CN112964763A - 电活性物质修饰mof复合材料的电化学免疫传感器及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及电活性物质修饰MOF复合材料的电化学免疫传感器及其制备与应用，本发明的电化学免疫传感器由Cu2+修饰金属‑有机框架复合材料、[Fe(CN)6]3‑修饰金属‑有机框架复合材料作为多组分同时检测的信号标签；Au/rGO复合材料制得的免疫传感器平台构建而成。本发明的电化学免疫传感器具有线性范围宽、灵敏度高、选择性好、绿色简单等优点，为同时检测临床血清中急性心肌梗死(AMI)的两种生物标志物提供了一种有效的方法，在AMI早期准确诊断方面具有一定的应用潜力，并对其他相关生物标志物的检测具有启发意义。

Description

电活性物质修饰MOF复合材料的电化学免疫传感器及其制备 与应用
技术领域
本发明属于金属有机框架材料和生物传感器技术领域，具体涉及一种电活性物质修饰MOF复合材料的电化学免疫传感器及其制备与应用。
背景技术
心血管疾病(CVD)每年引起的死亡人数占全球死亡人数的三分之一，对人类的健康造成严重威胁。其中，急性心肌梗死(AMI)具有较高的发病率和死亡率，尤其在发病初期死亡风险最高。因此，在AMI早期阶段提供直接和可靠的诊断信息对于及时治疗该疾病至关重要。目前，临床评估、心电图和AMI生物标志物水平监测是AMI的常规诊断方法。其中，AMI标志物的检测是一种经济有效且广泛用于评估心肌功能障碍和心肌梗死严重程度的方法，是AMI患者住院的参考标准。因此，AMI标志物的检测在临床诊断中有着至关重要的作用。心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)是一种细胞质蛋白，在心肌受损时可立即释放，具有很高的特异性，是AMI最早期的标志物。高灵敏C反应蛋白(hs-CRP)对AMI非常敏感，可作为AMI发生的危险评估因素之一。单一AMI标志物缺乏足够的敏感性和特异性，难以满足严格的诊断标准。相反，多个生物标志物的同时检测可以提高检测效率，甚至获得更多有意义或决定性的信息。因此，同时检测h-FABP和hs-CRP可以提高AMI临床诊断的准确性和可靠性。
近年来，国内外报道了各种监测生物标志物的免疫分析技术，比如酶联免疫吸附法(ELISA)、电化学发光法(ECL)、表面等离子体共振法(SPR)、荧光法、电化学法等。相比于其他免疫分析技术需要专业操作和集中的实验室设备，电化学免疫传感器因其分析快速、灵敏度高、操作简单、成本低等优势而备受关注。然而，值得注意的是，多组分标志物同时测定的电化学免疫传感器仍存在一些不足。首先，大部分已报道的电化学方法需要昂贵和复杂的信号分子标记过程，导致多组分电化学生物传感器的发展受限；其次，一些传感器依靠酶辅助反应来放大信号，从而增加分析时间和成本；另外，有些电化学免疫传感器对抗体和信号标签负载量低，不利于信号的形成和放大，导致传感器灵敏度较低。为了克服这些挑战，有必要开发一种具有简化标记程序和高灵敏度的无酶多组分电化学免疫传感器实现对h-FABP和hs-CRP的同时测定。
标记的第二抗体产生可区分的信号对多组分电化学免疫传感器的灵敏度的提高有着重要的作用。因此，寻找一种具有良好生物相容性和负载能力的新型载体用于固定生物分子和电活性材料是十分必要的。令人鼓舞的是，MOF作为一种新型的多孔材料，以其大比表面积、高孔隙率和易修饰的表面特性成为固定生物分子和信号标签的候选材料之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电活性物质修饰MOF复合材料的电化学免疫传感器及其制备与应用，用于人体血清中h-FABP和hs-CRP的同时检测，提高疾病的诊断效率和准确性，可实现AMI早期的诊断。
一种含有电活性物质修饰MOF复合材料信号探针，由Cu2+修饰金属-有机框架复合材料、[Fe(CN)6]3-修饰金属-有机框架复合材料作为信号标签，所述金属-有机框架材料为具有配体或团簇缺失型缺陷的NMOF。
铜离子(Cu2+)和铁氰酸根离子[Fe(CN)6]3-由于拥有独特的氧化还原电位(Cu2+：-0.18V vs.Ag/AgCl，[Fe(CN)6]3-：0.30V vs.Ag/AgCl)，可作为信号标签。UiO-66-NH2(标记为NMOF)因具有优异的稳定性和丰富易修饰的氨基位点，可作为纳米载体，通过与Cu2+的配位作用或与[Fe(CN)6]3-的静电作用来负载电活性材料。本发明的金属-有机框架NMOF不仅具有巨大的表面积，多孔结构，而且含有丰富的氨基官能团和缺陷位点，可以实现电活性物质Cu2+和[Fe(CN)6]3-的大量固载，简化信号探针的制备过程，放大电化学信号；同时Au/rGO不仅可牢固锚定抗体，还具有良好的导电能力，极大的提高了传感器体系的电化学信号，进一步提高了传感器的灵敏度。因此，Cu2+和[Fe(CN)6]3-修饰金属有机框架复合材料可以作为一种理想的信号探针，Au/rGO作为信号放大的传感器平台，用于构建无酶电化学免疫传感器。
一种含有电活性物质修饰MOF复合材料的电化学免疫传感器，由上述含有电活性物质修饰MOF复合材料信号探针和Au/rGO复合材料构建而成。
本发明电化学免疫传感器基于Au纳米颗粒修饰还原石墨烯(Au/rGO)复合材料和功能化氨基MOF的双信号放大的新型无酶夹心型电化学免疫传感器。在无需溶解或预浓缩的情况下，该传感器通过单次检测便可直接得到这两种离子的示差脉冲伏安(DPV)信号，可应用于构建生物传感器和用于h-FABP和hs-CRP的同时检测，优化了总体的检测程序和分析时间。
上述含有电活性物质修饰MOF复合材料信号探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备NMOF材料；
(2)分别制备Cu2+修饰金属-有机框架复合材料、[Fe(CN)6]3-修饰金属-有机框架复合材料；
(3)将Cu2+修饰金属-有机框架复合材料、[Fe(CN)6]3-修饰金属-有机框架复合材料分别分散在含2.5％GA的PBS溶液中(0.05M,pH＝7.0)，轻轻搅拌60min，离心后，即得所需固体；
(4)将步骤(3)的固体分散在含有1.0×10-5M Ab2的PBS溶液中，37℃条件下孵化1h，用PBS冲洗以除去未反应的抗体，得到anti-hs-CRP2-Cu@NMOF和anti-h-FBAP2-Fe@NMOF；
(5)在37℃条件下用质量分数为1wt％BSA溶液封闭步骤(4)所得anti-hs-CRP2-Cu@NMOF和anti-h-FBAP2-Fe@NMOF，封闭60min，取出并水洗，制得免疫传感器的信号探针。
进一步的，所述NMOF材料的制备方法为：将ZrCl4溶解于含有N,N-二甲基甲酰胺和HCl的混合溶液，超声溶解得到混合溶液；再加入含有2-氨基对苯二甲酸的DMF溶液，超声溶解，加热搅拌；冷却至室温后，用DMF和乙醇过滤洗涤多次，真空下干燥。
进一步的，所述Cu2+修饰金属-有机框架复合材料、[Fe(CN)6]3-修饰金属-有机框架复合材料的制备方法为：将NMOF材料分散液中分别加入Cu2+或[Fe(CN)6]3-水溶液，常温搅拌，离心得到沉淀；再用水溶液洗涤直至洗涤液变为无色。
上述电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(S1)制备Au/rGO复合材料；
(S2)制备含有电活性物质修饰MOF复合材料信号探针；
(S3)将玻碳电极表面预处理后，在电极表面修饰Au/rGO复合材料得到已修饰电极；再滴加抗体1(Ab1,指代anti-hs-CRP1和anti-h-FBAP1)的混合溶液，并孵化，用BSA溶液封闭取出水洗，制得免疫传感器平台；
(S4)将不同浓度的目标抗原溶液或血清样本滴涂在步骤(S3)所得免疫传感器平台，37℃反应形成抗原-抗体免疫复合材料，然后用PBS冲洗电极以除去未杂交的抗原；
(S5)再将步骤(S2)所得含有电活性物质修饰MOF复合材料信号探针混合液滴涂到步骤(S4)所得电极表面，在37℃条件下反应，再用PBS洗涤。
进一步的，所述Au/rGO复合材料的制备方法为：将HAuCl4溶液与氧化石墨烯分散液混合，搅拌均匀；再加入抗坏血酸钠，室温下搅拌；转移到反应釜中，升温至100℃加热；反应结束降温后，用水和乙醇多次洗涤离心，保存备用。
上述含有电活性物质修饰MOF复合材料的电化学免疫传感器的应用，用于同时检测两种急性心肌梗死AMI标志物。所述两种AMI标志物为h-FABP和hs-CRP。
与现有技术相比，本发明的电化学免疫传感器具有以下显著的优势：
(1)极大地简化了用于制造多组分电化学免疫传感器的免疫探针标记过程；
(2)与其他作为信标的电活性物质相比，[Fe(CN)6]3-和Cu2+毒性更小，成本更低，且首次被用于搭建多组分电化学免疫传感器；
(3)不需要酶促反应来放大信号；
(4)本发明的电化学免疫传感器实现了人体血清中h-FABP和hs-CRP的同时检测，且具有高灵敏度、令人满意的选择性和稳定性。
总之，本发明的电化学免疫传感器具有线性范围宽、灵敏度高、选择性好、绿色简单等优点，同时检测临床血清中多种AMI的生物标志物提供了一种有效的方法，在AMI早期准确诊断方面具有一定的应用潜力，并对其他相关生物标志物的检测具有启发意义。
附图说明
图1是本发明的Au/rGO纳米复合材料的TEM和PXRD图；其中图1中(a)是GO的TEM图，图1中(b)是Au/rGO的TEM图，图1中(c)是GO，rGO和Au/rGO的PXRD图；
图2是本发明的NMOF的形貌和结构进行表征；其中图2中(a)是NMOF纳米材料的SEM图像；图2中(b)是NMOF纳米材料的N2吸附-脱附等温线，图2中(c)插图是相应的孔径分布图；图2中(c)是NMOF和NMOF-labels的PXRD图；图2中(d)是NMOF和NMOF-labels的FT-IR光谱图；
图3是中(a)是本发明的Cu@NMOF的EDS能谱图；图3中(b)是本发明Fe@NMOF的EDS能谱图；
图4是本发明的NMOF(I)、Cu@NMOF(II)、Fe@NMOF(III)、anti-hs-CRP2-Cu@NMOF(IV)和anti-h-FBAP2-Fe@NMOF(V)的zeta电位图；
图5中(a)是Au/rGO/GCE，rGO/GCE和GCE在5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液种的CV曲线，扫速0.1Vs-1；图5中(b)是Au/rGO/GCE在不同扫速时的CV曲线，a-i分别表示0.01,0.025,0.05,0.075,0.1,0.125,0.15,0.175,0.2V s-1；
图6中(a)是Au/rGO/GCE和Ab1/Au/rGO/GCE的CV曲线；图6中(b)是Ab1与Au/rGO/GCE的孵化时间；图6中(c)是Ab1/Au/rGO/GCE与目标蛋白hs-CRP和h-FBAP的孵化时间；
图7是溶液pH值和孵育时间对本发明的电化学免疫传感器的影响，其中图7中(a)是溶液pH值对本发明的电化学免疫传感器的影响，图7中(b)是孵育时间对本发明的电化学免疫传感器的影响；
图8中(a)是免疫传感器对不同浓度的h-FABP和hs-CRP的DPV响应值，浓度：0.001-100ng mL-1；图8中(b)是h-FABP和hs-CRP的峰电流与浓度的关系；
图9中(a)是本发明的电化学免疫传感器的抗干扰能力；图10中(b)是本发明的电化学免疫传感器的稳定性；图9中(c)和图9中(d)是本发明的电化学免疫传感器的重现性；
图10是免疫传感器的交叉反应特性：图10中(a)是0ng mL-1 hs-CRP和h-FABP；图10中(b)是1.0ng mL-1 hs-CRP；图10中(c)是1.0ng mL-1 h-FABP；图10中(d)是1.0ng mL-1 hs-CRP和h-FABP。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施方案1
1、一种电活性物质修饰MOF复合材料的电化学免疫传感器的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)纳米颗粒/还原石墨烯复合材料(Au/rGO)的合成
氧化石墨烯(GO)是通过Hummers法制备合成：取1.0g天然片状石墨粉，0.5g NaNO3和23.0mL 98％H2SO4在冰浴中反应30min；缓慢加入3.0g KMnO4，温度控制在20℃以下继续反应2h，然后缓慢升温至35℃，恒温30min；缓慢加入46.0mL水，加热至98℃且恒温15min以保证石墨完全氧化。反应结束后，移去热源，在水浴中冷却10min；取140.0mL水稀释反应混合液，再加入3.0mL 30％H2O2，此时混合液为亮黄色。待反应液冷却至室温时，过滤，用水和5％HCl对其多次洗涤、离心。最后，所得的产物在室温下过夜真空干燥。
量取50μL 1％的HAuCl4溶液与25mL 2mg mL-1的GO溶液混合均匀后，加入0.253g抗坏血酸钠，室温下搅拌2h。然后，将混合溶液转移到反应釜中，升温至100℃加热3h。反应结束降温后，所得的固体即为Au/rGO复合材料，用水和乙醇多次洗涤离心后，在4℃环境下保存备用。
(2)NMOF信标(NMOF-labels)及信标探针(Ab2/NMOF-labels)的制备
利用水热法合成NMOF材料：将125mg ZrCl4溶解在含有10mL DMF和1mL HCl的混合溶液中，然后将含有134mg 2-氨基对苯二甲酸的5mL DMF溶液加入到上述混合物中，在80℃条件下加热搅拌过夜。冷却至室温后，用DMF和乙醇过滤洗涤多次后得到米黄色NMOF材料，并在120℃真空下干燥12h。本发明合成的NMOF具有丰富的配体或团簇缺失型缺陷。
信号标签的制备：取10mg NMOF分散在10mL 5mM的CuCl2或K3Fe(CN)6溶液钟，室温下搅拌24h。然后离心清洗数次，得到信号标签NMOF-labels(即Cu@NMOF或Fe@NMOF)。然后将2mg制得的信号标签分散在2mL含2.5％GA的PBS溶液中(0.05M,pH＝7.0)，轻轻搅拌。离心后，将所制备的信标分散泡在含有1.0×10-5M Ab2的PBS溶液中，37℃条件下孵化1h，制得Ab2/NMOF-labels信标探针(即anti-hs-CRP2-Cu@NMOF和anti-h-FBAP2-Fe@NMOF)，然后用PBS冲洗以除去未反应的抗体，再浸泡到1mL的1wt％BSA溶液中来屏蔽非特异性活性位点。反应1h后，用PBS洗涤离心多次，直到离心后上清液在260nm处无紫外吸收。最后将最终的产物分散在PBS溶液中，在4℃环境下保存备用。
(3)免疫传感器的制备
首先，将步骤(1)制备的Au/rGO分散在水中，超声分散得到2mg mL-1的Au/rGO溶液。其次，取5.0μL 2mg mL-1的Au/rGO溶液滴涂到抛光后的GCE上，随后，将5μL含有10μg mL- 1anti-hs-CRP1和anti-h-FBAP1的混合溶液滴涂在电极表面，并在37℃下孵化35min。然后用PBS洗涤后，继续泡在1wt％BSA溶液中孵化1h。将工作电极保存在4℃环境下备用。
接下来，将5.0μL不同浓度的目标抗原(hs-CRP和h-FBAP)溶液或血清样本滴涂在以上的工作电极上，37℃反应40min可形成抗原-抗体免疫复合材料，然后用PBS冲洗电极以除去未杂交的抗原。
再将5μL这两种信标探针混合液(即anti-hs-CRP2-Cu@NMOF和anti-h-FBAP2-Fe@NMOF)滴涂到上述电极表面，在37℃条件下反应1h，形成夹心型式免疫复合物，再用PBS洗涤。最后，将电极浸泡在pH＝5的HAc-NaAc缓冲溶液中，通过DPV在电位区间为-0.6V～+0.6V的条件下对其进行测试。
2、结果及讨论：
(1)多组分电化学免疫传感器的制作原理
Cu2+由于其独特的低氧化还原电位，是制备信号标签的理想材料。此外，[Fe(CN)6]3-是一种常见的氧化还原介质，其电子可在底物和电极界面上快速转移，且成本低，可用于制作信号标签。由于Cu2+和Fe(CN)6]3-之间的电位差异明显，可分别通过NMOF的NH2-与Cu2+的络合作用，以及NMOF的缺陷位点对[Fe(CN)6]3-的静电吸附作用，将这两种离子吸附到NMOF上，作为信标。随后，在GA的存在下，hs-CRP和h-FBAP抗体可以通过酰胺化反应结合到NMOF-labels的表面，从而制备得到信号探针。同时，修饰在电极上的Au/rGO不仅容易通过Au-NH2键将Ab1抗体吸附到其表面，而且具有良好的导电性，可以有效地放大信号。一旦存在目标抗原，利用抗原与抗体之间的高度生物特异性识别作用，便可形成夹心型免疫传感器，并产生Cu2+对应hs-CRP和[Fe(CN)6]3-对应h-FABP的电化学信号。在此过程中，Cu2+可被还原为Cu+，并在-0.18V(vs.Ag/AgCl)附近产生一个阴极峰；[Fe(CN)6]3-在0.30V(vs.Ag/AgCl)附近产生[Fe(CN)6]3-/4-的还原峰电流响应信号。因此，本发明的基于电活性离子修饰MOF的多组分电化学免疫传感器通过DPV上的两种可区分的信号变化实现对两个AMI生物标志物的同时检测。
(2)材料表征
利用TEM和PXRD对Au/rGO纳米复合材料进行表征，图1所示。图1中(b)的TEM图像显示，Au纳米颗粒(AuNPs)的平均尺寸约15nm，均匀附着在不规则褶皱的rGO表面。图1中(c)的PXRD图显示在2θ为11.6°处存在GO的特征衍射峰，而rGO在2θ为25°左右存在(002)晶面的衍射峰；在Au/rGO纳米复合材料，可观察到Au NPs在2θ为38.2°和44.3°对应(111)和(200)晶面的衍射峰，证明了复合材料的成功制备。
通过SEM、N2吸附-脱附等温试验和PXRD对NMOF的形貌和结构进行表征，图2所示。图2中(a)的SEM图像显示，NMOF晶体的形状近似为球形，平均直径在130nm左右。通过计算得到NMOF的BET表面积为974m2 g-1，从孔径分布图图2中(b)可知其孔径为0.6-2.3nm，说明所合成NMOF框架存在缺陷，这些缺陷可以有效提高NMOF的吸附性能。比较NMOF修饰前后的粉末衍射图图2中(c)，可观察到这两种信标离子修饰的NMOF，其衍射峰与纯NMOF保持一致，表明修饰信标离子不会破坏NMOF框架的完整性。图2中(d)为NMOF、Cu@NMOF、Fe@NMOF的FT-IR光谱图，如图所示，NMOF材料在3434cm-1和3370cm-1处存在由N-H的振动引起的吸收光谱。然而Cu2+修饰NMOF后，这两个吸收峰消失，并在580cm-1处出现Cu-N或Cu-O峰。同时，根据C≡N在2051cm-1的光谱特征峰可说明Fe(CN)6 3-吸附在NMOF上。基于这些特征峰的改变可以证明信标离子与NMOF发生作用。
从图3的EDS图可以表明Cu@NMOF和Fe@NMOF除了存在NMOF的Zr、O、C和N元素的特征峰外，还观察到Cu和Fe元素的存在。利用ICP进一步测定NMOF对信标离子的负载量，可知Cu@NMOF复合材料中Cu的含量为8.9％，而Fe@NMOF复合材料中Fe的12.3％。以上结果表明，本发明成功将信标离子固定到NMOF上。此外，通过图4中的zeta电位研究了NMOF的表面修饰。NMOF的Zeta电位为+24.5mV，这与NMOF的氨基(-NH2)质子化有关。当NMOF上修饰Cu2+或[Fe(CN)6]3-后，Cu@NMOF的Zeta电位为+26.9mV，而Fe@NMOF则为+6.6mV。这两个信标通过酰胺键固定Ab2后，其Zeta电位均变成负值。综合以上结果可以证明本发明成功合成了NMOF-labels复合材料和Ab2/NMOF-labels信标探针。
(3)电化学表征
本发明采用循环伏安法(CV)研究了不同修饰电极在含有0.1M KCl的[Fe(CN)6]3-/4-溶液(5mM)中的电化学行为。图5中(a)显示，裸GCE上可观察到来自[Fe(CN)6]3-/4-的一对氧化还原电位。分别利用rGO和Au/rGO对GCE进行修饰后，[Fe(CN)6]3-/4-的氧化还原峰电流依次增大，Au/rGO显示出优良的导电能力。此外，利用Randles-Sevcik方程(公式1)计算了还原rGO和Au/rGO修饰电极的电活性表面积。
Ip＝2.69×105n3/2AD1/2Cv1/2 (1)
其中，Ip是阳极峰电流(A)，n是电子转移的数目，A是电活性面积(cm2)，D和C是分别代表扩散系数(cm2 s-1)和[Fe(CN)6]3-/4-的浓度，而v代表扫描速率(Vs-1)。通过计算，得到Au/rGO/GCE，rGO/GCE和GCE的电活性表面积分别为0.192cm2，0.118cm2和0.041cm2。与裸GCE和rGO/GCE相比，Au/rGO/GCE电活性面积显著提高，说明Au/rGO可以提供更多的活性位点来固定抗体，从而有效地提高响应信号和检测灵敏度。
(4)分析条件的优化
本发明对多组分同时检测的电化学免疫传感器的几个重要参数进行研究。如图6所示，在含有[Fe(CN)6]3-/4-的溶液中，Ab1抗体(anti-hs-CRP1和anti-h-FBAP1)吸附到Au/rGO/GCE表面上可引起系统电流强度的降低，并在35min后稳定，这与蛋白质不良导电性有关，表明Ab1成功吸附到Au/rGO/GCE并在35min后趋于饱和。此外，hs-CRP或h-FBAP抗原与Ab1/Au/rGO/GCE的最佳孵化时间均为40min。
溶液的pH值对蛋白质的活性和电化学反应有很大影响。如图7中(a)所示，hs-CRP和h-FABP的电流响应随着溶液中pH值的增大而增大，在pH＝5.0时达到最大值后逐渐减小。这主要是因为在较低的pH值时，NMOF上的-NH2会发生质子化，以及在较高的pH值下，Cu2+会发生水解都不利于NMOF负载Cu2+。此外，NMOF上的缺陷末端的单羧酸在较高的pH值下可能会发生脱质子，使得NMOF与[Fe(CN)6]3-的静电作用减弱。基于两种电化学信号标签的敏感性和蛋白质的活性，选择pH＝5.0为最佳反应pH用于后续的实验研究。
Ab2/NMOF-labels(anti-hs-CRP2-Cu@NMOF和anti-h-FBAP2-Fe@NMOF)固定到工作电极的孵化时间，从图7中(b)可知电流响应信号随着孵化时间的增加而增强，其稳定时间对于hs-CRP是40min，而h-FBAP是50min。为了确保孵化的完全，最大限度地生成这两种分析物的夹芯型免疫复合物，选择50min作为最佳的孵育时间。
(5)传感器的性能评价
在上述优化条件下，将本发明的电化学免疫传感器应用于混合溶液中不同浓度hs-CRP和h-FABP的同时检测。利用DPV分别记录Cu2+和[Fe(CN)6]3-在-0.18V和0.30V的还原峰电流响应值I。从图8可以看出，随着hs-CRP和h-FABP浓度的增加，Cu2+和[Fe(CN)6]3-的I值均逐渐增大，且在0.001-100ng mL-1的浓度范围内与目标抗原浓度的对数值呈现出良好的线性关系，其中hs-CRP的检出限(LD)为0.15pg mL-1(S/N＝3)，h-FABP的LD为0.59pg mL-1(S/N＝3)。本发明电化学免疫传感器具有较宽的线性范围和低的LD，为提高早期诊断AMI的灵敏度表现出极大的应用。为考察所制备的免疫传感器的选择性，将h-FABP和hs-CRP分别与临床血清中可能产生干扰的物质，如人体白蛋白(HSA)、抗坏血酸(AA)、尿酸(UA)、葡萄糖(GL)、赖氨酸(Gys)、精氨酸(Arg)等混合，用以考察传感器的特异性。结果如图9中(a)所示，干扰物质的存在对h-FABP和hs-CRP的检测影响可忽略不计，这归因于抗体和抗原的特异性识别，使得该传感器对h-FABP和hs-CRP具有良好的特异性。同时，将该免疫传感器保存于4℃环境下，每3天记录一次该传感器在HAc-NAc(pH＝5.0)缓冲溶液中的响应电流值来考察其稳定性。从图9中(b)可知，h-FABP和hs-CRP的I值随着时间缓慢下降，但在1个月后仍能保持其初始值的95.5％和96.3％，表明该生物传感器具有良好的稳定性。将8支修饰好的电极，在相同条件下平行检测h-FABP和hs-CRP，结果如图9中(c)和9中(d)所示，h-FABP和hs-CRP的相对标准偏差(RSD)分别为2.1％和2.9％，表明该免疫传感器具有良好的重现性。
(6)交叉反应评估
电化学免疫传感器的多组分同时检测应排除分析物之间的交叉干扰。因此，本发明利用该免疫传感器检测只含有hs-CRP(或h-FBAP)单种抗原或二者的混合物，以评估其抗干扰能力。从图10可知，孵育液中含有一种或两种分析物时DPV的电流响应值差异较小。无分析物时，系统中无明显电流信号，说明该夹芯型免疫传感器几乎没有发生非特异性反应。然而，当溶液中仅含有hs-CRP时，免疫传感器在-0.18V出现Cu2+的还原峰。同样，溶液中仅含有h-FABP时，仅在0.30V出现[Fe(CN)6]3-的还原峰。而hs-CRP和h-FABP同时存在时，在-0.18V和0.30V可同时获得Cu2+和[Fe(CN)6]3-的电流信号，且信号之间可区分不相互干扰。综上所述，该传感器对h-FABP和hs-CRP的检测不存在相互干扰，两种分析物之间的交叉反应可以忽略不计。
(7)实际样品分析
为了进一步评估该免疫传感器在临床检测中的应用潜力，将本发明的电化学免疫传感器与商业ELISA法对临床血清样品中的hs-CRP和h-FABP进行检测，并将测定结果进行比较。从表1可知，本发明的电化学免疫传感器hs-CRP的RSD为1.3-2.3％，h-FABP的RSD为1.6-2.5％，结果与ELISA相近，表明本发明的电化学免疫传感器在同时检测hs-CRP和h-FABP的临床分析中具有广阔的应用潜力。
表1该免疫传感器与ELISA检测临床血清标本的结果比较
Figure BDA0002926493520000111
综上，本发明以Cu2+和[Fe(CN)6]3-修饰的NMOF作为可识别的信号标签，Au/rGO作为信号放大的传感器平台，开发了一种新型的可同时检测AMI生物标志物的多组分电化学免疫传感器。本发明的电化学免疫传感器的LD低，检测线性范围宽，与ELISA结果相符，是同时定量检测hs-CRP和h-FABP的良好信号转换平台。与其他免疫传感器相比，本发明的电化学免疫传感器具有绿色、简单、稳定、灵敏等优点，在AMI的早期临床诊断中具有潜在的应用价值，并对其他相关生物标志物的检测具有启发意义。

Claims (9)

1.一种含有电活性物质修饰MOF复合材料信号探针，其特征在于，由Cu2+修饰金属-有机框架复合材料、[Fe(CN)6]3-修饰金属-有机框架复合材料作为多组分同时检测的信号标签，所述金属-有机框架材料为具有配体或团簇缺失型缺陷的NMOF。
2.一种含有电活性物质修饰MOF复合材料的电化学免疫传感器，其特征在于，由权利要求1所述含有电活性物质修饰MOF复合材料信号探针和Au/rGO复合材料构建而成。
3.根据权利要求1所述含有电活性物质修饰MOF复合材料信号探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备NMOF材料；
(2)分别制备Cu2+修饰金属-有机框架复合材料、[Fe(CN)6]3-修饰金属-有机框架复合材料；
(3)将Cu2+修饰金属-有机框架复合材料、[Fe(CN)6]3-修饰金属-有机框架复合材料分别分散在含戊二醛的PBS缓存溶液中，搅拌、离心后，即得所需固体；
(4)将步骤(3)的固体分散在含有anti-hs-CRP2和anti-h-FBAP2的PBS缓存溶液中孵化，用PBS缓存溶液冲洗以除去未反应的抗体；
(5)用BSA溶液封闭，取出水洗。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述NMOF材料的制备方法为：将ZrCl4溶解于含有DMF和盐酸的混合溶液，超声溶解得到混合溶液；再加入含有2-氨基对苯二甲酸的DMF溶液，超声溶解，加热搅拌；冷却至室温后，用DMF和乙醇过滤洗涤多次，真空下干燥。
5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述Cu2+修饰金属-有机框架材料复合材料、[Fe(CN)6]3-修饰金属-有机框架材料复合材料的制备方法为：将NMOF材料分散液中分别加入Cu2+或[Fe(CN)6]3-水溶液，常温搅拌，离心得到沉淀；再用水溶液洗涤直至洗涤液变为无色。
6.根据权利要求2所述电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(S1)制备Au/rGO复合材料；
(S2)制备含有电活性物质修饰MOF复合材料信号探针；
(S3)将玻碳电极表面预处理后，在电极表面修饰Au/rGO复合材料得到已修饰电极；再滴加anti-hs-CRP1和anti-h-FBAP1的混合溶液，并孵化，用BSA溶液封闭取出水洗，制得免疫传感器平台；
(S4)将不同浓度的目标抗原溶液或血清样本滴涂在步骤(S3)所得免疫传感器平台，37℃反应形成抗原-抗体免疫复合材料，然后用PBS冲洗电极以除去未杂交的抗原；
(S5)再将步骤(S2)所得含有电活性物质修饰MOF复合材料信号探针混合液滴涂到步骤(S4)所得电极表面，在37℃条件下反应，再用PBS洗涤。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述Au/rGO复合材料的制备方法为：将HAuCl4溶液与氧化石墨烯分散液混合，搅拌均匀；再加入抗坏血酸钠，室温下搅拌；转移到反应釜中，升温至100℃加热；反应结束降温后，用水和乙醇多次洗涤离心，保存备用。
8.根据权利要求2所述含有电活性物质修饰MOF复合材料的电化学免疫传感器的应用，其特征在于，用于同时检测两种AMI标志物。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述两种AMI标志物为心型脂肪酸结合蛋白和高灵敏C-反应蛋白。
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