40% (%(w/w)); 108.3 내지 216.7 ㎎/mL)와 증가된 양의 점도 감소제의 합해진 효과를 나타낸다. X-축은 각각의 실험에서 사용한 항-TNFα 항체의 농도를 나타낸다. EO/SO/50/50 중 최대 30%의 mAb 농도의 이용은 42.8 N의 주입력으로 이어졌다. 이 항체 농도에서의 주입력은 비히클로서 100% EO를 이용함으로써 20.5 N으로 감소시킬 수 있었다. 도 3b는 주입력 및 점도 둘 모두에 있어서 EO/SO/50/50 중 증가하는 농도의 항-TNFα mAb (0 내지 40% (% w/w; 0216.7 ㎎/mL))의 제형들의 영향을 나타낸다. 도 3c는 100% SO, EO/SO/50/50 및 100% EO 비히클 중 증가하는 농도의 BSA (입자 크기: 2㎛, 0 내지 40% (%(w/w)); 0 내지 400 ㎎/mL)의 영향을 나타낸다. 주입력을 약 45 N 이하로 감소시키기 위하여, 제형들은 약 20% (%(w/w)) 이하의 단백질 및 비히클 중 28% 이상의 EO, 30% 이하의 단백질 및 비히클 중 50% 이상의 50% EO, 또는 100% EO 중 약 40% 이하의 단백질 농도의 단백질을 함유할 수 있다. 행해진 실험은 또한 비수성 고농도 현탁 제형들의 주입력 및 점도가 상관됨을 입증하였다. 도 4a는 20% (%(w/w)) 항-TNFα mAb 현탁 제형들에서의 상관 관계를 보여준다. 도 4b는 시험한 모든 항-TNFα mAb 현탁 제형들에 있어서의 상관 관계를 보여준다. 따라서, 주입력은 점도와, 주입성 둘 모두의 척도로서 사용될 수 있다. 적절하게는 비수성 고농도 현탁 제형 중 점도 감소제의 양 및 단백질 농도 둘 모두의 변경은 제형의 주입성에 긍정적인 영향을 준다.
입자 크기의 영향
주입성에 대한 입자 크기의 영향은 시험한 제형들의 주입력에 대한 상이한 입자 크기들의 영향을 측정함으로써 평가하였다. 1 내지 50% (%(w/w)) (10 내지 500 ㎎/mL)의 농도 범위에 걸쳐 2 ㎛ 및 13 ㎛의 BSA 입자를 함유하는 제형들을 EO/SO/50/50 비히클 중에 제조하였다. 이들 제형에서, 주입력은 단백질 농도가 증가함에 따라 증가하고 입자 크기가 증가함에 따라 감소하였다 (도 5). 예를 들어, 45 N 이하의 주입력을 성취하기 위하여, EO/SO/50/50 중의, 입자 크기가 13 ㎛인 40% (%(w/w))의 단백질의 제형을 사용할 수 있다. 고체상의 입자 크기를 증가시키면서 현탁물 중 입자의 일정 질량을 유지하는 것은 상기 시스템에 있어서 감소된 수의 입자에 이르게 된다. 따라서, 증가하는 입자 크기를 갖는 현탁물은 입자-입자 상호작용이 덜하며, 내유동성이 감소하였고, 이는 감소된 주입력에 이르게 되었다. 이 결과는, 비수성 현탁 제형 중 입자의 크기의 선택이, 더욱 높은 단백질 농도에서, 예를 들어 40% (%(w/w))에서 주입력에 유의한 영향을 주며 따라서 제형의 주입성에 유의한 영향을 줌을 입증한다. 예를 들어, 40% (5 w/w)의 13 ㎛ 단백질 입자를 포함하는 제형은 주입력이 40.5 N이며, 반면에, 2 ㎛ 단백질 입자를 포함하는 동일 제형은 주입력이 57 N이다. 따라서, 본 발명의 현탁 제형의 주입성은 단백질 농도 및 입자 크기 둘 모두와, 제형 중 점도 감소제의 양을 최적화함으로써 향상시킬 수 있다.
실시예 5
비수성 고농도 현탁 제형의 점도는 전단율의 증가에 의해 감소시킬 수 있다.
다양한 전단율에서 점도에 대한 비히클 선택 및 단백질 농도 둘 모두의 영향을 연구하였다. EO/SO/50/50 중 또는 SO 중 1 내지 40% (%(w/w))의 항-TNFα 항체를 함유하는 제형 290 μL를 40 ㎜, 1o 아크릴 콘 구성을 갖춘 AR2000 유량계 (티에이 인스트루먼츠) 상에 피펫팅하였다. 각각의 제형에 대한 점도 스캔은 전단율이 대략 8 s-1로부터 5000 s-1로 증가할 때 25℃에서 측정하였다.
사용한 비히클에 따라, 20% (%(w/w))의 항-TNFα mAb 제형들은 뉴턴 (EO/SO/50/50 중 항-TNFα mAb) 또는 비뉴턴 전단 박화 (SO 중 항-TNFα mAb) 거동 중 어느 하나를 보여주었다 (도 6a). 30% (%(w/w)) 이상의 단백질 농도에서, 항-TNFα mAb EO/SO50/50 제형들은 그의 거동을 뉴턴 전단 박화로부터 비뉴턴 전단 박화로 바꾸었다 (도 6b).
본 발명의 제형들의 전단 박화 거동의 평가는 그의 하류 프로세싱 및 제조에 결정적이다. 고도로 농축된 단백질 제형들은 흔히 증가된 점도로 이어지며, 상기 증가된 점도는 공정, 제조 및 보관 동안 상당한 난제를 제기한다. 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제형들의 프로세싱 및 제조 동안 점도에 대한 전단율의 영향을 평가하고 전단율을 적절하게 증가시키는 것은 점도를 유의하게 감소시키며, 따라서 제형의 처리 능력을 개선시킬 수 있다.
실시예 6
주입력을 변경시키기 위한 주입 속도의 조정
다양한 주입 속도를 이용하여 EO 중 40 내지 50% (%(w/w))(400 내지 500 ㎎/mL)의 2 ㎛ 및 13 ㎛ BSA 입자 (도 7a, 도 7b)에 대하여, 그리고 EO/SO/50/50 중 20 내지 40% (%(w/w))(108.33 내지 216.67 ㎎/mL)의 항-TNFα 항체 (도 7c)에 대하여 주입력을 평가하였다. 주입 속도는 단백질 농도에 의존적인 방식으로 주입력에 영향을 주었다. 40% (%(w/w))의 BSA에서, 주입력은 주입 속도에 덜 의존적이었다. 그러나, 50% (%(w/w))의 BSA 농도에서, 주입 속도를 250 ㎜/분으로부터 50 ㎜/분으로 감소시키면 주입력이 111.4 N으로부터 32.4 N으로 유의하게 감소하였다 (도 7a). 주입 속도에 의한 주입력에 대한 영향은 입자 크기에 의해 또한 영향을 받았다. 더욱 큰 입자 크기를 갖는 제형의 주입력은 주입 속도에 의해 영향을 덜 받았으며, 반면에, 더욱 작은 입자 크기를 갖는 제형의 주입력은 주입 속도에 의해 유의하게 영향을 받았다 (도 7b). 주입 속도를 50 내지 250 ㎜/분으로 하여 13 ㎛의 BSA 입자를 이용함으로써 주입 속도가 45 N 이하가 되었다. 또한, 주입 속도는 항-TNFα 항체 제형의 주입력에 영향을 주었으며, 주입 속도를 감소시켜 주입력을 감소시켰다 (도 7c).
실시예 7
건조 입자 제형의 최적화
항-TNFα 항체 CNTO148의 제형, 예를 들어 표 7에 나타낸 것들을 실시예 2에서 설명한 바와 같이 스프레이 건조 또는 동결건조에 의해 제조하였다. CNTO148의 스프레이 건조 또는 동결건조용 제형은 하기 부형제들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 0 내지 3의 대략적인 수크로스:단백질 비의 수크로스, 0 내지 3의 (수크로스 + 아미노산):단백질 비의 수크로스 + 아미노산, 약 0 내지 40 mM의 히스티딘 완충제, 약 0 내지 10 mM의 시트르산염 완충제, 0 내지 1.8의 대략적인 트레할로스:단백질 비의 트레할로스, 0 내지 1.8의 대략적인 만니톨:단백질 비의 만니톨, 0 내지 1.8의 대략적인 소르비톨:단백질 비의 소르비톨, 0 내지 1.8의 대략적인 (아미노산):단백질 비의 아미노산 - 상기 비는 w/w 비로 나타냄 - 및 약 0.01 내지 0.1%의 PS-80 (%(w/v)). pH를 약 5.5로 조정할 수 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
표 7에 나타낸 소정의 제형들을 5℃, 25℃ 또는 40℃에서의 0 내지 6개월 동안의 안정성에 대하여 시험하였다. 선택된 제형들을 실시예 8에서의 추가 연구를 위하여 비수성 비히클에 현탁시켰다.
실시예 8
CNTO148 현탁 제형
실시예 7로부터의 선택된 제형을 비수성 비히클 SO, EO, 또는 EO/SO/50/50에 100 ㎎/mL 또는 200 ㎎/mL로 현탁시켰다 (표 8). 스프레이 건조된 제형 및 현탁 제형 둘 모두의 안정성을 크기 배제 HPLC(SE-HPLC), 모세관 SDS-PAGE, 모세관 등전 집속(capillary isoelectric focusing; cIEF), 원편광 이색성(CD), 또는 질량 분광법에 의한 펩티드 지도화를 이용하여 5℃, 25℃, 또는 40℃에서 보관한 후 0, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6개월에 시험하였다. 표준 방법을 이용하여 과산화물이 제거되도록 산화알루미늄으로 선택된 제형들을 처리하였다. SE-HPLC에서, 시간이 지남에 따른 주요 HPLC 피크의 유지율 (%)을 제형 중 CNTO148의 안정성의 지표로서 평가하였다.
Figure pct00010
도 8a 및 도 8b와, 도 9a 및 도 9b는 SE-HPLC의 주요 피크의 안정성의 척도로서 최대 6개월간 25℃ (도 8a 및 도 8b) 및 40℃ (도 9a 및 도 9b)에서 보관한 후 선택된 스프레이 건조된 제형들 및 SO, EO, 및 SO/EO/50/50 중의 상기의 것들의 현탁물의 안정성을 나타낸다. 제형들은 스프레이 건조된(SD) 제형 유형 (표 7에서 실험 SD_1의 Form-1 대 Form-5 대 Form-7)을 기초로 하여 함께 분류되는 것으로 보이며, 이는 로딩 % 및 비히클 조성이 SE-HPLC를 이용하여 평가할 경우 안정성에 대하여 영향을 덜 줄 수 있음을 시사한다. 스프레이 건조된(SD) 제형 및 현탁 제형 둘 모두는 대조 수성 제형 (101㎎/mL의 단백질, 10 mM의 히스티딘, 4.5 ㎎/mL의 수크로스, 0.015%의 PS-80, pH 5.6)과 비교할 때 더 안정하였다.
CNTO148 생물활성 (일상적인 방법을 이용한 세포에 대한 TNFα의 활성의 저해)은, 스프레이 건조된 제형 및 100 ㎎/mL의 SO/EO/50/50 현탁 제형으로부터 처음에 측정하고, 최대 6개월 동안 25℃에서 그리고 최대 4.5개월 동안 40℃에서 보관한 후 측정하였다. CNTO148 생물활성은 스프레이 건조 후 유지되었으며, 25℃에서의 6개월의 보관 후 스프레이 건조된 제형에서 유지되었으며, 이외에도 현탁 제형에서 유지되었다 (도 10).
스프레이 건조된 제형 및 현탁 제형 둘 모두에 있어서의 이차 구조의 가능한 변화를 원자외선 CD 스캔을 이용하여 평가하였다 (도 11). 스프레이 건조된 제형 및 현탁 제형 둘 모두의 보관 후 또는 스프레이 건조 후 어떠한 변화도 확인되지 않았다.
실시예 9
CNTO148 제형
CNTO148을 실시예 1 내지 실시예 7에서 항-TNFα 항체로서 사용하였다. CNTO148의 추가의 현탁 제형을 실시예 7에서 설명한 CNTO148의 스프레이 건조된 입자 제형을 사용하여 표 9에 나타낸 바와 같이 만든다. 생성된 현탁 제형들을 본 명세서에 설명한 방법을 이용하여 그의 안정성 및 주입성에 대하여 평가한다.
Figure pct00011
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. Dao, Weiguo Hill, Beth Liu, Kui Mieczkowski, Carl <120> NON-AQUEOUS HIGH CONCENTRATION REDUCED VISCOSITY ANTIBODY SUSPENSION FORMULATIONS <130> CEN5287WOPCT1 <140> TO BE ASSIGNED <141> 2011-09-30 <150> 13/043925 <151> 2011-03-09 <150> 61/311896 <151> 2010-03-09 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Leu Tyr Asp Gly Ser Ser Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ser Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Leu Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ala Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Val Ser Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Ser Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 9 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims (24)

  1. 비수성 고농도 현탁 제형으로서,
    a. 소수성 제제(hydrophobic agent) 및 점도 감소제를 포함하는 비히클과;
    b. 부형제를 이용하여 제형화된 항체를 포함하는 제형.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 항-TNFα 항체인 제형.
  3. 제1항에 있어서, 상기 소수성 제제는 참깨유인 제형.
  4. 제1항에 있어서, 상기 점도 감소제는 에틸 올레에이트인 제형.
  5. 제1항에 있어서, 상기 비히클 중 상기 점도 감소제의 양은 상기 비히클의 0.2 부피% 내지 95 부피% (%(v/v))인 제형.
  6. 제2항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체는 상기 제형의 약 0.5 중량%, 1 중량%, 5 중량%, 10 중량%, 20 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 50 중량% 또는 60 중량% (%(w/w))로 존재하는 제형.
  7. 제2항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체는 스프레이 건조되거나 또는 동결건조된 제형.
  8. 제2항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체는 서열 번호 6의 경쇄 가변 영역(VL) 및 서열 번호 1 또는 2의 중쇄 가변 영역(VH), 또는 서열 번호 7의 VL 및 서열 번호 3, 4 또는 5의 VH를 포함하는 제형.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체는 IgG1/κ 타입의 것인 제형.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제형의 주입력은 45 뉴턴(N) 이하이며, 상기 주입력은 0.5 인치의 26 ½ 게이지 니들을 갖춘, 내경이 0.25 인치인 1 mL 강성 니들 차폐형 유리 시린지를 이용하여 250 ㎜/분의 주입 속도로 측정되는 제형.
  11. 제2항에 있어서, 40℃에서 1개월 이상 동안 안정한 제형.
  12. 제2항에 있어서, 부형제는 탄수화물, 아미노산, 완충제 또는 비이온성 계면활성제인 제형.
  13. 제12항에 있어서, 상기 탄수화물은 수크로스, 트레할로스, 만니톨 또는 소르비톨이며, 상기 아미노산은 히스티딘, 아이소류신, 메티오닌, 글리신, 아르기닌 또는 라이신이고, 상기 완충제는 히스티딘 완충제 또는 시트르산염 완충제이며, 상기 비이온성 계면활성제는 PS-80인 제형.
  14. 제12항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체에 대한 상기 탄수화물의 중량비 (w/w)는 약 0 내지 3 또는 약 1 내지 2이며, 상기 항-TNFα 항체에 대한 상기 아미노산의 중량비는 약 0 내지 2 또는 약 0.3 내지 1.8이고, 히스티딘 완충제 농도는 약 0 내지 40 mM 또는 약 5 내지 10 mM이며, 시트르산염 완충제 농도는 약 0 내지 10 mM 또는 약 5 내지 10 mM이고, 상기 비이온성 세제는 약 0% 내지 0.5% (%(w/v)) 또는 약 0.01 내지 0.1% (%(w/v))로 존재하는 제형.
  15. 서열 번호 6의 경쇄 가변 영역(VL) 및 서열 번호 1 또는 2의 중쇄 가변 영역(VH), 또는 서열 번호 7의 VL 및 서열 번호 3, 4 또는 5의 VH를 갖는 항-TNFα 항체의 입자 제형을 포함하는 현탁 제형으로서,
    a. 32.5 ㎎/mL의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 27.5 ㎎/mL의 수크로스, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    b. 16.25 ㎎/mL의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 27.5 ㎎/mL의 수크로스, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    c. 32.5 ㎎/mL의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 시트르산염, 27.5 ㎎/mL의 수크로스, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    d. 32.5 ㎎/㎖의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 55 ㎎/㎖의 수크로스, 10 ㎎/㎖의 아이소류신, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    e. 32.5 ㎎/㎖의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 65 ㎎/㎖의 수크로스, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    f. 32.5 ㎎/㎖의 상기 항-TNFα 항체, 5 mM의 히스티딘, 5 mM의 시트르산염, 65 ㎎/㎖의 수크로스, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    g. 32.5 ㎎/㎖의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 5 ㎎/㎖의 수크로스, 22.5 ㎎/mL의 만니톨, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    h. 32.5 ㎎/㎖의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 55 ㎎/㎖의 트레할로스, 10 ㎎/㎖의 아이소류신, 0.01% (%(w/v))의 PS-80; 또는
    i. 65 ㎎/㎖의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 55 ㎎/㎖의 수크로스, 0.01%의 PS-80을 포함하며,
    a 내지 i에 나타낸 상기 제형들은 참깨유 및 에틸 올레에이트를 포함하는 비수성 비히클에 분산되고, 상기 비히클 중 에틸 올레에이트의 양은 상기 비수성 비히클의 0.2 부피% 내지 95 부피% (%(v/v))인 현탁 제형.
  16. 제15항에 있어서, 상기 비히클 중 에틸 올레에이트의 양은 상기 비수성 비히클의 5%, 10%, 15%, 30% 또는 50% (%(v/v))인 현탁 제형.
  17. 제15항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체는 IgG1/k 타입의 것인 현탁 제형.
  18. 서열 번호 6의 경쇄 가변 영역(VL) 및 서열 번호 1 또는 2의 중쇄 가변 영역(VH), 또는 서열 번호 7의 VL 및 서열 번호 3, 4 또는 5의 VH를 갖는 항-TNFα 항체의 입자 제형을 포함하는 현탁 제형으로서,
    a. 32.5 ㎎/mL의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 27.5 ㎎/mL의 수크로스, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    b. 16.25 ㎎/mL의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 27.5 ㎎/mL의 수크로스, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    c. 32.5 ㎎/mL의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 시트르산염, 27.5 ㎎/mL의 수크로스, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    d. 32.5 ㎎/㎖의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 55 ㎎/㎖의 수크로스, 10 ㎎/㎖의 아이소류신, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    e. 32.5 ㎎/㎖의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 65 ㎎/㎖의 수크로스, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    f. 32.5 ㎎/㎖의 상기 항-TNFα 항체, 5 mM의 히스티딘, 5 mM의 시트르산염, 65 ㎎/㎖의 수크로스, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    g. 32.5 ㎎/㎖의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 5 ㎎/㎖의 수크로스, 22.5 ㎎/mL의 만니톨, 0.01% (%(w/v))의 PS-80;
    h. 32.5 ㎎/㎖의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 55 ㎎/㎖의 트레할로스, 10 ㎎/㎖의 아이소류신, 0.01% (%(w/v))의 PS-80; 또는
    i. 65 ㎎/㎖의 상기 항-TNFα 항체, 10 mM의 히스티딘, 55 ㎎/㎖의 수크로스, 0.01% (%(w/v))의 PS-80을 포함하며,
    a 내지 i에 나타낸 상기 제형들은 에틸 올레에이트를 포함하는 비수성 비히클에 분산된 현탁 제형.
  19. 제18항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체는 IgG1/k 타입의 것인 현탁 제형.
  20. 소수성 제제를 포함하는 비히클 중에 -50 ㎎/㎖의 항-TNFα 항체를 함유하는 제형의 주입력을 약 45 뉴턴(N) 이하로 감소시키는 방법으로서,
    a. 28 부피% 이상의 점도 감소제를 소수성 제제를 포함하는 비히클 내에 첨가하는 단계; 또는
    b. 입자 크기가 약 2 ㎛ 내지 13 ㎛인 단백질 입자를 이용하여 상기 제형을 제조하는 단계를 포함하며,
    상기 주입력은 0.5 인치의 26 ½ 게이지 니들을 갖춘, 내경이 0.25 인치인 1 mL 강성 니들 차폐형 유리 시린지를 이용하여 250 ㎜/분의 주입 속도로 측정되는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체는 서열 번호 6의 경쇄 가변 영역(VL) 및 서열 번호 1 또는 2의 중쇄 가변 영역(VH), 또는 서열 번호 7의 VL 및 서열 번호 3, 4 또는 5의 VH를 갖는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체는 IgG1/k 타입의 것인 방법.
  23. 서열 번호 6의 경쇄 가변 영역(VL) 및 서열 번호 1 또는 2의 중쇄 가변 영역(VH), 또는 서열 번호 7의 VL 및 서열 번호 3, 4 또는 5의 VH를 갖는 항-TNFα 항체의 비수성 고농도 현탁 제형을 제조하는 방법으로서,
    a. 상기 항-TNFα 항체를 제공하는 단계;
    b. 소수성 제제를 제공하는 단계;
    c. 점도 감소제를 제공하는 단계;
    d. 상기 소수성 제제 및 상기 점도 감소제를 혼합하여 비히클을 형성하는 단계; 및
    e. 상기 항-TNFα 항체를 단계 d에서 형성한 비히클 내에 50 ㎎/mL 이상의 농도로 첨가하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항-TNFα 항체는 IgG1/k 타입의 것인 방법.
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