KR20140063764A

KR20140063764A - 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 고 역가 제조

Info

Publication number: KR20140063764A
Application number: KR1020147008980A
Authority: KR
Inventors: 존 피. 오브라이언; 마크 에스. 패인
Original assignee: 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니
Priority date: 2011-09-09
Filing date: 2012-09-10
Publication date: 2014-05-27
Also published as: US20130244288A1; CA2847883A1; CL2014000572A1; BR112014005322A2; JP2014526253A; AU2012305709B2; IL231088A0; RU2014113919A; SG11201400440YA; WO2013036968A1; CN103764834A; EP2753703A1; MX2014002760A; US9080195B2; AU2012305709A1

Abstract

수크로스로부터의 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 효소적 제조 방법이 개시된다. 스트렙토코커스 살리바리우스 유래의 글루코실트랜스퍼라아제 효소 (gtfJ)를 사용하여 수크로스를 프룩토스 및 폴리 (α 1, 3 글루칸)으로 전환시킨다. 반투과성 막을 적용하여 gtf 효소의 부산물인 프룩토스를 연속적으로 제거함으로써 폴리 (α 1, 3 글루칸) 역가를 증가시키는 것이 개시된다.

Description

폴리 (α 1, 3 글루칸)의 고 역가 제조{HIGH TITER PRODUCTION OF POLY (α 1, 3 GLUCAN)}

본 발명은 구조 다당류 제조 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 효소 반응을 통한 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 제조에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 효소 반응 동안 형성되는 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 역가의 증가에 관한 것이다.

자연적 과정에 의해 β (1, 4) 글리코시드 결합을 통하여 글루코스로부터 형성되는 다당류인 셀룰로오스 (문헌[Applied Fiber Science, F. Happey, Ed., Chapter 8, E. Atkins, Academic Press, New York, 1979])는 이로부터 유도되는 많은 유용한 생성물의 결과로서 섬유로서의 상업적 명성을 성취하였다. 특히, 고도로 순수한 형태의 자연 발생 셀룰로오스인 면은 텍스타일 응용에 있어서 그의 유익한 속성으로 잘 알려져 있다.

셀룰로오스는 액정 용액을 형성하기에 충분한, 용액 중 사슬 연장 및 골격 강성을 나타낸다 (미국 특허 제4,501,886호). 그러나, 충분한 다당류 사슬 연장은 지금까지는 일차적으로 β (1, 4) 결합된 다당류에서 성취되었다. 글루칸 다당류 패밀리(family)에서의 상기 골격의 기하학적 구조(geometry)로부터의 임의의 유의한 일탈(deviation)은 분자 종횡비를 질서화된 이액 상(ordered lyotropic phase)의 형성에 필요한 것보다 더 낮게 낮춘다. 부가적으로, 면 및 레이온과 같은 중요한 상업적 셀룰로오스계 섬유가 토지 이용 및 환경적 영향(environmental imprint)과 관련하여 지속 가능성에 대한 쟁점(issue)을 점점 더 나타낸다는 것이 잘 알려져 있다.

따라서, 대부분은 재생가능한 자원으로부터 저가의 구조 재료를 생성하는 것에 대하여 현재 중점을 두기 때문에 필름, 섬유 및 수지에 있어서 유용성을 갖는 다른 글루코스-기재의 다당류를 발견하는 것이 매우 바람직하다. 게다가, 이러한 중합체는 그의 전체 수명 내내 환경적으로 유익한 물질을 제공한다.

α (1, 3) 글리코시드 결합을 갖는 것을 특징으로 하는 글루칸 중합체인 폴리 (α 1, 3 글루칸)은 수크로스의 수성 용액을 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)로부터 단리된 글루코실트랜스퍼라아제 (gtfJ) 효소와 접촉시킴으로써 단리되었다 (문헌[Simpson et al., Microbiology, 141: 1451-1460, 1995]). 글루칸은 글리코시딕 결합에 의해 결합된 D-글루코스 단량체들로 구성된 다당류를 말한다. 폴리 (α 1, 3 글루칸)으로 제조된 필름은 최대 150℃까지의 온도를 견뎠으며, β (1, 4) 결합된 다당류들로부터 수득되는 중합체에 비하여 이점을 제공하였다 (문헌[Ogawa et al., Fiber Differentiation Methods, 47: 353-362, 1980]).

미국 특허 제7,000,000호에는 스트렙토코커스 살리바리우스의 글루코실트랜스퍼라아제 효소 gtfJ를 사용하여 헥소스 단위들을 포함하는 다당류 섬유를 제조하는 것이 개시되어 있으며, 여기서 중합체 내의 헥소스 단위들 중 50% 이상은 α (1, 3) 글리코시드 결합을 통하여 결합되었다. 상기 개시된 중합체는, 이것이 용매 중에 또는 용매를 포함하는 혼합물 중에 임계 농도 초과의 농도로 용해될 때 액정 용액을 형성하였다. 이러한 용액으로부터, 텍스타일에서 사용하기에 매우 적합한 연속적인, 강한, 면-유사 섬유가 방사되었으며, 유도체화된 형태로 또는 비-유도체화된 (재생된) 형태로서 사용되었다. 미국 특허 제7,000,000호에서의 폴리 (α 1, 3 글루칸)은 배치(batch) 공정으로 제조되었으며, 여기서 폴리 (α 1, 3 글루칸) 역가는 전형적으로 반응기 부피 1 리터당 폴리 (α 1, 3 글루칸) 25 g 미만이었다.

효소 반응에 의해 형성되는 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 역가를 증가시키는 공정의 개발이 바람직할 수 있다.

본 발명은 섬유, 필름 및 펄프에서의 응용을 위한, 재생가능한 공급 원료로부터의 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 제조 방법이다. 이 중합체는 촉매로서 재조합 글루코실트랜스퍼라아제 (gtfJ) 효소를 이용하고 기질로서 수크로스를 이용한 1단계 효소 반응에서 직접적으로 제조된다.

일 태양에서, 본 발명은 반투과성 막에 의해 분리된 2개의 챔버를 포함하는 반응 시스템에서 폴리 (α 1, 3 글루칸)을 제조하는 방법으로서,

a) 제1 챔버는 i) 수크로스; 및 ii) 적어도 하나의 글루코실트랜스퍼라아제 효소를 포함하는 효소 반응액을 포함하며;

b) 효소 반응액과 접촉 상태로 있는 반투과성 막 - 여기서, 반투과성 막은 프룩토스 및 다른 저분자량 부분(moiety)에 대해서는 투과성이지만 폴리 (α 1, 3 글루칸)에 대해서는 불투과성임 - 에 의해 제1 챔버로부터 분리된 제2 챔버는 폴리 (α 1, 3 글루칸) 및 상기 적어도 하나의 글루코실트랜스퍼라아제 효소를 제1 챔버 내에 보유하면서 프룩토스 및 다른 저분자량 부분의 연속 제거를 용이하게 한다.

다른 태양에서, 개시된 발명은 리터당 30 내지 200 g의 역가의 폴리 (α 1, 3 글루칸)을 적어도 하나의 글루코실트랜스퍼라아제 효소에 의해 수크로스로부터 제조하는 방법이다.

DNA 서열의 설명

서열 번호 1은 이. 콜라이(E. coli)에서의 발현용으로 코돈 최적화된 성숙 글루코실트랜스퍼라아제의 합성된 유전자의 서열이다.

서열 번호 2는 플라스미드 pMP52의 DNA 서열이다.

서열 번호 3은 스트렙토코커스 살리바리우스 (ATCC 25975) 유래의 성숙 글루코실트랜스퍼라아제 (gtfJ 효소; EC 2.4.1.5; 젠뱅크(GENBANK)(등록상표) AAA26896.1)의 DNA 서열이다.

폴리 (α 1, 3 글루칸)은 스트렙토코커스 살리바리우스의 gtfJ 효소를 이용하여 수크로스와 같은 재생가능한 자원으로부터 효소에 의해 생성될 수 있는 잠재적 저가 중합체이다. α(1, 3) 글리코시드 결합을 갖는 헥소스 단위들을 포함하는 선택된 중합체는 상기 중합체가 소정의 조건 하에 용매 중에 용해될 때 질서화된 액정 용액을 형성할 수 있음이 밝혀졌다 (미국 특허 제7,000,000호). 게다가, 이러한 용액은 연속, 고강도, 면-유사 섬유로 방사될 수 있다. 미국 특허 제7,000,000호에서, 배치식 효소 반응이 gtfJ에 의한 수크로스의 폴리 (α 1, 3 글루칸)으로의 전환에 이용되었으며, 부산물인 프룩토스 및 레우크로스가 반응기 내에 축적되었다. 축적된 프룩토스는 효소 반응 동안 글루코실 부분에 대하여 경쟁하는 것으로 공지되어 있기 때문에, 이용가능한 글루코스의 폴리 (α 1, 3 글루칸)으로의 전환이 후속적으로 방해를 받으며, 이에 따라 반응기 단위 부피당 요구되는 생성물의 최종 역가가 제한되었다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "레우크로스"는 α (1, 5) 결합에 의해 결합된 글루코스 및 프룩토스로 이루어진 이당류를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "글루코실트랜스퍼라아제 (gtf) 효소"는, 수크로스의 글리코시딕 결합의 높은 자유 에너지를 이용하여 폴리 (α 1, 3 글루칸)을 합성하는 구강 연쇄상 구균, 예를 들어 스트렙토코커스 살리바리우스에 의해 배출되는 효소를 말한다. 글리코시딕 결합은 2개의 단당류를 연결시켜 이당류를 형성할 수 있다. 글리코시딕 결합은 α 또는 β 배열로 존재할 수 있으며, 예를 들어, α (1, 2), α (1, 3), α (1, 4), α (1, 6), β (1, 2), β (1, 3), β (1, 4) 또는 β (1, 6) 결합을 생성할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "α(1, 3) 글리코시드 결합"은 글루코스 분자들을 인접 글루코스 고리들 상의 고리 탄소 1 및 3을 통하여 서로에게 연결시키는 유형의 공유 결합을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리 (α 1, 3 글루칸)"은 α (1, 3) 글리코시딕 결합을 통한 글루코스 단위들의 결합에서 생기는 다당류 분자들로부터 수득되는 고분자량 선형 중합체를 말한다.

본 발명은 하나 이상의 gtf 효소를 이용한 효소 반응에서 수크로스로부터 생성되는 다당류인 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 역가를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 용어 "효소 반응"은 gtf 효소에 의해 수행되는 반응을 말한다. 본 발명의 "효소 반응액"은 일반적으로 가능하게는 수크로스를 폴리 (α 1, 3 글루칸)으로 전환시키기 위한 하나 이상의 프라이머, 및 수크로스를 포함하는 완충액 중 적어도 하나의 gtf 효소를 포함하는 반응 혼합물을 말한다.

본 발명에서 사용되는 글루코실트랜스퍼라아제 효소는 임의의 gtf 효소일 수 있다. 사용되는 gtf 효소는 임의의 연쇄상 구균 유래의 것일 수 있다. 적합한 gtf 효소는 예를 들어 스트렙토코커스 살리바리우스의 gtfJ, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 유래의 gtfB 및 gtfC, 및 스트렙토코커스 다우니(Streptococcus downei) 유래의 gtfI일 수 있다. 특히, 스트렙토코커스 종은 스트렙토코커스 살리바리우스일 수 있다. 더욱 특히는, gtf 효소는 스트렙토코커스 살리바리우스의 gtfJ (E.C. 2.4.1.5) 효소일 수 있다.

일 실시 형태에서, 효소 반응액은 본 명세서에 기재된 바와 같이 단지 하나의 gtf 효소를 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 효소 반응액은 하나 초과의 유형의 gtf 효소의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명의 목적을 위하여, 실시예에 기재된 바와 같이 gtfJ 생산용 재조합 이. 콜라이 주를 이용하여 충분한 양의 gtfJ 효소가 생산될 수 있다. 코돈 최적화된 유전자의 설계 및 이. 콜라이에서의 발현 방법이 본 기술 분야에 잘 알려져 있다.

재조합 미생물의 성장 방법이 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 반응을 수행하기 위한 요구되는 gtf 효소를 발현하는 재조합 미생물은 예를 들어 만입부(indentation)들이 있는 그리고 만입부들이 없는 다양한 유형의 플라스크; 밀봉되고 온도-제어될 수 있는 임의의 오토클레이브가능(autoclavable) 용기; 또는 임의의 유형의 발효기와 같은 임의의 용기에서 성장될 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명에서 폴리 (α 1, 3 글루칸) 생성을 위한 gtfJ 효소의 생성은 발효기에서 gtfJ 효소를 발현하는 재조합 이. 콜라이 MG1655/pMP52를 성장시킴으로써 성취될 수 있다.

본 발명에서 수크로스의 폴리 (α 1, 3 글루칸)으로의 전환을 위한 촉매로서 사용되는 스트렙토코커스 살리바리우스의 gtfJ 효소는 프라이머-의존성 gtf 효소이다. 본 출원에서 언급된 프라이머-의존성 gtf 효소는 폴리 (α 1, 3 글루칸) 합성 동안 상기 효소를 위한 프라이머로서 작용하기 위하여 효소 반응액 중 개시 분자의 존재를 필요로 하는 gtf 효소를 말한다. 따라서, "프라이머"는 이 용어가 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 프라이머-의존성 글루코실트랜스퍼라아제를 위한 개시자로서 작용할 수 있는 임의의 분자를 말한다. 많은 다른 글루코실트랜스퍼라아제가 프라이머-의존성 효소이다. 프라이머-비의존성 효소는 상기 반응을 수행하기 위한 프라이머의 존재를 필요로 하지 않는다. 본 발명의 목적을 위하여, 프라이머-비의존성 효소 및/또는 프라이머-의존성 gtf 효소 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두가 폴리 (α 1, 3 글루칸) 합성 동안 동일한 효소 반응 시스템에서 사용될 수 있다.

gtfJ는 프라이머-의존성 효소이다. 본 발명에서, 복합 분지형 글루칸인 덱스트란이 gtfJ 효소를 위한 프라이머로서 사용되었다. gtf가 프라이머-의존성 효소인 반면, 이 효소를 이용한 수크로스의 폴리 (α 1, 3 글루칸)으로의 전환은 프라이머의 부재 하에서 또한 일어날 수 있다.

스트렙토코커스 살리바리우스의 gtfJ 효소에 의한 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 생성은 그의 부산물인 프룩토스에 의해 저해된다. 프룩토스가 상기 효소 반응액 중에 축적될 때, 이것은 아마 이당류인 레우크로스의 형성으로 이어지는 이용가능한 글루코실 부분에 대한 경쟁에 의해 상기 효소에 의한 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 생성을 저해할 수 있다. 본 발명에서, gtfJ에 대한 프룩토스의 영향을 감소시키기 위하여, 효소 반응액 중 프룩토스를 연속적으로 제거하여 효소 반응액에서의 저해 수준으로의 그의 축적을 방지할 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 상기 반응 시스템은 하나 이상의 gtf 효소, 하나 이상의 프라이머, 및 수크로스를 포함하는, 제1 챔버 내에 포함된 효소 반응액을 제2 챔버 내에 포함된 둘러싸고 있는 완충제로부터 분리시키는 반투과성 막을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "챔버"는 효소 반응액 또는 효소 반응액의 생성물을 수용할 수 있는 임의의 용기를 말한다. 챔버는 유리, 플라스틱, 금속, 필름, 막 또는 효소 반응액을 수용할 수 있는 임의의 다른 유형의 불활성 재료로 만들어질 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "반투과성 막"은 일부 다른 분자를 보유하면서 확산에 의한 소정의 분자 또는 이온의 통과를 허용하는 막을 말한다. 상기 효소 및 폴리 (α 1, 3 글루칸)을 보유하면서 프룩토스 및 다른 저분자량 부분이 통과되게 하는, 분자 컷오프(cutoff)가 12,000 내지 100,000 Da인, 본질적으로 임의의 반투과성 막이 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다른 저분자량 부분"은 효소 반응액에 존재할 수 있는, 분자량이 1000 Da 미만인 다양한 화합물을 말한다. 제1 챔버에 포함된 효소 반응액으로부터 부산물인 프룩토스를 제거하는 것으로 인하여, 레우크로스 형성이 감소될 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 투석관을 반투과성 막으로 사용하여 부산물인 프룩토스를 효소 반응액으로부터 제거할 수 있다.

본 발명에 있어서, 효소 반응액은 20℃ 내지 25℃에서 유지될 수 있다.

본 발명은 섬유, 필름 및 펄프를 비롯한 다양한 응용을 위하여 쉽게 재생가능한 수크로스 공급 원료로부터 경제적으로 수득될 수 있는 저가 재료로서의 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 생성을 제공한다. 특히, 예를 들어 폴리 (α 1, 3 글루칸) 섬유는 면 및 재생 셀룰로오스 섬유를 기능적으로 대체하여, 전술한 현재의 것에 대비하여 지속 가능성이 탁월하고 환경 영향이 최소인 새로운 텍스타일 섬유에 이르게 될 것으로 예상된다.

실시예

본 명세서에 개시된 조성물 및 방법의 유리한 속성 및 효과를 하기에 기재된 실시예로부터 더욱 완전히 알 수 있다. 이들 실시예가 기초한 본 방법의 실시 형태는 단지 대표적인 것이며, 본 발명을 예시하기 위한 이들 실시 형태의 선택은 이들 실시예에 기재되지 않은 재료, 성분, 반응물, 조건, 사양, 단계 또는 기술이 이들 방법을 실시하는 데 적합하지 않거나, 이들 실시예에 기재되지 않은 요지가 첨부된 특허청구범위 및 그 등가물의 범주에서 배제됨을 나타내는 것은 아니다.

재료

투석관 (스펙트래퍼(Spectrapor) 25225-226, 12000의 분자량 컷오프)을 브이더블유알(VWR) (미국 펜실베이니아주 래더너 소재)로부터 획득하였다.

덱스트란 및 에탄올을 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 획득하였다. 수크로스를 브이더블유알로부터 획득하였다.

서프레서(Suppressor) 7153 소포제를 코그니스 코포레이션(Cognis Corporation; 미국 오하이오주 신시내티 소재)으로부터 획득하였다.

모든 다른 화학물질을 이러한 화학물질의 일반적으로 이용되는 공급처로부터 획득하였다.

시드(seed) 배지

발효기용 출발 배양물을 성장시키는 데 사용한 시드 배지는 하기를 함유하였다: 효모 추출물 (암버렉스(Amberx) 695, 5.0 그램/리터, g/L), K₂HPO₄ (10.0 g/L), KH₂PO₄(7.0 g/L), 시트르산나트륨 2수화물 (1.0 g/L), (NH₄)₂SO₄ (4.0 g/L), MgSO₄ 7수화물 (1.0 g/L) 및 시트르산제2철암모늄 (0.10 g/L). 상기 배지의 pH를 5 N NaOH 또는 H₂SO₄ 중 어느 하나를 이용하여 6.8로 조정하고, 플라스크 중 상기 배지를 살균하였다. 살균 후 첨가물은 글루코스 (50% (w/w) 용액 20 ㎖/L) 및 암피실린 (25 mg/㎖의 스톡 용액 4 ㎖/L)을 포함하였다.

발효기 배지

발효기에서 사용한 성장 배지는 하기를 함유하였다: KH₂PO₄ (3.50 g/L), FeSO₄ 7수화물 (0.05 g/L), MgSO₄ 7수화물 (2.0 g/L), 시트르산나트륨 2수화물 (1.90 g/L), 효모 추출물 (암버렉스 695, 5.0 g/L), 서프레서 7153 소포제 (0.25 밀리리터/리터, ㎖/L), NaCl (1.0 g/L), CaCl₂ 2수화물 (10 g/L), 및 NIT 미량 원소 용액 (10 ㎖/L). NIT 미량 원소 용액은 시트르산 1수화물 (10 g/L), MnSO₄ 수화물 (2 g/L), NaCl (2 g/L), FeSO₄ 7수화물 (0.5 g/L), ZnSO₄ 7수화물 (0.2 g/L), CuSO₄ 5수화물 (0.02 g/L) 및 NaMoO₄ 2수화물 (0.02 g/L)을 함유하였다. 살균 후 첨가물은 글루코스 (50% (w/w) 용액 12.5 g/L) 및 암피실린 (25 mg/㎖의 스톡 용액 4 ㎖/L)을 포함하였다.

실시예 1

글루코실트랜스퍼라아제 (gtfJ) 효소 발현 주의 제작

젠뱅크(GENBANK)(등록상표) (등록 번호: M64111.1)에 보고된, 스트렙토코커스 살리바리우스 (ATCC 25975) 유래의 성숙 글루코실트랜스퍼라아제 효소 (gtfJ; EC 2.4.1.5)를 코딩하는 유전자를 이. 콜라이에서의 발현용으로 최적화된 코돈을 이용하여 합성하였다 (디엔에이 2.0(DNA 2.0), 미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재). 핵산 생성물 (서열 번호 1)을 pJexpress404(등록상표) (미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재의 디엔에이 2.0) 내로 서브클로닝하여 pMP52 (서열 번호 2)로 식별되는 플라스미드를 생성하였다. 플라스미드 pMP52를 사용하여 이. 콜라이 MG1655 (ATCC 47076™)를 형질전환시켜 MG1655/pMP52로 식별되는 주를 생성하였다. 글루코실트랜스퍼라아제 효소 발현 주의 제작에 사용한 모든 절차는 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 과도한 실험 없이 당업자에 의해 수행될 수 있다.

실시예 2

발효에서의 재조합 gtfJ의 생성

실시예 1에서 설명한 바와 같이 제작한, gtfJ 효소를 발현하는 이. 콜라이 주 MG1655/pMP52의 예비 시드 배양물을 준비함으로써 발효기에서의 재조합 gtfJ 효소의 생성을 개시하였다. 상기 시드 배지의 10 ㎖ 분취물을 125 ㎖의 일회용 배플 플라스크(baffled flask) 내에 첨가하고, 20% 글리세롤 중 이. 콜라이 MG1655/pMP52 배양물 1.0 ㎖을 접종하였다. 이 배양물을 300 rpm (분당 회전수(revolutions per minute))으로 3시간 동안 진탕시키면서 37℃에서 성장시켰다.

2 L 진탕 플라스크에 0.5 L의 시드 배지를 충전시킴으로써 발효기 시작용 시드 배양을 준비하였다. 1.0 ㎖의 예비 시드 배양물을 플라스크 내의 0.5 L 시드 배지 내로 무균적으로 옮기고, 37℃ 및 300 rpm에서 5시간 동안 배양하였다. 37℃에서 상기에 설명한 발효기 배지 8 L를 포함하는 14 L 발효기 (미국 뉴저지주 퍼스 앰보이 소재의 브라운(Braun))로 >2의 550 ㎚에서의 광학 밀도(OD₅₅₀)로 상기 시드 배양물을 옮겼다.

이. 콜라이 MG1655/pMP52의 세포를 발효기에서 성장시키고, 배지 중 글루코스 농도가 0.5 g/L로 감소할 때 글루코스 공급 (1% (w/w) MgSO₄·7H₂O를 함유하는 50% (w/w) 글루코스 용액)을 개시하였다. 상기 공급을 분당 0.36 g의 공급물 (공급물의 g/min)로 시작하고, 각각 0.42, 0.49, 0.57, 0.66, 0.77, 0.90, 1.04, 1.21, 1.41 1.63, 1.92, 2.2 g의 공급물/min으로 매 시간 점진적으로 증가시켰다. 상기 속도는 그 후 변동이 없었다. 배지 중 글루코스 농도를 와이에스아이(YSI) 글루코스 분석기 (미국 오하이오주 옐로우 스프링즈 소재의 와이에스아이)를 사용하여 모니터링하였다. 글루코스 농도가 0.1 g/L를 초과할 때, 공급 속도를 감소시키거나 또는 일시적으로 중단하였다. 세포가 70의 OD₅₅₀에 도달할 때, 9 ㎖의 0.5 M IPTG (아이소프로필 β-D-1-티오갈락토-피라노사이드)를 첨가하여 글루코실트랜스퍼라아제 효소 활성의 유도를 개시하였다. 용존 산소 (DO) 농도를 25%의 공기 포화도로 제어하였다. DO를 먼저 임펠러 교반 속도 (400 내지 1200 rpm)에 의해 그리고 이후에 통기 속도 (2 내지 10의 분당 표준 리터(standard liters per minute; slpm))에 의해 제어하였다. pH를 6.8로 제어하였다. NH₄OH (14.5% (중량/부피; w/v)) 및 H₂SO₄ (20% (w/v))를 pH 제어에 사용하였다. 배압(back pressure)을 0.05 MPa (0.5 bar)로 유지하였다. 다양한 간격 (20, 25 및 30시간)으로 5 ㎖의 서프레서 7153 소포제를 발효기 내에 첨가하여 발포를 억제하였다. 세포를 IPTG를 첨가한지 8시간 후 원심분리에 의해 수확하고, 세포 페이스트로서 -80℃에서 보관하였다.

실시예 3

세포 페이스트로부터의 gtfJ 조 효소(crude enzyme) 추출물의 제조

상기에서 수득한 세포 페이스트를 pH 7.2의 50 mM 인산칼륨 완충제 중에 150 g/L로 현탁시켜 슬러리를 제조하였다. 상기 슬러리를 82.74 MPa (12,000 psi) (라니식 기계(Rannie-type machine), APV-1000 또는 APV 16.56)에서 균질화하고, 상기 균질화물을 4℃로 냉각시켰다. 중간 정도로 격렬하게 교반하면서, 세포 균질화물 1 리터당 50 g의 플록(floc) 용액 (알드리치 번호: 409138, pH 7.0의 50 mM 인산나트륨 완충제 중 5%)을 첨가하였다. 교반을 가벼운 교반으로 감소시켜 15분 동안 하였다. 그 후, 세포 균질화물을 5-10℃에서 4500 rpm에서 3시간 동안 원심분리함으로써 청징화하였다. 조 gtfJ 효소 추출물을 함유하는 상청액을 30 킬로달톤 (kDa) 컷오프 막을 이용하여 농축시켰다 (대략 5배). gftJ 효소 용액 중 단백질의 농도를 바이신코닌산 (BCA) 단백질 분석법 (시그마 알드리치)으로 측정하였더니 4-8 g/L였다.

실시예 4

반투과성 막의 사용에 의한 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 역가의 향상

이 실시예는 수크로스의 폴리 (α 1, 3 글루칸)으로의 전환 동안 형성된 부산물인 프룩토스의 제거 및/또는 희석이 폴리 (α 1, 3 글루칸) 역가를 증가시킴을 입증한다. 이 실시예에서 투석관을 반투과성 막으로 사용하였으며, 그 이유는 이것이 효소 반응 동안 형성된 부산물인 프룩토스를 상기 관의 내부로부터 투석 튜브의 외부로 통과시키기 때문이다.

이 실시예에서 효소 반응액은 8 L의 수크로스 스톡 용액 (표 1), 프라이머로서의 24 g의 덱스트란 T-10, 및 1.0 부피%의 gtf 효소를 함유하였다.

4개의 개별 투석 튜브 (50 ㎖의 용량)를 시험 샘플로서 사용하였으며, 50 ㎖의 효소 반응액을 충전시키고 밀봉하였다. 그 후, 개별 투석 튜브는 둘러싸고 있는 완충제로서의 상이한 부피의 수크로스 스톡 용액 (표 1)이 수용된 폴리에틸렌 버킷 내에 현수시켰다. 그 후 이들 폴리에틸렌 버킷을 자기 교반 플레이트 상에 두고, 20-25℃에서 72시간 동안 교반시켰다. 뚜껑이 있는 원심분리 튜브에서, 시험 샘플과 동일한 비율의 50 ㎖의 효소 반응액으로 이루어진 대조 샘플을 제조하고, 교반 없이 20-25℃의 온도에서 72시간 동안 정치시켰다. 대조 샘플을 투석 튜브 또는 둘러싸고 있는 완충제 내에 넣지 않았다.

72시간 후, 투석 튜브 내의 시험 샘플을 둘러싸고 있는 완충제로부터 꺼내고, 상기 튜브들을 절단하여 개봉하고, 40 마이크로미터 여과지 위에서 325 메시 스크린을 이용하여 부흐너(Buchner) 깔때기에서 폴리 (α 1, 3 글루칸) 고형물을 수집하였다. 상기 필터 케이크를 탈이온수 중에 재현탁시키고, 상기와 같이 2회 더 여과하여 잔류 수크로스, 프룩토스 및 다른 저분자량 용해성 부산물을 제거하였다. 마지막으로, 메탄올을 이용한 2회의 추가 세척을 실시하였다. 상기 필터 케이크를 상기 깔때기에서 철저히 짜내고, 진공 하에서 실온에서 건조시켰다. 대조 샘플에서 형성된 폴리 (α 1, 3 글루칸)을 또한 단리하여 칭량하였다. 시험 및 대조 샘플 중의 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 형성을 공개 정보를 이용하여 확인하였다 (문헌[Nakamura, T., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 68: 868-872, 2004]). 시험 샘플 및 대조 샘플로부터의, gtfJ 효소에 의한 수크로스의 폴리 (α 1, 3 글루칸)으로의 전환 후 수득된 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 생성된 건조 중량을 표 2에 나타낸다.

상기 결과는, 효소 반응액을 투석 튜브 내에 넣고, 부산물인 프룩토스가 투석 튜브의 내부에서 외부로 계속하여 통과되게 하는 둘러싸고 있는 완충제 내에 넣음으로써 상기 튜브 내부에서 상기 효소에 의해 형성된 프룩토스의 농도가 희석되게 할 때 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 역가가 유의하게 향상되었음을 명백하게 보여준다. 최고 중합체 역가는 부산물인 프룩토스의 더욱 높은 희석으로 이어질 수 있는, 둘러싸고 있는 완충제의 더욱 큰 부피에서 수득되었다.

실시예 5

시간 간격을 두고 형성된 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 양의 측정

3 L의 수크로스 스톡 용액 (표 1), 프라이머로서의 9 g의 덱스트란 T-10, 및 2.0% (부피%)의 gtf를 첨가하여 효소 반응액을 제조하였다.

7개의 개별 투석 튜브를 시험 샘플로 사용하였으며, 50 ㎖의 효소 반응액을 충전시키고 밀봉하였다. 그 후, 개별 투석 튜브는 둘러싸고 있는 완충제로서의 3 L의 수크로스 스톡 용액을 포함하는 폴리에틸렌 버킷 내에 현수시켰다. 상기 버킷을 자기 교반 플레이트 상에 두고, 20-25℃에서 72시간 동안 교반시켰다. 개별 투석 튜브들을 표 3에 나타낸 시간 간격으로 꺼냈다. 실시예 4에 설명한 바와 같이, 대조 샘플에서 형성된 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 역가는 72시간 후 일관되게 대략 0.6 g이었기 때문에, 이 실험에서 대조 샘플을 사용하지 않았다.

각각의 시간 간격으로, 투석 튜브에서 형성된 폴리 (α 1, 3 글루칸) 고형물을 실시예 4에서 설명한 바와 같이 단리하였다. 다양한 시간 간격으로 효소 반응액에서 수득된 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 생성된 건조 중량을 표 3에 나타낸다.

상기 결과는, 효소 반응을 더욱 긴 시간 (예를 들어, 72시간) 동안 진행시킴에 따라 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 생성량이 유의하게 향상됨을 명백하게 보여주었다.

SEQUENCE LISTING <110> DuPont John, O'Brien P Mark, Payne S <120> High titer production of poly (a 1,3 glucan) <130> CL5252 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4434 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> codon-optimized gtfj gene from Streptococcus salivarius <400> 1 atggacgaaa cgcaggataa gaccgtgacg cagagcaaca gcggcaccac cgcttccctg 60 gtcactagcc ctgaagccac gaaagaggcg gacaaacgca cgaacactaa agaggccgac 120 gttctgacgc ctgcaaaaga aacgaacgca gtcgagactg cgaccaccac taacacccag 180 gcgacggcgg aggccgccac gaccgcgacc accgcggacg tcgcggtggc tgcggtgccg 240 aacaaagaag cggtcgttac cacggatgct ccggcggtca cgaccgagaa agcggaagaa 300 cagccggcta ccgttaaagc agaagtcgtc aatacggaag tgaaagcgcc ggaagcggct 360 ctgaaagaca gcgaggttga ggcagcgctg agcctgaaga acatcaagaa cattgatggc 420 aagtattact atgttaatga ggatggcagc cacaaagaga atttcgctat taccgtgaat 480 ggccagctgc tgtactttgg taaagacggt gcgctgacgt cctctagcac gtattctttt 540 accccaggca ctaccaatat cgtggacggt tttagcatta acaaccgcgc ttacgacagc 600 agcgaggcga 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tggggtcagg tgggaccacc gcgctactgc 6240 cgccaggcaa acaaggggtg ttatgagcca tattcaggta taaatgggct cgcgataatg 6300 ttcagaattg gttaattggt tgtaacactg acccctattt gtttattttt ctaaatacat 6360 tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 6420 aggaagaata tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 6480 tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 6540 ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 6600 tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 6660 gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 6720 aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 6780 agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 6840 acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 6900 actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 6960 accacgatgc ctgtagcgat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 7020 actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 7080 cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatccgg agccggtgag 7140 cgtggttctc gcggtatcat cgcagcgctg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 7200 gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 7260 ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa gcggcgcgcc atcgaatggc gcaaaacctt 7320 tcgcggtatg gcatgatagc gcccggaaga gagtcaattc agggtggtga atatgaaacc 7380 agtaacgtta tacgatgtcg cagagtatgc cggtgtctct tatcagaccg tttcccgcgt 7440 ggtgaaccag gccagccacg tttctgcgaa aacgcgggaa aaagtggaag cggcgatggc 7500 ggagctgaat tacattccca accgcgtggc acaacaactg gcgggcaaac agtcgttgct 7560 gattggcgtt gccacctcca gtctggccct gcacgcgccg tcgcaaattg tcgcggcgat 7620 taaatctcgc gccgatcaac tgggtgccag cgtggtggtg tcgatggtag aacgaagcgg 7680 cgtcgaagcc tgtaaagcgg cggtgcacaa tcttctcgcg caacgcgtca gtgggctgat 7740 cattaactat ccgctggatg accaggatgc cattgctgtg gaagctgcct gcactaatgt 7800 tccggcgtta tttcttgatg tctctgacca gacacccatc aacagtatta ttttctccca 7860 tgaggacggt acgcgactgg gcgtggagca tctggtcgca ttgggtcacc agcaaatcgc 7920 gctgttagcg ggcccattaa gttctgtctc ggcgcgtctg cgtctggctg gctggcataa 7980 atatctcact cgcaatcaaa ttcagccgat agcggaacgg gaaggcgact ggagtgccat 8040 gtccggtttt caacaaacca tgcaaatgct gaatgagggc atcgttccca ctgcgatgct 8100 ggttgccaac gatcagatgg cgctgggcgc aatgcgcgcc attaccgagt ccgggctgcg 8160 cgttggtgcg gatatctcgg tagtgggata cgacgatacc gaagatagct catgttatat 8220 cccgccgtta accaccatca aacaggattt tcgcctgctg gggcaaacca gcgtggaccg 8280 cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat cagctgttgc cagtctcact 8340 ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 8400 cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtga 8455 <210> 3 <211> 1518 <212> PRT <213> Streptococcus salivarius <400> 3 Met Glu Asn Lys Ile His Tyr Lys Leu His Lys Val Lys Lys Gln Trp 1 5 10 15 Val Thr Ile Ala Val Ala Ser Val Ala Leu Ala Thr Val Leu Gly Gly 20 25 30 Leu Ser Val Thr Thr Ser Ser Val Ser Ala Asp Glu Thr Gln Asp Lys 35 40 45 Thr Val Thr Gln Ser Asn Ser Gly Thr Thr Ala Ser Leu Val Thr Ser 50 55 60 Pro Glu Ala Thr Lys Glu Ala Asp Lys Arg Thr Asn Thr Lys Glu Ala 65 70 75 80 Asp Val Leu Thr Pro Ala Lys Glu Thr Asn Ala Val Glu Thr Ala Thr 85 90 95 Thr Thr Asn Thr Gln Ala Thr Ala Glu Ala Ala Thr Thr Ala Thr Thr 100 105 110 Ala Asp Val Ala Val Ala Ala Val Pro Asn Lys Glu Ala Val Val Thr 115 120 125 Thr Asp Ala Pro Ala Val Thr Thr Glu Lys Ala Glu Glu Gln Pro Ala 130 135 140 Thr Val Lys Ala Glu Val Val Asn Thr Glu Val Lys Ala Pro Glu Ala 145 150 155 160 Ala Leu Lys Asp Ser Glu Val Glu Ala Ala Leu Ser Leu Lys Asn Ile 165 170 175 Lys Asn Ile Asp Gly Lys Tyr Tyr Tyr Val Asn Glu Asp Gly Ser His 180 185 190 Lys Glu Asn Phe Ala Ile Thr Val Asn Gly Gln Leu Leu Tyr Phe Gly 195 200 205 Lys Asp Gly Ala Leu Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Phe Thr Pro Gly 210 215 220 Thr Thr Asn Ile Val Asp Gly Phe Ser Ile Asn Asn Arg Ala Tyr Asp 225 230 235 240 Ser Ser Glu Ala Ser Phe Glu Leu Ile Asp Gly Tyr Leu Thr Ala Asp 245 250 255 Ser Trp Tyr Arg Pro Ala Ser Ile Ile Lys Asp Gly Val Thr Trp Gln 260 265 270 Ala Ser Thr Ala Glu Asp Phe Arg Pro Leu Leu Met Ala Trp Trp Pro 275 280 285 Asn Val Asp Thr Gln Val Asn Tyr Leu Asn Tyr Met Ser Lys Val Phe 290 295 300 Asn Leu Asp Ala Lys Tyr Ser Ser Thr Asp Lys Gln Glu Thr Leu Lys 305 310 315 320 Val Ala Ala Lys Asp Ile Gln Ile Lys Ile Glu Gln Lys Ile Gln Ala 325 330 335 Glu Lys Ser Thr Gln Trp Leu Arg Glu Thr Ile Ser Ala Phe Val Lys 340 345 350 Thr Gln Pro Gln Trp Asn Lys Glu Thr Glu Asn Tyr Ser Lys Gly Gly 355 360 365 Gly Glu Asp His Leu Gln Gly Gly Ala Leu Leu Tyr Val Asn Asp Ser 370 375 380 Arg Thr Pro Trp Ala Asn Ser Asp Tyr Arg Arg Leu Asn Arg Thr Ala 385 390 395 400 Thr Asn Gln Thr Gly Thr Ile Asp Lys Ser Ile Leu Asp Glu Gln Ser 405 410 415 Asp Pro Asn His Met Gly Gly Phe Asp Phe Leu Leu Ala Asn Asp Val 420 425 430 Asp Leu Ser Asn Pro Val Val Gln Ala Glu Gln Leu Asn Gln Ile His 435 440 445 Tyr Leu Met Asn Trp Gly Ser Ile Val Met Gly Asp Lys Asp Ala Asn 450 455 460 Phe Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val Asp Ala Asp Met 465 470 475 480 Leu Gln Leu Tyr Thr Asn Tyr Phe Arg Glu Tyr Tyr Gly Val Asn Lys 485 490 495 Ser Glu Ala Asn Ala Leu Ala His Ile Ser Val Leu Glu Ala Trp Ser 500 505 510 Leu Asn Asp Asn His Tyr Asn Asp Lys Thr Asp Gly Ala Ala Leu Ala 515 520 525 Met Glu Asn Lys Gln Arg Leu Ala Leu Leu Phe Ser Leu Ala Lys Pro 530 535 540 Ile Lys Glu Arg Thr Pro Ala Val Ser Pro Leu Tyr Asn Asn Thr Phe 545 550 555 560 Asn Thr Thr Gln Arg Asp Glu Lys Thr Asp Trp Ile Asn Lys Asp Gly 565 570 575 Ser Lys Ala Tyr Asn Glu Asp Gly Thr Val Lys Gln Ser Thr Ile Gly 580 585 590 Lys Tyr Asn Glu Lys Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Asn Tyr Val Phe Ile 595 600 605 Arg Ala His Asp Asn Asn Val Gln Asp Ile Ile Ala Glu Ile Ile Lys 610 615 620 Lys Glu Ile Asn Pro Lys Ser Asp Gly Phe Thr Ile Thr Asp Ala Glu 625 630 635 640 Met Lys Gln Ala Phe Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Met Leu Ser Ser Asp 645 650 655 Lys Lys Tyr Thr Leu Asn Asn Ile Pro Ala Ala Tyr Ala Val Met Leu 660 665 670 Gln Asn Met Glu Thr Ile Thr Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr 675 680 685 Asp Asp Gly His Tyr Met Glu Thr Lys Ser Pro Tyr Tyr Asp Thr Ile 690 695 700 Val Asn Leu Met Lys Ser Arg Ile Lys Tyr Val Ser Gly Gly Gln Ala 705 710 715 720 Gln Arg Ser Tyr Trp Leu Pro Thr Asp Gly Lys Met Asp Asn Ser Asp 725 730 735 Val Glu Leu Tyr Arg Thr Asn Glu Val Tyr Thr Ser Val Arg Tyr Gly 740 745 750 Lys Asp Ile Met Thr Ala Asn Asp Thr Glu Gly Ser Lys Tyr Ser Arg 755 760 765 Thr Ser Gly Gln Val Thr Leu Val Ala Asn Asn Pro Lys Leu Asn Leu 770 775 780 Asp Gln Ser Ala Lys Leu Asn Val Glu Met Gly Lys Ile His Ala Asn 785 790 795 800 Gln Lys Tyr Arg Ala Leu Ile Val Gly Thr Ala Asp Gly Ile Lys Asn 805 810 815 Phe Thr Ser Asp Ala Asp Ala Ile Ala Ala Gly Tyr Val Lys Glu Thr 820 825 830 Asp Ser Asn Gly Val Leu Thr Phe Gly Ala Asn Asp Ile Lys Gly Tyr 835 840 845 Glu Thr Phe Asp Met Ser Gly Phe Val Ala Val Trp Val Pro Val Gly 850 855 860 Ala Ser Asp Asn Gln Asp Ile Arg Val Ala Pro Ser Thr Glu Ala Lys 865 870 875 880 Lys Glu Gly Glu Leu Thr Leu Lys Ala Thr Glu Ala Tyr 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1085 1090 1095 Glu Arg Gly Val Gly Tyr Val Leu Ser Asp Glu Ala Thr Gly Lys 1100 1105 1110 Tyr Phe Thr Val Thr Lys Glu Gly Asn Phe Ile Pro Leu Gln Leu 1115 1120 1125 Thr Gly Lys Glu Lys Val Ile Thr Gly Phe Ser Ser Asp Gly Lys 1130 1135 1140 Gly Ile Thr Tyr Phe Gly Thr Ser Gly Thr Gln Ala Lys Ser Ala 1145 1150 1155 Phe Val Thr Phe Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Phe Asp Ala Arg Gly 1160 1165 1170 His Met Val Thr Asn Ser Glu Tyr Ser Pro Asn Gly Lys Asp Val 1175 1180 1185 Tyr Arg Phe Leu Pro Asn Gly Ile Met Leu Ser Asn Ala Phe Tyr 1190 1195 1200 Ile Asp Ala Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Asn Ser Lys Gly Gln 1205 1210 1215 Met Tyr Lys Gly Gly Tyr Thr Lys Phe Asp Val Ser Glu Thr Asp 1220 1225 1230 Lys Asp Gly Lys Glu Ser Lys Val Val Lys Phe Arg Tyr Phe Thr 1235 1240 1245 Asn Glu Gly Val Met Ala Lys Gly Val Thr Val Ile Asp Gly Phe 1250 1255 1260 Thr Gln Tyr Phe Gly Glu Asp Gly Phe Gln Ala Lys Asp Lys Leu 1265 1270 1275 Val Thr Phe Lys Gly Lys Thr Tyr Tyr Phe Asp Ala His Thr Gly 1280 1285 1290 Asn Gly Ile Lys Asp Thr Trp Arg Asn Ile Asn Gly Lys Trp Tyr 1295 1300 1305 Tyr Phe Asp Ala Asn Gly Val Ala Ala Thr Gly Ala Gln Val Ile 1310 1315 1320 Asn Gly Gln Lys Leu Tyr Phe Asn Glu Asp Gly Ser Gln Val Lys 1325 1330 1335 Gly Gly Val Val Lys Asn Ala Asp Gly Thr Tyr Ser Lys Tyr Lys 1340 1345 1350 Glu Gly Phe Gly Glu Leu Val Thr Asn Glu Phe Phe Thr Thr Asp 1355 1360 1365 Gly Asn Val Trp Tyr Tyr Ala Gly Ala Asn Gly Lys Thr Val Thr 1370 1375 1380 Gly Ala Gln Val Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Asn Ala Asp 1385 1390 1395 Gly Ser Gln Val Lys Gly Gly Val Val Lys Asn Ala Asp Gly Thr 1400 1405 1410 Tyr Ser Lys Tyr Asn Ala Ser Thr Gly Glu Arg Leu Thr Asn Glu 1415 1420 1425 Phe Phe Thr Thr Gly Asp Asn Asn Trp Tyr Tyr Ile Gly Ala Asn 1430 1435 1440 Gly Lys Ser Val Thr Gly Glu Val Lys Ile Gly Asp Asp Thr Tyr 1445 1450 1455 Phe Phe Ala Lys Asp Gly Lys Gln Val Lys Gly Gln Thr Val Ser 1460 1465 1470 Ala Gly Asn Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Tyr Gly Asp Ser Gly Lys 1475 1480 1485 Arg Ala Val Ser Thr Trp Ile Glu 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Claims

반투과성 막에 의해 분리된 2개의 챔버를 포함하는 반응 시스템에서 폴리 (α 1, 3 글루칸)을 제조하는 방법으로서,
a) 제1 챔버는 i) 수크로스, 및 ii) 적어도 하나의 글루코실트랜스퍼라아제 효소를 포함하는 효소 반응액을 포함하며;
b) 효소 반응액과 접촉 상태로 있는 반투과성 막 - 여기서, 상기 반투과성 막은 프룩토스에 대해서는 투과성이지만 폴리 (α 1, 3 글루칸)에 대해서는 불투과성임 - 에 의해 제1 챔버로부터 분리된 제2 챔버는 폴리 (α 1, 3 글루칸) 및 상기 적어도 하나의 글루코실트랜스퍼라아제 효소를 제1 챔버 내에 보유하면서 프룩토스 및 다른 저분자량 부분(moiety)의 연속 제거를 용이하게 하는 방법.
제1항에 있어서, 효소 반응액을 20℃ 내지 25℃의 온도로 유지하는 방법.
제1항에 있어서, 적어도 하나의 프라이머를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 반투과성 막은 폴리 (α 1, 3 글루칸)의 리터당 30 g 내지 리터당 200 g의 범위의 농도로의 축적을 용이하게 하는 방법.
제1항에 있어서, 반투과성 막의 분자량 컷오프(cut-off)는 12,000 내지 100,000 Da인 방법.
제5항에 있어서, 반투과성 막은 투석관인 방법.
제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 글루코실트랜스퍼라아제 효소는 연쇄상 구균으로부터 유래되는 방법.
제7항에 있어서, 상기 적어도 하나의 글루코실트랜스퍼라아제 효소는 gtfJ, gtfB, gtfC 및 gtfI로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제7항에 있어서, 글루코실트랜스퍼라아제 효소는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 유래의 것인 방법.
제9항에 있어서, 스트렙토코커스 살리바리우스의 글루코실트랜스퍼라아제 효소는 gtfJ인 방법.
제3항에 있어서, 상기 적어도 하나의 프라이머는 덱스트란인 방법.
제1항에 있어서, 글루코실트랜스퍼라아제 효소는 프라이머-비의존성 효소인 방법.
제1항에 있어서, 글루코실트랜스퍼라아제 효소는 프라이머-의존성 효소인 방법.
제1항에 있어서, 하나 초과의 글루코실트랜스퍼라아제 효소가 효소 반응액에 존재하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 하나 초과의 글루코실트랜스퍼라아제 효소는 적어도 하나의 프라이머-의존성 효소와 적어도 하나의 프라이머-비의존성 효소의 혼합물을 포함하는 방법.