KR20140125817A

KR20140125817A - 다기능 줄기세포의 심근분화 유도방법

Info

Publication number: KR20140125817A
Application number: KR1020147023632A
Authority: KR
Inventors: 나카츠지 노리오; 미나미 이츠나리; 우에스기 모토나리; 아이바 카즈히로
Original assignee: 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
Priority date: 2012-01-27
Filing date: 2013-01-25
Publication date: 2014-10-29
Also published as: WO2013111875A1; KR101996343B1; EP2808383B1; US9587220B2; EP2808383A4; US20150017718A1; JP6274510B2; EP2808383A1; JPWO2013111875A1

Abstract

본 발명은 다기능 줄기세포의 심근 유도방법에 관한 것으로,
(1) 다기능 줄기세포를 1 이상의 WNT 신호 활성화제를 포함하는 배지 중에서 배양하는 공정; 및,
(2) 공정(1)에서 수득한 세포를 1 이상의 WNT 신호 억제제를 포함하는 배지 중에서 배양하는 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

다기능 줄기세포의 심근분화 유도방법{Method For Inducing Differentiation of Pluripotent Stem Cell Into Cardiac Muscle}

본 발명은 다기능 줄기세포의 심근분화 유도방법에 관한 것이다.

사람의 다기능 줄기세포(human pluripotent stem cells, hPSC)(사람 배아 줄기세포(hESC) 및 사람 인공 다기능 줄기세포(hiPSC)를 포함)는 미분화 상태에서는 무한 증식하고, 심장을 포함하는 사람 조직의 많은 유형의 세포로 분화할 수 있다(비특허문헌 1-7). 따라서, hPSC는 심장질환에 대한 세포기반 치료(cell-based therapy)에 유용하다. 세포기반 치료에는 hPSC에서 기능적인 심근세포의 효율적인 생산이 필요로 된다. 현재 사용되는 가장 일반적인 방법은 배아모양체(embryoid body)의 사이토카인(예를 들면, DKK1, bFGF, 액티빈 A(Activin A) 및 BMP4)과의 현탁배양(suspension culture) 또는 마우스 END2(근위 내배엽(visceral endoderm) 유사 세포)와의 접착 공배양(adhesion co-culture)이다(비특허문헌 13,15-17). 그러나, 이 방법은 효율성이 낮고(심근세포의 생산은 10~50%)(비특허문헌 15), 동물세포 또는 우태아 혈청(FBS)을 사용하는 이종 성분의 오염(xeno-contamination)이 불가피하며(비특허문헌 18), 또한 재조합 사이토카인의 사용은 대규모 생산에 비용 효율이 좋지 않다. 게다가, 지금까지의 연구에 의하면, 심근세포의 유도에 최적인 사이토카인 농도는 개별 hPSC주 간에 서로 다른데(비특허문헌 19), 이는 방법의 최적화가 필요하다는 것을 시사하고 있다. 최근 hPSC주에 의존하지 않는 보편적인 심근 분화방법이 보고되었지만, 이 방법은 효율적인 분화를 위해서는 FBS와 bFGF 및 BMP4와 같은 성장인자를 필요로 한다(비특허문헌 20) .

저분자 화합물은 재조합 사이토카인과 FBS 중의 미지의 인자 대체물의 유력한 후보이며(비특허문헌 21), 대규모 배양을 위한 기지조성 배지 만들기에 적합하다. 지금까지 WNT 신호와 TGF-β 신호와 같은 신호전달 경로를 활성화 또는 억제하기 위해(비특허문헌 22,23) 또는 전사인자에 갈음하여 유전자의 발현을 조절하기 위해(비특허문헌 24,25), 저분자 화합물이 이용되고 있다. 다수의 저분자 화합물이 분화의 촉진과 관련하여 시험 또는 스크리닝되고 있다. BMP 신호 억제제(Dorsomorphin) p38MAPK 신호 억제제(SB203580), WNT 신호 활성화제(BIO) 및 WNT 신호 억제제(XAV939, IWR-1, IWP-1 및 IWP-3)는 심근분화를 촉진하는 것으로 보고되고 있다(비특허문헌 26-32). 그러나, 이러한 처리는 혈청함유 조건에도 10-60%의 심근분화 밖에 얻을 수 없다(비특허문헌 26-32). 대규모 임상 적용을 위하여는, 더 효율적인 분화를 유도하는 저분자 화합물이 요구되고 있다.

본 발명은 효율적인 다기능 줄기세포의 심근분화 유도방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 다기능 줄기세포의 심근분화 유도방법이며, 다음의 각 공정을 포함하는 방법을 제공한다:

(1) 다기능 줄기세포를 1 이상의 WNT 신호 활성화제를 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계 및;

(2) 상기 공정(1)에서 수득한 세포를 1 이상의 WNT 신호 억제제를 포함하는 배지 중에서 배양하는 공정.

.

본 발명은 1 이상의 WNT 신호 활성화제 및/또는 1 이상의 WNT 신호 억제제를 포함하는 심근분화 촉진용 키트로서, 상기 방법에 사용되는 키트를 제공한다.

본 발명에 의하면, 기존의 방법에 비교하여 고효율 저비용으로 다기능 줄기세포의 심근세포로의 분화를 유도할 수 있다.

[도 1] 심근분화를 촉진하는 저분자 화합물의 동정 및 특성 결정
(a) 저분자 화합물 스크리닝의 설명도. 사람 αMHC 프로모터 유도 EGFP(enhanced green fluorescent protein) 유전자 변형 원숭이 ESC와 하이 컨텐츠 분석(HCA) 시스템을 이용하여, 9,600개의 화합물로부터 1개의 히트 화합물이 동정되었다(비특허문헌 47).
(b) 히트 화합물 N11474의 유효시간창(effective time window). 사람 αMHC 프로모터에 의해 유도된 GFP 발현 비율에 근거하면, 4-8일째의 처리가 심근분화에 가장 효과적이었다. DMSO 대조 발현수준은 100%이다. 0-4일째의 처리에서 GFP 발현은 완전히 억제되었다. 실험은 2회 실시하였다.
(c, d) N11474 및 관련 화합물의 구조-활성 상관관계, 및 이들 화합물에 의한 심근분화 촉진. (c) N11474 및 KY02111의 화학식. (d) N11474 및 관련 화합물에 의해 유도된 GFP 발현수준. 위의 그래프는 GFP 유도율을 나타낸다. 웰 전체 이미지(아래 사진)의 백색 반점은 GFP 신호를 갖는 콜로니를 나타낸다(스케일 바는 10mM이다). 벤조티아졸 고리와 디메톡시페닐 고리를 연결하는 탄소 사슬의 길이가 GFP 발현 유도에 중요하였다. 탄소수 2 또는 3의 화합물(KY02111 또는 KY02114)가 가장 높은 수준의 유도를 보여 주었다. 실험은 3회 실시하였다.
(e) PSC 주에 대한 KY02111 효과의 일반성. hESC 주(KhES-1 및 KhES-3), 원숭이 ESC 주(CMK6.4), 마우스 ESC 주(R1), 및 hiPSC 주(IMR90-1, IMR90-4, 253G1 및 RCHIPC0003)는 KY02111 처리에 의해 심근세포로 분화하였다. 배양접시에 있는 전체 콜로니에 대한 박동 콜로니의 비율은 모든 PSC주에 있어서 70 내지 90% 증가하였다(평균 ± SEM, n= 2).
[도 2] KY02111 처리 hPSC로부터 유도된 심근세포의 특성 결정
(a, b) KY02111는 심근 마커의 발현을 촉진하였다. (a) IMR90-1 hiPSC을 KY02111 또는 DMSO로 처리한 후, 심근 마커(cTnT, α액티닌(αActinin) 및 NKX2.5), 페이스메이커 마커(pacemaker marker)인 HCN4 및 선유 아세포 마커(fibroblast marker)인 비멘틴(Vimentin)을 검출하였다. 위의 사진은 KY02111를 처리한 세포이고, 아래 사진은 DMSO를 처리한 세포이다(스케일 바는 100μm이다).
(b) KY02111를 처리한 세포의 약 80% 또는 16% 및 대조구 세포의 2% 또는 0.8%가 각각 심근 마커 또는 HCN4 양성이었다. 비멘틴 양성 비율은 KY02111 및 DMSO에서 각각 20%와 70%였다(평균 ± SEM, n= 3).
(c) KY02111 유도 심근세포의 qPCR 유전자 발현분석. 전체 RNA를 심근분화 15일째(왼쪽 막대) 및 30일째(오른쪽 막대)의 분화세포에서 추출하였다. 심근 마커 유전자(αMHC, βMHC, cTnT, α액티닌 및 NKX2.5) 및 채널 유전자(HCN4, Nav1.5, Cav1.2, Cav3.2, HERG1b 및 KCNQ1)가 KY02111 유도 심근세포에서 고도로 발현하고 있다. 거의 모든 유전자가 30일째 상향조절되어, 그 유전자 발현수준은 성인 심장조직의 유전자 발현수준(100%)과 거의 동등하였다(평균 ± SEM, n= 3). qPCR에 사용된 프라이머는 표 1에 나타내었다.
(d, e) KY02111 유도 심근세포(KY-CM)의 기능성. (d) 패치고정법(patch clamp recording)에 있어서 KY02111 유도 심근세포로부터의 자발적인 심실 모양(ventricular-like) 또는 페이스메이커 모양(pacemaker-like) 활동전위(action potential, AP). (e) 100nM E4031(HERG 채널 차단제) 및 4μM 크로마놀 293B(Chromanol 293B)(KCNQ1 채널 차단제)에 의해 유도된 활동전위 지속기간의 연장. 이러한 결과는 KY-CM이 전기적으로나 약학적으로 기능적임을 보여준다.
[도 3] KY02111 및 다른 WNT 억제제에 의한 WNT 신호경로의 억제를 통한 심근분화의 상승적 촉진.
(a) 하향조절된 유전자의 히트 맵(heatmap). IMR90-1 hiPSC을 KY02111 또는 DMSO 12 또는 24시간 처리하여(KY12h, KY24h, DMSO12h 또는 DMSO24h), 26개의 유전자가 동정되었다. 22개의 하향조절된 유전자를 이용하여 히트 맵을 작성하였다. 4 개의 상향조절된 유전자는 표 2에 나타내었다. WNT 신호전달 경로의 표적 유전자를 표 2에 나타내었다.
(b) 화학 및 단백질성 WNT 억제제의 심근분화 촉진활성의 비교(평균 ± SEM, n= 4; ** 스튜던트 t-검정(student's t-test), P= 0.009). 활성은 사람 αMHC 프로모터에 의해 유도된 EFGP 유전자를 가진 원숭이 ESC를 이용하여 측정하였다. DMSO 대조구 처리의 활성수준을 100%로 하였다. 저분자 화합물의 WNT 억제제는 KY02111(10μM), IWP-2(10μM), XAV939(10μM) 및 IWR-1(10μM)였다. 단백질성 인자는 IGFBP4(1μg/ml) Dkk1(300ng/ml) 및 bFGF, BMP4, VEGF, DKK1 및 액티빈 A의 혼합물(cytokines)(비특허문헌 16)이었다. 어떠한 억제제의 농도도 심근분화를 위하여 최적화되었다(데이터 비 제시).
(c, d) GSK3β 억제제는 심근분화에 대한 KY02111의 효과를 소실시키지 않았다. 사람 αMHC 프로모터에 의해 유도된 GFP 신호를 갖는 콜로니 KY02111(KY), XAV939(XAV), IWP-2(IWP) 처리는 5μM BIO(GSK3β 억제제)의 존재 또는 비 존재 하에서 유도되었다. (c) 웰 전체의 GFP 신호(흰색 점)의 사진. 각 사진의 왼쪽 아래 숫자는 GFP 신호 비율의 증가를 나타낸다(DMSO= 100%). (d) 박동 콜로니의 비율(평균 ± SEM, n= 3). 이 결과는 BIO는 KY02111 의한 심근분화의 촉진은 사라지지만, XAV939 및 IWP-2의 활성은 완전히 억제하는 것을 보여준다.
(e) KY02111과 XAV939, IWP-2, 또는 XAV939 및 IWP-2와의 상승효과. 분화 0일째 1 웰(well) 당 6 x 10⁶ 개 IMR90-1 hiPSC 세포를 6 웰 플레이트에 첨가하였다. 왼쪽의 막대는 KY02111(KY), XAV939(XAV), IWP-2(IWP), KY + XAV, KY + IWP 및 KY + XAV + IWP에 의해 유도된 박동 심근 콜로니의 수(number of beating cardiac colony)를 나타낸다. 오른쪽 막대는 모든 콜로니의 총 세포 수와 cTnT 양성 세포의 비율을 곱하여 산출한 전 심근세포 수(total number of cardiomyocyte)를 나타낸다(도 10의 a, b 참조). 평균 ± SEM, n= 4, * P <0.05, ** P <0.001(스튜던트 t-검정, KY02111 단독 처리 및 각 처리를 비교).
[도 4] WNT 신호전달 경로를 제어하는 저분자 화합물을 이용한 혈청 불포함기지조성 배지(defined medium)의 심근분화
(a) WNT 신호 조절제를 이용한 심근분화의 설명도. 분화 초기(0-3일째)에는 전 배양한 PSC 응집체를 혈청-불포함 IMDM 기초 배지(0.4-2% 알부민과 GSK3β 억제제(2μM BIO 및 5μM CHIR99021) 함유) 중, 젤라틴 또는 라미닌 211을 코팅한 접시에서 배양하였다. 중기(3-9일째)에서는 10μM KY02111 또는 10μM KY02111과 2μM XAV939를 포함하는 기지조성 배지에서 배양하였다. 박동 심근 콜로니는 일반적으로 9일째에 나타났다. 후기(9-30일째)에서는 보고된 바와 같이, 심근 콜로니를 WNT 신호 조절제를 포함하지 않는 기지조성 배지에서 부유배양에 의해 유지하였다(비특허문헌 33).
(b) 혈청 함유 및 혈청-불포함 조건 하에서 분화효율. 심근분화는 혈청(FBS) 또는 1-2% BSA(Alb)를 포함하는 배지를 이용하여, 도 4의 a에 기재된 바와 같이 실시하였다. cTnT 양성 세포의 비율은 Metamorph 소프트웨어에 의해 측정하였다.
(c) 혈청 함유(FBS) 및 혈청-불포함(Alb) 조건 하에서 분화세포의 cTnT 면역염색. 스케일 바는 100μm이다.
(d) 알부민 함유 배지에서 DMSO 대조구, KY02111(KY) 또는 KY02111 + XAV939(KY + XAV)에 의해 유도된 cTnT 양성 세포의 대표적인 유동 세포 계측법 데이터. FACSCantoII(BD Biosciences)에 의해 각 시료 당 30,000 세포를 측정하였다.
(e) 혈청-불포함 기지조성 배양조건에서의 박동 콜로니 수(왼쪽 막대) 및 모든 심근세포 수(오른쪽 막대). 분화 0일째 1 웰(well) 당 6 x 10⁶ 개 IMR90-1 hiPSC 세포를 6 웰 플레이트에 첨가하였다. 오른쪽 막대는, 전체 콜로니의 총 세포 수와 cTnT 양성 세포의 비율과 곱하여 산출한 각 웰의 심근세포 수를 나타낸다. KY02111 또는 KY + XAV에 의해 유도된 박동 콜로니 수와 전체 심근세포 수는 모두 혈청 함유 배지(FBS) 중에서보다 기지조성 배지(Alb) 중에서 더 증가하였다. 평균 ± SEM, n= 4; * P <0.05, ** P <0.001(스튜던트 t-검정).
[도 5] KY02111 및 관련 화합물
(a) KY02111의 합성. 다른 관련 화합물도 동일한 방법을 이용하여 합성하였다.
(b) 심근분화 촉진 활성을 갖는 KY02111 관련 화합물의 화학식.
(c) 상기 (b)의 KY02111 관련 화합물의 심근분화 활성(원숭이 ESC의 αMHC 프로모터 유도 GFP 증가율, DMSO= 100%). 탄소 사슬 수 2 또는 3개의 화합물은 탄소 사슬 수 0, 1 또는 4개의 화합물보다 강한 활성을 나타내었다. 벤조티아졸 고리의 R₁ 기로서 염소 또는 니트로 기는 메틸기, 히드록시메틸기 및 불소보다 적합하였다.
[도 6] KY02111에 의해 유도된 심근분화의 경시적 변화
hiPSC(IMR90-1)의 박동 콜로니 비율은 심근분화 동안 10일째부터 38일째까지 증가하였다. 박동은 대략 10일째부터 시작하였다. 30일째, 접시의 심근 콜로니를 실시예의 "1. 방법"에 기술된 대로 부유 배양하였다.
[도 7] KY02111에 의해 유도된 심근세포 패치고정법(patch clamp recording)
(a) KY02111 유도 심근세포(KY-CM)의 전위 의존성 Ca2+ 채널 전류의 전류 전압(IV) 곡선(n= 8, 평균 ± SEM).
(b) KY-CM 전위 의존성 Na+ 채널 전류의 전류 전압(IV) 곡선(n= 8, 평균 ± SEM).
(c) KY-CM 전위 의존성 HCN 채널 전류의 전류 전압(IV) 곡선(n= 5, 평균 ± SEM).
(d) KY-CM HERG 채널 전류(IKr) 및 KCNQ1 전류(IKs). 유지 전위(holding potential): -40mV; 탈분극 테스트 펄스: -40mV에서 +40mV까지 500m초. 3개의 추적(처리 전(위), HERG 채널 차단제인 E4031 처리 후(중), KCNQ1 채널 차단제인 크로마놀 293B 처리 후(아래))을 함께 표시하였다. KY-CM에서 E4031 및 크로마놀 293B에 의한 IKr 전류 및 IKs 전류의 억제가 명확하게 검출되었다.
(e) KY-CM의 활동전위 및 이온 채널 전류의 평균적 성질. RP: 정지전위(resting potential). APA: 활동전위 진폭(action potential amplitude). APD90: 90% 재분극시의 활동전위 지속. Vmax: 최대 상승속도. INa: -90mV에서 40mV까지의 탈분극시의 전위 의존성 Na+ 채널 전류. ICa: -40mV에서 10mV까지의 탈분극시의 전위 의존성 Ca2+ 채널 전류. IKs: 크로마놀 293B 의해 억제된 -40mV에서 40mV까지 500m초 탈분극 펄스 후의 전위 의존성 K + 채널 전류. IKr: E4031에 의해 억제된 -40mV에서 40mV까지 500m초 탈분극 펄스 후의 전위 의존성 K+ 채널 전류. If: 자테부라딘(zatebradine)에 의해 억제된 -50mV에서 -140mV까지 500m초 과분극 펄스 후의 HCN 채널 전류. E4031-APDinc: E4031에 의해 유도된 APD90 증가율. C293B-APDinc: 크로마놀 293B에 의해 유도된 APD90.
[도 8] KY-CM을 이용한 QT 간격 연장시험(interval prolongation test)
(a) 미소 전극 어레이(microelectrode array, MEA) 접시의 단일 KY-CM 콜로니.
(b) KY-CM 콜로니로부터 방출되는 ECG-유사 파(ECG-like wave). 위: 처리 이전의 파형. 아래: 10μM 아스테미졸(Astemizole) 처리 후의 파형. Na +-K +파 피크 간격은 아스테미졸에 의해 연장되었다. 아스테미졸은 항히스타민제이지만, HERG 채널을 억제하는 것으로 보고되었다(비특허문헌 34).
(c) Na +-K + 간격 연장 그래프. 아스테미졸은 4 분 간격으로 용량의존적으로 첨가하였다. Na +-K + 간격은 대조 조건인 0.1% DMSO 처리로 변화하지 않았다.
[도 9a] KY02111 및 WNT 신호 조절제에 의한 유전자 발현 프로파일 및 TCF 수용체 분석(1). KY02111을 처리한 IMR90-1 hiPSC의 마이크로어레이 실험으로 동정된 WNT 표적 유전자의 검증. 시험된 모든 유전자에서 qPCR 분석에 의한 유전자 발현 패턴은 마이크로어레이 데이터와 마찬가지였다.
[도 9b] KY02111 및 WNT 신호 조절제에 의한 유전자 발현 프로파일 및 TCF 수용체 분석(2). KY02111 처리에 의해 하향조절된 유전자의 DiRE(Distant Regulating Elements of co-regulatedgenes) 분석(비특허문헌 35). 22개의 유전자 전체 또는 KY02111 처리 후 12 시간 시점에서 가장 하향조절된 10개 유전자를 분석하였다. 출력 데이터로부터 가장 타당한 전사인자는 고전적 WNT 신호전달 경로의 이펙터인 LEF1 및 TCF4인 것으로 나타났다.
[도 9c] KY02111 및 WNT 신호 조절제에 의한 유전자 발현 프로파일 및 TCF 수용체 분석(3). KY02111, XAV939, IWP-2 또는 BIO를 처리한 IMR90-1 hiPSC의 qPCR에 의한 유전자 발현분석. 전체 RNA를 처리 12,24 및 72 시간 후 추출하였다. 시험된 모든 유전자의 발현수준이 WNT 신호 억제제(XAV939 및 IWP-2) 및 KY02111 의해 억제되었다. WNT 신호 활성화제인 BIO는 이러한 유전자 발현수준을 증가시키는 경향이 있었다.
[도 9d] KY02111 및 WNT 신호 조절제에 의한 유전자 발현 프로파일 및 TCF 수용체 분석(4). TOPflash 플라스미드를 도입한 hiPSC(IMR90-1)를 이용한 KY02111(K), XAV939(X), IWP-2(I) 및 DMSO 대조구(D) TCF 리포터 루시퍼라제 분석. Wnt3a(W) 또는 BIO(B)를 첨가하여, WNT 신호전달 경로 및 TCF 프로모터 활성을 상승시켰다. KY02111 및 XAV939는 Wnt3a 및 BIO에 의한 TCF 프로모터 활성을 저해하였다. IWP-2는 TCF 프로모터 활성을 저해하지 않았는데, 이는 IWP-2가 WNT 리간드 분비 억제제이기 때문이라고 여겨진다. n= 14, 평균 ± SEM * P <0.05, ** P <0.01(독립된 양측 스튜던트 t-검정(unpaired two-tailed Student's t-test)). HEK293 세포에서 KY02111의 TCF 리포터 분석. HEK293 세포에서 KY02111은 BIO에 의한 TCF 프로모터 활성을 억제했으나, KY02111는 Wnt3a에 의한 TCF 프로모터 활성을 더욱 강화하였다. n= 4, 평균 ± SEM * P <0.05, ** P <0.01(독립 양측 스튜던트 t-검정).
[도 10] KY02111과 XAV939, IWP-2 및 XAV939 + IWP-2의 전 세포 수(total cell number) 및 심근세포율(cardiomyocyte ratio)에 대한 상승효과
(a) 6-웰 플레이트의 단일 웰에 있어서 분화세포의 수.
(b) cTnT 양성 심근세포 비율. IMR90-1 hiPSC는 실시예의 "1. 방법"에 기재된 대로, KY02111(KY), XAV939(XAV), IWP-2(IWP), KY + XAV, KY + IWP 또는 KY + XAV + IWP에 의해 처리하였다. 전 세포 수를 NucleoCounter(Chemometec)를 이용하여 심근분화 14일째에 측정하였다. cTnT 양성 심근세포는 실시예의 "1. 방법"에 기재된 대로 검토하였다. 분화 1일째에 6 웰 플레이트의 1 웰(well) 당 600 만개의 IMR90-1 hiPSC 세포를 사용하였다. n= 4, 평균 ± SEM * P <0.001(KY02111 단독과 비교).
[도 11] WNT 신호전달 경로를 조절하는 저분자 화합물에 의한 사이토카인, 혈청 및 이종 성분을 포함하지 기지조성 조건에서의 강력한 심근분화
(a) hESC 주(H1, H9 및 KhES-3) 및 hiPSC 주(IMR90-1 및 253G1)는 초기에 BIO + CHIR99021 처리 및 후기의 KY02111 + XAV939의 처리에 의해 고효율로 심근세포로 분화하였다. 도 4의 a에서 보듯이, 0.4% 사람 혈청 알부민 및 사람 라미닌 211을 사용하였다. 심근 박동 콜로니 비율(배양접시에 있는 모든 콜로니에 대한 박동 콜로니)는 모든 hPSC주에서 85-95%였다. n= 3, 평균 ± SEM.
(b) 각 hPSC주에서 수득한 cTnT 양성 세포의 대표적인 유동 세포 계측법 데이터. FACSCantoII(BD Biosciences)에 의해 각 시료 당 30,000세포를 측정하였다.
(c) 이종 성분 및 사이토카인 불포함 조건에서의 IMR90-1 hiPSC 유래 심근세포에서 cTnT 및 α액티닌(αActinin)의 면역염색. 스케일 바: 100μm. 사코미어(sarcomere) 구조가 명확하게 감지되었다.

본 발명에서 "다기능 줄기세포"(pluripotent stem cell, "PSC")는 성체를 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 분화능(pluripotency)과 세포분열을 거쳐도 다분화 기능을 유지할 수 있는 자기복제 능력을 갖는 세포를 의미한다. "다기능 줄기세포"는 배아 줄기세포(embryonic stem cell, "ES 세포" 또는 "ESC"), 배아 생식세포(embryonic germ cell, "EG 세포"), 인공 다기능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, "iPS 세포" 또는 "iPSC")가 포함한다. "다기능 줄기세포"의 생물종은 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 포유류이며, 보다 바람직하게는 설치류 또는 영장류이다. 본 발명은 원숭이 또는 사람 다기능 줄기세포에 특히 적합하다.

ES 세포는 초기 배아에서 유래된 다기능 줄기세포이며, 배반포(blastocyst)의 내부 세포 덩어리(inner cell mass) 또는 착상후 초기 배아의 외배엽(epiblast)으로부터 수립할 수 있다. ES 세포의 예로서는, 사람(참조: Thomson JA et al., Science 282: 1145-1147(1998), Biochem Biophys Res Commun 345(3), 926-32(2006); 붉은 털 원숭이와 비단 원숭이 등 영장류(Thomson JA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848(1995); Thomson JA et al., Biol. Reprod 55: 254-259(1996)); 토끼(특표 2000-508919호); 햄스터(Doetshman T. et al., Dev. Biol 127: 224-227(1988)), 돼지(Evans MJ et al., Theriogenology 33: 125128(1990); Piedrahita JA et al., Theriogenology 34: 879-891(1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert 40: 51-56(1990); Talbot NC et al., Cell. Dev. Biol. 29A: 546-554(1993)), 양(Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl 43: 255-260(1991)), 소(Evans MJ et al., Theriogenology 33: 125-128(1990); Saito S. et al. Roux. Arch. Dev. Biol 201: 134-141(1992)), 밍크(Sukoyan MA et al., Mol. Reorod. Dev 33: 418-431(1993)) 등의 세포를 들 수 있다(이들 문헌은 인용에 의해 본 명세서에 포함).

EG 세포는 시원 생식세포(primordial germ cell)로부터 유래된 다기능 줄기세포이며, 사람 EG 세포(Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 7844-7848(1995))(인용에 의해 본 명세서에 포함)를 예로 들 수 있다.

본 발명에서 "iPS 세포(iPS cell)"는 체세포와 조직 줄기세포와 같은 다기능 줄기세포 이외의 세포로부터 유도된 다기능 줄기세포를 의미한다. iPS 세포의 작제 방법은, 예를 들어, WO2007/069666, WO2009/006930, WO2009/006997, WO2009/007852, WO2008/118820, Cell Stem Cell 3(5): 568-574(2008), Cell Stem Cell 4(5): 381-384(2009), Nature 454: 646-650(2008), Cell 136(3):411-419(2009), Nature Biotechnology 26: 1269-1275(2008), Cell Stem Cell 3: 475 - 479(2008), Nature Cell Biology 11: 197-203(2009), Cell 133(2): 250-264(2008), Cell 131(5): 861-72(2007), Science 318(5858): 1917 -20(2007)(이 문헌은 인용에 의해 본 명세서에 포함)에 기술되어 있다. 그러나, 인위적으로 유도된 다기능 줄기세포라면, 어떠한 방법으로 작제된 세포도 본 발명의 "iPS 세포"에 포함된다.

본 발명에서 "Wnt 신호 활성화제(WNT signaling activator)"는 Wnt 신호전달 경로를 활성화하는 물질을 의미한다. Wnt 신호 활성화제로는, 예를 들면 BIO 및 CHIR99021 등의 GSK3β 억제제가 예시된다. 본 발명의 방법에 있어서는, 2개 이상, 예를 들어 2, 3 또는 4개의 Wnt 신호 활성화제를 병용해도 좋다.

본 발명에서 "Wnt 신호 억제제(WNT signaling inhibitor)"는 Wnt 신호경로를 억제하는 물질을 의미한다. Wnt 신호 억제제에는, 예를 들어 다음의 일반식(I)의 화합물 또는 그 염, IWP2, XAV939 및 IWR1 등의 화합물, 및 IGFBP4 및 Dkk1 등의 단백질이 포함된다. 바람직하게는, 본 발명에서 Wnt 신호 억제제는 화합물이다. 본 발명의 방법에 있어서는, 2개 이상, 예를 들어 2, 3 또는 4개의 Wnt 신호 억제제를 병용해도 좋다.

일반식(I):

상기 식에서,

R₁-R₅는 각각 독립적으로 수소 원자; 할로겐 원자; 수산기; 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기; 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기; 또는 -NR₁₂R₁₃ (R₁₂ 및 R₁₃은 각각 독립적으로 수소 원자, 산소 원자, 또는 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이다)이고(이때, R₁-R₅ 중 인접한 2개가 함께 -O-CH₂-O- 또는 -O-(CH₂)₂-O-을 형성하여도 무방하다),

R₆-R₉는 각각 독립적으로 수소 원자; 할로겐 원자; 수산기; 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기; -C(O)A로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기(A는 비치환 또는 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기로 치환된 포화 또는 불포화 5 또는 6 원환이며, 상기 환은 질소 원자, 산소 원자, 및 황 원자로부터 독립적으로 선택되는 1 또는 2 개의 원자를 포함할 수 있다); 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기; 또는 -NR₁₂R₁₃(R₁₂ 및 R₁₃는 각각 독립적으로 수소 원자, 산소 원자, 또는 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이다)이며(이때, R₆-R₉ 중 인접한 2 개가 함께 -O-CH₂-O- 또는 -O-(CH₂)₂-O-을 형성하여도 무방하다),

R₁₀-R₁₁은 각각 독립적으로 수소 원자; 또는 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이고,

X는, -CR₁₄(R₁₄는 수소 원자, 할로겐 원자, 수산기, 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기, 또는 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이다); 산소 원자; 황 원자; 셀레늄 원자; 또는 -NR₁₅(R₁₅는 수소 원자, 탄소수 1~5 직쇄 또는 분지상의 알킬기, 또는 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 아실기이다)이며, 및

n은 0-6의 정수이다.

탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기로는, 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, 부톡시기, 이소부톡시기, sec-부톡시기, tert-부톡시기, 펜틸옥시기를 예로 들 수 있다.

탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기로는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기를 예로 들 수 있다 .

탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 아실기로는, 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부틸기, 이소부틸기, 발레릴기, 이소발레릴기를 예로 들 수 있다.

할로겐 원자로는, Cl, Br, I 또는 F를 예로 들 수 있다.

바람직한 실시태양으로는, R₁-R₅는 각각 독립적으로 수소 원자; 할로겐 원자, 수산기; 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기; 또는 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이고, 이때 R₁-R₅ 중 인접한 2개가 함께 -O-CH₂-O- 또는 -O-(CH₂)₂-O-를 형성하여도 좋다.

R₂ 및 R₃은 바람직하게는, 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기이거나, 또는 함께 -O-CH₂-O- 또는 -O-(CH₂)₂-O-를 형성한다. 보다 바람직하게는, R₂ 및 R₃는 메톡시기, 에톡시기, 또는 프로폭시기이고, 가장 바람직하게는, 메톡시기는 에톡시기이다.

R₁, R₄ 및 R₅는 바람직하게는, 수소 원자이다.

한가지 실시태양에 있어서, R₆-R₉은 각각 독립적으로 수소 원자; 할로겐 원자; 수산기; 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기; 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기; 또는 -NR₁₂R₁₃(R₁₂ 및 R₁₃은 각각 독립적으로 수소 원자, 산소 원자, 또는 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이다)이며, 이때 R₆-R₉ 중 인접한 2개가 함께 -O-CH₂-O- 또는 -O-(CH₂)₂-O-를 형성하여도 무방하다.

R₆ 및 R₉은 바람직하게는, 각각 독립적으로 수소 원자; 할로겐 원자; 수산기; 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기; 또는 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이고, 보다 바람직하게는 수소 원자이다.

바람직한 실시태양에 있어서, R₇은 수소 원자; 할로겐 원자; 수산기; 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기; -C(O)A로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기(A는 비치환 또는 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기로 치환된 포화 혹은 불포화 5 또는 6원 고리이며, 그 고리는 질소 원자 산소 원자 및 유황 원자에서 독립으로 선택되는 1 또는 2개의 원자를 포함해도 좋다); 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기; 또는 -NR₁₂R₁₃(R₁₂및 R₁₃은 각각 독립적으로 수소 원자 산소 원자, 또는 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이다)이며, R₈은 수소 원자; 할로겐 원자, 수산기; 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기; 또는 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이거나, 또는, R₇ 및 R₈는 함께 -O-CH₂-O- 또는 -O-(CH₂)₂-O-를 형성한다.

하나의 실시태양에 의하면, R₇은 -C(O)A로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄상 알콕시기이며, -C(O)A는 전기 알콕시기의 말단 탄소 원자에 결합하고 있다.

바람직한 실시태양에 있어서, A는 질소 원자를 적어도 1개 포함하고, 이러한 A로서는 비치환 또는 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기로 치환된, 피로리디닐, 이미다조리디닐, 피라조리디닐, 피로릴, 이미다조릴, 피라조릴, 티아조릴, 이소티아조릴, 옥사조릴, 이소옥사조릴, 피페리디닐, 피페라디닐, 모르폴리닐(morpholinyl), 피리딜, 피리미디닐, 피라디닐 및 피리다디닐기가 예시된다. 보다 바람직한 실시태양에서는, A는 비치환 또는 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기로 치환된, 피페리디닐기, 피페라디닐기, 또는 모르폴리닐기이다. 보다 더 바람직한 실시태양으로는, A는 비치환 또는 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기로 치환된 피페리딘-1-일기, 피페라진-1-일기, 또는 모르폴린-4-일기이다.

R₁₀ 및 R₁₁은 바람직하게는, 수소 원자이다.

바람직한 실시태양에 있어서, X는 산소 원자; 황 원자; -NR₁₅(R₁₅는 수소 원자, 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기, 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상 아실기이다)이다. X는 바람직하게는, 황 원자이다.

바람직한 실시태양에 있어서, n은 0 내지 4의 정수이다. 보다 바람직한 실시태양에 있어서, n은 2 또는 3이다.

본 발명에 있어서, 특히 바람직한 WNT 신호 억제제는 이하에서 선택되는 화합물 또는 그의 염이다:

KY02111

KY01041

T61164

KY02114

KY01045

KY01040

KY02109

KY01042

KY01043

KY01046

PB2852

N11474

PB2572

PB2570

KY02104

SO087

SO102

SO096

SO094

일반식(I)의 화합물은 공지된 방법(J. Med. Chem., 1965, 8(5), pp 734-735)(인용에 의해 본 명세서에 포함)에 따라, 혹은 실시예에 기재된 방법에 따라 합성할 수 있다.

상기 화합물은 예를 들면, J. Med. Chem., 1965, 8(5), pp 734-735(인용에 의해 본 명세서에 포함)에 기재되어 있다(N11474, T61164). 또한, UkrOrgSynthesis사(PB2852, PB2572, PB2570)나 ENAMINE사(T61164) 등으로부터 입수 가능하다.

본 발명의 방법에서, 공정(1) "다기능 줄기세포를 1 이상의 WNT 신호 활성화제를 포함한 배지 중에서 배양하는 공정" 및 공정(2) "공정(1)에서 수득한 세포를 1 이상의 WNT 신호 억제제를 포함한 배지 중에서 배양하는 공정"에 있어서의 배지는 일반적으로 다기능 줄기세포 심근분화에 사용되는 배지라면 무방하며, 그의 조성은 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 방법에 이용하는 배지는 IMDM 배지를 기본으로 한 심근분화 배지(예를 들어, 실시예에서 사용하는 배지), DMEM을 기본으로 한 심근분화 배지(예를 들어, DMEM/F12 배지(Sigma) 200ml, 우태아 혈청(GIBCO) 50ml, MEM non-essential amino acid solution(Sigma) 2.5ml, 페니실린-스트렙토마이신(GIBCO) 2.5ml, 200mM L-글루타민 2.5ml, 2-머캡토에탄올), 또는 StemPro-34SFM(GIBCO) + BMP4(10ng/ml)와 같은 배지가 예시된다.

본 발명의 방법에 있어서, 일반적으로 다기능 줄기세포 심근분화에 적합한 배양방법을 사용할 수 있다. 배양방법으로서는 접착배양(adhesion culture), 부유배양(floating culture), 현탁배양(suspension culture) 등을 예로 들 수 있다. 본 발명의 방법에서는 END2 세포와 같은 지지세포(feeder cell)를 사용할 필요가 없다.

본 발명의 방법에 따르면, 혈청을 포함하지 않는 배지(혈청 불포함 배지)라도 효율적으로 다기능 줄기세포의 심근분화를 유도할 수 있다. 혈청 불포함 배지를 이용하는 경우, 배지는 알부민을 포함하는 것이 좋다. 배양방법으로는 접착배양법을 이용하는 것이 바람직하다. 알부민은 소혈청 알부민, 사람 혈청 알부민을 예로 들 수 있다. 접착배양법에서는, 젤라틴 또는 라미닌(예를 들면, 사람 라미닌 211)을 코팅한 배양접시를 이용할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어 알부민을 포함한 혈청 불포함 배지를 이용한 경우, 혈청, 사이토카인, 지지세포 등 알부민 이외의 단백질이나 사용하는 다기능 줄기세포는 다른 생물종에 유래하는 성분(즉, 이종 성분)의 비 존재하에서 다기능 줄기세포의 심근분화를 유도할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 심근분화 배지의 배양(심근분화 배양)의 개시로부터 공정(1) 및 공정(2)의 개시까지의 기간, 및 공정(1) 및 공정(2)의 배양기간은 적절히 변경될 수 있다. 공정(2)는 공정(1)의 종료 직후부터 시작해도 좋고, 공정(1)의 종료부터 일정 기간 후에 개시되어도 무방하다. WNT 신호 활성화제 및 WNT 신호 억제제는 다기능 줄기세포의 심근분화 초기 단계 및 중기 단계에 각각 첨가하면 된다. 여기서, 다기능 줄기세포의 심근분화 초기 단계는 중배엽 표지 유전자(mesoderm marker gene)의 발현 상승이 일어나는, 다기능 줄기세포에서 중배엽의 분화 유도기를 의미하고, 중기 단계는 중배엽에서 심근으로의 분화 유도기를 의미한다. 중배엽 표지 유전자로는 T, MIXL1, NODAL 등을 예로 들 수 있다. 예를 들어, 원숭이 또는 사람 ES 세포 또는 iPS 세포의 경우, 심근분화 배양 0~2일째 또는 0~3일째, 즉 심근분화 배양 개시부터 2 또는 3일 동안 공정(1)을 실시하고, 이어서 심근분화 배양 14일 중 2일 이상(구체적으로는, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일), 바람직하게는 3~10일, 보다 바람직하게는 4~10일, 보다 더 바람직하게는 4~8일, 한층 더 바람직하게는 4~6일간 공정(2)를 실시하는 것이 좋다. 여기에서, 공정(2)는 심근분화 배양 10일 중 4~6일, 예를 들면 심근분화 배양 3~9일째, 3~8일째, 3~7일째, 4~10일째, 4~9일째, 또는 4~8일째에 실시하는 것이 바람직하다.

WNT 신호 활성화제 및 WNT 신호 억제제의 농도는 특별히 한정되지는 않는다. WNT 신호 활성화제로 BIO 또는 CHIR99021을 사용할 경우, 최종 농도 100nM~100μM, 바람직하는 1μM~10μM를 사용한다. WNT 신호 억제제로서 일반식(I)의 화합물 또는 IWP2, XAV939 또는 IWR1을 이용하는 경우, 예를 들면 최종 농도 0.5~20μM, 바람직하는 1~10μM를 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 방법은 심근세포의 제조에 이용할 수 있다. 심근세포의 분화는, 예를 들어, 박동 심근세포의 수(number of beating cardiac colony), 심근 마커의 발현(expression of cardiac marker), 이온 채널의 발현(expression of ion channel), 전기 생리학적 자극에 대한 반응(response to electrophysiological stimulus) 등을 통해 확인할 수 있다. 심근 마커(cardiac marker)로는 αMHC, βMHC, cTnT, α액티닌 및 NKX2.5를 예로 들 수 있다. 또한, 이온 채널(ion channel)로는 HCN4, Nav1.5, Cav1.2, Cav3.2, HERG1b 및 KCNQ1을 예로 들 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 얻어진 심근세포는 실험실 조건의 약제 안전성 시험, 혹은 심장 질환 등에 대한 이식용 심근세포로서 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 1개 이상의 WNT 신호 활성화제 및/또는 1개 이상의 WNT 신호 억제제를 포함한 심근분화 촉진용 키트로서, 본 발명의 심근분화 유도방법에 사용되는 키트를 제공한다.

이하에서는, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명한다.

실시예

1. 방법

(1) hESC, hiPSC 및 원숭이 ESC의 배양

PSC주는 모두 Primate ES Cell Culture Medium(ReproCELL Inc., Japan) 중의 미토마이신 C 처리 마우스 태아 선유아세포(mouse embryonic fibroblast, MEF) 상에서, hPSC에 대해서는 5ng/ml bFGF와 함께, 원숭이 ESC에 대해서는 bFGF 없이 유지하였다. 사람 ESC주는 KhES-1, KhES-3, H1 및 H9(비특허문헌 1, 41)를 이용하였다. 사람 iPSC주는 253G1, IMR90-1, IMR90-4(비특허문헌 42, 43) 및 RCHIPC0003을 이용하였다. RCHIPC0003은 ReproCELL에 의한 사람 선유아세포에서 수립되었다. 원숭이 ESC주는 CMK6.4(비특허문헌 1, 44, 45)를 이용하였다. hESC주는 사람 ES세포 수립 및 사용에 관한 지침(일본국 문부과학성)에 따라 사용하였다.

(2) 형질도입 원숭이 ESC주

사람 αMHC 프로모터의 제어 하에서 EGFP를 발현하는 원숭이 ESC를 작제하기 위하여, 전사 개시부위의 상류에서 오픈 리딩 프레임 직전의 제3엑손까지 918 bp를 KhES-1 hESC의 게놈 DNA에서 PCR에 따라 프라이머 세트(정방향 프라이머, 5'-CCAGGCACCTGCACCCTCTGG-3'; 역방향 프라이머, 5'-(SalI 연결을 포함) 22 TAGTCGACCTTGGTGCTTCCCCTGGGTCAGAG-3')를 이용하여 증폭시키고, pGEM-T Easy Vector(Promega)에 연결하였다. 클론 벡터 유래의 HindIII/SalIfra를 pEGFP-1(Clontech)에 결합하였다. 선형화한 αMHC-EFGP 벡터를 CMK6.4 원숭이 ESC에 전기천공법으로 도입하였다. 형질도입 ESC 클론은 G418(Sigma-Aldrich)에 의해 선택적으로 증식시켰다. EGEP의 발현은 박동 콜로니(beating colony)로 확인하였다.

(3) 심근분화를 촉진하기 위한 저분자 화합물의 하이 콘텐츠 분석(HCA) 검사

콘플루언트(계대 4-5일 후) αMHC-GFP 형질도입 원숭이 ESC를 CTK 용액(비특허문헌 1)에 의해 효소적으로 해리시키고, ESC 덩어리(지름 40-100μm)를 40μm 및 100μm의 Cell Strainer(BD Biosciences)을 이용하여 수득하였다. 이 ESC 덩어리(약 5.0×10³세포/웰)를 96웰 플레이트(Greiner Bio-One, 96-well black plate, Cat. No. 655090)에 옮기고, 하기 (4)의 심근분화 배지 중에서 배양하였다. 심근분화 6 내지 14일째에 화합물 라이브러리에서 유래한 9,600개의 화합물(DMSO에 용해)을 96웰 플레이트를 이용하여 스크리닝하였다. 16웰을 대조구(0.1% DMSO)로 80웰을 화합물(1웰에 대해 1화합물)로 사용하였다. 각 화합물의 최종 농도는 약 1-5μM이었다. 저분자 화합물을 포함하는 배지는 4일마다 교환하였다. 14일째에 Metamorph 이미징 시스템(Molecular Device)을 이용한 플레이트 전체 스캐닝에 의해 ESC의 GFP 형광을 측정하였다. Metamorph 소프트웨어를 사용하여 GFP 형광 데이터를 해석하고, 각 웰에 대해 형광영역(fluorescence area), 전 형광강도(total fluorescence intensity), 평균 형광강도(average fluorescence intensity) 및 GFP 양성 콜로니 수(number of GFP-positive colony)를 계산하였다. 다음과 같은 기준에 의해 히트 화합물을 결정하였다: 그 화합물의 웰의 평균 형광강도가 대조구의 평균 형광강도(16웰의 평균) +6 SD보다 크고, 그 화합물의 전 형광강도가 대조구의 전 형광강도 +0 SD보다 크며; 또는, 그 화합물의 전 형광강도가 대조구의 전 형광강도 +4 SD보다 크고, 그 화합물의 평균 형광강도가 대조구의 평균 형광강도 +0 SD보다 크다. 120개의 화합물이 이 기준을 충족시켜 각 화합물을 8웰을 이용하여 재시험하였다. N11474라 하는 분자가 DMSO와 비교하여 유의적으로 ESC의 GFP 형광을 증가시켰다(스튜던트 t검정 t, P=0.015).

(4) 혈청 함유 배지에서의 심근분화

콘플루언트 hESC 및 hiPSC를 CTK 용액을 이용하고 조심스럽게 해리시키고 Primate ES Cell Culture Medium(ReproCELL, Japan)을 이용한 페트리 접시(BD BioSciences)로 옮겼다. 세포를 현탁배양으로 8 내지 24시간 유지하고 응집시켰다. hPSC 응집체(hPSC aggregate)의 크기(지름 0.3-1mM)는 효율적인 분화에 중요하다. 현탁배양에 이어 세포 응집체를 배양접시에 다음과 같은 심근분화 배지 중에서 부착시켰다(3-10×10⁵세포/cm²): IMDM(Sigma)(20% FBS(Gibco), 1% MEM 비필수 아미노산 용액(Sigma), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco), 2mM L-글루타민(Sigma), 0.001% 2-머캡토 에탄올(Gibco) 및 0.005N NaOH, 10ng/ml BMP4(R&D Systems)를 함유). 3일째(hiPSC주) 또는 4일째(사람 또는 원숭이 ESC주)에 배지를 10μM KY02111 및/또는 다른 WNT 억제제를 첨가한 심근분화 배지로 교환하였다: XAV939(Wako, Japan), IWP-2(Santa Cruz Biotechnology), IWR-1(Merck4Bioscience), IGFBP4(R&D Systems), Dkk1(R&D Systems)와 bFGF(R&D Systems), BMP4(R&D Systems), VEGF(R&D Systems), DKK1(R&D Systems)및 Activin A(R&D Systems)의 혼합물(비특허문헌 16). 배지는 2 내지 3일 마다 교환하였다. KY02111 및 다른 WNT 억제제는, hiPSC주 및 원숭이 ESC주에 대해서는 9일째까지, hESC주에 대해서는 14일째까지 첨가하였다. 15일째에 배양접시 위의 심근세포 콜로니를 단백질 분해효소 용액(0.1% 콜라게나제 타입 I, 0.25% 트립신, 1U/ml DNase I, 116mM NaCl, 20mM HEPES, 12.5mM NaH₂PO₄, 5.6mM 포도당, 5.4mM KCl 및 0.8mM MgSO₄, pH 7.35)과 함께 0.5 내지 2시간 배양하고, 웰의 바닥에서 모든 심근 콜로니를 해리시켰다. 해리시킨 심근 콜로니를 새로운 심근분화 배지를 포함하는 15ml 튜브에 옮겨 중력에 의해 침전시키고, 상등액을 흡인에 의해 제거하였다. 이어서, 심근 콜로니를 초저 접착배양접시(Ultra-low culture dish, Corning, 3261) 또는 6웰 플레이트(Corning, YO-01835-24)로 혈청 및 NaOH를 모두 포함하지 않는 심근분화 배지 중에서 옮겼다. 이 부유 심근 콜로니를 1개월 이상 유지하고 배지를 5일마다 교환하였다. 마우스 ESC(R1주)를 이미 보고된 대로 분화시키고(비특허문헌 46), KY02111을 3 내지 6일째에 첨가하였다. 맥박 콜로니는 9일째에 계측하였다.

(5) 혈청 불포함 기지조성 배지에서의 심근분화

상기 페트리 접시에서 전 배양한 후, 세포 응집체(cell aggregate)를 젤라틴(Sigma G2625) 또는 사람 라미닌 211(BioLamina, Sweden)을 코팅한 배양접시에, 다음과 같은 혈청 불포함 심근분화 배지 중에서 3-10 x 10⁵세포/cm²으로 부착시켰다: IMDM(Sigma)(1% MEM 비필수 아미노산 용액(Sigma), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco), 2mM L-글루타민(Sigma), 0.5mM L-카르니틴(Sigma), 0.001% 2-머캡토 에탄올(Gibco) 및 1-2% 소혈청 알부민(Wako, Japan), 또는 0.4% 사람 혈청 알부민(Sigma), 5μM CHIR99021(Axon) 및 2μM BIO(Calbiochem)을 함유). 3-9일째에 10μM KY02111 및/또는 다른 WNT 억제제(XAV939 및/또는 IWP-2)을 세포배양물에 첨가하고, 배지를 2일마다 교환하였다. 15일째에 심근 콜로니를 단백질 분해효소 용액과 5 내지 10분간 배양하고, 모든 콜로니를 웰의 바닥으로부터 해리시켰다. 이 심근 콜로니를 0.1% 알부민을 포함하는 심근분화 배지와 함께 15 ml 튜브에 옮기고, 중력에 의해 침전시켜 상등액을 회수한 다음, 심근 콜로니를 초저 접착배양 6웰 플레이트(ultra-low culture 6-well plate, Corning, YO-01835-24)에 0.1% 알부민을 포함하는 심근분화 배지와 함께 옮겼다. 이 부유 심근 콜로니를 1개월 이상 유지하고 배지를 5일마다 교환하였다.

(6) 면역염색 및 유동세포계측

심근 콜로니를 전술한 프로테아제 용액과 함께 1-2시간 37℃에서 교반함으로써 해리시킨 다음, 젤라틴(Sigma)으로 코팅한 커버 유리 위에서 하루를 배양하고 4% 파라 포름알데하이드로 고정하였다. Triton X로 투과 처리한 후, 세포를 2% 스킴 밀크로 1 내지 2시간 처리하고, 이하의 1차 항체를 2시간 동안 배양하였다: NKX2.5(토끼 폴리클로널, 1:250; Abcam), α액티닌(마우스 모노클로널, 1:800; Sigma) 심근 TnT(마우스 모노클로널, 1:100; Santa Cruz Biotechnology), 비멘틴(마우스 모노클로널, 1:800; Sigma V6630) 및 HCN4(마우스 모노클로널, 1:400; Abcam). 사용한 2차 항체는 Alexa546 결합 항 마우스 IgG, Alexa488 결합 항 마우스 IgG 및 Alexa488 결합 항 토끼 IgG(1:1000; 모두 Molecular Probes, Invitrogen으로부터 입수). 핵은 DAPI에 의해 가시화하였다. 화상은 형광 현미경(Olympus)하에 수득하였다. cTnT, α액티닌, NKX2.5, HCN4 및 비멘틴 양성 세포의 수를 3개의 영역에서 Metamorph 이미징 시스템(Molecular Devices)을 이용하여 계측하였다. 약 1,000개의 DAPI 염색 세포를 이용하여 면역양성 세포의 비율을 계산하였다(면역양성 세포 수/DAPI 염색 세포 수). 유동세포 계측을 위하여, hPSC 유래 심근 콜로니에서 단일세포를 항 cTnT항체에 의해 염색하고, Alexa488 결합 항 마우스 IgG 2차 항체에 의해 염색하였다. 세포는 FACS CantoII 유동세포계측기(BD Biosciences)를 이용하여 분석하였다. 데이터는 FACADiva 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 해석하였다.

(7) 마이크로어레이 실험

IMR90-1 iPSC을 혈청 함유 심근분화 배지 중에서 배양하였다. 3일째에 세포를 10μM KY02111 또는 0.1% DMSO로 0, 12 또는 24시간 처리하였다. 비처리 세포(0 h), KY02111로 12시간 또는 24시간 처리한 세포(KY12hr 또는 KY24hr), 0.1% DMSO로 12시간 또는 24시간 처리한 세포(DMSO12hr 또는 DMSO24hr)를 마이크로어레이 분석에 사용하였다. 전세포 RNA를 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 제조원의 설명대로 조제하였다. cDNA의 합성, 실험실 조건에서의 전사 및 비오틴 표지 cRNA 및 Human Gene 1.0 ST 배열(Affymetrix)의 혼성화는 Affymetrix의 프로토콜에 따랐다. 혼성화 이후의 배열은 Affymetrix GeneChip Scanner를 이용하여 스캔하였다. 데이터의 정규화 및 추가 분석은 GeneSpring GX(Agilent Technologies)를 이용하여 행하였다. 유전자를 발현하는 처리 세포의 대조구에 대한 비율(KY02111/DMSO)을 각 시점에서 계산하였다. KY02111 처리 후 12시간 및 24시간의 양 시점에서 KY/DMSO 비율이 25%를 넘는 변화를 보여 주는 유전자를 KY02111에 응답하여 하향조절(down-regulation) 또는 상향조절(up-regulation)되는 유전자로서 동정하였다(하향조절되는 유전자= KY12h/DMSO12h<0.75 및 KY24h/DMSO24h<0.75; 상향조절되는 유전자= KY12h/DMSO12h>1.25 및 KY24h/DMSO24h>1.25). 마이크로어레이 데이터는 NCBI의 Gene Expression Omnibus(GEO) 공공 데이터베이스에 제출하였다(GEO accession number, GSE33622). DiRE(Distant Regulating Elements of co-regulated genes) 분석을 위하여, 모든 유전자 또는 하향조절된 상위 10개의 유전자(KY12h/DMSO12h 비율에 근거한다)를 웹 프로그램(http://dire.dcode.org/)(비특허문헌 35)을 이용하여 해석하였다.

(8) qRT-PCR

전세포 RNA를 RNeasy Mini Kit(QIAGEN)를 이용하여 분리하였다. 게놈 DNA는 DNase I(Invitrogen)을 이용하여 완전히 소화하였다. 전세포 RNA(0.5μg)를 SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)를 이용한 cDNA 합성에 사용하였다. qRT-PCR은 7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)에서 SYBER GREEN PCR Master Mix를 이용하여 3회 실시하였다. 사이클 조건은 다음과 같았다: 95℃ 10분; 95℃ 15초, 40 사이클; 60℃ 1분. 성인의 심장조직에서 유래한 전세포 RNA(BioChain)를 이용하여, hPSC에서 유래한 심근세포의 심근 표지 유전자(cardiac marker gene)의 발현 수준을 평가하였다. 모든 값을 GAPDH 발현 수준에 대해서 정규화시키고, 성인 심장에 있어서 대응하는 값(100%)과 비교하였다. 프라이머 세트는 하기 표 1에 나타내었다.

(9) TOPFlash 검정

TCF 리포터 분석을 위하여, IMR90-1 hiPSC를 상술한 바와 같이 혈청 함유 분화 배양(serum-containing differentiation culture)으로 배양하고, 2일째에 TOPflash 플라스미드(Millipore 21-170) 및 pRL-SV40 플라스미드(바다 표고버섯(Renilla) 루시퍼라제 형질도입 대조구, Promega E1980)를 FuGENE HD transfection Reagenet(Promega E2311)를 이용하여 형질도입하였다. 24시간 후, 10μM KY02111, 10μM XAV939 또는 10μM IWP-2를 60ng/ml 마우스 Wnt3a(Wako 232-02421) 또는 3μM BIO의 어느 하나와 함께 배지에 첨가하였다. 형질도입 48시간 이후(4일째), 루시퍼라제 활성을 Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay System 키트(Promega E1980) 및 2030 ARVO X3 플레이트 리더(PerkinElmer)를 사용하여 측정하였다. 루시퍼라제 활성은 키트의 프로토콜에 따라 형질도입 대조구인 바다 표고버섯 루시퍼라제의 발광에 대해 정규화하였다. HEK293 세포를 이용한 실험에서는, 세포를 10% FBS DMEM 배지 중에서 배양하여 FuGENE HD를 이용하여 TOPflash 및 pRL-SV40 플라스미드를 형질도입하였다. 24시간 후, 형질도입한 세포를 10μM KY02111, 10μM XAV939 또는 10μM IWP-2를 3μM BIO 또는 60ng/ml 마우스 Wnt3a를 함께 포함하는 배지 중 96웰 플레이트에 파종하였다(10,000세포/웰). 루시퍼라제 활성은 상술한 방법으로 형질도입 48시간 후에 측정하였다.

(10) 패치고정법(Patch-Clamp Recording)

박동 hPSC 유래 심근세포로부터 단백질 분해효소 용액을 이용하여 세포를 분리하였다. 해리된 세포를, 젤라틴 코팅한 커버 유리 위에서 3 내지 7일간 배양하였다. 패치고정은 약 25℃의 항온실에서 실시하였다. 자발적 박동 콜로니(spontaneously beating cell)로부터, 전세포 패치고정(whole cell patch-clamp configuration)으로부터 얻은 데이터를 HEKA EPC10 증폭기(HEKA Instruments Inc.)를 이용하여 기록하였다. 외부 용액(140mM NaCl, 5mM KCl, 10mM HEPES, 2mM CaCl₂, 1mM MgCl₂ 및 10mM 포도당 함유)은 NaOH에 의해 pH 7.2로 조절하였다. 피펫 용액(80mM 아스파르트산 나트륨, 50mM KCl, 1mM MgCl₂, 10mM EGTA, 3mM ATP-Mg 및 10mM HEPES)은 KOH에 의해 pH 7.2로 조절하였다. 일부 실험에서는 세포를 0.1μM E4031, 4μM 크로마놀 293B, 4μM 자테브라딘(zatebradine), 1μM 테트로도톡신(tetradotoxin, TTX) 또는 4μM 니페디핀(nifedipine)으로 5분간 처리하였다. 이들 억제제는 Sigma-Aldrich로부터 입수하였다. E4031 및 TTX의 1mM 보관용액(은 H₂O로 조제하였다. 크로마놀 293B, 자테브라딘 염산염 및 니페디핀의 20mM 보관용액은 DMSO로 조제하였다. 보관용액은 모두 사용하기 전까지 -20℃에서 보존하였다. 전류 전압 곡선(current-voltage relationship)은 막전위(membrane potential)를 -40mV에서 -60mV로 유지하고, 탈분극 펄스(depolarizing pulse)를 500mm초, INa에 대해서는 -60mV에서 60mV까지, ICaL에 대해서는 -40mV에서 40mV까지, IKs 및 IKr에 대해서는 -40mV에서 40mV까지, 및 Ih에 대해서는 -50mV에서 -140mV까지 단계적으로 송달함으로써 취득하였다.

(11) QT 간격 연장 분석(QT interval prolongation assay)

미소 전극 배열(microelectrode array, MEA) 접시(Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany)를 ReproCoat(RCESD006, ReproCELL, Japan)으로 5% CO₂ 조건하 37℃에서 1시간 코팅하였다. 코팅 후 30일째인 KY02111 유도 심근세포를 전기 MAE 접시 상의 1ml Cardiomyocyte Culture Medium(RCESD006, ReproCELL, Japan)으로 옮겼다. 피펫의 팁 또는 유리 막대기를 이용하여 심근세포를 조심스럽게 전극으로 이동시키고, 하룻밤 배양하여 MEA 접시에 부착시켰다. 다음날, 배지를 Cardiomyocyte Test Medium(RCESD003, ReproCELL, Japan)으로 교환하였다. 맥박 콜로니의 존재를 확인한 다음, MEA 접시를 MEA 증폭기(Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany)에 접속하여, 심전도(ECG) 모양의 파형(electrocardiogram-like wave)을 기록하였다. 기록한지 2분 후, 300pM 아스테미졸(astemizole, Sigma) 또는 0.1% DMSO를 첨가하여 아스테미졸의 농도(300pM-30μM)를 4분마다 증가시켰다. 각 아스테미졸 처리 2분 후에 ECG 모양의 파형을 기록하였다. 박동율, Na+ 진폭, K+ 진폭 및 Na+-K+ 간격을 LabChart TM 소프트웨어 v7(ADInstruments, Adelaide, Australia)에 의해 해석하였다.

(12) 통계학적 해석

결과는 모두 평균±SEM으로 표시하였다. 독립된 양측 스튜던트 t검정(unpaired two-tailed student t-test)을 이용하여, 서로 다른 처리로부터의 측정값의 평균치를 비교하였다. P<0.05일 때 유의차가 있다고 판단하였다.

(13) 화학합성

KY02111, KY01041, KY02114, KY01045, KY01040, KY02109, KY01042, KY01043, KY01046 및 KY02104는 이하의 "3. 제조예"에 기재된 대로 합성하였다. PB2852, PB2572 및 PB2570:PB285238764, PB257239592 및 PB257074412는 UkrOrgSynthesis에서 구입하였다. T61164:T6116478은 ENAMINE에서 구입하였다.

2. 결과

(1) KY02111의 발견 및 특성 결정

hPSC로부터의 심근분화를 효율적으로 촉진하는 저분자 화합물을 동정하기 위하여, 사람 αMHC 프로모터 제어하에서 EGFP를 발현하는 원숭이 ES세포(ESC)을 이용하는 하이 콘텐츠 분석(HCA)시스템을 구축하였다(도 1의 a). 증강된 GFP 신호의 화학적 스크리닝(chemical screening)은 상술한 "1. 방법"의 설명과 같다. 이 시스템에 의해, GFP 강도 및 형광 영역을 포함하는 HCA 파라미터의 값을 대조구와 비교하여 유의적으로 증강시키는 분자로서 N11474이 동정되었다(스튜던트 t검정, P= 0.015).

상기 화학적 스크리닝에서 원숭이 ESC에 저분자 화합물을 8일간(6-14일째) 처리하였다. N11474이 효율적으로 분화를 촉진하는 기간을 결정하기 위해 복수의 패턴 처리를 하고, 14일째에 αMHC 프로모터 제어 하에서 발현된 EGFP의 전체 신호 강도를 관찰하였다(도 1의 b). 6-10일째의 N11474 처리는 상술한 검사 프로토콜과 마찬가지로 효과적이며, 8일째 이후(8-12일째 또는 10-14일째) 처리는 효과가 낮았다. 4-8일째의 처리에 의해 GFP 발현 증가가 최대가 되었고, 0-4일째의 처리에서는 GFP 발현은 완전히 억제되었다. 이들 결과는 N11474이 원숭이 ESC의 심근분화의 초기 단계(0-4일째)에서는 억제제로 작용하고, 중기 단계(4-8일째)에 있어서는 촉진제로 작용하는 것을 시사한다.

다음으로, N11474 유사체를 화학적으로 합성하여 이들 원숭이 ESC의 심근분화 촉진능력을 평가하였다. 구조-활성 상관관계 연구를 통하여, 벤조 티아졸 고리에 있어서 메톡시기의 전자 구인기(electron-withdrawing group)와의 치환 및 메틸렌 연결의 길이 조절에 의하여 생물학적 활성이 크게 개선되는 것으로 밝혀졌고, 그 결과 신규 분자인 KY02111이 얻어졌다(도 1의 c, d; 도 5의 a-c). 이 저분자 화합물은 대조구(DMSO)보다 약 73배, N11474보다 7.4배, 효율적으로 심근분화를 촉진하였다(도 1의 d).

KY02111 활성의 일반성을 다양한 영장류 및 설치류의 PSC을 이용하여 검토하였다. KY02111은 심장 박동 콜로니의 비율을 2종류의 사람 ESC주(KhES-1 및 KhES-3), 4종류의 사람 iPSC주(253G1, IMR90-1, IMR90-4 및 RCHIPC0003) 및 1종류의 마우스 ESC주(R1) 세포 응집괴에서 60-94% 증가시켰다(도 1의 e). hiPSCs(IMR90-1)을 이용한 시간 경과적 실험으로 박동 콜로니는 10일째에 출현해 25일째까지 수가 증가하였다(도 6). 맥박 콜로니를 계대 배양하면, 그 후의 박동 콜로니의 비율은 90%까지 증가했는데(도 6), 이것은 기계적 억제(mechanical inhibition)의 감소에 의한 것으로 판단되었다(비특허문헌 33). 심근 콜로니는 적어도 50일째까지 박동이 지속되었다(도 6).

(2) KY02111로 부터 생산되는 심근세포의 특성

면역 세포화학(immunocytochemistry)의 실험결과로부터, KY02111로 처리한 hiPSC(IMR90-1)에서는 약 73-85%가 심근 마커인 심근 토로포닌 T(cardiac troponin T, cTnT)α-액틴 또는 NKX2.5을 발현하지만, 이들 마커가 양성인 DMSO 처리 세포는 소수임을 보였다(도 2의 a, b). 심장 페이스메이커 마커(cardiac pacemaker marker)인 HCN4는 16%의 KY02111 처리 세포에서 발현하였고, 비멘틴 양성 세포(선유아세포)의 비율은 3.3배 감소하였다(도 2의 b). 평활근 마커인 SMA(smooth muscle actin)는 KY02111 처리 세포가 거의 검출되지 않았다(데이터 비 제시). 이러한 결과는, hPSC 유래 심근세포는 세포 소팅(cell sorting) 조작을 하지 않고, 단순히 KY02111 유도 세포 콜로니를 회수함으로써 농축할 수 있음을 시사한다. 15일째 및 30일째의 실시간 PCR 분석에 따라, KY02111 유도 심근세포(KY-CM)는 심근 마커인 αMHC, NKH2.5 및 HCN4을 발현하고, 검토한 이온 채널 유전자는 모두 성인 심장조직과 비슷한 수준으로 발현되고 있는 것이 밝혀졌다(도 2의 c).

전세포 패치고정법에 의한 전기 생리학적 분석을 이용하여, KY-CM이 기능적 세포인지의 여부를 검토하였다. 활동 전위 특성으로부터, KY-CM 집단은 심실 세포 및 페이스메이커 세포를 포함한다는 점이 시사되었다(도 2의 d). 전위 의존성 Ca² ⁺ 채널, Na⁺ 채널 및 HCN 채널 전류의 특성을 이온 통로 블로커인 니페디핀(nifedipine), 리도카인( lidocaine) 및 자테브라딘(zatebradine)을 각각 이용하여 검토하였다(도 7의 a-c). 전류 밀도와 전압의 관계로부터, KY-CM은 전기 생리학적으로 기능적인 세포임이 확인되었다. KY-CM을 HERG 채널 블로커인 E4031 및 KCNQ1 채널 블로커인 크로마놀 293B로 처리하면, 심전도(ECG)에 의해 검출되는 QT 연장에 상당하는 활동전위 지속시간(action potential duration, APD)이 증가하였다(도 2의 e). APD90(90% 재분극시의 APD)의 지속시간은 E4031 처리에 대해 37.0%±11.2, 크로마놀 293B 처리에 대해 42.1%±8.8 증가하였다(도 2의 e, 도 7의 e). 전위 의존성 K⁺전류는 E4031 및 크로마놀 293B의 처리에 의해 억제되었다(도 7의 d, e). 이들 결과는 KY-CM이 기능적 HERG 채널 및 KCNQ1 채널을 발현하고 있는 것을 나타낸다. 미소 전극 배열을 이용하여 실시한 약제 유발 QT 연장 시험으로, ECG 모양 파형이 KY-CM 콜로니에서 방출됨을 알 수 있었다(도 8의 a, b). 임상에서 QT 연장을 가져오는 아스테미졸(비특허문헌 34) 처리에 의해, ECG 모양 파형의 Na⁺-K⁺간격은 용량의존적으로 연장되었다(도 8의 c). 전체적으로 이들 결과는 KY-CM이 전기적 및 약리학적으로 기능적임을 나타낸다.

(3) KY02111에 의한 고전적(canonical) WNT 신호경로의 저해

KY02111이 어떻게 hPSC의 심근분화를 촉진하는지 알아보기 위하여, KY02111 처리 hiPSC(IMR90-1) 유전자 발현 프로파일을 마이크로어레이 기술을 이용하여 분석하였다. KY02111 또는 DMSO를 심근분화 배양 3일째(IMR90-1 세포에 있어서 최적인 시작점)에 첨가하고, 12시간 및 24시간 후에 세포 집단(cell population)을 회수하였다. KY02111 처리 후, 12시간 및 24시간 모두 22종류의 하향조절되는 유전자 및 4종류의 상향조절되는 유전자가 특정되었다(도 3의 a, 표 2). 마이크로어레이 해석에서는 소수의 유전자 밖에 추출되지 않았으나(세포 집단이 고도로 균질하지 않기 때문이라고 여겨진다), 마이크로어레이 데이터를 qPCR에 의해 확인하였다(도 9a). 하향조절된 22종류의 유전자에 대해 원위의 조절요소(distant regulatory element)를 예측 가능한 DiRE(비특허문헌 35)를 이용하여 공통의 전사인자 결합부위를 살펴보면, TCF4이 공통의 전사인자로 예측되었다(도 9b). 처리 세포에서 가장 하향조절된 상위 10개의 유전자를 조사하면, LEF1 및 TCF4이 공통의 전사인자로 예측되었다(도 9b). 하향조절된 22개의 유전자 중 16개의 유전자(70%)는 고전적 WNT 신호경로의 유전자 표적으로 판단되었다(표 2). 게다가, WNT 유전자 표적에 대한 KY02111의 효과는 XAV939 및 IWP-2 등의 다른 WNT 억제제의 효과와 매우 유사했지만, WNT 활성화제인 BIO의 효과와는 유사하지 않았다(도 9c). 이들 결과는 KY02111이 hPSC의 고전적 WNT 신호경로를 저해하는 것을 시사한다.

고전적 WNT 신호경로 활성측정에 일반적으로 이용되는 리포터 시스템인 TOPflash 검정을 이용하여, KY02111이 신규한 WNT 신호 억제제인지의 여부를 확인하였다. IMR90-1 세포에 TOPflash 및 pRL-SV40을 형질도입하고, KY02111 또는 다른 WNT 억제제와 함께 Wnt3a 또는 BIO를 처리하였다. KY02111 또는 기존의 WNT 억제제인 XAV939의 처리에 의해 분명히 루시퍼라제 활성이 감소되었다(도 9d). Wnt3a 또는 BIO을 이용한 TOPflash의 결과로부터, KY02111은 고전적 WNT 신호경로의 억제제임이 시사되었다. 흥미롭게도 HEK293 세포를 이용한 Wnt3a의 존재하에서의 TOPflash 검정에서는 KY02111이 루시퍼라제 활성을 증강할 것으로 나타났으나, Wnt3a 대신 BIO을 사용한 분석에서는 KY02111이 BIO의 WNT 활성화를 상쇄하는 것으로 밝혀졌다(도 9d). 이 활성은 세포주에 의존할 가능성이 있기는 하나, KY02111은 확실히 hPSC의 WNT 신호경로에 대한 억제 효과를 가진다.

(4) WNT 억제제와 KY02111의 시너지 효과

다음으로, KY02111, 몇가지 화학성 또는 단백질성 WNT 억제제(IWP-2, IWR-1, XAV939, DKK1 및 IGFBP4(비특허문헌 36)), 및 여러 종의 사이토카인 조합에 의해 형질도입 원숭이 ESC의 심근분화 촉진을 비교하였다. 예상한 대로, 이것들은 모두 αMHC 프로모터에 의해 유도되는 GFP 신호강도를 증강시켰지만, KY02111이 가장 효과적이고, 또 다른 화학성 WNT 억제제는 단백질성 억제제나 사이토카인보다 효과가 높았다(도 3의 c, d). KY02111의 처리에 의해 대조구와 비교하여 약 80배 분화가 증가하였다. KY02111 처리는 hiPSC의 심근분화의 촉진에서도 가장 효과적이었다(도 3의 d). 얻어진 분화세포의 전 세포 수는 WNT 억제제 사이에 유사하였다(도 10의 a), 박동 콜로니의 비율은 서로 상이하였으며, KY02111, IWP-2 및 XAV939의 각각에 대해 87,37 및 7.5%였다(도 3의 d). cTnT 양성 세포의 비율은 박동 콜로니의 비율과 같은 경향을 나타내었다(도 10의 b).

BIO을 IWP-2 또는 XAV939과 함께 첨가하면, 원숭이 ESC 및 hiPSC의 심근분화는 완전히 저해됐지만, KY02111에 의해 촉진되는 심근분화는 BIO의 영향을 받지 않았다(도 3의 c, d). 이들 결과는 KY02111에 의한 WNT 억제 메커니즘이 O-아실 전달 효소인 PORCN과 폴리 ADP-리보스 중합효소인 TNKS를 저해하는 IWP-2와 XAV939(비특허문헌 22, 31)와는 다르다는 점을 시사한다. KY02111은 고전적 WNT 신호경로에서 GSK3β의 하류에 작용할 수 있다.

WNT 억제제 간에 표적이 서로 다르므로, WNT 억제제를 조합하여 사용하는 것으로 다기능 줄기세포 심근세포의 분화가 증가하는지의 여부를 조사하였다. KY02111 단독으로, IMR90-1 iPSC에서 약 80%의 cTnT 양성 세포가 생산되었다. KY02111을 다른 WNT 억제제와 병용하여도 분화효율은 유의적으로 증가하지 않았다(도 10의 b). 그러나, WNT 억제제를 조합하여 처리하는 경우, KY02111 단독처리와 비교하여 전 세포 수 및 박동 콜로니 측정이 유의미하게 증강되었다(도 3의 e, 도 10의 a). 생산된 심근세포 수는 대조구와 비교하여, KY02111 처리에 의해서 80배, 조합 처리(KY+XAV, KY+IWP 및 KY+XAV+IWP)에 의해서 130-220배 높았다(도 3의 e).

(5) 기지조성의 사이토카인 및 이종 성분 불포함 심근분화

혈청 불포함 배지에서의 분화효율을 조사하면, 젤라틴 또는 사람 라미닌 211에 의한 코팅과 0.4% 사람 혈청 알부민 또는 1-2% 소혈청 알부민 첨가라는 2가지 요건이 밝혀졌다. 비 접착 세포(non-attached cell)는 거의 심근세포로 분화하지 않았고, 알부민을 포함하지 않는 혈청 불포함 배지에서는 세포사가 일어났다(데이터 비제시).

WNT 신호경로 활성화는 hPSC의 심근분화의 초기 단계에서 필요하다. 따라서, WNT 활성화제인 BIO 및 CHIR99021의 효과를 분화의 초기 단계에서 사이토카인인 BMP4의 비 존재하에 검토하였다(도 4의 a). BIO 및 CHIR99021에 의한 0-3일째의 처리 및 그에 이어 KY02111 단독 또는 KY02111 및 XAV939(KY+XAV)의 처리는 혈청 함유배지 및 혈청 불포함 알부민 함유배지 모두 IMR90-1 hiPSC의 84-98%의 분화를 가져왔다(도 4의 b, c). 이들 결과는 심근분화 유도에 외인성 BMP4와 혈청은 필수가 아니며, 저분자 화합물에 의한 WNT 신호경로 활성화와 내인성 신호 전달 인자로 충분하다는 것을 시사한다.

KY+XAV 처리에서는 KY02111 처리에 의한 분화효율과 유의적으로 서로 다른 분화효율을 얻지 못하였다(도 4의 b). 그러나, FACS 분석에 따르면 사이토카인 불포함 및 혈청 불포함 조건 하에서, KY+XAV의 처리에 의한 효율(98.1%)은 KY02111 단독 처리에 의한 효율(90.2%)보다 약간 높았다(도 4의 d). 게다가, 면역염색 해석결과, KY+XAV 처리에 의한 cTnT 양성 세포의 비율(97.7%±0.8)은 KY02111 단독 처리에 의한 비율(93.3%±4.4)보다 높은 것으로 나타났다(도 4의 b, c). 따라서, KY와 XAV의 병용은 hPSC의 고효율적인 심근분화를 야기하는 것으로 판단되었다.

KY02111과 혈청의 처리에 의한 분화효율(83.7%±8.0)은 KY02111과 알부민의 처리에 의한 분화효율(93.3%±4.4)보다 낮았다(도 4의 b). 맥박 콜로니 측정 및 심근세포 수는 혈청 존재하의 KY02111 처리보다 혈청 비 존재하의 KY02111 처리 쪽이 약 3배 높았다(도 4의 e). 마찬가지로, 혈청 존재하의 KY+XAV 처리에 의해 박동 콜로니 수 및 심근세포 수는 혈청 비 존재하 처리에 비해 약 1.5배 증가되었다(도 4의 e). 이러한 결과는 FBS가 심근 유도 및/또는 심근 전구세포의 증식을 저해하는 인자를 포함할 가능성이 있음을 시사한다.

추가적인 실험을 통하여, 서로 다른 hPSC(KhES-3, H1, H9 및 253G1)가 기지조성의 사이토카인 및 이종 성분 불포함 배지에서 KY02111, BIO, CHIR99021 및 XAV939에 의해 효율적으로 심근세포로 분화되는 것을 확인할 수 있었다. IMR90-1 hiPSC에서 관찰된 바와 같이, 시험한 모든 세포주에 있어서 이들 처리에 의한 박동 콜로니 및 cTnT 양성 세포의 비율이 증가하였다(도 11의 a, b). 게다가, cTnT 및 α-액티닌의 면역염색에 의하여, IMR90-1 hiPSC에서 유래된 심근세포에서 사코미어(sarcomere) 구조가 분명히 나타났다(도 11의 c). 전체적으로 이러한 결과는 WNT 신호경로를 조절하는 저분자 화합물과 기지조성의 배지를 이용하는 KY02111에 의한 분화방법에 의해, hPSC에서 유래한 기능적인 심근세포가 더 효율적으로 생산되는 것을 나타낸다.

3. 제조예

KYO01041

3,4-디메톡시 벤조일릴 클로라이드(100mg, 0.55mmol)와 트리에틸아민(83.0 ㎕, 6mmol)을 염화 메틸렌(500㎕)에 용해하고, 2-아미노-6-클로로벤조티아졸(105mg, 0.57mmol)을 가하여 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응종료된 후, 염화메틸렌으로 희석하고 포화 식염수로 세정하였다. 황산 마그네슘으로 건조시킨 후, 용매를 제거하였다. 잔사에 에탄올을 가하여 70℃로 가열하고 용해시킨 후 실온으로 냉각시킴으로써 재결정하여, 2-(3,4-디메톡시벤즈아미드)-6-클로로벤조티아졸을 130mg, 수율 68%로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃): d10.15(s, 1H), 7.83(d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.63-7.45(m, 3H), 7.36(dd, J= 1.8, 8.7 Hz, 1H), 6.91(d, J= 8.2 Hz, 1H), 3.96(s, 3H), 3.94(s, 3H)

MS(ESI) Found: 349 [M+H]⁺

KY02111

3-(3,4-디메톡시페닐)프로판오일 클로라이드(100mg, 0.42mmol)와 2-아미노-6-클로로벤조티아졸(78mg, 0.42mmol)을 기질로 이용하여 상기와 동일하게 반응을 수행하여, 2-(3-(3,4-디메톡시페닐)프로판아미드)-6-클로로벤조티아졸을 113mg, 수율 72%로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃): d9.41(s, 1H), 7.79(d, J= 2.9 Hz, 1H), 7.62(d, J= 11.7 Hz, 1H), 7.37(dd, J= 2.6, 11.4 Hz, 1H), 6.80-6.67(m, 3H), 3.85(s, 3H), 3.82(s, 3H), 3.03(t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.77(t, J= 9.9 Hz, 2H)

MS(ESI) Found: 399 [M+H]⁺

KY02114

4-(3,4-디메톡시페닐)부탄오일 클로라이드(100mg, 0.41mmol)와 2-아미노-6-클로로벤조티아졸(76mg, 0.41mmol)을 기질로 이용하여 상기와 동일하게 반응을 수행하여, 2-(4-(3,4-디메톡시페닐)부탄아미드)-6-클로로벤조티아졸을 121mg, 75%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃): d9.15(s, 1H), 7.79(d, J= 2.9 Hz, 1H), 7.64(d, J= 11.3 Hz, 1H), 7.39(dd, J= 2.6, 11.4 Hz, 1H), 6.80-6.68(m, 3H), 3.87(s, 3H), 3.84(s, 3H), 2.67(t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.48(t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.09(m, 2H)

MS(ESI) Found: 413 [M+H]⁺

KY01045

5-(3,4-디메톡시페닐)펜탄오일 클로라이드(30mg, 0.13mmol)와 2-아미노-6-클로로벤조티아졸(23mg, 0.13mmol)을 기질로 이용하여 상기와 동일하게 반응을 수행하여, 2-(5-(3,4-디메톡시페닐)펜탄아미드)-6-클로로벤조티아졸을 39mg, 75%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃): d8.91(s, 1H), 7.79(d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.66(d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.49(dd, J= 2.3, 8.7 Hz, 1H), 6.79(d, J= 7.8 Hz, 1H), 6.71(d, J= 7.8 Hz, 1H) 6.70(s, 1H), 3.87(s, 3H), 3.86(s, 3H), 2.62(t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.52(t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.80(m, 2H), 1.72(m, 2H)

MS(ESI) Found: 405 [M+H]⁺

KY01040

3,4-디메톡시벤조일릴 클로라이드(100mg, 0.5mmol)와 2-아미노-6-니트로벤조티아졸(105mg, 0.57mmol)을 기질로 이용하여 상기와 동일하게 반응을 수행하여, 2-(3,4-디메톡시벤자마이드)-6-니트로벤조티아졸을 100mg, 56%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃): d10.15(s, 1H), 8.80(d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.31(dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.73(d, J= 9.2 Hz, 1H), 7.63-7.47(m, 2H), 6.95(d, J= 8.7 Hz, 1H), 3.98(s, 3H), 3.97(s, 3H)

MS(ESI) Found: 360 [M+H]⁺

KY02109

2-(3,4-디메톡시페닐)아세틸 클로라이드(100mg, 0.51mmol)와 2-아미노-6-클로로벤조티아졸(94mg, 0.51mmol)을 기질로 이용하여 상기와 동일하게 반응을 수행하여, 2-(2-(3,4-디메톡시페닐)아세트아미드)-6-클로로벤조티아졸을 153mg, 83%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃): d8.91(s, 1H), 8.75(s, 1H), 8.31(dd, J= 12.1 Hz, 1H), 7.77(d, J= 11.7 Hz, 1H), 7.00-6.70(m, 3H), 3.92(s, 3H), 3.90(s, 3H), 3.86(s, 2H)

MS(ESI) Found: 396 [M+H]⁺

KY01042

3-(3,4-디메톡시페닐)프로판오일 클로라이드(100mg, 0.5mmol)와 2-아미노-6-니트로벤조티아졸(105mg, 0.57mmol)을 기질로 이용하여 상기와 동일하게 반응을 수행하여, 2-(3-(3,4-디메톡시페닐)프로판아미드)-6-니트로벤조티아졸을 138mg, 71%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃): d9.29(s, 1H), 8.75(d, J= 1.8 Hz, 1H), 8.31(dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.77(d, J= 9.2 Hz, 1H), 6.80(d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.75(d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.74(s, 1H), 3.85(s, 3H), 3.84(s, 3H), 3.06(t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.83(t, J= 7.3 Hz, 2H)

MS(ESI) Found: 388 [M+H]⁺

KY01043

4-(3,4-디메톡시페닐)부탄오일 클로라이드(55mg, 0.25mmol)와 2-아미노-6-니트로벤조티아졸(50mg, 0.25mmol)을 기질로 이용하여 상기와 동일하게 반응을 수행하여, 2-(4-(3,4-디메톡시페닐) 부탄아미드)-6-니트로벤조티아졸을 65mg, 66%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃): d8.75(d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.29(dd, J= 2.3, 8.7 Hz, 1H), 7.70(d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.75(d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.67(s, 1H), 6.66(d, J= 8.7 Hz, 1H), 3.83(s, 3H), 3.83(s, 3H), 2.66(t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.54(t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.11(m, 2H)

MS(ESI) Found: 402 [M+H]⁺

KY01046

5-(3,4-디메톡시페닐)펜탄오일 클로라이드(30mg, 0.13mmol)와 2-아미노-6-니트로벤조티아졸(25mg, 0.13mmol)을 기질로 이용하여 상기와 동일하게 반응을 수행하여, 2-(5-(3,4-디메톡시페닐)펜탄아미드)-6-니트로벤조티아졸을 38mg, 70%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃): d8.94(s, 1H), 8.75(d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.32(dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.81(d, J= 9.2 Hz, 1H), 6.80(d, J= 7.8 Hz, 1H), 6.72(d, J= 7.8 Hz, 1H) 6.71(s, 1H), 3.88(s, 3H), 3.86(s, 3H), 2.63(t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.56(t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.82(m, 2H), 1.73(m, 2H)

MS(ESI) Found: 416 [M+H]⁺

KY02104

2-(3,4-디메톡시페닐)아세틸 클로라이드(100mg, 0.51mmol)와 2-아미노-6-플루오로벤조티아졸(86mg, 0.51mmol)을 기질로 이용하여 상기와 동일하게 반응을 수행하여, 2-(2-(3,4-디메톡시페닐)아세트아미드)-6-플루오로벤조티아졸을 157mg, 89%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(CDCl₃): d9.14(s, 1H), 7.64(dd, J= 6.2, 12.1 Hz, 1H), 7.50(dd, J= 3.6, 11.0 Hz, 1H), 7.14(ddt, J= 3.7, 12.1 Hz, 1H), 6.90-6.78(m, 3H), 3.90(s, 3H), 3.87(s, 3H), 3.80(s, 2H)

MS(ESI) Found: 369 [M+H]⁺

SO087

2-아미노-6-브로모벤조티아졸(500mg, 2.18mmol), 3-(3,4-디메톡시페닐)프로피온산(505mg, 2.40mmol), O-(6-클로로벤조티아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로니움 헥사플루오로포스페이트(1.09g, 2.63mmol) 및 N,N'-디이소프로필에틸아민(419ml, 2.41mmol)을 함유하는 N,N'-디메틸포름아미드(5ml) 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 종료된 후, 반응용액을 초산에틸로 희석하고 포화 탄산수소나트륨 수용액, 증류수, 포화 염화나트륨 수용액으로 세정하였다. 황산 나트륨으로 건조시킨 후 용매를 제거하였다. 잔사에 에탄올을 가하여 환류시키고 재결정을 행하여, 2-(3-(3,4-디메톡시페닐)프로판아미드)-6-브로모벤조티아졸을 320mg, 35%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(DMSO-d₆): d12.45(s, 1H), 8.25(d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.66(d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.56(dd, J= 1.8, 8.4 Hz, 1H), 6.87-6.83(m, 2H), 6.77-6.73(m, 1H), 3.71(s, 3H), 3.70(s, 3H), 2.88(t, J= 7.0 Hz, 2H), 2.79(t, J= 7.0 Hz, 2H)

SO102

2-아미노-6-클로로벤조티아졸(55mg, 0.298mmol)과 3-(3,4-디메톡시페닐)프로피온산(80mg, 0.357mmol)을 기질로 이용하여 SO087과 동일한 반응을 수행하여, N-(6-클로로벤조티아졸-2-일)-3-(4-에톡시-3-메톡시페닐)프로판아미드를 40mg, 34%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(DMSO-d₆): d12.44(s, 1H), 8.11(d, J= 2.2 Hz, 1H), 7.71(d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.44(dd, J= 2.2, 8.8 Hz, 1H), 6.90-6.82(m, 2H), 6.72(dd, J= 1.8, 7.0 Hz), 3.94(q, J= 7.0 Hz, 2H), 3.72(s, 3H), 2.91-2.85(m, 2H), 2.82-2.75(m, 2H), 1.28(t, J= 7.0 Hz, 3H)

SO094

2-아미노-6-히드록시벤조티아졸(400mg, 2.41mmol)의 N,N'-디메틸포름아미드(7ml) 용액을 아르곤 분위기하에서 빙냉 교반하면서 수소화 나트륨(60%)(106mg, 2.65mmol)을 가하여 30분간 교반한 후, 4-브로모에틸 부티레이트(521ml, 3.62mmol)를 가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 종료된 다음, 반응액을 초산 에틸로 희석하고, 포화 염화 암모늄 수용액, 포화 염화 나트륨 수용액으로 세정하였다. 황산 나트륨으로 건조시킨 후, 용매를 제거하고, 에틸 4-((2-아미노벤조티아졸-6-일)(옥시)부타노에이트를 372mg, 55%의 수율로 수득하였다.

에틸 4-((2-아미노벤조티아졸-6-일)옥시)부타노에이트(372mg, 1.33mmol), 3-(3,4-디메톡시페닐)프로피온산(335mg, 1.59mmol), O-(6-클로로벤조티아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸유로니움 헥사플루오로포스페이트(659mg, 1.59mmol) 및 N,N'-디이소프로필에틸아민(278ml, 1.59mmol)의 N,N'-디메틸포름아미드(5ml) 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 종료된 다음, 반응액 초산 에틸로 희석하고, 포화 탄산 수소나트륨 수용액, 증류수, 포화 염화 나트륨 수용액으로 세정하였다. 황산 나트륨으로 건조하고, 용매를 제거하였다. 잔사를 에탄올을 가하여 환류하고 재결정을 행하여, 에틸 4-((2-(3-(3,4-디메톡시페닐)프로판아미드)벤조티아졸-6-일)옥시)부타노에이트를 447mg, 76%의 수율로 수득하였다.

에틸 4-((2-(3-(3,4-디메톡시페닐)프로판아미드)벤조티아졸-6-일)옥시)부타노에이트(447mg, 0.946mmol)의 1,4-디옥산 용액에 5N NaOH 수용액(378ml)을 가하고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 종료된 다음, 반응액을 농축하고 빙냉 하에서 6N 염산으로 중화시켰다. 추출물을 흡인하여 수세한 다음, 4-((2-(3-(3,4-디메톡시페닐)프로판아미드)벤조티아졸-6-일)옥시)부탄산을 271mg, 64%의 수율로 수득하였다.

4-((2-(3-(3,4-디메톡시페닐)프로판아미드)벤조티아졸-6-일)옥시)부탄산 (100mg, 0.225mmol) 및 모르폴린(22ml, 0.248mmol)의 N,N'-디메틸포름아미드(1ml) 용액에 1-히드록시벤조트리아졸(38mg, 0.248mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 염산염(52mg, 0.270mmol)을 가하고 실온에서 2일간 교반하였다. 반응이 종료된 다음, 반응액을 초산 에틸로 희석하고 포화 탄산 수소나트륨 수용액, 증류수, 포화 염화 나트륨 수용액으로 세정하였다. 황산 나트륨으로 건조하여 용매를 제거하였다. 잔사를 에탄올을 가하여 환류하고, 재결정을 행하여 3-(3,4-디메톡시페닐)-N-(6-(4-모르폴리노-4-옥소부톡시)벤조티아졸-2-일)프로판아미드를 50mg, 43%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(DMSO-d₆): d12.20(s, 1H), 7.60(d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.55(d, J= 2.6 Hz, 1H), 7.01(dd, J= 2.6, 8.8 Hz, 1H), 6.86-6.83(m, 2H), 6.75(dd, J= 1.8, 8.1 Hz), 4.03(t, J= 6.2 Hz, 2H), 3.71(s, 3H), 3.70(s, 3H), 3.56-3.53(m, 4H), 3.46-3.42(m, 4H), 2.87(t, J= 7.0 Hz), 2H), 2.75(t, J= 7.0 Hz, 2H), 2.51-2.46(m, 2H), 1.96(t, J= 7.0 Hz, 2H)

SO096

4-((2-(3-(3,4-디메톡시페닐)프로판아미드)벤조티아졸-6-일)옥시)부탄산 (80mg, 0.180mmol)과 1-메틸피페라진(21.8ml, 0.198mmol)을 기질로 이용하여 SO094과 동일한 반응을 수행하여, 3-(3,4-디메톡시페닐)-N-(6-(4-(4-메틸피페라진-1-일)-4-옥시부톡시)벤조티아졸-2-일)프로판아미드를 39mg, 41%의 수율로 수득하였다.

¹H NMR(DMSO-d₆): d12.20(br s, 1H), 7.54(d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.48(d, J= 2.6Hz, 1H), 6.96(dd, J= 2.6, 8.8 Hz, 1H), 6.86-6.82(m, 2H), 6.73(dd, J= 1.8, 8.1 Hz, 1H), 4.01(t, J= 6.2 Hz, 2H), 3.71(s, 3H), 3.69(s, 3H), 3.45-3.41(m, 4H), 2.86(t, J= 7.7 Hz, 2H), 2.70(t, J= 7.7 Hz, 2H), 2.50-2.45(m, 2H), 2.29-2.20(m, 4H), 2.15(s, 3H), 1,94(t, J= 7.0 Hz, 2H)

비특허문헌

1. Suemori, H. et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochem Biophys Res Commun 345, 926-932(2006).

2. Smith, K.P., Luong, M.X. & Stein,g.S. Pluripotency: toward agold standard for human ES and iPS cells. J Cell Physiol 220, 21-29(2009).

3. Yamashita, J.K. ES and iPS cell research for cardiovascular regeneration. Exp Cell Res 316, 2555-2559(2010).

4. Yoshida, Y. & Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol 50, 327-332(2011).

5. Lutolf, M.P.,gilbert, P.M. & Blau, H.M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature 462, 433-441(2009).

6. Irion, S., Nostro, M.C., Kattman, S.J. & Keller,g.M. Directed differentiation of pluripotent stem cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 73, 101-110(2008).

7. Chien, K.R., Moretti, A. & Laugwitz, K.L. Development. ES cells to the rescue. Science 306, 239-240(2004).

8. Menasche, P. Stem cell therapy for heart failure: are arrhythmias a real safety concern? Circulation 119, 2735-2740(2009).

9. Passier, R., van Laake, L.W. & Mummery, C.L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature 453, 322-329(2008).

10. Segers, V.F. & Lee, R.T. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature 451, 937-942(2008).

11. Srivastava, D. & Ivey, K.N. Potential of stem-cell-based therapies for heart disease. Nature 441, 1097-1099(2006).

12. Chien, K.R., Domian, I.J. & Parker, K.K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science 322, 1494-1497(2008).

13. Laflamme, M.A. & Murry, C.E. Heart regeneration. Nature 473, 326-335(2011).

14. Hansson, E.M., Lindsay, M.E. & Chien, K.R. Regeneration next: toward heart stem cell therapeutics. Cell Stem Cell 5, 364-377(2009).

15. Rajala, K., Pekkanen-Mattila, M. & Aalto-Setala, K. Cardiac differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cells Int 2011, 383709(2011).

16. Yang, L. et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature 453, 524-528(2008).

17. Paige, S.L. et al. Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells. PLoS One 5, e11134(2010).

18. Even, M.S., Sandusky, C.B. & Barnard, N.D. Serum-free hybridoma culture: ethical, scientific and safety considerations. Trends Biotechnol 24, 105-108(2006).

19. Kattman, S.J. et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell 8, 228-240(2011).

20. Burridge, P.W. et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One 6, e18293(2011).

21. Xu, Y., Shi, Y. & Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature 453, 338-344(2008).

22. Chen, B. et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol 5, 100-107(2009).

23. Ichida, J.K. et al. A small-molecule inhibitor of tgf-Beta signaling replaces sox2 in reprogramming by inducing nanog. Cell Stem Cell 5, 491-503(2009).

24. Sato, A., Kawazoe, Y., Kamisuki, S. & Uesugi, M. Synthesis of synthetic small molecule transcription factors(STF). Nucleic Acids Symp Ser(Oxf), 29-30(2006).

25. Kamisuki, S. et al. A small molecule that blocks fat synthesis by inhibiting the activation of SREBP. Chem Biol 16, 882-892(2009).

26.graichen, R. et al. Enhanced cardiomyogenesis of human embryonic stem cells by a small molecular inhibitor of p38 MAPK. Differentiation 76, 357-370(2008).

27. Hao, J. et al. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PLoS One 3, e2904(2008).

28. Naito, A.T. et al. Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 19812-19817(2006).

29. Qyang, Y. et al. The renewal and differentiation of Isl1+ cardiovascular progenitors are controlled by a Wnt/beta-catenin pathway. Cell Stem Cell 1, 165-179(2007).

30. Ren, Y. et al. Small molecule Wnt inhibitors enhance the efficiency of BMP-4-directed cardiac differentiation of human pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol 51, 280-287(2011).

31. Wang, H., Hao, J. & Hong, C.C. Cardiac induction of embryonic stem cells by a small molecule inhibitor of Wnt/beta-catenin signaling. ACS Chem Biol 6, 192-197(2011).

32. Willems, E. et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res 109, 360-364(2011).

33. Otsuji, T.G. et al. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Res 4, 201-213(2010).

34. Suessbrich, H., Waldegger, S., Lang, F. & Busch, A.E. Blockade of HERG channels expressed in Xenopus oocytes by the histamine receptor antagonists terfenadine and astemizole. FEBS Lett 385, 77-80(1996).

35.gotea, V. & Ovcharenko, I. DiRE: identifying distant regulatory elements of co-expressedgenes. Nucleic Acids Res 36, W133-139(2008).

36. Zhu, W. et al. IGFBP-4 is an inhibitor of canonical Wnt signalling required for cardiogenesis. Nature 454, 345-349(2008).

37. Mignone, J.L., Kreutziger, K.L., Paige, S.L. & Murry, C.E. Cardiogenesis from human embryonic stem cells. Circ J 74, 2517-2526(2010).

38. Sato, S., Murata, A., Shirakawa, T. & Uesugi, M. Biochemical target isolation for novices: affinity-based strategies. Chem Biol 17, 616-623(2010).

39. Jacot, J.G., Martin, J.C. & Hunt, D.L. Mechanobiology of cardiomyocyte development. J Biomech 43, 93-98(2010).

40. Asai, Y., Tada, M., Otsuji, T.G. & Nakatsuji, N. Combination of functional cardiomyocytes derived from human stem cells and a highly-efficient microelectrode array system: an ideal hybrid model assay for drug development. Curr Stem Cell Res Ther 5, 227-232(2010).

41. Thomson, J.A. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147(1998).

42. Takahashi, K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872(2007).

43. Yu, J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917-1920(2007).

44. Suemori, H. & Nakatsuji, N.generation and characterization of monkey embryonic stem cells. Methods Mol Biol 329, 81-89(2006).

45. Suemori, H. et al. Establishment of embryonic stem cell lines from cynomolgus monkey blastocysts produced by IVF or ICSI. Dev Dyn 222, 273-279(2001).

46. Yuasa, S. et al. Transient inhibition of BMP signaling by Noggin induces cardiomyocyte differentiation of mouse embryonic stem cells. Nat Biotechnol 23, 607-611(2005).

47. Murakami,g. et al. Chemical library screening identifies a small molecule that downregulates SOD1 transcription for drugs to treat amyotrophic lateral sclerosis. J Biomol Screen 16, 405-414(2011).

이상의 문헌의 어느 것도 인용에 의해 본 명세서에 포함되었다.

서열목록 프리텍스트

서열번호 1: 프라이머

서열번호 2: 프라이머

서열번호 3: 프라이머

서열번호 4: 프라이머

서열번호 5: 프라이머

서열번호 6: 프라이머

서열번호 7: 프라이머

서열번호 8: 프라이머

서열번호 9: 프라이머

서열번호 10: 프라이머

서열번호 21: 프라이머

서열번호 22: 프라이머

서열번호 23: 프라이머

서열번호 24: 프라이머

서열번호 25: 프라이머

서열번호 26: 프라이머

서열번호 27: 프라이머

서열번호 28: 프라이머

서열번호 29: 프라이머

서열번호 30: 프라이머

서열번호 31: 프라이머

서열번호 32: 프라이머

서열번호 33: 프라이머

서열번호 34: 프라이머

서열번호 35: 프라이머

서열번호 36: 프라이머

SEQUENCE LISTING <110> Kyoto University <120> Method for Inducing Cardiac Differentiation of Pluripotent Stem Cells <130> 671287 <150> US 61/591,805 <151> 2012-01-27 <160> 36 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 1 acccctcgga ccataggatt ac 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 2 aaggcgcact gaagttctgt g 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 caacctcact gacggtgaaa aa 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 acaaattctg gtgtgccaaa gtt 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 ccttggatgg gtattccaga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 6 cctgaggcac agtctgatga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 7 tgttggggag gagtttcatc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 8 gcacaacaag tggaagggac 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 9 ccaacaacta caacgcctac ga 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 10 cccttcttgg tcttcccatt ct 22 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 11 cccaagcccc atagtgccca aag 23 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 12 caggggaggc atcgcagggt c 21 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 13 ggtaccccga catccactt 19 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 14 tggaaggatt tcccactctg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 15 ctcaagctca tggccactct 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 16 gcctcctttg cttttaccac t 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 17 acaagctgca gctaaaggtc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 18 tcaagatgtg gcaaagctac 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 19 accctgagtc ccctggattt 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 20 tcactcattg cacgctgcat 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 21 ctgctgcttt ggtgtcagag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 22 ttcctatggg gtcatccttg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 23 ggtgtccatc aacaacatgg 20 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 24 gccttgaaga gcgcgtag 18 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 25 gagcaacttg tcggtgctg 19 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 26 gatttggcca gcttgaagac 20 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 27 catgctcacg gtgttcca 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 28 catgctcacg gtgttcca 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 29 ctatgctgcg ctgggagt 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 30 ctcgcagggg ttgtcttc 18 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 31 acgcttactg ccagggtgac 20 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 32 gccgactggc aaccagag 18 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 33 ccacctcaac ctcatggtg 19 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 34 acagtgaggg cttcccaat 19 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 35 atggaaatcc catcaccatc tt 22 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 36 cgccccactt gattttgg 18

Claims

다음의 각 공정을 포함하는 다기능 줄기세포의 심근분화 유도방법:
(1) 다기능 줄기세포를 1 이상의 WNT 신호 활성화제를 포함하는 배지 중에서 배양하는 공정; 및,
(2) 상기 공정 (1)에서 수득한 세포를 1 이상의 WNT 신호 억제제를 포함하는 배지 중에서 배양하는 공정.
제1항에 있어서,
1 이상의 WNT 신호 억제제가 이하의 일반식(I)의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 방법:

상기 식에서,
R₁-R₅는 각각 독립적으로 수소 원자; 할로겐 원자; 수산기; 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기; 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기; 또는 -NR₁₂R₁₃(R₁₂ 및 R₁₃은 각각 독립적으로 수소 원자, 산소 원자, 또는 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이다)이고(이때, R₁-R₅ 중 인접한 2개가 함께 -O-CH₂-O- 또는 -O-(CH₂)₂-O-을 형성하여도 무방하다),
R₆-R₉는 각각 독립적으로 수소 원자; 할로겐 원자; 수산기; 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기; -C(O)A로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기(A는 비치환 또는 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기로 치환된 포화 또는 불포화 5 또는 6 원환이며, 상기 환은 질소 원자, 산소 원자, 및 황 원자로부터 독립적으로 선택되는 1 또는 2 개의 원자를 포함할 수 있다); 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기; 또는 -NR₁₂R₁₃(R₁₂ 및 R₁₃는 각각 독립적으로 수소 원자, 산소 원자, 또는 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이다)이며(이때, R₆-R₉ 중 인접한 2 개가 함께 -O-CH₂-O- 또는 -O-(CH₂)₂-O-을 형성하여도 무방하다),
R₁₀-R₁₁은 각각 독립적으로 수소 원자; 또는 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이고,
X는, -CR₁₄(R₁₄는 수소 원자, 할로겐 원자, 수산기, 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알콕시기, 또는 비치환 또는 할로겐 원자로 치환된 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 알킬기이다); 산소 원자; 황 원자; 셀레늄 원자; 또는 -NR₁₅(R₁₅는 수소 원자, 탄소수 1~5 직쇄 또는 분지상의 알킬기, 또는 탄소수 1~5의 직쇄 또는 분지상의 아실기이다)이며, 및
n은 0-6의 정수이다.
제2항에 있어서,
1 이상의 WNT 신호 억제제가 이하의 그룹으로부터 선택되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는
방법.
KYO2111

KY01041

T61164

KY02114

KY01045

KY01040

KY02109

KY01042

KY01043

KY01046

PB2852

N11474

PB2572

PB2570

KY02104

SO087

SO102

SO096

SO094
제3항에 있어서,
1 이상의 WNT 신호 억제제가 이하의 화합물 또는 그의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는
방법.
KYO2111
제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 있어서,
1 이상의 WNT 신호 억제제가 XAV939 및 IWP-2로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 WNT 신호 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는
방법.
제1항 내지 제5항의 어느 한 항에 있어서,
1 이상의 WNT 신호 활성화제가 GSK3β억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는
방법.
제6항에 있어서,
1 이상의 WNT 신호 활성화제가 BIO 및 CHIR99021로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 WNT 신호 활성화제를 포함하는 것을 특징으로 하는
방법.
제1항 내지 제7항의 어느 한 항에 있어서,
공정 (1) 및 (2)에 있어서의 배지가 혈청을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는
방법.
제1항 내지 제8항의 어느 한 항에 있어서,
공정 (1) 및 (2)에 있어서의 배지가 사이토카인을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는
방법.
제1항 내지 제9항의 어느 한 항에 있어서,
공정 (1) 및 (2)에 있어서의 배지가 알부민을 포함하는 것을 특징으로 하는
방법.
제10항에 있어서,
공정 (1) 및 (2)에 있어서의 배지가 알부민 이외의 단백질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는
방법.
제1항 내지 제11항의 어느 한 항에 있어서,
공정 (1) 및 (2)가 이종성분 비 존재하에서 행해지는 것을 특징으로 하는
방법.
제1항 내지 제12항의 어느 한 항에 있어서,
다기능 줄기세포가 원숭이 또는 사람 다기능 세포인 것을 특징으로 하는
방법.
제1항 내지 제13항의 어느 한 항에 있어서,
심근세포의 제조방법인 것을 특징으로 하는
방법.
1 이상의 WNT 신호 활성화제 및/또는 1 이상의 WNT 신호 억제제를 포함하며, 제1항 내지 제14항의 어느 한 항에 기재된 방법에 사용되는 것을 특징으로 하는 심근분화 촉진용 키트.