KR20140109880A - 종이기반 진단 테스트 - Google Patents

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세르지 에스. 셰프코플라이어스
샤오시 양
줄리 캔터 워쉬코
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Abstract

질병 또는 상태를 진단하는데 사용되는 응집반응을 이용한 디바이스 및 그의 사용 방법. 본 발명의 진단 디바이스는 포어, 응집 구역 및 검사 판독 구역을 갖는 기판을 포함할 수 있고, 상기 응집 구역은 응집제에 의해 기능화되어 시료의 응집을 일으킨다.

Description

종이기반 진단 테스트{PAPER BASED DIAGNOSTIC TEST}
공동계류 출원
[0001] 이 출원은 2011년 11월 10일자 미국 가특허출원 No. 61/558,009 및 2012년 8월 24일자 미국 가특허출원 No. 61/692,994에 기초한 우선권 주장 출원으로 상기 2 출원은 그 내용 전체가 이하에 설명되는 바와 같이 참조 병합되었다.
I. 발명의 분야
[0002] 본 발명은 간편하고 저렴하며 신속한 종이-기반 진단 디바이스 및 그의 사용방법에 관한 것이다.
II. 일반적 배경기술
[0003] 생물학적 체액(biological fluids)의 분석은 개개인이나 인구집단의 건강 상태를 모니터링하고 질병이나 상태를 진단하는데 유용하다. 가장 최근의 진단 분석법은 일반적으로, 숙련된 자들에 의해 수행되어야만 하는 대형의 값비싼 실험 장비를 필요로 할 뿐 아니라 생물학적 시료도 상당히 많은 양을 요구한다. 따라서, 대부분의 현행 진단 분석법은 거리가 먼 지역에서 실시하기 어려울 수 있으므로 개발도상국에서는 사용하기 힘들다. 또한, 대부분의 현행 진단 분석법은 응급 상황이나 가정의 건강 관리(홈케어) 상황에서는 유용하지 않다. 따라서, 번거롭지 않으면서 소량의 생물학적 시료만으로도 구동이 가능한 저가의 진단 분석법이 필요하다.
[0004] 미소유체 종이-기반 디바이스(Microfluidic paper-based devices: "μPADs")는 일반적으로 작고, 휴대가능하며 저가의 소재로부터 쉽게 조립이 가능하며 원거리의, 자원이 제한된 장소로 운반이 가능하다. 예를 들어, μPADs는 고체 잉크(왁스) 프린터를 이용하여 종이 위에 패턴을 인쇄하고 잉크를 용융시켜 종이 기판의 전체 두께에 걸친 소수성 배리어를 생성시킴으로써 쉽게 만들 수 있다. μPADs는 유체 기판으로서 종이를 사용하며, 시료 저장 구역으로부터 생물학적 시료를 운반하는데 종이의 윅킹(wicking)/모세관 특성을 이용한다. 이 디바이스들은 일반적으로 복잡한 실험 장비를 필요로 하지 않으므로, 대체로 임상 실무에 있어 진단 용도로 매우 적합하며, 특히 개발도상국, 응급 상황과 홈케어 상황에서 특히 유용하다.
[0005] 많은 μPADs는 비색 분석법(colorimetric assays)을 이용한다. 비색 분석법은 시각적 판독값을 제공하고 대체로 수행하기 간편하며, 안정하고 저렴하므로 생물학적 체액의 분석을 위해 비색 분석법을 이용하는 것은 대체로 매력적이다. 비색 분석법에서, 생물학적 시료는 테스트 판독 구역에 저장된 시약과 반응하며 이 반응에 의해 감지가능한 색이 나타난다. 그러나, 전통적인 비색 분석법은 광학적으로 투명한 시료(예컨대, 물, 뇨, 미리 분리된 혈장)로 한정되어 있다. 만일 불투명한 시료가 사용될 경우, 발현된 색상의 검출이 시료의 색상으로 인해 간섭될 수 있다.
[0006] 혈장은 그 조성이 몸의 장기와 조직에 영향을 미치는 병리학적 과정에 관해 이례적으로 많은 정보를 담고 있기 때문에 생물학적 시료로 흔히 사용된다. 예를 들어, 에스테르화되지 않은 지방산, 글루코스, 헤파린 및 리소포스파트산의 검출에 혈장 검사가 수행된다. 그러나, 비색 분석법에서 혈장을 이용하기 위해서는, 먼저 혈장을 전혈로부터 분리하는 것이 바람직하다. 혈장 분리는 전혈 중의 적혈구("RBCs")의 진한 색상으로 인해 진단을 위한 비색 분석법의 검사 결과의 품질을 간섭할 수 있기 때문에, 특히 중요한 단계이다. 원심분리 또는 자석 분리법에 기초하여 전혈로부터 적혈구를 분리하는 통상적인 방법은 효과적이기는 하지만, 전혈 시료로부터 혈장을 분리하기 위한 부가적인 시료 준비 단계(진단 검사법 외에)를 필요로 한다. 마이크로 규모로 전혈의 레올로지 거동 및 유체역학에 기초한 혈장 정제법은 분리를 위해 정밀한 특성을 갖는 특이적으로 설계된 미소유체 디바이스를 필요로 하며; 따라서, 대부분의 임상 상황에서 사용하기에 적절치 못하다 (그리고 특히 홈케어 상황에서 사용하기에 부적합하다). 따라서, 혈장 분리 단계를 진단 분석법의 일부로서 통합하는 것을 가능케 하기 위한 μPADs의 이노베이션이 필요하다. 혈장 분리 단계를 비색 μPADs의 디자인에 통합시킴으로써, 이들을 완전히 병합된 진단 디바이스로 변모시켜, 종종 고가의 부피가 큰 장비와 특수 훈련된 전문인력을 필요로 하는 별도의 시료 준비 단계에 대한 필요성을 없애주어 이들의 다재다능함을 현저히 증가시켜준다. 이러한 완전히 통합된 μPADs는 현장에서 직접 채취되어 디바이스의 응집 구역(응집 구역)에 간단히 놓여진 전혈 시료를 분석할 수 있다. 혈장 분리 단계의 통합에 의해, 비색 μPADs는 보다 많은 응용분야와 상황에 적절히 사용할 수 있으며 이러한 한가지 예로서 인간 혈장에 존재하는 임상적으로 타당한 많은 생물분자들을 검사하는 비색법을 사용할 수 있는 한편 RBCs가 제시하는 진한 적색으로부터의 간섭을 제어하는 것이 가능하다. 따라서, 자동화된 정량화가 가능한 포인트-오브-케이스(point-of-case)를 가능케하기 위해 μPADs에 일대 혁신이 필요하다.
[0007] μPADs는 또한 혈액 샘플 중 겸상 헤모글로빈의 존재를 탐지하는데도 이용될 수 있다(예컨대, 겸상 세포 질환의 진단에). 헤모글로빈(Hb)은 RBCs에 있는 철을 함유하는 산소-운반 단백질이다. 각각의 헤모글로빈 분자는 4개의 글로빈 사슬들로 이루어져 있다: 태아성 헤모글로빈(Hb F)은 2개의 α 사슬과 2개의 γ 사슬을 가지며, 성인 헤모글로빈(Hb A)은 2개의 α 사슬과 2개의 β 사슬을 갖는다. 글로빈 사슬 생성을 조절하는 유전자 돌연변이는 아미노산 서열을 변형하여 Hb의 비정상적 형태를 생산하는 구조적 변이체와 글로빈 사슬의 생산을 저하 또는 제거하는 돌연변이(지중해 빈혈)를 포함한다. Hb의 대부분의 다른 정상적 및 비정상적 형태와 달리, 데옥시-Hb S는 하나의 Hb S 분자의 β 사슬 상의 발린 치환 자리에서의 소수성 팻치가 다른 Hb S 분자의 β 사슬 상의 상보적인 소수성 자리에 결합하도록 배열을 변형시킨다. 혐기성 환경에서의 Hb S의 중합에 의해 RBCs는 비틀린 겸상 모양으로 된다.
[0008] 오직 하나의 Hb S 카피만이 유전되고 정상적인 Hb A를 인코딩하는 유전자의 다른 카피를 지니는 사람들(유전형 Hb AS)은 겸상 적혈구 성향(sickle cell trait: SCT)을 가지며, 비록 정맥 혈전색전증과 신수질 암종에 걸릴 위험성이 높기는 하지만, 일반적으로 건강한 것으로 여겨진다. Hb S의 2개 카피가 유전된 사람들(유전형 Hb SS)은 겸상적혈구병(sickle cell disease: SCD)의 가장 흔한 형태인 겸상 적혈구 빈혈에 걸리게 된다. Hb의 다른 유형(C 또는 E)에 책임이 있거나 β-지중해 빈혈에 책임이 있는 돌연변이가 이형접합 돌연변이 (유전형 Hb SC, Hb SE, Hb Sβ+ 또는 Hb Sβ0) 화합물로서 HbS와 조합될 경우 보다 희귀한 형태의 SCD가 일어난다. Hb SS 및 Hb Sβ0을 갖는 개체들은 가장 심각한 형태의 SCD를 갖는다.
[0009] 전세계 인구의 5%는 임상적으로 유의적인 Hb 변이체의 보균자인 것으로 추정된다. SCD 사례자의 거의 85%와 모든 선천성 감염 케이스의 70% 이상이 아프리카에서 발생하는데, 아프리카의 경우 SCD 유병률은 줄잡아도 태어날 때부터 10.68/1000 꼴이다 (미국의 경우 0.49/1000임). 미국의 경우 현재 국가 차원에서 필수적으로 행하여지는 신생아 스크리닝을 통해, 연간 대략 2,000명의 영아가 SCD에 걸린 채 태어나는 것으로 진단되고 있다. 비록 SCD가 심각한 라이프타임 이환율과 조기 사망을 일으키기는 하지만, 미국과 같은 고소득국가에서 이 질병에 걸린채 태어난 사람들의 대부분은 성인기까지 생존할 수 있다. 그러나 대부분의 저소득국가에서 이 질병에 걸린 채로 태어나는 사람들의 대부분은 조기 치료(early intervention)를 받지 못함으로 해서 5세가 되기 전에 사망하여 선진국의 경우와 극명한 대비를 나타낸다.
[0010] 고소득국가의 경우 SCD의 치료에 있어서 신생아 스크리닝은 하나의 가장 커다란 진전이 되었다. 임상실험에서, SCD는 주로 헤모글로빈 전기영동(HE)을 통해 진단되지만, 환자의 RBCs에서의 그의 존재를 탐지하기 위해 Hb 변이체의 전기적 전하 차이를 이용하는 고성능액체 크로마토그래피(HPLC) 및 등전점 전기영동(IEF) 검사법으로도 진단된다. 그러나, 이들 진단 검사법을 실시하기 위해서는 특수 장비, 소모성 재료 및 고도로 훈련된 전문인력을 필요로 하는 임상 실험실을 필요로 하므로 비용이 많이 들고 따라서 정작 SCD가 가장 만연한 저소득국가와 같이 자원이 한정된 곳에서는 대체로 이를 이용할 수 없다. 따라서, 대부분의 아프리카 국가에서, 전 신생아 스크리닝은 여전히 엄두를 못 낼 정도로 비용이 많이 들며 질병에 걸린 개체의 대다수는 출생시건 살아가면서건 이 질병에 걸린 것으로 진단을 받지도 못하는 실정이다. 최근 세계보건기구에 의해 SCD에 대한 염가의 진단 검사법을 개발하기 위한 시급한 필요성이 우선적으로 인정되었다.
[0011] 이에 더해, 고소득국가에서 SCD에 현재 사용되는 진단 검사법(예컨대 HE, HPLC 및 IEF)은 혈액 시료를 치료가 필요한 장소로부터 중앙 병원 실험실로 이동시킬 것을 요하므로, 응급 상황에서는 이들 검사법을 이용하는 SCD의 확정적인 진단이 거의 불가능하다. 따라서, SCD 관련 합병증의 긴급 치료를 필요로 하되 질병 이력이 알려져 있지 않은 성인 환자들에서의 진단을 확정하기 위해서는 치료 장소에서 SCD를 진단할 수 있는 신속한 검사법이 현저히 요구되고 있다.
[0012] 고농도 인산염 완충액에서의 데옥시-Hb S의 불용성은 혈액 시료 중에 Hb S의 존재 여부를 가시적으로 확인하기 위한 간단한 정성적인 방법으로서 혈액은행과 임상 실험실에서 널리 이용되어 왔다. 비록 표준 Hb 용해도 검사법이 저렴하고 신속한 분석법이긴 하지만, 이 검사법으로는 SCT와 SCD를 구별할 수 없는데 이는 이들 두 가지 유형의 혈액 시료들이 모두 Hb S를 함유하기 때문이다. 이러한 한계를 극복하기 위한 Hb 용해도 분석법의 이전의 변형법들은 추가적인 시료 준비 단계를 필요로 하고, 부가적인 실험장비 (예컨대 원심분리, 막여과)를 사용하며 SCD와 SCD를 식별하기 위한 분석 장비(예컨대 분광광도계)를 필요로 함에 따라, 자원이 한정된 경우나 긴급 체제 하에서 실시하기에 이 검사법은 지나치게 고비용이고, 복잡하며, 시간이 많이 들고 실용성이 현저히 떨어진다. 따라서, SCD를 신속하고 간편하게 진단할 수 있는 포인트-오브-케이스 진단을 가능케 하기 위해 μPADs의 혁신이 필요하다.
[0013] 이하에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 μPADs는 다른 μPADs와는 그 구조, 용법 및 접근법이 실질적으로 상이하며 전술한 바와 같은 이 기술분야의 종래 문제점에 대한 해결책을 제시한다.
[0014] 후술되는 바와 같이 본 발명의 새로운 특징들이 특허청구범위에 지적되어 있지만, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 기술자라면 본 명세서에 설명된 본 발명의 구체적인 내용과 형태 및 그의 실시 방식에 대해 본 발명의 정신으로부터 벗어남이 없이 다양한 생략, 변형, 치환 및 변경을 가해질 수 있음을 이해할 것이므로, 본 발명의 범위는 후술되는 상세한 설명으로 한정되는 것이 아니다.
발명의 개요
[0015] 본 발명의 일 측면은 포어, 응집 구역(응집 구역), 및 상기 응집 구역이 응집제에 의해 기능화되는 장소인 검사 판독 구역을 갖는 기판을 포함하는 진단 디바이스를 포함한다.
[0016] 본 발명의 또 다른 측면은 포어, 응집 구역(응집 구역), 및 상기 응집 구역이 응집제에 의해 기능화되는 장소인 검사 판독 구역을 갖는 기판을 포함하는 진단 디바이스를 제공하는 단계; 상기 응집 구역에 혈액 시료를 침착시키는 단계; 상기 혈액 시료를 전개시키는 단계; 및 상기 검사 판독 구역을 관찰하는 단계를 포함하는, 질병 또는 상태를 진단하는 방법을 포함한다.
[0017] 본 발명의 또 다른 측면은 포어 및 응집 구역을 갖는 기판을 포함하는 진단 디바이스를 제공하는 단계; 일정 부피의(a volume of) 혈액 시료를 일정 부피의 응집제와 혼합하는 단계; 상기 혼합물의 액적(droplet)을 상기 응집 구역에 침착시키는 단계; 상기 혼합물 액적을 전개시켜 상기 기판 위에 혈액 얼룩 패턴(blood stain pattern)을 생성하는 단계; 및 상기 혈액 얼룩 패턴을 관찰하는 단계를 포함하는, 질병 또는 상태를 진단하는 방법을 포함한다.
[0018] 본 발명의 또 다른 측면은 포어를 갖는 기판을 포함하는 진단 디바이스를 제공하되, 상기 기판은 응집 구역과 검사 판독 구역을 더 포함하고 상기 응집 구역은 응집제에 의해 기능하며 상기 검사 판독 구역은 분석 시약에 의해 기능하는 것인 진단 디바이스를 제공하는 단계; 상기 응집 구역에 혈액 시료를 침착시키는 단계; 상기 혈액 시료를 전개시키는 단계; 및 상기 검사 판독 구역을 관찰하는 단계를 포함하는, 질병 또는 상태의 진단 방법을 포함한다.
[0019] 본 발명의 또 다른 측면은 포어를 갖는 기판을 포함하는 진단 디바이스를 제공하되, 상기 기판은 응집 구역을 더 포함하는 것인 진단 디바이스를 제공하는 단계; 일정 부피의 혈액 시료를 일정 부피의 응집제와 혼합하는 단계; 상기 액적을 상기 상기 응집 구역에 침착시키는 단계; 상기 액적을 전개시켜 상기 기판 위에 혈액 얼룩 패턴을 생성하는 단계; 및 상기 혈액 얼룩 패턴을 관찰하는 단계를 포함하는, 질병 또는 상태를 진단하는 방법을 포함한다.
[0020] 본 발명의 또 다른 측면은 포어를 갖는 기판을 포함하되, 상기 기판은 응집 구역과 검사 판독 구역을 더 포함하고; 상기 응집 구역은 응집제에 의해 기능하는 것인 기판; 상기 검사 판독 구역의 이미지를 캡쳐할 수 있는 광학 이미지 캡쳐 디바이스; 및 상기 이미지를 분석할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 포함하는, 질병 또는 상태의 진단용 시스템을 포함한다.
[0021] 본 발명의 또 다른 측면은 포어를 갖는 기판으로서, 상기 기판은 응집 구역을 더 포함하는 것인 기판; 및 상기 응집 구역에 침착된 시료로서 상기 시료는 전혈과 응집제의 혼합물로 된 것인 시료; 상기 기판의 이미지를 캡쳐할 수 있는 광학 이미지 캡쳐 디바이스; 및 상기 이미지를 분석할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 포함하는, 질병 또는 상태의 진단용 시스템을 포함한다.
[0022] 본 발명의 또 다른 측면은 혈액 시료를 수용하기 위한 수단; 상기 혈액 시료의 적혈구 세포를 응집시키기 위한 수단; 상기 수용 수단으로부터 상기 혈액 시료의 혈장을 운반하기 위한 수단; 및 상기 혈장에서 피검물(analyte)의 존재 여부를 탐지하기 위한 수단을 포함하는, 질병 또는 상태를 진단하기 위한 디바이스를 포함한다.
[0023] 본 발명의 또 다른 측면은 질병 또는 상태를 진단하기 위한 디바이스로서, 응집 수단과 혼합된 전혈로 된 시료를 수용하기 위한 수단; 상기 시료의 Hb의 가용성 형태(soluble forms)를 상기 수용 수단으로부터 운반하여 혈액 얼룩 패턴을 생성하기 위한 수단; 상기 혈액 얼룩 패턴을 스캐닝하기 위한 수단; 및 상기 스캐닝된 혈액 얼룩 패턴을 상기 질병 또는 질병의 상기 진단과 연관시키기 위한 수단을 포함하는 것인, 질병 또는 상태를 진단하기 위한 디바이스를 더 포함한다.
[0024] 전술한 그리고 기타의 본 발명의 특성들은 첨부된 도면, 후술하는 설명 그리고 특허청구범위로부터 명확히 이해될 수 있을 것이다.
[0025] 본 발명의 특성과 목적이 보다 잘 이해할 수 있도록, 첨부된 도면을 참조로 이하에 상세한 설명을 제공하며, 이하에서 숫자는 도면의 해당 부분의 숫자와 일치한다.
[0026] 도 1A는 전혈로부터 RBCs를 분리하고자 할 경우 공지의 RBC의 변형가능성(deformability) 특성을 도시한 도면이다.
[0027] 도 1B는 전혈 중 RBCs로부터 혈장을 여과하는 공지 방법을 도시한 도면이다.
[0028] 도 1C는 전혈 중 RBCs로부터 혈장을 여과하기 위해 RBC 응집을 이용하는 것에 관한 도면이다.
[0029] 도 2A는 미처리 종이에 전혈을 찍은 결과를 나타낸 도면이다.
[0030] 도 2B는 응집 항체 항-A,B로 처리된 종이에 전혈을 찍은 결과를 나타낸 도면이다.
[0031] 도 2C는 전혈 시료의 부피와 전혈 스팟(spot)의 반경 간의 관계, 응집된 RBC 스팟의 반경과 혈장 밴드의 폭 간의 관계를 나타낸 도면이다.
[0032] 도 3은 혈장 분리가 통합된 μPAD 디자인을 나타낸 도면이다.
[0033] 도 4A는 혈장 분리가 통합된 μPAD의 구동방식을 나타낸 도면이다.
[0034] 도 4B는 검사 구역에서 반응이 일어난 후 혈장 분리가 통합된 μPAD를 나타낸 도면이다.
[0035] 도 5는 혈장 분리가 통합된 μPAD를 이용하여 전혈 시료 중의 글루코스 농도를 정량하는 것에 관한 도면이다.
[0036] 도 6은 응집 현상을 이용한 종이-기반 헤모글로빈 용해도 분석의 용례를 나타낸 개략적인 다이아그램이다.
[0037] 도 7A는 응집 현상을 이용한 종이-기반 헤모글로빈 용해도 분석을 이용하는 동안 생성된 혈액 얼룩 패턴을 나타낸 도면이다.
[0038] 도 7B는 도 7A에 나타난 혈액 얼룩 패턴을 정량하는 적색 강도 프로파일을 나타낸 도면이다.
[0039] 도 8A는 정상(Hb AA), SCT(Hb AS) 및 SCD (Hb SS, Hb Sβ 또는 Hb SC) 혈액 시료의 색상 강도 프로파일을 나타낸 도면이다.
[0040] 도 8B는 도 8A의 각 샘플에 있어서 5 mm에서의 정규화된(normalized) 색상 강도 값을 나타낸 도면이다.
바람직한 구체예에 대한 상세한 설명
[0041] 본 발명의 일 측면은 온전히 μPAD 내에 함유된 소량의 전혈 시료 중 적혈구(RBCs)로부터 혈장을 분리하기 위한 진단 디바이스 및 그의 이용 방법을 제공한다.
[0042] RBC 응집을 이용한 RBCs 로부터의 혈장 분리
[0043] 도 1A에 도시된 바와 같이, 정상적인 건강한 RBCs 100은 극히 변형되기 쉬우며, RBCs 100보다 직경이 작은 포어 102를 갖는 기판 101을 통해 쉽게 통과할 수 있다. 기판 100은 종이, 특히 크로마토그래피 종이, 천, 스트링 또는 윅킹(wicking) 또는 모세관 특성을 갖는 기타 재료일 수 있다. RBC 100이 통과할 수 있는 가장 작은 포어 102의 직경은 세포의 부피와 표면적에 따라 달라지지만, 정상적인 인간 RBC의 경우 대체로 2.5 ㎛이다. 따라서, 각각의 직경(d)이 2.5 ㎛ 미만인 포어 102를 갖는 기판 101은 도 1B에 도시된 바와 같이, 전혈 시료 중 RBCs 100으로부터 혈장을 분리하기 위한 매우 직접적인 수단이다. 그러나, 포어 102를 통한 유량(Q)는 포어 102의 직경(d)의 네제곱에 비례하므로, Q ∝ d4, 기판 101의 포어 102의 직경(d)이 작을수록, 기판 101을 통한 혈장의 체적 부피 유량도 적다. 이에 더해, 여과된 RBCs는 기판 101 상에서 매우 효과적으로 팩(pack)하는 경향이 있으므로(이들의 변형성 때문에), 이는 종국적으로 기판 101을 통한 혈장 흐름의 완전한 분리독립(secession)을 유도하게 된다. 따라서, 직경이 2.5 ㎛ 미만인 포어 102를 갖는 기판이 RBCs 100으로부터 혈장을 매우 효과적으로 분리한다 하더라도, 정제된 혈장의 수율은 비색 분석법에 사용되기에 충분치 않을 수 있다. 반대로, 포어 102의 직경을 증가시키면 기판 101을 통한 정제된 혈장의 흐름이 증가되지만, 분리 효율이 불가피하게 저감될 것이다.
[0044] 도 1C에 도시된 바와 같이, 본 발명은 RBCs의 유효 크기를 증가시키기 위해 RBC 응집을 이용하여, 직경이 2.5 ㎛보다 현저히 큰 포어 102를 갖는 기판 101을 이용함으로써 여과될 수 있는, 응집된 커다란 다세포 RBCs 103을 형성하고, 따라서 정제된 혈장을, 보다 높은 체적 유량에서 얻는다. 일반적으로 응집(agglutination)은 RBCs와 같은 입자들이 응괴하여 보다 큰 입자를 만드는 것이다. 응집은 응집제 첨가에 의해 일어나거나 또는 온도 변화에 의해 일어날 수 있다. 응집으로 인해, RBCs는 μPAD의 기판 101 내의 포어 102를 통과하기에는 너무 큰 응집된 RBCs 103을 형성하게 된다. 그 결과, 응집된 RBCs 103은 기판 101에서 엉기게 되고 따라서 전혈 시료로부터 혈장이 분리된다. 기판 101의 포어 102를 통과하는 혈장은 이어서 기판 101을 통해 외부로 빠져나간다(wicked outwardly). 본 발명에서, 기판 101 내의 포어 102는 응집된 RBCs 103를 효과적으로 여과할 정도로 충분히 작으면서도, 비색 분석의 완결을 위하여 적절히 높은 혈장 유량을 달성할 수 있을 정도로 충분히 크다.
[0045] 응집은 응집 항체(항-A,B)와 같은 응집제를 전혈에 첨가함으로써 개시될 수 있다. 항-A,B는 인간 RBCs 표면에 존재하는 항원 A 및 항원 B에 선택적으로 결합하는, 면역글로불린 클래스 IgM의 모노클로날 항체이다. 항-A,B 항체에 의한 RBCs의 직접 응집은 A 또는 B, 또는 A와 B 항원 모두가 RBCs의 표면에 존재할 경우 일어난다 (혈액형 A형, B형 및 AB형).
[0046] 도 2A는 인산염 완충염수(대조군)로 처리된 종이 기판 상에 떨어뜨린 전혈 시료의 시각적 외관을 나타낸 도면이고 도 2B는 응집 항체들로 처리된 종이 위에 떨어뜨린 전혈 시료의 시각적 외관을 나타낸 도면이다. 도 2A와 도 2B를 비교하면, 인산염 완충염수(대조군) 처리된 종이 위에 떨어뜨려진 전혈 시료 201이 분리됨이 없이 종이를 통해 윅킹(wicking)하는 RBCs와 혈장의 균일한 상(phase)로서 거동함을 볼 수 있다. 그러나, 전혈 시료를 항-A,B 항체 용액으로 전처리한 종이 위에 떨어트렸을 경우, 응집된 RBCs 202(종이 섬유에서 엉기게 된다)로부터 혈장이 분리되어, 응집된 RBCs 주위에 혈장 밴드 203이 형성된다. 혈장 밴드 203은 인산염 완충염수로 처리된 종이 상의 전혈 시료 201 또는 응집된 RBCs 202보다 현저히 더 멀리까지 확산된다.
[0047] 크로마토그래피 종이 위에 15 μL의 항-A,B 용액 또는 인산염 완충염수(대조군)를 떨어뜨린 다음 종이를 건조시키고 1 μL 내지 10 μL 용적의 전혈 시료를 첨가한 후 인산염 완충염수(대조군)으로 처리된 전혈 시료에 의해 형성된 스팟의 반경과 RBC 스팟의 반경 및 응집 항체로 처리된 종이 상의 전혈 시료에 의해 생성된 혈장 밴드의 폭을 측정하자, 분리된 혈장에 의해 형성된 밴드의 폭이 항-A,B 항체로 처리된 종이 상에 침착된 전혈 시료의 용적에 유의적으로 의존하지 않은 것으로 밝혀졌다. 이것은 다양한 용적의 전혈 시료에 있어서 밀리미터 단위의 전혈 스팟의 반경, 응집된 RBC 스팟의 반경 및 혈장 밴드의 폭을 도시하고 있는 도 2C에서도 추가로 확인된다.
[0048] RBC 응집을 이용하는 μ PAD 디바이스
[0049] 도 3은 응집 현상을 이용하여 전혈로부터 혈액 혈장 분리가 통합된 μPAD 300의 디자인을 나타낸 도면이다. μPAD 300의 패턴은 중심부에 있는 응집 구역 301 및 μPAD 300의 가장자리 상에 위치한 4개의 검사 판독 구역 302, 303, 304, 305를 포함한다. 전술한 데이터(도 2C에 도시된 바와 같음)를 이용하여 μPAD 300의 중심부에 응집된 RBC를 효과적으로 유지하고, 분리된 혈장을 가장자리의 검사 판독 구역 302, 303, 304, 305 내로 충분량 흐르게 할 수 있는 μPAD 300의 최적 형상과 크기를 탐지하였다. 응집 구역 301의 중심과 검사 판독 구역 302, 303, 304, 205의 외곽 가장자리 사이의 최적 거리는 대략 0.5 cm이다.
[0050] μPAD 300을 손끝을 찔러서 쉽게 수득할 수 있는 혈액량에 해당하면서, 자원이 한정된 설비에서 현재 이용가능한 많은 신속 진단 검사법에 필요한 혈액 시료량에 해당하는, 대략 7 μL의 전혈 시료를 가지고 구동하는데 최적화시켰다.
[0051] 검사 판독 구역 302, 303, 304, 305 중의 색상 변화 분석을 단순화하기 위해, μPAD 300의 검사 판독 구역 302, 303, 304, 305를 사각형 모양으로 만들었다. μPAD 300 디자인의 검사 판독 구역 302, 303, 304, 305의 형상을 사각형으로 함으로써 스캐닝 및 컴퓨터 분석에 의해 색상 변화를 정량화시킬 때 이들의 자동화된 선택이 가능해진다. 그러나, 검사 판독 구역은 어떤 모양이든 무방하다.
[0052] μPADs 300은 고체-잉크(왁스) 프린터 (예컨대, Phaser 8560N, Xerox, Norwalk, CT)를 이용하여 크로마토그래피 종이(예컨대, Whatman No. 1 크로마토그래피 종이, Piscataway, NJ) 상에 많은 μPADs 300 패턴들 (예컨대, 어레이 내에 배열됨)을 인쇄한 다음 패턴화된 종이를 150℃의 열판에서 3분간 가열하고, 상기 종이를 실온으로 냉각하여 종이의 전 두께를 통해 소수성 배리어를 형성함으로써 만들 수 있다. 용융 프로세스는 μPAD의 패턴의 최초 설계시 차지했던 인쇄선의 확장을 초래한다. 이어서 (i) 항-A,B 항체 용액을 좋기로는 1-20 μL 범위의 용적으로 응집 구역 301 위에 스포팅하고, (ii) 비색 분석 시약 301을 1-20 μL 범위의 용적으로 검사 판독 구역 302, 303, 304의 세 군데에 각각 스포팅하고, (iii) 인산염 완충염수 301을 좋기로는 1-20 μL 범위의 용적으로, 나머지 한 군데의 검사 판독 구역 305에 스포팅함으로써 μPAD 300을 기능하도록 한다. 인산염 완충염수로 처리된 검사 판독 구역 305는 색상 변화를 측정하는데 이용된다. 이어서 기능화된 각각의 μPAD 300을 추가 사용 전에 건조시킨다.
[0053] RBC 응집을 이용한 μ PAD 의 사용
[0054] 도 4A 및 4B를 참조로 μPAD 400을 이용한 전혈 시료의 비색 분석을 수행하기 위해, 7 μL 방울의 전혈 시료 401을 μPAD 400의 중심부의 응집 구역 402에 침착시킨다. 전혈 시료 401은 확산하여 응집 구역 402를 채우게 되는데 이것은 전혈 시료 401의 '배수조(catch basin)' 역할을 하여 응집된 RBCs 403을 보유하는 한편 혈장으로 하여금 바깥쪽으로 측면 이동하여 μPAD 400 주변의 검사 판독 구역 404, 405, 406, 407 내로 이동하게 한다. 분리된 혈장은 검사 판독 구역 404, 405, 406, 407을 채우고 이 구역에서 혈장의 목적 피검물이 비색 분석 시약과 반응하여 혈장의 목적 피검물의 농도에 비례하는 색상 변화을 일으킨다. 도 4B에서, 검사 판독 구역 404, 405, 406은 비색 분석 시약에 의해 기능하여 이들 검사 판독 구역 404, 405, 406에서 색상 변화를 초래하고, 검사 판독 구역 407은 비색 분석 시약에 의해 기능화하지 않으므로(그리고 그 대신 인산염 완충염수에 의해 기능할 수 있음), 대조군으로서 작용하며, 색상 변화를 일으키지 않는다. 일반적으로, 전혈 시료 401의 도입으로부터 RBC 응집 403, 혈장 분리 및 검사 판독 구역 404, 405, 406에서의 탐지가능한 색상 변화가 일어나기까지 5분이 채 걸리지 않는다.
[0055] 실시예 1: 전혈 시료에서 혈중 글루코스 농도의 측정
[0056] 일례로서 혈중 글루코스 분석법을 이용하여 RBC 응집-기반 혈장 분리된 μPAD를 시험하였다. 이 분석법에서, 글루코스 옥시다제는 혈장 시료에 존재하는 글루코스의 산화를 촉매하여 과산화수소(H2O2)를 생성시킨다. 이어서 호스래디쉬 퍼옥시다제는 H2O2와 요오드화칼륨과의 반응을 촉매하여 갈변을 일으킨다. 색상 변화 강도는 생성된 H2O2의 양에 비례하므로, 글루코스의 양에도 비례한다.
[0057] 혈중 글루코스에 대한 비색 분석법의 민감도를 알아보기 위해, 미지의 여러가지 농도의 글루코스가 들어있는 3.5 μL의 혈장을 분석 시약으로 전처리된 크로마토그래피 종이의 사각-패턴 구역(μPADs를 만드는데 사용된 것과 동일한 종이로서 직경이 약 2-200μm인 포어가 있는 것으로 관찰됨) 위에 스포팅시켰다. 전혈(건강한 지원자로부터 채혈된 인간 정맥 혈액으로부터 얻음)을 원심분리 (800xg, 15 분)하여 혈장을 준비하였다. Liquid Glucose (Oxidase) Reagent Set (Pointe Scientific, Inc.)을 이용하여 제조자 지침에 따라 혈장 농도를 분광광도계를 이용하여 측정하였다 (500 nm, NanoDrop 1000, Nano Drop products, Wilmington, DE). 색상 변화 대조군으로서 사용하기 위해 사각-패턴 구역의 일부를 1 μL의 인산염 완충염수로 처리하였다. 분석을 위해 5분간 전개시켜, 종이를 스캐닝하고 이미지를 MATLAB
Figure pct00001
으로 불러와서 다양한 농도의 글루코스에 있어서의 색상 변화를 정량하였다. 도 5는 생리학적 범위(50 - 200 mg/dL)에서 혈중 글루코스 농도에 대한 색상 변화의 의존성의 검정선(calibration curve)을 나타낸 도면이다.
[0058] 전혈 시료 401에 대해 혈중 글루코스의 이러한 비색 분석으르 직접 수행할 수 있는 μPAD 400을 제작함에 있어, 원래 동일한 피검물에 대해 상이한 비색 분석법들을 이용하거나 상이한 피검물들에 대해 비색 분석법들을 이용할 수 있지만, μPAD 400의 3개의 검사 판독 구역 404, 405, 406에서 동일한 비색 분석을 기능화시켜 동일 시료 401에 대한 측정을 3회 실시하였다. 각각의 3개의 검사 판독 구역 404, 405, 406을, 요오드화칼륨(탈이온수 중 0.6M), 전분 (포화 염 용액 중 0.3g/mL), 글루코스 옥시다제(0.1M 인산칼륨 중 100 U/mL, pH 7.4, 0.05 M NaCl, 5 mM 콜산, 0.1% Triton
Figure pct00002
X-100), 및 호스래디쉬 퍼옥시다제(0.1M 인산칼륨 중 20 U/mL, pH 7.4, 0.05 M NaCl, 5 mM 콜산, 0.1% Triton
Figure pct00003
X-100)으로 이루어진 용액 1 μL로 기능화시켰다. 네번째 검사 판독 구역 407을 1 μL의 인산염 완충염수로 처리하여 색상의 밝기와 배경색 변화를 제어하였다. 응집 구역 402를 7 μL의 Seraclone 항-A,B (ABO3) 클론 BS 63/BS 85 (Biotest Medical Diagnostics GmbH, Germany)으로 기능화시켰다. 모든 시약들을 μPAD 400 사용 전에 건조시켰다.
[0059] μPAD 400를 이용하여, 미지의 글루코스 농도를 갖는 전혈 시료 401 (혈액형이 A, B 또는 AB형인 건강한 지원자로부터 채혈한 인간 정맥 혈액으로부터 얻음)을 검사하기 위해, 7 μL의 시료 401을 μPAD의 응집 구역 402에 스포팅하고 5분간 전개시켰다. 이어서, μPAD 400의 검사 판독 구역 404, 405, 406에서의 색상 변화를, 휴대용 스캐너(예컨대, CanoScan LiDE110, Canon USA Inc, Lake Success, NY)로 크로마토그래피 종이 함유 μPAD 400를 스캐닝하고, MATLAB
Figure pct00004
(The MathWorks Inc, Natick, MA)으로 이미지를 분석하여 정량하였다. 마지막으로 분석을 n이한 검정선(도 5에 도시된 바와 같음)을 이용하여 색상 변화값을 혈주우 글루코스 농도로 변환시켰다. 그러나, 이 부분의 분석은 디지털 카메라가 장착된 스마트폰을 이용하여도 수행할 수 있다. 전혈 시료 중의 글루코스 농도는 μPAD 400으로 측정시 89.5 mg/dL였고, 통상적인 분광광도계(NanoDrop 1000)을 이용하여 독립적으로 측정시 82.5 mg/dL였다.
[0060] 이 실험은 혈액형이 A, B 또는 AB형인 건강한 지원자로부터 얻은 전혈 시료에서 RBC 응집반응을 유도하기 위해 항-A,B 항체를 이용하였다. 그러나, 이 특이적인 분리 전략은 혈액형이 O형인 개체(전체 인구의 대략 44%)에 대하여는 실시할 수 없을 것인데 이는 이들의 혈액은 항원 A 또는 항원 B를 함유하지 않기 때문이다. 항원 H는 혈액형이 Oh "봄베이 표현형" (전체 인구의 0.0004% 미만)인 경우를 제외하고 O형인 사람들을 포함하여 모든 RBC의 표면에 존재한다. 항원 H는 항원 A와 항원 B의 전구체이며 개체의 ABO식 혈액형에 따라, 항원 A나 항원 B, 또는 두 가지 모두로 변환된다. 결과적으로, A, B 또는 AB형의 RBCs는 O형의 RBCs에 비해 항원 H를 현저히 적게 가지며, 본 발명자들은 항-H IgM 항체가 O형 RBCs의 강한 응집과 A, B 또는 AB형 RBCs의 약한 응집을 유도할 것으로 고찰하였다. 따라서, 본 발명자들은 항원 A, B 및 H (항-H 및 항-A,B의 혼합물로서 또는 단일 항-ABH 항체로서)과 반응성인 IgM 항체를 이용할 경우 거의 모든 사람들에게 이러한 혈장 분리 접근법을 적용할 수 있을 것으로 고찰하였다.
[0061] 전술한 실험은 글루코스 농도의 검사를 위해 비색 분석법을 사용하였지만, 본 발명자들은 다른 분석법들도 그들의 해당 시약을 이용하여 검사될 수 있을 것으로 보았다. 이의 예로는 비에스테르화 지방산 검사를 위한 Sigma 트리글리세라이드 진단 키트; 유리 지방산 검사를 위한 디페닐카르바지드 함유 디페닐카르바존; 콜레스테롤 검사를 위한 amplex Red, 콜레스테롤 옥시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제인 인산염 완충염수; 헤파린 검사를 위한 Azure A 분석; 및 리소포스파티드산 검사를 위한, 0.01% Triton X-100 함유 HEPES 완충액 (pH 7.6) 중 리소포스포리파제, 퍼옥시다제, G3PO, G3PDH, HSD, NADH, 콜산, TOOS 및 4-아미노안티피린을 들 수 있다.
[0062] 본 발명의 또 다른 측면은 혈액 시료 중 겸상 헤모글로빈의 존재여부를 탐지하기 위해 전체가 μPAD에 함유된 소량의 전혈 시료 중 데옥시-Hb S로부터 Hb A, C 및 F를 분리하기 위한 진단 디바이스 및 진단 방법을 제공한다.
[0063] 응집반응을 이용한 Hb S로부터 Hb A, C 및 F의 분리
[0064] 종래기술에는 혈액 시료에서 화학적으로 RBCs를 용해(lyse)시키는 사포닌을 이용하여, 용액 내로 Hb를 방출시키고, 아황산나트륨(저렴하고 안전한 환원제) 존재 하에, 유리된 Hb를 데옥시-Hb로 전환시키는 SickleDex (SickleDexTM, Streck, Omaha, NE)과 같은 레귤러 Hb 용해도 분석법이 알려져 있다. 고농축 인산염 완충액에서, 데옥시-Hb S는 배열이 변형되어, 중합 및 침전하게되고 가시적으로 뿌연 용액(Hb의 비겸상(non-sickling) 형태의 용해도는 영향을 받지 않은 채임)으로 된다. 중합으로 인해, Hb S 분자들은 응집하여 커다란 수프라 분자 집괴(supra-molecular agglomerates)를 형성하는데 이것은 Hb의 다른 유형에 비해 그의 유효 크기가 현저히 증가한 것이다.
[0065] 상업적으로 구득가능한 종래의 Hb 용해도 분석법(예컨대 SickleDex)은 Hb S를 함유하는 혈액 시료로부터 정상적인(Hb AA) 혈액 시료를 식별하는데 유용하지만, 이들은 SCD 환자로부터의 혈액 (Hb SS, Sβ또는 SC)으로부터 SCT (Hb AS) 혈액을 구별하지는 못하는데, 이는 이들 시료 모두가 어느 정도 Hb S를 함유하기 때문이다. 따라서, 진단 분석법의 일부로서 전혈로부터 Hb A, C 및 F의 분리를 가능케 하도록 μPADs를 혁신할 필요가 있다.
[0066] 본 발명의 한가지 측면은 Hb A, C 및 F로부터 Hb S를 분리하기 위해 응집반응을 이용하여 전술한 문제점을 해결하는 μPAD를 제공하는 것이다. 기판 상에 Hb 용해도 분석의 성분들이 혼합된 전혈 한 방울을 떨어뜨리면 중합된 데옥시-Hb S가 결과된다 (Hb가 용액 내로 방출된 결과로서, 소듐 하이드로설파이트의 존재 하에, 유리된 Hb가 데옥시-Hb로 변환되어 중합한다). 기판은 종이, 특히 크로마토그래피 종이, 천, 스트링 또는 윅킹 또는 모세관 특성을 갖는 기타 재료일 수 있다. 그 후 전혈의 중합된 데옥시-Hb S는 혈액 얼룩의 중심에 남게 되어, 기판의 포어를 통과할 수 없게 되고 기판과 엉겨붙는 한편, Hb A, C 및 F의 분자들은 가용성인 채로 남아있어 모세관 작용에 의해 얼룩의 주변으로 측면 이동하게 된다. 이어서 정상적인, SCT 및 SCD 시료들은 각 샘플에 의해 생성된 독특한 혈액 얼룩 패턴에 기초하여 쉽게 구별될 수 있다.
[0067] 도 6은 종이-기반 Hb 용해도 분석법의 작동 원리를 도식적으로 나타낸 도면이다. 종이-기반 Hb 용해도 분석을 실시하기 위해, 10-50μL 범위 용량의 혈액 한 방울을, 여기서 응집제인 SickleDex 용액에 첨가한다. SickleDex 용액은 혈액 시료 대 SickleDex 용액의 용량비가 1:20이 되도록 첨가한다. 이 혼합물 601 한 방울을 μPAD 600의 종이 기판 602에 침착시킨다. 중합된 데옥시-Hb S의 집괴 뿐 아니라 세포 잔해물 역시 종이 기판 602의 포어를 통과하지 못하여, 종이 기판 602에 의해 엉겨붙게 되고 본래의 액적의 윤곽선 내에 머물게 되어, 전개중인 혈액 얼룩의 중심에 적색 스팟 603이 만들어진다. 액적 내에 존재하는 Hb의 가용성 형태는 바깥쪽으로 측면 이동하여 중심의 적색 스팟 603 주변에 분홍색 고리 604가 형성된다. 혈액 얼룩의 전체 직경과 그의 중심의 적색 스팟 603의 직경을 종이 기판 602 상에 침착된 액적 601의 부피에 의해 측정하자, 이들은 시료의 유형과 무관하였다. 그러나, 분홍색 고리 604의 색상 강도는 혈액 시료에 존재하는 Hb의 가용성 형태(예컨대 Hb A, F 또는 C)의 농도와 강한 상관관계를 나타내었다.
[0068] Hb S 응집반응을 이용한 μ PAD
[0069] 도 7A는 전혈로부터 Hb S를 분리하기 위해 응집반응을 이용하는 μPAD의 디자인을 나타낸 도면이다. μPAD 700은 중심부에 사각 형상의 소수성 배리어 702 및 응집 구역 701을 포함한다. μPAD 700의 소수성 배리어 702의 사각 패턴은 하나의 μPAD 700으로부터 다른 것으로 혈액이 확산되는 것을 제한하여, 시료들의 잠재적인 교차오염을 방지하기 위해 설계된 것이다. μPAD 700의 각 코너에 있는 45o의 정렬선 703은 작동자가 μPAD 700의 중심부의 응집 구역 701 내에 시료 액적들을 침착시킬 수 있도록 시각적인 가이드를 제공한다. μPAD 700의 이러한 매우 단순한 디자인은 혈액 얼룩 패턴을 디지털화 및 분석하는데 사용되는 자동화 이미지 분석 역시도 유의적으로 단순화시켜준다. 그러나, 특수한 형상의 μPAD 700을 사용할 필요는 없다 - 분석 수행을 위해 간단히 크로마토그래피 종이 조각을 사용해도 충분하다. 소수성 배리어 702의 패턴을 일러스트레이션 소프트웨어 (예컨대, Canvas 11, ACD Systems International Inc., Seattle, WA)를 이용하여 백색 배경위에 검은색 선으로 그린 다음, 고체-잉크 프린터(예컨대, a Phaser 8560N, Xerox, Norwalk, CT)를 이용하여 크로마토그래피 종이 시트 (예컨대, No. 1, Whatman, Piscataway, NJ)에 인쇄한다. 인쇄된 크로마토그래피 종이를 왁스의 융점 보다 높은 온도로 열판에서 가열하여(150℃, 3분) 종이의 전체 두께를 통해 소수성 배리어 702를 형성시킬 수 있었다. 용융 프로세스에 의해 μPAD 700의 패턴을 최초로 디자인하였을 때보다 인쇄선이 더 넓어지는 결과가 초래되었다.
[0070] Hb S 응집반응을 이용하는 μ PAD
도 6을 참조로, μPAD 600을 이용하여 전혈 시료의 종이-기반 Hb 용해도 분석 수행을 위해, 소량, 즉 약 10-50μL의 전혈을 1:20의 용량비로 SickleDex 용액과 가볍게 혼합하여, 5분간 방치한 다음 20 μL 부피의 이 혼합물의 액적을 μPAD 600의 중심부에 침착시킨다. 액적은 종이 기판 602의 중심부로부터 방사상으로 확산하여, 독특한 혈액 얼룩 패턴을 형성한다. 결과적인 혈액 얼룩을 휴대용 스캐너를 이용하여 디지털화한 다음 분석하였다.
이미지 프로세싱 알고리듬을 이용하여 혈액 얼룩 패턴을 분석하였다. 혈액 얼룩의 정량화는 혈액 얼룩의 천연 대칭성에 의해 유의적으로 단순화된다. 컴퓨터 알고리듬은 얼룩의 기하학적 중심을 자동적으로 탐지하여, 이미지를 중심부에 대해 약 1O 스텝 회전시켜, 혈액 얼룩의 360개의 독립적인 1 픽셀-너비의 수평선 스캔을 수집한다 (이러한 수평선 스캔 1개가 점선 605로 도시되어 있음). 이어서 이들 선 스캔들을 평균내어 혈액 얼룩의 중심부로부터 그의 가장자리까지의 적색 강도 변화 패턴의 대표적인 단일 곡선을 구한다. Hb AA, Hb AS 및 Hb SS를 함유하는 혈액 시료에 대한 각 곡선의 예를 도 7B에 나타내었다.
도 7B에서 볼 수 있는 바와 같이, 적색 강도 곡선은 혈액 시료의 모든 유형에 있어서 전체적으로 대략 동일한 프로파일을 갖는다. 적색 강도는 얼룩의 중심부로부터 서서히 증가하여 중심 스팟과 가장자리의 분홍색 고리의 계면에서 최대치에 달한다. 중심 스팟에 있어서의 이러한 특징적인 색상 변화는 본래의 액적의 침착에 의해 잔류하는 윤곽선을 향한 액체의 방사상 유출과 함께 중합된 HbS 집괴들의 이동에 기인한 것으로 고찰된다. 분홍색 고리의 색상은 비교적 균일하고, 얼룩의 바깥쪽 가장자리에서 배경색으로 희미해진다. 분홍색 고리의 색상 균일성은 분홍색 고리의 색상이 고인산염 완충 용액에서 분자수준으로 균일하게 용해된 채 남아있는 Hb의 가용성 형태의 농도에 의해 결정된다는 사실에 기인하는 것으로 여겨진다.
[0071] 실시예 2: 건강한, SCT 또는 SCD
[0072] 본 발명의 μPAD를 대표적인 예들로서 1개의 정상적인 (Hb AA), 1개의 SCT (Hb AS) 및 1개의 SCD (Hb SS) 혈액 시료에 각각 사용하였다. 본 발명자들은 소량, 즉 약 10-50μL 양의 각각의 전혈 시료를 SickleDex 용액과 1:20의 부피비로 가볍게 혼합하여 5분 방치한 다음 각각의 혼합물 20 μL 액적을 μPAD의 중심부에 침착시켰다. 정상적인 인간 정맥 혈액(Hb AA))을 건강한 지원자로부터 얻고; SCD (Hb SS) 및 SCT (Hb AS) 혈액 시료는 Sickle Cell Center of Southern Louisiana (New Orleans, LA)로부터 입수하였다. 이전의 3개월 이내에 혈액 수혈을 받았던 SCD 환자로부터의 혈액 시료는 제외하였다. SCD 시료의 Hb A, F, C 및 S 함량을 표준 환자 케어의 일부로서 헤모글로빈 전기영동을 통해 측정하였다. SCT 혈액 시료를 SCD 환자의 생물학적 부모(대개 모친)로부터 채혈하였다. 헤마토크릿 값이 25% 미만(빈혈을 나타냄)인 SCT 시료는 제외하였다. 이 실험에서 사용된 SickleDex 용액 (SickleDexTM, Streck, Omaha, NE)은 다음 2 성분, 즉: (i) 건조 시약 분말로서 공급되는 소듐 하이드로설파이트 및 사포닌, 그리고 (ii) 0.1% 2-클로로아세트아미드가 혼합된 2.3M 인산칼륨 용해 완충액으로 구성된, 상업적으로 구입가능한 테스트 키트이다. 시약 분말을 함유하는 바이알 1개의 내용물을 용해 완충액(제조자가 공급한 상태) 1병에 첨가하고 격렬히 교반하여 완전히 용해시켰다. Hb 용해 분석용 용액을 혈액과 1:20의 부피비로 혼합하였다.
[0073] 각각의 μPAD에 침착된 액적은 종이 기판을 통해 중심부로부터 방사상으로 확산되어, 도 7A에 도시된 바와 같이, 3가지 유형의 각각의 시료마다 독특한 혈액 얼룩 패턴을 형성한다. μPAD의 크기와 액적의 부피는 얼룩의 최외곽 가장자리가 μPAD 주변의 패턴 외곽선과 정렬선에 닿지 않도록 하는 것이었다. 혈액 얼룩이 있는 크로마토그래피 종이를 함유하는 μPADs 어레이 시트를 휴대용 평판 스캐너 (CanoScan LiDE110, Canon USA Inc., Lake Success, NY)에 삽입하였다. 그러나, 디지털 카메라가 장착된 스마트폰을 이용하여서도 이 분석 작업을 완결지을 수 있다. 스캐닝된 이미지를 이미지 알고리듬(MATLAB
Figure pct00005
, The MathWorks Inc., Natick, MA)을 이용하여 분석 및 디지털화하여 도 7B에 도시된 적색 강도 프로파일을 생성하였다. μPAD 상에 시료를 도입하여, 혈액 얼룩을 형성하고, 이미지를 스캐닝한 다음 마지막으로 자동화 이미지 분석에 이르기까지 이 모든 단계를 포함하여 분석이 종결될 때까지 걸리는 총 시간은 약 10분이었다. 이와 대조적으로, SCD를 진단하는데 일반적으로 사용되는 표준 Hb 전기영동 검사법은 적어도 2시간이 소요되며 심지어는 종종 약 1주일이 걸리기도 한다.
[0074] 여전히 7A를 참조하면, 3가지 혈액 시료 각각은 μPAD 중심부에 보다 진한 적색 스팟 704(~ 3 mm 반경)이 있고 (동일한 액적의 본래 위치를 아웃라인 윤곽임), μPAD의 주변에 보다 연한 분홍색 고리 705 (~ 5.5 mm 폭)를 갖는 유사한 크기의 얼룩들을 나타내지만, 본 발명자들은 혈액 얼룩 패턴들 간에 시각적으로 두드러진 차이가 있음을 관찰하였다. 정상적인 혈액(Hb AA)에 의해 생성된 혈액 얼룩의 색상은 전체적으로 거의 균일하고, 중심 스팟 704의 외곽이 약간 더 어두운 윤곽선을 나타내었다 (본 발명자들은 이것이 RBCs의 용해에 의해 생성된 세포 잔해물의 침착에 기인하는 것이라 여긴다). SCT 혈액 (Hb AS)에 의해 생성된 혈액 얼룩의 중심 스팟 704는 정상 시료의 그것보다 유의적으로 더 진하였고 주변부의 분홍색 고리 705는 정상 시료의 그것보다 유의적으로 더 옅었다. SCD 혈액 (Hb SS)에 의해 생성된 혈액 얼룩의 중심 스팟 704는 3가지 시료 중 가장 진하였으며, μPAD의 주변부의 분홍색 고리 705는 거의 보이지 않았다.
[0075] Hb S (농축 인산염 완충액에서 산소제거될 때 중합한다)는 중심 스팟의 색상에 책임이 있고 Hb의 다른 형태들(동일 조건 하에서 용해된 채로 남아있다)은 분홍색 고리의 색상 변화에 책임이 있으므로, 이러한 차이점들은 각 시료의 RBCs에 존재하는 Hb의 가용 형태 및 Hb S의 분획의 유의적인 차이로서 설명될 수 있다. 일반적으로, 건강한 대상자 (Hb AA)로부터의 RBCs의 Hb S 함량은 0%이고, SCT 대상자(Hb AS)의 경우 Hb S 함량은 20-40%로 가변적이며, SCD 대상자 (Hb SS)의 경우에는 이것이 80-100% 정도로 높다. 따라서, Hb S 분획이 가장 높으면서 가용성 Hb의 분획(예컨대 Hb A, F 또는 C)이 최저인 SCD (Hb SS) 시료는 가장 진한 중심 스팟과, 주변부에 실제로 거의 보이지 않는 분홍색 고리를 생성한다.
[0076] 따라서 혈액 얼룩 패턴들 간의 차이를 이용하여 건강한 대상자, SCT 대상자 및 SCD 대상자로부터 얻은 혈액 시료를 식별할 수 있다. 도 8A는 정상 (Hb AA), SCT (Hb AS) 및 SCD (Hb SS, Hb Sβ, Hb SC) 대상자로부터의 시료에 대한 혈액 얼룩의 정규화된 색상 강도 프로파일을 도시한 도면이다. 색상 강도 프로파일을 곡선하 총면적(본래 시료 중의 Hb 농도를 반영함)에 의해 정규화하여 대상자들 간의 헤마토크릿 차이를 설명한 다음, 각각의 Hb 유전형 내에서 모든 대상자들의 값을 평균내었다. 혈액 얼룩의 중심으로부터 5 mm 거리에서의 정규화된 색상 강도 (도 8A에서 SCD 인덱스라 표시된 점선)는 동일한 Hb 유전형 그룹으로부터 유래한 대상자들 간에는 매우 일관성 있었으며, 서로 다른 그룹들 간에 있어서는 가장 극명한 차이를 나타내었다. SCD 인덱스의 물리적 의미는 농축 인산염 완충액 중 산소제거될 때 가용성인 채로 남아있는 시료 중의 Hb의 분획이다. 도 8B에 도시된 바와 같이, 본 발명자들은 SCD 인덱스를 Hb 유전형의 시료들을 식별하기 위한 정량적인 측량 도구로 삼았다. 도트는 각 혈액 유전형(Hb AA (3), Hb AS (3), Hb SS (6), Hb Sβ (1), 및 Hb SC(4))과 그 개체 시료에 대한 SCD 인덱스 값의 개별적인 혈액 시료를 나타낸다. 각 혈액 유전형 Hb AA, Hb AS, Hb SS 및 Hb SC)의 3개의 수평선들은 시료의 평균값(가운데 수평선)과 평균보다 높거나 낮은 표준 편차(각각 가장 위의 수평선과 가장 아래의 수평선)을 나타낸다. 본 발명자들의 실험은 혈액 유전형 Hb Sβ에 대해 하나의 시료만을 포함하였으므로, 그 시료는 하나의 평균값만을 포함하며 표준 편차는 계산할 수 없었다. 따라서, 도 8B로부터, 이 방법을 이용하여 분색된 시료들의 대다수는 평균값으로부터 1개의 편차 내의 SCT 값이 결과된 것으로 관찰될 수 있다. 도 8B로부터, 정상(Hb AA) 시료에 대한 SCD 인덱스는 검사된 다른 종류(SCT 또는 SCD)의 시료에 대한 SCD 인덱스보다 유의적으로 더 높다는 것을 알 수 있다 (p<0.001). SCT (Hb AS) 개체로부터의 혈액 시료에 대한 SCD 인덱스는 Hb SS 및 Hb Sβ 환자들 (SCD의 가장 흔하면서 위중한 2 가지 형태임)의 경우보다 유의적으로 현저히 더 높았고(p<0.001), Hb SC 환자들(SCD의 보다 덜 흔하면서, 보다 약한 형태)의 경우보다 확실히 더 높았다 (현저히 더 높은 것보다는 그 정도가 덜하지만)(p<0.05). Hb SS / Sβ 그룹과 Hb SC 간의 차이 역시 고도로 유의적이었으며(p<0.001), Hb Sc 환자들은 일반적으로 건강한 SCT 개체와 SCD 인덱스 관점에서 보다 위중한 형태의 SCD 환자 사이에 위치된다. Hb 유전형들 간의 SCD 인덱스 값의 유의적인 차이로 인해, 이 SCT 인덱스 값은 혈액 시료를 정상(Hb AA), SCT (Hb AS) 및 SCD (Hb SS, Hb Sβ, Hb SC)로서 동정하는데 효과적인 것으로 입증되었다.
[0077] 또한, 본 발명자들은 본 발명의 μPAD가 다음에 대응하는 응집제를 이용하여 하기의 질병 및 감염증을 진단하는데 이용할 수 있을 것으로 생각한다: 후천성 중증근육무력증과 아세틸콜린 수용체 항체; 폐렴 미코플라즈마와 저온 응집소(cold agglutinins); 전염성 단핵증과 저온 응집소; 인플루엔자와 저온 응집소; 비세균성 감염과 저온 응집소; 콜라겐 혈관 질환과 저온 응집소; 간경변과 저온 응집소; 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종과 저온 응집소; 살모넬라와 열성 응집소(열성 응집소); 리케챠와 열성 응집소; 브루셀라병과 열성 응집소; 야토병과 열성 응집소; 백혈병과 열성 응집소; 림프종과 열성 응집소; 인체면역결핍 바이러스와 HIV 항체; 인체 면역결핍 바이러스와 뇨 HIV 항체; 인체 면역결핍 바이러스와 타액 HIV 항체; 천식과 IgE 항체; 피부염과 IgE 항체; 음식물 알레르기와 IgE 항체; 라텍스 알레르기와 IgE 항체; 알레르기성 비염과 IgE 항체; 혈관부종과 IgE 항체; 전신홍반성 루푸스와 항카르디올리핀 항체; 항인지질 증후군과 항카르디올리핀 항체; CREST 증후군과 항중심절 항체; 전신홍반성 루푸스와 항-DNA 항체; 만성 간염과 항-DNA 항체; 전염성 단핵증과 항-DNA 항체; 담즙성 간경변과 항-DNA 항체; 굿파스처 증후군과 항사구체 기저막 항체; 자가면역 사구체신염과 항사구체 기저막 항체; 루푸스 신염과 항사구체 기저막 항체; 자가면역 간염과 항-간/신장 마이크로좀 항체; 고감마글로불린혈증과 항-간/신장 마이크로좀 항체; 매독과 항미토콘드리아 항체; 류마티스성 심장병과 항심근 항체; 스트렙토코커스 감염과 항심근 항체; 심근병증과 항심근 항체; 악성빈혈과 항-벽세포(anti-parietal cell) 항체; 소아당뇨병과 항-벽세포 항체; 공피증과 항공피증 항체; 만성활동 간염과 항-평활근 항체; 단핵구증 간염과 항-평활근 항체; 바이러스성 간염과 항-평활근 항체; 만성 갑상선염과 항갑상선글로불린 항체; 류마티스 관절염과 항갑상선글로불린 항체; 갑상선항진증과 항갑상선글로불린 항체; 갑상선기능저하증과 항갑상선글로불린 항체; 만성 갑상선염과 항갑상선 퍼옥시다제 항체; 류마티스 관절염과 항갑상선 퍼옥시다제 항체; 갑상선항진증과 항갑상선 퍼옥시다제 항체; 갑상선기능저하증과 항갑상선 퍼옥시다제 항체; 급성 진균 감염과 진균 항체 IgG, IgA 및 IgM; 셀리악병과 글리아딘 항체 및 근내막(endomysial) 항체; 리지오넬라병과 리지오넬라병 항체; 감염홍반과 파르보바이러스 B19 항체; 일과성 재생불량성 빈혈과 파르보바이러스 B19 항체; 만성 빈혈과 파르보바이러스 B19 항체; 면역 혈소판결핍증과 혈소판 항체; 광견병과 광견병-무력화 항체; 풍진 감염과 풍진 항체; 홍역 감염과 홍역 항체; 톡소플라즈마증과 톡소플라즈마 항체; 및 웨스트 나일 바이러스와 웨스트 나일 바이러스 항체.

Claims (57)

  1. 포어를 갖는 기판을 포함하는 진단 디바이스로서, 상기 기판은 응집 구역과 검사 판독 구역을 더 포함하고, 상기 응집 구역은 응집제에 의해 기능화되는 것인 진단 디바이스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 응집 구역은 혈액 시료를 수용하도록 작동하는 것인 진단 디바이스.
  3. 제2항에 있어서, 상기 기판은 상기 혈액 시료를 상기 검사 판독 구역으로 전달할 수 있는 것인 진단 디바이스.
  4. 제3항에 있어서, 상기 검사 판독 구역은 분석 시약에 의해 기능화되는 것인 진단 디바이스.
  5. 제4항에 있어서, 상기 분석 시약은 비색 분석의 일부인 것인 진단 디바이스.
  6. 제5항에 있어서, 상기 비색 분석에 의해 상기 혈액 시료 중의 글루코스 농도를 측정할 수 있는 것인 진단 디바이스.
  7. 제4항에 있어서, 상기 디바이스는 제2의 검사 판독 구역을 더 포함하며, 상기 제2 검사 판독 구역은 대조군 시약에 의해 기능화되는 것인 진단 디바이스.
  8. 제7항에 있어서, 상기 대조군 시약은 인산염 완충염수인 것인 진단 디바이스.
  9. 제1항에 있어서, 상기 디바이스는 제2 검사 판독 구역을 더 포함하며, 상기 제2 판독 구역은 대조군 시약에 의해 기능화되는 것인 진단 디바이스.
  10. 제9항에 있어서, 상기 대조군 시약은 인산염 완충염수인 것인 진단 디바이스.
  11. 제1항에 있어서, 상기 디바이스는 상기 기판을 둘러싸는 소수성 배리어를 더 포함하는 것인 진단 디바이스.
  12. 제11항에 있어서, 상기 소수성 배리어는 왁스인 것인 진단 디바이스.
  13. 제12항에 있어서, 상기 기판은 크로마토그래피 종이인 것인 진단 디바이스.
  14. 제13항에 있어서, 상기 기판의 상기 포어들은 직경이 약 2-200 ㎛ 범위인 것인 진단 디바이스.
  15. 제12항에 있어서, 상기 검사 판독 구역은 직사각형인 것인 진단 디바이스.
  16. 제15항에 있어서, 상기 응집 구역의 중심과 상기 검사 판독 구역의 가장자리 간의 거리는 약 0.5 cm인 것인 진단 디바이스.
  17. 포어를 갖는 기판으로서, 상기 기판은 응집 구역을 더 포함하는 것인 기판; 및 상기 응집 구역에 침착된 시료
    를 포함하는 진단 디바이스로서, 상기 시료는 전혈과 응집제와의 혼합물을 포함하는 것인 진단 디바이스.
  18. 제17항에 있어서, 상기 기판은 Hb의 가용성 형태들을 바깥쪽으로 측면 이동시킬 수 있는 것인 진단 디바이스.
  19. 제18항에 있어서, 상기 응집제는 Hb 용해도 분석의 용액인 것인 진단 디바이스.
  20. 제19항에 있어서, 상기 Hb 용해도 분석은 SickleDexTM인 것인 진단 디바이스.
  21. 제20항에 있어서, 상기 시료는 일정 부피의 전혈과 일정 부피의 SickleDexTM이 각각 1:20의 부피비로 혼합되어 있는 것인 진단 디바이스.
  22. 제19항에 있어서, 상기 진단 디바이스는 겸상적혈구병을 검사할 수 있는 것인 진단 디바이스.
  23. 제17항에 있어서, 상기 디바이스는 상기 기판을 둘러싸는 소수성 배리어를 더 포함하는 것인 진단 디바이스.
  24. 제23항에 있어서, 상기 소수성 배리어는 왁스인 것인 진단 디바이스.
  25. 제24항에 있어서, 상기 기판은 크로마토그래피 종이인 것인 진단 디바이스.
  26. 제25항에 있어서, 상기 기판의 상기 포어들은 직경이 약 2-200 ㎛ 범위인 것인 진단 디바이스.
  27. 포어를 갖는 기판을 포함하는 진단 디바이스를 제공하는 단계로서, 상기 기판은 응집 구역과 검사 판독 구역을 더 포함하고; 상기 응집 구역은 응집제에 의해 기능화되고 상기 검사 판독 구역은 분석 시약에 의해 기능화되는 것인 단계;
    상기 응집 구역에 혈액 시료를 침착시키는 단계;
    상기 혈액 시료를 전개시키는 단계; 및
    상기 검사 판독 구역을 관찰하는 단계
    를 포함하는 질병 또는 상태의 진단 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 혈액 시료는 부피가 약 7 μL인 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 검사 판독 구역은 색상을 변화시킬 수 있는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 프로세싱 단계 후 상기 검사 판독 구역의 이미지를 캡쳐하기 위해 광학 이미지 캡쳐 디바이스를 사용하는 단계, 및 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 상기 이미지를 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 컴퓨터 소프트웨어는 상기 이미지를 정량화된 값으로 변환시킬 수 있는 것이고 상기 정량화된 값은 상기 질병 또는 상태의 상기 질환과 연관되는 것인 방법.
  32. 포어를 갖는 기판을 포함하는 진단 디바이스를 제공하는 단계로서, 상기 기판은 응집 구역을 더 포함하는 것인 단계;
    일정 부피의 전혈을 일정 부피의 응집제와 혼합하는 단계;
    상기 혼합물 액적을 상기 응집 구역에 침착시키는 단계;
    상기 액적을 전개시켜 상기 기판 상에서 혈액 얼룩 패턴을 생성시키는 단계; 및
    상기 혈액 얼룩 패턴을 관찰하는 단계
    를 포함하는 질병 또는 상태의 진단 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 기판은 크로마토그래피 종이인 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 기판의 상기 포어는 직경이 2-200 ㎛인 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 응집제는 Hb 용해도 분석 용액인 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 Hb 용해도 분석은 SickleDexTM인 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 시료는 일정 부피의 전혈과 일정 부피의 SickleDexTM이 각각 1:20의 부피비로 혼합되어 있는 것인 진단 디바이스.
  38. 제37항에 있어서, 상기 전개 단계 후 혈액 얼룩 패턴의 이미지를 캡쳐하기 위해 광학 이미지 캡쳐 디바이스를 사용하는 단계, 및 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 상기 이미지를 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 컴퓨터 소프트웨어는 이미지를 정량화된 값으로 변환할 수 있는 것이고 상기 정량된 값은 상기 질병 또는 상태의 상기 진단과 연관되는 것인 방법.
  40. 포어를 갖는 기판으로서, 상기 기판은 응집 구역과 검사 판독 구역을 더 포함하는 것이고; 상기 응집 구역은 응집제에 의해 기능화되는 것인 기판;
    상기 검사 판독 구역의 이미지를 캡쳐할 수 있는 광학 이미지 캡쳐 디바이스; 및
    상기 이미지를 분석할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어
    를 포함하는 질병 또는 상태 진단을 위한 시스템.
  41. 제40항에 있어서, 상기 광학 이미지 캡쳐 디바이스는 휴대용 광학 스캐너인 것인 시스템.
  42. 제40항에 있어서, 상기 광학 이미지 캡쳐 디바이스는 디지털 카메라가 장착된 손에 쥘 수 있는 전자 디바이스인 것인 시스템.
  43. 제40항에 있어서, 상기 포스트웨어는 상기 이미지를 정량화된 값으로 변환할 수 있는 것이고 상기 정량화된 값은 상기 질병 또는 상태의 상기 진단과 연관되는 것인 시스템.
  44. 포어를 갖는 기판으로서, 상기 기판은 응집 구역을 더 포함하는 것인 기판; 및 상기 응집 구역에 침착된 시료로서, 상기 시료는 전혈과 응집제와의 혼합물을 포함하는 것인 시료;
    상기 기판의 이미지를 캡쳐할 수 있는 광학 이미지 캡쳐 디바이스; 및
    상기 이미지를 분석할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어
    를 포함하는 질병 또는 상태 진단을 위한 시스템.
  45. 제44항에 있어서, 상기 광학 이미지 캡쳐 디바이스는 휴대용 광학 스캐너인 것인 시스템.
  46. 제44항에 있어서, 상기 광학 이미지 캡쳐 디바이스는 디지털 카메라가 장착된 휴대전화기인 것인 시스템.
  47. 제44항에 있어서, 상기 소프트웨어는 상기 이미지를 정량화된 값으로 변환시킬 수 있는 것이고 상기 정량화된 값은 상기 질병 또는 상태의 상기 진단과 연관되는 것인 시스템.
  48. 혈액 시료를 수용하기 위한 수단;
    상기 혈액 시료의 적혈구가 상기 수용 수단과 접촉할 때 상기 적혈구를 응집시키기 위한 수단;
    상기 혈액 시료의 혈장을 상기 수용 수단으로부터 상기 혈장 중의 피검물의 존재 여부를 결정하기 위한 수단으로 운반하기 위한 수단
    을 포함하는 질병 또는 상태를 진단하기 위한 디바이스.
  49. 제48항에 있어서, 상기 피검물의 농도를 측정하기 위한 수단을 더 포함하는 것인 디바이스.
  50. 제49항에 있어서, 상기 피검물은 글루코스인 것인 디바이스.
  51. 제48항에 있어서, 상기 측정 수단의 이미지를 캡쳐하기 위한 수단을 더 포함하는 것인 디바이스.
  52. 제51항에 있어서, 상기 이미지를 상기 질병 또는 상태의 상기 진단과 연관시키기 위한 수단을 더 포함하는 것인 디바이스.
  53. 제48항에 있어서, 상기 혈장을 상기 디바이스에 함유시키기 위한 수단을 더 포함하는 것인 디바이스.
  54. 전혈을 응집시키기 위한 수단이 혼합된 전혈을 포함하는 시료를 수용하기 위한 수단; 및
    상기 시료의 Hb의 가용성 형태를 상기 수용 수단으로부터 운반하여 혈액 얼룩 패턴을 생성하기 위한 수단
    을 포함하는, 질병 또는 상태를 진단하기 위한 디바이스.
  55. 제54항에 있어서, 상기 혈액 얼룩 패턴의 이미즐ㄹ 캡쳐하기 위한 수단을 더 포함하는 것인 디바이스.
  56. 제55항에 있어서, 상기 이미지를 상기 질병 또는 상태의 상기 진단과 연관시키기 위한 수단을 더 포함하는 것인 디바이스.
  57. 제56항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 겸상적혈구병인 것인 디바이스.

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