JPWO2013111875A1 - 多能性幹細胞の心筋分化誘導法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)多能性幹細胞を1以上のWNTシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程、および;
(2)工程(1)で得られた細胞を1以上のWNTシグナル阻害剤を含む培地中で培養する工程。
を含む方法を提供する。
式(I):
R1−R5は、各々独立して、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基;非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基−NR12R13(R12及びR13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基である)である、ここでR1−R5のうち隣接する2つが一緒になって−O−CH2−O−または−O−(CH2)2−O−を形成していてもよい、
R6−R9は、各々独立して、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基;基−C(O)Aで置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基(Aは、非置換又は炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和5または6員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される1または2個の原子を含んでいてもよい);非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基−NR12R13(R12及びR13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基である)である、ここでR6−R9のうち隣接する2つが一緒になって−O−CH2−O−または−O−(CH2)2−O−を形成していてもよい、
R10−R11は、各々独立して、水素原子;又は炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基である、
Xは、−CR14(R14は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基、非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基である);酸素原子;硫黄原子;セレン原子;又は基−NR15(R15は、水素原子、炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数1〜5の直鎖又は分岐アシル基である)である、および
nは、0から6の整数である]。
KY02111
(1)hESC, hiPSC、およびサルESCの培養
PSC株はいずれも、マイトマイシンC処理マウス胎児線維芽細胞 (MEF)上、Primate ES Cell Culture Medium (ReproCELL Inc., Japan)中で、hPSCについては 5 ng ml-1 bFGFとともに、サルESCについてはbFGFなしで、維持した。ヒトESC株は、KhES-1、KhES-3、H1、およびH9(非特許文献1,41)を用いた。ヒトiPSC株は、253G1、IMR90-1、IMR90-4(非特許文献42,43)、およびRCHIPC0003を用いた。RCHIPC0003は、ReproCELLによりヒト線維芽細胞から樹立された。サルESC株は、CMK6.4(非特許文献1,44,45)を用いた。hESC株は、ヒトES細胞の樹立及び使用に関する指針(文部科学省)にしたがい使用した。
ヒトαMHCプロモーターの制御下でEGFPを発現するサルESCを作成するため、転写開始部位の上流からオープンリーディングフレーム直前の第3エキソンまでの918 bpを、KhES-1 hESCのゲノムDNAからPCRにより、プライマーセット(フォワードプライマー, 5’- CCAGGCACCTGCACCCTCTGG-3’; リバースプライマー, 5’- ( SalI リンカーを含む) 22 TAGTCGACCTTGGTGCTTCCCCTGGGTCAGAG-3’)を用いて増幅し、pGEM-T Easy Vector (Promega)にライゲートした。クローニングベクター由来のHindIII/SalI フラグメントをpEGFP-1 (Clontech)に結合した。直鎖化したαMHC-EFGP ベクターを CMK6.4 サルESCにエレクトロポレーションにより導入した。トランスジェニックESCクローンは、G418 (Sigma-Aldrich)により選択的に増殖させた。EGEPの発現は拍動コロニーにおいて確認した。
コンフルエント (継代4-5日後) のαMHC-GFPトランスジェニックサルESCをCTK溶液(非特許文献1)により酵素的に解離させ、ESC塊 (直径40-100 μm) を40μmおよび100 μmのCell Strainer (BD Biosciences)を用いて得た。このESC塊 (約5.0×103 細胞/ウェル) を96ウェルプレート (Greiner Bio-One, 96-well black plate, Cat. No. 655090) に移し、下記(4)の心筋分化培地中でインキュベートした。心筋分化6-14日目に、化合物ライブラリー由来の9600化合物 (DMSOに溶解) を、96ウェルプレートを用いてスクリーニングした。16ウェルを対照 (0.1% DMSO)に、80ウェルを化合物(1ウェルにつき1化合物)に使用した。各化合物の最終濃度は約1-5μMであった。低分子化合物を含む培地は、4日毎に交換した。14日目に、Metamorphイメージングシステム (Molecular Device)を用いたプレート全体のスキャニングにより、ESCのGFP蛍光を測定した。Metamorphソフトウェアを使用してGFP蛍光データを解析し、各ウェルについて、蛍光領域、全蛍光強度、平均蛍光強度、およびGFP陽性コロニーの数を計算した。ヒット化合物は以下の基準により決定した:その化合物のウェルの平均蛍光強度が対照の平均蛍光強度(16ウェルの平均)+6 SDよりも大きく、その化合物の全蛍光強度が対照の全蛍光強度+0 SD よりも大きい;または、その化合物の全蛍光強度が対照の全蛍光強度+4 SD よりも大きく、その化合物の平均蛍光強度が対照の平均蛍光強度+0 SD よりも大きい。120化合物がこの基準を満たし、各化合物につき8ウェルを用いて再試験した。N11474という分子が、DMSOと比較して有意にESCのGFP蛍光を増加させた (スチューデントt検定t, P=0.015)。
コンフルエントのhESCおよびhiPSCをCTK溶液を用いて穏やかに解離させ、Primate ES Cell Culture Medium (ReproCELL, Japan)を用いてペトリ皿 (BD BioSciences) に移した。細胞を懸濁培養にて8-24時間維持し、凝集させた。hPSC凝集体の大きさ (直径0.3-1 mm) は、効率的な分化に重要である。懸濁培養に続き、細胞凝集体を培養ディッシュに以下の心筋分化培地中で付着させた (3-10×105 細胞/cm2):IMDM (Sigma) (20% FBS (Gibco)、1% MEM 非必須アミノ酸溶液 (Sigma)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Gibco)、および0.005N NaOH、並びに10 ng ml-1 BMP4 (R&D Systems)含有)。3日目(hiPSC株)または4日目(ヒトまたはサルESC株)に、培地を10μM KY02111および/または他のWNT阻害剤を添加した心筋分化培地に交換した:XAV939 (Wako, Japan)、IWP-2 (Santa Cruz Biotechnology)、IWR-1 (Merck4Bioscience)、IGFBP4 (R&D Systems)、Dkk1 (R&D Systems)、並びに、bFGF (R&D Systems)、BMP4 (R&D Systems)、VEGF (R&D Systems)、DKK1 (R&D Systems)、およびActivin A (R&D Systems)の混合物(非特許文献16)。培地は2-3日毎に交換した。KY02111および他のWNT阻害剤は、hiPSC株およびサルESC株については9日目まで、hESC株については14日目まで添加した。15日目に、培養ディッシュ上の心筋細胞コロニーを、プロテアーゼ溶液 (0.1% コラゲナーゼタイプI、0.25% トリプシン、1 U ml-1 DNase I、116 mM NaCl、20 mM HEPES、12.5 mM NaH2PO4、5.6 mM グルコース、5.4 mM KCl、および0.8 mM MgSO4、pH 7.35)とともに0.5-2時間インキュベートし、ウェルの底から全ての心筋コロニーを解離させた。解離した心筋コロニーを新しい心筋分化培地を含む15 mlチューブに移し、重力により沈澱させ、上清を吸引により除去した。次いで、心筋コロニーを、超低接着培養ディッシュ (Corning, 3261) または6ウェルプレート (Corning, YO-01835-24) に、血清およびNaOHをいずれも含まない心筋分化培地中にて移した。この浮遊心筋コロニーを1ヵ月以上維持し、培地を5日毎に交換した。マウスESC (R1株)の分化方法は既報のとおり実施し(非特許文献46)、KY02111は3-6日目に添加した。拍動コロニーは9日目に計測した。
上記のペトリ皿での前培養後、細胞凝集体を、ゼラチン (Sigma G2625) またはヒトラミニン211 (BioLamina, Sweden) をコートした培養ディッシュに、以下の血清不含心筋分化培地中、3-10 x 105 細胞/cm2で付着させた:IMDM (Sigma)(1% MEM 非必須アミノ酸溶液 (Sigma)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)、2 mM L-グルタミン (Sigma)、0.5 mM L-カルニチン (Sigma)、0.001% 2-メルカプトエタノール (Gibco)、および1-2% ウシ血清アルブミン (Wako, Japan)、または0.4% ヒト血清アルブミン (Sigma)、並びに5μM CHIR99021 (Axon)および2μM BIO (Calbiochem)を含有))。3-9日目に、10μM KY02111および/または他のWNT阻害剤 (XAV939および/またはIWP-2)を細胞培養に添加し、培地を2日毎に交換した。15日目に、心筋コロニーをプロテアーゼ溶液と5-10分間インキュベートし、全てのコロニーをウェルの底から解離させた。この心筋コロニーを、0.1% アルブミンを含む心筋分化培地ともに15 mlチューブに移し、重力により沈澱させ、上清を回収し、心筋コロニーを超低接着培養6ウェルプレート(Corning, YO-01835-24) に0.1% アルブミンを含む心筋分化培地ともに移した。この浮遊心筋コロニーを1ヵ月以上維持し、培地を5日毎に交換した。
心筋コロニーを、前述のプロテアーゼ溶液とともに1-2時間37℃で撹拌することにより解離させ、ゼラチン (Sigma)でコートしたカバーガラス上で1日培養し、4% パラホルムアルデヒドで固定した。Triton Xで透過処理後、細胞を2% スキムミルクで1-2時間処理し、以下の一次抗体と2時間インキュベートした: NKX2.5 (ウサギポリクローナル, 1:250; Abcam)、αアクチニン (マウスモノクローナル, 1:800;Sigma)、心筋TnT (マウスモノクローナル, 1:100; Santa Cruz Biotechnology)、ビメンチン (マウスモノクローナル, 1:800; Sigma V6630)、およびHCN4 (マウスモノクローナル, 1:400; Abcam)。使用した二次抗体は、Alexa546結合抗マウスIgG、Alexa488結合抗マウスIgG、およびAlexa488結合抗ウサギIgG (1:1000; いずれもMolecular Probes, Invitrogenより入手)。核はDAPIにより可視化した。画像は蛍光顕微鏡 (Olympus)下に取得した。cTnT、αアクチニン、NKX2.5、HCN4、およびビメンチン陽性細胞の数を3つのランダムな領域から、Metamorphイメージングシステム (Molecular Devices)を用いて計測した。約1000個のDAPI染色細胞を用いて免疫陽性細胞の割合を計算した (免疫陽性細胞数/DAPI染色細胞数)。フローサイトメトリーのため、hPSC由来心筋コロニーからの単一細胞を抗cTnT抗体により染色し、Alexa488結合抗マウスIgG二次抗体により染色した。細胞は、FACS CantoII フローサイトメーター (BD Biosciences)を用いて解析した。データは、FACADiva ソフトウェア (BD Biosciences)を使用して解析した。
IMR90-1 iPSCを血清含有心筋分化培地中で培養した。3日目に、細胞を10μM KY02111または0.1% DMSOにて0、12、または24時間処理した。非処理細胞(0 h)、KY02111で12時間または24時間処理した細胞 (KY12hrまたはKY24hr)、0.1% DMSOで12時間または24時間処理した細胞 (DMSO12hrまたはDMSO24hr)をマイクロアレイ解析に使用した。全RNAをRNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて製造元の説明にしたがい調製した。cDNAの合成、インビトロ転写、およびビオチンラベル化cRNA、およびHuman Gene 1.0 ST アレイ (Affymetrix)へのハイブリダイゼーションは、Affymetrixのプロトコールにしたがい実施した。ハイブリダイズ後のアレイは、Affymetrix GeneChip Scannerを用いてスキャンした。データの正規化および更なる解析は、GeneSpring GX (Agilent Technologies)を用いて行った。遺伝子を発現する処理細胞の対照に対する割合 (KY02111/DMSO)を、各時点で計算した。KY02111の処理後12時間および24時間の両方の時点でKY/DMSO比において25%を超える変化を示す遺伝子を、KY02111に応答してダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションされる遺伝子として同定した(ダウンレギュレーションされる遺伝子=KY12h/DMSO12h <0.75 およびKY24h/DMSO24h <0.75; アップレギュレーションされる遺伝子=KY12h/DMSO12h >1.25およびKY24h/DMSO24h >1.25)。マイクロアレイデータは、NCBIのGene Expression Omnibus (GEO) パブリックデータベースへ提出した (GEO accession number, GSE33622)。DiRE(Distant Regulating Elements of co-regulated genes)解析のため、全ての遺伝子またはダウンレギュレーションされた上位10遺伝子 (KY12h/DMSO12h比に基づく)を、ウェブのプログラム (http://dire.dcode.org/)(非特許文献35)用いて解析した。
全RNAをRNeasy Mini Kit (QIAGEN)を用いて単離した。ゲノムDNAは、DNase I (Invitrogen)を用いて完全に消化した。全RNA (0.5μg)を、SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen)を用いたcDNA合成に使用した。qRT-PCRは、7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems)にてSYBER GREEN PCR Master Mixを用いてトリプリケートで実施した。サイクル条件は以下のとおりである:95℃10分; 95℃15秒40サイクル; 60℃1分。ヒト成人心臓組織由来の全RNA (BioChain) を用いて、hPSC由来の心筋細胞の心筋マーカー遺伝子の発現レベルを評価した。全ての値をGAPDH発現レベルに対してノーマライズし、ヒト成人心臓における対応する値 (100%)と比較して表した。プライマーセットは表1に示す。
TCFレポーターアッセイのため、IMR90-1 hiPSCを前述のとおり血清含有分化培養にて培養し、2日目に、TOPflashプラスミド(Millipore 21-170)およびpRL-SV40プラスミド (ウミシイタケルシフェラーゼトランスフェクションコントロール, Promega E1980) をFuGENE HD transfection Reagenet (Promega E2311)を用いてトランスフェクトした。24時間後、10μM KY02111、10μM XAV939、または10μM IWP-2を、60 ng ml-1 マウスWnt3a (Wako 232-02421)または3μM BIOのいずれかとともに、培地に添加した。トランスフェクションの48時間後 (4日目)、ルシフェラーゼ活性をDual-Luciferase Reporter 1000 Assay System キット (Promega E1980)および2030 ARVO X3 プレートリーダー (PerkinElmer)を用いて測定した。ルシフェラーゼ活性は、キットのプロトコールにしたがい、トランスフェクションコントロールであるウミシイタケルシフェラーゼの発光に対してノーマライズした。HEK293細胞を用いた実験では、細胞を10% FBS DMEM培地中で培養し、FuGENE HDを用いてTOPflashおよびpRL-SV40プラスミドをトランスフェクトした。24時間後、トランスフェクトした細胞を、10μM KY02111、10μM XAV939、または10μM IWP-2を、3μM BIOまたは60 ng ml-1 マウスWnt3aとともに含む培地中、96ウェルプレートに播種した (10,000 細胞/ウェル)。ルシフェラーゼ活性は、前述の方法によりトランスフェクションの48時間後に測定した。
拍動hPSC由来心筋細胞より、プロテアーゼ溶液を用いて細胞を単離した。解離した細胞を、ゼラチンをコートしたカバーガラス上で3-7日間培養した。パッチクランプ法は、約25℃の恒温室にて実施した。自発的拍動コロニーから、ホールセルパッチクランプの構成から得られるデータをHEKA EPC10 増幅器 (HEKA Instruments Inc.)を用いて記録した。外部溶液(140 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM HEPES、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、および10 mMグルコースを含有)は、NaOHによりpH 7.2 に調節した。ピペット溶液(80mM アスパラギン酸カリウム、50 mM KCl、1 mM MgCl2、10 mM EGTA、3 mM ATP-Mg、および10 mM HEPES)は、KOHによりpH 7.2 に調節した。一部の実験では、細胞を、0.1μM E4031、4μM クロマノール 293B、4μM ザテブラジン、1μM テトロドトキシン (TTX)、または4μM ニフェジピンで5分間処理した。これら阻害剤は、Sigma-Aldrichから入手した。E4031およびTTXの1 mM ストック溶液は、H2Oにより調製した。クロマノール 293B、ザテブラジン塩酸塩、およびニフェジピンの20 mM ストック溶液は、DMSOにより調製した。ストック溶液は全て、使用まで-20℃で保存した。電流電圧曲線は、膜電位を-40 mVから-60 mVに維持し、脱分極パルスを500ミリ秒間、INaについては-60 mVから60 mVまで、ICaL については-40 mVから40 mVまで、IKsおよびIKrについては-40 mVから40 mVまで、およびIhについては-50 mVから-140 mV まで、段階的に送達することで取得した。
微小電極アレイ (MEA)ディッシュ (Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany)を、ReproCoat (RCESD006, ReproCELL, Japan)により、5% CO2下にて37℃で1時間コーティングした。コーティング後、30日目のKY02111誘導心筋細胞を、前記MAEディッシュ上の1 mlのCardiomyocyte Culture Medium (RCESD006, ReproCELL, Japan)に移した。ピペットチップまたはガラス棒を用いて、心筋細胞を穏やかに電極上へ移動させ、一晩培養してMEAディッシュに付着させた。翌日、培地をCardiomyocyte Test Medium (RCESD003, ReproCELL, Japan)に交換した。拍動コロニーの存在を確認した後、MEAディッシュをMEA 増幅器 (Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany)に接続し、心電図(ECG)様波を記録した。記録の2分後、300 pM アステミゾール (Sigma) または0.1% DMSO を添加し、アステミゾールの濃度(300 pM-30μM)を4分毎に増加させた。各アステミゾール処理の2分後にECG様波を記録した。拍動率、Na+振幅、K+振幅、およびNa+-K+間隔は、LabChart TM ソフトウェア v7 (ADInstruments, Adelaide, Australia)により解析した。
結果はいずれも平均±SEMで表した。独立両側スチューデントt検定(Unpaired two-tailed student t-test)を用いて、異なる処理からの測定値の平均値を比較した。P <0.05のときに有意差ありと判断した。
KY02111、KY01041、KY02114、KY01045、KY01040、KY02109、KY01042、KY01043、KY01046、およびKY02104は、「3.製造例」に記載のとおり合成した。PB2852、PB2572、およびPB2570: PB285238764、PB257239592、およびPB257074412はUkrOrgSynthesisから購入した。T61164: T6116478はENAMINEから購入した。
(1)KY02111の発見および特性決定
hPSCからの心筋分化を効率的に促進する低分子化合物を同定するため、ヒトαMHCプロモーターの制御下でEGFPを発現するサルES細胞(ESC)を用いるハイコンテント解析(HCA)システムを構築した(図1a)。増強されたGFPシグナルの化学スクリーニングは「(1)方法」に説明のとおりである。このシステムにより、GFP強度および蛍光領域を含むHCAパラメータの値を対照と比較して有意に増強する分子として、N11474が同定された (スチューデントt検定, P=0.015)。
免疫細胞化学により、KY02111により処理したhiPSC(IMR90-1)では約73-85%が心筋マーカーである心筋トロポニンT(cTnT)、α-アクチン、またはNKX2.5を発現するが、これらマーカーが陽性であるDMSO処理細胞は少数であることが示された(図2a、b)。心臓ペースメーカーマーカーであるHCN4は16%のKY02111処理細胞において発現しており、ビメンチン陽性細胞(線維芽細胞)の比率は3.3倍減少した(図2b)。平滑筋マーカーであるSMA(Smooth Muscle Actin)はKY02111処理細胞ではほとんど検出されなかった(データ非提示)。これらの結果から、hPSC由来心筋細胞は、細胞ソーティングの操作を行うことなく、単にKY02111誘導細胞コロニーを回収することによって濃縮できることが示唆される。15日目および30日目のリアルタイムPCR解析により、KY02111誘導心筋細胞(KY-CM)は、心筋マーカーであるαMHC、NKH2.5、およびHCN4を発現すること、検討したイオンチャネル遺伝子はいずれも成人心臓組織と同様のレベルで発現していることが示された(図2c)。
KY02111が如何にしてhPSCの心筋分化を促進するのかを調べるため、KY02111処理したhiPSC (IMR90-1)の遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイ技術を用いて解析した。KY02111またはDMSOを心筋分化培養3日目(IMR90-1細胞にとって最適な開始点)に添加し、12および24時間後に細胞集団を回収した。KY02111処理後、12時間および24時間の両方で、22種類のダウンレギュレーションされる遺伝子および4種類のアップレギュレーションされる遺伝子が同定された(図3a、表2)。マイクロアレイ解析では少数の遺伝子しか抽出されなかった(細胞集団が高度に不均質のためと考えられる)が、マイクロアレイデータをqPCRにより確認した(図9a)。ダウンレギュレーションされた22遺伝子について、遠位の調節要素を予測可能なDiRE(非特許文献35)を用いて共通の転写因子結合部位を調べると、TCF4が共通の転写因子として予測された(図9b)。処理細胞において最もダウンレギュレーションされた上位10遺伝子を調べると、LEF1およびTCF4 が共通の転写因子として予測された(図9c)。ダウンレギュレーションされた22遺伝子のうち16遺伝子 (70%) は、古典的WNTシグナル経路の標的遺伝子として知られていた(表2)。さらに、WNT標的遺伝子に対するKY02111の効果は、XAV939およびIWP-2などの他のWNT阻害剤の効果と非常に類似していたが、WNT活性化剤であるBIOの効果とは類似していなかった(図9d)。これらの結果は、KY02111がhPSCにおける古典的WNTシグナル経路を阻害することを示唆する。
次に、KY02111、数種の化学性またはタンパク性WNT阻害剤(IWP-2、IWR-1、XAV939、DKK1、およびIGFBP4(非特許文献36))、および数種のサイトカインの組合せによるトランスジェニックサルESCにおける心筋分化の促進を比較した。予想どおり、これらはいずれもαMHCプロモーターにより誘導されるGFPシグナル強度を増強したが、KY02111が最も効果的であり、また、他の化学性WNT阻害剤はタンパク性阻害剤やサイトカインよりも効果が高かった(図3c、d)。KY02111の処理により、対照と比較して約80倍分化が増加した。KY02111の処理は、hiPSCの心筋分化の促進においても最も効果的であった(図3d)。得られた分化細胞の全細胞数はWNT阻害剤の間で類似していたが(図10a)、拍動コロニーの割合は相違しており、KY02111、IWP-2、およびXAV939のそれぞれについて87、37、および7.5%であった(図3d)。
cTnT陽性細胞の割合は拍動コロニーの割合と同様の傾向を示した(図10b)。
血清不含培地における分化効率を調べると、ゼラチンまたはヒトラミニン211によるコーティングと、0.4% ヒト血清アルブミンまたは1-2% ウシ血清アルブミンの添加という、2つの要件が明らかとなった。非接着細胞はほとんど心筋細胞へ分化せず、アルブミンを含まない血清不含培地では細胞死が起こった(データ非提示)。
KY01041
3,4−ジメトキシベンゾイルイルクロリド(100mg,0.55mmol)とトリエチルアミン(83,0μl.6mmol)を塩化メチレン(500μl)に溶かし、2−アミノ−6−クロロベンゾチアゾール(105mg,0.57mmol)を加え一時間、室温にて撹拌した。反応終了後、塩化メチレンに希釈し、飽和食塩水にて洗浄した。硫酸マグネシウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加え、70度に加熱し、溶解させた後に室温に戻すことで再結晶を行い、2−(3,4−ジメトキシベンズアミド)−6−クロロベンゾチアゾールを130mg、収率68%で得た。
1H NMR (CDCl3): δ10.15(s, 1H), 7.83 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 7.63-7.45 (m, 3H), 7.36 (dd, J= 1.8, 8.7 Hz, 1H), 6.91 (d, J= 8.2 Hz, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H)
MS(ESI) Found: 349 [M+H]+
3−(3,4−ジメトキシフェニル)プロパノイルクロリド(100mg,0.42mmol)と2−アミノ−6−クロロベンゾチアゾール(78mg,0.42mmol)を基質に用いて上記と同様に反応を行い、2−(3−(3,4−ジメトキシフェニル)プロパンアミド)−6−クロロベンゾチアゾールを113mg、収率72%で得た。
1H NMR (CDCl3): δ9.41(s, 1H), 7.79 (d, J= 2.9 Hz, 1H), 7.62 (d, J= 11.7 Hz, 1H), 7.37 (dd, J= 2.6, 11.4 Hz, 1H), 6.80-6.67 (m, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.03 (t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.77 (t, J= 9.9 Hz, 2H)
MS(ESI) Found: 399 [M+H]+
4−(3,4−ジメトキシフェニル)ブタノイルクロリド(100mg,0.41mmol)と2−アミノ−6−クロロベンゾチアゾール(76mg,0.41mmol)を基質に用いて上記と同様に反応を行い、2−(4−(3,4−ジメトキシフェニル)ブタンアミド)−6−クロロベンゾチアゾールを121mg、収率75%で得た。
1H NMR (CDCl3): δ9.15(s, 1H), 7.79 (d, J= 2.9 Hz, 1H), 7.64 (d, J= 11.3 Hz, 1H), 7.39 (dd, J= 2.6, 11.4 Hz, 1H), 6.80-6.68 (m, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 2.67 (t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.48 (t, J= 9.9 Hz, 2H), 2.09 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 413 [M+H]+
5−(3,4−ジメトキシフェニル)ペンタノイルクロリド(30mg,0.13mmol)と2−アミノ−6−クロロベンゾチアゾール(23mg,0.13mmol)を基質に用いて上記と同様に反応を行い、2−(5−(3,4−ジメトキシフェニル)ペンタンアミド)−6−クロロベンゾチアゾールを39mg、収率75%で得た。
1H NMR (CDCl3): δ8.91 (s, 1H), 7.79 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.66 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 7.49 (dd, J= 2.3, 8.7 Hz, 1H), 6.79 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 6.71 (d, J= 7.8 Hz, 1H) 6.70 (s, 1H), 3.87(s, 3H), 3.86 (s, 3H), 2.62 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.52 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.80 (m, 2H), 1.72 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 405 [M+H]+
3,4−ジメトキシベンゾイルイルクロリド(100mg,0.5mmol)と2−アミノ−6−ニトロベンゾチアゾール(105mg,0.57mmol)を基質に用いて上記と同様に反応を行い、2−(3,4−ジメトキシベンズアミド)−6−ニトロベンゾチアゾールを100mg、収率56%で得た。
1H NMR (CDCl3): δ10.15(s, 1H), 8.80 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.31 (dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.73 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 7.63-7.47 (m, 2H), 6.95 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.97 (s, 3H)
MS(ESI) Found: 360 [M+H]+
2−(3,4−ジメトキシフェニル)アセチルクロリド(100mg,0.51mmol)と2−アミノ−6−クロロベンゾチアゾール(94mg,0.51mmol)を基質に用いて上記と同様に反応を行い、2−(2−(3,4−ジメトキシフェニル)アセトアミド)−6−クロロベンゾチアゾールを153mg、収率83%で得た。
1H NMR (CDCl3): δ8.91(s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.31 (dd, J= 12.1 Hz, 1H), 7.77 (d, J= 11.7 Hz, 1H), 7.00-6.70 (m, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.86 (s, 2H)
MS(ESI) Found: 396 [M+H]+
3−(3,4−ジメトキシフェニル)プロパノイルクロリド(100mg,0.5mmol)と2−アミノ−6−ニトロベンゾチアゾール(105mg,0.57mmol)を基質に用いて上記と同様に反応を行い、2−(3−(3,4−ジメトキシフェニル)プロパンアミド)−6−ニトロベンゾチアゾールを138mg、収率71%で得た。
1H NMR (CDCl3): δ9.29(s, 1H), 8.75 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 8.31 (dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.77 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 6.80 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.75 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.06 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.83 (t, J= 7.3 Hz, 2H)
MS(ESI) Found: 388 [M+H]+
4−(3,4−ジメトキシフェニル)ブタノイルクロリド(55mg,0.25mmol)と2−アミノ−6−ニトロベンゾチアゾール(50mg,0.25mmol)を基質に用いて上記と同様に反応を行い、2−(4−(3,4−ジメトキシフェニル)ブタンアミド)−6−ニトロベンゾチアゾールを65mg、収率66%で得た。
1H NMR (CDCl3): δ8.75 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.29 (dd, J= 2.3, 8.7 Hz, 1H), 7.70 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.75 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.66 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 2.66 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.54 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.11 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 402 [M+H]+
5−(3,4−ジメトキシフェニル)ペンタノイルクロリド(30mg,0.13mmol)と2−アミノ−6−ニトロベンゾチアゾール(25mg,0.13mmol)を基質に用いて上記と同様に反応を行い、2−(5−(3,4−ジメトキシフェニル)ペンタンアミド)−6−ニトロベンゾチアゾールを38mg、収率70%で得た。
1H NMR (CDCl3): δ8.94 (s, 1H), 8.75 (d, J= 2.3 Hz, 1H), 8.32 (dd, J= 2.3, 9.2 Hz, 1H), 7.81 (d, J= 9.2 Hz, 1H), 6.80 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 6.72 (d, J= 7.8 Hz, 1H) 6.71 (s, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 2.63 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 2.56 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.73 (m, 2H)
MS(ESI) Found: 416 [M+H]+
2−(3,4−ジメトキシフェニル)アセチルクロリド(100mg,0.51mmol)と2−アミノ−6−フルオロベンゾチアゾール(86mg,0.51mmol)を基質に用いて上記と同様に反応を行い、2−(2−(3,4−ジメトキシフェニル)アセトアミド)−6−フルオロベンゾチアゾールを157mg、収率89%で得た。
1H NMR (CDCl3): δ9.14(s, 1H), 7.64 (dd, J= 6.2, 12.1 Hz, 1H), 7.50 (dd, J= 3.6, 11.0 Hz, 1H), 7.14 (ddt, J= 3.7, 12.1 Hz, 1H), 6.90-6.78 (m, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.80 (s, 2H)
MS(ESI) Found: 369 [M+H]+
2−アミノ−6−ブロモベンゾチアゾール(500mg,2.18mmol)、3−(3,4−ジメトキシフェニル)プロピオン酸(505mg,2.40mmol)、O−(6−クロロベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(1.09g,2.63mmol)、およびN,N’−ジイソプロピルエチルアミン(419μl,2.41mmol)のN,N’−ジメチルホルムアミド(5ml)溶液を室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、蒸留水、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去した。残渣にエタノールを加えて還流し、再結晶を行い、2−(3−(3,4−ジメトキシフェニル)プロパンアミド)−6−ブロモベンゾチアゾールを320mg、収率35%で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ12.45 (s, 1H), 8.25 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.56 (dd, J = 1.8, 8.4 Hz, 1H), 6.87-6.83 (m, 2H), 6.77-6.73 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 2.88 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 7.0 Hz, 2H)
2−アミノ−6−クロロベンゾチアゾール(55mg,0.298mmol)および3−(3,4−ジメトキシフェニル)プロピオン酸(80mg,0.357mmol)を基質に用いてSO087と同様に反応を行い,N−(6−クロロベンゾチアゾール−2−イル)−3−(4−エトキシ−3−メトキシフェニル)プロパンアミドを40mg、収率34%で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ12.44 (s, 1H), 8.11 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 2.2, 8.8 Hz, 1H), 6.90-6.82 (m, 2H), 6.72 (dd, J = 1.8, 7.0 Hz), 3.94 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.91-2.85 (m, 2H), 2.82-2.75 (m, 2H), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H)
2−アミノ−6−ヒドロキシベンゾチアゾール(400mg,2.41mmol)のN,N’−ジメチルホルムアミド(7ml)溶液をアルゴン雰囲気下、氷冷攪拌中、水素化ナトリウム(60%)(106mg,2.65mmol)を加えて30分攪拌後、4−ブロモ酪酸エチル(521μl,3.62mmol)を加えて室温にて終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を酢酸エチルにて希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和塩化ナトリウム水溶液にて洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去し、エチル 4−((2−アミノベンゾチアゾール−6−イル)オキシ)ブタノエートを372mg、収率55%で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ12.20 (s, 1H), 7.60 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 2.6, 8.8 Hz, 1H), 6.86-6.83 (m, 2H), 6.75 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz), 4.03 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.70 (s, 3H), 3.56-3.53 (m, 4H), 3.46-3.42 (m, 4H), 2.87 (t, J = 7.0 Hz), 2H), 2.75 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.51-2.46 (m, 2H), 1.96 (t, J = 7.0 Hz, 2H)
4−((2−(3−(3,4−ジメトキシフェニル)プロパンアミド)ベンゾチアゾール−6−イル)オキシ)ブタン酸(80mg,0.180mmol)および1−メチルピペラジン(21.8μl,0.198mmol)を基質に用いてSO094と同様に反応を行い、3−(3,4−ジメトキシフェニル)−N−(6−(4−(4−メチルピペラジン−1−イル)−4−オキソブトキシ)ベンゾチアゾール−2−イル)プロパンアミドを39mg、収率41%で得た。
1H NMR (DMSO-d6): δ12.20 (br s, 1H), 7.54 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 2.6Hz, 1H), 6.96 (dd, J = 2.6, 8.8 Hz, 1H), 6.86-6.82 (m, 2H), 6.73 (dd, J = 1.8, 8.1 Hz, 1H), 4.01 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.71 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.45-3.41 (m, 4H), 2.86 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.70 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.50-2.45 (m, 2H), 2.29-2.20 (m, 4H), 2.15 (s, 3H), 1,94 (t, J = 7.0 Hz, 2H)
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(上記文献はいずれも引用により本明細書に含まれる。)
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Claims (15)
- 多能性幹細胞の心筋分化誘導法であって、以下の工程を含む方法:
(1)多能性幹細胞を1以上のWNTシグナル活性化剤を含む培地中で培養する工程、および;
(2)工程(1)で得られた細胞を1以上のWNTシグナル阻害剤を含む培地中で培養する工程。 - 1以上のWNTシグナル阻害剤が、以下の式(I)の化合物またはその塩を含む、請求項1に記載の方法:
式(I):
R1−R5は、各々独立して、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基;非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基−NR12R13(R12及びR13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基である)である、ここでR1−R5のうち隣接する2つが一緒になって−O−CH2−O−または−O−(CH2)2−O−を形成していてもよい、
R6−R9は、各々独立して、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基;基−C(O)Aで置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基(Aは、非置換又は炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和5または6員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される1または2個の原子を含んでいてもよい);非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基−NR12R13(R12及びR13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖または分岐アルキル基である)である、ここでR6−R9のうち隣接する2つが一緒になって−O−CH2−O−または−O−(CH2)2−O−を形成していてもよい、
R10−R11は、各々独立して、水素原子;又は炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基である、
Xは、−CR14(R14は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基である);酸素原子;硫黄原子;セレン原子;又は基−NR15(R15は、水素原子、炭素数1〜5の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数1〜5の直鎖又は分岐アシル基である)である、および
nは、0から6の整数である]。 - 1以上のWNTシグナル阻害剤が、以下からなる群から選択される化合物またはその塩を含む、請求項2に記載の方法:
KY02111
- 1以上のWNTシグナル阻害剤が、以下の化合物またはその塩を含む、請求項3に記載の方法:
KY02111
- 1以上のWNTシグナル阻害剤が、XAV939およびIWP−2からなる群から選択されるWNTシグナル阻害剤を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 1以上のWNTシグナル活性化剤が、GSK3β阻害剤を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 1以上のWNTシグナル活性化剤が、BIOおよびCHIR99021からなる群から選択されるWNTシグナル活性化剤を含む、請求項6記載の方法。
- 工程(1)および(2)における培地が血清を含まない、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 工程(1)および(2)における培地がサイトカインを含まない、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 工程(1)および(2)における培地がアルブミンを含む、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 工程(1)および(2)における培地がアルブミン以外のタンパク質を含まない、請求項10に記載の方法。
- 工程(1)および(2)が異種成分非存在下で行われる、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 多能性幹細胞がサルまたはヒト多能性幹細胞である、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 心筋細胞の製造方法である、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 1以上のWNTシグナル活性化剤および/または1以上のWNTシグナル阻害剤を含む心筋分化促進用キットであって、請求項1〜14のいずれかに記載の方法に使用されるキット。
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