ES2960599T3

ES2960599T3 - Formulaciones de proteínas

Info

Publication number: ES2960599T3
Application number: ES15738505T
Authority: ES
Inventors: Sungae Park; Arnold J Mcauley
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2015-06-15
Publication date: 2024-03-05
Anticipated expiration: 2035-06-15
Also published as: US20170209582A1; EP4285930A2; JP2021178862A; EP3160511B1; JP6634394B2; EP3160511A1; WO2015200027A1; MX2020012893A; JP2017519777A; MX2016017025A; AU2023200296B2; JP2019203018A; AU2023200296A1; CA2952609A1; EP4285930A3; AU2015280480A1; JP2023162442A; AU2020250182A1

Abstract

La presente divulgación proporciona formulaciones de proteínas sólidas que son estables en una variedad de temperaturas durante períodos de tiempo prolongados. La presente divulgación también proporciona métodos para preparar y usar estas formulaciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones de proteínas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE. UU. Número de Serie 62/017.560, presentada el 26 de junio de 2014.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de esta invención se refiere a composiciones y métodos relacionados con formulaciones de proteínas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los fármacos proteicos terapéuticos pueden ser inestables y vulnerables a influencias ambientales y otras influencias externas, lo que podría provocar cambios que reduzcan su actividad. Los intentos de formular proteínas terapéuticas pueden conducir con frecuencia a formulaciones que causan malestar al paciente(por ejemplo, formulaciones de pH bajo).

En algunos casos, las formulaciones de proteínas terapéuticas se estabilizan añadiendo proteínas adicionales a la formulación. Por ejemplo, se ha usado seroalbúmina humana (HSA) como estabilizador. Sin embargo, la adición de proteínas adicionales a un producto farmacéutico no es ideal por diversas razones, incluido el riesgo de una respuesta inmune adversa o contaminación viral.

El documento WO 2007/014073 describe una disolución que comprende una proteína, como por ejemplo darbepoetina alfa, en aproximadamente 40 a 150 mg/ml, aproximadamente 7 a 50 mM de histidina, aproximadamente 2% a 4% de manitol, aproximadamente 1,0 a 2,5% de sacarosa, y aproximadamente 0,004% a 0,015% de polisorbato 20 o polisorbato 80, con pH de 4,5 a 7,5.

En consecuencia, existe la necesidad de formulaciones de proteínas que proporcionen estabilidad a largo plazo a diversas temperaturas, y que minimicen el dolor asociado con la inyección.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En una realización, la invención proporciona una formulación de proteína sólida que comprende un estabilizador, un alcohol de azúcar, un azúcar y un tensioactivo, como se define en las reivindicaciones.

En otra realización, la invención proporciona una formulación de proteína sólida que comprende darbepoetina alfa, histidina, manitol, sacarosa, y polisorbato-80. También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que comprende glutamato de sodio, manitol, sacarosa, y polisorbato 20. También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que comprende histidina, manitol, sacarosa, y polisorbato 20. En una realización adicional, la invención proporciona un método para preparar la formulación de proteína sólida, que comprende: a) diluir dicha proteína con un amortiguador de liofilización; y b) liofilizar dicha proteína diluida. En otra realización, la invención proporciona un kit que comprende formulaciones de proteínas sólidas y un amortiguador de reconstitución.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

LaFigura 1describe los resultados de una comparación de la desnaturalización de Aranesp usando el anticuerpo detector 9G8A sin (A) y con (B) polisorbato-80 a 37°C.

LaFigura 2describe los resultados de una comparación de la desnaturalización de Aranesp usando el anticuerpo detector 9G8A con polisorbato-80 a 45°C.

LaFigura 3describe los resultados de una comparación del % de pico principal por SEC de Aranesp® sin polisorbato-80 en formulación liofilizada en comparación con formulación líquida a 37°C y 45°C.

LaFigura 4describe una superposición SEC-HPLC de muestras que no contienen polisorbato-80 reconstituidas con 4% de sorbitol a los 24 meses a 45°C. (A) Representa la superposición de muestras ampliadas, y (B) representa la superposición de muestras sin ampliar.

LaFigura 5describe los resultados de una comparación del % del pico principal mediante SEC de Aranesp® sin polisorbato-80 entre la formulación liofilizada a 45°C.

LaFigura 6describe los resultados de una comparación del % del pico principal mediante SEC de Aranesp® con polisorbato-80 entre la formulación liofilizada a 45°C.

LaFigura 7describe los resultados de una comparación del pH de Aranesp® con y sin polisorbato-80 entre la formulación liofilizada y la líquida a 45°C.

LaFigura 8describe los resultados de una comparación del % de oxidación de Aranesp después del almacenamiento a 4°C durante un máximo de 24 meses.

LaFigura 9describe los resultados de una comparación del % de oxidación de Aranesp en formulación líquida y Lio después del almacenamiento a 29°C durante un máximo de 24 meses: P62N500 y P62N500T son formulaciones líquidas, y las otras muestras son una formulación liofilizada.

LaFigura 10describe los resultados de una comparación del % de oxidación de Aranesp en formulación lio sólo después del almacenamiento a 29°C.

LaFigura 11describe los resultados de una comparación del % de oxidación de Aranesp en formulación líquida y Lio después del almacenamiento a 37°C durante un máximo de 24 meses: P62N500 y P62N500T son formulaciones líquidas, y el resto de ellas son formulaciones liofilizadas.

LaFigura 12describe los resultados de una comparación del % de oxidación de Aranesp en la formulación Lio sólo después del almacenamiento a 37°C.

LaFigura 13describe los resultados de una comparación del % de oxidación de Aranesp en formulación líquida y Lio después del almacenamiento a 45°C durante un máximo de 24 meses: P62N500 y P62N500T son formulaciones líquidas, y las muestras restantes son formulaciones liofilizadas.

LaFigura 14describe los resultados de una comparación del % de oxidación de Aranesp en formulación Lio sólo después del almacenamiento a 37°C durante un máximo de 24 meses.

LaFigura 15describe los resultados de una comparación de Aranesp (500 pg/ml) sin polisorbato-80 en tres muestras liofilizadas y reconstituidas en 4% de sorbitol entre la formulación líquida de Aranesp para degradación y especies de recorte mediante HPLC de fase inversa no reducida después de almacenarlas durante 24 meses a 45°C.

LaFigura 16describe los resultados de una comparación de Aranesp sin polisorbato-80 en tres muestras liofilizadas y reconstituidas en 4% de sorbitol entre la formulación líquida de Aranesp para degradación y especies de recorte mediante HPLC de fase inversa no reducida después de almacenarlas durante 24 meses a 37°C.

LaFigura 17describe los resultados del % de los picos principales de SEC-HPLC de muestras que no contienen polisorbato 80 a 4°C.

LaFigura 18describe los resultados del % de los picos principales de SEC-HPLC de muestras que contienen polisorbato 80 a 4°C.

LaFigura 19describe los resultados del % de los picos principales de SEC-HPLC de muestras que no contienen polisorbato 80 a 29°C.

LaFigura 20Adescribe los resultados del % de los picos principales de SEC-HPLC de muestras que contienen polisorbato 80 a 29°C. LaFigura 20Bdescribe los resultados del % de los picos principales de SEC-HPLC de muestras que no contienen polisorbato 80 a 29°C.

LaFigura 21describe los resultados del % de los picos principales de SEC-HPLC de muestras que contienen polisorbato 80 a 37°C.

LaFigura 22describe los resultados de una comparación de los resultados de Aranesp® 9G8A a diferentes temperaturas entre CZ y vial de vidrio. El recipiente CZ mostró una mayor desnaturalización a temperaturas más altas (25°C, 37°C, 45°C).

LaFigura 23describe los resultados de una comparación del % HMW por SEC de Aranesp® en dos recipientes diferentes con tres diluyentes de reconstitución diferentes a diferentes temperaturas.

LaFigura 24describe los resultados de una comparación del % de los picos principales por SEC de Aranesp® en dos recipientes diferentes con tres diluyentes de reconstitución diferentes a diferentes temperaturas. LaFigura 25describe los resultados de un recuento de partículas HIAC por ml de muestras de proteínas a diferentes temperaturas.

LaFigura 26describe los resultados de la observación visual de muestras liofilizadas. A los 12 meses, las muestras mostraron una cantidad baja de torta liofilizada en el vial de CZ a 4°C. Los viales con tapas azules contienen muestras de proteínas. Los viales con tapas verdes contienen muestras de placebo.

LaFigura 27describe los resultados de una comparación de la concentración de Aranesp® (|jg/ml) a diferentes temperaturas.

LaFigura 28describe los resultados de una comparación del % de oxidación de Aranesp después de almacenarlo a cuatro temperaturas diferentes (4°C, 29°C, 37°C y 45°C) en dos recipientes diferentes (CZ y vial de vidrio).

LaFigura 29describe los resultados de una comparación de especies de recorte de Aranesp mediante HPLC de fase inversa no reducida después de almacenarlas durante 12 meses a cuatro temperaturas diferentes en dos recipientes diferentes.

LaFigura 30describe los resultados de una comparación del pH de Aranesp a cuatro temperaturas diferentes (4°C, 29°C, 37°C y 45°C) en dos recipientes diferentes (CZ y vial de vidrio).

LaFigura 31describe los resultados de una comparación de la osmolaridad de Aranesp a cuatro temperaturas diferentes (4°C, 29°C, 37°C y 45°C) en dos recipientes diferentes (CZ y vial de vidrio).

LaFigura 32describe los resultados del análisis del % de bajo peso molecular de la muestra mediante SEC a 4°C y 37°C hasta 12 semanas para la muestra de 100 |ug/ml y 500 |ug/ml en dos formulaciones de liofilización diferentes.

LaFigura 33describe los resultados del análisis del % de alto peso molecular de la muestra mediante SEC a 4°C y 37°C hasta 12 semanas para la muestra de 100 |ug/ml y 500 |ug/ml en dos formulaciones de liofilización diferentes.

LaFigura 34describe los resultados del análisis del % de los picos principales de la muestra mediante SEC a 4°C y 37°C hasta 12 semanas para la muestra de 100 |ug/ml y 500 |ug/ml en dos formulaciones de liofilización diferentes.

LaFigura 35describe los resultados del análisis del % de cadena pesada de la muestra mediante CE-SDS a 4°C y 37°C hasta 12 semanas para la muestra de 100 |ug/ml y 500 |ug/ml en dos formulaciones de liofilización diferentes.

LaFigura 36describe los resultados del análisis del % de cadena ligera de la muestra mediante CE-SDS a 4°C y 37°C hasta 12 semanas para la muestra de 100 |ug/ml y 500 |ug/ml en dos formulaciones de liofilización diferentes.

LaFigura 37describe los resultados del análisis del % de cadena pesada no glicosilada de la muestra mediante CE-SDS a 4°C y 37°C hasta 12 semanas para la muestra de 100 |ug/ml y 500 |ug/ml a dos diferentes formulaciones de liofilización

LaFigura 38describe los resultados de un electroferograma de mAb anti-EPO mediante CE-SDS después de almacenar 7 semanas a 4°C y 37°C para una muestra de 500 |ug/ml en dos formulaciones de liofilización diferentes: H= formulación de histidina, G = formulación de glutamato.

LaFigura 39describe los resultados de los barridos de DSC de las muestras pre-lio en amortiguadores GMST y HMST. Negro = 0,1 mg/ml de mAb anti-EPO 8C10-GMST, rojo = 0,1 mg/ml de mAb anti-EPO 8C10-HMST, verde = 0,5 mg/ml de mAb anti-EPO 8C10-GMST y azul = 0,5 mg/ml de mAb anti-EPO 8C10-GMST. Las señales de las muestras de 0,1 mg/ml se normalizaron a 0,5 mg/ml (se usó la misma normalización para todas las muestras de 0,1 mg/ml).

LaFigura 40describe los resultados de los barridos de DSC de las muestras de mAb anti-EPO 8C10-GMST 0,1 mg/ml en diferentes condiciones. Negro = pre-lio, rojo = lio (T=0), verde = lio (T=7 semanas a 4°C), azul = lio (T=7 semanas a 37°C), ciano = lio (T=12 semanas a 4°C), y amarillo oscuro = lio (T=12 semanas a 37°C).

LaFigura 41describe los resultados de los barridos de DSC de las muestras de mAb anti-EPO 8C10-HMST 0,1 mg/ml en diferentes condiciones. Negro = pre-lio, rojo = lio (T=0), verde = lio (T=7 semanas a 4°C) y azul = lio (T=7 semanas a 37°C).

LaFigura 42describe los resultados de los barridos de DSC de las muestras de mAb anti-EPO 8C10-GMST 0,5 mg/ml en diferentes condiciones. Negro = pre-lio, rojo = lio (T=0), verde = lio (T=7 semanas a 4°C), azul = lio (T=7 semanas a 37°C), ciano = lio (T=12 semanas a 4°C), y amarillo oscuro = lio (T=12 semanas a 37°C).

LaFigura 43describe los resultados de los barridos de DSC de las muestras de mAb anti-EPO 8C10-HMST 0,5 mg/ml en diferentes condiciones. Negro = pre-lio, rojo = lio (T=0), verde = lio (T=7 semanas a 4°C) y azul = lio (T=7 semanas a 37°C).

LaFigura 44describe los resultados del análisis de distribución de tamaños de muestras de mAb anti EPO a T=0 (aumentado 10x).

LaFigura 45describe los resultados de los análisis de AUC de muestras de mAb anti EPO. Los amortiguadores de glutamato están en el panel superior, los amortiguadores de histidina en los paneles inferiores; 4°C se presentan en azul y 37°C en rojo. Las muestras de PreLio son T=0 en todos los gráficos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a formulaciones de proteínas, como se define por las reivindicaciones. La presente invención proporciona además composiciones, kits y métodos relacionados con formulaciones de proteínas, como se define por las reivindicaciones.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo aquí, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos normales en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas aquí son bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente invención se llevan a cabo generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (1990). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante, como se realiza habitualmente en la técnica o como se describe aquí. La terminología usada con respecto a la química analítica, la química orgánica sintética y la química medicinal y farmacéutica descritas aquí, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de la misma, son los bien conocidos y comúnmente usados en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéuticas, y tratamiento de pacientes.

Los siguientes términos, salvo que se indique lo contrario, se entenderán que tienen los siguientes significados:

Una "glicoproteína" es una proteína que tiene oligosacáridos unidos covalentemente a cadenas laterales polipeptídicas.

Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina de origen natural, cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (alrededor de 25 kDa) y una cadena "pesada" (alrededor de 50-70 kDa). La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de alrededor de 100 a 110 o más aminoácidos, principalmente responsable del reconocimiento de antígenos. La porción carboxi terminal de cada cadena define una región constante, principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de alrededor de 12 o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región "D" de alrededor de 10 aminoácidos más. Véase en general, Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo de modo que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión.

Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción de unión a antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica, a menos que se especifique lo contrario. Las porciones de unión a antígeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno incluyen, entre otras, Fab, Fab', F(ab')<2>, Fv, anticuerpos de dominio (dAbs), fragmentos que incluyen regiones determinantes de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos, y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al polipéptido.

Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos usando técnicas bien conocidas en la técnica, y se contempla el uso de tales fragmentos o análogos con las formulaciones de la presente invención.

Formulaciones

La presente invención se refiere a formulaciones de proteínas, y en particular, a formulaciones de proteínas sólidas y estables como se definen en las reivindicaciones.

Dado que ciertos aspectos de la invención se refieren a formulaciones de proteínas que pueden almacenarse y usarse en una variedad de condiciones ambientales (por ejemplo, amplios intervalos de temperatura), la invención proporciona formulaciones que mantienen la estabilidad de las proteínas en una variedad de estas condiciones ambientales. Además de los constituyentes de formulación específicos expuestos aquí, las formulaciones de la invención pueden comprender además uno o más vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980), siempre que no afecten negativamente a las características deseadas de la formulación.

La formulación comprende un aminoácido como estabilizador, que es histidina. Las concentraciones de estabilizadores de aminoácidos en las formulaciones de la invención pueden oscilar de 0,1 mM a 100 mM antes de solidificarse, dependiendo de las propiedades deseadas. En una realización, la formulación no comprende una proteína estabilizadora adicional (por ejemplo, albúmina).

La concentración de histidina es 10 mM.

En realizaciones adicionales, las formulaciones pueden comprender un amortiguador que no es un aminoácido. En una realización específica, el amortiguador que no es un aminoácido es succinato de sodio. Las concentraciones de amortiguadores que no son aminoácidos en las formulaciones de la invención pueden oscilar de 0,1 mM a 100 mM antes de solidificarse, dependiendo de las propiedades deseadas.

En una realización, la concentración de succinato de sodio es 0,1 mM a 100 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 0,1 mM a 50 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 0,1 mM a 40 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 0,1 mM a 30 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 0,1 mM a 20 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 0,1 mM a 15 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 0,1 mM a 10 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 0,1 mM a 5 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 0,1 mM a 1 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 1 mM a 100 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 1 mM a 50 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 1 mM a 40 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 1 mM a 30 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 1 mM a 20 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 1 mM a 15 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 1 mM a 10 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 5 mM a 50 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 5 mM a 25 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 5 mM a 15 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 0,1 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 0,5 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 1 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 2 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 3 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 4 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 5 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 6 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 7 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 8 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 9 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 10 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 11 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 12 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 13 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 14 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es 15 mM.

En una realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 100 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 50 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 40 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 30 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 20 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 15 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 10 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 5 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 1 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 100 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 50 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 40 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 30 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 20 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 15 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 10 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 5 mM a alrededor de 50 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 5 mM a alrededor de 25 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 5 mM a alrededor de 15 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 0,1 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 0,5 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 1 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 2 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 3 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 4 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 5 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 6 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de

7 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 8 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 9 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 10 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 11 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 12 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 13 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 14 mM. En otra realización, la concentración de succinato de sodio es alrededor de 15 mM.

En realizaciones adicionales, el amortiguador es glutamato de sodio. Las concentraciones de glutamato de sodio pueden oscilar de 0,1 mM a 100 mM antes de solidificarse, dependiendo de las propiedades deseadas.

En una realización, la concentración de glutamato de sodio es 0,1 mM a 100 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 0,1 mM a 50 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 0,1 mM a

40 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 0,1 mM a 30 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 0,1 mM a 20 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 0,1 mM a 15 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 0,1 mM a 10 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 0,1 mM a 5 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 0,1 mM a 1 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 1 mM a 100 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 1 mM a 50 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 1 mM a 40 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 1 mM a 30 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 1 mM a 20 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 1 mM a 15 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 1 mM a 10 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 5 mM a 50 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 5 mM a 25 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 5 mM a 15 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 0,1 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 0,5 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 1 mM.

En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 2 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 3 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 4 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 5 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 6 mM.

En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 7 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 8 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 9 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 10 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 11 mM.

En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 12 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 13 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 14 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es 15 mM.

En una realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 100 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 50 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 40 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor otra realizació concentración de glutamato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor otra realizació concentración de glutamato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor otra realizació concentración de glutamato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor otra realizació concentración de glutamato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor otra realizació concentración de glutamato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 1 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 100 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 50 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 40 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 30 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 20 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 15 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 10 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 5 mM a alrededor de 50 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 5 mM a alrededor de 25 mM.

En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 5 mM a alrededor de 15 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 0,1 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 0,5 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor

de 1 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 2 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 3 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 4 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 5 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 6 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 7 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 8 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 9 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 10 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 11 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 12 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 13 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 14 mM. En otra realización, la concentración de glutamato de sodio es alrededor de 15 mM.

En realizaciones adicionales, las formulaciones pueden comprender una sal inorgánica o una sal orgánica. En ciertas realizaciones, estas sales funcionan como amortiguadores en la formulación de proteínas. Los ejemplos no limitativos de una sal inorgánica incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, e hidrogenocarbonato de sodio. Los ejemplos no limitativos de una sal orgánica incluyen citrato de sodio, citrato de potasio y acetato de sodio. En una realización específica, la sal inorgánica es fosfato de sodio. Las concentraciones de sales inorgánicas u orgánicas en las formulaciones de la invención pueden oscilar de 0,1 mM a 100 mM antes de solidificarse, dependiendo de las propiedades deseadas.

En una realización, la concentración de fosfato de sodio es 0,1 mM a 100 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 0,1 mM a 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 0,1 mM a 40 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 0,1 mM a 30 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 0,1 mM a 20 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 0,1 mM a 15 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 0,1 mM a 10 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 0,1 mM a 5 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 0,1 mM a 1 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 1 mM a 100 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 1 mM a 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 1 mM a 40 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 1 mM a 30 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 1 mM a 20 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 1 mM a 15 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 1 mM a 10 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 5 mM a 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 5 mM a 25 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 5 mM a 15 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 0,1 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 0,5 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 1 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 2 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 3 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 4 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 5 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 6 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 7 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 8 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 9 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 10 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 11 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 12 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 13 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 14 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es 15 mM.

En una realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 100 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 40 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 30 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 20 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 15 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 10 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 5 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 0,1 mM a alrededor de 1 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 100 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 40 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 30 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 20 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 15 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 1 mM a alrededor de 10 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 5 mM a alrededor de 50 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 5 mM a alrededor de 25 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 5 mM a alrededor de 15 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 0,1 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 0,5 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 1 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 2 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 3 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 4 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 5 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 6 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 7 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 8 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 9 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 10 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 11 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 12 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 13 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 14 mM. En otra realización, la concentración de fosfato de sodio es alrededor de 15 mM.

La formulación de proteína comprende un alcohol de azúcar, que es manitol. La concentración de manitol es alrededor de 2%.

La formulación de comprende un azúcar, que es sacarosa. La concentración de sacarosa es alrededor de 0,5%.

La formulación de comprende un tensioactivo, que es polisorbato 80. La concentración de polisorbato 80 es alrededor de 0,005%.

En una realización, la concentración de polisorbato 20 está entre alrededor de 0,0001% y alrededor de 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre alrededor de 0,001% y alrededor de 0,5%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre alrededor de 0,001% y alrededor de 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre alrededor de 0,005% y alrededor de 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre alrededor de 0,005% y alrededor de 0,05%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre alrededor de 0,01% y alrededor de 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre alrededor de 0,5% y alrededor de 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,009%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,008%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,007%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,006%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,005%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,004%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,003%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,002%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,001%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,01%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,02%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,03%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,04%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,05%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,06%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,07%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,08%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,09%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es alrededor de 0,5%.

En una realización, la concentración de polisorbato 20 está entre 0,0001% y 0,01%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre 0,001% y 0,5%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre 0,001% y 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre 0,005% y 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre 0,005% y 0,05%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre 0,01% y 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 está entre 0,5% y 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,009%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,008%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,007%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,006%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,005%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,004%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,003%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,002%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,001%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,01%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,02%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,03%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,04%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,05%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,06%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,07%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,08%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,09%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,1%. En otra realización, la concentración de polisorbato 20 es 0,5%.

En una realización, el pH está entre alrededor de 5,0 y alrededor de 8,0 antes de solidificarse. En otra realización, el pH está entre alrededor de 4,0 y alrededor de 10,0. En otra realización, el pH está entre alrededor de 5,0 y alrededor de 7,0. En otra realización, el pH está entre alrededor de 5,0 y alrededor de 9,0. En otra realización, el pH está entre alrededor de 6,0 y alrededor de 9,0. En otra realización, el pH es alrededor de 5,0. En otra realización, el pH es alrededor de 5,5. En otra realización, el pH es alrededor de 6,0. En otra realización, el pH es alrededor de 6,5. En otra realización, el pH es alrededor de 7,0. En otra realización, el pH es alrededor de 7,5. En otra realización, el pH es alrededor de 8,0. En otra realización, el pH es alrededor de 8,5. En otra realización, el pH es alrededor de 9,0. En otra realización, el pH es alrededor de 9,5. En otra realización, el pH es alrededor de 10,0.

En otra realización, el pH está entre 6,0 y 8,0 antes de solidificarse. En otra realización, el pH está entre 4,0 y 10,0. En otra realización, el pH está entre 5,0 y 7,0. En otra realización, el pH está entre 5,0 y 9,0. En otra realización, el pH está entre 6,0 y 9,0. En otra realización, el pH es 5,0. En otra realización, el pH es 5,1. En otra realización, el pH es 5,2. En otra realización, el pH es 5,3. En otra realización, el pH es 5,4. En otra realización, el pH es 5,5. En otra realización, el pH es 5,6. En otra realización, el pH es 5,7. En otra realización, el pH es 5,8. En otra realización, el pH es 5,9. En otra realización, el pH es 6,0. En otra realización, el pH es 6,1. En otra realización, el pH es 6,2. En otra realización, el pH es 6,3. En otra realización, el pH es 6,4. En otra realización, el pH es 6,5. En otra realización, el pH es 6,6. En otra realización, el pH es 6,7. En otra realización, el pH es 6,8. En otra realización, el pH es 6,9. En otra realización, el pH es 7,0. En otra realización, el pH es 7,5. En otra realización, el pH es 8,0. En otra realización, el pH es 8,5. En otra realización, el pH es 9,0. En otra realización, el pH es 9,5. En otra realización, el pH es 10,0.

En una realización, la concentración de proteína está entre alrededor de 0,01 mg/ml y alrededor de 10 mg/ml. En una realización, la concentración de proteína está entre alrededor de 0,01 mg/ml y alrededor de 1 mg/ml. En una realización, la concentración de proteína está entre alrededor de 0,1 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml mM antes de solidificarse. En otra realización, la concentración de proteína está entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml. En una realización, la concentración de proteína está entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 50 mg/ml. En una realización, la concentración de proteína está entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 25 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 10 mg/ml. En una realización, la concentración de proteína está entre alrededor de 5 mg/ml y alrededor de 50 mg/ml. En una realización, la concentración de proteína está entre alrededor de 5 mg/ml y alrededor de 25 mg/ml. En una realización, la concentración de proteína está entre alrededor de 10 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml. En una realización, la concentración de proteína está entre alrededor de 10 mg/ml y alrededor de 50 mg/ml. En una realización, la concentración de proteína está entre alrededor de 10 mg/ml y alrededor de 25 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 0,01 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 0,05 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 0,1 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 0,2 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 0,3 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 0,4 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 0,5 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 1 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 2 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 3 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 4 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 5 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 6 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 7 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 8 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 9 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 10 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 20 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 30 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 40 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 50 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 60 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 70 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 80 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 90 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es alrededor de 100 mg/ml.

En una realización, la concentración de proteína está entre 0,01 mg/ml y 10 mg/ml. En una realización, la concentración de proteína está entre 0,01 mg/ml y 1 mg/ml. En una realización, la concentración de proteína está entre 0,1 mg/ml y 100 mg/ml mM antes de solidificarse. En otra realización, la concentración de proteína está entre 1 mg/ml y 100 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 1 mg/ml y 50 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 1 mg/ml y 25 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 1 mg/ml y 10 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 5 mg/ml y 50 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 5 mg/ml y 25 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 10 mg/ml y 100 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 10 mg/ml y 50 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína está entre 10 mg/ml y 25 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 0,01 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 0,05 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 0,1 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 0,2 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 0,3 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 0,4 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 0,5 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 1 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 2 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 3 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 4 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 5 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 6 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 7 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 8 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 9 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 10 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 20 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 30 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 40 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 50 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 60 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 70 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 80 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 90 mg/ml. En otra realización, la concentración de proteína es 100 mg/ml.

Las formulaciones de proteínas sólidas abarcan, pero no se limitan a, formulaciones de proteínas que comienzan en un estado líquido y posteriormente se les elimina el líquido (es decir, que pasan de una disolución de proteína hidratada a una disolución de proteína deshidratada). Ejemplos no limitativos de métodos para lograr esto incluyen liofilización (también llamada secado por congelación o criodesecación) o secado por pulverización. En la liofilización, el material se congela y deshidrata rápidamente en condiciones de vacío, lo que da como resultado la sublimación del líquido de la fase sólida a la fase gaseosa. El secado por pulverización es un método para producir un polvo seco a partir de un líquido o una suspensión secando rápidamente con un gas caliente. Los procesos de liofilización y secado por pulverización son bien conocidos en la técnica, y pueden optimizarse fácilmente para producir el resultado deseado. Véanse también Lyophilization of Biopharmaceuticals, Biotechnology: Pharmaceutical Aspects, Henry R. Costantino (Editor), Michael J. Pikal (Editor); Lyophilization: Introduction and Basic Principles, Thomas A. Jennings, CRC Press, 1999; y Freeze-Drying/Lyophilization Of Pharmaceutical & Biological Products, Segunda Edición: Revisada y Ampliada (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Louis Rey (Editor), Joan C. May (Editor), CRC Press 2004. En una realización, la formulación de proteína sólida está liofilizada. En otra realización, la formulación de proteína sólida se seca por pulverización. A lo largo de esta descripción, puede haber referencia a "antes de solidificarse", lo que significa la formulación de proteína en estado líquido antes de eliminar el líquido como se describió anteriormente.

Un aspecto de la invención es proporcionar formulaciones de proteínas (tanto sólidas como líquidas) que sean estables y mantengan su estabilidad a través de una variedad de temperaturas diferentes y durante períodos de tiempo prolongados. Esta propiedad es útil por una variedad de razones diferentes, que incluyen, pero no se limitan a, la facilidad de almacenamiento en una amplia variedad de entornos clínicos.

En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos un mes a entre 4 grados C y 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos dos meses a entre 4 grados C y 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos tres meses a entre 4 grados C y 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos cuatro meses a entre 4 grados C y 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos cinco meses a entre 4 grados C y 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos seis meses a entre 4 grados C y 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos doce meses a entre 4 grados C y 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos dieciocho meses a entre 4 grados C y 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos veinticuatro meses a entre 4 grados C y 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos treinta y seis meses a entre 4 grados C y 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos cuarenta y ocho meses a entre 4 grados C y 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos sesenta meses a entre 4 grados C y 45 grados C.

En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos alrededor de un mes a entre alrededor de 4 grados C y alrededor de 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos alrededor de dos meses a entre alrededor de 4 grados C y alrededor de 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos alrededor de tres meses a entre alrededor de 4 grados C y alrededor de 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos alrededor de cuatro meses a entre alrededor de 4 grados C y alrededor de 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos alrededor de cinco meses a entre alrededor de 4 grados C y alrededor de 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos alrededor de seis meses a entre alrededor de 4 grados C y alrededor de 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos alrededor de doce meses a entre alrededor de 4 grados C y alrededor de 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos alrededor de dieciocho meses a entre alrededor de 4 grados C y alrededor de 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos alrededor de veinticuatro meses a entre alrededor de 4 grados C y alrededor de 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos alrededor de treinta y seis meses a entre alrededor de 4 grados C y alrededor de 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos alrededor de cuarenta y ocho meses a entre alrededor de 4 grados C y alrededor de 45 grados C. En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante al menos alrededor de sesenta meses a entre alrededor de 4 grados C y alrededor de 45 grados C.

En una realización, la formulación de proteína sólida es estable durante alrededor de un mes a alrededor de 4 grados C, alrededor de 29 grados C, alrededor de 37 grados C, y/o alrededor de 45 grados C. En una realización adicional, la formulación de proteína sólida es estable durante alrededor de dos meses a alrededor de 4 grados C, alrededor de 29 grados C, alrededor de 37 grados C, y/o alrededor de 45 grados C. En una realización adicional, la formulación de proteína sólida es estable durante alrededor de tres meses a alrededor de 4 grados C, alrededor de 29 grados C, alrededor de 37 grados C, y/o alrededor de 45 grados C. En una realización adicional, la formulación de proteína sólida es estable durante alrededor de cuatro meses a alrededor de 4 grados C, alrededor de 29 grados C, alrededor de 37 grados C, y/o alrededor de 45 grados C. En una realización adicional, la formulación de proteína sólida es estable durante alrededor de cinco meses a alrededor de 4 grados C, alrededor de 29 grados C, alrededor de 37 grados C, y/o alrededor de 45 grados C. En una realización adicional, la formulación de proteína sólida es estable durante alrededor de seis meses a alrededor de 4 grados C, alrededor de 29 grados C, alrededor de 37 grados C, y/o alrededor de 45 grados C. En una realización adicional, la formulación de proteína sólida es estable durante alrededor de doce meses a alrededor de 4 grados C, alrededor de 29 grados C, alrededor de 37 grados C, y/o alrededor de 45 grados C. En una realización adicional, la formulación de proteína sólida es estable durante alrededor de dieciocho meses a alrededor de 4 grados C, alrededor de 29 grados C, alrededor de 37 grados C, y/o alrededor de 45 grados C. En una realización adicional, la formulación de proteína sólida es estable durante alrededor de veinticuatro meses a alrededor de 4 grados C, alrededor de 29 grados C, alrededor de 37 grados C, y/o alrededor de 45 grados C. En una realización adicional, la formulación de proteína sólida es estable durante alrededor de treinta y seis meses a alrededor de 4 grados C, alrededor de 29 grados C, alrededor de 37 grados C, y/o alrededor de 45 grados C. En una realización adicional, la formulación de proteína sólida es estable durante alrededor de cuarenta y ocho meses a alrededor de 4 grados C, alrededor de 29 grados C, alrededor de 37 grados C, y/o alrededor de 45 grados C. En una realización adicional, la formulación de proteína sólida es estable durante alrededor de sesenta meses a alrededor de 4 grados C, alrededor de 29 grados C, alrededor de 37 grados C, y/o alrededor de 45 grados C.

Aún en una realización adicional, la formulación de proteína sólida se reconstituye con un líquido. En una realización, la formulación de proteína sólida se reconstituye con agua. En otra realización, la formulación de proteína sólida se reconstituye con una disolución de reconstitución que comprende sorbitol y cloruro de sodio. En ciertas realizaciones, la concentración de sorbitol es 4%, la concentración de cloruro de sodio es 0,7%, y el pH es 7. En realizaciones adicionales, la formulación de proteína sólida se reconstituye con una disolución de reconstitución que además comprende alcohol bencílico. En una realización específica, la concentración de alcohol bencílico es 1%. En realizaciones adicionales, el líquido usado para reconstituir la formulación de proteína sólida es estéril.

En una realización específica, la invención proporciona una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (0,5 a 5 mg/ml), histidina 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, polisorbato-800,005%, a pH 7, antes de solidificarse.

En una realización específica, la invención proporciona una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (2 mg/ml), histidina 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, polisorbato-80 0,005%, a pH 7, antes de solidificarse.

También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (0,5 a 5 mg/ml), fosfato sódico 10 mM, manitol 4,5%, sacarosa 0,5%, polisorbato-800,005%, a pH 6, antes de solidificarse.

También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (0,5 a 5 mg/ml), fosfato sódico 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, polisorbato-800,005%, a pH 7, antes de solidificarse.

También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (0,5 a 5 mg/ml), succinato sódico 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, polisorbato-800,005%, a pH 7, antes de solidificarse.

También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (0,5 a 5 mg/ml), succinato sódico 10 mM, manitol 4,5%, sacarosa 0,5%, polisorbato-800,005%, a pH 6, antes de solidificarse.

También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (0,5 a 5 mg/ml), fosfato sódico 20 mM, NaCl 140 mM, polisorbato-80 0,005%, a pH 6,2, antes de solidificarse.

También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (0,5 a 5 mg/ml), histidina 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, a pH 7, antes de solidificarse.

También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (2 mg/ml), histidina 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, a pH 7, antes de solidificarse.

También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (0,5 a 5 mg/ml), fosfato sódico 10 mM, manitol 4,5%, sacarosa 0,5%, a pH 6, antes de solidificarse.

También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (0,5 a 5 mg/ml), fosfato sódico 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, a pH 7, antes de solidificarse.

También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (0,5 a 5 mg/ml), succinato sódico 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, a pH 7, antes de solidificarse.

También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (0,5 a 5 mg/ml), succinato sódico 10 mM, manitol 4,5%, sacarosa 0,5%, a pH 6, antes de solidificarse.

También se describe, pero no según la invención, una formulación de proteína sólida que consiste, que consiste esencialmente en, o que comprende: Aranesp (0,5 a 5 mg/ml), fosfato sódico 20 mM, NaCl 140 mM, a pH 6,2, antes de solidificarse.

En otra realización, la invención proporciona un método para preparar una formulación de proteína sólida y estable, comprendiendo dicho método: a) diluir dicha proteína con un amortiguador de liofilización; y b) liofilizar dicha proteína diluida, antes de solidificarse.

En ciertas realizaciones, las formulaciones de la invención comprenden una glicoproteína. En una realización, la proteína es eritropoyetina. En otra realización, la proteína es un análogo de la eritropoyetina. En una realización adicional, la proteína es darbepoetina alfa. En aún una realización adicional, la proteína es un anticuerpo. En aún otra realización, la proteína es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

La eritropoyetina es una hormona glicoproteica implicada en la maduración de las células progenitoras eritroides en eritrocitos. Es esencial para regular los niveles de glóbulos rojos en circulación. La eritropoyetina natural es producida por el hígado durante la vida fetal y por el riñón de los adultos, circula en la sangre, y estimula la producción de glóbulos rojos en la médula ósea. La anemia es casi invariablemente una consecuencia de insuficiencia renal debido a la disminución de la producción de eritropoyetina en el riñón. Se ha descubierto que la eritropoyetina recombinante producida mediante técnicas de ingeniería genética que implican la expresión de un producto proteico de una célula hospedante transformada con el gen que codifica la eritropoyetina es eficaz cuando se usa en el tratamiento de la anemia resultante de la insuficiencia renal crónica.

La identificación, clonación y expresión de genes que codifican la eritropoyetina se describe en la patente de EE.UU. n° 4.703.008. Una descripción de la purificación de eritropoyetina recombinante a partir de medio celular que soporta el crecimiento de células de mamífero que contienen plásmidos de eritropoyetina recombinante, por ejemplo, se incluye en la patente de EE.UU. n° 4.667.016. La expresión y recuperación de eritropoyetina recombinante biológicamente activa a partir de hospedantes de células de mamíferos que contienen el gen de eritropoyetina en plásmidos recombinantes ha puesto a disposición cantidades de eritropoyetina adecuadas para aplicaciones terapéuticas. Se conocen las secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de varias especies de eritropoyetina.

Actualmente, existen en el mercado varios productos farmacéuticos de eritropoyetina humana recombinante (por ejemplo, Epogen®; epoetina alfa). Además de la epoetina alfa, se han desarrollado otras epoetinas (por ejemplo, epoetina beta, delta, omega, zeta). En el contexto de la presente invención, se pretende que todas las formas de eritropoyetinas queden abarcadas cuando se usa el término "eritropoyetina" o "eritropoyetina humana recombinante".

También están abarcadas por la invención ciertas formulaciones que comprenden análogos de la eritropoyetina humana. En ciertas realizaciones, la frase "análogo de la eritropoyetina humana" se refiere a eritropoyetina con uno o más cambios en la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana, lo que da como resultado un aumento en el número de sitios para la unión del ácido siálico. Un ejemplo no limitativo es la darbepoetina alfa (Aranesp®), un análogo hiperglicosilado de la eritropoyetina humana. Los sitios añadidos para la glicosilación en estos análogos pueden dar como resultado un mayor número de cadenas de hidratos de carbono, y un mayor contenido de ácido siálico, que la eritropoyetina humana. También se proporcionan análogos de eritropoyetina que comprenden secuencias de aminoácidos que incluyen la reordenación de al menos un sitio para la glicosilación. También se incluyen análogos que comprenden una adición de uno o más aminoácidos al extremo carboxi terminal de la eritropoyetina, en los que la adición proporciona al menos un sitio de glicosilación. Se pueden generar análogos mediante mutagénesis dirigida al sitio que tienen adiciones, eliminaciones o sustituciones de restos de aminoácidos que aumentan o alteran los sitios que están disponibles para la glicosilación. Estos análogos pueden tener una mayor cantidad de cadenas de hidratos de carbono que la eritropoyetina humana. Véase además, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.27.217.689.

En otro aspecto, la presente invención proporciona formulaciones que comprenden anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos, muteínas de anticuerpos, y variantes de anticuerpos, que se unen específicamente a la eritropoyetina humana.

Los anticuerpos pueden comprender cualquier región constante conocida en la técnica. La región constante de cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda, por ejemplo una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda humana. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma, o mu, por ejemplo una región constante de cadena pesada de tipo alfa, delta, épsilon, gamma, o mu humana. En una realización, la región constante de cadena ligera o pesada es un fragmento, derivado, variante, o muteína de una región constante de origen natural.

En una realización, un anticuerpo comprende además los dominios kappa o lambda de cadena ligera constante o un fragmento de estos. Las secuencias de las regiones constantes de la cadena ligera, y los polinucleótidos que las codifican, son bien conocidos en la técnica. En otra realización, un anticuerpo comprende además un dominio constante de cadena pesada, o un fragmento del mismo, tal como la región constante de cadena pesada de IgG1 o IgG2; tales secuencias son bien conocidas en la técnica.

Los anticuerpos incluyen aquellos que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE e IgD), así como fragmentos Fab o F(ab<')2>de los mismos. Además, si se desea una IgG4, también se puede desear introducir una mutación puntual en la región bisagra como se describe en Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407, (incorporado aquí como referencia) para aliviar una tendencia a formar enlaces de disulfuro dentro de la cadena H que pueden conducir a heterogeneidad en los anticuerpos IgG4.

El término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe ampliamente en la sección Definiciones. Un anticuerpo puede comprender una molécula de anticuerpo completa (incluyendo versiones policlonales, monoclonales, quiméricas, humanizadas, o humanas que tienen cadenas pesadas y/o ligeras de longitud completa), o comprender un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos F(ab')<2>, Fab, Fab', Fv, Fc y Fd, y pueden incorporarse en anticuerpos de dominio único, anticuerpos monocatenarios, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). También se incluyen polipéptidos de anticuerpos, tales como los descritos en la patente de Ee . UU. n.° 6.703.199, incluidos monocuerpos de polipéptidos de fibronectina. Otros polipéptidos de anticuerpos se describen en la publicación de patente de EE. UU. 2005/0238646, que son polipéptidos monocatenarios.

La invención proporciona formulaciones de proteínas estables. El término estable, en ciertas realizaciones no limitativas, se refiere a la estructura y actividad de la proteína. En ciertas realizaciones, estable significa que la proteína mantiene la secuencia de aminoácidos y la estructura de conformación adecuadas. Ejemplos no limitativos de métodos para analizar esto incluyen ensayos de unión de anticuerpos o electroforesis en gel.

En ciertas realizaciones, un aspecto de la estabilidad es el porcentaje de oxidación medido durante un período de tiempo de almacenamiento. Al oxidarse una proteína, puede perder actividad, entre otras propiedades. En una realización, la proteína en las formulaciones de la presente invención tiene un porcentaje de oxidación de entre alrededor de 5% y alrededor de 10%. En otra realización, la proteína en las formulaciones de la presente invención tiene un porcentaje de oxidación menor que alrededor de 10%. En otra realización, la proteína en las formulaciones de la presente invención tiene un porcentaje de oxidación menor que alrededor de 5%. En una realización, la proteína en las formulaciones de la presente invención tiene un porcentaje de oxidación de entre 5% y 10%. En otra realización, la proteína en las formulaciones de la presente invención tiene un porcentaje de oxidación menor que 10%. En otra realización, la proteína en las formulaciones de la presente invención tiene un porcentaje de oxidación menor que 5%.

Aún en otras realizaciones, estable significa que la proteína presente en la formulación tiene y conserva un efecto biológico. Los ejemplos no limitativos incluyen bioensayos que miden el efecto de la proteína en una línea celularin vitro, o bioensayos que miden el efecto de la proteína en un animalin vivo.

Las formulaciones de proteínas de la presente invención se pueden administrar a un paciente a través de diversas vías y de forma apropiada para la indicación y la composición. Las formulaciones de proteínas de la presente invención se pueden administrar mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo, pero sin limitarse a, la administración parenteral. Si se inyecta, la formulación se puede administrar, por ejemplo, por vía intraarticular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutánea, mediante inyección en bolo, o infusión continua.

Las dosis y la frecuencia de administración pueden variar según factores tales como la vía de administración, la proteína particular empleada, la naturaleza y gravedad de la enfermedad a tratar, si la afección es aguda o crónica, y el tamaño y estado general de la sujeto. Las dosis apropiadas pueden determinarse mediante procedimientos conocidos en la técnica pertinente, por ejemplo en ensayos clínicos que pueden implicar estudios de aumento de dosis.

Se proporcionan kits para uso por médicos y/o sujetos, que incluyen una o más proteínas en una formulación de la invención y una etiqueta u otras instrucciones para uso en el tratamiento de cualquiera de las afecciones analizadas aquí. En una realización, el kit incluye una preparación estéril de una o más proteínas en una formulación liofilizada de la invención, y una disolución reconstituyente estéril, separada, y estas pueden estar en uno o más viales.

Una vez descrita la invención, los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

1. Objetivo

El objetivo de este estudio fue investigar la viabilidad del desarrollo de una formulación de Aranesp® estable a temperatura ambiente para tener ventajas en el manejo y almacenamiento. La formulación comercial actual es una formulación líquida que se almacena a 2-8C. La formulación liofilizada no es una formulación preferida en el mercado, ya que necesita ser reconstituida e inyectada con un procedimiento de dos etapas. Desde LyoTip®, un dispositivo que ofrece una manera conveniente de administrar formulación liofilizada como jeringas precargadas de líquido al combinar tanto el procedimiento de reconstitución como de inyección en una sola etapa sin interrupciones, se investigaron formulaciones liofilizadas para un estudio de estabilidad de almacenamiento a largo plazo para una formulación estable a temperatura ambiente en vial de vidrio de 3 cc.

2. Sumario de experimentos

Aranesp® (2 mg/mL) se formuló en cinco formulaciones liofilizadas mediante diálisis de Aranesp® a granel, y la estabilidad en almacenamiento se comparó con la formulación líquida en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,2. La muestra dializada (0,25 ml) se introdujo en un vial de vidrio de 3 cc y se liofilizó. Las muestras liofilizadas se almacenaron a 4°C, 29°C, 37°C, y 45°C durante 24 meses para determinar su estabilidad en almacenamiento. En cada momento, las muestras se reconstituyeron con 1 ml de tres disoluciones de reconstitución (se utilizó agua para P45MSu6 y S45MSu6; sorbitol 4% y cloruro de sodio 0,7% para P2MSu7, S2MSu7 y H2MSu7) para obtener una concentración final de 500 pg/ml. Las muestras reconstituidas se analizaron para SEC-HpLC (HPLC de exclusión de tamaño), anticuerpo 9G8A (monitorización con relación a la falta de plegamiento de proteínas), pH, % de oxidación, RP-HPLC (impurezas y clips), partículas subvisibles, concentración, y osmolaridad.

3. Material y equipo

Se usaron los siguientes materiales: Material a granel de Aranesp (2 mg/ml), Polisorbato 80, viales de vidrio de 3 cc, tapones largos Daikyo para liofilización. Se prepararon los siguientes seis amortiguadores de formulación:

• P2MSu7: Fosfato de sodio 10 mM, 2 % manitol, 0,5 % sacarosa, pH 7 (lote n.° 29070904-11)

• S2MSu7: Succinato de sodio 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, pH 7 (lote n.° 29070904-21)

• H2MSu7: Histidina 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, pH 7 (lote n.° 29070904-19)

• P45MSu6: Fosfato de sodio 10 mM, manitol 4,5%, sacarosa 0,5%, pH 6 (lote n.° 29070627-18)

• S45MSu6: Succinato de sodio 10 mM, manitol 4,5%, sacarosa 0,5%, pH 6 (lote n.° 29070627-19)

• P62N: Fosfato de sodio 20 mM, NaCl 140 mM, pH 6,2

El equipo adicional usado incluyó: Para la liofilización, se usó un casete de diálisis Slide-A Lyser (Pierce), un filtro Corning (0,22 pm), una cámara fría para dializar las muestras durante 2 días, y un liofilizador Virtis.

4. Procedimiento de preparación de muestras

4.1. Preparación de las muestras

Aranesp® (2 mg/ml) se dializó en cinco amortiguadores de formulación en una cámara fría (2-8°C) durante 2 días usando un casete de diálisis Slide-A Lyser. Se comprobó el pH y la osmolaridad del amortiguador a temperatura ambiente antes de dializar las muestras. Después de la diálisis, la concentración de la muestra se comprobó mediante A280. Las muestras se prepararon con polisorbato-80 al 0,005% y sin polisorbato-80. Las muestras con polisorbato-80 se prepararon añadiendo una disolución madre de polisorbato-80 al 10% (p/v) a la muestra para obtener un 0,005%. La disolución de polisorbato-80 al 10% se preparó pesando 2,5 g de polisorbato-80, y se disolvió con 25 ml de cada amortiguador. Las muestras se filtraron usando un filtro Corning (0,22 pm) en una campana estéril. La muestra filtrada y el placebo (0,25 ml) se rellenaron en un vial de vidrio de 3 cc, y se sometieron a un ciclo de liofilización usando el liofilizador Virtis (Tabla 1). La muestra líquida en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, polisorbato-80 0,005%, pH 6,2, se preparó añadiendo polisorbato-80 en la masa para obtener un 0,005%. Las muestras de control líquidas, las muestras liofilizadas y los placebos se almacenaron a 4°C, 29°C, 37°C y 45°C durante 24 meses para determinar su estabilidad en almacenamiento. En cada momento, las muestras se reconstituyeron con 1 ml de tres disoluciones de reconstitución (se utilizó agua para P45MSu6 y S45MSu6; sorbitol 4% y cloruro de sodio 0,7% para P2MSu7, S2MSu7 y H2MSu7) para obtener una concentración final de 500 pg/ml. Cuando las muestras (0,25 ml) con polisorbato-800,005% se reconstituyeron con 1 ml del amortiguador de reconstitución respectivo, la muestra contenía 0,00125% de polisorbato-80, ya que se diluyó con 1 ml del amortiguador de reconstitución. Las muestras reconstituidas se analizaron para SEC-HPLc (HPLC de exclusión de tamaño), 9G8A (monitorización con relación a la falta de plegamiento de proteínas), pH, % de oxidación, y RP-HPLC no reducida (impurezas y recortes).

La lista de muestras, los puntos de tiempo, y la temperatura se indican en el Apéndice 1.

4.2. Procedimiento de liofilización:

Los viales de las muestras se cargaron en estantes previamente enfriados (4°C) de un liofilizador. Las muestras se sometieron a tres etapas de congelación, secado primario y secado secundario. Primero, las muestras se mantuvieron durante 60 minutos a 4°C, y después se enfriaron de 4°C hasta -50°C durante 180 min. La temperatura del estante se elevó hasta -12°C durante 70 min después de mantenerla a -45°C durante 60 min. Luego, la temperatura se redujo nuevamente hasta -50°C durante 70 minutos después de mantenerla a -12°C durante 360 minutos.

Las muestras estuvieron a -50°C durante 60 min. Para el secado primario, la temperatura del estante se elevó hasta -10°C durante 40 min, y se mantuvo durante 1500 min manteniendo el vacío de la cámara a 50 mTorr. Para el secado secundario, la temperatura del estante se elevó hasta 25°C durante 350 min, y se mantuvo durante 720 min. Después, la temperatura se redujo hasta 5°C durante 140 min. Una vez finalizados todos los ciclos, se colocó el tapón en el vial dentro de la cámara de secado.5

Tabla 1.Procedimiento de liofilización mediante liofilizador Virtis.

5. Métodos analíticos

5.1. Método 9G8A

5.1.1. Método 9G8A 1

El ensayo se analizó usando el instrumento Bioveris hasta 12 meses. Las muestras se diluyeron hasta 0,4 gg/ml con diluyente (BSA al 1% y PS-80 al 0,1% en PBS) usando dilución en serie. También se preparó una dilución de curva patrón con el diluyente. Se cargaron 10 gl de cada muestra en una placa de 96 pocillos por cuadruplicado. Después, la placa se incubó a temperatura ambiente en oscuridad durante una hora. Se añadieron a cada pocillo 50 gl de anticuerpo 9G8A marcado con TAG (5 gl de 9G8A por 3 ml de diluyente), y la placa se incubó durante otra hora. Se añadieron a los pocillos 50 gl de anticuerpo policlonal de cabra conjugado con biotina (5 gl de cabra con biotina por 3 ml de diluyente), y se incubaron durante otra hora. Se añadieron 25 gl de perlas de estreptavidina a los pocillos, y se incubaron durante 30 minutos. Por último, se añadieron a los pocillos 115 gl de 1 x-PBS. La placa se analizó usando el analizador Bioveris M-8. Se dio el valor ECL (enzimático-quimioluminiscente), y el valor ECL se convirtió en porcentaje de desnaturalización relativa.

5.1.2. Método 9G8A 2

Puesto que la compañia BioVeris no podía ayudar con la instrumentación, tuvimos que desarrollar un método manual. Las muestras se analizaron usando el nuevo método 9G8A a partir del mes 18. Se añadió disolución de anticuerpo 9G8A diluida (100 gl) a cada uno de los pocillos necesarios para el conjunto de análisis. La placa se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después, la placa se lavó tres veces con diluyente (BSA al 1% y PS-80 al 0,1% en PBS), y se secó entre lavados. A cada uno de los pocillos se transfirieron 100 gl de patrón diluido, de control o de muestras. Después de una hora de incubación, el líquido de la placa se decantó y se lavó tres veces. Se añadió una disolución de anticuerpo secundario, y se incubó durante otra hora. El líquido de la placa se decantó y se lavó nuevamente. Se añadieron 100 gl de HRP a cada uno de los pocillos, y se incubaron durante otros 30 minutos. El líquido se decantó de la placa y se lavó 3 veces con diluyente. Se añadieron a cada pocillo 100 gl del reactivo sustrato preparado, y la placa se colocó en el lector de placas para el análisis.

5.2. Cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC)

Se usó cromatografía de exclusión por tamaño como ensayo indicador de la estabilidad. Las separaciones se realizaron con un sistema HPLC Agilent 1100 equipado con el software Chromeleon. El método empleó dos columnas (TosoHaas TSK gel G3000SWxl, 7,8 mm x 300 mm) unidas en serie junto con una columna protectora (TSKgel Guard Column SWXL 6,0 mm x 4,0 cm). Se cargaron 10 gg de proteína en la columna, y se eluyeron isocráticamente a un caudal de 0,5 ml/min con una fase móvil que consistía en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,2. La proteína se monitorizó mediante detección UV a 215 nm y 280 nm. Se usó el porcentaje del área del pico frente al recuento del área total en el cromatograma para cuantificar las cantidades de especies de alto peso molecular (HMW) y especies de bajo peso molecular (LMW).

5.3. Porcentaje de oxidación

La detección de oxidación de metionina 54 se realizó mediante un análisis de mapa de péptidos modificado. La eliminación de los azúcares de las muestras requirió filtración (Millipore Microcon Centrifugal Filter

Dispositivos Ultracel YM-10) mediante centrifugación (12000 rpm durante 20 minutos a 25°C). El volumen de la muestra se llevó nuevamente con agua a la concentración original para la digestión con tripsina. Las muestras se diluyeron hasta 20 gg/ml con amortiguador de dilución (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, polisorbato 80 0,005%, pH 6,2). Se añadió amortiguador de digestión (metionina 10 mM en Tris-HCl 500 mM, pH 8) en una relación de 1:10 de amortiguador de digestión a volumen total. Después se añadió tripsina (1 mg/ml) en una relación de 1:5 de tripsina a concentración final de proteína (en gg). Las muestras se incubaron a 29°C durante 15 horas, y después se inactivaron con 10 gl de TFA al 25%.

La detección de la oxidación empleó un análisis de cromatografía de fase reversa en el que se separaron 2 gg (100 gl) de muestra cargada en una columna C8 (Phenomenex Develosil 5u 300C8-HG 300A 150 x 2,0 mm) usando un gradiente escalonado a un caudal de 2 ml/minuto. (La fase móvil A, que consistía en 40% de acetonitrilo y 0,1% de TFA, se ejecutó durante 5 minutos. A continuación, la fase móvil B, que consistía en 46% de actetonitrilo y 0,1% de TFA, se aumentó del 0% al 100% en 0,15 minutos, y se ejecutó durante 15 minutos. Finalmente, la fase móvil A se ejecutó durante 10 minutos). La temperatura de la columna se fijó en 55°C. El análisis de cromatografía se realizó en un sistema Beckman HPLC Gold acoplado a un espectrómetro de masas Thermo LCQ Deca para la cuantificación de iones. La detección de los picos se realizó a 214 nm (UV), y el análisis de espectrometría de masas (modo de ión único) usó un barrido con zoom en m/z seleccionados: 1264 (sin oxidar), 1272 (oxidado), 1342 (parcialmente sin oxidar) y 1350 (parcialmente oxidado). Los datos se informaron como % de oxidación.

5.4. Fase inversa no reducida

Se usó cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa no reducida (NRRP-HPLC) para determinar el contenido y la pureza de la proteína, ya que los productos de degradación se detectan fácilmente con esta técnica. Se usó HPLC de fase inversa no reducida (NRRP) para separar las especies de recorte del monómero de eritropoyetina de longitud completa. Las medidas se realizaron con una cromatografía de líquidos de alto rendimiento Shimadzu usando una columna de sílice de fase unida C4 Phenomenex Jupiter de 5 gm, 300 A (150 x 4,6 mm). La fase móvil A era ácido trifluoroacético al 0,0651% (v/v) en agua, y la fase móvil B era ácido trifluoroacético al 0,0651% en acetonitrilo al 90%. Las muestras se analizaron mediante un sistema de gradiente de 20% B a 100% B en 135 min, a un caudal de 1,0 ml/min con detección a 215 nm. La superposición del cromatograma se usó para comparar la detección de especies de degradación o de recorte.

5.5. pH

El pH de la muestra se monitorizó usando un pH-metro Mettler Toledo MP200. El instrumento se calibró usando amortiguadores patrón de pH 4 y pH 7.

5.6. Osmolaridad

Los datos de osmolaridad se usaron para determinar el porcentaje de amortiguador de reconstitución.

La osmolaridad se midió con un microosmómetro de Advanced Instruments, Inc, modelo 330. Se usó como referencia el patrón de 290 mOsm.

6. Resultados y discusión

6.1.9G8A

La similitud conformacional de las muestras del producto se evaluó usando un ensayo de unión al anticuerpo 9G8A (Elliott, Chang et al. 1996, Elliott, Lorenzini et al. 1996). El anticuerpo monoclonal 9G8A reconoce un epítopo lineal, ERYLL, que consiste en los aminoácidos 13-17, tanto en Aranesp nativa como desnaturalizada. Estos aminoácidos quedan más expuestos después de un cambio conformacional en o la desnaturalización de Aranesp, lo que permite una mayor unión a 9G8A. Los datos se representaron como una relación de reactividad de la muestra con respecto a la de un patrón de darbepoetina alfa. Un valor de 1 indica que no hay diferencias en la reactividad entre la muestra y el patrón.

Las formulaciones liofilizadas sin (A) o con (B) polisorbato-80 mostraron ser más estables que la formulación líquida hasta 24 meses de almacenamiento a 37°C. La formulación líquida P62N mostró una mayor desnaturalización relativa a temperaturas más altas (Figura 1).

6.2. Detección de agregación mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

La mayoría de las formulaciones liofilizadas de Aranesp, excepto la muestra en P45MSu6, demostraron más estabilidad que la formulación líquida a temperaturas más altas (37°C y 45°C) hasta 24 meses de almacenamiento (Figura 3). Además, la degradación aumenta con la temperatura.

El método de SE-HPLC usado en este estudio no separa el pico de polisorbato de las especies de HMW. Por lo tanto, se ha observado un ligero aumento en el % de especies de HMW para las muestras que contienen polisorbato en comparación con las muestras que no contienen polisorbato-80 (Figuras 3 y 6). No hubo diferencias significativas entre la formulación liofilizada a 4°C y 29°C; sin embargo, se observó que P45MSu6T tenía una mayor degradación en comparación con otra formulación liofilizada a 37°C y 45°C (Figuras 5 y 6). Se ha observado que H2MSu7 era más estable que otras formulaciones (Figura 4). La muestra en la formulación H2MSu7 mostró el menor pico de dímero (flecha) en la superposición después de almacenarse durante 24 meses a 45°C. Además, no hubo diferencias significativas entre las muestras reconstituidas con sorbitol o cloruro de sodio.

6.3. Medida del pH

Hubo menos de 10% de cambio en la mayoría de las formulaciones en todas las temperaturas (4°C, 29°C, 37°C y 45°C) durante 24 meses de almacenamiento.

6.4. Porcentaje de oxidación

La metionina reside en la posición 54 en Aranesp, y es propensa a la oxidación. Es esta oxidación de las muestras digeridas con tripsina la que se cuantificó mediante análisis de LC/MS. Los datos mostrados son % de oxidación. Después de 24 meses de almacenamiento a 4°C, todas las formulaciones liofilizadas mostraron igual o menor oxidación que las formulaciones líquidas (Figura 8). Además, no se observaron diferencias entre los tres amortiguadores de reconstitución. La adición de Polisorbato-80 no mostró ningún efecto significativo sobre la estabilidad de las formulaciones liofilizadas.

El almacenamiento a temperaturas elevadas (29°C, 37°C, y 45°C) durante hasta 24 meses dio como resultado que todas las formulaciones liofilizadas expresaran niveles de oxidación significativamente más bajos que las formulaciones líquidas para los tres tipos de reconstitución, aunque la oxidación aumentó a medida que aumentaba la temperatura (Figuras 9-11). Sin embargo, la histidina sin formulación liofilizada de polisorbato tuvo una oxidación significativamente mayor en comparación con todas las demás formulaciones liofilizadas a los 12 meses. No se observaron diferencias entre los amortiguadores de reconstitución de cloruro de sodio y sorbitol. Dos formulaciones liofilizadas adicionales, histidina con polisorbato y fosfato, también mostraron una oxidación elevada cuando se almacenaron a 45°C durante hasta 24 meses (pero la formulación de fosfato mostró el resultado con la reconstitución con agua). Finalmente, aunque la formulación líquida que contiene polisorbato mostró una mayor oxidación que la formulación líquida que no contiene polisorbato, no se observaron diferencias significativas en las formulaciones liofilizadas.

6.5. Degradación y detección de especies de recorte mediante HPLC de fase inversa no reducida

La HPLC de fase inversa no reducida se usa para detectar especies de degradación y de recorte. En la Figura 12 se muestran superposiciones de cromatogramas de cromatografía de fase inversa no reducida de Aranesp® después de almacenarla durante 24 meses a 45°C. La Figura 13 mostró la superposición de cromatogramas después de almacenarlos durante 24 meses a 37°C. Las tres muestras liofilizadas no mostraron ninguna especie de degradación 0 de recorte con dos diluyentes reconstituidos diferentes después de almacenarlas durante 24 meses a 4°C, 29°C, 37°C y 45°C. Sin embargo, la muestra de formulación líquida se degradó mucho para ambas temperaturas. El pico principal de la muestra en la formulación líquida casi se apagó a 45°C.

7. Conclusiones

Se evaluó la estabilidad de formulaciones liofilizadas de Aranesp a temperatura ambiente hasta 45°C y 24 meses. Los datos obtenidos sugieren que no hay cambios significativos en los atributos evaluados tales como agregados, recortes, especies no plegadas y oxidación. Las formulaciones que contenían menos manitol al 2% mostraron un mejor perfil de estabilidad en comparación con las formulaciones de manitol al 4,5%. Los datos obtenidos de esta factibilidad sugieren que la formulación liofilizada de Aranesp es estable a temperatura ambiente hasta al menos 45°C y al menos 24 meses.

Apéndice 1.

Título: Factibilidad para desarrollar una formulación de Aranesp liofilizada estable a temperatura ambiente con LyoTip

Objetivo:Para desarrollar y optimizar la formulación de liofilización NESP para LyoTip, se liofilizaron 0,25 ml (2 mg/ml) de cada formulación y se prepararon para estudios de estabilidad a cuatro temperaturas. Esta muestra se diluirá con 1 ml de disolución de reconstitución para obtener 500 pg/ml.

Temperatura y condición de almacenamiento:4°C, 29°C, 37°C, 45°C

Intervalo:0, 1,3, 6, 12, 18, 24 meses

Amortiguador:succinato de sodio, fosfato de sodio, histidina

Conc. formulada:Concentración inicial: Alrededor de 2 mg/ml. Concentración de muestra reconstituida: alrededor de 500 pg/ml

Concentración de polisorbato:0,005 %

ARANESP: Concentración: 2 mg/ml

Vials:Tipo vial de 3 cc, los viales se lavaron y esterilizaron.

Tapón:tapón de liofilización

Preparación de muestras:

1. Diversos amortiguadores:

1. P2MSu7: Fosfato de sodio 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, pH 7 -11)

2. S2MSu7: Succinato de sodio 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, pH 7

3. H2MSu7: Histidina 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, pH 7

4. P45MSu6: Fosfato de sodio 10 mM, manitol 4,5%, sacarosa 0,5%, pH 6

5. S45MSu6: Succinato de sodio 10 mM, manitol 4,5%, sacarosa 0,5%, pH 6

2. Formulación de liofilización:

La masa de Aranesp (100 ml por formulación) se dializó en amortiguador de formulación en una cámara fría durante 2 días usando un Slide-A Lyser para dializar. Después de la diálisis, la concentración se midió mediante UV-Vis.

3. Preparación de las muestras:

A cada muestra, añada una disolución de polisorbato al 10% en agua para obtener una formulación de polisorbato al 0,005%. Cada muestra se filtró utilizando un filtro de jeringa de 0,22 pm en una campana estéril.

a. Muestra sin polisorbato

Para las muestras de liofilización, rellene 0,25 ml de muestra en un vial de 3 cc, y se usa un tapón de liofilización. La muestra de P62N500 permanecerá como una disolución líquida para control.

b. Muestra con polisorbato

c. Placebo sin polisorbato

d. Placebo con polisorbato

4. Descripción de la muestra 5

5. Constitución de muestra para análisis: Reconstituya la muestra con 1 ml de la siguiente disolución en cada punto de tiempo

a. Agua para P45MSu6 y S45MSu6

Para P2MSu7, S2MSu7 y H2MSu7, use la siguiente disolución

b. Sorbitol 3%: 1 ml

C. cloruro de sodio 0,45%: 1 ml

Análisis y puntos de tiempo:

1 ml por vial de muestra

Método analítico:

columna C4 Júpiter 300A; 250 x 4,6 mm; S./N.: 202394, lote no. 5267-4

Fase móvil; A-0,065% TFA en agua, B-0,065% TFA en 95% Acetonitrilo,

Tiempo de ejecución: 145 min, caudal 0,75 ml/min,

Detección: 215 nm, 230 nm, 280 nm

Gradiente: 20% B (5 min); 20 % - 70 % B (100 min); lavado y equilibrado

(40 min)

Carga de muestra: 3 gg

SEC HPLC:

Columna: Dos columnas de TSK G3000swxl, caudal isocrático de 0,5 ml/min, tiempo de ejecución de 80 min, amortiguador fosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 0,5 M a pH 6,9

Detección: 215 nm, 230 nm, 280 nm, inyección para amortiguador: 100 gl,

Muestra de HSA y Tween: 3 gg.

Informe a 215 nm para el área total y el % del pico principal del área total.

Lista de muestras por punto de tiempo

EJEMPLO 2

1. Objetivo

Se seleccionó una formulación de liofillzación de Aranesp del Ejemplo 1 anterior; el estudio de compatibilidad del vial de plástico CZ (Diakyo Crystal Zenith) frente al vial de vidrio fue necesario porque LyoTip® está hecho de material de plástico Crystal Zenith. En este estudio, se realizó la comparabilidad del recipiente (Daikyo Crystal Zenith) con el vial de vidrio sobre el efecto de la estabilidad en almacenamiento de Aranesp® y la posibilidad de la formulación de Aranesp® que no pica. Para una formulación que no pica, se usó alcohol bencílico al 1% con cloruro de sodio al 0,7% en una disolución de pH 7,0 para reconstituir la muestra liofilizada.

2. Sumario de experimentos

Aranesp® (1,84 mg/ml) se formuló en histidina 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, polisorbato 80 0,005%, pH 7, mediante diálisis del amortiguador de formulación de Aranesp (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6.2) . La muestra dializada (0,25 ml) se cargó en viales Crystal Zenith de 2 cc y viales de vidrio de 3 cc, y se liofilizó. Las muestras liofilizadas se almacenaron a 4°C, 29°C, 37°C, y 45°C durante 12 meses para determinar su estabilidad en almacenamiento. En cada momento, las muestras se reconstituyeron con 1 ml de tres disoluciones de reconstitución (NaCl al 0,70%, pH 7; NaCl al 0,70% más alcohol bencílico al 1%, pH 7,0; NaCl al 0,70%, pH 7 con PS-80 al 0,004%) para hacer la concentración final de 500 pg/ml. Las muestras reconstituidas se analizaron para SE-HPLC (HPLC de exclusión de tamaño), 9G8A (monitorización con relación a la falta de plegamiento de proteínas), pH, % de oxidación, RP-HPLC (impurezas y recortes), partículas subvisibles, concentración, y osmolaridad.

3. Materiales y equipo

3.1. Aranesp granel (1,84 mg/ml)

3.2. Polisorbato-80

3.3. Viales de vidrio soplado de 3 cc (vidrio tipo 1 EP)

3.4. Viales Diakyo Crystal Zenith (DS CZ VIAL 2 ml 13 mm fabricados por West. Como tapón, se usaron tapones largos Daikyo para liofilización.

3.5. Histidina 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, pH 7 (H2MSu7)

3.6. El casete de diálisis Slide-A Lyser se obtuvo de Pierce.

3.7. Para la filtración se usó un filtro Corning (0,22 pm).

3.8. Las muestras se dializaron durante dos días en cámara frigorífica.

3.9. Para la liofilización se usó el liofilizador Virtis.

4. Procedimiento de preparación de muestras

Aranesp® (1,84 mg/ml) se formuló en histidina 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, polisorbato 80 0,005%, pH 7, mediante diálisis del amortiguador de formulación de Aranesp (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6.2) en una cámara fría (2-8°C) durante 2 días usando un casete de diálisis Slide-A Lyser. Se comprobó el pH y la osmolaridad del amortiguador a temperatura ambiente antes de la diálisis. Después de la diálisis, se comprobó la concentración de la muestra. Se añadió una disolución madre de polisorbato-80 al 1% (p/v) a la muestra para obtener un 0,005%. La disolución de polisorbato-80 al 1% se preparó añadiendo 0,25 g de polisorbato 80 a 25 ml de amortiguador HM2MSu7. Las muestras se filtraron usando un filtro Corning (0,22 pm) en una campana estéril. La muestra filtrada (0,25 ml) se rellenó en dos tipos diferentes de viales (Crystal Zenith y vial de vidrio) y se sometió a un ciclo de liofilización en el edificio 8 usando el liofilizador Virtis (Tabla 2). Se liofilizaron 0,25 ml de placebos y formulación que contenía proteínas, y se almacenaron a 4°C, 29°C, 37°C y 45°C durante 12 meses para determinar su estabilidad en almacenamiento. En cada momento, las muestras se reconstituyeron con 1 ml de tres disoluciones de reconstitución (NaCl al 0,70%, pH 7; NaCl al 0,70% más alcohol bencílico al 1%, pH 7,0; NaCl al 0,70%, pH 7 con PS-80 al 0,004%) para hacer la concentración final de 500 pg/ml. Las muestras reconstituidas se analizaron para SEC-HPLC (HPLC de exclusión de tamaño), 9G8A (monitorización con relación a la falta de plegamiento de proteínas), pH, % de oxidación, RP-HPLC no reducida (impurezas y recortes), partículas subvisibles, concentración, y osmolaridad. La lista de muestras, los puntos de tiempo, y la temperatura se indican en los Apéndices 1 y 2.

Tabla 2.Ciclo de liofilización

5. Método analítico

5.1. Método 9G8A

Las muestras se diluyeron según se requirió de 0,34 a 4,2 gg/ml en 1x PBS, 1% de BSA, 0,1% de amortiguador polisorbato-80, y se distribuyeron en una placa de 96 pocilios. Se añadieron cincuenta gl de anticuerpo anti-rHuEPO 9G8A (2 gg/ml) marcado con TAG (BioVeris), y las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador de placas. Entonces se añadieron cincuenta gl de un anticuerpo anti-rHuEPO de conejo biotinilado purificado por afinidad (concentración madre 0,5 gg/ml), y las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en el agitador de placas. A continuación, se añadieron 25 gl de perlas recubiertas de estreptavidina (concentración madre, 0,566 gg/ml) diluidas a 0,6 gg/ml en disolución amortiguada con fosfato (PBS) 1x, seroalbúmina bovina al 1%, y polisorbato-80 al 0,1%, y las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la placa agitadora. La placa se transfirió a un analizador M8 (IGEN International, Gaithersburg, MD), y la señal quimioluminiscente se midió según las instrucciones del fabricante. La señal quimioluminiscente se convirtió en una relación de muestra y patrón Aranesp a granel, y se informó como reactividad relativa, siendo 1 igual al patrón, e indicando los valores >1 desnaturalización de las proteínas.

5.2. Cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC)

Se usó cromatografía de exclusión por tamaño como ensayo indicador de la estabilidad. Las separaciones se realizaron con un sistema HPLC Agilent 1100 equipado con el software Chromeleon. El método empleó dos columnas (TosoHaas TSK gel G3000SWxl, 7,8 mm x 300 mm) unidas en serie junto con una columna protectora (TSKgel Guard Column SwXL 6,0 mm x 4,0 cm). Se cargaron 10 gg de proteína en la columna y se eluyeron isocráticamente a un caudal de 0,5 ml/min, con una fase móvil que consistía en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, pH 6,2. La proteína se monitorizó mediante detección UV a 215 nm y 280 nm. Se usó el porcentaje del área del pico frente al recuento del área total en el cromatograma para cuantificar las cantidades de especies de alto peso molecular (HMW) y especies de bajo peso molecular (LMW).

5.3. Concentración

Las concentraciones de proteína se determinaron mediante espectroscopía UV/VIS usando un sistema de espectrofotómetro UV/Vis Agilent modelo 8453 que usa el software Chemstation. La absorción a 280 nm se determinó usando la ley de Beer con un coeficiente de extinción de 0,98 en una cubeta con una longitud de recorrido de 1 cm.

5.4. Análisis de partículas subvisibles con HIAC

HIAC monitorizó el recuento de partículas subvisibles en el intervalo 2-25 gm. Antes del análisis, las muestras se desgasificaron a vacío durante 1 hora con la tapa abierta. Se realizaron cuatro medidas de 0,2 ml para cada muestra, y antes de las medidas de las muestras se usó agua Millipore para obtener el blanco del sistema. Se descartó la primera serie, y las tres últimas se promediaron para obtener los recuentos acumulativos por mililitro. Según las directrices de la USP, se monitorizaron tamaños de partículas de 2, 5, 7,5, 10, 15, 20, y 25 gm.

5.5. % de oxidación

Se llevó a cabo un ensayo de detección de oxidación que incluyó digestión de la muestra con tripsina, seguido de cromatografía de fase reversa con detección por espectrometría de masas (RP-HPLC/MS). Se usó el ensayo de oxidación de LC/MS para determinar el porcentaje de metionina 54 oxidada. Se prepararon disoluciones de todas las muestras a 500 pl o 10 pg de muestra 0,02 mg/ml en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 140 mM, polisorbato 80 al 0,005%, a pH 6,2. Entonces se añadieron a la muestra 50 pl de Tris-HCl 0,5 M, metionina 10 mM, a pH 8,0. Se añadió tripsina (2 pl de 1 mg/ml) a la muestra, y se incubó durante la noche a 29°C. La muestra se inactivó con 10 pl de TFA al 25%. El análisis de las muestras se realizó usando un Beckman HPLC System Gold (Osiris, System ID # 408774) acoplado a un espectrómetro de masas LCQ Deca (Promasseous). El caudal fue 0,20 ml/min usando el método isocrático con 42% de acetonitrilo, 0,1% de TFA como fase móvil, columna Zorbax 300SB-C8 (150 x 2,1 mm, 5 pm, 300 Angstrom, referencia: 883750-906) a 60°C de temperatura. La detección se realizó a 215 y 280 nm con UV, y se usó un barrido con zoom en m/z seleccionadas: 1264 (sin oxidar), 1272 (oxidado), 1342 (parcialmente sin oxidar) y 1350 (parcialmente oxidado). El porcentaje de producto oxidado se evaluó utilizando las relaciones de picos de péptidos específicos.

5.6. Fase inversa no reducida

Se usó cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa no reducida (NRRP-HPLC) para determinar el contenido y la pureza de la proteína, ya que los productos de degradación se detectan fácilmente con esta técnica. Se usó HPLC de fase inversa no reducida (NRRP) para separar las especies de recorte del monómero de eritropoyetina de longitud completa. Las medidas se realizaron con un cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento Shimadzu usando una columna de sílice de fase unida C4 Phenomenex Jupiter de 5 pm, 300 A (150 x 4,6 mm, 00F-4167-E0). La fase móvil A era ácido trifluoroacético al 0,0651% (v/v) en agua, y la fase móvil B era ácido trifluoroacético al 0,0651% en acetonitrilo al 90%. Las muestras se analizaron mediante un sistema de gradiente de 20% B a 100% B en 135 min, a un caudal de 1,0 ml/min con detección a 215 nm. La superposición del cromatograma se usó para comparar la detección de especies de degradación o de recorte.

5.7. Medida del pH

5.8. Determinación de la osmolaridad

6. Resultados y discusión

6.1.9G8A

No hubo diferencias significativas al comparar entre diferentes diluyentes de reconstitución, incluido el alcohol bencílico y el polisorbato-80. Sin embargo, hubo un ligero aumento en la desnaturalización relativa a temperaturas más altas para las muestras en el vial de Crystal Zenith (CZ) en comparación con las muestras en el vial de vidrio. Los resultados se resumen en la Figura 22.

No hubo diferencias significativas en el % de especies de HMW (Figura 23) en Aranesp® cuando se compararon tres diluyentes de reconstitución diferentes, incluido el alcohol bencílico y el polisorbato-80, hasta 37°C. Sin embargo, hubo un ligero aumento en las especies de alto peso molecular a 45°C para las muestras en viales de vidrio en comparación con las muestras en viales de Crystal Zenith (CZ) (Figura 23). El Aranesp® en vial de CZ mostró un mayor % de pico principal que las muestras en el vial de vidrio a 45°C (Figura 24).

6.3. Análisis de partículas subvisibles,

No se observó ninguna tendencia en el recuento de partículas entre muestras en viales de vidrio y de cz. Los recuentos de partículas se mantuvieron por debajo de las directrices de la USP para partículas de 10 pm y 25 pm tanto en muestras de proteína como de placebo en las cuatro temperaturas (Figura 25). Las directrices de la USP es <6.000 partículas por recipiente para partículas >10 pm, y <600 partículas por recipiente para partículas >25 pm.

6.4. Inspección visual

Las muestras en el vial de CZ almacenadas a 4°C durante 12 meses mostraron que la torta liofilizada se derritió tanto para la proteína como para el placebo en el vial de CZ (Figura 26). Muestra que la humedad penetra en el vial de CZ.

6.5. Medida de la concentración

La concentración de proteína disminuyó ligeramente después de 12 meses de almacenamiento en muestras a 4°C en un vial de CZ. Sin embargo, en otras temperaturas y puntos de tiempo, no hubo diferencias en la concentración de proteínas entre las muestras y los recipientes.

6.6. % de oxidación

El % de oxidación de Aranesp almacenado durante 12 meses a cuatro temperaturas diferentes (4°C, 29°C, 37°C y 45°C) se muestra en la Figura 28. La velocidad de oxidación más rápida observada para las muestras en viales de CZ en comparación con las muestras en viales de vidrio a 29°C, 37°C y 45°C. Después de 12 meses de incubación, las muestras en el vial de CZ mostraron alrededor de 25% de oxidación, mientras que las muestras en el vial de vidrio mostraron alrededor de 5% de oxidación a una temperatura de almacenamiento de 29°C. La diferencia es más significativa para el almacenamiento a mayor temperatura. No hubo diferencias entre los tres amortiguadores de reconstitución (cloruro de sodio al 0,7%, alcohol bencílico al 1% o polisorbato-80 al 0,004%) para cuatro temperaturas (4°C, 29°C, 37°C y 45°C) hasta 12 meses de almacenamiento.

6.7. Degradación y detección de especies de recorte mediante HPLC de fase inversa no reducida

Se usó HPLC de fase inversa no reducida para detectar las especies de degradación y de recorte. En la Figura 29 se muestran superposiciones de cromatogramas de cromatografía de fase inversa no reducida de Aranesp® después de almacenarla durante 12 meses a cuatro temperaturas diferentes. Las muestras liofilizadas en viales de CZ o en viales de vidrio no mostraron ninguna especie de degradación ni de recorte con tres diluyentes reconstituidos diferentes después del almacenamiento durante 12 meses a 4°C, 29°C, 37°C y 45°C.

6.8. Medida del pH

El pH inicial no cambió durante el tiempo de almacenamiento y a cuatro temperaturas diferentes (Figura 30).

6.9. Medida de la osmolaridad

Las muestras reconstituidas con alcohol bencílico muestran una osmolaridad mayor que otras muestras para las cuatro temperaturas. No hay diferencia entre muestras en diferentes recipientes. Aunque hay un valor atípico en muestras a 4°C, no hay tendencia. Los resultados se resumen en la Figura 31.

7. Conclusiones

Investigamos una posible reformulación de Aranesp que puede almacenarse a temperatura ambiente durante al menos 2 años y que no pica.

Usando la formulación liofilizada de Aranesp (histidina 10 mM, manitol 2%, sacarosa 0,5%, polisorbato 800,005%, pH 7) y tres amortiguadores de reconstitución (cloruro de sodio al 0,7%, alcohol bencílico al 1%, polisorbato-80 al 0,004%), se realizó un estudio comparativo preliminar del recipiente para determinar la estabilidad de Aranesp en el vial de Daikyo Crystal Zenith (CZ) frente al vial de vidrio. La degradación física y química se monitorizó mediante SE-HPLC, % de oxidación, pH, RP-HPLC, e inmunoensayo con 9G8A. El resultado no muestra diferencias entre los amortiguadores de reconstitución (cloruro de sodio al 0,7%, alcohol bencílico al 1%, polisorbato-80 al 0,004%) y diferentes recipientes (vial de CZ y de vidrio), basado en el análisis de 9G8A (falta de plegamiento), partículas subvisibles, RP-HPLC (recortes) y SE-HPLC (agregación). Sin embargo, se observó una disminución de la estructura de la torta y un mayor porcentaje de oxidación en las muestras en viales de CZ en comparación con las muestras en viales de vidrio. Esto demostró que el vial de CZ era susceptible a la penetración de humedad y oxígeno. Este estudio demostró que se puede usar alcohol bencílico al 1% como amortiguador de reconstitución para evitar el picor. Además, la liofilización de la formulación de Aranesp a pH 7 puede reducir el efecto picante que puede almacenarse a temperatura ambiente durante al menos 2 años.

Apéndice 1. Lista de muestras

A n i 2.P n i m f h .

Ejemplo 3

Sumario

Se desarrolló una formulación liofilizada de anticuerpo monoclonal anti-EPO para una formulación estable a temperatura ambiente. Se investigaron dos formulaciones liofilizadas y dos concentraciones (100 ug/ml, 500 ug/ml).

1. GMST: glutamato de sodio 10 mM (de ácido glutámico), 4% de manitol, 2% de sacarosa, 0,01% de polisorbato 20, pH 5,2

2. HMST: histidina 10 mM, 4% de manitol, 2% de sacarosa, 0,01% de polisorbato 20, pH 6,0 Las muestras en la formulación de histidina mostraron un % de pico principal ligeramente mayor que en el amortiguador de glutamato según los resultados de SE-HPLC. En general, las muestras de dos formulaciones no mostraron ningún cambio significativo en la agregación, la conformación general y la estabilidad térmica después de la incubación a 372C durante hasta 12 semanas.

Materiales:

mAb anti-EPO 8C10 (véase la publicación de solicitud de patente de EE.UU. No. 20130295113A1, número de solicitud 13/888.777)

Amortiguador de formulación:

• GMST: glutamato de sodio 10 mM (de ácido glutámico), 4% de manitol, 2% de sacarosa, 0,01 % de polisorbato 20, pH 5,2

• HMST: histidina 10 mM, 4% de manitol, 2% de sacarosa, 0,01% de polisorbato 20, pH 6,0

T l . i ri i n l m r mA ni EP

Métodos:

Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

Se utilizó el método de exclusión por tamaño (SEC) para monitorizar el monómero y las especies de alto peso molecular (HMWS), tal como el dímero, y la agregación. El método empleó dos columnas (Tosoh G3000SWxl, 7,8 mm x 300 mm) unidas en serie junto con una columna protectora (TSKgel Guard Column SWXL 6,0 mm x 4,0 cm) que usa una HPLC Agilent 1100 (Nombre: KGB). El caudal fue isocrático de 0,5 ml/min, con una fase móvil que consistía en fosfato de sodio 50 mM; cloruro de sodio 300 mM, pH 6,8. La detección de proteína se monitorizó mediante detección UV a 215 nm. Se utilizó el recuento de área porcentual frente al recuento de área total para el % de pico principal y el % de pico de HMW (alto peso molecular).

Método de CE-SDS reducido

El método de CE-SDS se realizó usando Beckman Coulter PA-800 (dos caras) con una apertura de 100 x 800 y sílice fundida desnuda, 50 um de diámetro interior a 20 cm (longitud efectiva) y 30 cm (longitud total) con el kit Beckman SDS-MW. . Los datos se recogieron usando el software Beckman Karat 32. Las integraciones de picos se realizaron usando Chromeleon, y se usó Excel para calcular el % de pureza en función del área corregida. Se concentraron 1,0 ml de muestras de 100 mcg/ml de<g>M<s>T 100 y HMST 100, y 200 ul de 500 mcg/ml de GMST 500 y HMST 500 hasta un volumen final de 45 ul usando Nanospin de 30K MWCO. Se añadieron 50 ul de amortiguador de muestras y 5 ul de 2-mercaptoetanol, y se calentaron a 70°C durante 10 minutos; después se cargaron en un tubo de muestras de PCR para el ensayo de CE-SDS.

DSC

La estabilidad térmica de las muestras se evaluó mediante DSC en un sistema MicroCal VP-Capillary DSC, en el que las diferencias de temperatura entre la celda de referencia y la de muestra se miden continuamente y se calibran en unidades de potencia. Este canal de datos se conoce como señal DP o potencia diferencial entre la celda de referencia y la de muestra. La falta de plegamiento de las moléculas de proteínas aparece como una transición endotérmica en el termograma DSC, y puede caracterizarse por las temperaturas de transición térmica (fusión) (Tm). Las muestras se calentaron de 4°C hasta 110°C a una velocidad de calentamiento de 60°C/hora. El tiempo de barrido previo fue 15 minutos, y el período de filtrado fue 10 segundos. Las concentraciones usadas en los experimentos de DSC fueron 0,1 y 0,5 mg/ml. El análisis de los datos se realizó usando el software MicroCal Origin 7.

Análisis de ultracentrifugación analítica (AUC)

Las muestras se analizaron mediante un instrumento Beckman Coulter ProteomeLab XL-I. Las muestras de mAb anti EPO se almacenaron a 4°C antes del análisis, y se analizaron sin dilución. Los experimentos de velocidad de sedimentación se realizaron a 45.000 rpm después de la absorbancia a 280 nm. Los experimentos se realizaron en conjuntos de celdas centrales de doble sector con ventanas de cuarzo. Los barridos se recogieron a 20°C sin demora entre barridos, 120 barridos por cada muestra. Los datos de AUC-SV se analizaron usando Sedfit v11.8 usando el modelo de "distribución continua c(s)". Los parámetros para los análisis de distribución de c(s) fueron: rango de s de 2 a 30, resolución de 200, y selección de datos para el análisis de 6,4 a 6,8. En el análisis de AUC-SV, se permitió que la relación de fricción, el ruido invariante en el tiempo y la posición del menisco flotaran durante el ajuste de mínimos cuadrados no lineal. Se usó el siguiente parámetro para el análisis de distribución de AUC-SV: volumen específico parcial 0,73 ml/g, densidad y viscosidad de los amortiguadores Glu e His fueron 1,02100 g/ml y 0,01210 Pa.

Método de preparación de muestras

La muestra se dializó frente a dos amortiguadores de formulación a 2-8°C durante 3 días. La concentración de la muestra se midió usando A280 nm después de dializar la muestra. Las muestras se diluyeron o concentraron hasta 100 pg/ml y 500 pg/ml con dos amortiguadores de formulación. Las muestras se filtraron con un filtro de 0,22 pm, se repartieron alícuotas de 1 ml de muestra en un vial de 3 cc, y los viales se taparon. Se guardó algo de muestra para las pruebas del tiempo cero pre-lio. Las muestras se liofilizaron según el procedimiento de liofilización. Después de la liofilización, las muestras se almacenaron en una cámara fría hasta cada punto de tiempo. Las muestras se reconstituyeron con 1 ml de agua en cada punto de tiempo.

Procedimiento de liofilización

Los viales de muestra se cargaron en estantes "preenfriados" (4°C) de un liofilizador. Las muestras se sometieron a tres etapas de congelación, secado primario y secado secundario. En primer lugar, las muestras se mantuvieron durante 30 minutos a 4°C; se enfriaron de 4°C hasta -45°C durante 123 min, y se mantuvieron a 45°C durante 180 min. La temperatura del estante se elevó hasta -12°C durante 150 min después de mantenerla a -45°C durante 180 min. Luego, la temperatura se redujo nuevamente hasta -45°C durante 150 min después de mantenerla a -12°C durante 240 min. Las muestras estuvieron a -45°C durante 120 min. Para el secado primario, la temperatura del estante se elevó hasta -10°C, y se mantuvo durante 25 horas manteniendo el vacío de la cámara a 120 mTorr después de hacer que la temperatura del condensador fuera inferior a -50°C. Para el secado secundario, la temperatura del estante se elevó hasta 25°C durante 234 minutos mientras se bajaba la presión de la cámara hasta 100 mTorr. Después de eso, la temperatura del estante estuvo a 25°C durante 11 horas mientras se mantenía la presión de la cámara a 100 mTorr. Una vez finalizados todos los ciclos, el tapón se colocó en el vial dentro de la cámara de secado.

Resultados y discusión

Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

Ambas muestras liofilizadas mostraron un ligero aumento del % de especies de bajo peso molecular (%LMW) hasta 12 semanas de almacenamiento tanto para el almacenamiento a 4°C como a 37°C (Figura 32). Según datos de 7 semanas a temperatura más alta (37°C), la muestra en la formulación de histidina mostró menos %LMW para 100 pg/ml. También para el % de especies de alto peso molecular (%HMW), la formulación de histidina mostró ligeramente menos que la muestra en la formulación de glutamato a temperatura más alta (Figura 33). Sin embargo, no hubo diferencias antes y después de la liofilización. En general, la muestra en la formulación de histidina mostró un % de pico principal mayor que en la formulación de glutamato (Figura 34). No se evaluó la formulación de histidina a las 12 semanas debido a la disponibilidad de las muestras.

Degradación por Electroforesis Capilar (CE-SDS)

Este método analítico se usa para analizar la cadena pesada (HC), la cadena ligera (LC), la HC no glicosilada (NGHC) y otras especies de picos menores en condiciones reductoras y desnaturalizantes. La CE-SDS reducido separa las proteínas en función de las diferencias en su tamaño hidrodinámico en condiciones reductoras y desnaturalizantes. Las especies de proteínas se unen a SDS, un detergente aniónico, y se inyectan electrocinéticamente en un capilar de sílice fundida desnudo lleno de amortiguador de gel de SDS. Se aplica un voltaje eléctrico a través del capilar, bajo el cual las proteínas recubiertas de SDS se separan por su diferencia en migración en una disolución basada en polímero hidrófilo. Las proteínas son detectadas por un detector de matriz de fotodiodos (PDA) cuando pasan a través de una ventana de detección UV. La pureza se evalúa determinando el porcentaje de área del pico corregido de cada componente. No hubo diferencias significativas entre las formulaciones para el % de cadena pesada (Figura 35), el % de cadena ligera (Figura 36) y el % de cadena pesada no glicosilada (Figura 37) mediante el método de CE-SDS reducido. Los electroferogramas superpuestos mostrados en la Figura 38 demostraron que no se observaron especies de degradación detectables en todas las condiciones probadas a las 7 semanas.

Estabilidad térmica mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC)

Se usó calorimetría diferencial de barrido (DSC) para analizar las muestras de mAb anti-EPO en dos amortiguadores diferentes. Con esta técnica se puede comparar la estabilidad térmica relativa de cada muestra. Los barridos de DSC de las 4 muestras pre-lio en amortiguadores GMST y HMST se muestran en la Figura 39, y las temperaturas de transición térmica se enumeran en la Tabla 3. La desviación estándar típica de las medidas de la temperatura de transición térmica estuvo dentro de ± 0,5°C. Los datos de DSC sugirieron que la estabilidad térmica de las muestras pre-lio era similar en ambos amortiguadores y a ambas concentraciones. La comparación de los barridos de DSC de cada muestra de mAb anti-EPO en diferentes condiciones y puntos de tiempo se muestra en las Figuras 40-43, y las temperaturas de transición térmica también se enumeran en la Tabla 4. Una vez más, los datos de DSC sugirieron que la estabilidad térmica de las muestras permanece similar en ambos amortiguadores y a ambas concentraciones y temperaturas en el tiempo durante hasta 12 semanas. Parecía que el dominio C<h>2 de cada muestra después de 7 semanas se pierde su plegamiento a una temperatura más baja en comparación con el del tiempo cero. Estudios adicionales sugirieron que las diferencias podrían deberse al análisis de las muestras en diferentes momentos.

T l 4. T m r r r n i i n rmi m r

Análisis por ultracentrifugación analítica (AUC) de agregados en mAb anti-EPO

Se usó el método de velocidad de sedimentación por ultracentrifugación analítica (AUC-SV) para determinar la distribución de tamaños de las muestras de mAb anti EPO. Una ventaja importante de AUC-SV es que los análisis se realizan en el amortiguador de formulación real, y no hay preocupación por la pérdida de agregados en una matriz de columna o filtros. Por lo tanto, AUC-SV también puede detectar especies de alto peso molecular (HMWS) reversibles y débilmente asociadas. AUC-SV puede caracterizar dímeros y agregados de orden superior, tanto covalentes como no covalentes, determinar su tamaño, y cuantificar el contenido de agregados.

AUC-SV es una técnica de variabilidad inherentemente alta. El análisis estándar de AUC-SV se realizó a una concentración de proteína de 0,5 mg/ml por triplicado. Parte de las muestras de mAb anti EPO estaban disponibles sólo a 0,1 mg/ml; el análisis a una concentración inferior a 0,5 mg/ml da como resultado una variabilidad mayor de la habitual. Las muestras formuladas a 0,5 mg/ml sólo estaban disponibles en pequeñas cantidades, y por lo tanto los análisis se realizaron en una sola réplica. Los restos del análisis Biacore estuvieron disponibles sólo para tres muestras de 0,5 mg/ml, y éstas se analizaron por duplicado. Además, sólo estaban disponibles muestras de Glu a T=12 semanas.

La distribución del coeficiente de sedimentación de alta resolución c(s) de las muestras de mAb anti EPO se ilustra en la Figura 44. El eje vertical del gráfico muestra la distribución de concentraciones, y el eje horizontal muestra la separación de las especies en función de sus coeficientes de sedimentación. Los gráficos tienen una expansión de 10 veces para una mejor visualización de las pequeñas fracciones de las especies de mayor peso molecular. Todas las muestras analizadas tenían un patrón de distribución muy similar: el HMWS principal detectado en todas las medidas de las réplicas fue dímero, y se detectaron pequeñas cantidades de trímero en algunas réplicas. Los patrones de distribución de tamaños después de T=7 semanas y T=12 semanas (no presentados) fueron similares a los de T=0 semanas presentados en la Figura 13. Se detectaron trazas de especies de LMWS en la mayoría de las réplicas.

Todos los resultados de los análisis de AUC-SV se resumen en la Tabla 5, y para facilitar la interpretación, también se presentan gráficamente en la Figura 45. Como se puede ver a partir de los datos, el contenido de HMWS en todas las muestras varía dentro de 2-5%, y debido a la variabilidad bastante alta del método (las razones discutidas anteriormente), no se puede extraer ninguna conclusión sobre el efecto de la composición del amortiguador (Glu frente a His) o la concentración de proteína (0,1 frente a 0,5 mg/ml). El único efecto observable fue el aumento del contenido de LMWS en la muestra de amortiguador de His: La muestra de PreLio contenía trazas de LMWS por debajo del 0,1%, y aquellas aumentaron en la muestra de PostLio hasta 0,7 ± 0,4%. También hay indicios de un aumento en el contenido de HMWS en el amortiguador de Glu a 37°C después de 12 semanas (7,1%), pero desafortunadamente la muestra correspondiente de His - 37°C - 12 semanas no estaba disponible. Una recomendación de este conjunto experimental sería realizar un experimento mucho más largo (al menos varias veces más que éste) a temperatura elevada (37°C) para observar posibles efectos de la composición del amortiguador y la concentración de proteínas en la estabilidad a largo plazo.

En resumen, AUC-SV no observó ningún efecto detectable de la composición del amortiguador (Glu frente a His) o de la concentración de proteínas (0,1 frente a 0,5 mg/ml) durante el experimento de 7 semanas.

Tabla 5. Sumario de los análisis de AUC-SV de muestras de mAb anti EPO.

Conclusión

En conclusión, las dos formulaciones liofilizadas mantuvieron la estabilidad del anticuerpo durante al menos 12 semanas de almacenamiento a 4°C y 37°C usando SEC, AUC, CE-SDS reducida, y DSC.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación de proteína sólida, que comprende un estabilizador, un alcohol de azúcar, un azúcar y un tensioactivo,

en la que

dicho estabilizador es histidina;

dicho alcohol de azúcar es manitol;

dicho azúcar es sacarosa; y

dicho tensioactivo es polisorbato-80;

y en la que antes de solidificarse, la concentración de histidina es 10 mM, la concentración de manitol es 2%, la concentración de sacarosa es 0,5%, y la concentración de polisorbato-80 es 0,005% (p/v).

2. La formulación de la reivindicación 1, en

que el pH está entre 6,0 y 8,0 antes de solidificarse.

3. La formulación de la reivindicación 2, en

que el pH es 7,0 antes de solidificarse.

4. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la concentración de proteína está entre 0,1 mg/ml y 100 mg/ml antes de solidificarse.

5. La formulación de la reivindicación 4, en la que la concentración de proteína es 2 mg/ml antes de solidificarse.

6. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha proteína es una glicoproteína.

7. La formulación de la reivindicación 6, en

que dicha proteína es darbepoetina alfa.

8. La formulación de la reivindicación 6, en

que dicha proteína es un anticuerpo.

9. La formulación de la reivindicación 8, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

10. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha formulación está liofilizada.

11. Una formulación que comprende la formulación de la reivindicación 10, que se reconstituye con un líquido.

12. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha proteína es estable; opcionalmente en la que dicha proteína es estable durante al menos 1 mes, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses o al menos 24 meses, u opcionalmente en la que dicha proteína es estable a entre 4 y 45 grados C, o en la que dicha proteína es estable a 4 grados C, a 29 grados C, a 37 grados C o a 45 grados C.

13. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el porcentaje de oxidación de dicha proteína está entre 5% y 10%, o en la que el porcentaje de oxidación de dicha proteína es menor que 10%, o en la que el porcentaje de oxidación de dicha proteína es menor que 5%.

14. Un método para preparar la formulación de proteína sólida de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo dicho método:

a) diluir dicha proteína con un amortiguador de liofilización; y

b) liofilizar dicha proteína diluida.

15. Un kit que comprende la formulación de proteína sólida de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un amortiguador de reconstitución.