CN111781263B - 基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法。所述电化学免疫传感器以丝网印刷电极为基底电极,包括工作电极、参比电极和对电极,其中工作电极经rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料修饰,同时通过物理吸附和Au‑S键的作用将大量HBsAb固定到修饰电极表面。本发明所制备的电化学免疫传感器具有灵敏度高、特异性强及准确度高等优点,能够在乙型肝炎的早期诊断及临床监测中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及电化学免疫传感器领域,具体涉及一种基于rGO/PB@AuPtNPs纳米材料的电化学免疫传感器的制备方法和在乙肝表面抗原检测方面的应用。
背景技术
乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)是一种乙型肝炎病毒外壳上的特异性包膜蛋白。根据中国疾病预防控制中心的调查报道,我国约有9300万人感染。尽管HBsAg本身并不能直接进行传染,但在乙肝病毒最早出现的时候总能发现HBsAg的存在,因此成为 HBV 感染的主要标志物之一。而在乙肝感染者中,有相当大比例的患者血清中HBsAg的含量远低于医院常用检测仪器的检出限,出现假阴性,进而导致出现漏检的情况,因此只有尽可能早的检测到人体内的HBsAg及其准确数量才能够更有效的对HBV的复制进行抑制,从而抑制可能出现的持续感染。所以,发展一种低检测限、高灵敏度的检测方法是十分必要的。
目前,临床上常用的HBsAg检测方法主要有四种:酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法、荧光分析法和化学发光酶免疫分析法。其中大都需要昂贵的仪器或专业的操作方法等,且存在漏检或错检的情况。而电化学免疫分析方法所需仪器设备更加简易且成本低廉、特异性强,是今后HBsAg检测的一个重要方向。
还原性氧化石墨烯-四乙烯五胺(rGO)是一种新型的通过还原性氧化石墨烯与四乙烯五氨通过共价键方式结合的纳米材料,不仅保留了还原性氧化石墨烯的优良特性也增加了新的性能,具有更好的水溶性且稳定性更好,又因为其表面存在大量氨基,大大增加了对金属离子的吸附能力,因而被广泛应用于电化学免疫传感器的设计构建。
AuPt核壳纳米复合材料,相较于单金属对应物表现出更大的表面积和更好的催化性能,还因为两种金属之间的协同作用而产生新的性质。AuPtNPs不仅具有优异的导电性和生物相容性还具有较高的催化效率加快电极界面的电子传递速率的作用,为捕获抗体的孵化提供了良好的微环境,进一步提高了电化学免疫传感器工作界面的稳定性。
电化学免疫传感器是一种基于生物传感器相关测定原理的、将免疫测定和传感技术进行结合而设计制造的一类新型的电化学传感器,具有灵敏度高、仪器设备简单、操作方便、易于保存等特点,在临床诊断中具有一定的潜力。
发明内容
本发明提供了一种基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法及应用,实现了对乙肝表面抗原的高灵敏检测。
本发明目的之一是提供一种基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法。
本发明目的之二是将所制备的基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器用于乙肝表面抗原的高灵敏、特异性检测。
为了实现上述目的,本发明一种基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器,所述电化学传感器以丝网印刷电极为基底电极,包括工作电极、参比电极和对电极,所述工作电极表面修饰rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料后,固定乙肝抗体,并通过牛血清蛋白对非特异性活性位点进行封闭。
本发明基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)取1.5 μL rGO/PB@AuPtNPs复合溶液滴加到工作电极表面,置于25 ℃恒温孵育箱中进行干燥;
所述rGO/PB@AuPtNPs复合溶液是由rGO/PB溶液与AuPtNPs溶液按照1:2的体积比混合而成;
(2)将5.0 μL HBsAb滴加到上述的修饰电极表面,置于4 ℃冰箱中孵育12 h;
(3)取8 μL、1wt%的BSA滴加到步骤(2)的修饰电极表面,用以消除非特异性活性位点,随后用pH=7.4的0.01 M磷酸盐缓冲液进行清洗并进行干燥,置于4 ℃冰箱中保存,即制得基于rGO/PB纳米复合材料的电化学纳米复合材料的传感器。
所述步骤(1)中rGO/PB@AuPtNPs复合溶液的浓度为2.5 mg/mL。rGO/PB@AuPt NPs溶液是过量的,使用PBS去除未结合的rGO/PB@AuPtNPs。
所述步骤(2)中乙肝抗体HBsAb的浓度为250 μg/mL,乙肝抗体是过量的。
所述步骤(3)中BSA溶液的溶剂为0.1 M PBS,BSA溶液是过量的。
进一步,制备方法所述rGO/PB溶液的制备,步骤如下:
(1)取0.015 mM的K3Fe(CN)6与0.015 mM的FeCl3 与超纯水混合制取混合水溶液,并用HCl将混合溶液的pH调节到1.5,搅拌至混合溶液变为深青色;
(2)取0.025 mM的rGO加入上述所制备的的混合溶液中并搅拌30 min,使其均匀分散;
(3)取上述混合物置于120 ℃微波炉中,加热3 h,随炉冷却至室温后取出,离心洗涤后制得rGO/PB溶液。
进一步,制备方法所述AuPtNPs溶液的制备,步骤如下:
(1)取125 μL 、4 wt%的HAuCl4加入到50mL 超纯水中并缓慢搅拌加热至沸腾;然后,将750 μL、1 wt%的柠檬酸三钠迅速加入到沸腾溶液中,继续加热15 min,直至溶液的颜色从淡黄变为酒红色,待溶液冷却至室温即得AuNPs溶液;
(2)取1.25 mL、1 wt%的H2PtCl6加入到沸腾的AuNPs溶液中,并将1 mL的0.1 M的抗坏血酸逐滴加入,在低速搅拌的条件下持续加热20 min,溶液变成暗黑色后不再继续加热,自然冷却至室温后用超纯水离心洗涤,即制得AuPtNPs溶液。
进一步,制备方法所述rGO/PB@AuPtNPs复合溶液的制备,步骤如下:
将2 mL rGO/PB溶液逐滴加入到4 mL AuPtNPs溶液中,并在室温下避光搅拌24 h,然后将所得混合溶液用超纯水洗涤离心,即制得rGO/PB@AuPtNPs复合溶液。
制备的基于rGO/PB的电化学免疫传感器,应用于乙肝表面抗原的检测,步骤如下:
(1)以丝网印刷电极为基底电极,用电化学工作站在50 μL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行测试;
(2)通过差分脉冲伏安法在电位为-0.5 V~0.5 V的区间内进行检测;
(3)采用不同浓度的乙肝表面抗原进行测定,记录不同浓度抗原所对应的峰值电流变化,从而获得相应的回归方程和相关系数;
(4)利用工作曲线法,得到待测样品中乙肝表面抗原的浓度。
通过借助该传感器绘制的抗原浓度对数与信号探针电流衰减比例之间关系的标准曲线图,该平台可以检测到相对应的乙肝表面抗原浓度。
本发明相较于现有技术具有如下优点:
1. 本发明制备了一种基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器,具有检出限低,线性范围宽,灵敏度高,操作简捷等优势,对于血清中乙肝表面抗原的高灵敏度、高选择性和高稳定性定量检测有一定的临床应用前景;
2. 本发明将rGO/PB@AuPtNPs作为电化学免疫传感器的基底材料,AuPtNPs相较于单金属材料不仅能够更加高效的固定抗体,还能加快传感器敏感界面的电子转移,从而提高电化学免疫传感器的灵敏度。
附图说明
图1为实施例rGO/PB@AuPtNPs复合材料制备流程图;
图中:1 rGO,2 PB,3 AuPtNPs。
图2为实施例电化学免疫传感器制备流程图;
图中:1 rGO,2 PB,3 AuPtNPs 4 SPE,5 HBsAb,6 BSA,7 HBsAg。
图3为实施例对修饰电极进行测试各过程的CV扫描图:
图中:(a) bare SPE, (b) rGO/PB, (c) rGO/PB@AuNPs,(d) rGO/PB@AuPt, (e)rGO/PB@AuPt/HBsAb,(f)rGO/PB@AuPt/HBsAb/BSA,(g) rGO/PB@AuPt/HBsAb/ BSA/HBsAg。
图4为实施例对修饰电极进行测试各过程的EIS扫描图:
图中: (a) bare SPE,(b) rGO/PB,(c)rGO/PB@AuNPs,(d) rGO/PB@AuPt/HBsAb,(e) rGO/PB@AuPt/HBsAb/BSA,(f) rGO/PB@AuPt/HBsAb/ BSA/HBsAg。
图5(a)为实施例制备的电化学免疫传感器检测不同浓度HBsAg的DPV扫描图;(b)HBsAg浓度对数与响应电流之间的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步阐述,实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明。
实施例
基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备,包括如下过程:
1.rGO/PB@AuPtNPs复合材料的制备,如图1-2所示:
(1) rGO/PB溶液的制备
在干燥容器内分别称取0.015 mM的K3Fe(CN)6与0.015 mM的FeCl3 与超纯水混合制取混合水溶液,并通过pH检测仪对混合溶液的pH进行检测,用HCl将混合溶液的pH调节到1.5,随后持续搅拌至混合溶液变为深青色;
取0.025 mM的rGO 1加入上述所制备的混合溶液中,并持续搅拌30 min,使rGO均匀分散;
取上述混合物置于120 ℃微波炉中,持续加热3 h,随炉冷却至室温后取出,离心洗涤后制得rGO1和PB 2的rGO/PB溶液;
(2) AuPtNPs溶液的制备
取125 μL HAuCl4(4 wt%)加入到50 mL 超纯水中,缓慢搅拌加热至沸腾。然后向其中迅速加入750 μL柠檬酸三钠(1 wt%)作为还原剂,持续加热15 min,直至溶液颜色从淡黄变为酒红色,即得AuNPs溶液;
取1.25 mL的H2PtCl6(1 wt%)加入到沸腾的AuNPs水溶液中,并将1 mL 0.1 M的抗坏血酸通过移液枪逐滴加入,在低速搅拌的条件下持续加热20 min,溶液变成暗黑色后不再加热,自然冷却至室温后使用超纯水离心洗涤,即得AuPtNPs 3溶液;
(3) rGO/PB@AuPtNPs复合溶液的制备
取2 mL rGO/PB溶液逐滴加入到4 mL AuPtNPs 3溶液中,并在室温避光匀速搅拌24 h,然后将所得混合溶液用超纯水洗涤离心,即得rGO/PB@AuPtNPs复合材料。
电极的修饰与电化学免疫传感器界面的制备,如图1-2所示:
(1)取1.5 μL rGO/PB@AuPtNPs复合材料水分溶液滴加到工作电极SPE 4表面,置于25 ℃恒温孵育箱中烘干,使用纯净水洗涤;
(2)滴加5.0 μL HBsAb 5溶液至上述的修饰电极表面,置于4 ℃冰箱孵育12 h,取出待恢复至室温后使用pH7.4的0.01 M磷酸盐缓冲液进行清洗以去除未固定的抗体,置于在25 ℃的恒温孵育箱中干燥;
(3)取8 μL的BSA 6(1 wt%)滴加到步骤(2)的修饰电极表面,用以消除未封闭的非特异性活性位点,随后用pH7.4的0.01 M磷酸盐缓冲液清洗并干燥。置于4 ℃冰箱中保存,即制得基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器。
电化学表征
使用循环伏安法(CV)、电化学阻抗法(EIS)对修饰电极进行测试,其中CV在0.01 M磷酸缓冲液中进行,EIS在5 mM Fe(CN)6 3-/4-和0.1 M KCl电解质溶液中进行(见图3、图4)。可以明显看出在裸电极上修饰rGO/PB复合材料之后,出现明显的氧化还原峰,且阻抗明显减小,这是由于PB作为电化学探针为电化学检测提供电信号,rGO具有大比表面积,能够加速电子传递速率。在电极表面修饰AuPtNPs后,其峰值电流进一步增大,阻抗值进一步减小。而在修饰电极表面依次固定HBsAb、BSA和HBsAg后,其峰值电流逐渐下降,阻抗逐渐增大,这是由于HBsAb、BSA、HBsAg被固定到修饰电极表面后,阻碍了电子转移速率。说明了rGO/PB@AuPtNPs修饰电极是成功、有效的。
系列浓度HBsAg的测定
使用所制备的电化学传感器对不同浓度(0.25×10-3, 0.5×10-3, 1×10-3, 5×10-3, 1×10-2, 5×10-2, 0.1, 1, 10, 100, 200, 400和800 ng/ml)的HBsAg进行检测,并使用DPV记录检测结果(见图5中的(a)部分),得到DPV峰电流与HBsAg浓度的对数间呈线性关系(见图5中的(b)部分,)。
实际样本中HBsAg的检测
为评价所制备的电化学免疫传感器在实际应用中的精确度和准确性,将含有不同浓度HBsAg的人血清样品(采集自桂林医学院),通过DPV进行检测。将检测结果与医院所用的电化学发光免疫法所得结果进行比对,如表1所示,相对标准误差在-1.35%~12.6%之间,表明所制备的免疫传感器能够有效地应用于人血清HBsAg的定量检测。
综上所述,一种基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器,通过采用双金属AuPtNPs、普鲁士蓝(PB)和还原氧化石墨烯四乙烯五胺(rGO)修饰的丝网印刷电极构建了一种具有高灵敏度并能进行定量检测的无标记电化学免疫传感器。使用PB作为电子传递介质提供电化学信号,并利用rGO作为PB的载体材料,大大提高了氧化还原信号的稳定性和强度。AuPtNPs的加入进一步增强了电化学信号,并为固定乙肝表面抗体提供有效的活性位点。在最佳条件下,免疫分析显示检测范围为0.25 pg/mL至800 ng/mL,检测限为0.08pg/mL(S/N=3)。此外,在将该方法用于人血清样品的分析中,与电化学发光免疫分析法的结果具有良好的一致性,具有一定的临床应用价值。
本发明中所用原料、设备,若无特别说明,均为本领域的常用原料、设备;本发明中所用方法,若无特别说明,均为本领域的常规方法。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何限制,凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换,均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (2)
1.基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取1.5 μL rGO/PB@AuPtNPs复合溶液滴加到工作电极表面,置于25 ℃恒温孵育箱中进行干燥;
所述rGO/PB@AuPtNPs复合溶液是由rGO/PB溶液与AuPtNPs溶液按照1:2的体积比混合而成;
(2)将5.0 μL HBsAb滴加到上述的修饰电极表面,置于4 ℃冰箱中孵育12 h;
(3)取8 μL、1wt%的BSA滴加到步骤(2)的修饰电极表面,用以消除未封闭的非特异性活性位点,随后用pH=7.4的0.01 M磷酸盐缓冲液进行清洗并进行干燥,置于4 ℃冰箱中保存,即制得基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器;
所述步骤(1)中rGO/PB@AuPtNPs复合溶液的浓度为2.5 mg/mL;
所述步骤(2)中HBsAb的浓度为250 μg/mL;
所述步骤(3)中BSA溶液的溶剂为0.1 M PBS;
所述rGO/PB溶液的制备,步骤如下:
(1)取0.015 mM的K3Fe(CN)6与0.015 mM的FeCl3 与超纯水混合制取混合水溶液,并用HCl将混合溶液的pH调节到1.5,搅拌至混合溶液变为深青色;
(2)取0.025 mM的rGO加入上述所制备的混合溶液中并搅拌30 min,使其均匀分散;
(3)取上述混合物置于120 ℃微波炉中,加热3 h,随炉冷却至室温后取出,离心洗涤后制得rGO/PB溶液;
所述AuPtNPs溶液的制备,步骤如下:
(1)取125 μL 、4 wt%的HAuCl4加入到50 mL 超纯水中并缓慢搅拌加热至沸腾;然后,将750 μL、1 wt%的柠檬酸三钠迅速加入到沸腾溶液中,继续加热15 min,直至溶液的颜色从淡黄色变为酒红色,待溶液冷却至室温即得AuNPs溶液;
(2)取1.25 mL、1 wt%的H2PtCl6加入到沸腾的AuNPs溶液中,并将1 mL的0.1 M的抗坏血酸逐滴加入,在低速搅拌的条件下持续加热20 min,溶液变成暗黑色后不再加热,自然冷却至室温后用超纯水离心洗涤,即制得AuPtNPs溶液;
所述rGO/PB@AuPtNPs复合溶液的制备,步骤如下:
将2 mL rGO/PB溶液逐滴加入到4 mL AuPtNPs溶液中,并在室温下避光搅拌24 h,然后将所得混合溶液用超纯水洗涤离心,即制得rGO/PB@AuPtNPs复合溶液。
2.如权利要求1所述制备方法制备的基于rGO/PB@AuPtNPs纳米复合材料的电化学免疫传感器,应用于乙肝表面抗原的检测,步骤如下:
(1)以丝网印刷电极为基底电极,用电化学工作站在50 μL、pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行测试;
(2)通过差分脉冲伏安法在电位为-0.5 V~0.5 V的区间内进行检测;
(3)采用不同浓度的乙肝表面抗原进行测定,记录不同浓度抗原所对应的峰值电流变化,从而获得相应的回归方程和相关系数;
(4)利用工作曲线法,得到待测样品中乙肝表面抗原的浓度。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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