KR20140066525A - 안지오포이에틴-4 단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Angiopoietin-4 단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Angiopoietin-4 단백질은, 내피세포 특이적인 단백질의 수준을 증가시켜 음경 혈관 내피세포의 재생을 유도하여 음경해면체의 내압을 증가시킴으로써, 우수한 발기부전 개선 효과가 있어, 발기부전의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

안지오포이에틴-4 단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating erectile dysfunction comprising Angiopoietin-4 protein}

본 발명은 안지오포이에틴-4(Angiopoietin-4)단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

발기부전은 남성 성기능 장애의 일종으로서, 남성의 성기가 발기되지 않거나 발기 상태가 지속되지 않아 성행위를 할 수 없는 현상이다. 발기부전의 원인은 크게 심인성 원인과 기질성 원인으로 구별된다. 심인성 발기부전은 심리적, 정신적 영향에 의한 교감신경의 과다한 작용으로 인한 노르아드레날린(noradrenaline)의 과도한 분비, 음경해면체 평활근 긴장도 증가, 신경 전달물질의 분비 억제 등에 기인한다. 또한, 기질성 발기 부전은 그 원인에 따라, 신경인성, 혈관성, 및 내분비성 발기부전으로 분류된다.

상기 혈관성 발기부전은 고지질혈증, 당뇨, 고혈압, 흡연, 전신 심혈관질환 등으로 인해서 음경 혈관내피세포가 손상되어 혈관내피세포에서 일산화질소 (nitric oxide: NO) 등의 이완성 물질의 분비가 원활하지 않아 생기는 장애이다.

최근 연구는 기질성 원인에 더 비중을 두고 있고, 그의 치료로서 주로 비아그라(viagra, 성분명: 실데나필)를 포함한 경구용 PDE-5(phosphodiesterase-5) 저해제가 전세계적으로 사용되고 있다. 이러한 경구용 약물은 음경해면체에 특이적으로 분포하는 PDE-5의 저해에 의한 cGMP의 농도를 증가시킴으로써 음경해면체 내 혈류를 증대시켜 발기를 유도하여 발기부전의 치료효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 두통, 안면홍조, 소화불량, 및 심장마비 등 여러 가지 부작용이 보고되고 있을 뿐만 아니라, 비아그라와 같은 PDE-5 저해제 계열의 약물들은 분자적 수준에서 일시적인 단백질 발현 및 관련 인자들을 조절하는 것으로 근본적인 치료라 할 수 없다. 더욱이 당뇨에 의한 발기부전의 경우, 이와 같은 치료제의 효과가 잘 나타나지 않을 뿐만 아니라, 설령 효과가 있다 해도 그 효능이 장기간 지속되지 못한다는 단점이 있다.

따라서, 발기부전 음경 내의 비정상화된 혈관 구조를 근본적으로 치료하고, 그 효능도 장시간 지속되는 발기부전 치료제의 필요성이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 안지오포이에틴-4(Angiopoietin-4)는 Angiopoietin 패밀리 중 하나로, 구조적으로 비슷한 coiled-coil 도메인(domain)과 피브리노겐-유사(fibrinogen-like) 도메인을 가지고 있다. Angiopoietin-4는 마우스 Angiopoietin-3의 상동성(orthologs)으로써, 아미노산 배열이 65%에서 일치한다(Valenzuela DM et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 96(5), pp1904-9, 1999). 다른 Angiopoietin과 마찬가지로 Angiopoietin-4 는 Tie-2 수용체 티로신 키나아제에 주로 결합하는 것으로 알려져 있으며, Angiopoietin-1과 같이 Tie-2 수용체를 인산화시켜 신호를 전달한다고 보고되고 있다(Lee HJ et al., FASEB J, 18(11), pp1200-8, 2004). 또한, Angiopoietin-4가 마우스 각막에서 Tie-2 수용체를 활성화시킴으로써 혈관신생을 유도한다는 보고가 있다(Lee HJ et al., FASEB J, 18(11), pp1200-8, 2004). 그러나, 현재까지 Angiopoietin-4의 발기부전의 예방 또는 치료에 대한 기술내용이 교시되거나 기재된 바 없으며, 이에 대한 연구도 전무한 상태이다.

이에 본 발명자들은 발기부전 예방 또는 치료용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, Angiopoietin-4 단백질이 내피세포 특이적인 단백질의 수준을 증가시켜 음경 혈관 내피세포의 재생을 유도하여 음경해면체의 내압을 증가시킴으로써 발기부전 개선 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Angiopoietin-4 단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Angiopoietin-4 단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Angiopoietin-4 단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 Angiopoietin-4 단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 Angiopoietin-4 단백질은, 내피세포 특이적인 단백질의 수준을 증가시켜 음경 혈관 내피세포의 재생을 유도하여 음경해면체의 내압을 증가시킴으로써, 우수한 발기부전 개선 효과가 있어, 발기부전의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 HUVEC 및 음경 섬유모세포에서의 Angiopoietin-4의 발현 정도를 면역침강 웨스턴블롯으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 음경 혈관내피세포에서의 angiopoietin-4의 발현 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 당뇨 마우스 모델의 음경에서의 angiopoietin-4의 발현 정도를 cDNA 마이크로어레이(microarray)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 당뇨 마우스 모델의 음경에서의 angiopoietin-4의 발현 정도를 웨스턴블롯으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 당뇨 마우스 모델에서 angiopoietin-4 단백질 투여에 의한 음경신경 전기자극에 따른 음경해면체 내압(발기력) 측정 결과를 나타낸 도이다.(C:Control, P:PBS, AS:Ang-4 Single, AR:Ang-4 Repeat)
도 6은 당뇨 마우스 모델의 음경해면체 조직에서 angiopoietin-4 단백질 투여에 의한 혈관내피세포 특이적 단백질인 PECAM-1의 발현 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.(C:Control, P:PBS, AS:Ang-4 Single, AR:Ang-4 Repeat)
도 7은 당뇨 마우스 모델의 음경해면체 조직에서 angiopoietin-4 단백질 투여에 의한 혈관내피세포 특이적 단백질인 PECAM-1 및 p-eNOS의 발현 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.(C:Control, P:PBS, AS:Ang-4 Single, AR:Ang-4 Repeat)
도 8은 당뇨 마우스 모델의 혈관내피세포에서 angiopoietin-4 단백질 투여에 의한 superoxide anion(과산화물 음이온)의 발현 정도를 히드로에티딘(hydroethidine)으로 형광염색하여 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.(C:Control, P:PBS, AS:Ang-4 Single, AR:Ang-4 Repeat)
도 9는 제대정맥내피세포에서 angiopoietin-4 단백질 투여에 의한 Tie-2, Akt 및 eNOS의 인산화 양상을 웨스턴블롯으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 안지오포이에틴-4(Angiopoietin-4) 단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물에서 유효성분인 Angiopoietin-4 단백질은 angiopoietin-4 단백질 전체뿐만 아니라 그의 생리학적 활성 단편을 포함한다. 상기 단편은 angiopoietin-4 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자의 혈관내피세포 재생 활성을 실질적으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 단편은 천연 angiopoietin-4의 혈관내피세포 활성에 관여하는 활성 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 상기 angiopoietin-4 단백질은 angiopoietin-4 전장 단백질 또는 그의 생리학적 활성 단편 자체뿐만 아니라 그의 융합 단백질을 포함한다. 상기 융합 단백질은 angiopoietin-4 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자의 혈관내피세포 재생 활성을 실질적으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 융합 단백질은 angiopoietin-4 단백질 또는 그 단편이 angiopoietin-4 단백질 또는 그 단편의 분리에 유용한 융합 파트너, 표적부위로의 전달에 유용한 융합 파트너, 체내 안정성을 증가시키기 위한 융합 파트너 등에 연결된 것일 수 있다. 상기 연결은 angiopoietin-4 단백질 또는 그 단편의 N 말단 또는 C 말단 또는 측쇄를 통하여 연결된 것일 수 있다. 상기 연결은 공유 또는 비공유 결합에 의하여 이루어진 것일 수 있다. 상기 융합 파트너는 폴리펩티드를 포함하는 것일 수 있다. 분리에 유용한 융합 파트너는 His 서열, 예를 들면, His₆ 서열일 수 있다. 표적부위로의 전달에 유용한 융합 파트너, 또는 체내 안정성을 증가시키기 위한 융합 파트너는 항체 불변 영역, 예를 들면, Fc 영역 또는 PEG와 같은 체내 분해에 저항을 부여하는 중합체일 수 있다.

상기 angiopoietin-4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체뿐만 아니라, 다른 물질과 융합된 형태의 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 다른 물질은 상기 angiopoietin-4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 전달될 수 있도록 하는 것, 세포 내에서 세포 내의 유전자 발현기구에 의하여 발현될 수 있도록 하는 것, 및 세포 내외에서 안정하게 유지되도록 하는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 융합은 공유 또는 비공유 결합에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 융합은 소포 중에 포집되는 형태를 포함한다.

상기 angiopoietin-4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서 및/또는 전사종결인자와 같은 유전자 발현 조절인자와 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 angiopoietin-4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 삽입되어 세포 내에서 발현될 수 있도록 된 것일 수 있다. 상기 angiopoietin-4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 음경의 내피세포, 예를 들면, 해면체 내피세포 또는 음경 혈관내피세포에 특이적으로 발현되도록 하는 조절인자와 연결된 구조체일 수 있다. 상기 angiopoietin-4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 아데노바이러스 게놈에 삽입되어 해면체 내피세포 또는 음경 혈관 내피세포에 특이적으로 발현되도록 하는 조절인자와 연결된 구조체의 형태일 수 있다. 상기 구조체는 바이러스 입자에 포집되어 있는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 Angiopoietin-4 단백질은 당뇨성 발기부전 동물모델에 있어서, 음경 해면체 내피세포 또는 음경 혈관내피세포의 재생을 유도하고, 내피세포에서 혈관내피세포 특이적인 단백질인 PECAM-1(platelet/endothelial cell adhesion molecule-1) 및 p-eNOS의 발현을 증가시킴으로써 음경해면체 내압을 상승시켜 발기력을 개선시키는 우수한 효과가 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 Angiopoietin-4 단백질은 발기부전에 대한 치료 효과가 우수하므로, 발기부전의 예방 또는 치료에 유용한 의약품 또는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

상기 발기부전은 음경내피세포의 기능 저하 또는 손상에 의하여 야기될 수 있다. 이러한 음경내피세포의 기능 저하 또는 손상은 고지질혈증(고콜레스테롤증 발기부전 포함), 당뇨병, 고혈압, 음경신경손상 및 이들의 조합으로부터 선택된 것으로부터 야기될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 Angiopoietin-4 단백질과 함께 발기부전의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 또한, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 mg/ kg 내지 10000 mg/kg의 양으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 음경 해면체 내(intracavernous) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 발기부전의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에서, '건강기능식품'이란 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.

본 발명의 Angiopoietin-4 단백질은 발기부전의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 Angiopoietin-4 단백질을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 Angiopoietin-4 단백질을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 Angiopoietin-4 단백질은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제조예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Angiopoietin-4의 발현 양상

1-1. HUVEC 및 음경 섬유모세포에서의 Angiopoietin-4의 발현

인간유래의 혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) 및 음경 섬유모세포에서의 Angiopoietin-4의 발현을 확인하기 위해서, 인간의 제대정맥내피세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 및 음경 섬유모세포에 대해 면역침강법(immunoprecipitation)을 수행하여, 각 세포 내 angiopoietin-4 발현 양상을 조사하였다.

구체적으로는, HUVECs 및 음경으로부터 분리하여 일차 배양한 섬유모세포를 대상으로 하였다. HUVECs는 0.2% 젤라틴 코팅된 세포 배양 접시에서 영양분, 성장인자, 항생제를 첨가한 M-199 배지로 배양하였고, 섬유모세포는 영양분, 항생제를 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 배지로 각각 배양하였다. 각각의 세포는 37 ^oC, 5% CO₂ 조건의 습기 있는 배양기에서 배양하였다.

배양된 HUVECs 및 음경 섬유모세포에 대해 면역침강법을 수행하였다. 면역침강법에 대한 실험 방법은 다음과 같다.

HUVECs과 음경 섬유모세포를 각각 100mm 배양접시에서 가득 차게 배양하였다. 인산완충용액(PBS)으로 세 번 깨끗이 세척한 후, 세포 분해 완충액(RIPA buffer)으로 용해시킨 후 세포 내 단백질을 추출하였다. 각각의 세포에서 나온 단백질을 정량하여 동일량(500mg)을 만든 후, angiopoietin-4 항체를 1mg씩 넣고 8시간 동안 반응시켰다. IgG 대조군은 추출한 단백질 500mg에 항-IgG 항체를 넣어 위의 비교군과 동일하게 반응시킨다. 이후 각 실험군에 단백질 G 아가로오스 비드(protein G agarose beads)를 50mL씩 넣고, 4℃에서 밤새도록(overnight) 반응시켰다. 반응시킨 물질을 13,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버린 후 인산완충용액으로 세척하는 과정을 세 번 반복하고, 마지막으로 상층액을 제거하고 SDS loading dye를 넣은 뒤 100℃에서 가열하여 비드와 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질이 있는 상층액을 이용하여 웨스턴블롯을 수행하였다. 웨스턴블롯 분석은 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 전기영동시켰으며, 니트로셀롤로오스 막(nitrocellulose membranes)에 전기영동 된 단백질을 이동시켜 항-angiopoietin-4 항체를 이용하여 angiopoietin-4의 발현 정도를 관찰하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, HUVECs 및 음경 섬유모세포의 면역침강 웨스턴블롯의 결과, angiopoietin-4가 혈관내피세포인 HUVECs에서 섬유모세포에 비해 더 많이 발현됨을 확인할 수 있었다.

1-2. 음경 혈관내피세포에서의 angiopoietin-4의 발현

음경 혈관내피세포에서 angiopoietin-4의 발현 양상을 확인하기 위해서, 정상 마우스의 음경해면체 조직에서 혈소판-내피세포 부착 분자-1(platelet/endothelial cell adhesion molucule-1, PECAM-1) 및 angiopoietin-4에 대한 면역조직화학염색을 수행하여 공초점 현미경 분석을 수행하였다.

구체적으로는, 음경조직을 4℃에서 4% 파라포름알데히드에서 24 시간 동안 고정한 후 동결 절편기에서 7㎛ 두께로 잘라서 음경조직 절편을 준비하였다. 다음으로, 준비된 음경조직 절편을 슬라이드에 올리고, 슬라이드 위의 조직을 4% 파라포름알데히드에서 약 5분간 고정시켰다. 고정된 음경조직 절편들을 세척 완충액(2% FBS + 0.1% Sodium Azide in PBS)에 3회 세척한 후에 비특이적 단백질 차단 완충액(5% BSA in PBS)으로 1시간 차단(blocking) 하였다. 첫 번째 항체(항-PECAM-1 햄스터 항체, 항-angiopoietin-4 고트 항체)를 1:100 비율로 4℃에서 밤새도록 반응시킨 후 남아 있는 항체를 제거하기 위해서 세척 완충액으로 다시 3회 세척한 다음, PECAM-1 및 angiopoietin-4에 특이적으로 반응한 항체를 형광으로 확인할 수 있도록 제작된 두 번째 항체(FITC-표지된 항-햄스터 항체 또는 TRITC-표지된 항-고트 항체)를 1:1000 비율로 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 남아있는 항체를 제거하기 위해 세척 완충액으로 다시 3회 세척한 후에 형광현미경이나 형광물질을 확인할 수 있는 공초점 현미경으로 발현 정도를 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 공초점 현미경 관찰 결과, 정상 음경조직에서 Angiopoietin-4는 주로 혈관내피세포에서 발현이 되었고, 특히 음경 해면체 동맥에서의 발현이 뚜렷하게 관찰되었다.

1-3. 당뇨 마우스 모델의 음경에서의 angiopoietin-4의 발현

당뇨 모델 마우스의 음경에서의 angiopoietin-4의 발현 정도를 비교하기 위해서, 마우스에 당뇨를 유도한 후 8주째 된 당뇨 마우스의 음경조직에서 정상 마우스와의 angiopoietin-4 유전자 및 단백질 발현 차이를 cDNA microarray와 웨스턴블롯을 통해 관찰하였다.

구체적으로는, 당뇨 마우스 모델을 구축하기 위해 생후 2개월 된 수컷 마우스(C57BL/6J)를 대상으로 하였고, 스트렙토조토신을 50 mg/kg 농도로 5일 연속으로 마우스의 복강 내에 투여함으로써 당뇨를 유도하였다. 당뇨 유도 8주 후, 혈당 및 체중을 확인하여 당뇨 여부를 확인하였고, 음경조직을 얻어 각각의 실험을 진행하였다. 당뇨 마우스의 음경에서 angiopoietin-4의 발현을 정상 마우스와 비교하기 위해 cDNA microarray와 웨스턴블롯을 시행하였다.

1-3-1. cDNA microarray

cDNA microarray는 음경조직에서 요도 및 배부 혈관신경분절을 제거한 후, 음경해면체조직에서 수행하였다. 조직을 분쇄하고 트리졸을 처리하여 RNA를 추출한 후, cDNA microarray 분석을 하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, cDNA microarray 분석 결과, 정상 마우스와 비교시 당뇨 마우스의 음경에서 angiopoietin-4의 유전자 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다.

1-3-2. 웨스턴블롯

cDNA microarray는 음경조직에서 요도 및 배부 혈관신경분절을 제거한 후, 정상 마우스와 당뇨 마우스의 음경해면체조직을 얻어 실시예 1-2에서와 동일한 방법으로 웨스턴블롯을 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, cDNA microarray 결과와 마찬가지로 당뇨 마우스의 음경에서 정상 마우스에 비해 angiopoietin-4의 단백질 발현이 감소하였음을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 당뇨성 발기부전 마우스 모델에서의 angiopoietin-4 단백질의 발기부전 치료 효과

당뇨성 발기부전 마우스 모델에서의 angiopoietin-4 단백질의 발기부전 치료 효과를 확인하기 위해서, 생후 2개월 된 수컷 마우스(C57BL/6J)를 대상으로 하였고, 총 4 개의 군으로 나누어 실험을 진행하였다(N = 10/군; 1군, 정상 마우스; 2군, 당뇨 마우스 + PBS [20㎕] 투여군; 3군, 당뇨 마우스 + angiopoietin-4 단백질을 1번 주사 [day 0; 5.8㎍/20㎕]; 4군, 당뇨 마우스 + + angiopoietin-4 단백질을 2번 주사 [day -3, 0; 5.8㎍/20㎕]).

2-1. 전기 자극에 따른 발기력 분석

당뇨성 발기부전 마우스 모델에 Angiopoietin-4 단백질을 음경해면체 내에 주사 후 1주째에 음경해면체의 신경을 자극하여 발기력을 측정하였다.

발기력 측정에 관한 실험 방법은, 준비된 마우스의 하복부에서 좌측 표피부분을 개복하고, 전립선의 후외측에 위치한 음경해면체신경(음경신경)이 잘 보이도록 준비하였다. 음경신경의 전기자극을 위해서 백금전극을 음경신경에 위치시킨 후, 1 내지 5 볼트 12 헤르츠 강도로 약 1분 동안 전기자극을 가하여 음경을 발기시켰다. 이때 음경해면체에 삽입된 카테터를 통해서 발기시 음경내부의 압력(음경해면체 내압)에 대한 데이터 수집을 위하여 컴퓨터와 연결되어 있는 압력 전달기 (바이오스팩 시스템, 미국)를 통해서 측정하였고, 측정된 압력 수치는 음경 발기력을 의미한다.

당뇨 마우스 모델에서 angiopoietin-4 단백질 투여군과 대조군에서 음경신경 전기자극에 따른 음경해면체 내압(발기력) 측정 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5A는 angiopoietin-4 단백질을 음경해면체 내에 한번 또는 두번 주사 후 1주째에 음경해면체에 1V 또는 5V로 신경자극 후 발기력을 측정한 결과이다. 도 5A에서의 세로축의 ICP(Intracavernous Pressure: 음경해면체내 압력)는 발기시 음경내부의 압력(음경해면체 내압)을 의미하며, 일반적으로 발기력을 나타내는 지표이다. 도 5A에서의 가로축은 전기자극 후의 시간을 나타내며, 1분간의 전기자극 기간은 가로축에 검정색 막대로 표시하였다.

또한, 도 5B는 발기력을 표현한 것으로, 최고 음경해면체 내압(Maximal ICP)을 평균 수축기 혈압(MSBP)으로 나눈 값을 나타내고, 도 5C 또한 발기력을 나태낸 것으로, 음경해면체 내압 곡선의 면적(Total ICP[area under the curve])을 평균 수축기 혈압(MSBP)으로 나눈 값을 나타낸 것이다. 이는 혈압자체가 음경해면체내압에 영향을 줄 수 있기 때문이다.

도 5에 나타낸 바와 같이, angiopoietin-4 단백질을 두 번 투여한 군(Ang-4 Repeat)에서 PBS 투여군(PBS)에 비해서 가장 높은 발기력 개선효과를 보였으며, 정상 대조군의 약 87% 정도까지 발기력이 회복됨을 확인할 수 있었다. 음경발기에 대한 두 가지 변수, 즉 최고 음경해면체 내압과 음경압력곡선의 면적이 angiopoietin-4 단백질 투여 후 현저한 상승 효과를 확인할 수 있었다.

2-2. 음경 혈관내피세포에서의 혈관내피세포 특이적 단백질인 PECAM-1 및 p-eNOS의 발현

음경은 일종의 특수한 혈관조직으로 정상적인 음경 발기를 위해서는 음경혈관의 정상적인 활동이 필수적이며, 특히 음경 혈관내피세포에서 생성되는 내피성 산화질소 생성효소(endothelial nitric oxide synthase: eNOS)는 음경혈관의 이완 및 이로 인한 음경 발기에 중요한 역할을 하는 일산화질소(NO)를 생성하는 주된 효소이다.

음경 혈관의 비정상적인 구조나 활동력은 발기력을 감소시키는 원인이 되기 때문에, 정상 마우스에 스트렙토조토신을 투여해서 당뇨를 유도한 후 음경 발기조직 내 혈관의 구조적 변화를 관찰하고자, 당뇨성 발기부전 마우스 모델의 음경해면체 조직에서 혈소판-내피세포 부착 분자-1(platelet/endothelial cell adhesion molucule-1, PECAM-1)의 발현 및 인산화된 내피성산화질소생성효소(phosphorylated endothelial nitric oxide synthase, p-eNOS)의 활성화 정도 즉, 인산화(phosphorylation) 정도에 대한 면역조직화학염색 후 공초점 현미경 분석을 수행하였으며, 혈관내피세포의 양적 변화 및 eNOS 활성화를 조사하였다.

음경해면체 조직을 4℃에서 4% 파라포름알데히드에서 24 시간 동안 고정한 후 동결 절편기에서 7㎛ 두께로 잘라 조직 절편을 준비하였다. 준비된 음경해면체 조직 절편을 슬라이드 상에 올리고, PECAM-1 및 p-eNOS 발현 분석을 위해 준비된 슬라이드 상의 조직을 4% 파라포름알데히드에서 약 5분간 고정시켰다. 고정된 음경조직 절편들을 세척 완충액(2% FBS + 0.1% Sodium Azide in PBS)으로 3회 세척한 후에 비특이적 단백질 차단 완충액(5% BSA in PBS)으로 1시간 차단하였다. 첫 번째 항체(항-PECAM-1 햄스터 항체, 항-p-eNOS 고트 항체)를 1:100 비율로 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 남아 있는 항체를 제거하기 위해서 세척 완충액으로 다시 3회 세척하였다. PECAM-1 및 p-eNOS에 특이적으로 반응한 항체를 형광으로 확인할 수 있도록 제작된 두 번째 항체(FITC-표지된 항-가토 항체 또는 TRITC-표지된 항-햄스터 항체)를 1:1000 비율로 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 남아있는 항체를 제거하기 위해 세척 완충액으로 다시 3회 세척한 후에 형광현미경이나 형광물질을 확인할 수 있는 공초점 현미경으로 발현 정도를 분석하였다.

당뇨 마우스의 음경해면체 조직에서 angiopoietin-4 단백질 투여군과 대조군의 혈관내피세포 특이적 단백질인 PECAM-1의 발현 정도를 도 6에 나타내었고, PECAM-1 및 p-eNOS의 발현 정도를 도 7에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 당뇨 마우스의 음경해면체 조직에서 angiopoietin-4 단백질 투여군과 대조군의 혈관내피세포 특이적 단백질인 PECAM-1의 발현 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과, 당뇨 마우스에 PBS를 주사한 군(PBS)의 음경해면체 조직에서 정상 마우스(Control)에 비해 혈관내피세포의 수가 현저하게 감소되어 있음을 확인하였다. Angiopoietin-4 단백질을 2번 투여한 군(Ang-4 Repeat)에서 그렇지 않은 군(PBS: angiopoietin-4 단백질 대신 PBS를 투여한 군, Ang-4 Single: angiopoietin-4 단백질을 1번 투여한 군)에 비하여 혈관내피세포 특이적 단백질의 발현 증가를 관찰하였으며, 이는 당뇨에 의하여 감소된 혈관내피세포가 angiopoietin-4 단백질에 의하여 그의 재생이 유도되고, 그에 따라 발기력이 회복된다는 것을 증명하는 결과이다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 당뇨 마우스의 음경조직에서 angiopoietin-4 단백질 투여군과 대조군에서 PECAM-1 및 p-eNOS의 발현 정도를 초점 현미경으로 분석한 결과, 당뇨 마우스에 PBS를 투여한 군의 음경에서 정상 마우스(Control)에 비해 p-eNOS 발현이 현저하게 감소되어 있음을 확인하였다. Angiopoietin-4 단백질을 2번 투여한 군(Ang-4 Repeat)에서는 그렇지 않은 군(PBS: angiopoietin-4 단백질 대신 PBS를 투여한 군, Ang-4 Single: angiopoietin-4 단백질을 1번 투여한 군)에 비하여 p-eNOS 발현이 증가됨을 확인할 수 있었고, 이는 당뇨에 의하여 야기된 eNOS 활성감소가 angiopoietin-4 단백질 주입으로 다시 정상 수준으로 회복하였음을 의미한다.

2-3. 혈관내피세포에서의 과산화물 음이온(superoxide anion)의 생성

정상 마우스에 스트렙토조토신을 투여하여 당뇨를 유도한 후, 당뇨성 발기부전 마우스 모델의 음경 발기조직 내 혈관내피세포에서 과산화물 음이온의 생성여부를 조사하고자 히드로에티딘(hydroethidine) 염색을 통해 반응 정도를 확인하였다.

히드로에티딘은 산화환원에 민감한 표지자로, 세포 속의 활성산소의 일종인 과산화물 음이온을 탐지하는데 사용된다. 과산화물과 히드로에티딘이 반응하면 에티디움(ethidium)이라는 2-전자 산화된 산물(two-electron oxidized product)이 생성되고, 이 에티디움은 DNA에 붙어 500-530nm의 파장을 흡수하여 590-620nm의 형광을 낸다. 과산화물 음이온은 반응성이 강한 음이온 유리기로 NADPH 산화 효소에 의해 다량으로 만들어져 유해성을 띄며 DNA 손상까지 일으킬 수 있는 물질이다.

상기 실시예 2-2에서와 동일한 방법으로, 항-PECAM-1 항체로 형광면역염색을 하고 마지막 세척을 마친 후, 히드로에티딘(1mM in PBS)을 30분 동안 처리하여 형광현미경이나 형광물질을 확인할 수 있는 공초점 현미경으로 발현 정도를 분석하였다.

당뇨 마우스의 음경조직 절편에서 angiopoietin-4 단백질 투여군과 대조군의 과산화물 음이온과 반응하는 히드로에티딘을 처리한 후 발광 정도를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 당뇨 마우스에 PBS를 주사한 군(PBS)의 음경에서 정상 마우스(Control)에 비해 과산화물 음이온이 현저하게 증가되어 있음을 확인하였다. Angiopoietin-4 단백질을 2번 투여한 군(Ang-4 Repeat)에서 그렇지 않은 군(PBS: angiopoietin-4 단백질 대신 PBS를 투여한 군, Ang-4 Single: angiopoietin-4 단백질을 1번 투여한 군)에 비하여 과산화물 음이온의 생성이 감소되었음을 확인할 수 있었으며, 이는 당뇨에 의하여 증가된 과산화물 음이온이 angiopoietin-4 단백질에 의하여 그의 생성이 감소되고, 그에 따라 발기력이 회복된다는 것을 증명하는 결과이다.

실시예 3. HUVECs에서 Angiopoietin-4의 효과

Tie-2(tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains 2)는 angiopoietin 패밀리의 수용체 막단백질로, 혈관내피세포에서 많이 발현되며 혈관 형성에 영향을 주는 요소 중 하나이다. 주요 리간드(ligand)는 angiopoietin-1과 angiopoietin-2가 있고, angiopoietin-1은 Tie-2를 인사화시켜 혈관내피세포의 생존, 이동, 증식에 관여하며, angiopoietin-2는 angiopoietin-1의 역할에 반대로 작용한다고 알려져 있다. 혈관내피세포의 생존, 이동, 증식에 관여하는 신호전달경로 중의 하나인 Tie-2-AKT-eNOS 시스템의 인산화에 angiopoietin-4가 미치는 영향을 확인하기 위해서 웨스턴블롯을 수행하였다.

대조군과 단백질 처리군 두 군으로 나누어, HUVECs에 angiopoietin-4를 200ng/ml의 농도로 처리하여 웨스턴블롯을 수행하였다.

그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에서 나타낸 바와 같이, 웨스턴블롯의 결과, angiopoietin-4 단백질을 처리한 HUVECs에서 대조군에 비해 Tie-2의 인산화가 증가되었고, 그 하위 신호인 AKT와 eNOS 또한 대조군 보다 많은 양이 인산화된 것을 확인할 수 있었다(9A). 또한, pTie-2/Tie2(9B), pAKT-AKT(9C) 및 p-eNOS/eNOS(9D)의 인산화 양을 정량적으로 분석한 결과, 평균적으로 angiopoietin-4를 처리한 군에서 대조군에 비해 Tie-2는 1.9배, AKT는 2.4배, eNOS는 3.0배 더 많이 인산화가 되었음을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 angiopoietin-4가 혈관내피세포의 생존, 이동, 증식에 영향을 준다는 것을 의미한다.

이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명에 따른 Angiopoietin-4 단백질은 당뇨에 의해 감소된 혈관내피세포의 재생을 유도하고, 혈관내피세포 특이적 단백질인 PECAM-1 및 p-eNOS의 발현 증가 뿐만 아니라, 혈관내피세포에서 Angiopoietin-4 단백질에 의한 Tie-2의 인산화를 증가시켜 혈관내피세포의 생존, 이동 및 증식에 영향을 미쳐 음경해면체 내압을 상승시킴으로써 발기부전에 대하여 우수한 발기력 개선 효과가 있어, 발기부전의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

이하 본 발명의 상기 조성물을 포함하는 약학적 조성물 및 건강기능식품의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 조성물의 제제

1-1. 산제의 제조

angiopoietin-4 단백질 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

angiopoietin-4 단백질 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캡슐제의 제조

angiopoietin-4 단백질 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

angiopoietin-4 단백질 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄ㆍH₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

angiopoietin-4 단백질 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 식품 조성물의 제제

2-1. 건강식품의 제조

angiopoietin-4 단백질 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2-2. 건강음료의 제조

angiopoietin-4 단백질 100 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃ 에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (7)

1. 안지오포이에틴-4(Angiopoietin-4) 단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 Angiopoietin-4 단백질은 음경 해면체 내피세포 또는 음경 혈관내피세포를 재생시키는 것을 특징으로 하는, 발기부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 Angiopoietin-4 단백질은 내피세포에서 혈관내피세포 특이적인 단백질인 PECAM-1(platelet/endothelial cell adhesion molecule-1) 및 p-eNOS의 발현 수준을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 발기부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 혈관내피세포 특이적인 단백질인 PECAM-1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule-1) 및 p-eNOS의 발현의 증가로 음경해면체 내압을 상승시켜 발기력을 개선시키는 것을 특징으로 하는, 발기부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 발기부전은 음경내피세포의 손상에 의하여 야기된 것을 특징으로 하는, 발기부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 음경내피세포의 손상은 고지질혈증, 당뇨병, 고혈압 및 음경신경손상으로부터 선택된 1종 이상으로부터 야기된 것을 특징으로 하는, 발기부전의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 안지오포이에틴-4(Angiopoietin-4) 단백질을 유효성분으로 포함하는 발기부전의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
   
   
   

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