KR20140054288A - Nedd8-활성화 효소의 억제제 - Google Patents

Abstract

Nedd8-활성화 효소(NAE)의 억제제, 즉 화합물 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트 및 이의 약학적으로 허용되는 염인 화학 물질; 이의 고체 형태; 및 이의 프로드럭이 개시되어 있다. 암과 같은 질환을 치료하기 위한 화학 물질을 사용하는 방법이 또한 개시되어 있다.

Description

NEDD8-활성화 효소의 억제제{INHIBITORS OF NEDD8-ACTIVATING ENZYME}

본 발명은 다양한 질환, 특히 암 및 염증성 질환을 비롯한 세포 증식 질환의 치료를 위한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 NEDD8-활성화 효소의 활성을 억제하는 화합물을 제공한다.

유비퀴틴 유사 분자(ubiquitin-like molecule: ubl)에 의한 단백질의 번역후 변형은 세포 분열, 세포 신호전달 및 면역 반응을 비롯한 많은 생물학적 과정을 조절하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 세포 내 중요한 조절 과정이다. Ubl은 ubl의 C 말단 글라이신과의 아이소펩타이드 결합을 통해 표적 단백질 위의 라이신에 공유 결합된 작은 단백질이다. 유비퀴틴 유사 분자는 표적 단백질의 분자 표면을 바꾸고 단백질-단백질 상호작용, 효소 활성, 안정성 및 표적의 세포내 편재화와 같은 특성에 영향을 미칠 수 있다.

유비퀴틴 및 다른 ubl은 ubl의 C 말단 글라이신과의 아실-아데닐레이트 중간체의 형성을 촉매화하는 특이적 E1 효소에 의해 활성화된다. 이후, 활성화된 ubl 분자는 티오에스터 결합 중간체의 형성을 통해 E1 효소 내의 촉매 시스테인 잔기로 전달된다. E1-ubl 중간체 및 E2는 회합되어 티오에스터 교환을 발생시키고, 여기서 ubl은 E2의 활성 부위 시스테인으로 전달된다. 이후, ubl은 표적 단백질에서 라이신 측쇄의 아미노 기와의 아이소펩타이드 결합 형성을 통해, 직접 또는 E3 리가제와 함께, 표적 단백질에 접합된다.

ubl 변형의 생물학적 결과는 해당 표적에 따라 달라진다. 유비퀴틴은 ubl을 가장 잘 규명짓는 것이고, 유비퀴틴화의 변형의 결과는 26S 프로테아좀(proteasome)에 의한 폴리-유비퀴틴화 단백질의 분해이다. 유비퀴틴은 이의 특이적 E1 활성화 효소, Uba1(유비퀴틴 활성화 효소, UAE), E2의 패밀리의 유래의 접합 효소 및 E3의 고리 또는 HECT 클래스 중 어느 하나의 유래의 유비퀴틴 리가제를 포함하는 효소 캐스케이드를 통해 이의 표적 단백질에 접합된다. 문헌[Huang et al., Oncogene, 23:1958-71 (2004)]을 참조한다. 현재 알려진 40개 초과의 E2 및 100개 초과의 E3의, E2 단백질과 E3 단백질의 특정 조합에 의해 표적 특이성은 조절된다. 유비퀴틴 이외에, 10개의 유비퀴틴 유사 단백질이 존재하고, 각각은 특이적 E1 활성화 효소에 의해 활성화되고 유사하지만 구별되는 하향 접합 경로를 통해 프로세싱되는 것으로 생각된다. E1 활성화 효소가 확인된 다른 ubl로는 Nedd8(APPBP1-Uba3), ISG15(UBE1L) 및 SUMO 패밀리(Aos1-Uba2)를 들 수 있다.

ubl Nedd8은 이종이합체 Nedd8-활성화 효소(APPBP1-Uba3)(NAE)에 의해 활성화되고 단일 E2(Ubc12)로 전달되어, 결국에는 쿨린(cullin) 단백질에 결찰된다. 네딜화(neddylation)의 작용은 유비퀴틴화에 관여하는 쿨린계 유비퀴틴 리가제의 활성화 및 이에 따른 p27 및 I-κB를 포함하는 세포 신호전달 단백질 및 많은 세포주기의 교대이다. 문헌[Pan et al., Oncogene. 23:1985-97 (2004)]을 참조한다. ubl SUMO는 이종이합체 sumo 활성화 효소(Aos1-Uba2)(SAE)에 의해 활성화되고 단일 E2(Ubc9)에 전달된 후, 여러 E3 리가제와 배위되어, 결국에는 표적 단백질을 수모화(sumoylation)시킨다. Sumo 변형은 표적 단백질의 세포내 편재화에 영향을 미칠 수 있고, SUMO 패밀리 구성원에 의해 변형된 단백질은 핵 수송, 신호 전달 및 스트레스 반응에 관여한다. 문헌[Seeler and Dejean, Nat Rev Mol Cell Biol. 4:690-9, (2003)]을 참조한다. 수모화의 기능은 전사 조절에 관여하는 세포 신호전달 경로(예를 들면, 사이토카인, WNT, 성장 인자 및 스테로이드 호르몬 신호전달)의 활성화; 및 유전체 완전성(예를 들면, DNA 복제, DNA 손상, 재조합 및 보수에 대한 반응)의 조절에 관여하는 경로를 들 수 있다. 문헌[Muller et al, Oncogene. 23:1998-2006, (2004)]을 참조한다. 다른 ubl(예를 들면, ISG15, FAT10, Apg12p)은 여전히 생물학적 기능이 조사 중에 있다.

E1 활성화 효소 활성을 통해 조절되는 중요한 특정 경로는 유비퀴틴-프로테아좀 경로(ubiquitin-proteasome pathway: UPP)이다. 상기 기재된 바대로, 효소 UAE 및 NAE는 유비퀴틴화 캐스케이드에서 2의 상이한 단계에서 UPP를 조절한다. UAE는 캐스케이드의 제1 단계에서 유비퀴틴을 활성화하는 반면, NAE는 Nedd8의 활성화를 통해 쿨린계 리가제의 활성화를 책임지고, 결국 특정한 표적 단백질에 유비퀴틴을 최종적으로 전달하는 데 필요하다. 정상 세포 유지에 기능적 UPP 경로가 필요하다. UPP는 전사, 세포주기 진행 및 아폽토시스(이들 모두 종양 세포를 비롯한 질환 상태에 중요함)에 관여하는 많은 중요한 조절 단백질의 교대에 중추적 역할을 한다. 예를 들면, 문헌[King et al., Science 274: 1652-1659 (1996); Vorhees et al., Clin. Cancer Res., 9: 6316-6325 (2003); 및 Adams et al., Nat. Rev. Cancer, 4: 349-360 (2004)]을 참조한다. 세포 증식은 UPP의 억제에 특히 민감하다. 문헌[Drexler, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94: 855-860 (1977)]을 참조한다. 발암에서의 UPP 경로의 역할은 잠재적 항암 치료로서 프로테아좀 억제를 조사하게 한다. 예를 들면, 벨케이드(VELCADE)(등록상표)(보르테조밉)에 의한 26S 프로테아좀의 억제에 의한 UPP 경로의 조절은 특정 암에서 효과적인 치료인 것으로 입증되었고, 1 이상의 선행 치료로 받은 다발성 골수종 및 외투 세포 림프종 환자의 치료에 승인받았다. NAE 및 UAE 활성을 하향조절하는 쿨린계 유비퀴틴 리가제에 의해 수치가 조절되는 단백질의 예로는 CDK 억제제 p27^Kip1 및 NFκB, IκB의 억제제를 들 수 있다. 문헌[Podust et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 4579-4584 (2000), 및 Read et al., Mol. Cell Biol., 20: 2326-2333 (2000)]을 참조한다. p27의 분해 억제는 세포주기의 G1상 및 S상을 통해 세포의 진행을 차단하는 것으로 예상된다. IκB의 분해 방해는 NF-κB의 핵 편재화, 악성 표현형과 관련된 다양한 NF-κB 의존적 유전자의 전사 및 표준 세포독성 치료제에 대한 내성을 방지해야 한다. 추가로, NF-κB는 여러 전염증성 중재자의 발현에 중요한 역할을 하며, 이는 염증성 질환에서 이 억제제의 역할을 시사한다. 더욱이, UPP의 억제는 예를 들면 류마티스성 관절염, 천식, 다발성 경화증, 건선 및 재관류 손상을 포함하는 염증성 질환; 예를 들면, 파킨슨병, 알츠하이머병, 3자 암호 반복 질환을 포함하는 신경퇴행성 질환; 신경병증 통증; 허혈 질환, 예를 들면 뇌졸중, 경색증, 신장 질환; 및 악액질과 같은 추가의 치료에 대한 유용한 표적으로 연루된다. 예를 들면, 문헌[Elliott and Ross, Am. J. Clin. Pathol., 116:637-46 (2001); Elliott et al., J. Mol. Med., 81:235-45 (2003); Tarlac and Storey, J. Neurosci. Res. 74: 406-416 (2003); Mori et al., Neuropath. Appl. Neurobiol., 31: 53-61 (2005); Manning, Curr. Pain Headache Rep., 8: 192-8 (2004); Dawson and Dawson, Science, 302: 819-822 (2003); Kukan, J. Physiol. Pharmacol., 55: 3-15 (2004); Wojcik and DiNapoli, Stroke, 35:1506-18 (2004); Lazarus et al., Am J Physiol., 27:E332-41 (1999)]을 참조한다.

E1 활성화 효소의 표적화는 세포 신호전달 및 세포 분열의 완전성을 유지하는 데 중요한 다양한 생화학 경로를 방해하는 독특한 기회를 제공한다. E1 활성화 효소는 ubl 접합 경로의 제1 단계에서 작용하여, E1 활성화 효소의 억제는 ubl 변형의 하향 생물학적 결과를 특이적으로 조절한다. 그러므로, 이 활성화 효소의 억제 및 그 결과로 생긴 ubl 접합의 하향 효과의 억제는 질환 기전에 중요한 세포 분열, 세포 신호전달 및 세포 생리학의 몇몇 양태의 완전성을 방해하는 방법을 나타낸다. 따라서, 다양한 세포 작용의 조절물질인 UAE, NAE 및 SAE와 같은 E1 효소는 질환 및 장애의 치료에 대한 새로운 접근법의 확인을 위한 잠재적으로 중요한 치료학적 표적이다.

미국 특허 출원 제11/346,469호(2006년 2월 2일 출원, 공보 US 2006/0189636) 및 국제 특허 출원 제PCT/US06/04637호(2006년 2월 2일 출원, 공보 WO 2006/084281)(모두 "크리출리(Critchley) 등")는 하기 화학식의 다양한 E1 효소 억제제를 보고하고 있다:

상기 식 중, A는

,

,

,

,

,

또는

이다.

이 출원은 본원의 대상인 화학 물질(chemical entity)을 보고하지는 않는다.

미국 특허 출원 제11/700,614호(2007년 1월 31일 출원, 공보 US 2007/0191293) 및 국제 특허 출원 제PCT/US07/02560호(2007년 1월 31일 출원, 공보 WO 2007/092213)(모두 "랑스톤(Langston) 등")는 하기 화학식의 다양한 E1 효소 억제제를 보고하고 있다:

상기 식 중, A는

,

,

,

,

,

또는

이다.

이 출원은 본원의 대상인 화학 물질을 보고하지는 않는다.

미국 특허 출원 제11/890,338호(2007년 8월 6일 출원, 공보 US 2008/0051404) 및 국제 특허 출원 제PCT/US07/17463호(2007년 8월 6일 출원, 공보 WO 2008/019124)(모두 "클라이본(Claiborne) 등")는 하기 화학식의 다양한 E1 효소 억제제를 보고하고 있다:

상기 식 중, 고리 A는, 5원 또는 6원 아릴, 헤테로아릴, 지환족 또는 헤테로사이클릭 고리에 임의로 축합된, 6원 질소 함유 헤테로아릴 고리이고; W는 -CH_2-, -CHF-, -CF_2-, -CH(R¹)-, -CF(R¹)-, -NH-, -N(R¹)-, -O-, -S- 또는 -NHC(O)-이다.

이 출원은 본원의 대상인 화학 물질을 보고하지는 않는다.

이때, 정부 보건 기관은 E1 활성화 효소의 억제제를 승인하지 않았다. NAE와 같은 E1 활성화 효소의 억제제에 대한 수요가 여전히 있다.

일 양태에서, 본 발명은 화합물 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}-메틸 설파메이트(I-216) 및 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 이의 프로드럭인 화학 물질에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 화합물 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트(I-216) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이의 프로드럭인 화학 물질 및 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 화합물 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트(I-216) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 고체 형태에 관한 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 화합물 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)-옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트(I-216) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이의 프로드럭인 화학 물질을 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법에 관한 것이다.

도 1은 30㎎/㎏에서 단일 피하 투여 후 HCT116 종양 이종이식을 보유하는 암컷 Ncr 누드 마우스에서 {(1S,2S,4R)-2-하이드록시-4-[(6-{[(1R,2S)-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]사이클로펜틸}메틸 설파메이트(I-115)의 약력학적 및 약동학적 매개변수를 나타낸다.
도 2는 10㎎/㎏에서 단일 피하 투여 후 HCT116 종양 이종이식을 보유하는 암컷 Ncr 누드 마우스에서 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}-메틸 설파메이트(I-216)의 약력학적 및 약동학적 매개변수를 나타낸다.
도 3은 30㎎/㎏에서 단일 피하 투여 후 HCT116 종양 이종이식을 보유하는 암컷 Ncr 누드 마우스에서 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}-메틸 설파메이트(I-216)의 약력학적 및 약동학적 매개변수를 나타낸다.
도 4는 결정질 I형 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}-메틸 설파메이트(I-216) 하이드로클로라이드의 x선 분말 회절(x-ray powder diffraction: XRPD) 패턴을 나타낸다.
도 5는 결정질 I형 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}-피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}-메틸 설파메이트(I-216) 하이드로클로라이드의 시차 주사 열량측정법(differential scanning calorimetry: DSC) 온도기록도를 나타낸다.
도 6은 결정질 I형 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)-옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}-메틸 설파메이트(I-216) 하이드로클로라이드의 (thermogravimetric analysis: TGA) 온도기록도를 나타낸다.
도 7은 하기 실시예 2에서 제조된 결정질 I형 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}-메틸 설파메이트(I-216) 하이드로클로라이드의 x선 분말 회절(XRPD) 패턴을 나타낸다.
도 8은 하기 실시예 2에서 제조된 결정질 I형 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}-피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}-메틸 설파메이트(I-216) 하이드로클로라이드의 시차 주사 열량측정법(DSC) 온도기록도를 나타낸다.
도 9는 하기 실시예 2에서 제조된 결정질 I형 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)-옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}-메틸 설파메이트(I-216) 하이드로클로라이드의 열중량 분석(TGA) 온도기록도를 나타낸다.
도 10은 하기 실시예 9에서 제조된 결정질 II형 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}-메틸 설파메이트(I-216) 하이드로클로라이드의 x선 분말 회절(XRPD) 패턴을 나타낸다.

Nedd8-활성화 효소(NAE)의 억제제로서 효과적인 화학 물질이 제공된다. 화학 물질은 실험실내 및 생체내 NAE 활성을 억제하는 데 유용하고 세포 증식의 질환, 특히 암 및 NAE 활성과 관련된 다른 질환을 치료하는 데 유용하다. 화학 물질은 하기 화합물 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]-아미노}-피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시-사이클로펜틸}메틸 설파메이트(본 명세서에 "I-216"라 칭함) 및 비공유로 회합된 분자 집합체이다:

따라서, 화합물 I-216을 포함하는 화학 물질은, 예를 들면 유리 화합물 I-216, I-216의 약학적으로 허용되는 염, I-216의 약학적으로 허용되는 용매화물 및 I-216의 약학적으로 허용되는 염의 약학적으로 허용되는 용매화물을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 화학 물질은 유리 화합물 I-216 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다. 몇몇 실시양태에서, 화학 물질은 I-216의 약학적으로 허용되는 염이다. 몇몇 실시양태에서, 화학 물질은 유리 화합물 I-216 또는 이의 약학적으로 허용되는 용매화물이다. 몇몇 실시양태에서, 화학 물질은 I-216의 약학적으로 허용되는 염의 약학적으로 허용되는 용매화물이다.

클라이본 등은 NAE를 포함하는 E1 효소의 다양한 억제제를 보고하고 있다. 예를 들면, 클라이본 등은 하기 표 1의 화합물이 NAE 검정(클라이본 실시예 137)에서 500nM 이하의 IC₅₀ 값을 나타낸다는 것을 보고하고 있다.

클라이본 등은 하기 표 2의 화합물이 이 NAE 검정(클라이본 실시예 137)에서 500nM 초과 10μM 이하의 IC₅₀ 값을 나타낸다는 것을 추가로 보고하고 있다.

클라이본 등은 또한 하기 표 3의 화합물이 이 NAE 검정(클라이본 실시예 137)에서 10μM 초과의 IC₅₀ 값을 나타낸다는 것을 보고하고 있다.

클라이본 등은 또한 실시예 137에서 sumo-활성화 효소(SAE) 및 유비퀴틴-활성화 효소(UAE) HTRF 검정을 보고하고 있다. 그러나, IC₅₀ 값은 기록되어 있지 않다.

도면에 도시된 것처럼, 10㎎/㎏로 투여된 I-216의 혈장 AUC(도 1)는 30㎎/㎏로 투여된 I-115에 대해 관찰되는 것에 필적하고(도 2), 30㎎/㎏로 투여된 I-216에 대해 관찰된 AUC의 거의 절반이다(도 3). 따라서, 화합물 I-216은 I-115보다 NAE의 2배 내지 3배 더 강력한 억제제인 것으로 생각된다.

용어 "약"은 본 명세서에서, 대략, 범위에서, 거의 또는 쯤을 의미하기 위해 사용된다. 용어 "약"은, 숫자 범위와 함께 사용될 때, 기재된 숫자 값보다 크거나 적게 경계를 확장하여 이 범위를 변경한다. 달리 기재되지 않은 한, 용어 "약"은 본 명세서에서 10% 변이로 기술된 값보다 크거나 적게 숫자 값을 변경하기 위해 사용된다.

달리 기재되지 않은 한, 용어 "포함한다" 및 "포함하는" 등은 제한이 아닌 것으로 의도된다. 예를 들면, "포함하는"은 포함하는을 의미하지만, 달리 기재되지 않은 한, 이것으로 제한되지 않는다.

상대 입체화학이 정의된 본 명세서에 기재된 화합물에서, 화합물의 부분입체이성체 순도는 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99%이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "부분입체이성체 순도"는 존재하는 모든 부분입체이성체의 총량의 백분율로 표시되는 도시된 상대 입체화학을 갖는 화합물의 양을 의미한다.

바람직하게는, 화합물의 거울상이성질체 순도는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99%이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "거울상이성질체 순도"는 도시된 화합물 및 이의 거울상이성질체의 총량의 백분율로 표시되는 도시된 절대 입체화학을 갖는 화합물의 양을 의미한다.

부분입체이성체 및 거울상이성질체 순도를 결정하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 화합물과 이의 부분입체이성체 간을 정량적으로 구별할 수 있는 임의의 분석 방법에 의해 부분입체이성체 순도를 결정할 수 있다. 적합한 분석 방법의 예로는, 제한 없이, 핵 자기 공명 분광학(NMR), 가스 크로마토그래피(GC) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 들 수 있다. 유사하게, 화합물과 이의 거울상이성질체 간을 정량적으로 구별할 수 있는 임의의 분석 방법에 의해 거울상이성질체 순도를 결정할 수 있다. 적합한 분석 방법의 예로는, 제한 없이, 키랄 컬럼 충전 재료를 사용하는 GC 또는 HPLC를 들 수 있다. 광학적으로 풍부한 유도체화제, 예를 들면 모셔(Mosher) 산에 의해 거울상이성질체를 우선 유도체화는 경우 NMR에 의해 또한 이 거울상이성질체를 구별할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 "결정질"은 구성 원자, 분자 또는 이온이 매우 규칙적인 화학 구조를 갖는 규칙적으로 정렬된 반복 3차원 패턴으로 충전된 고체를 의미한다. 특히, 결정질 염은 1 이상의 결정질 형태이다. 본원의 목적을 위해, 용어 "결정질 형태" 및 "다형"은 동의어이고; 이 용어는 상이한 특성(예를 들면, 상이한 XRPD 패턴, 상이한 DSC 스캔 결과)을 갖는 결정 사이를 구별한다. 유사다형은 통상적으로 재료의 상이한 용매화물이고 따라서 이의 특성은 서로 다르다. 따라서, 각각의 구별되는 다형 및 유사다형은 본 명세서에서 구별되는 결정질 형태인 것으로 생각된다.

"실질적으로 결정질"은 적어도 특정한 중량 백분율이 결정질인 염을 의미한다. 특정한 중량 백분율은 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 및 99.9%를 들 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 실질적으로 결정질은 적어도 70% 결정질인 염을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 실질적으로 결정질은 적어도 80% 결정질인 염을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 실질적으로 결정질은 적어도 85% 결정질인 염을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 실질적으로 결정질은 적어도 90% 결정질인 염을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 실질적으로 결정질은 적어도 95% 결정질인 염을 의미한다.

용어 "용매화물 또는 용매화"는 본 발명의 화합물과 1종 이상의 용매 분자의 물리적 회합을 의미한다. 이 물리적 회합은 수소 결합을 포한다. 특정한 경우에, 예를 들면 1종 이상의 용매 분자가 결정질 고체의 결정 격자에 도입될 때 용매화물은 단리될 수 있다. "용매화물 또는 용매화"는 액상 및 단리 가능한 용매화물 둘 다를 포함한다. 대표적인 용매화물은 예를 들면 수화물, 에탄올레이트 및 메탄올레이트를 포함한다.

용어 "수화물"은 용매 분자가 소정의 화학량론적 양으로 존재하는 H₂O인 용매화물을 의미하고, 예를 들면 반수화물, 일수화물, 이수화물 및 삼수화물을 포함한다.

용어 "혼합물"은 배합물의 상 상태(예를 들면, 액체 또는 액체/결정질)와 무관하게 혼합물의 배합 성분을 의미한다.

용어 "시딩"(seeding)은 용액 또는 혼합물이 결정화를 개시하게 하는 결정질 재료의 첨가를 의미한다.

본 발명의 몇몇 실시양태는 I-216 염산염에 관한 것이고, 여기서 이 염산염의 적어도 특정한 중량 백분율은 결정질이다. 몇몇 실시양태에서, 염산염은 실질적으로 결정질이다. 결정질 또는 실질적으로 결정질인 염산염의 예는 염산염의 결정질 형태 또는 상이한 결정질 형태의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 몇몇 실시양태는 염산염에 관한 것이고, 여기서 이 염산염의 적어도 특정한 중량 백분율은 결정질이다. 특정한 중량 백분율은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 및 99.9%를 포함한다. 이 염산염의 특정한 중량 백분율이 결정질일 때, 염산염의 나머지는 염산염의 비결정질 형태이다.

본 발명의 몇몇 실시양태는 결정질 형태 또는 실질적으로 결정질인 형태인 I-216 염산염에 관한 것이다. 결정질 형태는 이 결정질 염산염의 특정한 중량 백분율일 수 있다. 특정한 중량 백분율은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 및 99.9%를 포함한다. 이 염산염의 특정한 중량 백분율이 지칭된 결정질 형태일 때, 염산염의 나머지는, 염산염의 비결정질 형태와 지칭된 결정질 형태를 제외한, 염산염의 1종 이상의 결정질 형태의 몇몇 조합이다. 몇몇 실시양태에서, 염산염은 적어도 90중량%의 결정질 형태이다. 몇몇 실시양태에서, 염산염은 적어도 95중량%의 결정질 형태이다. 몇몇 실시양태에서, 염산염은 적어도 80중량%의 결정질 형태이다. 몇몇 실시양태에서, 염산염은 적어도 85중량%의 결정질 형태이다.

달리 기재되지 않은 한, 염산염의 결정질 형태가 2θ 각도로 제시된 1 이상의 XRPD 피크를 이용하여 확인되는 경우, 각각의 2θ 값은 소정 값±0.2도를 의미하는 것으로 이해된다.

명세서 및 특허청구범위에 걸쳐, 염산염의 결정질 형태가 DSC 프로필(예를 들면, 흡열 전이의 개시, 용융 등)로부터 1 이상의 온도를 이용하여 확인되는 경우, 각각의 온도 값은 소정 값±2℃를 의미하는 것으로 이해된다.

고체 형태

I-216의 염산염의 결정질 1형(1형)을 기술하는 정보를 규명하는 법칙이 본 명세서에 제공된다.

도 4는 CuKα 방사선을 이용하여 얻은 I-216의 염산염의 I형의 x선 분말 회절(XRPD) 패턴을 나타낸다. 도 4에서 확인된 피크는 표 4에 기재된 피크를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, I형은 4.5°, 15.2°, 21.3°, 21.8° 및 24.0°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 한다. 몇몇 실시양태에서, I형은 4.5°, 7.5°, 14.4°, 14.6°, 15.2°, 15.9°, 19.5°, 21.3°, 21.8°, 22.4°, 22.7°, 24.0° 및 24.8°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 한다. 몇몇 실시양태에서, I형은 4.5°, 7.5°, 8.9°, 9.8°, 13.3°, 14.4°, 14.6°, 15.2°, 15.9°, 17.2°, 19.5°, 20.0°, 21.3°, 21.8°, 22.4°, 22.7°, 24.0°, 24.8°, 25.7° 및 26.4°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 한다. 몇몇 실시양태에서, I형은 실질적으로 도 4에 도시된 XRPD 패턴을 특징으로 한다.

몇몇 실시양태에서, I형은 4.5±0.3°의 2θ 각도에서의 기준 피크 및 기준 피크에 비해 10.7°, 16.8°, 17.3° 및 19.5°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 한다. 용어 "기준 피크"는 당업자가 물질의 다형 형태를 알려준다고 생각하는, 즉 기기 노이즈와 구별되는 XRPD 회절도에서의 피크를 의미한다. "상대"는 각각의 피크의 관찰된 2θ 각도가 기준 피크의 2θ 각도 및 그 피크의 상대 2θ 각도의 합이라는 것을 의미한다. 예를 들면, 기준 피크가 4.4°의 2θ 각도를 갖는 경우, 상대 피크는 15.1°, 21.2°, 21.7° 및 23.9°의 2θ 각도를 가질 것이고; 기준 피크가 4.5°의 2θ 각도를 갖는 경우, 상대 피크는 15.2°, 21.3°, 21.8° 및 24.0°의 2θ 각도를 가질 것이고; 기준 피크가 4.6°의 2θ 각도를 갖는 경우, 상대 피크는 15.3°, 21.4°, 21.9° 및 24.1°의 2θ 각도를 가질 것이고, 기타 등등일 것이다. 몇몇 실시양태에서, I형은 4.5±0.3°의 2θ 각도에서의 기준 피크 및 기준 피크에 비해 3.0°, 9.9°, 10.1°, 10.7°, 11.4°, 15.0°, 16.8°, 17.3°, 17.9°, 18.2°, 19.5° 및 20.3°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 한다. 몇몇 실시양태에서, I형은 4.5±0.3°의 2θ 각도에서의 기준 피크 및 기준 피크에 비해 3.0°, 4.4°, 5.3°, 8.8°, 9.9°, 10.1°, 10.7°, 11.4°, 12.7°, 15.0°, 15.5°, 16.8°, 17.3°, 17.9°, 18.2°, 19.5°, 20.3°, 21.2° 및 21.9°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 한다. 당업자가 물질의 다형 형태를 확인시켜 준다고 생각하는 임의의 피크는 기준 피크로서 작용할 수 있고, 이후 상대 피크를 계산할 수 있다. 예를 들면, 기준 피크가 24.0°의 2θ 각도를 갖는 경우, 상대 피크는 기준 피크에 비해 -19.5°, -8.8°, -2.7° 및 -2.2°의 2θ 각도를 가질 것이다. 도 5는 I형의 시차 주사 열량측정법(DSC) 프로필을 나타낸다. DSC 온도기록도는 온도의 함수로서 샘플로부터 열 흐름을 좌표화한 것이고, 온도 속도 변화는 약 10℃/분이다. 몇몇 실시양태에서, I형은 실질적으로 도 5에 도시된 DSC 프로필을 특징으로 한다. 도 5는 약 129.8℃의 개시를 갖는 흡열 사건 및 용융과 결부되는 물 손실에 상응하는 약 135.6℃에서의 피크를 나타낸다. 약 181.6℃의 개시 및 약 195.5℃에서의 피크를 갖는 광역 흡열 및 약 275.3℃의 개시 및 약 275.5℃에서의 피크를 갖는 급격한 흡열이 또한 관찰된다.

도 6은 I-216의 염산염의 I형의 열 중량 분석(TGA) 프로필을 나타낸다. TGA 온도기록도는 온도의 함수로서 샘플의 중량 손실(%)를 좌표화한 것이고, 온도 속도 변화는 약 10℃/분이다. 도 6은 100℃ 내지 150℃에서 대략 3.7%의 중량 손실을 나타내어, I-216 HCl I형이 일수화물이라는 것을 제시한다. 몇몇 실시양태에서, I-216 HCl I형은 실질적으로 도 6에 도시된 TGA 프로필을 특징으로 한다. 칼 피셔(Karl Fischer) 측정은 약 3.5%의 함수량을 나타내어, 추가로 TGA 프로필에 나타난 중량 손실이 물 손실로 인한 것이라는 것을 제시하고, 이는 I형이 일수화물이라는 것을 나타낸다.

도 10은 CuKα 방사선을 이용하여 얻은 I-216의 염산염의 II형의 x선 분말 회절(XRPD) 패턴을 나타낸다. 도 10에서 확인된 피크는 표 5에 기재된 피크를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, II형은 8.7°, 15.2°, 15.7°, 19.6° 및 24.2°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 한다. 몇몇 실시양태에서, II형은 4.3°, 8.7°, 15.2°, 15.7°, 19.6°, 20.0°, 20.8°, 22.5°, 23.1° 및 24.2°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 한다. 몇몇 실시양태에서, II형은 4.3°, 8.7°, 12.4°, 14.5°, 15.2°, 15.7°, 17.3°, 18.2°, 18.5°, 19.6°, 20.0°, 20.8°, 22.0°, 22.5°, 23.1°, 24.2°, 24.7°, 25.7°, 28.2° 및 29.4°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 한다. 몇몇 실시양태에서, II형은 실질적으로 도 10에 도시된 XRPD 패턴을 특징으로 한다.

몇몇 실시양태에서, II형은 8.7±0.3°의 2θ 각도에서의 기준 피크 및 기준 피크에 비해 6.5°, 7.0°, 10.9° 및 15.5°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 한다. 용어 "기준 피크" 및 "상대"는 이전에 기재된 것과 동일한 의미를 갖는다. 몇몇 실시양태에서, II형은 8.7±0.3°의 2θ 각도에서의 기준 피크 및 기준 피크에 비해 -4.4°, 6.5°, 7.0°, 10.9°, 11.3°, 12.1°, 13.8°, 14.4° 및 15.5°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 한다. 몇몇 실시양태에서, II형은 8.7±0.3°의 2θ 각도에서의 기준 피크 및 기준 피크에 비해 -4.4°, 3.7°, 5.8°, 6.5°, 7.0°, 8.6°, 9.5°, 9.8°, 10.9°, 11.3°, 13.3°, 13.8°, 14.4°, 15.5°, 16.0°, 17.0°, 19.5° 및 20.7°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 한다. 당업자가 물질의 다형 형태를 확인시켜 준다고 생각하는 임의의 피크는 기준 피크로서 작용할 수 있고, 이후 상대 피크를 계산할 수 있다. 예를 들면, 기준 피크가 24.2°의 2θ 각도를 갖는 경우, 상대 피크는 기준 피크에 비해 -15.5°, -9.0°, -8.5° 및 -4.6°의 2θ 각도를 가질 것이다.

합성 방법

당업자에 공지된 방법에 의해 및/또는 하기 도시된 반응식 및 하기 실시예를 참조하여 화합물 I-216을 제조할 수 있다. 예시적인 합성 경로가 하기 반응식 1-4 및 하기 실시예에 기재되어 있다.

[반응식 1]

반응식 1은 하기 실시예 1에 추가로 예시된 (1R,2S)-5-클로로-2-메톡시인단-1-아민(8)의 합성을 기술한 것이다. 야콥센(Jacobsen) 촉매를 사용하여 6-클로로-1H-인덴(1)을 에폭시화하여 옥시렌(2)을 생성하였고, 이를 아세토나이트릴 중의 발연 황산으로 처리하여, 물 첨가 및 가열 후 rel-(1R,2S)-1-아미노-5-클로로인단-2-올(3)을 얻었다. D-(-)-만델산을 사용하여 Rel-(1R,2S)-1-아미노-5-클로로인단-2-올(3)을 키랄 분해하여 키랄 보조물질의 제거 후 (1R,2S)-1-아미노-5-클로로인단-2-올(5)을 생성하였다. 프탈산 무수물을 사용하여 (5) 중의 1차 아민의 보호를 성취하여 화합물(6)을 얻었다. 요오드화메틸로 하이드록실 기를 메틸화하여 화합물(7)을 얻고, 이후 이를 하이드라진으로 탈보호하여 원하는 (1R,2S)-5-클로로-2-메톡시인단-1-아민(8)을 생성하였다.

[반응식 2]

반응식 2는 하기 실시예 2에 추가로 예시된 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트 HCl 1형의 합성을 보여준다. 라세미-(9)의 1차 알콜을 tert-뷰틸다이메틸실릴 에터로서 보호하여 화합물(10)을 생성하였고, 이를 아크릴 수지 상의 킨디다 안타르티카(Candida Antartica)를 사용하여 효소 분할하여 99% 초과의 거울상이성질체 과량을 갖는 화합물(11)을 생성하였다. 이후, (11) 중의 제2 알콜을 이의 tert-뷰틸다이메틸실릴 에터로서 보호하여 (12)를 얻었다. 화합물(12)을 윌킨슨(Wilkinson) 촉매의 존재 하에 카테콜 보란으로 처리하여 (13)을 얻고, 이를 4,6-다이클로로피리미딘과 추가로 반응시켜 화합물(14)을 얻었다. (14)의 1차 알콜을 선택적으로 탈보호한 후, (15)와 (1R,2S)- 5-클로로-2-메톡시인단-1-아민(8)의 반응에 의해 분자의 인단 부분을 설치하여 화합물(16)을 얻었다. 화합물(16)을 클로로설폰아마이드와 반응시킨 후, 산성 조건 하에 제2 알콜을 탈보호하여 I-216을 제조하였다. I-216을 아세토나이트릴 중의 염산으로 처리하여 I-216의 염산염의 I형을 얻었다.

[반응식 3]

반응식 3은 하기 실시예 4에 추가로 예시된 (1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-아민 하이드로클로라이드(20)의 제법을 보여준다. 5-클로로-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-온(17)을 산성 조건 하에 트라이메틸오르토포르메이트와 반응시킨 후, 코서 시약 [PhI(OH)(OTs)]로 처리하여 5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-온(18)을 생성하였다. 인데논을 티탄 테트라에톡사이드의 존재 하에 (R)-tert-뷰틸 설핀아마이드로 처리하여 상응하는 설핀아마이드(19)를 얻었다. HPLC에 의해 원치않는 부분입체이성체가 5% 미만으로 검출될 때까지 반응을 진행시켰다. NaBH₄를 사용하여 미정제 설핀아마이드를 환원시켜 1차 아민을 얻고, 이를 염산으로 처리하여 (1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-아민 하이드로클로라이드(20)를 얻었다.

[반응식 4]

반응식 4는 하기 실시예 5에 추가로 예시된 I-216 염산염 I형의 제법에 대한 경로를 보여준다. (1,2R,3,5R)-3-(벤질옥시)-2-(벤질옥시메틸)-6-옥사바이사이클로[3.1.0]헥산(21) 중의 에폭사이드를 리튬 다이아이소프로필아마이드로 처리하여 개환하고, 트라이메틸실릴클로라이드로 처리하여 생성된 음이온을 포획하여 (22)를 얻었다. 수소 및 Pd/BaSO₄ 촉매를 사용하여 이중 결합을 환원시키고 트라이메틸실릴 보호기를 제거하여 제2 알콜(23)을 얻었다. 제2 알콜(23)을 메실화한 후, 테트라뷰틸암모늄 아세테이트, 이어서 수산화나트륨으로 처리하여 (24)를 얻고, 이를 수산화나트륨 및 4,6-다이클로로피리미딘과 반응시켜 중간체(25)를 얻었다. 삼염화붕소를 사용하여 벤질 보호기를 제거하여 (26)를 얻은 후, 130℃ 및 50psi에서 (1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-아민 하이드로클로라이드(20)와 반응시켜 ((1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일아미노)피리미딘-4-일옥시)-2-하이드록시사이클로펜틸)메틸 설파메이트(27)를 형성하였다. 화합물(27) 중의 1차 알콜을 설파메이트화하여 I-216을 얻었다. 아이소프로필 알콜 중의 I-216을 6M 염산으로 처리한 후 반용매로서 아이소프로필 아세테이트를 첨가하여 I-216의 염산염의 I형을 생성하였다.

용도

본 발명의 화학 물질은 E1 효소 활성의 유용한 억제제이다. 특히, 화학 물질은 NAE의 억제제이도록 설계된다. 억제제란 표적 단백질에 대한 ubl(특히, Nedd8) 접합에서 E1 효소의 효과의 촉진을 감소시키고/시키거나(예를 들면, 유비퀴틴화, 네딜화의 감소), ubl(특히, Nedd8) 접합에 의해 중재되는 세포내 신호전달을 감소시키고/시키거나, ubl(특히, Nedd8) 접합에 의해 중재되는 단백질분해를 감소시키는(예를 들면, 쿨린 의존성 유비퀴틴화 및 단백질분해(예를 들면, 유비퀴틴-프로테아좀 경로)의 억제) 화학 물질을 포함하도록 의도된다. 따라서, 본 명세서에 추가로 자세히 제공된 방법 또는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 실험실내 또는 생체내, 또는 세포 또는 동물 모델에서 E1 효소를 억제하는 능력에 대해 본 발명의 화학 물질을 평가할 수 있다. E1 효소에 결합하거나 이의 활성을 직접 중재하는 능력에 대해 화학 물질을 평가할 수 있다. 대안적으로, 간접 세포 검정 또는 E1 활성화의 하향 효과를 측정하는 검정을 통해 화학 물질의 활성을 평가하여 E1 억제(예를 들면, 쿨린 의존성 유비퀴틴화 및 단백질분해의 억제)의 하향 효과의 억제를 평가할 수 있다. 예를 들면, ubl 접합 기질(예를 들면, ubl 접합 E2, 네딜레이트화 쿨린, 유비퀴틴화 기질)의 검출; 하향 단백질 기질 안정화(예를 들면, p27의 안정화, IκB의 안정화)의 검출; UPP 활성 억제의 검출; 기질 안정화 및 단백질 E1 억제의 하향 효과의 검출(예를 들면, 리포터 검정, 예를 들면 NFκB 리포터 검정, p27 리포터 검정)에 의해 활성을 평가할 수 있다. 활성을 평가하기 위한 검정이 하기 실험 섹션에 기재되어 있고/있거나 당해 분야에 공지되어 있다.

본 발명의 화학 물질가 작용기에서 유도체화되어 생체내 모 화학 물질로 다시 전환될 수 있는 프로드럭 유도체를 제공할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 프로드럭의 예로는 생리학적으로 허용되고 대사상 불안정한 유도체를 들 수 있다. 더 구체적으로, 본 발명의 화학 물질의 프로드럭은 화학 물질의 -NH- 기의 카바메이트 또는 아마이드, 또는 화학 물질의 -OH 기의 에터 또는 에스터이다.

화학 물질의 -NH- 기의 이러한 카바메이트 프로드럭은 하기 카바메이트를 들 수 있다: 9-플루오레닐메틸, 9-(2-설포)플루오레닐메틸, 9-(2,7-다이브로모)플루오레닐메틸, 17-테트라벤조[a,c,g,i]플루오레닐메틸, 2-클로로-3-인데닐메틸, 벤즈[f]인덴-3-일메틸, 2,7,다이-tert-뷰틸-[9-(10,10-다이옥소-10,10,10,10-테트라-하이드로-티오-잔틸)]-메틸, 1,1-다이옥소벤조[b]티오펜-2-일-메틸, 2,2,2-트라이클로로에틸, 2-트라이메틸실릴에틸, 2-페닐에틸, 1-(1-아다만틸)-1-메틸에틸, 2-클로로에틸, 1,1-다이메틸-2-할로에틸, 1,1-다이메틸-2,2-다이브로모에틸, 1,1-다이메틸-2,2,2-트라이클로로에틸, 1-메틸-1-(4-바이페닐릴)에틸, 1-(3,5-다이-tert-뷰틸페닐)-1-메틸에틸, 2-(2'-및 4'-피리딜)에틸, 2,2-바이스(4'-나이트로페닐)에틸, N-2-피발로일아미노)-1,1-다이메틸에틸, 2-[(2-나이트로페닐)다이티오]-1-페닐에틸, 2-(N,N-다이사이클로헥실카복스아미도)에틸, tert-뷰틸, 1-아다만틸, 2-아다만틸, 비닐, 알릴, 1-아이소프로필알릴, 신나밀, 4-나이트로신나밀, 3-(3'-피리딜)프로프-2-엔일, 8-퀴놀릴, N-하이드록시피페리디닐, 알킬다이티오, 벤질, 파라-메톡시벤질, 파라-나이트로벤질, 파라-브로모벤질, 파라-클로로벤질, 2,4-다이클로로벤질, 4-메틸설피닐벤질, 9-안트릴메틸, 다이페닐메틸, 페노티아지닐-(10)-카보닐, N'-파라-톨루엔설포닐아미노카보닐 및 N'-페닐아미노티오카보닐.

화학 물질의 -NH- 기의 이러한 아마이드 프로드럭은 하기 아마이드를 들 수 있다: N-포밀, N-아세틸, N-클로로아세틸, N-트라이클로로아세틸, N-트라이플루오로아세틸, N-페닐아세틸, N-3-페닐프로피오닐, N-4-펜테노일, N-피콜리노일, N-3-피리딜카복스아미도, N-벤조일페닐알라닐, N-벤조일 및 N-파라-페닐벤조일.

화학 물질의 -OH 기의 이러한 에터 프로드럭은 하기 에터를 들 수 있다: 메틸, 메톡시메틸, 메틸티오메틸, (페닐다이메틸실릴)메톡시메틸, 벤질옥시메틸, 파라-메톡시벤질옥시메틸, 파라-나이트로벤질옥시메틸, 오르토-나이트로벤질옥시메틸, (4-메톡시페녹시)메틸, 구아야콜메틸, tert-부톡시메틸, 4-펜테닐옥시메틸, 실록시메틸, 2-메톡시에톡시메틸, 2,2,2-트라이클로로에톡시메틸, 바이스(2-클로로에톡시)메틸, 2-(트라이메틸실릴)에톡시메틸, 메톡시메틸, 테트라하이드로피라닐, 3-브로모테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 1-메톡시사이클로헥실, 4-메톡시테트라하이드로피라닐, 4-메톡시테트라하이드로티오피라닐, 4-메톡시테트라하이드로티오피라닐 S,S-다이옥사이드, 1-[(2-클로로-4-메틸)페닐]-4-메톡시피페리딘-4-일, 1-(2-플루오로페닐)-4-메톡시피페리딘-4-일, 1,4-다이옥산-2-일, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로티오퓨라닐, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타하이드로-7,8,8,-트라이메틸-4,7-메타노벤조퓨란-2-일, 1-에톡시에틸, 1-(2-클로로에톡시)에틸, 1-[2-(트라이메틸실릴)에톡시]에틸, 1-메틸-1-메톡시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시-2-플루오로에틸, 1-메틸-1-페녹시에틸, 2,2,2-트라이클로로에틸, 1,1-다이아니실-2,2,2,-트라이클로로에틸, 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-페닐아이소프로필, 2-트라이메틸실릴에틸, 2-(벤질티오)에틸, 2-(페닐셀레닐)에틸, tert-뷰틸, 알릴, 프로파길, 파라-클로로페닐, 파라-메톡시페닐, 파라-나이트로페닐, 2,4-다이나이트로페닐, 2,3,5,6-테트라플루오로-4-트라이플루오로메틸)페닐, 벤질, 파라-메톡시벤질, 3,4-다이메톡시벤질, 오르토-나이트로벤질, 파라-나이트로벤질, 파라-할로벤질, 2,6-다이클로로벤질, 파라-사이아노벤질, 파라-페닐벤질, 2,6-다이플루오로벤질, 파라-아실아미노벤질, 파라-아지도벤질, 4-아지도-3-클로로벤질, 2-트라이플루오로메틸벤질, 파라-(메틸설피닐)벤질, 2-피콜릴, 4-피콜릴, 3-메틸-2-피콜릴 N-옥시도, 2-퀴놀리닐메틸, 1-피레닐메틸, 다이페닐메틸, p,p'-다이나이트로벤즈하이드릴, 5-다이벤조수베릴, 트라이페닐메틸, 알파-나프틸다이페닐메틸, 파라-메톡시-페닐-다이페닐메틸, 다이(파라-메톡시페닐)페닐메틸, 트라이(파라-메톡시페닐)메틸, 4-(4'-브로모펜아실옥시)페닐다이페닐메틸, 4,4',4''-트리스(4,5-다이클로로프탈이미도페닐)메틸, 4,4',4''-트라이(레불리노일옥시페닐)메틸, 4,4',4''-트라이(벤조일옥시페닐)메틸, 4,4'-다이메톡시-3''-[N-(이미다졸릴메틸)트리틸, 4,4'-다이메톡시-3''[N-이미다졸릴에틸]카바모일]트리틸, 1.1-바이스(4-메톡시-페닐)-1'-피레닐메틸, 4-(17-테트라벤조[a,c,g,i]플루오레닐메틸)-4,4''-다이메톡시트리틸, 9-안트릴, 9-(9-페닐)잔테닐, 9-(9-페닐-10-옥소)안트릴, 1,3-벤조다이티올란-2-일, 벤즈아이소티아졸릴 S,S-다이옥시도, 트라이메틸실릴, 트라이에틸실릴, 트라이아이소프로필실릴, 다이메틸아이소프로필실릴, 다이에틸아이소프로필실릴, 다이메틸헥실실릴, tert-뷰틸다이메틸실릴, tert-뷰틸다이페닐실릴, 트라이벤질실릴, 트라이-파라-자일릴실릴, 트라이페닐실릴, 다이페닐메틸실릴, 다이-tert-뷰틸메틸실릴, 트리스(트라이메틸실릴)실릴, (2-하이드록시스티릴)다이메틸실릴, (2-하이드록시스티릴)다이아이소프로필실릴, tert-뷰틸메톡시페닐실릴 및 tert-부톡시다이페닐실릴.

화학 물질의 -OH 기의 이러한 에스터 프로드럭은 하기 에스터를 들 수 있다: 포르메이트, 벤조일포르메이트, 아세테이트, 클로로아세테이트, 다이클로로아세테이트, 트라이클로로아세테이트, 트라이플루오로아세테이트, 메톡시아세테이트, 트라이페닐메톡시아세테이트, 페녹시아세테이트, 파라-클로로페녹시아세테이트, 페닐아세테이트, 파라-P-페닐아세테이트, 다이페닐아세테이트, 니코티네이트, 3-페닐프로피오네이트, 4-펜테노에이트, 4-옥소펜타노에이트, 4,4-(에틸렌다이티오)펜타노에이트, 5-[3-바이스(4-메톡시페닐)하이드록시메틸페녹시]레불리네이트, 피발로에이트, 1-아다만토네이트, 크로토네이트, 4-메톡시크로토네이트, 벤조에이트, 파라-페닐벤조에이트 및 2,4,6-트라이메틸벤조에이트. 추가로, 생체내 본 명세서에 기재된 모 화학 물질을 생성할 수 있는, 대사상 불안정한 -OH 기의 에터, 에스터 또는 -NH- 기의 카바메이트 또는 아마이드와 유사한 모 화학 물질의 임의의 생리학적으로 허용되는 균등물은 본 발명의 범위 내에 있다. 예를 들면, 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Ed. John Wiley & Sons, Inc. (1999)]을 참조한다.

본 발명의 몇몇 실시양태는 본 발명의 화학 물질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 몇몇 실시양태는 본 발명의 화학 물질의 프로드럭 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

약학적으로 허용되는 염이 이 조성물에 사용되는 본 발명의 화학 물질인 경우, 이 염은 바람직하게는 무기 또는 유기 산 및 염기로부터 유도된다. 적합한 염의 검토를 위해, 예를 들면 문헌[Berge et al, J. Pharm. Sci. 66:1-19 (1977) 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., A. Gennaro (ed.), Lippincott Williams & Wilkins (2000) ("Remington's")]을 참조한다.

적합한 산 부가염의 예로는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠 설포네이트, 바이설포네이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄퍼레이트, 캄퍼 설포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 루코헵타노에이트, 글라이세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐-프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오사이아네이트, 토실레이트 및 운데카노에이트를 들 수 있다.

적합한 염기 부가염은 암모늄염, 알칼리 금속염, 예컨대 나트륨염 및 칼륨염, 알칼리 토금속염, 예컨대 칼슘염 및 마그네슘염, 유기 염기와의 염, 예컨대 다이사이클로헥실아민염, N-메틸-D-글루카민 및 아미노산, 예컨대 아르기닌, 라이신 및 등과의 염을 들 수 있다.

또한, 저급 알킬 할라이드, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 및 뷰틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드; 다이알킬 설페이트, 예컨대 다이메틸, 다이에틸, 다이뷰틸 및 다이아밀 설페이트, 장쇄 할라이드, 예컨대 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드, 아르알킬 할라이드, 예컨대 벤질 및 펜에틸 브로마이드 등과 같은 물질로 염기성 질소 함유 기를 4급화할 수 있다. 이렇게 수용성 또는 지용성 또는 분산성 생성물을 얻는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 수혜 피험체, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간에 투여하기에 적합한 형태이다. 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 본 명세서에서 수혜 피험체와 상용성이고 활성 물질의 활성을 종료시키지 않으면서 활성 물질을 표적 부위에 전달하기에 적합한 재료를 의미하기 위해 사용된다. 담체와 관련되는 독성 또는 부작용이 있는 경우, 이는 바람직하게는 활성 물질의 의도하는 용도에 합당한 위험/이익 비에 비례한다. 이러한 많은 약학적으로 허용되는 담체는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Remington's; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th Ed., R.C. Rowe et al. (eds.), Pharmaceutical Press (2009)]을 참조한다.

당해 분야에 널리 공지된 방법, 예컨대 무엇보다도 종래 과립, 혼합, 용해, 캡슐화, 동결건조 또는 유화 공정에 의해 본 발명의 약제학적 조성물을 제조할 수 있다. 과립, 침전물 또는 미립자, 동결 건조, 회전 건조 또는 분무 건조 분말, 비결정질 분말을 포함하는 분말, 정제, 캡슐제, 시럽, 좌제, 주사, 유화제, 엘릭시르제, 현탁제 또는 용액제를 비롯한 다양한 형태로 조성물을 제조할 수 있다. 제제는 안정화제, pH 개질제, 계면활성제, 가용화제, 생체이용률 개질제 및 이들의 조합을 임의로 포함할 수 있다.

이 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 담체는 이온 교환물질, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예컨대 포스페이트 또는 카르보네이트, 글라이신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화 식물성 지방산, 물, 염 또는 전해질의 부분 글라이세라이드 혼합물, 예컨대 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트라이실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질, 폴리에틸렌 글라이콜, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 중합체, 폴리에틸렌 글라이콜 및 양모지를 들 수 있다.

바람직한 실시양태에 따르면, 포유동물, 바람직하게는 인간에 대한 약제학적 투여를 위해 본 발명의 조성물을 제제화한다. 경구로, 비경구로, 흡입 스프레이로, 국소로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질내로 또는 이식 저장소를 통해 본 발명의 이러한 약제학적 조성물을 투여할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 척추강내, 간장내, 병변내 및 두개내 주사 또는 점적 기법을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물을 경구로, 정맥내로 또는 피하로 투여한다. 본 발명의 제제를 속효성(short-acting), 속용성(fast-releasing) 또는 지효성(long-acting)이도록 설계할 수 있다. 더 추가로, (예를 들면, 주사에 의한) 종양 부위에의 투여와 같이 전신 방식보다는 국소 방식으로 상기 화합물을 투여할 수 있다.

액체, 예컨대 오일, 물, 알콜 및 이들의 조합을 사용하여 액체 현탁제 또는 용액제로서 약제학적 제제를 제조할 수 있다. 가용화제, 예컨대 사이클로덱스트린이 포함될 수 있다. 경구 또는 비경구 투여를 위해 약학적으로 적합한 계면활성제, 현탁제 또는 유화제를 첨가할 수 있다. 현탁제는 오일, 예컨대 땅콩유, 참깨유, 면실유, 옥수수유 및 올리브유를 들 수 있다. 현탁 제제는 또한 지방산의 에스터, 예컨대 에틸 올레에이트, 아이소프로필 미리스테이트, 지방산 글라이세라이드 및 아세틸화 지방산 글라이세라이드를 포함할 수 있다. 현탁 제제는 알콜, 예컨대 에탄올, 아이소프로필 알콜, 헥사데실 알콜, 글라이세롤 및 프로필렌 글라이콜을 포함할 수 있다. 현탁 제제에서 에터, 예컨대 폴리(에틸렌글라이콜), 석유 탄화수소, 예컨대 광유 및 석유; 및 물을 또한 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물의 무균 주사제 형태는 수성 또는 유성 현탁제일 수 있다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당해 분야에 공지된 기법에 따라 이 현탁제를 제제화할 수 있다. 무균 주사용 제제는 또한 예를 들면 1,3-뷰탄다이올 중의 용액으로서 비독성 비경구로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 무균 주사용 용액제 또는 현탁제일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 무균, 고정유를 용매 또는 현탁 매질로서 통상 사용한다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 다이-글라이세라이드를 포함하는 임의의 완하성 고정유를 사용할 수 있다. 지방산, 예컨대 올레산 및 이의 글라이세라이드 유도체는 약학적으로 허용되는 천연 오일, 예컨대 올리브유 또는 캐스터유에서처럼, 특히 이의 폴리옥시에틸화 버전에서 주사제의 제법에서 유용하다. 이 오일 용액제 또는 현탁제는 또한 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제, 예컨대 유화제 및 현탁제와 같은 약학적으로 허용되는 제형의 제제에 통상적으로 사용되는 카복시메틸 셀룰로스 또는 유사한 분산제를 포함할 수 있다. 다른 통상적으로 사용되는 계면활성제, 예컨대 트윈(Tween), 스팬(Span) 및 다른 유화제, 또는 약학적으로 허용되는 고체, 액체 또는 다른 제형의 제조에 통상적으로 사용되는 생체이용률 증강제를 또한 제조의 목적을 위해 사용할 수 있다. 비경구 투여를 위해 볼루스 주사 또는 연속 점적과 같은 주사에 의해 화합물을 제제화할 수 있다. 주사용 단위 제형은 앰플 또는 다용량 용기에 있을 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물을 캡슐제, 정제, 수성 현탁제 또는 용액제를 포함하는 임의의 경구로 허용되는 제형으로 경구로 투여할 수 있다. 수성 현탁제가 경구 용도에 필요한 경우, 활성 성분을 유화제 및 현탁제와 합한다. 원하는 경우, 특정한 감미료, 향료 또는 착색제를 또한 첨가할 수 있다. 이러한 고체 제형에서, 활성 화학 물질을 1종 이상의 약학적으로 허용되는 불활성 부형제 또는 담체, 예컨대 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘 및/또는 a) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 미세결정질 셀룰로스 및 규산, b) 결합제, 예컨대 카복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 수크로스 및 아카시아 등, c) 습윤제, 예컨대 글라이세롤, d) 붕괴제, 예컨대 한천-한천, 탄산칼슘, 폴리비닐피롤리디논, 크로스카르멜로스, 나트륨 전분 글라이콜레이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정한 실리케이트 및 탄산나트륨, e) 용액 지연제, 예컨대 파라핀, f) 흡수 촉진제, 예컨대 4급 암모늄 화합물, g) 습윤제, 예컨대 세틸 알콜 및 글라이세롤 모노스테아레이트 등, h) 흡착제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토 및 i) 활택제, 예컨대 탈크, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 고체 폴리에틸렌 글라이콜, 황산 라우릴 나트륨, 이산화규소 및 이들의 혼합물과 혼합할 수 있다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우, 제형은 또한 완충제를 포함할 수 있다.

활성 화학 물질은 또한 상기 기재된 1종 이상의 부형제를 갖는 마이크로 캡슐화된 형태일 수 있다. 코팅 및 쉘, 예컨대 장용 코팅, 방출 제어 코팅 및 약제학적 제제 분야에 널리 공지된 다른 코팅으로 정제, 당의정, 캡슐제, 환제 및 산제의 고체 제형을 제조할 수 있다. 이러한 고체 제형에서, 활성 화합물을 1종 이상의 불활성 희석제, 예컨대 수크로스, 락토스 또는 전분과 혼합할 수 있다. 이러한 제형은 또한, 일반 실행으로서, 불활성 희석제 이외의 추가의 물질, 예를 들면 타정 활택제 및 다른 타정 조제, 예컨대 스테아르산마그네슘 및 미세결정질 셀룰로스를 포함할 수 있다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우, 제형은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 이것은 임의로 불투명화제를 포함할 수 있고, 또한, 임의로 지연 방식으로, 오직 또는 우선적으로 장관의 특정 부위에서 활성 성분(들)을 방출하는 조성일 수 있다. 사용될 수 있는 임베딩 조성물의 예로는 중합체 물질 및 왁스를 들 수 있다.

대안적으로, 직장 투여를 위한 좌제 형태로 본 발명의 약제학적 조성물을 투여할 수 있다. 실온에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체여서 직장에서 용융되어 약물을 방출하는 적합한 비자극성 부형제와 물질을 혼합하여 이것을 제조할 수 있다. 이러한 재료는 코코아 버터, 비즈왁스 및 폴리에틸렌 글라이콜을 들 수 있다.

특히 치료 표적이 눈, 피부 또는 대장의 질환을 포함하는 국소로 용이하게 접근 가능한 부위 또는 장기를 포함할 때 본 발명의 약제학적 조성물을 또한 국소로 투여할 수 있다. 이 각각의 부위 또는 장기에 용이하게 적합한 국소 제제를 제조한다.

직장 좌제 제제(하기 참조) 또는 적합한 관장 제제로 대장에 대한 국소 적용을 수행할 수 있다. 국소 경피 패치를 또한 사용할 수 있다. 국소 적용을 위해, 1종 이상의 담체 중에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 포함하는 적합한 연고에서 약제학적 조성물을 제제화할 수 있다. 본 발명의 화합물의 국소 투여를 위한 담체는 광유, 유동 파라핀, 백색 바셀린, 프로필렌 글라이콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물을 들 수 있다. 대안적으로, 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체 중에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 포함하는 적합한 로션 또는 크림에서 약제학적 조성물을 제제화할 수 있다. 적합한 담체는 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스터 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알콜 및 물을 들 수 있다.

안과용 용도를 위해, 등장성인 pH 조정 무균 식염수 중의 마이크화 현탁액으로서, 또는 바람직하게는, 보존제, 예컨대 벤질알코늄 클로라이드와 함께 또는 이것 없이 등장성인 pH 조정 무균 식염수 중의 용액으로서 약제학적 조성물을 제제화할 수 있다. 대안적으로, 안과용 용도를 위해, 연고, 예컨대 석유 중에 약제학적 조성물을 제제화할 수 있다.

비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 본 발명의 약제학적 조성물을 또한 투여할 수 있다. 이러한 조성물을 약제학적 제제의 분야에 널리 공지된 기법에 따라 제조할 수 있고, 벤질 알콜 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용률을 증대시키는 흡수 증강제, 불화탄소 및/또는 다른 종래 가용화제 또는 분산제를 사용하여 식염수 중의 용액으로서 제조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 질환(예를 들면, 증식 질환, 예를 들면 암, 염증성, 신경퇴행성 질환)과 관련된 치료학적 적용에 특히 유용하다. 본 명세서에 사용되는 용어 "피험체"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "환자"는 인간을 의미한다. 바람직하게는, 치료하고자 하는 관련 질환을 앓고 있거나 이의 재발을 전개시키거나 경험할 위험이 있는 환자 또는 피험체에 대한 투여를 위해 상기 조성물을 제제화한다. 본 발명의 바람직한 약제학적 조성물은 경구, 정맥내 또는 피하 투여를 위해 제제화된 것이다. 그러나, 치료학적 유효량의 본 발명의 화학 물질을 포함하는 임의의 상기 제형은 일상적인 실험 분야 내에 있고, 따라서 본 발명의 범위 내에 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 다른 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 다른 치료제는 치료하고자 하는 질환, 장애 또는 병증을 앓고 있는 환자에게 보통 투여되는 것이다.

"치료학적 유효량"은, 단일 또는 다회 용량 투여 시, E1 효소 활성 및/또는 치료하고자 하는 질환 또는 장애 상태의 중증도를 검출 가능하게 감소시키에 충분한 화학 물질 또는 조성물의 양을 의미한다. "치료학적 유효량"은 또한, 이러한 치료의 부재 하에 예상되는 것보다, 세포를 치료하거나, 치료하고자 하는 질환 또는 장애 상태의 진행을 연장시키거나 예방하기에(예를 들면, 암의 추가의 종양 성장의 예방, 추가의 염증성 반응의 예방), 질환을 앓는 피험체의 증상을 완화시키거나, 경감시키거나, 감소시키거나, 개선시키기에 충분한 양을 포함하도록 의도된다. 요구되는 E1 효소 억제제의 양은 소정의 조성물의 특정 화합물, 치료하고자 하는 질환의 유형, 투여 경로 및 질환을 치료하기 위해 필요한 시간에 따라 달라진다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 용량 및 치료 섭생이 사용하고자 하는 특정 화학 물질의 활성, 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이, 투여 시간, 배출 속도, 약물 병용, 주치의의 판단 및 치료하고자 하는 특정 질환의 중등도를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라지는 것으로 또한 이해되어야 한다. 억제제를 다른 물질과 병용하여 투여하는 특정 양태에서, 본 발명의 조성물에 존재하는 추가의 치료제의 양은 통상적으로 유일한 활성 물질로서 이 치료제를 포함하는 조성물에서 보통 투여되는 양보다 많지 않다. 바람직하게는, 추가의 치료제의 양은 유일한 치료학적 활성 물질로서 이 물질을 포함하는 조성물에 보통 존재하는 양의 약 50% 내지 약 100% 범위이다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명은 샘플을 본 발명의 화학 물질 또는 본 발명의 화학 물질을 포함하는 조성물과 접촉하는 단계를 포함하는 샘플에서 E1 효소 활성을 억제하거나 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 명세서에 사용되는 샘플은 정제되거나 부분 정제된 E1 효소, 배양된 세포 또는 세포 배양물의 추출물; 포유동물로부터 얻은 생검 세포 또는 유체 또는 이의 추출물; 및 체액(예를 들면, 혈액, 혈청, 타액, 뇨, 대변, 정액, 눈물) 또는 이의 추출물을 포함하는 샘플을 들 수 있다. 실험실내 또는 생체내, 세포내 또는 인시츄로 샘플에서 E1 효소 활성의 억제를 수행할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 화학 물질 또는 약제학적 조성물을 질환, 질환의 증상을 앓고 있거나, 질환의 재발을 발생시키거나 경험할 위험이 있는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 이 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 치료는 질환, 질환의 증상 또는 이 질환의 소인을 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 구제, 감소, 호전, 개선하거나, 영향을 미치는 것일 수 있다. 이론에 구속되고자 함이 없이, 치료는 실험실내 또는 생체내 세포 또는 조직의 성장 억제, 제거 또는 사멸을 발생시키거나, 그렇지 않으면 세포 또는 조직(예를 들면, 비정상 세포, 이환 조직)의 역량을 감소시켜 본 명세서에 기재된 질환(예를 들면, 증식성 질환, 예를 들면 암, 염증성 질환)과 같은 질환을 중재하는 것으로 생각된다. 본 명세서에 사용되는 세포 또는 조직(예를 들면, 증식성 세포, 종양 조직)의 "성장을 억제한다" 또는 "성장 억제"는 이의 성장 및 전이를 느리게 하거나, 간섭하거나, 중지시키거나, 중단시키는 것을 의미하고, 반드시 성장의 전체 제거를 나타내지는 않는다.

질환 적용은 E1 효소 활성 억제가 이환 세포 또는 조직의 생존 및/또는 확장에 치명적인(예를 들면, 세포는 E1 억제에 감수성이고; E1 활성 억제는 질환 기전을 파괴하고; E1 활성 감소는 질환 기전의 억제제인 단백질을 안정화하시키고; E1 활성 감소는 질환 기전의 활성제인 단백질을 억제시키는 것) 질환을 들 수 있다. 질환 적용은 또한 E1 효소 활성(예를 들면, NAE 활성)을 감소시켜 활성이 조절될 수 있는 효과적인 쿨린 및/또는 유비퀴틴화 활성을 요하는 임의의 질환, 장애 또는 병증을 포함하도록 의도된다.

예를 들면, 본 발명의 방법은 질환 상태의 유지 및/또는 진행을 위한 효과적인 쿨린 의존성 유비퀴틴화 및 단백질분해 경로(예를 들면, 유비퀴틴 프로테아좀 경로)를 요하는 질환을 비롯하여 세포 증식을 수반하는 질환의 치료에 유용하다. 본 발명의 방법은 E1 활성(예를 들면, NAE 활성)에 의해 조절되는 단백질(예를 들면, NFκB 활성화, p27^Kip 활성화, p21^WAF/CIP1 활성화, p53 활성화)을 통해 중재되는 질환의 치료에 유용하다. 관련 질환은 증식성 질환, 가장 특히 암 및 염증성 질환(예를 들면, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 천식, 만성 패쇄성 폐 질환(COPD), 골관절염, 피부병(예를 들면, 아토피 피부염, 건선), 혈관 증식성 질환(예를 들면, 죽상동맥경화증, 재협착), 자가면역 질환(예를 들면, 다발성 경화증, 조직 및 장기 거부)); 및 감염과 관련된 염증(예를 들면, 면역 반응), 신경퇴행성 질환(예를 들면, 알츠하이머병, 파킨슨병, 운동 신경 질환, 신경병증 통증, 3자 암호 반복 질환, 성상세포종 및 알콜 간 질환의 결과로서의 신경변성), 허혈 손상(예를 들면, 뇌졸중) 및 악액질(예를 들면, 다양한 신체 및 병리 상태를 수반하는 가속 근육 단백질 분해(예를 들면, 신경 손상, 단식, 열, 산성증, HIV 감염, 암 고통 및 특정한 내분비병))를 들 수 있다.

본 발명의 화합물 및 약제학적 조성물은 암의 치료에 특히 유용하다. 본 명세서에 사용되는 용어 "암"은 비조절 또는 조절이상 세포 증식, 세포 분화 감소, 주변 조직을 침윤하는 부적절한 능력 및/또는 이소성 부위에서 새로 성장시키는 부적절한 능력을 특징으로 하는 세포 질환을 의미한다. 용어 "암"은 고형 종양 및 혈액 종양을 포함한다. 용어 "암"은 피부, 조직, 장기, 뼈, 연골, 혈액 및 혈관의 질환을 포함한다. 용어 "암"은 추가로 원발성 및 전이성 암을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 고형 종양은 췌장암; 방광암; 대장암; 전이성 유방암을 포함하는 유방암; 안드로겐 의존성 및 안드로겐 독립적 전립선암을 포함하는 전립선암; 예를 들면, 전이성 신세포 암종을 포함하는 신장암; 간세포암; 예를 들면, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC), 소세포 폐암, 기관지 페포암(bronchioloalveolar carcinoma: BAC) 및 폐의 선암을 포함하는 폐암; 예를 들면, 진행성 상피 또는 원발성 복막암을 포함하는 난소암; 자궁경부암; 위암; 식도암; 예를 들면, 두경부의 편평 세포 암종을 포함하는 두경부암; 흑색종; 신경내분비계 종양을 포함하는 내분비계 암; 예를 들면, 신경교종, 역형성 핍지교종, 성인 다형성 교모세포종 및 성인 역형성 성상세포종을 포함하는 뇌종양; 골암; 및 연조직 육종을 들 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 암은 혈액학적 악성종양이다. 혈액학적 악성종양의 예로는 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia: AML); 가속 CML 및 CML 모세포 단계(CML-BP)를 포함하는 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia: CML); 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia: ALL); 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL); 호치킨병(Hodgkin's disease: HD); 여포성 림프종 및 외투 세포 림프종을 포함하는 비호치킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma: NHL); B-세포 림프종; T-세포 림프종; 다발성 골수종(multiple myeloma: MM); 반델스트롬(Waldenstrom) 거대글로불린혈증; 불응성 빈혈(refractory anemia: RA), 불응성 빈혈 및 환형 정적아구 세포증(refractory anemia with ringed siderblast: RARS), 과대 모세포 불응성 빈혈(refractory anemia with excess blast: RAEB) 및 전환 중이 RAEB(RAEB in transformation: RAEB-T)을 포함하는 골수이형성 증후군(MDS); 및 골수증식성 증후군을 들 수 있다.

치료하고자 하는 특정 질환 또는 병증에 따라, 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 E1 효소 억제제를 추가의 치료제 또는 치료제들과 함께 투여한다. 몇몇 실시양태에서, 추가의 치료제(들)는 치료하고자 하는 질환 또는 병증을 앓고 있는 환자에게 보통 투여되는 것이다. 특정 질환 또는 병증을 치료하기 위해 보통 투여되는 본 명세서에 사용되는 추가의 치료제는 "치료하고자 하는 질환 또는 병증에 적절한" 것으로 공지되어 있다.

본 발명의 E1 억제제를 단일 제형 또는 독립적 제형으로 다른 치료제와 함께 투여할 수 있다. 독립적 제형으로 투여할 때, 본 발명의 E1 억제제의 투여 전에, 투여와 동시에, 투여 후에 다른 치료제를 투여할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 E1 효소 억제제를 증식성 질환 및 암의 치료에 적절한 세포독성제, 방사선치료 및 면역치료로부터 선택되는 치료제와 함께 투여한다. 본 발명의 E1 효소 억제제와 함께 사용하기에 적합한 세포독성제의 예로는, 예를 들면 카페시티빈, 젬시타빈, 5-플루오로우라실 또는 5-플루오로우라실/류코보린, 플루다라빈, 시타라빈, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 메토트렉세이트를 포함하는 항대사물질; 예를 들면, 에토포사이드, 테니포사이드, 캄프토테신, 토포테칸, 이리노테칸, 독소루비신 및 다우노루비신을 포함하는 토포아이소머라제 억제제; 예를 들면, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함하는 빈카 알카로이드; 예를 들면, 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함하는 탁산; 예를 들면, 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴을 포함하는 백금 물질; 예를 들면, 악티노마이신 D, 블레오마이신, 미토마이신 C, 아드리아마이신, 다우노루비신, 이다루비신, 독소루비신 및 페길화 리포솜 독소루비신을 포함하는 항생제; 예컨대, 멜팔란, 클로르암부실, 부술판, 티오테파, 이포스파마이드, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조신, 데카르바진 및 사이클로포스파마이드를 포함하는 알킬화제; 예를 들면, CC-5013 및 CC-4047; 예를 들면, 이마티닙 메실레이트 및 게피티닙을 포함하는 단백질 티로신 키나제 억제제; 예를 들면, 보르테조밉을 포함하는 프로테아좀 억제제; 탈리도마이드 및 관련 동족체; 예를 들면, 트라스투주맙, 리툭시맙, 세툭시맙 및 베바시주맙을 포함하는 항체; 미톡산트론; 덱사메타손; 프레드니손; 및 테모졸로마이드를 들 수 있다.

본 발명의 억제제와 함께 사용될 수 있는 물질의 다른 예로는 소염제, 예컨대 코르티코스테로이드, TNF 차단제, Il-1 RA, 아자티오프린, 사이클로포스파마이드 및 설파살라진; 면역조절 및 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 타클롤리무스, 라파마이신, 마이코페놀레이트 모페틸, 인터페론, 코르티코스테로이드, 사이클로포스파마이드, 아자티오프린, 메토트렉세이트 및 설파살라진; 항박테리아제 및 항바이러스제; 및 알츠하이머병 치료를 위한 물질, 예컨대 도네페질, 갈란타민, 메만틴 및 리바스티그민을 들 수 있다.

본 발명이 더 완전히 이해하기 위해, 하기 제조 및 시험 실시예가 기재되어 있다. 이 실시예는 단지 예시를 위한 것이고, 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되도록 의도되지 않는다.

실시예

약어

AcOH 아세트산

ACN 아세토나이트릴

DABCO 트라이에틸렌다이아민

DCM 다이클로로메탄

DCP 4,6-다이클로로피리미딘

DEA 다이에틸아민

DIPEA N,N-다이아이소프로필에틸아민

DMSO 다이메틸설폭사이드

Et₂O 다이에틸 에터

EtOAc 에틸 아세테이트

EtOH 에탄올

Et₃N 트라이에틸아민

FA 포름산

H₂O 물

h 시간

IPA 아이소프로필 알콜

IPAc 아이소프로필 아세테이트

LC/MS 액체 크로마토그래피 질량 스펙트럼

LDA 리튬 다이아이소프로필아마이드

MTBE 메틸 tert-뷰틸 에터

MeOH 메탄올

min 분

MS 질량 스펙트럼

NMP N-메틸-2-피롤리돈

rt 실온

P₃NO 4-페닐프로필피리딘-N-옥사이드

TBS tert-뷰틸다이메틸실릴

TFA 트라이플루오로아세트산

THF 테트라하이드로퓨란

TLC 박층 크로마토그래피

TMS 트라이메틸실릴

일반적 방법

x선 분말 회절. 브루커(Bruker) AXS D8 어드밴스(Advance) x선 회절계를 사용하여 XRPD를 수행하였다. 분말 측정을 위해 대략 100㎎의 샘플을 50㎜ 직경 석영 샘플링 팬에 온화하게 편평하게 하였다. 2θ/θ 고정 커플링 각도를 이용하여 2.9 내지 29.6 °2θ의 연속 스캔으로 샘플을 실행하였다. 각각의 각도 간격은 0.05°2θ이고, 2초 동안 데이터를 수집하였다. 주변 조건 하에 샘플 실행을 수행하고, EVA 버전 9.0 소프트웨어를 이용하여 모든 데이터 분석을 수행하였다.

열 분석. 시차 주사 열량측정법(differential scanning calorimetry: DSC) 및 열중량 분석(thermogravimetric analysis: TGA)을 이용하여 열 사건을 분석하였다. 모든 샘플 실행에 TA 인스트루먼츠(instruments) DSC Q200 및 TGA Q500을 사용하였다. Q 시리즈 소프트웨어에 대해 써멀 어드밴티지(Thermal Advantage)를 사용하여 온도기록도를 분석하였다.

시차 주사 열량측정법. 뚜껑이 있는 알루미늄 팬에 샘플(1㎎ 내지 2㎎)을 밀봉하였다. 샘플을 10℃/분의 증가 속도로 25℃로부터 400℃로 가열하고, 50㎖/분으로 질소 샘플 퍼지를 유지시켰다.

열중량 분석. 개방된 백금 팬에서 샘플(5㎎ 내지 10㎎)을 실행하였다. 샘플을 60㎖/분의 질소 샘플 퍼지로 10℃/분의 증가 속도로 400℃로 가열하였다.

실시예 1. (1R,2S)-5-클로로-2-메톡시인단-1-아민(8)의 합성

단계 1: rel-(1aR,6aS)-4-클로로-6,6a-다이하이드로-1aH-인데노[1,2-b]옥시렌(2).

염화메틸렌(20㎖) 중의 4-페닐프로필피리딘-N-옥사이드(278㎎, 1.31m㏖)의 교반 중인 용액에 0℃에서 (R,R)-야콥센 촉매(237.0㎎, 0.3732m㏖) 및 차아염소산나트륨 용액(물 중 2.0M; 16㎖, 32m㏖)을 첨가하였다. 생성된 갈색의 현탁액을 0℃에서 15분 동안 교반한 후, 염화메틸렌(20㎖) 중의 6-클로로-1H-인덴(1)(2.81g, 18.6m㏖) 용액을 주사기를 통해 첨가하면서 추가의 차아염소산나트륨(물 중 2.0M; 16㎖, 32m㏖)을 동시에 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 빙욕을 제거하고 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 분취량을 취하고, 실리카(헥산)에서의 TLC는 모든 출발 물질이 소비되었다는 것을 나타냈다. 반응물을 염수에 붓고 염화메틸렌으로 추출하였다. 합한 추출물을 식염수로 세척한 후, 황산나트륨 위로 건조하고, 여과시키고, 감압 하에 증발시켜 미정제 생성물이 남았고, 이를 고진공 하에 정치하여 고화시켰다. 수율: 갈색의 고형분 약 3.7g. ¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.55 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.23 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 4.36 (s, 1H), 4.16 (s, 1H), 3.03 (dd, J = 45.8, 18.2 Hz, 2H).

단계 2: rel-(1R,2S)-1-아미노-5-클로로인단-2-올(3).

아세토나이트릴(30㎖, 500m㏖) 중의 발연 황산(4.098㎖, 44.06m㏖)의 -40℃ 혼합물에 아세토나이트릴(70㎖) 및 헥산(40㎖) 중의 rel-(1aR,6aS)-4-클로로-6,6a-다이하이드로-1aH-인데노[1,2-b]옥시렌(2)(2.94g, 17.6m㏖)의 현탁액을 적하하였다. 이후, 이상(biphasic) 혼합물을 실온으로 가온하고, 추가의 시간 동안 교반하여 흐릿한 적갈색의 혼합물이 남았다. 물(30㎖)을 조심스럽게 첨가하고(모든 고형분이 용해되어 적갈색의 용액이 생성됨), 생성된 용액을 30분 동안 교반하였다. 이후, 추가의 물(70㎖)을 첨가하고, 반응물을 질소 분위기 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 물(50㎖)을 반응물에 첨가하고, 증류 헤드를 부착하고, 헤드 온도가 100℃에 도달할 때까지 혼합물을 환류에 놓고 증류시켰다. 증류 헤드를 제거하고, 환류 콘덴서를 부착하고, 반응물을 1시간 동안 환류에서 가열하여 테두리 주위에 약간 어두운 점성질 고형분과 함께 청명한 오렌지색의 용액이 생성되었다. 반응물을 약간 냉각시킨 후, 열수 용액을 점성질 물질로부터 500㎖ 둥근 바닥 플라스크로 따랐다. 용액을 교반하고, 실온으로 냉각시킨 후, 50% NaOH 수용액을 적하하여 염기성(pH 12)으로 만들었다. 염화메틸렌을 첨가하고, 혼합물을 잘 교반한 후, 분리 깔때기로 옮겼다. 유기층을 분리하고, (모든 생성물이 수성층으로부터 추출된다는 것을 TLC 분석이 나타낼 때까지) 수성층을 추가의 염화메틸렌으로 반복 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 식염수로 세척하고, 황산나트륨 위로 건조하고, 여과시키고, 진공 하에 증발시켜 담갈색의 분말로서 2.53g의 미정제 생성물이 남았다. LCMS: 포름산, [M + H+ + Na+] = 208; ¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.31 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.24 - 7.15 (m, 2H), 4.79 (s, 1H), 4.20 (s, 1H), 4.01 (s, 1H), 2.92 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 2.73 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 2.15 - 1.43 (s, 2H). 키랄 HPLC(2.0㎖/분 - 45분 실행에서 95/5/0.1% 헥산/EtOH/DEA로 용리되는 키랄팩(Chiralpak) AD 4.6X250 컬럼)은 80%의 ee를 나타냈다.

단계 3 및 단계 4: (1R,2S)-1-아미노-5-클로로인단-2-올(5)의 키랄 분할.

환류에서 메탄올(100㎖) 중의 rel-(1R,2S)-1-아미노-5-클로로인단-2-올(3)(2.53g, 13.8m㏖)의 용액을 포함하는 플라스크에 교반하면서 D-(-)-만델산(2.09g, 13.8m㏖)을 첨가하였다. 약 15분 동안 환류시킨 후, 맨틀을 제거하고, 용액을 교반하면서 실온으로 냉각하였다. 열원이 제거된 후 약 15분에 고형분이 침전하기 시작하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이후, 혼합물을 여과시키고, 메탄올(10㎖), 이어서 다이에틸 에터(15㎖)로 세척하고, 진공 하에 건조하여 2.50g의 중간 염을 제공하였다. 여과액을 약 1/3 용적으로 농축시키고 밤새 냉동시키고, 이때 더 많은 생성물이 침전되었다. 다시, 혼합물을 여과시키고, 메탄올(7.5㎖), 이어서 다이에틸 에터(10㎖)로 세척하고, 진공 하에 건조하여 추가의 0.60g의 중간 염을 제공하였다. 전체 3.1g을 수집하였다.

분해가 완료될 때까지, 중간 염을 에틸 아세테이트(50㎖)와 수성 NaOH(0.2M, 60㎖)의 혼합물 중에 교반하였다. 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 유기층을 분리하였다. 수성층을 에틸 아세테이트(3X50㎖)로 추가로 추출하였다. 세척물이 중성이 될 때까지, 합한 유기층을 식염수로 세척한 후, 황산나트륨 위로 건조하고, 여과시키고, 증발시켜 담갈색의 고형분이 남았다. 고진공 하에 추가로 건조하여 담갈색의 분말로서 1.42g(56% 수율)의 표적 화합물이 생성되었다. 표적 화합물에 대한 분석 데이터: ¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.31 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.24 - 7.15 (m, 2H), 4.83 (s, 1H), 4.20 (t, J = 3.9 Hz, 1H), 4.00 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 2.92 (dd, J = 16.2, 4.9 Hz, 1H), 2.73 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 1.85 (s, 2H). 키랄 HPLC(2.0㎖/분 - 45분 실행에서 95/5/0.1% 헥산/EtOH/DEA로 용리되는 키랄팩 AD 4.6X250 컬럼)은 99% 초과의 ee를 나타냈다.

단계 5: 2-[(1R,2S)-5-클로로-2-하이드록시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]-1H-아이소인돌-1,3(2H)-다이온(6).

1ℓ 둥근 바닥 플라스크에서, N,N-다이아이소프로필에틸아민(15.2㎖, 0.0871㏖)을 톨루엔(473㎖, 4.44㏖) 중의 (1S,2R)-1-아미노-5-클로로인단-2-올(16.0g, 0.0871㏖) 및 프탈산 무수물(14.2g, 0.0958㏖)의 현탁액에 첨가하고, 반응 혼합물을 환류에서 18시간 동안 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 이때 다량의 고형분이 침전되었다. 원하는 생성물인 고형분을 여과시키고, EtOAc로 세정하고, 수집하였다. 여과액을 0℃로 냉각시키고, 여과시키고, 고형분을 EtOAc로 세정하고, 제1 배취(batch)와 합했다. 여과액을 분리 깔때기로 옮기고, H₂O(200㎖)로 희석하였다. 층을 분리하고, 수성층을 EtOAc(3x200㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 1x염수(100㎖)로 세척하고, MgSO₄ 위로 건조하고, 여과시키고 진공 하에 농축시켰다. 생성된 미백색의 고형분을 EtOAc 중에 현탁시키고, 큰 덩어리를 음파처리로 파괴하고, 현탁액을 0℃로 냉각시켰다. 고형분을 여과시키고, 이전의 2개의 배취와 합했다. 여과액을 진공 하에 농축시키고, 생성된 백색의 고형분을 최종 시간에 Et₂O(100㎖) 중에 현탁시키고, 여과시키고, 이전의 3개의 배취와 합했다. 고형분의 모든 4개의 배취의 전체 수율은 25.3g(92%)이었다. LCMS: (FA) ES+ 분자 이온 314, 주요 이온화 167; ¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.83 (s, 4H), 7.33 (s, 1H), 7.27 (d, J = 8.2, 1H), 7.19 (dd, J = 2.0, 8.1, 1H), 5.52 (d, J = 7.4, 1H), 5.34 (d, J = 5.2, 1H), 4.64 (dt, J = 6.9, 12.7, 1H), 3.21 (dd, J = 7.4, 16.1, 1H), 3.02 (dd, J = 6.1, 16.1, 1H).

단계 6: 2-[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]-1H-아이소인돌-1,3(2H)-다이온(7)

테트라하이드로퓨란(186㎖, 2.29㏖) 중의 2-[(1R,2S)-5-클로로-2-하이드록시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]-1H-아이소인돌-1,3(2H)-다이온(25.8g, 0.0822㏖)의 용액에 요오드화메틸(20.5㎖, 0.329㏖)을 첨가하고, 용액을 0℃에서 교반하였다. 이 용액에 테트라하이드로퓨란(90.4㎖, 0.0904㏖) 중의 1.00M 칼륨 tert-부톡사이드를 첨가 깔때기를 통해 1시간 동안 적하하였다. 반응물을 0.1N HCl(250㎖)을 첨가하여 급냉시키고, EtOAc(600㎖)를 포함하는 분리 깔때기로 옮겼다. 층을 분리하고, 유기층을 1N NaOH(각각 2x100㎖) 및 염수(100㎖)로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 위로 건조하고, 여과시키고 농축시켜 2-[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]-1H-아이소인돌-1,3(2H)-다이온(25.8g, 96%)을 얻고, 이를 다음 단계에서 추가로 정제하지 않고 사용하였다.

단계 7: (1R,2S)-5-클로로-2-메톡시인단-1-아민(8)

에탄올(260㎖, 4.4㏖) 중의 2-[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]-1H-아이소인돌-1,3(2H)-다이온(7)(25.8g, 0.0787㏖)의 현탁액에 하이드라진(4.94㎖, 0.157㏖)을 첨가하고, 플라스크를 환류 콘덴서에 부착하고, 90℃의 욕 온도로 가열하였다. 교반한지 몇분 후 침전물이 형성되기 시작하고, 혼합물을 가열한지 1시간 후 점증 슬러리/고형분이 되었다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 고형분 반응 부산물을 여과시키고, CH₂Cl₂(약 300㎖)로 세척하였다. 휘발물을 진공 하에 여과액으로부터 제거하고, 잔사를 CH₂Cl₂(250㎖) 중에 현탁시키고, 이때 고형분 부산물을 정제로 다시 제거하였다. 휘발물을을 진공 하에 제거하고, 잔사를 CH₂Cl₂(약 50㎖) 중에 다시 현탁시켰다. 고형분 부산물을 최종 시간에 정제로 제거하여 적색/오렌지색의 왁스질 고형분으로서 (1R,2S)-5-클로로-2-메톡시인단-1-아민(15.5g, 99%)을 얻었다. LCMS: (FA) ES+ 분자 이온 198, 주요 이온화 181; ¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.30 (d, J = 7.9, 1H), 7.25 - 7.16 (m, 2H), 4.14 (d, J = 4.9, 1H), 3.89 (td, J = 2.8, 4.9, 1H), 3.29 (s, 3H), 2.89 (ddd, J = 3.8, 16.4, 21.3, 2H), 2.04 (s, 2H). 키랄 HPLC(1.0㎖/분 - 30분 실행에서 95/5/0.1% 헥산/EtOH/DEA로 용리되는 키랄팩 AD 4.6X250 컬럼)은 99% 초과의 ee를 나타냈다.

실시예 2. {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트(I-216)의 합성

단계 1: rel-(1R,5R)-5-({[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸)사이클로펜트-2-엔-1-올(10).

질소 분위기 하에 0℃에서 염화메틸렌(800㎖, 10㏖) 중의 rel-(1R,5R)-5-(하이드록시메틸)사이클로펜트-2-엔-1-올(47.20g, 0.4135㏖), N,N-다이메틸아미노피리딘(2.52g, 0.0207㏖) 및 1H-이미다졸(30.97g, 0.4549㏖)의 용액에 tert-뷰틸다이메틸실릴 클로라이드(28.0g, 0.186㏖)를 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 2.5시간 동안 교반하고, 이때 tert-뷰틸다이메틸실릴 클로라이드(28.0g, 0.186㏖)를 첨가하였다. 반응물을 추가로 2시간 동안 교반하였다. 포화 NaCl 수용액(200㎖) 및 물(200㎖)을 첨가하여 반응물을 급냉시켰다. 층을 분리하고, 유기층을 물(3x200㎖) 및 염수(1x200㎖)로 세척하고, Na₂SO₄ 위로 건조하고, 여과시키고 진공 하에 농축시켰다. 재료를 다음 단계에서 추가로 정제하지 않고 사용하였다.

단계 2: (1S,5S)-5-({[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸)사이클로펜트-2-엔-1-올(11)

메틸 tert-뷰틸 에터(1500㎖, 10㏖) 중의 아크릴 수지(24.9g; 10,800단위/g) 상의 rel-(1R,5R)-5-({[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸)-사이클로펜트-2-엔-1-올(이전 단계로부터의 미정제 (10)) 및 킨디다 안타르크티카의 현탁액에 아세트산 에테닐 에스터(190㎖, 2.05㏖)를 첨가하고, 반응물을 밤새 교반하였다. 고형분을 정제로 제거하고, 휘발물을 진공 하에 제거하여 청명한 무색 오일(143그램)을 제공하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(1㎏ 실리카 겔 컬럼, 용리제 0% 내지 30% Et₂O:헥산)로 정제하여 원하는 거울상이성질체 (1S,5S)-5-({[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸)사이클로펜트-2-엔-1-올(37.5그램, 79.5%)을 얻었다. 키랄 HPLC; 키랄 테크놀로지스 키랄팩(Chiral Technologies Chiralpak) AS RH (4.6X150㎜) 5마이크론 컬럼, 용리제 - 55%(99:1 H₂O/CH₃CN 중의 0.1% 포름산), 45%(95:5 CH₃CN/H₂O 중의 0.1% 포름산)는 99% 초과의 ee를 나타냈다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 5.96 - 5.91 (m, 1H), 5.86 - 5.80 (m, 1H), 4.87 (dd, J = 2.3, 4.9, 1H), 3.87 (dd, J = 4.7, 10.1, 1H), 3.79 (dd, J = 7.7, 10.1, 1H), 2.50 - 2.40 (m, 1H), 2.35(ddt, J = 2.0, 8.4, 16.8, 1H), 2.23 - 2.14 (m, 1H), 0.90 (s, 9H), 0.08 (s, 3H), 0.07 (s, 3H). 원치않는 거울상이성질체를 81.6% 수율로 상응하는 아세테이트로서 단리하였다.

단계 3: tert-뷰틸[((1S,2S)-2-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}사이클로펜트-3-엔-1-일)메톡시]다이메틸실란(12)

오븐 건조된 2ℓ 2구 플라스크 내에서, 질소 하에 냉각된, 염화메틸렌(500㎖, 8㏖) 중의 (1S,5S)-5-({[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸)사이클로펜트-2-엔-1-올(11)(98.07g, 0.3864㏖)의 용액에 1H-이미다졸(31.57g, 0.4637㏖)을 첨가하였다. 생성된 황색의 용액에 약 30분 동안 첨가 깔때기를 통해 염화메틸렌(300㎖, 5㏖) 중의 tert-뷰틸다이메틸실릴 클로라이드(58.2g, 0.386㏖)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 18시간 동안 기계적으로 교반하였다. 반응물을 물(500㎖)을 첨가하여 급냉시키고, 층을 분리하였다. 유기층을 물(2x500㎖)로 세척하고, MgSO₄, 위로 건조하고, 여과시키고, 진공 하에 농축시켜 미정제 잔사로서 tert-뷰틸[((1S,2S)-2-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}사이클로펜트-3-엔-1-일)메톡시]다이메틸실란(143.3g)을 얻고, 이를 추가로 정제하지 않고 사용하였다.

단계 4: (1R,3S,4S)-3-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}-4-({[tert-뷰틸(다이-메틸)실릴]옥시}메틸)사이클로펜탄올(13)

2ℓ 둥근 바닥 플라스크 내에서, tert-뷰틸[((1S,2S)-2-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}사이클로펜트-3-엔-1-일)메톡시]다이메틸실란(12)(12.08g의 미정제 잔사)을 톨루엔으로 3회 공비시키고, 30분 동안 진공 하에 건조하고, 아르곤 분위기 하에 무수 테트라하이드로퓨란(402.7㎖) 중에 용해시켰다. 이 용액에 테트라하이드로퓨란(1.00M, 88.1㎖, 0.0881㏖) 중의 카테콜보란을 적하하였다. 이후, 아르곤을 20분 동안 버블링하여 반응 용액의 산소를 제거하였다. 이후, 트리스(트라이페닐포스핀)로듐(I) 클로라이드(3.26g, 0.00352㏖)를 첨가하고, 반응물을 아르곤 하에 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응물에 물(528.8㎖, 0.5288㏖) 중의 1.00M 수산화나트륨을 첨가한 후, 과산화수소 용액(물 중의 35중량%, 30.79㎖, 0.3525㏖)을 조심스럽게 첨가하고, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 포화 Na₂S₂O₃(500㎖)을 첨가하여 반응물을 급냉시키고, 층을 분리하고, 수성층을 EtOAc(2x300㎖)로 추출하였다. 합한 유기 부분을 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 위로 건조하고, 여과시키고 진공 하에 농축시켰다. 갈색의 오일을 컬럼 크로마토그래피(용리제 헥산 중의 0% 내지 20% 에터)를 정제하여 (1R,3S,4S)-3-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}-4-({[tert-뷰틸(다이-메틸)실릴]옥시}메틸)사이클로펜탄올(7.78g, 2단계 수율 = 66%)을 얻었다. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 4.50 (d, J = 4.3, 1H), 4.34 (td, J = 2.7, 4.8, 1H), 3.71 (dd, J = 7.0, 10.0, 1H), 3.53 (dd, J = 7.0, 10.0, 1H), 2.32 - 2.20 (m, 1H), 2.04 (ddd, J = 2.6, 6.7, 13.9, 1H), 1.85 (ddd, J = 7.1, 10.3, 13.5, 1H), 1.73 (dt, J = 4.8, 13.9, 1H), 1.63 (ddd, J = 2.1, 7.9, 13.5, 1H), 1.35 (s, 1H), 0.88 (s, 9H), 0.86 (s, 9H), 0.04 (s, 3H), 0.03 (s, 9H).

단계 5: 4-{[(1R,3S,4S)-3-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}-4-({[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸)사이클로펜틸]옥시}-6-클로로피리미딘(14)

화염 건조된 50㎖ 둥근 바닥 플라스크에 수산화나트륨(0.322g, 0.008㏖) 및 테트라하이드로퓨란(20㎖, 0.3㏖)을 충전하고, 생성된 현탁액을 질소 분위기 하에 0℃로 냉각시켰다. 현탁액에 0℃에서 0.5㎖ THF 중의 용액 (1R,3S,4S)-3-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}-4-({[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸)사이클로펜탄올(13)(1.45g, 0.004㏖)을 적하하였다. 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반하고, 이때 4,6-다이클로로피리미딘(0.659g, 0.004㏖)을 첨가하고, 혼합물을 실온으로 가온하고, 18시간 동안 교반하였다. 포화 NH₄Cl 수용액(25㎖)을 첨가하여 반응물을 급냉시키고, 분리 깔때기에 옮겼다. 층을 분리하고, 수성층을 tert-BuOMe(3x25㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 MgSO₄ 위로 건조하고, 여과시키고 진공 하에 농축시켰다. 생성된 오일을 실리카 겔 크로마토그래피(용리제 - 헥산 중의 0% 내지 10% EtOAc)로 정제하여 4-{[(1R,3S,4S)-3-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}-4-({[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸)사이클로펜틸]옥시}-6-클로로피리미딘(1.75g, 92% 수율)을 얻었다. LCMS: (FA) ES+ 473; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.55 (d, J = 0.7, 1H), 6.69 (d, J = 0.8, 1H), 5.61 - 5.49 (m, 1H), 4.36 (dd, J = 4.6, 6.8, 1H), 3.73 (dd, J = 7.0, 10.0, 1H), 3.57 (dd, J = 6.7, 9.9, 1H), 2.36 - 2.13 (m, 2H), 2.10 - 1.73 (m, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.88 (s, 9H), 0.08 - 0.00 (m, 12H).

단계 6: {(1S,2S,4R)-2-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}-4-[(6-클로로피리미딘-4-일)옥시]사이클로펜틸}메탄올(15)

2ℓ 둥근 바닥 플라스크 내에서, 4-{[(1R,3S,4S)-3-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]-옥시}-4-({[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}메틸)사이클로펜틸]옥시}-6-클로로피리미딘(14)(20.5g, 0.0433㏖)을 에탄올(647.2㎖, 11.08㏖) 중에 용해시키고, -45℃의 내부 온도로 냉각시켰다. 여기에 EtOH 중의 2% 농축 HCl의 미리 냉각된 (-20℃) 용액(326㎖, 0.0516㏖, 319.5㎖ 에탄올 중에 6.5㎖ 농축 HCl을 희석하여 제조)을 첨가하였다. (플라스크를 캡핑 시 압력 축적 방지하기 위해) 반응 혼합물을 -25℃로 가온한 후, 캡핑하고, -35℃에서 냉장고에 위치시켰다. 반응물을 -35℃에서 18시간 동안 정치시켰다. 반응물을 물(40㎖, 2㏖) 중의 용액으로서 탄산나트륨(13.78g, 0.1300㏖)(HCl에 비해 약 3당량)으로 급냉시켰다. 휘발물을 진공 하에 제거하고, 반응 혼합물을 CH₂Cl₂(750㎖)로 희석하였다. 고형분을 여과시키고, 치워 놓고, 휘발물을 여과액으로부터 진공 하에 제거하였다. 생성된 수성 혼합물을 EtOAc(500㎖) 및 물(200㎖)로 희석하고, 분리 깔때기로 옮겼다. 층을 분리하고, 수성층을 EtOAc(2x250㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na₂SO₄ 위로 건조하고, 여과시키고 진공 하에 농축시켰다. 미정제 잔사를 컬럼 크로마토그래피(약 50㎖ CH₂Cl₂을 갖는 컬럼에 적용, 400g 컬럼, 40분 동안 용리제 0% 내지 40% EtOAc:헥산)로 정제하여 {(1S,2S,4R)-2-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}-4-[(6-클로로피리미딘-4-일)옥시]사이클로펜틸}메탄올(11.2g, 72%)을 얻었다. LCMS: (FA) ES+ 359; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.56 (app d, J = 0.6, 1H), 6.70 (app d, J = 0.8, 1H), 5.62 - 5.54 (m, 1H), 4.56 (dd, J = 5.6, 10.9, 1H), 3.86 - 3.78 (m, 1H), 3.70 (ddd, J = 6.0, 7.6, 11.3, 1H), 2.48 (dd, J = 4.6, 7.6, 1H), 2.42 - 2.31 (m, 1H), 2.23 (ddd, J = 6.3, 9.8, 14.2, 1H), 2.15 - 2.09 (m, 2H), 1.89 (ddd, J = 1.9, 8.0, 14.3, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.12 (s, 3H), 0.11 (s, 3H).

단계 7: {(1S,2S,4R)-2-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]사이클로펜틸}메탄올(16)

350㎖ 밀봉형 반응 용기 내에서, 1-부탄올(99.2㎖, 1.09㏖) 중의 {(1S,2S,4R)-2-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}-4-[(6-클로로피리미딘-4-일)옥시]사이클로펜틸}메탄올(15)(11.2g, 0.0312㏖) 및 N,5-다이클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-아민(9.00g, 0.0384㏖) 용액에, 트라이에틸아민(21.7㎖, 0.156㏖)을 첨가하였다. 용기를 밀봉한 후, 오일 욕 내에서 교반하면서 72시간 동안 148℃로 가열하였다. 용기를 실온으로 냉각시키고, 휘발물을 진공 하에 제거하고, Et₂O(200㎖)를 생성된 잔사에 첨가하였다. 고형분을 음파처리로 균질화하고, 여과시키고, Et₂O(50㎖)로 세정하였다. 여과액에 셀라이트(Celite)(등록상표)(100㎖)를 첨가하고, 휘발물을 진공 하에 제거하였다. 셀라이트(등록상표)에 흡착된 생성물을 건조 로드 카트리지에 첨가하고, 컬럼 크로마토그래피(400g 컬럼, 80분 동안 용리제 0% 내지 80% EtOAc:헥산)를 통해 정제하여 {(1S,2S,4R)-2-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]사이클로펜틸}메탄올(11.5g, 71%)을 얻었다. LCMS: (FA) ES+ 520; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.31 (s, 1H), 7.24 - 7.13 (m, 3H), 5.75 (s, 1H), 5.56 (s, 1H), 5.45 (dt, J = 2.9, 5.8, 2H), 4.57 (dd, J = 5.9, 11.2, 1H), 4.19 (td, J = 1.3, 4.7, 1H), 3.84 - 3.77 (m, 1H), 3.75 - 3.65 (m, 1H), 3.37 (s, 3H), 3.10 (d, J = 16.6, 1H), 2.97 (dd, J = 4.5, 16.7, 1H), 2.58 (dd, J = 4.8, 7.4, 1H), 2.43 - 2.32 (m, 1H), 2.23-2.06 (m, 3H), 1.90 (dd, J = 8.0, 14.2, 1H), 0.91 (s, 9H), 0.11 (s, 3H), 0.10 (s, 3H).

단계 8: {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트(I-216)

N,N-다이메틸아세트아마이드(160㎖, 1.7㏖) 중의 {(1S,2S,4R)-2-{[tert-뷰틸(다이메틸)실릴]옥시}-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]사이클로펜틸}메탄올(16)(11.5g, 0.0221㏖)의 용액에 클로로설폰아마이드(6.64g, 0.0575㏖)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 이때 12M 염산(90㎖, 1.1㏖)을 25분 동안 첨가 깔때기를 적하하여, 내부 반응 온도를 50℃보다 낮게 유지시켰다. 첨가를 완료하면, 냉각 욕을 제거하고, 반응물을 교반하면서 2시간 동안 실온으로 가온하였다. 다음에 물(200.0㎖, 11.10㏖) 중의 탄산나트륨(70.30g, 0.6633㏖)의 현탁액을 천천히 첨가하여 반응물을 조심스럽게 급냉시켰다. 생성된 현탁액을 여과시키고, 고형분을 EtOAc(3회 세정, 전체 - 800㎖)로 세정하였다. 고형분을 치워 놓고, 여과액을 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하였다. 수성층을 3xEtOAc(전체 EtOAc - 2000㎖)로 추출하고, 합한 유기층을 Na₂SO₄ 위로 건조하고, 여과시키고 진공 하에 농축시켰다. 미정제 잔사를 컬럼 크로마토그래피(CH₂Cl₂에 적용, 400g 컬럼, 80분 동안 용리제 0% 내지 10% MeOH:CH₂Cl₂, 이어서 20분 동안 10% MeOH:CH₂Cl₂)로 정제하여 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트(10.3g, 96%)를 얻었다. LCMS: (FA) ES+ 485; ¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.16 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.22 - 7.13 (m, 2H), 5.98 (s, 1H), 5.52 (d, J = 32.8, 1H), 5.34 (s, 1H), 4.43 - 4.35 (m, 1H), 4.32 (dd, J = 7.5, 9.8, 1H), 4.22 (td, J = 2.5, 5.0, 1H), 4.16 (dd, J = 7.3, 9.8, 1H), 3.34 (s, 4H), 3.10 (dd, J = 2.1, 16.6, 1H), 3.02 (dd, J = 4.8, 16.6, 1H), 2.58 - 2.46 (m, 1H), 2.28 (ddd, J = 2.2, 6.9, 14.8, 1H), 2.12 - 1.90 (m, 4H).

단계 9: {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트 HCl 염(I-216 HCl I형)

{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트(I-216)(24.1g, 0.0497㏖)를 교반 막대가 구비된 500㎖ rbf 내에 위치시켰다. 아세토나이트릴(500㎖)을 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 1분 동안 음파처리한 후, 질소 분위기 하에 실온에서 1시간 동안 교반하여 고형분이 완전히 분산되게 하였다. 수성 염산(6.0M, 9.15㎖, 0.0549㏖)을 느린 스트림으로 첨가하고 - 용액이 묽어졌지만, 전체 용액이 그렇지는 않았다. 혼합물을 이전에 제조된 I-216 HCl 염(하기 실시예 3에 기재된 바대로 제조)의 약간의 결정으로 시딩하고, 혼합물을 1분 동안 음파처리한 후, 질소 분위기 하에 실온에서 2시간 동안 교반하고, 혼합물은 이때, 백색의 고형분이 용액으로부터 침전되면서, 쾌 점증되었다. 교반된 혼합물을 다이에틸 에터(500㎖)로 희석한 후, 냉장고에서 밤새 저장하였다. 침전물을 소결 유리 깔때기에 수집하고, 에터로 세척한 후, 진공 하에 40℃에서 밤새 건조하여 보풀보풀한 백색의 결정질 분말로서 표적 화합물(24.37g(94% 수율))이 남았다. ¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.44 (s, 1 H), 8.38 (s, 2 H), 7.43 (s, 2H), 7.36 (s, 1H), 7.23 (dd, J = 20.1, 8.1 Hz, 3H), 6.22 (s, 1H), 5.68 (s, 1H), 5.26 (s, 1H), 4.31 - 4.12 (m, 4H), 4.09 - 3.92 (m, 1H), 3.05 (s, 3H), 2.36 (dt, J = 18.8, 7.6 Hz, 1H), 2.21 (dd, J = 14.0, 6.5 Hz, 1H), 2.05 - 1.93 (m, 2H), 1.89 (dd, J = 13.3, 8.3 Hz, 1H). LCMS: 포름산, [M + H+] = 485.3. 키랄 HPLC(0.75㎖/분 - 60분 실행에서 60/40/0.1% 헥산/EtOH/DEA로 용리되는 키랄셀(Chiralcel) OJ 4.6X250 컬럼)는 생성물이 99.7% ee라는 것을 나타냈다. HPLC 분석은 생성물이 99.2% 순수하다는 것을 나타냈다. 이 실시예 2에서 제조된 I-216 HCl I형에 대한 XRPD 데이터가 도 7에 도시되어 있다. 도 7에서 확인된 피크는 표 5에 도시된 피크를 포함한다.

[표 5]

이 실시예 2에서 제조된 I-216 HCl I형에 대한 DSC 데이터는 도 8에 도시되어 있고, 이 실시예 2에서 제조된 I-216 HCl I형에 대한 TGA 데이터는 도 9에 도시되어 있다.

실시예 3. {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트 염산염(I-216 HCl)의 합성.

{(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트 I-216(4.44g, 0.00916㏖)을 교반 막대가 구비된 250㎖ 둥근 바닥 플라스크 내에 위치시켰다. 아세토나이트릴(82.5㎖)을 교반하면서 첨가하였다. 혼합물을 교반하고, 몇분 동안 음파처리하였다(고형분이 완전히 용해되지 않았다). 플라스크를 빙욕 내에 액침시킨 후, 교반하면서, 수성 염산(6.0M, 1.69㎖, 0.0101㏖)을 느린 스트림으로 첨가하고, 이때 고형분이 부분적으로 용해되었다. 빙욕을 제거하고, 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 실온에서 2시간 동안 교반하고, 이때 점증된 백색의 침전물이 형성되었다. 다이에틸 에터(82.5㎖)를 교반하면서 첨가하고, 생성된 혼합물을 냉장고 내에서 밤새 저장하였다. 침전된 생성물을 소결 깔때기에서 수집하고, 차가운 에터로 세척한 후, 고진공 하에 42℃에서 24시간 동안 건조하여 보풀보풀한 백색의 분말로서 표적 화합물(3.84g(80% 수율))을 얻었다. LCMS: 포름산, [M + H+] = 485.2. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.42 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.27 - 7.18 (m, 2H), 6.26 (s, 1H), 5.78 (s, 1H), 5.30 (s, 1H), 4.46 - 4.38 (td, J = 5.2, 2.0 Hz, 1H), 4.39 - 4.25 (m, 2H), 4.23 - 4.13 (dd, J = 9.9, 7.4 Hz, 1H), 3.37 (s, 3H), 3.18 - 3.04 (m, 2H), 2.62 - 2.47 (m, 1H), 2.42 - 2.31 (ddd, J = 15.0, 6.9, 2.0 Hz, 1H), 2.24 - 2.14 (dt, J = 15.0, 4.6 Hz, 1H), 2.14 - 2.02 (dd, J = 10.3, 5.9 Hz, 2H).

실시예 4. (1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-아민 하이드로클로라이드(20)의 합성

단계 1: 5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-온(18)

온도 프로브, 질소 입구, 냉각 욕 및 오버헤드 기계적 교반기가 구비된 22ℓ 다구 반응기에 메탄올(2400㎖)을 충전하고, -20℃로 냉각시켰다. 황산(384㎖, 7.22㏖)을 첨가 깔때기를 통해 1시간 동안 충전하였다. 온도는 약 -25℃에서 유지되었고, 약 5분 동안 -18℃에서 최고였다. 트라이메틸 오르토포르메이트(906㎖, 8.3㏖), 이어서 고형분으로서 5-클로로-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-온(17)(600.00g, 3.61㏖)을 10분 동안 첨가하였다. 내부 온도가 2℃로 약간 증가하였다. 코서(Koser) 시약(1553g, 3.97㏖)을 20분 동안 메탄올(2400㎖) 중에 용해시키고, 이를 1시간 15분 동안 반응 용기에 첨가하였다. 첨가는 발열성이고, 내부 온도는 약 -20℃에서 유지되었다. 첨가 완료 시, 어두운 적색의 용액을 -20℃에서 1시간 동안 교반하고, 이때 HPLC 분석은 원하는 생성물로 완전히 전환된다는 것을 나타냈다. 물(7200㎖)을 소량 분획으로 첨가하였다. 소량의 물(약 50㎖)을 첨가한 후, 생성물이 갑자기 침전하였다. 교반이 느려지고 어려워졌다. 혼합물을 0℃ 내지 10℃에서 1시간 동안 교반하고, 3000㎖ 굵은 소결 깔때기를 통해 여과시켰다. 정제가 2시간 후 완료되었고, 여과액의 pH가 약 5에 도달할 때가지 케이크를 물(7200㎖)로 세정하였다. 습식 케이크를 반응기에 다시 첨가하고, 헵탄(3000㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 -20℃에서 1시간 동안 교반하고 여과시켰다. 케이크를 헵탄(1200㎖)으로 세정하고, 30분 동안 컨디셔닝하였다. 습식 케이크를 고진공 하에 3일 동안 건조하여 헵탄을 완전히 제거하고, 함수량을 2% 미만으로 감소시켰다. 재료는 99%(HPLC에 의한 AUC)의 순도 및 중량% 검정에 의해 93중량%(622.88g, 88%)를 가졌다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl3, δ): 7.69 (m, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.38 (m, 1H), 4.18 (m, 1H), 3.63 (s, 3H), 3.47 (m, 1H) 및 2.99 (m, 1H).

단계 2: (R,E)-N-((S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일리덴)-2-메틸프로판-2-설핀아마이드(19)

콘덴서, 질소 입구, 가열 맨틀 및 오버헤드 기계적 교반기가 구비된 22ℓ 다구 반응기에 5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-온(18)(622.88g, 3.17㏖) 및 (R)-tert-뷰틸설핀아마이드(460.7g, 3.8㏖)를 충전하였다. 테트라하이드로퓨란(3100㎖)을 혼합물에 첨가하고, 온도가 9℃로 하강하였다. Ti(OEt)₄(985㎖, 4.76㏖)를 10분 동안 첨가하였다. 혼합물을 68℃로 가열하고, 모든 고형분이 약 35℃에서 용해되었다. 5시간 후, 반응물은 HPLC 중량% 검정에 의해 측정할 때 50% 수율을 성취하였다. 원치않는 부분입체이성체가 5% 미만(AUC)으로 분해될 때까지, 반응물을 추가로 5시간 동안 68℃에서 교반하였다. 반응물을 주변 온도로 2시간 동안 냉각시키고, 16시간 동안 교반하였다. HPLC 분석은 이 기간 동안 명확한 반응 프로필 변화를 나타냈다. 다음 단계에서 추가로 정제하지 않고 이 미정제 반응 혼합물을 취했다.

단계 3 및 단계 4: (1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-아민 하이드로클로라이드(20)

질소 입구, 냉각 욕 및 오버헤드 기계적 교반기가 구비된 22ℓ 다구 반응기에 테트라하이드로퓨란(4000㎖) 중의 미정제 (R,E)-N-((S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일리덴)-2-메틸프로판-2-설핀아마이드(21)[대략 475g, 대략 1.58㏖]를 충전하였다. 메탄올(9300㎖)을 소량 분획으로 첨가하였다. 명확한 온도 변화가 관찰되지 않았다. 아세톤/건조 빙욕을 사용하여 혼합물을 -24℃로 냉각시켰다. 2ℓ 3구 둥근 바닥 플라스크에 트라이글림(528㎖)을 충전하고, 9℃로 냉각시켰다. NaBH₄(60.2g, 1.58㏖)를 소량 분획으로 첨가하였다. 온도가 1℃로 약간 증가하였다. 혼합물을 주변 온도로 가온시키고, 모든 고형분이 용해될 때까지 2시간 동안 교반하여 약간 혼탁한 용액을 얻었다. NaBH₄ 용액을 22ℓ 반응기에 -24℃에서 50분 동안 충전하였다. 첨가 속도에 의해 발열을 조절하였다. 명확한 가스 방출이 관찰되지 않았다. 첨가 완료 시, 혼합물을 추가로 2시간 동안 -24℃에서 교반하고, 이때 HPLC 분석은 완전한 반응 및 92%(건조)를 나타냈다. 혼합물을 3시간 동안 주변 온도로 가온시키고, 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 약 7℃로 다시 냉각시키고, 물(950㎖)을 분획으로 첨가하여 내부 온도를 5℃ 증가시켰다. 셀라이트(475g)를 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 이후, 혼합물을 대형 벤치탑 필터(i.d.: 19인치)를 통해 여과시키고, 필터 케이크를 메탄올(4000㎖)로 세정하였다. 여과액의 최종 분획의 HPLC 분석은 유의하지 않은 양의 생성물을 나타냈다. 합한 여과액을 감압 하에 약 6ℓ의 용적으로 농축시켰다. 아이소프로필 아세테이트(950㎖)를 첨가하고, 층을 분리시켰다. 수성층을 아이소프로필 아세테이트(900㎖)로 추출하고, 합한 유기층을 포화 염수(2000㎖)로 세척하였다. 이후, 용액을 황산나트륨 위로 건조하고, 약 2ℓ로 농축시켰다. 이후, 혼합물을 테트라하이드로퓨란(3000㎖x2)과 공비 증류시켰다. 칼-피셔(Karl-Fisher) 분석은 약 0.2%의 함수량을 나타냈다.

질소 입구, 냉각 욕 및 오버헤드 기계적 교반기가 구비된 22ℓ 다구 반응기에 미정제 설포닐 중간체(대략 475g, 대략 1.58㏖) 및 2-메틸-테트라하이드로퓨란(9500㎖)을 충전하였다. 용액을 -20℃로 냉각시키고, 다이옥산(800㎖, 3.16㏖) 중의 4M 염산을 40분 동안 첨가하였다. 발열이 명확하지 않았다. 생성물이 첨가 완료 시 침전되었다. 혼합물을 -20℃에서 추가로 1시간 동안 교반하고, 이때 HPLC 분석은 완전한 전환을 나타냈다. 혼합물을 대형 부흐너(

) 깔때기(i.d.: 11인치)를 통해 여과시켰다. 정제는 2시간이 걸렸다. 필터 케이크를 아세톤(1000㎖)으로 세정하고, 1시간 동안 컨디셔닝하였다. 이후, 고형분을 반응기로 다시 옮기고, 아세톤(3500㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 주변 온도에서 16시간 동안 교반한 후, 여과시켰다. 필터 케이크를 아세톤(500㎖)으로 세정한 후, 진공 하에 16시간 동안 건조하였다. 대략 293g의 생성물을 미백색의 고형분으로서 얻었다. HPLC 분석은 96% 순도 및 96% ee를 나타냈다. 콘덴서, 질소 입구, 가열 맨틀 및 오버헤드 기계적 교반기가 구비된 22ℓ 다구 반응기에 (1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-아민 하이드로클로라이드(20)(290g, 1.24㏖) 및 에탄올(5200㎖)을 충전하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 약간 혼탁한 용액을 얻었다. 혼합물을 미세 소결 깔때기를 통해 여과시키고, 투명한 여과액을 반응기로 다시 충전하였다. 용액을 55℃로 가열하고, 30분 동안 교반하였다. 2-메톡시-2-메틸프로판(5200㎖)을 1.5시간 동안 첨가하고, 온도를 첨가 동안 55℃에서 유지시켰다. 고형분이 첨가 완료 시 침전되었다. 생성된 백색의 현탁액을 55℃에서 1시간 동안 교반하고, 2시간 동안 주변 온도로 천천히 냉각시켰다. 혼합물을 주변 온도에서 2일 동안 교반한 후, 대형 부흐너 깔때기(i.d.: 11인치)를 통해 여과시켰다. 필터 케이크를 MTBE(1000㎖)로 세정하고, 진공 하에 16시간 동안 건조하였다. 생성물을 백색의 고형분(184.4g, 50%, >99% AUC, >99% ee)으로서 얻었다. ¹H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 7.50 (m, 1H), 7.37 (m, 2H), 4.78 (m, 1H), 4.40 (m, 1H), 3.51 (s, 3H) 및 3.19 (m, 1H).

실시예 5. ((1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일아미노)피리미딘-4-일옥시)-2-하이드록시사이클로펜틸)메틸 설파메이트 하이드로클로라이드 I형(I-216 HCl I형)의 합성

단계 1: ((1R,4S)-4-(벤질옥시)-3-(벤질옥시메틸)사이클로펜트-2-엔일옥시)트라이메틸실란(22)

질소 블랭킷 하에 -15℃에서 2-메톡시-2-메틸프로판(2000㎖) 중의 다이프로필아민(212㎖, 1.55㏖)의 용액에 헥산(567㎖, 1.42㏖) 중의 2.50M n-뷰틸리튬을, -10℃ 미만의 온도를 유지시키면서, 10분 동안 천천히 첨가하였다. 생성된 백색의 현탁액을 -15℃에서 30분 동안 교반하였다. 이 현탁액에, -10℃ 미만의 온도를 유지시키면서, 메틸 tert-뷰틸 에터(1200㎖) 중의 용액으로서 30분 동안 천천히 (1S,2R,3S,5R)-3-(벤질옥시)-2-(벤질옥시메틸)-6-옥사바이사이클로[3.1.0]헥산(21)(400.00g, 1.29㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 -15℃에서 30분 동안 교반하였다. TLC 분석은 남은 출발 물질(20% 에틸 아세테이트/헵탄)이 없다는 것을 나타냈다. -10℃ 미만의 온도를 유지시키면서 클로로트라이메틸실란(204㎖, 1.61㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 가온하고, 30분 동안 교반하였다. TLC 분석은 알콜 중간체(20% 에틸 아세테이트/헵탄)가 없다는 것을 나타냈다. 8℃ 미만의 온도를 유지시키면서 물(4ℓ)을 천천히 첨가하여 반응 혼합물을 급냉시켰다. 수성층을 분리하고, 유기층을 물(3x4ℓ)로 3회 추출하고 물(4ℓ) 중의 포화 염화나트륨으로 1회 추출하였다. 유기층을 감압 하에 농축시켜 오렌지색의 오일(480g, 97.4%)을 생성하였고, 이를 추가로 정제하지 않고 사용하였다. ¹H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 7.18 (m, 10H), 5.65 (s, 1H), 4.55 (t, 1H), 4.30 (m, 5H), 4.02 (s, 2H), 2.58 (m, 1H), 1.47 (m, 1H) 및 0.00 (s, 9H).

단계 2: (1S,3S,4S)-3-(벤질옥시)-4-(벤질옥시메틸)사이클로펜탄올(23)

테트라하이드로퓨란(9.6ℓ) 중의 ((1R,4S)-4-(벤질옥시)-3-(벤질옥시메틸)사이클로펜트-2-엔일옥시)트라이메틸실란(22)(478.00g, 1.2494㏖)의 용액에 황산바륨(265.9g, 0.1249㏖) 상의 Pd, 5중량%를 첨가하고, 혼합물을 200rpm에서 교반하면서 수소 100psi 하에 주변 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 18시간 후 HPLC 분석은 출발 물질 소모를 나타냈다. 반응 혼합물을 중간 소결 깔때기를 통해 여과시키고, 베드를 테트라하이드로퓨란(2000㎖)으로 세척하였다. 여과액을 농축하여 황색의 오일을 생성시켰다. 생성된 오일을 에틸 아세테이트(2000㎖) 중에 채우고, 여기에 물(2000㎖) 중의 2.0M 염산을 첨가하고, 이상 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 유기층을 분리하고, 물(2000㎖) 중의 포화 중탄산나트륨으로 1회 추출하고, 물(2000㎖) 중의 2.0M 수산화나트륨으로 2회 추출하고, 물(2000㎖) 중의 포화 염화나트륨으로 최종적으로 추출하였다. 유기층을 농축시켜 갈색의 오일(344g, 88%)을 생성시키고, 이를 추가로 정제하지 않고 사용하였다. ¹H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 7.18 (m, 10H), 4.38 (m, 4H), 4.12 (m, 1H), 3.85 (t, 1H), 3.68 (m, 1H), 3.44 (m, 1H), 2.00 (m, 3H), 1.75 (m, 1H) 및 1.42 (m, 1H).

단계 3: (1R,3S,4S)-3-(벤질옥시)-4-(벤질옥시메틸)사이클로펜탄올(24)

0℃에서 염화메틸렌(3400㎖) 및 트라이에틸아민(455.08㎖, 3265.0m㏖) 중의 (1S,3S,4S)-3-(벤질옥시)-4-(벤질옥시메틸)사이클로펜탄올(23)(340.00g, 1088.3m㏖)의 용액에, 10℃ 미만의 온도를 유지시키면서, 질소 블랭킷 하에 메탄설포닐 클로라이드(92.661㎖, 1197.2m㏖)를 천천히 첨가하였다. 반응물을 주변 온도로 가온시키고, 1시간 동안 교반하였다. HPLC는 완전한 출발 물질 소모를 나타냈다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 10℃ 미만의 온도를 유지시키면서 물(1700㎖)로 급냉시켰다. 유기물을 분리하고, 물(1700㎖)로 2회 추출하고 물(1700㎖) 중의 포화 중탄산나트륨으로 2회 추출하였다. 황산나트륨(50g)을 첨가하고, 혼합물을 10분 동안 교반하였다. 슬러리를 여과시키고, 여과액을 농축시켜 갈색의 오일을 생성시켰다. 오일을 테트라하이드로퓨란(3400㎖) 중에 채우고, 여기에 테트라뷰틸암모늄 아세테이트(656.28g, 2176.7m㏖)를 첨가하고, 혼합물을 주변 온도에서 20시간 동안 교반하였다. HPLC 분석은 완전한 출발 물질 소모를 나타냈다. 반응 혼합물을 약 2용적(700㎖)으로 농축시키고, 에틸 아세테이트(3400㎖)를 첨가하고, 혼합물을 물(1700㎖)로 3회 추출하고 물(1700㎖) 중의 포화 염화나트륨으로 1회 추출하였다. 유기물을 농축시키고, 생성된 잔사를 0% 내지 20% 에틸 아세테이트/헥산[에틸 아세테이트(4ℓ) + 헥산(16ℓ)]으로 실리카 겔(1㎏)의 플러그를 통해 용리시켰다. 원하는 분획을 합하고 농축시켜 갈색의 잔사를 생성시켰다. 생성된 잔사에, 메탄올(4000㎖), 물(2000㎖) 중의 수산화나트륨(130.59g, 3265.0m㏖)의 혼합물을 첨가하고, 반응 혼합물을 주변 온도에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC 분석은 완전한 출발 물질 소모를 나타냈다. 반응 혼합물 중의 대부분의 메탄올을 농축시키고, 물(1700㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트(3x1700㎖)로 3회 추출하였다. 합한 유기물을 물(1700㎖) 중의 포화 염화나트륨으로 세척하고, 황산나트륨 위로 건조하였다(50g). 생성된 슬러리를 여과시키고 농축시켜 담갈색의 오일(238g, 70%)을 생성시켰다. ¹H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 7.28 (m, 10H), 4.50 (m, 3H), 4.38 (m, 2H), 4.12 (t, 1H), 3.70 (m, 1H), 3.45 (m, 1H), 2.52 (m, 1H), 2.11 (m, 1H) 및 1.75 (m, 3H).

단계 4: 4-((1R,3S,4S)-3-(벤질옥시)-4-(벤질옥시메틸)사이클로펜틸옥시)-6-클로로피리미딘(25)

0℃에서, 질소 블랭킷 하에, 테트라하이드로퓨란(1150㎖) 중의 (1R,3S,4S)-3-(벤질옥시)-4-(벤질옥시메틸)사이클로펜탄올(24)(226.500g, 725.026m㏖) 용액에, 10℃ 미만의 온도를 유지시키면서, 광유(86.995g, 2175.1m㏖) 중의 NaH, 60%를 적하하였다. 이후, 테트라하이드로퓨란(1150㎖) 중의 4,6-다이클로로피리미딘(118.81g, 797.53m㏖)의 용액을, 5℃ 미만의 온도를 유지시키면서, 30분 동안 첨가하였다. 혼합물을 주변 온도로 가온하고, 24시간 동안 교반하였다. HPLC 분석은 반응 혼합물이 74%의 출발 물질을 포함한다는 것을 나타냈다. 반응 혼합물을, 10℃ 미만의 온도를 유지시키면서, 물(1150㎖) 중의 물(1150㎖)과 포화 염화암모늄의 혼합물로 급냉시켰다. 테트라하이드로퓨란 층을 분리하고, 약 2용적(500㎖)으로 농축시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트(1150㎖)로 2회 추출하였다. 유기층을 합하고, 물(1150㎖)로 2회 세척하고 물(1150㎖) 중의 포화 염화나트륨으로 1회 세척하였다. 이후, 유기물을 농축시켰다. 잔사를 테트라하이드로퓨란(2300㎖) 중에 채우고, 질소 블랭킷 하에 0℃로 냉각시켰다. 광유(86.995g, 2175.1m㏖) 중의 NaH, 60%를, 10℃ 미만의 온도를 유지시키면서, 적하하였다. 혼합물을 주변 온도로 가온하고, 16시간 동안 교반하였다. HPLC 분석은 반응이 완료된다는 것을 나타냈다. 반응 혼합물을 물(1150㎖) 중의 물(1150㎖)과 포화 염화암모늄의 혼합물로 급냉시켰다. 테트라하이드로퓨란 층을 분리하고, 약 2용적(500㎖)으로 농축시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트(1150㎖)로 2회 추출하였다. 유기층을 합하고, 물(1150㎖)로 2회 세척하고 물(1150㎖) 중의 포화 염화나트륨으로 1회 세척하였다. 이후, 유기물을 농축시켜 미정제 중간체 4-((1R,3S,4S)-3-(벤질옥시)-4-(벤질옥시메틸)사이클로펜틸옥시)-6-클로로피리미딘을 생성시켰다. 이 미정제 반응 혼합물을 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 취했다.

단계 5: (1S,2S,4R)-4-(6-클로로피리미딘-4-일옥시)-2-(하이드록시메틸)사이클로펜탄올(26)

미정제 중간체 4-((1R,3S,4S)-3-(벤질옥시)-4-(벤질옥시메틸)사이클로펜틸옥시)-6-클로로피리미딘(25)을 염화메틸렌(3000㎖) 중에 채우고, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 염화메틸렌(1087.538㎖, 1087.538m㏖) 중의 1.0M 트라이클로로-보란을 10℃ 미만으로 유지시키면서 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. HPLC 분석은 출발 물질 소모를 나타냈다. 반응 혼합물을 물(2300㎖) 중의 포화 중탄산나트륨에 천천히 첨가하고, 이상 혼합물을 20분 동안 교반하였다. 염화메틸렌 층을 분리하고, 수성물질을 염화메틸렌(2300㎖)으로 2회 추출하였다. 유기물을 합하고 농축시켰다. 잔사를 50% 내지 100% 에틸 아세테이트/헥산(헥산(6ℓ) + 에틸 아세테이트(14ℓ)로 실리카 겔(1㎏) 플러그를 통해 용리시켜 정제하였다. 원하는 분획을 합하고 농축시켜 적색의 고형분(124g, 70%)을 생성시켰다. ¹H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 8.58 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 5.61 (m, 1H), 4.39 (t, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.61 (m, 1H), 2.25 (m, 3H) 및 2.00 (m, 2H)

단계 6: (1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일아미노)피리미딘-4-일옥시)-2-(하이드록시메틸)사이클로펜탄올(27)

500㎖ 파르(Parr) 압력 용기에 N-메틸피롤리디논(200㎖) 중의 (1S,2S,4R)-4-(6-클로로피리미딘-4-일옥시)-2-(하이드록시메틸)사이클로펜탄올(26)(25.00g, 102.2m㏖)을 첨가하였다. 이 혼합물에 (1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-아민 하이드로클로라이드(31.10g, 132.8m㏖), 이어서 N,N-다이아이소프로필에틸아민(88.99㎖, 510.9m㏖)을 첨가하였다. 이후, 용기를 밀봉하고, 질소 30psi로 가압하고, 22시간 동안 130℃로 가열하였다. 반응이 온도에 도달할 때까지 압력을 50psi로 증가시키고 반응 과정 동안 유지시켰다. 22시간 후, 반응물을 주변 온도로 냉각시키고, 압력을 빼냈다. 염화메틸렌(250㎖)을 반응 혼합물에 첨가하고, 이후 이를 물(250㎖) 중의 포화 중탄산나트륨으로 추출하였다. 이후, 유기층을 물(250㎖)로 4회 추출하고 물(250㎖) 중의 포화 염화나트륨으로 1회 추출하였다. 이후, 유기층을 황산나트륨(7.5g) 위로 건조하고 여과시키고 농축시켰다. 검정색의 반고체 오일에 아세토나이트릴(250㎖)을 첨가하고, 혼합물을 주변 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 이때 베이지색의 고형분이 침전되었고, 이를 여과시키고 감압 하에 40℃에서 16시간 동안 건조하였다. 연갈색의 고형분(17g, 41%)을 얻었다. ¹H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 8.19 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.18 (m, 2H), 5.97 (s, 1H), 5.58 (m, 1H), 5.30 (m, 1H), 4.41 (m, 1H), 4.22 (m, 1H), 3.76 (m, 1H), 3.61 (m, 1H), 3.30 (s, 3H), 3.05 (m, 2H), 2.30 (m, 2H) 및 1.97 (m, 3H).

단계 7: ((1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일아미노)피리미딘-4-일옥시)-2-하이드록시사이클로펜틸)메틸 설파메이트(I-216)

3ℓ 반응기 내에서 (1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일아미노)피리미딘-4-일옥시)-2-(하이드록시메틸)사이클로펜탄올(27)(85.00g, 209.4m㏖)을 N-메틸피롤리디논(510㎖) 중에 용해시켰다. 이 용액에 (4-아자-1-아조니아바이사이클로[2.2.2]옥트-1-일설포닐)(tert-부톡시카보닐)아자나이드-1,4-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥탄(1:1) 하이드로클로라이드(실시예 6에 기재된 바대로 제조)(368g, 838m㏖)를 일 분획으로 적하하고, 아세토나이트릴(255㎖)을 천천히 첨가하였다. 생성된 점증 슬러리를 주변 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 완료 시, 물(595㎖)을 주변 온도에서 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물에, 에틸 아세테이트(1.70ℓ)를 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 물(2x595㎖)로 2회 세척하고 물(595㎖) 중의 포화 염화나트륨으로 1회 세척하였다. 합한 수성층을 에틸 아세테이트(850㎖)로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 황산나트륨(20g) 위로 건조하고 여과시키고 농축시켰다. 잔사를 아세토나이트릴(680㎖) 중에 채우고, 생성된 용액을 5℃ 미만의 온도로 냉각시켰다. 물(255㎖, 3060m㏖) 중의 12.0M 염산을, 10℃ 미만의 내부 온도를 유지시키면서, 천천히 첨가하고, 생성된 혼합물을 주변 온도에서 13시간 교반하였다. HPLC는 Boc 보호 중간체가 남아 있지 않다는 것을 나타낸다. 반응 혼합물을 20℃ 미만을 유지시키면서 물(850㎖) 중의 포화 탄산나트륨과 물(850㎖)의 혼합물에 천천히 첨가하였다. 이후, 에틸 아세테이트(850㎖)를 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 물(850㎖)로 2회 추출하고 물(850㎖) 중의 포화 염화나트륨으로 1회 추출하였다. 수성층을 합하고, 에틸 아세테이트(850㎖)로 2회 추출하였다. 유기물을 합하고, 황산나트륨(20g) 위로 건조하고 여과시키고 농축시켰다. 생성된 잔사를 염화메틸렌(170㎖) 중에 용해시키고, 4ℓ 염화메틸렌, 4ℓ 염화메틸렌/에틸 아세테이트(1:1) 및 최종적으로 8ℓ 에틸 아세테이트로 실리카(1㎏)의 플러그를 통해 용리시켰다. 원하는 분획을 합하고 농축시켜 잔류 NMP를 포함하는 황색의 반고체(71g)를 생성시켰다. ¹H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 8.19 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.18 (m, 2H), 5.97 (s, 1H), 5.58 (m, 1H), 5.35 (m, 1H), 4.35 (m, 2H), 4.15 (m, 2H), 3.30 (s, 3H), 3.05 (m, 2H), 2.51 (m, 1H), 2.30 (m, 2H) 및 2.00 (m, 2H).

단계 8: ((1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일아미노)피리미딘-4-일옥시)-2-하이드록시사이클로펜틸)메틸 설파메이트 하이드로클로라이드 I형(I-216 HCl I형)의 제법

3구 3ℓ 반응기 내에, 단계 7로부터의 미정제 I-216(142.00g, 292.81 m㏖)을 아이소프로필 알콜(710㎖) 중에 슬러리화하고, 혼합물을 20분 동안 60℃로 가열하였다. 이후, 물(97.604㎖, 585.62m㏖) 중의 6.0M 염산을 매우 천천히 첨가하고, 혼합물을 60℃에서 10분 동안 교반하였다. 10㎖ 6M HCl을 첨가한 후 완전한 분해가 7℃의 발열과 함께 관찰되었다. 반응 혼합물을 50℃로 냉각시키고, 이미 제조된 I-216 HCl I형(하기 실시예 7에 기재된 바대로 제조)(100㎎)으로 시딩하였다. 고형분이 천천히 침전되기 시작하고, 이 슬러리를 50℃에서 60분 동안 교반하였다. 아이소프로필 아세테이트(1420㎖)를 45℃ 초과로 유지시키면서 1시간 동안 천천히 첨가하였다. 혼합물을 주변 온도로 냉각시키고, 2시간 동안 교반하고, 5℃ 미만으로 냉각시키고, 2시간 동안 교반하였다. 고형분을 여과시키고, 베드를 아세트산, 1-메틸에틸 에스터(710㎖)로 중력 세척하였다. 고형분을 감압 하에 45℃에서 16시간 동안 건조하여 백색의 고형분(113.5g, 2단계에 걸쳐 51%)을 생성시켰다. ¹H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 8.48 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.22 (m, 2H), 6.30 (m, 1H), 5.82 (m, 1H), 5.31 (m, 1H), 4.44 (t, 1H), 4.30 (m, 2H), 4.18 (m, 1H), 3.35 (s, 3H), 3.15 (m, 2H), 2.55 (m, 1H), 2.38 (m, 1H) 및 2.17 (m, 3H). LCMS: R_f = 9.30분, ES⁺ = 485(FA). I형에 대한 XRPD 데이터가 도 4에 도시되어 있다. I형에 대한 DSC 데이터가 도 5에 도시되어 있고, I형에 대한 TGA 데이터가 도 6에 도시되어 있다.

실시예 6: (4-아자-1-아조니아바이사이클로[2.2.2]옥트-1-일설포닐)(tert-부톡시카보닐)아자나이드-1,4-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥탄(1:1) 하이드로클로라이드의 합성

클로로설포닐 아이소사이아네이트(45.2㎏, 319.4㏖)를 톨루엔(194.2㎏)에 첨가하고, 생성된 용액을 약 0℃ 내지 6℃로 냉각시켰다. 이후, 톨루엔(48.0㎏) 중의 tert-뷰틸 알콜(23.6㎏, 318.4㏖)의 용액을, 약 0℃ 내지 6℃의 온도를 유지시키면서, 90분 동안 첨가하였다. 이후, tert-뷰틸 알콜이 완전히 소비될 때까지(대략 80분) 혼합물을 교반하였다. 톨루엔(293.0㎏) 중의 트라이에틸렌다이아민(DABCO, 71.4㎏, 636.5㏖)의 용액을, 약 0℃ 내지 6℃의 온도를 유지시키면서, 2.5시간 동안 혼합물에 첨가하였다. 이후, 혼합물을 20℃ 내지 25℃로 가온하고, 8시간 동안 교반하였다. 고형분 생성물을 질소 분위기 하에 원심분리 정제로 분리시키고, 톨루엔(180.8㎏), 이어서 tert-뷰틸 메틸 에터(51.0갤론)로 세척하고, 추가의 리커(liquor)가 배출되지 않는 것으로 보일 때까지(대략 60분) 스피닝하였다. 이후, 고형분을 진공 하에 추가로 건조하여 132.9㎏의 (4-아자-1-아조니아바이사이클로[2.2.2]옥트-1-일설포닐)(tert-부톡시카보닐)아자나이드-1,4-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥탄(1:1) 하이드로클로라이드를 얻었다.

실시예 7: 실시예 5에 사용된 시드 I-216 염산염 I형의 합성

단계 1: tert-뷰틸 [({(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메톡시)설포닐]카바메이트

500㎖ 반응기 내에서, 아세토나이트릴(30㎖) 중의 (4-아자-1-아조니아바이사이클로[2.2.2]옥트-1-일설포닐)(tert-부톡시카보닐)아자나이드-1,4-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥탄(1:1) 하이드로클로라이드(43.4g, 98.6m㏖)의 용액에 N-메틸피롤리디논(60㎖) 중의 (1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일아미노)피리미딘-4-일옥시)-2-(하이드록시메틸)사이클로펜탄올(27)(10g, 24.6m㏖)을 첨가하였다. 생성된 점증 슬러리를 주변 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 완료 시, 물(66.6㎖)을 주변 온도에서 천천히 첨가하였다. 생성된 혼합물에, 에틸 아세테이트(66.7㎖)를 첨가하였다. 수성층을 에틸 아세테이트(3x66.6㎖)로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 물(66.7㎖)로 1회 세척하고 물(66.7㎖) 중의 포화 염화나트륨으로 1회 세척하였다. 합한 유기층을 황산마그네슘(3g) 위로 건조하고 여과시키고 농축시켰다. 이 생성물을 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 취했다.

단계 2: ((1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일아미노)피리미딘-4-일옥시)-2-하이드록시사이클로펜틸)메틸 설파메이트 하이드로클로라이드 I형(I-216 HCl I형)의 제법

단계 1로부터의 잔사(10g)를 아세토나이트릴(81.5㎖) 중에 채우고, 생성된 용액을 5℃ 미만의 온도로 냉각시켰다. 12.0M 염산(27.7㎖, 904m㏖)을, 10℃ 미만의 내부 온도를 유지시키면서, 천천히 첨가하고, 생성된 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반한 후, 실온으로 가온하고 15시간 동안 교반하였다. HPLC는 Boc 보호 중간체가 남아 있지 않다는 것을 나타냈다. 반응 혼합물에 물(20㎖, 1110m㏖)을 첨가하고, 온도를 60℃로 증가시켰다. 일단 이 온도에서 반응물을 실시예 8에 기재된 바대로 제조된 물질로 시당하였다. 시드를 유지시키고, 반응물을 실온으로 천천히 냉각시키고 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 여과시키고 물(66㎖)로 세척하고 감압 하에 밤새 건조하였다. 이는 60% 수율로 생성물의 백색의 고형분(5.3g, 9.8m㏖)을 생성시켰다. ¹H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 8.19 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.18 (m, 2H), 5.97 (s, 1H), 5.58 (m, 1H), 5.35 (m, 1H), 4.35 (m, 2H), 4.15 (m, 2H), 3.30 (s, 3H), 3.05 (m, 2H), 2.51 (m, 1H), 2.30 (m, 2H) 및 2.00 (m, 2H).

실시예 8: 실시예 7에 사용된 시드 I-216 염산염 I형의 합성

tert-뷰틸 [({(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메톡시)설포닐]카바메이트(1g; 실시예 7에 기재된 것과 유사한 방식으로 제조, 단계 1)를 아세토나이트릴(8.12㎖) 중에 채우고, 생성된 용액을 5℃ 미만의 온도로 냉각시켰다. 12.0M 염산(2.7㎖, 89m㏖)을, 10℃ 미만의 내부 온도를 유지시키면서, 천천히 첨가하고, 생성된 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반한 후, 실온으로 가온하고 15시간 동안 교반하였다. HPLC는 Boc 보호 중간체가 남아 있지 않다는 것을 나타냈다. 반응 혼합물에 소량의 물 및 중탄산나트륨을 첨가하여 중화시키지만, 이 양은 용액을 완전히 중화시키지 않았다. 반응 혼합물을 40℃에서 농축시킨 후, 용액을 실온으로 냉각시키고 밤새 교반하였다. 추가의 물을 첨가하고, 용액을 더 긴 시간 동안 교반하였다. 반응물을 여과시키고 물로 세척하고 감압 하에 밤새 건조하여 68% 수율로 생성물의 백색의 고형분(0.598g, 1.15m㏖)을 생성시켰다. ¹H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 8.19 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.18 (m, 2H), 5.97 (s, 1H), 5.58 (m, 1H), 5.35 (m, 1H), 4.35 (m, 2H), 4.15 (m, 2H), 3.30 (s, 3H), 3.05 (m, 2H), 2.51 (m, 1H), 2.30 (m, 2H) 및 2.00 (m, 2H).

이 백색의 고형분(250㎎, 0.479m㏖)을 아이소프로필 알콜(2.5㎖, 32.6m㏖) 중에 현탁시키고 60℃로 가열하였다. 물(0.120㎖, 0.959m㏖) 중의 8.0M HCl을 첨가하고 약간 분해되었다. 15분 후, 가열을 제거하고, 현탁액을 실온으로 냉각시키고 밤새 교반하였다. 고형분을 여과시키고 5% 수성 IPA로 세척하고 감압 하에 밤새 건조하였다. 이에 의해 81.6% 수율의 표적 화합물(0.204g, 0.391m㏖)을 얻었다. ¹H NMR (300 MHz, CD3OD, δ): 8.19 (s, 1H), 7.25 (s, 1H), 7.18 (m, 2H), 5.97 (s, 1H), 5.58 (m, 1H), 5.35 (m, 1H), 4.35 (m, 2H), 4.15 (m, 2H), 3.30 (s, 3H), 3.05 (m, 2H), 2.51 (m, 1H), 2.30 (m, 2H) 및 2.00 (m, 2H).

실시예 9: ((1S,2S,4R)-4-(6-((1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일아미노)피리미딘-4-일옥시)-2-하이드록시사이클로펜틸)메틸 설파메이트 하이드로클로라이드 II형(I-216 HCl II형)의 제법

I-216 HCl I형(0.5g, 상기 실시예 5에 기재된 바대로 제조)을 주변 온도에서 18시간 동안 물(10㎖) 중에 슬러리화하였다. 생성된 고형분을 여과시키고 물(2.5㎖)로 세척하고 감압 하에 주변 온도에서 16시간 동안 건조하였다. 이에 의해 90% 수율의 백색의 고형분(0.45g)으로서 I-216 HCl의 II형을 얻었다. ¹H NMR (300 MHz, CD₃OD, δ): 8.35 (s, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.21 (m, 2H), 6.17 (m, 1H), 5.65 (m, 1H), 5.35 (m, 1H), 4.41 (t, 1H), 4.30 (m, 2H), 4.17 (m, 1H), 3.36 (s, 3H), 3.10 (m, 2H), 2.55 (m, 1H), 2.35 (m, 1H) 및 2.10 (m, 3H). LCMS: R_f = 9.29분, ES⁺ = 485(FA). II형에 대한 XRPD 데이터가 도 10에 도시되어 있다.

실시예 10: 생체내 종양 약력학적 모델

100㎕ 인산염 완충 식염수 중의 HCT116 종양 세포(2x10⁶)(ATCC CCL-247호)를 26게이지 바늘침을 사용하여 암컷 Ncr 누드 마우스(5주령 내지 8주령, 챨스 리버(Charles River))의 오른쪽 옆구리에 피하 공간으로 무균 주사하였다. 접종 후 7일에 시작하여, 노기스(vernier caliper)를 사용하여 종양을 1주 2회 측정하였다. 표준 절차(0.5x(길이x폭²))를 이용하여 종양 용적을 계산하였다. 종양이 대략 3 내지 700㎣의 용적에 도달하였을 때, 마우스를 군으로 무작위화하고, 다양한 농도에서 화합물 억제제(200㎕)를 피하 주사하였다. 종양을 수확하고 코바리스 백(Covaris bag)에서 파괴한 후 코바리스 E200에서 음파처리하기 위해 드라이 아이스 위의 유리관으로 옮겼다. 포유동물 단백질 추출 시약(MPER) 용리 완충제(피어스(Pierce), 78501)를 하기(최종 농도)로 보충하였다: 1x 프로테아제 억제제 칵테일 세트(칼바이오켐(Calbiochem), 539134), 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 중의 5mM o-펜안트롤린(시그마(Sigma), P1294호 및 시그마 DMSO D2650호), 10mM 요오도아세트이미드(시그마), 2mM 나트륨 오르토바나데이트(시그마, S6508호), 25mM 나트륨 플루오라이드 및 25mM β-글라이세로포스페이트. 차가운 용리 완충제(300 내지 800㎕)를 음파처리 바로 전에 종양에 첨가하였다. 음파처리 단계는 다음과 같다: 10초, 1% 500mV50, 20초, 20% 500mV50, 20초, 10% 500mV50. 음파처리 샘플을 웨트 얼음(wet ice)에 위치시킨 후, 에펜도르프 관(Eppendorf tube)에 붓고 원심분리기(microfuge)에서 14000rpm에서 4℃에서 20분 동안 스피닝하였다. 상청액을 새로운 관에 옮기고, 피어스 바이신콜린산(bicinchoninic acid: BCA) 시약 및 단백질 표준품을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 종양 용리물을 -80℃에서 저장하였다.

네딜레이트화 쿨린의 정량 분석을 위한 절차는 하기와 같다: 리튬 도데실 설페이트(LDS) 로딩 완충제 및 샘플 환원제(인비트로겐(Invitrogen) NP0007 및 NP0004)와 함께 20㎍ 종양 용리물을 4% 내지 12% 바이스-트리스 겔, 1.5mM, 10웰 겔(인비트로겐 NP0315Box)에 로딩하였다. 겔을 2-(N-모르폴리노) 에탄 설폰산(MES) 실행 완중체(인비트로겐 NP0002) 중에 150V에서 실행하였다. 겔을 적절한 분자량 마커에서 절단하고, 반건조 이송 장치(아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences), TE70)를 사용하여 PVDF-FL(밀리포어(Millipore), IPFL00010)로 옮겼다. 이송 후, 막을 오디세이 차단제(Odyssey blocker)(LI-COR 바이오사이언시스 927-40000호)에서 차단한 후, 오디세이 차단제 중의 1차 항체 + 0.1% 트윈-20(시그마 P7949호)과 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 막을 트윈-20(TBST)과 트리스 완충 식염수 중에 3회 세척한 후, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 680 라벨링 염소 항래빗 면역글로빈 G, 중쇄 및 경쇄(IgG(H+L)) 항체(모레큘러 프로브즈(Molecular Probes) 카달로그 A-21109호)와 항온처리하였다. 암소에서 제2 항체와 항온처리 1시간 후, 막을 TBST로 5회 세척하고 트리스 완충 식염수(TBS)로 1회 세척하고, 광으로부터 보호하였다. 막을 1시간 이상 동안 건조한 후, 오디세이 인프라레드 이미징 시스템(LI-COR 바이오사이언시스)으로 스캐닝하였다. 하기 1차 항원을 사용하였다: 항-Nedd-8(MIL10 클론 52-9-5, 에피토믹스(Epitomics)에 의해 개발, 1:4000 희석). 1:2000에서 제2 항체를 사용하였다. 웨스턴 블롯 신호의 정량분석을 오디세이 소프트웨어로 수행하였다.

본 명세서에 언급된 특허 및 과학 문헌은 당해 분야의 당업자에게 이용 가능한 지식을 확립한다. 달리 언급되지 않은 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자가 통상 이해하는 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 등록 특허, 출원 및 참조문헌은, 이들 각각이 구체적으로 및 개별적으로 참조문헌에 의해 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로, 본 명세서에 참조문헌으로 포함된다. 불일치의 경우, 정의를 비롯하여 본 개시내용이 지배하는 것으로 의도된다.

본 발명의 여러 실시양태가 기재되어 있지만, 제공된 기본 실시예가 변경되어 본 발명의 화합물, 방법 등을 이용하는 다른 실시양태를 수행할 수 있다는 것이 명확하다. 따라서, 본 발명의 범위가 예의 방식으로 본 명세서에 표시되고, 특정 실시양태에 의해 제한되도록 의도되지 않는 것으로 이해된다.

Claims (22)

1. 화합물 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트를 포함하는 화학 물질(chemical entity).
2. 제1항에 있어서, 상기 화학 물질은 염산염 또는 이의 약학적으로 허용되는 용매화물인 것인 화학 물질.
3. 제2항에 있어서, 상기 화학 물질은 실질적으로 결정질 I형인 것인 화학 물질.
4. 제2항에 있어서, 적어도 70중량%가 결정질 I형인 것인 화학 물질.
5. 제2항에 있어서, 적어도 80중량%가 결정질 I형인 것인 화학 물질.
6. 제2항에 있어서, 적어도 90중량%가 결정질 I형인 것인 화학 물질.
7. 제2항에 있어서, 적어도 95중량%가 결정질 I형인 것인 화학 물질.
8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, I형은 4.5°, 15.2°, 21.3°, 21.8° 및 24.0°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 x선 분말 회절(x-ray powder diffraction: XRPD) 패턴을 특징으로 하는 것인 화학 물질.
9. 제8항에 있어서, I형은 4.5°, 7.5°, 14.4°, 14.6°, 15.2°, 15.9°, 19.5°, 21.3°, 21.8°, 22.4°, 22.7°, 24.0° 및 24.8°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 하는 것인 화학 물질.
10. 제8항에 있어서, I형은 4.5°, 7.5°, 8.9°, 9.8°, 13.3°, 14.4°, 14.6°, 15.2°, 15.9°, 17.2°, 19.5°, 20.0°, 21.3°, 21.8°, 22.4°, 22.7°, 24.0°, 24.8°, 25.7° 및 26.4°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 XRPD 패턴을 특징으로 하는 것인 화학 물질.
11. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, I형은 4.5±0.3°의 2θ 각도에서의 기준 피크 및 기준 피크에 비해 10.7°, 16.8°, 17.3° 및 19.5°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 x선 분말 회절(XRPD) 패턴을 특징으로 하는 것인 화학 물질.
12. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, I형은 4.5±0.3°의 2θ 각도에서의 기준 피크 및 기준 피크에 비해 3.0°, 9.9°, 10.1°, 10.7°, 11.4°, 15.0°, 16.8°, 17.3°, 17.9°, 18.2°, 19.5° 및 20.3°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 x선 분말 회절(XRPD) 패턴을 특징으로 하는 것인 화학 물질.
13. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, I형은 4.5±0.3°의 2θ 각도에서의 기준 피크 및 기준 피크에 비해 3.0°, 4.4°, 5.3°, 8.8°, 9.9°, 10.1°, 10.7°, 11.4°, 12.7°, 15.0°, 15.5°, 16.8°, 17.3°, 17.9°, 18.2°, 19.5°, 20.3°, 21.2° 및 21.9°의 2θ 각도에서의 피크를 갖는 x선 분말 회절(XRPD) 패턴을 특징으로 하는 것인 화학 물질.
14. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, I형은 실질적으로 도 4에 도시된 XRPD 패턴을 특징으로 하는 것인 화학 물질.
15. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, I형은 약 129.6℃에서의 개시와 함께 약 135.7℃에서의 피크를 갖는 흡열을 특징으로 하는 시차 주사 열량측정법(differential scanning calorimetry: DSC) 온도기록도를 특징으로 하는 것인 화학 물질.
16. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, I형은 실질적으로 도 5에 도시된 DSC 온도기록도를 특징으로 하는 것인 화학 물질.
17. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, I형은 약 100℃ 내지 약 150℃에서 약 3.7%의 중량 손실을 특징으로 하는 열중량 분석(thermogravimetric analysis: TGA) 온도기록도를 특징으로 하는 것인 화학 물질.
18. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, I형은 실질적으로 도 6에 도시된 TGA 온도기록도를 특징으로 하는 것인 화학 물질.
19. 화학 물질의 프로드럭으로서,
    상기 화학 물질은 화합물 {(1S,2S,4R)-4-[(6-{[(1R,2S)-5-클로로-2-메톡시-2,3-다이하이드로-1H-인덴-1-일]아미노}피리미딘-4-일)옥시]-2-하이드록시사이클로펜틸}메틸 설파메이트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이고;
    상기 프로드럭은 상기 화학 물질의 -NH- 기의 카바메이트 또는 아마이드, 또는 상기 화학 물질의 -OH 기의 에터 또는 에스터인 것인 화학 물질의 프로드럭.
20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 화학 물질 또는 제19항의 프로드럭, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
21. 제20항에 있어서, 경구 투여에 적합한 조성물.
22. 암의 치료를 필요로 하는 피험체에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 화학 물질 또는 제19항의 프로드럭을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법.

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