CN103889988A - Nedd8-活化酶的抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示为Nedd8-活化酶NAE的抑制剂的化学实体，即，化合物氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯及其医药学上可接受的盐；其固态形式；及其前药。本发明还揭示了使用所述化学实体以治疗例如癌症的病症的方法。

Description

NEDD8-活化酶的抑制剂
技术领域
本发明涉及用于治疗各种病症、特别地细胞增殖病症(包括癌症和炎性病症)的化合物、组合物和方法。特别地，本发明提供抑制NEDD8-活化酶的活性的化合物。
背景技术
泛素样分子(ubl)对蛋白质的翻译后修饰为细胞内重要的调控过程，在控制许多生物过程(包括细胞分裂、细胞信号传导和免疫响应)中起关键作用。Ubl为小蛋白，其经由异肽与ubl的C-末端甘氨酸的连接共价连接到靶蛋白上的赖氨酸。泛素样分子改变靶蛋白的分子表面且可影响诸如蛋白-蛋白相互作用、酶活性、靶标的稳定性和细胞定位的性质。
泛素和其它ubl由特定的E1酶活化，所述酶催化与ubl的C-末端甘氨酸形成酰基-腺苷酸中间体的过程。然后，活化的ubl分子通过形成硫酯键中间体转移到E1酶内的催化的半胱氨酸残基。E1-ubl中间体和E2缔合，导致硫酯交换，其中所述ubl被转移到E2的活性位点半胱氨酸。ubl然后通过与靶蛋白中赖氨酸侧链的氨基形成异肽键直接地或与E3连接酶结合而偶联到靶蛋白。
ubl修饰的生物学结果取决于讨论的靶标。泛素为ubl中最具特征性的并且通过泛素化修饰的结果为聚-泛素化蛋白通过26S蛋白酶体降解。泛素通过酶促级联偶联到其靶蛋白，所述酶促级联涉及其特异性E1活化酶、Uba1(泛素活化酶，UAE)、来自E2s家族的偶联酶和来自E3s的RING或HECT类的泛素连接酶。参见黄(Huang)等人，癌基因(Oncogene)，23：1958-71(2004)。靶标特异性由E2和E3蛋白的特定组合控制，目前已知存在>40个E2s和>100个E3s。除了泛素之外，还存在至少10种泛素-样蛋白，认为每种蛋白均由特异性E1活化酶激活且通过类似但不同的下游偶联途径处理。已鉴别出针对其的E1活化酶的其它ulb包括Nedd8(APPBP1-Uba3)、ISG15(UBE1L)和SUMO家族(Aos1-Uba2)。
ubl Nedd8由异源二聚体Nedd8-活化酶(APPBP1-Uba3)(NAE)激活且被转移到单个E2(Ubc12)，最终导致链接到滞蛋白(cullin)蛋白。类泛素化(neddylation)的功能为在许多细胞周期蛋白和细胞信号蛋白(包括p27和I-κB)的泛素化以及因此周转中涉及的基于滞蛋白的泛素连接酶的活化。参见潘(Pan)等人，癌基因.23：1985-97(2004)。ubl SUMO由异源二聚体sumo活化酶(Aosl-Uba2)(SAE)激活并转移到单个E2(Ubc9)，随后与多个E3连接酶配位，最终导致靶蛋白的sumo化(sumoylation)。Sumo修饰可影响靶蛋白的细胞定位且由SUMO家族成员修饰的蛋白参与细胞核转运、信号转导和应激应答。参见席勒(Seeler)和德让(Dejean)，自然综述：分子细胞生物学(Nat Rev Mol Cell Biol.)4：690-9，(2003)。sumo化的功能包括在转录调控中涉及的细胞信号途径(例如，细胞因子、WNT、生长因子和类固醇激素信号传导)；以及在基因组完整性的控制中涉及的途径(例如，DNA复制、对DNA损害、重组和修复的响应)的激活。参见米勒(Muller)等人，癌基因.23：1998-2006，(2004)。存在其它的ubl(例如，ISG15、FAT10、Apg12p)，其生物功能仍在调查中。
经由E1活化酶活性调控的特别重要的途径为泛素-蛋白酶体途径(UPP)。如上文讨论，在泛素化级联中，酶UAE和NAE以两个不同的步骤调控UPP。在级联的第一步骤中UAE激活泛素，而NAE经由Nedd8的活化负责基于滞蛋白的连接酶的活化，这进而是泛素到某些靶蛋白的最终转移所必需的。功能性UPP途径是正常的细胞维持所必需的。UPP在涉及转录、细胞周期进程和细胞凋亡中的许多关键的调控蛋白的周转中起重要作用，所有这些在疾病状态(包括肿瘤细胞)中很重要。参见，如，京(King)等人，科学(Science)274：1652-1659(1996)；佛尔西斯(Vorhees)等人，临床癌症研究(Clin.CancerRes.)，9：6316-6325(2003)；和亚当斯(Adams)等人，自然评论：癌症(Nat.Rev.Cancer)，4：349-360(2004)。增殖细胞对UPP的抑制特别地敏感。参见，德雷克斯勒(Drexler、)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)94：855-860(1977)。在肿瘤形成中UPP途径的作用已经导致研究蛋白酶体抑制作为潜在抗癌治疗。例如，通过
Figure BDA0000495144480000021
(硼替佐米(bortezomib))抑制26S蛋白酶体来调节UPP途径已经在某些癌症中被证明为有效治疗且被批准用于治疗多发性骨髓瘤和外套细胞淋巴瘤患者，所述患者已接收至少一种在先治疗。由基于滞蛋白的-泛素连接酶控制其水平的蛋白的实例包括CDK抑制剂p27Kip1和NFκB、IκB的抑制剂，所述连接酶在NAE和UAE活性的下游。参见，普德斯特(Podust)等人，国家科学院院刊，97：4579-4584(2000)和里德(Read)等人，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)，20：2326-2333(2000)。对p27降解的抑制预期通过细胞周期的G1和S期阻止细胞的进程。干扰IκB的降解将防止NF-κB的细胞核定位、与恶性表型相关的各种NF-κB依赖性基因的转录和对标准细胞毒性治疗的抗性。另外，NF-κB在多个促炎介体的表达中起着关键作用，表明此类抑制剂在炎性疾病中的作用。此外，UPP的抑制已经被认为是针对另外治疗的有用靶标，诸如炎性病症，包括例如，类风湿性关节炎、哮喘、多发性硬化、银屑病和再灌注损伤；神经变性病症，包括例如，帕金森氏病(Parkinson′sdisease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、三联体重复病症；神经性疼痛；局部缺血性病症，例如，中风、梗塞、肾病症；和恶病质。参见，例如艾略特(Elliott)和罗尔思(Ross)，美国临床病理学杂志(Am.J.Clin.Pathol.)，116：637-46(2001)；艾略特等人，分子医学杂志(J.Mol.Med.)，81：235-45(2003)；达拉(Tarlac)和斯托里(Storey)，神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)74：406-416(2003)；莫里(Mori)等人，神经病理学和应用神经生物学(Neuropath.Appl.Neurobiol.)，31：53-61(2005)；曼宁(Manning)，最新疼痛与头痛症报告(Cuurr.Pain Headache Rep.)，8：192-8(2004)；道森(Dawson)和道森，科学(Science)，302：819-822(2003)；酷坎(Kukan)，生理学和药理学杂志(J.Physiol.Pharmacol.)，55：3-15(2004)；沃伊齐克(Wojcik)和帝纳波利(DiNapoli)，中风(Stroke)，35：1506-18(2004)；拉扎勒斯(Lazarus)等人，美国生理学杂志(Am J Physiol.)，27：E332-41(1999)。
靶向E1活化酶提供干扰对于维持细胞分裂和细胞信号传导的完整性来说重要的多种生物化学途径的唯一机会。E1活化酶在ubl偶联途径的第一步骤时起作用；因此，对E1活化酶的抑制将特异性调节ubl修饰的下游生物学结果。因此，对这些活化酶的抑制和所产生的对ubl-偶联的下游效应的抑制表示干扰细胞分裂的完整性、细胞信号传导和对于疾病机制来说重要的细胞生理学的若干方面的方法。因此，E1酶诸如UAE、NAE和SAE，作为不同的细胞功能的调控剂，是用于鉴别治疗疾病和病症的新方法的潜在重要的治疗靶标。
美国专利申请案第11/346,469号(2006年2月2日提交，公开案第US2006/0189636号)和国际专利申请案第PCT/US06/04637号(2006年2月2日提交，公开案第WO2006/084281号)(共同地颁予“克里奇利(Critchley)等人”)报道下式的各种E1酶抑制剂：
Figure BDA0000495144480000041
这些申请案未报道为本申请的主题的化学实体。
美国专利申请案第11/700,614号(2007年1月31日提交，公开案第US2007/0191293号)和国际专利申请案第PCT/US07/02560号(2007年1月31日提交，公开案第WO2007/092213号)(共同地颁予“兰斯顿(Langston)等人”)报道下式的各种E1酶抑制剂：
Figure BDA0000495144480000042
其中：
A为
Figure BDA0000495144480000043
Figure BDA0000495144480000044
这些申请案未报道为本申请的主题的化学实体。
美国专利申请案第11/890,338号(2007年8月6日提交，公开案第US2008/0051404号)和国际专利申请案第PCT/US07/17463号(2007年8月6日提交，公开案第W02008/019124号)(共同地颁予“克莱本(Claiborne)等人”)报道下式的各种E1酶抑制剂：
其中
环A为6元含氮杂芳基环，任选地稠合于5或6元芳基、杂芳基、环脂族基或杂环；且W为-CH2-、-CHF-、-CF2-、-CH(R1)-、-CF(R1)-、-NH-、-N(R1)-、-O-、-S-或-NHC(O)-。
这些申请案未报道为本申请的主题的化学实体。
此时，还没有E1活化酶的抑制剂被政府卫生行政部门批准作为治疗。仍存在对E1活化酶抑制剂(诸如NAE)的需要。
发明内容
在一个方面，本发明涉及化学实体，所述化学实体为化合物氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)及其医药学上可接受的盐，和其前药。
在一个方面，本发明涉及包含化学实体的组合物，所述化学实体为化合物氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)或其医药学上可接受的盐或其前药以及一种或一种以上医药学上可接受的载剂。
在一个方面，本发明涉及化合物氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)或其医药学上可接受的盐的固态形式。
在一个方面，本发明涉及治疗癌症的方法，所述方法包括向需要此种治疗的患者投与化学实体，所述化学实体为化合物氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)或其医药学上可接受的盐或其前药。
附图说明
图1展示在具有HCT116肿瘤异种移植物的雌性Ncr裸小鼠中以30mg/kg单次皮下投与之后氨基磺酸{(1S，2S，4R)-2-羟基-4-[(6-{[(1R，2S)-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]环戊基}甲酯(I-115)的药效动力学和药物动力学参数。
图2展示在具有HCT116肿瘤异种移植物的雌性Ncr裸小鼠中以10mg/kg单次皮下投与之后氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)的药效动力学和药物动力学参数。
图3展示在具有HCT116肿瘤异种移植物的雌性Ncr裸小鼠中以30mg/kg单次皮下投与之后氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)的药效动力学和药物动力学参数。
图4展示结晶形式I氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)盐酸盐的x射线粉末衍射(XRPD)谱图。
图5展示结晶形式I氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)盐酸盐的差示扫描量热(DSC)热谱图。
图6展示结晶形式I氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)盐酸盐的热重分析(TGA)热谱图。
图7展示在以下实例2中制备的结晶形式I氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)盐酸盐的x射线粉末衍射(XRPD)谱图。
图8展示在以下实例2中制备的结晶形式I氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)盐酸盐的差示扫描量热(DSC)热谱图。
图9展示在以下实例2中制备的结晶形式I氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)盐酸盐的热重分析(TGA)热谱图。
图10展示在以下实例9中制备的结晶形式II氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)盐酸盐的x射线粉末衍射(XRPD)谱图。
具体实施方式
本文提供作为Nedd8-活化酶(NAE)的抑制剂有效的化学实体。所述化学实体可用于抑制活体外和活体内的NAE活性且可用于治疗细胞增殖的病症，特别为癌症和与NAE活性相关的其它病症。所述化学实体为化合物氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(在本文中被称为“I-216”)：
Figure BDA0000495144480000071
和非共价缔合的分子实体。包含化合物I-216的化学实体因此包括(例如)游离化合物I-216、I-216的医药学上可接受的盐、I-216的医药学上可接受的溶剂化物和I-216的医药学上可接受的盐的医药学上可接受的溶剂化物。在一些实施例中，化学实体为游离的化合物I-216或其医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化学实体为I-216的医药学上可接受的盐。在一些实施例中，化学实体为游离的化合物I-216或其医药学上可接受的溶剂化物。在一些实施例中，化学实体为I-216的医药学上可接受的盐的医药学上可接受的溶剂化物。
克莱本等人报道E1酶(包括NAE)的各种抑制剂。例如，克莱本等人报道在以下表1中的化合物在NAE测定中表现出小于或等于500nM的IC50值(克莱本实例137)。
表1
Figure BDA0000495144480000072
Figure BDA0000495144480000081
Figure BDA0000495144480000091
Figure BDA0000495144480000101
Figure BDA0000495144480000111
Figure BDA0000495144480000121
Figure BDA0000495144480000131
克莱本等人进一步报道在以下表2中的化合物在此NAE测定中表现出大于500nM且小于10μM的IC50值(克莱本实例137)。
表2
Figure BDA0000495144480000141
Figure BDA0000495144480000151
Figure BDA0000495144480000161
克莱本等人还报道在以下表3中的化合物在此NAE测定中表现出大于10μM的IC50值(克莱本实例137)。
表3
Figure BDA0000495144480000162
Figure BDA0000495144480000171
在实例137中，克莱本等人也报道了sumo-活化酶(SAE)和泛素-活化酶(UAE)HTRF测定。然而，未报道IC50值。
如图中所示，以10mg/kg投与的I-216的血浆AUC(图1)与以30mg/kg投与的I-115的血浆AUC(图2)类似，且对于以30mg/kg投与的I-216观察到大约一半AUC(图3)。因此，与，预期化合物I-216为比I-115强2至3倍的NAE的抑制剂。
本文使用的术语“约”意指大约、在范围内、大致或大概。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过延伸所示数值的上下边界修饰此范围。除非另外指明，否则本文术语“约”用于修饰偏差为10％的所述值的上下数值。
除非另外指明，否则术语“包括(include)”和“包括(including)”等打算为非限制性的。例如，除非另外指出，否则“包括”意指包括但不限于。
在本文所述的化合物中，其中定义了相对立体化学，化合物的非对映体纯度优选为至少80％、更优选为至少90％、又更优选为至少95％且最优选为至少99％。如本文所用，术语“非对映体纯度”是指具有所描绘的相对立体化学的化合物的量，表示为所有存在的非对映体的总量的百分比。
优选地，化合物的对映体纯度为至少80％、更优选为至少90％、又更优选为至少95％且最优选为至少99％。如本文所用，术语“对映体纯度”是指具有所描绘的绝对立体化学的化合物的量，表示为所描绘的化合物及其对映体的总量的百分比。
用于确定非对映和对映体纯度的方法在本领域中熟知。非对映体纯度可以通过能够定量区分化合物及其非对映体的任何分析方法来测定。合适的分析方法的实例包括但不限于核磁共振光谱法(NMR)、气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。类似地，对映体纯度可以通过能够定量区分化合物及其对映体的任何分析方法来测定。合适的分析方法的实例包括但不限于使用手性柱填充材料的GC或HPLC。如果首次用光学富集的衍生剂如莫舍(Mosher)酸衍生化，则对映体也可以通过NMR区分。
如本文所用，“结晶”是指其中构成原子、分子或离子堆积成具有高度规则的化学结构的规则有序、重复三维谱图的固体。特别地，结晶盐可以以一种或一种以上结晶形式制备。对于本申请案的目的，术语“结晶形式”和“多晶形物”为同义的；术语区分具有不同性质(例如，不同的XRPD谱图、不同的DSC扫描结果)的结晶。假多晶形物通常为材料的不同溶剂化物，且因此其性质彼此不同。因此，每一不同的多晶形物和假多晶形物在本文中视为是不同的结晶形式。
“实质上结晶”是指为至少特定重量百分比结晶的盐。特定的重量百分比包括50％、60％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％和99.9％。在一些实施例中，实质上结晶是指为至少70％结晶的盐。在一些实施例中，实质上结晶是指为至少80％结晶的盐。在一些实施例中，实质上结晶是指为至少85％结晶的盐。在一些实施例中，实质上结晶是指为至少90％结晶的盐。在一些实施例中，实质上结晶是指为至少95％结晶的盐。
术语“溶剂化物或溶剂化”意指本发明的化合物与一个或一个以上溶剂分子的物理缔合。此物理缔合包括氢键。在某些情况下，例如当一个或一个以上溶剂分子并入结晶固体的晶格时，溶剂化物将能够分离。“溶剂化物或溶剂化”涵盖溶液相和可分离的溶剂化物两者。代表性的溶剂化物包括(例如)水合物、乙醇化物(ethanolates)和甲醇化物(methanolates)。
术语“水合物”是指其中溶剂分子为以定义的化学计量存在的H20的溶剂化物且包括(例如)半水合物、一水合物、二水合物和三水合物。
术语“混合物”是指混合物的合并组分，不管组合的相态如何(例如，液体或液体/结晶)。
术语“引晶”是指将结晶物质加入至溶液或混合物以引发结晶。
本发明的一些实施例涉及I-216盐酸盐，其中至少特定重量百分比的盐酸盐为结晶。在一些实施例中，盐酸盐为实质上结晶。结晶或实质上结晶盐酸盐的实例包括盐酸盐的结晶形式或不同结晶形式的混合物。本发明的一些实施例涉及盐酸盐，其中至少特定重量百分比的盐酸盐为结晶。特定的重量百分比包括10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％和99.9％。当特定重量百分比的盐酸盐为结晶时，盐酸盐的剩余物为盐酸盐的非晶形。
本发明的一些实施例涉及为结晶形式或实质上结晶形式的I-216盐酸盐。结晶形式可以为特定重量百分比的结晶盐酸盐。特定的重量百分比包括10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％和99.9％。当特定重量百分比的盐酸盐为指定的结晶形式时，盐酸盐的剩余物为盐酸盐的非晶形和盐酸盐的一种或一种以上结晶形式(排除指定结晶形式)的某些组合。在一些实施例中，盐酸盐为至少90重量％的结晶形式。在一些实施例中，盐酸盐为至少95重量％的结晶形式。在一些实施例中，盐酸盐为至少80重量％的结晶形式。在一些实施例中，盐酸盐为至少85重量％的结晶形式。
除非另外指明，否则当盐酸盐的结晶形式使用一个或一个以上以角度2θ给定的XRPD峰鉴别时，所述2θ值中的每一者应理解为意指给定值±0.2度。
在整个说明书和权利要求书中，当盐酸盐的结晶形式使用来自DSC曲线的一种或一种以上温度鉴别时(例如，开始吸热转换、熔化等)，每个温度值应理解为意指给定值±2℃。
固态形式
本文提供表征信息的分类以描述I-216的盐酸盐的结晶形式1(形式1)。
图4展示使用CuKa辐射获得的I-216的盐酸盐的形式I的X射线粉末衍射(XRPD)谱图。在图4中鉴别的峰包括列于表4中的那些。
表4
Figure BDA0000495144480000201
在一些实施例中，形式I的特征在于在4.5°、15.2°、21.3°、21.8°和24.0°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。在一些实施例中，形式I的特征在于在4.5°、7.5°、14.4°、14.6°、15.2°、15.9°、19.5°、21.3°、21.8°、22.4°、22.7°、24.0°和24.8°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。在一些实施例中，形式I的特征在于在4.5°、7.5°、8.9°、9.8°、13.3°、14.4°、14.6°、15.2°、15.9°、17.2°、19.5°、20.0°、21.3°、21.8°、22.4°、22.7°、24.0°、24.8°、25.7°和26.4°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。在一些实施例中，形式I的特征在于实质上如图4中所示的XRPD谱图。
在一些实施例中，形式I的特征在于具有2θ角度为4.5±0.3°的参考峰且相对于所述参考峰在10.7°、16.8°、17.3°和19.5°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。术语“参考峰”是指在XRPD衍射图中，所属领域技术人员视为告知物质的多晶形式的峰，即，与仪器噪音相区分。“相对”意指观察的每一峰的2θ角度将为参考峰的2θ角度和所述峰的相对2θ角度的总和。例如，如果参考峰具有4.4°的2θ角度，那么相对峰将具有15.1°、21.2°、21.7°和23.9°的2θ角度；如果参考峰具有4.5°的2θ角度，那么相对峰将具有15.2°、21.3°、21.8°和24.0°的2θ角度；如果参考峰具有4.6°的2θ角度，那么相对峰将具有15.3°、21.4°、21.9°和24.1°的2θ角度；等。在一些实施例中，形式I的特征在于具有2θ角度为4.5±0.3°的参考峰且相对于所述参考峰在3.0°、9.9°、10.1°、10.7°、11.4°、15.0°、16.8°、17.3°、17.9°、18.2°、19.5°和20.3°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。在一些实施例中，形式I的特征在于具有2θ角度为4.5±0.3°的参考峰且相对于所述参考峰在3.0°、4.4°、5.3°、8.8°、9.9°、10.1°、10./°、11.4°、12./°、15.0°、15.5°、16.8°、1/.3°、1/.9°、18.2°、19.5°、20.3°、21.2°和21.9°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。所属领域技术人员视为告知物质的多晶形式的任何峰可充当参考峰，然后可以计算相对峰。例如，如果参考峰具有24.0°的2θ角度，那么相对于所述参考峰，相对峰将具有-19.5°、-8.8°、-2.7°和-2.2°的2θ角度。图5展示形式I的差示扫描量热(DSC)谱图。DSC热谱图将热流随着样品温度的变化作图，温度速率变化为约10℃/min。在一些实施例中，形式I的特征在于实质上如图5中所示的DSC曲线。图5展示在约129.8℃下开始且在约135.6℃下具有峰的吸热事件，此对应于与熔化相结合的水损失。还观察到在约181.6℃下开始且在约195.5℃下具有峰的宽吸热，以及在约275.3℃下开始且在约275.5℃下具有峰的尖锐吸热。
图6展示I-216的盐酸盐的形式I的热重分析(TGA)曲线。TGA热谱图将样品的重量损失百分比随着温度的变化作图，温度速率变化为约10℃/min。图6展示在100℃至150℃之间有大约3.7％的重量损失，此表明I-216HCI的形式I为一水合物。在一些实施例中，I-216HCI的形式I的特征在于实质上如图6中所示的TGA曲线。卡尔-费谢尔(Karl Fischer)测量值展示约3.5％的水含量，此进一步表明在TGA曲线中见到的重量损失是由于水的损失，此表明形式I为一水合物。
图10展示使用CuKα辐射获得的I-216的盐-酸盐的形式II的X射线粉末衍射(XRPD)谱图。在图10中鉴别的峰包括列于表5中的那些。
表5
Figure BDA0000495144480000211
Figure BDA0000495144480000221
在一些实施例中，形式II的特征在于在8.7°、15.2°、15.7°、19.6°和24.2°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。在一些实施例中，形式II的特征在于在4.3°、8.7°、15.2°、15.7°、19.6°、20.0°、20.8°、22.5°、23.1°和24.2°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。在一些实施例中，形式II的特征在于在4.3°、8.7°、12.4°、14.5°、15.2°、15.7°、17.3°、18.2°、18.5°、19.6°、20.0°、20.8°、22.0°、22.5°、23.1°、24.2°、24.7°、25.7°、28.2°和29.4°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。在一些实施例中，形式II的特征在于实质上如图10中所示的XRPD谱图。
在一些实施例中，形式II的特征在于具有2θ角度为8.7±0.3°的参考峰且相对于所述参考峰在6.5°、7.0°、10.9°和15.5°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。术语“参考峰”和“相对”具有如先前所述的相同的意义。在一些实施例中，形式II的特征在于具有2θ角度为8.7±0.3°的参考峰且相对于所述参考峰在-4.4°、6.5°、7.0°、10.9°、11.3°、12.1°、13.8°、14.4°和15.5°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。在一些实施例中，形式II的特征在于具有2θ角度为8.7±0.3°的参考峰且相对于所述参考峰在-4.4°、3.7°、5.8°、6.5°、7.0°、8.6°、9.5°、9.8°、10.9°、11.3°、13.3°、13.8°、14.4°、15.5°、16.0°、17.0°、19.5°和20.7°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。所属领域技术人员视为告知物质的多晶形式的任何峰可充当参考峰，然后可以计算相对峰。例如，如果参考峰具有24.2°的2θ角度，那么相对于所述参考峰，相对峰将具有-15.5°、-9.0°、-8.5°和-4.6°的2θ角度。
合成方法
化合物I-216可以通过所属领域技术人员已知的方法和/或通过参考下文展示的方案以及随后的实例来制备。示例性的合成路线陈述于以下方案1-4中和以下实例中。
方案1
Figure BDA0000495144480000231
方案1描述(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基二氢化茚-1-胺(8)的合成，其在以下实例1中进一步例证。使用雅各布森(Jacobsen)催化剂环氧化6-氯-1H-茚(1)以得到环氧乙烯(2)，将其用在乙腈中的发烟硫酸处理，其在加入水和加热之后产生rel-(1R，2S)-1-氨基-5-氯二氢化茚-2-醇(3)。使用D-(-)-扁桃酸手性拆分rel-(1R，2S)-1-氨基-5-氯二氢化茚-2-醇(3)以在去除手性助剂之后得到(1R，2S)-1-氨基-5-氯二氢化茚-2-醇(5)。使用邻苯二甲酸酐实现对(5)中的伯胺的保护，产生化合物(6)。用碘甲烷对羟基甲基化则产生化合物(7)，其随后用肼去保护以得到所需的(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基二氢化茚-1-胺(8)。
方案2
Figure BDA0000495144480000241
方案2展示氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯HCl形式1的合成，其在以下实例2中进一步例证。将外消旋-(9)的伯醇保护成叔丁基二甲基甲硅烷基醚以得到化合物(10)，其使用在丙烯酸树脂上的坎迪德安塔迪卡(Candida Antartica)进行酶促拆分以得到具有大于99％的对映体过量的化合物(11)。然后将在(11)中的仲醇保护成其叔丁基二甲基甲硅烷基醚以得到(12)。将化合物(12)在存在威尔金森催化剂(Wilkinson’s catalyst)的情况下用儿茶酚硼烷处理以得到(13)，其进一步与4，6-二氯嘧啶反应以得到化合物(14)。将(14)的伯醇选择性地去保护且然后通过(15)与(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基二氢化茚-1-胺(8)反应来装入分子的二氢化茚部分以得到化合物(16)。通过将化合物(16)与氨基磺酰氯反应、随后在酸性条件下将仲醇去保护来制备I-216。用在乙腈中的盐酸处理I-216以得到I-216的盐酸盐的形式I。
方案3
Figure BDA0000495144480000251
方案3描述(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺盐酸盐(20)的制备，其在以下实例4中进一步例证。将5-氯-2，3-二氢-1H-茚-1-酮(17)与原甲酸三甲酯在酸性条件下反应，随后用科泽(Koser)试剂[PhI(OH)(OTs)]处理以得到5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-酮(18)。将二氢茚酮用(R)-叔丁基亚磺酰胺在存在四乙氧基钛的情况下处理以得到相应的亚磺酰胺(19)。允许反应进行直至通过HPLC可检测到小于5％的不需要的非对映异构体。将粗制亚磺酰胺使用NaBH4还原以得到伯胺，其用盐酸处理以得到(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺盐酸盐(20)。
方案4
Figure BDA0000495144480000261
方案4展示用于制备I-216盐酸盐的形式I的路线，其在以下实例5中进一步例证。(1S，2R，3S，5R)-3-(苄氧基)-2-(苄氧基甲基)-6-氧杂双环[3.1.0]己烷(21)中的环氧化物通过用二异丙基酰胺锂处理而开环，并且所得阴离子通过用三甲基氯硅烷处理而捕获以得到(22)。使用氢和Pd/BaSO4催化剂还原双键且去除三甲基甲硅烷基保护基团以得到仲醇(23)。将仲醇(23)进行甲磺酰化且然后用四丁基乙酸铵处理，随后用氢氧化钠处理以得到(24)，其与氢化钠和4，6-二氯嘧啶反应以得到中间体(25)。使用三氯化硼去除苄基保护基团以得到(26)，随后在130℃和50psi下通过与(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺盐酸盐(20)反应，以导致形成氨基磺酸((1S，2S，4R)-4-(6-((1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基氨基)嘧啶-4-基氧基)-2-羟基环戊基)甲酯(27)。将在化合物(27)中的伯醇进行氨基磺酸化以得到I-216。I-216的盐酸盐的形式I通过用6M盐酸处理在异丙基醇中的I-216，随后加入作为反溶剂的乙酸异丙酯来生成。
用途
本发明的化学实体为E1酶活性的有用抑制剂。特别地，设计化学实体为NAE的抑制剂。抑制剂意在包括化学实体，所述化学实体降低在ubl(特别地，Nedd8)中的E1酶偶联到靶蛋白的促进效应(例如降低泛素化，类泛素化)，降低由ubl(特别地，Nedd8)偶联介导的细胞内信号传导和/或降低由ubl(特别地，Nedd8)偶联介导的蛋白质水解(例如，抑制滞蛋白依赖的泛素化和蛋白质水解(例如，泛素蛋白酶体途径))。因此，根据在本文进一步详述中提供的方法或所属领域已知的方法可以测定本发明的化学实体在活体外或活体内或在细胞或动物模型中抑制E1酶的能力。可以评估化学实体直接结合或介导E1酶活性的能力。或者，化学实体的活性可以通过间接的细胞测定或测量E1活化的下游效应以评估E1抑制的下游效应的抑制(例如，对滞蛋白-依赖的泛素化和蛋白质水解的抑制)来评估。例如，活性可以通过以下来评估：对ubl-偶联的底物(例如，ubl-偶联的E2s、类泛素化的滞蛋白、泛素化的底物)的检测；对下游蛋白底物稳定化(例如，p27的稳定化、IκB的稳定化)的检测；对UPP活性的抑制的检测；对蛋白E1抑制和底物稳定化的下游效应的检测(例如，报道子测定，例如NFκB报道子测定、p27报道子测定)。用于评估活性的测定描述于以下实验部分和/或为本领域已知的。
应理解，本发明的化学实体可以在官能团处衍生化以提供前药衍生物，其能够在活体内转化返回至母体化学实体。此类前药的实例包括生理上可接受的和代谢上不稳定的衍生物。更具体地说，本发明的化学实体的前药为化学实体的-NH-基团的氨基甲酸酯或酰胺，或化学实体的-OH基团的醚或酯。
化学实体的-NH-基团的此些氨基甲酸酯前药包括以下氨基甲酸酯：9-芴基甲基、9-(2-磺基)芴基甲基、9-(2，7-二溴)芴基甲基、17-四苯并[a，c，g，i]芴基甲基、2-氯-3-茚基甲基、苯并[f]茚-3-基甲基、2，7-二-叔丁基-[9-(10，10-二氧代-10，10，10，10-四氢硫代黄嘌呤酸基)]甲基、1，1-二氧代苯并[b]噻吩-2-基-甲基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-苯乙基、1-(1-金刚烷基)-1-甲基乙基、2-氯乙基、1，1-二甲基-2-卤代乙基、1，1-二甲基-2，2-二溴乙基、1，1-二甲基-2，2，2-三氯乙基、1-甲基-1-(4-联苯基)乙基、1-(3，5-二叔丁基苯基)-1-甲基乙基、2-(2’-和4’-吡啶基)乙基、2，2-双(4’-硝基苯基)乙基、N-(2-特戊酰基氨基)-1，1-二甲基乙基、2-[(2-硝基苯基)二硫代]-1-苯乙基、2-(N，N-二环己基甲酰胺基)乙基、叔丁基、1-金刚烷基、2-金刚烷基、乙烯基、烯丙基、1-异丙基烯丙基、肉桂基、4-硝基肉桂基、3-(3’-吡啶基)丙-2-烯基、8-喹啉基、N-羟基哌啶基、烷基二硫基(alkyldithio)、苄基、对甲氧基苄基、对硝基苄基、对溴苄基、对氯苄基、2，4-二氯苄基、4-甲基亚硫酰基苄基、9-蒽基甲基、二苯基甲基、吩噻嗪基-(10)-羰基、N’-对甲苯磺酰基氨基羰基和N’-苯基氨基硫代羰基。
化学实体的-NH-基团的此些酰胺前药包括以下酰胺：N-甲酰基、N-乙酰基、N-氯乙酰基、N-三氯乙酰基、N-三氟乙酰基、N-苯基乙酰基、N-3-苯基丙酰基、N-4-戊烯酰基、N-吡啶甲酰基、N-3-吡啶甲酰胺基、N-苯甲酰基苯丙氨酰基、N-苯甲酰基和N-对苯基苯甲酰基。
化学实体的-OH基团的此些醚前药包括以下醚：甲基、甲氧基甲基、甲基甲硫基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基、苄氧基甲基、对甲氧基苄氧基甲基、对硝基苄氧基甲基、邻硝基苄氧基甲基、(4-甲氧基苯氧基)甲基、愈创木酚甲基(guaiacolmethyl)、叔丁氧基甲基、4-戊烯基氧基甲基、甲硅烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2，2，2-三氯乙氧基甲基、双(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、薄荷氧基甲基(menthoxymethyl)、四氢吡喃基、3-溴四氢吡喃基、四氢噻喃基、1-甲氧基环己基、4-甲氧基四氢吡喃基、4-甲氧基四氢噻喃基、4-甲氧基四氢噻喃基S，S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基、1-(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基、1，4-二氧杂环己-2-基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、2，3，3a，4，5，6，7，7a-八氢-7，8，8，-三甲基-4，7-甲桥苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基乙基、1-甲基-1-苄氧基-2-氟乙基、1-甲基-1-苯氧基乙基、2，2，2，-三氯乙基、1，1-二茴香基-2，2，2，-三氯乙基、1，1，1，3，3，3-六氟-2-苯基异丙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-(苄硫基)乙基、2-(苯基硒基)乙基、叔丁基、烯丙基、炔丙基、对氯苯基、对甲氧基苯基、对硝基苯基、2，4-二硝基苯基、2，3，5，6-(四氟-4-三氟甲基)苯基、苄基、对甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基、2，6-二氯苄基、对氰基苄基、对苯基苄基、2，6-二氟苄基、对酰基氨基苄基、对叠氮基苄基、4-叠氮基-3-氯苄基、2-三氟甲基苄基、对(甲基亚硫酰基)苄基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧代、2-喹啉基甲基、1-芘基甲基、二苯基甲基、对，对’-二硝基二苯甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α-萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、二(对甲氧基苯基)苯基甲基、三(对甲氧基苯基)甲基、4-(4’-溴苯甲酰基甲基氧基)苯基二苯基甲基、4，4’，4”-三(4，5-二氯邻苯二甲酰亚胺基苯基)甲基、4，4’，4”-三(乙酰丙酸基氧基苯基)甲基、4，4’，4”-三(苯甲酰基氧基苯基)甲基、4，4’-二甲氧基-3”-[N-(咪唑基甲基)]三苯甲基、4，4’-二甲氧基-3”[N-(咪唑基乙基)氨甲酰基]三苯甲基、1，1-双(4-甲氧基苯基)-1’-芘基甲基、4-(17-四苯并[a，c，g，i]芴基甲基)-4，4”-二甲氧基三苯甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)氧杂蒽基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基、1，3-苯并二硫杂环戊-2-基、苯并异噻唑基S，S-二氧代、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、二甲基异丙基甲硅烷基、二乙基异丙基甲硅烷基、二甲基叔己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三苄基甲硅烷基、三-对二甲苯基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、二苯基甲基甲硅烷基、二叔丁基甲基甲硅烷基、三(三甲基甲硅烷基)甲硅烷基、(2-羟基苯乙烯基)二甲基甲硅烷基、(2-羟基苯乙烯基)二异丙基甲硅烷基、叔丁基甲氧基苯基甲硅烷基和叔丁氧基二苯基甲硅烷基。
化学实体的-OH基团的此些酯前药包括以下酯：甲酸酯、苯甲酰甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯苯氧基乙酸酯、苯基乙酸酯、对-P-苯基乙酸酯、二苯基乙酸酯、烟酸酯、3-苯基丙酸酯、4-戊烯酸酯、4-氧代戊酸酯、4，4-(亚乙基二硫代)戊酸酯、5-[3-双(4-甲氧基苯基)羟甲基苯氧基]乙酰丙酸酯、特戊酸酯、1-金刚烷酸酯(1-adamantoate)、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、对苯基苯甲酸酯和2，4，6-三甲基苯甲酸酯。另外，类似于代谢上不稳定的醚、-OH基团的酯或-NH-基团的氨基甲酸酯或酰胺且能够在体内产生本文描述的母体化学实体的本化学实体的任何生理上可接受的等效物均在本发明的范围内。参见如，格林(Greene)和伍兹(Wuts)，有机合成中的保护基团(ProtectiveGroups in Organic Synthesis)，第3版.约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons，Inc.)(1999)。
本发明的一些实施例涉及包含本发明的化学实体和医药学上可接受的载剂的组合物。本发明的一些实施例涉及包含本发明的化学实体的前药和医药学上可接受的载剂的组合物。
如果医药学上可接受的盐为在这些组合物中利用的本发明的化学实体，那么所述盐优选来源于无机或有机酸和碱。对于合适的盐的综述，参见例如，贝尔热(Berge)等人，制药科学杂志(J.Pharm.Sci.)66：1-19(1977)和雷明顿：制药科学与实践(Remington：TheScience and Practice ofPharmacy)，第20版，A.真纳罗(A.Gennaro)(编辑)，利平科特威廉姆斯·威尔金斯(Lippincott Williams&Wilkins)(2000)(″雷明顿″)。
合适的酸加成盐的实例包括以下：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡萄糖庚酸盐(glucoheptanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基-丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。
合适的碱加成盐包括铵盐、碱金属盐(诸如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(诸如钙盐和镁盐)、与有机碱形成的盐(诸如二环己基胺盐、N-甲基-D-葡糖胺)和与氨基酸(诸如精氨酸、赖氨酸等)形成的盐。
另外，碱性-含氮基团可以用诸如以下的试剂季铵化：低碳烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐，诸如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基的硫酸盐；长链卤化物，诸如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物，例如苄基和苯乙基的溴化物等。因此可获得水溶性或油-溶性或可分散产物。
本发明的药物组合物优选呈适用于投与接受者、优选为哺乳动物、更优选为人的形式。本文使用的术语“医药学上可接受的载剂”是指与接受者相容且适用于向靶位点递送活性剂而不会终止药剂的活性的材料。与载剂相关的毒性或不良作用(例如果有的话)优选为与活性剂的预期使用的合理风险/得益比率相当。许多此类医药学上可接受的载剂在本领域中为已知的。参见例如，雷明顿：医药赋形剂手册(Remington′s；HandbookofPharmaceutical Excipients)，第6版，R.C.罗维(R.C.Rowe)等人(编辑)，医药出版社(Pharmaceutical Press)(2009)。
本发明的药物组合物可以通过本领域熟知的方法制造，尤其例如常规造粒、混合、溶解、包封(encapsulating)、冻干或乳化过程。可以以各种形式制备组合物，包括颗粒、沉淀或微粒、粉末(包括冷冻干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末、非晶形粉末)、片剂、胶囊、糖浆、栓剂、注射剂、乳液、酏剂、悬浮液或溶液。调配物可任选地含有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂、增溶剂、生物利用率调节剂和这些的组合。
可以在这些组合物中使用的医药学上可接受的载剂包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如人血清白蛋白)、缓冲物质(诸如磷酸盐或碳酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和的植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(诸如鱼精蛋白硫酸盐)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶状二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、-基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
根据优选的实施例，将本发明的组合物经调配用于医药投与给哺乳动物、优选为人投与。本发明的此些药物组合物可以经口、不经肠、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入的贮器投与。如本文所用，术语“不经肠”包括皮下、静脉内、腹膜内、肌内、-关节内、-滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内及颅内注射或输注技术。优选地，组合物经口、静脉内或皮下投与。可以将本发明的调配物设计成短效、快速释放或长效的。再此外，可以将化合物以局部而非全身的方式投与，诸如在肿瘤位点投与(例如，通过注射)。
药物调配物可以使用液体(诸如油、水、醇和这些的组合)制备成液体悬浮液或溶液。可以包括诸如环糊精的增溶剂。可以加入医药学上合适的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂用于经口或不经肠投与。悬浮液可以包括油，诸如花生油、芝麻油、棉籽油、玉米油和橄榄油。悬浮液制剂还可含有脂肪酸的酯，诸如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化的脂肪酸甘油酯。悬浮液调配物可以包括醇，诸如乙醇、异丙基醇、十六烷醇、甘油和丙二醇。在悬浮液调配物中还可使用醚(诸如聚(乙二醇))、石油烃(诸如矿物油和凡士林)；和水。
本发明的组合物的无菌可注射形式可以为水性或油性悬浮液。这些悬浮液可根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来调配。无菌可注射制剂也可为在无毒的不经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受媒剂和溶剂尤其为水、林格氏溶液(Ringer′s solution)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、非挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可采用任何温和不挥发性油，包括合成的单-甘油酯或二-甘油酯。与天然医药学上可接受的油(例如橄榄油或蓖麻油，尤其呈聚氧乙基化形式)一样，脂肪酸(例如油酸及其甘油酯衍生物)可用于制备注射液。这些油溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或通常用于调配医药学上可接受的剂型(包括乳液和悬浮液)的类似的分散剂。其它常用的表面活性剂如吐温(Tweens)、司盘(Spans)及其它常用于制造医药学上可接受的固体、液体或其它剂型的乳化剂或生物利用率增强剂也可用于调配的目的。化合物可以经调配用于通过注射(诸如通过快速浓注或连续输注)进行不经肠投与。用于注射的单位剂型可存于安瓿或多剂量容器中。
本发明的药物组合物可以任何经口可接受的剂型经口投与，所述剂型包括胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。当需要水性悬浮液用于口服时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，还可加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。在此些固体剂型中，活性化学实体与至少一种惰性、医药学上可接受的赋形剂或载剂(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、微晶纤维素和硅酸，b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂，例如甘油，d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲纤维素、羟基乙酸淀粉钠、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂，例如石蜡，f)吸收促进剂，例如季铵化合物，g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸附剂，例如高岭土和膨润土，以及i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、硬脂酰富马酸钠、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、二氧化硅以及它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型也可包含缓冲剂。
活性化学实体还可为具有如上所述的一种或一种以上赋形剂的微包封形式。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可制备成具有包衣和壳，诸如肠溶包衣、释放控制包衣和医药调配领域中熟知的其它包衣。在此些固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂(例如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。通常的做法是，此些剂型还可包含除惰性稀释剂之外的另外物质，例如压片润滑剂以及诸如硬脂酸镁和微晶纤维素等的其它压片助剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，所述剂型还可以包含缓冲剂。它们可任选地含有遮光剂且也可以在肠道的某一部位任选地以延迟的方式仅或优先释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
或者，本发明的医药组合物可以以栓剂的形式投与用于直肠投与。这些可以通过将药剂与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述无刺激性赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体且因此将在直肠中融化以释放药物。此些材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
本发明的医药组合物还可局部投与，尤其当治疗目标包括局部投与容易达到的区域或器官(包括眼、皮肤或下肠道的疾病)时更是如此。对于这些区域或器官的每一者来说，容易制备合适的局部调配物。
下肠道的局部投与可以以直肠栓剂调配物(参见上文)或以合适的灌肠调配物实现。还可以使用局部投与的经皮贴剂。对于局部投与来说，可将医药物组合物调配成含有悬浮或溶解于一种或一种以上载剂中的活性组分的合适软膏剂。-用于本发明化合物的局部投与的载剂包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将医药物组合物调配成含有悬浮或溶解于一种或一种以上医药学上可接受的载剂中的活性组分的合适洗剂或霜剂。合适的载剂包括矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
对于眼科应用来说，可将药物组合物在等渗、pH调节的无菌盐水中调配成微粉化悬浮液，或者优选地在使用或不使用诸如氯苄烷铵的防腐剂的情况下，在等渗、pH调节的无菌盐水中调配成溶液。或者，对于眼科应用来说，可将医药组合物调配成诸如凡士林的软膏。
本发明的医药组合物也可通过鼻气溶胶或通过吸入投与。根据医药调配领域中熟知的技术制备此些组合物，并且可采用苄醇或其它合适的防腐剂、增强生物利用率的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其它常规增溶或分散剂将此些组合物制备成存于生理盐水中的溶液。
本发明的医药组合物尤其可用于与如本文所述的病症(例如，增殖性病症，例如癌症、炎症、神经变性病症)相关的治疗应用(例如，。本文所用的术语“受试者”意指动物，优选为哺乳动物，更优选为人。本文所用的术语“患者”意指人。优选地，组合物经调配用于投与给具有或处于发生或经历正治疗的相关病症的复发的风险中的患者或受试者。本发明的优选医药物组合物为经调配用于口服、静脉内或皮下投与的那些。然而，含有本发明的治疗有效量的化学实体的任何上述剂型完全在常规实验的范围内且因此完全在本发明的范围内。在某些实施例中，本发明的医药组合物可进一步包含另一治疗剂。优选地，此些其它治疗剂为通常投与于患有正治疗的病症、疾病或病状的患者的治疗剂。
“治疗有效量”意指在单或多剂量投与时足以引起E1酶活性和/或正治疗的病症或疾病状态的严重程度的可检测降低的化学实体或组合物的量。“治疗有效量”也打算包括足以治疗细胞、延长或防止正治疗的病症或疾病状态进展(例如，防止癌症的另外的肿瘤生长、预防另外的炎症反应)、改善、减轻、缓解或改良受试者病症的症状超过不存在此治疗下所预计的症状的量。所需的E1酶抑制剂的量将取决于给定组合物的特定化合物、正治疗的病症的类型、投与途径和治疗所述病症所需的时间长度。也应当理解，针对任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于多个因素，包括所用特定化学实体的活性、患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食、投与时间、排泄率、药物组合、治疗医生的判断和进行治疗的特定疾病的严重程度。在其中抑制剂与另一药剂组合投与的某些方面中，在本发明组合物中存在的另外治疗剂的量一股将不超过通常在包含所述治疗剂作为唯一活性剂的组合物中所投与的量。优选地，另外治疗剂的量通常在包含所述药剂作为唯一治疗活性剂的组合物中存在的量的约50％至约100％的范围内。
在一些实施例中，本发明涉及抑制或降低样品中E1酶活性的方法，其包括将所述样品与本发明的化学实体或包含本发明的化学实体的组合物接触。如本文所用，样品包括包含纯化的或部分纯化的E1酶、培养的细胞或细胞培养物的提取物的样品；从哺乳动物获得的活组织检查细胞或液体或其提取物；和体液(例如血液、血清、唾液、尿液、粪便、精液、泪液)或其提取物。样品中E1酶活性的抑制可以在活体外或活体内、细胞内或原位进行。
在一些实施例中，本发明提供治疗患有病症、病症的症状、处于发生或经历病症的复发的风险的患者的方法，其包含向患者投与本发明的化学实体或医药组合物。治疗可以痊愈、治愈、缓解、减少、改变、补救、缓和、减轻、改良或影响病症、所述病症的症状或对所述病症的易感性。尽管不希望受理论的约束，据信治疗引起在活体外或或体内抑制细胞或组织的生长、消融或杀伤或以其它方式降低细胞或组织(例如，异常细胞、患病组织)介导病症(例如，如本文所述的病症(例如增殖性病症，如癌症、炎性病症))的能力。如本文所用，“抑制细胞或组织的生长”或“细胞或组织的生长的抑制”(例如，增殖性细胞、肿瘤组织)是指减缓、中断、阻止或停止其生长和转移且不一定指示完全消除生长。
疾病应用包括其中抑制E1酶的活性不利于患病细胞或组织的存活和/或扩展的那些病症(例如，细胞对E1抑制敏感；对E1活性的抑制破坏疾病机制；降低E1活性使为疾病机制的抑制剂的蛋白保持稳定；降低E1活性产生为疾病机制的激活剂的蛋白质的抑制作用)。疾病应用也打算包括需要有效的滞蛋白和/或泛素化活性的任何病症、疾病或病状，所述活性可以通过降低E1酶活性(例如，NAE活性)来调控。
例如，本发明的方法可用于治疗涉及细胞增殖的病症，其包括需要有效的滞蛋白依赖性泛素化和蛋白水解途径(例如，泛素蛋白酶体途径)用于疾病状态的维持和/或进展的病症。本发明的方法可用于治疗由通过E1活性(例如，NAE活性)来调节的蛋白质介导的病症(例如，NFκB活化、p27Kip活化、p21WAF/CIP1活化、p53活化)。相关的病症包括增殖性病症，最特别地是癌症和炎性病症(例如，类风湿性关节炎、炎性肠病、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨关节炎、皮肤病(例如，特应性皮炎、银屑病)、血管增殖性病症(例如，动脉粥样硬化、再狭窄)、自身免疫性疾病(例如，多发性硬化症、组织和器官排斥)；以及与感染有关的炎症(例如，免疫应答)、神经变性病症(例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、运动神经元疾病、神经性疼痛、三联体重复病症、星形细胞瘤和由于酒精性肝病造成的神经变性)、缺血性损伤(例如，中风)和恶病质(例如，伴有各种生理和病理状态的加速肌肉蛋白分解(例如，神经损伤、禁食、发热、酸中毒、HIV感染、癌症痛苦以及某些内分泌病)。
本发明的化合物和医药组合物对于癌症的治疗特别有用。本文所用的术语“癌症”是指特征在于以下的细胞病症：不受控制或失调的细胞增殖、减少的细胞分化、不适当的侵入周围组织的能力和/或在异位位点建立新生长的能力。术语“癌症”包括实体瘤和血液肿瘤。术语“癌症”涵盖皮肤病、组织病、器官病、骨病、软骨病、血液病和血管病。术语“癌症”进一步涵盖原发性和转移性癌症。
在某些实施例中，癌症为实体瘤。可以通过本发明的方法治疗的实体瘤的实例包括胰腺癌；膀胱癌；结肠直肠癌；乳腺癌，包括转移性乳腺癌；前列腺癌，包括雄激素依赖性和雄激素非依赖性前列腺癌；肾癌，包括例如，转移性肾细胞癌；肝细胞癌；肺癌，包括例如，非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌、细支气管肺泡癌(bronchioloalveolarcarcinoma，BAC)和肺腺癌；卵巢癌，包括例如，渐进性上皮细胞或原发性腹膜癌；宫颈癌；胃癌；食管癌；头颈癌，包括例如，头颈鳞状细胞癌；黑素瘤；神经内分泌癌，包括转移性神经内分泌瘤；脑肿瘤，包括例如，神经胶质瘤、间变性寡轴突胶质细胞瘤(anaplastic oligodendroglioma)、成人多形性胶质母细胞瘤和成人间变性星形细胞瘤；骨癌；和软组织肉瘤。
在一些实施例中，癌症为恶性血液病。血液恶性病的实例包括急性髓性白血病(AML)；慢性骨髓性白血病(CML)，包括加速期CML和CML急变期(CML-BP)；急性淋巴母细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；霍奇金氏病(Hodgkin′s disease，HD)；非-霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括滤泡性淋巴瘤和外套细胞淋巴瘤；B-细胞淋巴瘤；T-细胞淋巴瘤；多发性骨髓瘤(MM)；沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinemia)；骨髓增生异常综合症(MDS)，包括难治性贫血(RA)、难治性贫血伴环形铁幼粒细胞(RARS)、难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)和转变型RAEB(RAEB-T)；和骨髓增殖性综合症。
取决于待治疗的特定病症或病状，在一些实施例中，本发明的E1酶抑制剂联合一种或一种以上另外的治疗剂投与。在一些实施例中，另外的治疗剂为通常投与给患有正治疗的病症或病状的患者的治疗剂。如本文所用，通常投与以治疗特定病症或病状的另外的治疗剂被称为“适合于正治疗的病症或病状”。
本发明的E1抑制剂可以与其它治疗剂以单一剂量形式或以分开的剂量形式投与。当以分开的剂量形式投与时，可以在投与本发明的E1抑制剂之前、同时或之后投与其它治疗剂。
在一些实施例中，本发明的E1酶抑制剂联合选自适合用于治疗增殖性病症和癌症的细胞毒性剂、放射疗法和免疫疗法的治疗剂投与。适用于与本发明的E1酶抑制剂组合使用的细胞毒性剂的实例包括：抗代谢物，包括，如，卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)、5-氟尿嘧啶或5-氟尿嘧啶/甲酰四氢叶酸、氟达拉滨(fludarabine)、阿糖胞苷、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁(pentostatin)和甲氨蝶呤；拓扑异构酶抑制剂，包括例如，依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、喜树碱(camptothecin)、拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、阿霉素和柔红霉素；长春花生物碱，包括例如，长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastin)；紫杉烷，包括例如，紫杉醇和多西他赛(docetaxel)；铂剂，包括例如，顺铂、卡铂和奥沙利铂(oxaliplatin)；抗生素，包括例如，放线菌素D、博来霉素、丝裂霉素C、阿霉素、柔红霉素、伊达比星(idarubicin)、阿霉素和聚乙二醇化阿霉素脂质体；烷化剂，诸如美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥、白消安(busulfan)、噻替派(thiotepa)、异环磷酰胺、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、链佐星(streptozocin)、达卡巴嗪(dacarbazine)和环磷酰胺；包括例如，CC-5013和CC-4047；和蛋白酪氨酸激酶抑制剂，包括例如，甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)和吉非替尼(gefitinib)；蛋白酶体抑制剂，包括例如，硼替佐米(bortezomib)；沙立度胺(thalidomide)和相关的类似物；抗体，包括例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、西妥昔单抗(cetuximab)和贝伐单抗(bevacizumab)；米托蒽醌(mitoxantrone)；地塞米松(dexamethasone)；泼尼松(prednisone)；和替莫唑胺(temozolomide)。
可以与本发明的抑制剂组合的其它药剂的实例包括抗炎剂，诸如皮质类固醇、TNF阻滞剂、II-1RA、硫唑嘌呤、环磷酰胺和柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；免疫调节剂和免疫抑制剂，诸如环孢霉素、他克莫司(tacrolimus)、雷帕霉素(rapamycin)、吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil)、干扰素、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和柳氮磺胺吡啶；抗菌剂和抗病毒剂；和用于阿尔茨海默氏病治疗的药剂，诸如多奈哌齐(donepezil)、加兰他敏(galantamine)、美金刚胺(memantine)和利斯的明(rivastigmine)。
为了更充分地理解本发明，陈述以下制备和测试实例。这些实例仅为了说明目的而并非打算理解为以任何方式限制本发明的范围。
实例
缩写
Figure BDA0000495144480000361
Figure BDA0000495144480000371
一股方法
X射线粉末衍射。使用布鲁克(Bruker)AXS D8高级X-射线衍射仪进行XRPD。将大约100mg样品轻轻地弄平至50mm直径的石英样品盘上用于粉末测量。使用2θ/θ锁定耦合角度从2.9至29.6°2θ对样品进行连续扫描。每一角度间隔为0.05°2θ并收集2秒数据。在环境条件下进行样品运行，并且使用EVA版本9.0软件对所有数据进行分析。
热分析。使用差示扫描量热法(DSC)和热重分析(TGA)对热事件进行分析。将TA仪器DSC Q200和TGA Q500用于所有样品运行。使用针对Q系列软件的ThermalAdvantage对热谱图进行分析。
差示扫描量热法。将样品(1-2mg)密封在带盖的铝盘中。将样品以10℃/min的升温速率从25℃加热至400℃，同时氮气吹扫样品保持恒定在50mL/min。
热重分析。将样品(5-10mg)在敞开铂盘中运行。将样品以10℃/min的升温速率加热至400℃，同时以60mL/min进行氮气吹扫样品。
实例1.(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基二氢化茚-1-胺(8)的合成
步骤1：rel-(1aR，6aS)-4-氯-6，6a-二氢-1aH-茚并[1，2-b]环氧乙烯(2)。
在0℃下，向4-苯基丙基吡啶-N-氧化物(278mg，1.31mmol)在二氯甲烷(20mL)中的搅拌溶液中加入(R，R)-雅各布森催化剂(237.0mg，0.3732mmol)和次氯酸钠溶液(2.0M水溶液；16mL，32mmol)。将所得褐色悬浮液在0℃下搅拌15分钟，然后经由注射器加入6-氯-1H-茚(1)(2.81g，18.6mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液，同时加入另外的次氯酸钠(2.0M水溶液；16mL，32mmol)。将反应物在0℃下搅拌1小时，然后移除冰浴并将反应物在室温下搅拌1小时。取等分试样并且硅胶上的TLC(己烷)展示所有起始物质均被消耗。将反应物倾入于盐水中并用二氯甲烷萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，然后经硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，以留下粗产物，其在高真空下放置时发生固化。获得约3.7g褐色固体。1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.55(d，J＝7.6Hz，1H)，7.32(s，1H)，7.23(d，J＝7.3Hz，1H)，4.36(s，1H)，4.16(s，1H)，3.03(dd，J＝45.8，18.2Hz，2H)。
步骤2：rel-(1R，2S)-1-氨基-5-氯二氢化茚-2-醇(3)。
向发烟硫酸(4.098mL，44.06mmol)在乙腈(30mL，500mmol)中的-40℃混合物中逐滴加入rel-(1aR，6aS)-4-氯-6，6a-二氢-1aH-茚并[1，2-b]环氧乙烯(2)(2.94g，17.6mmol)在乙腈(70mL)和己烷(40mL)中的悬浮液。然后使两相混合物升温到室温并另外搅拌1小时，留下混浊的铁红色混合物。小心加入水(30mL)(所有固体溶解以产生红褐色溶液)并将所得溶液搅拌30分钟。然后加入另外的水(70mL)并将反应物在氮气气氛下于室温下搅拌过夜。将水(50mL)加入到反应物中，附接蒸馏头，使混合物回流并蒸馏直到蒸馏头温度达到100℃为止。移除蒸馏头并附接回流冷凝器，并将反应物加热回流1小时以产生在边缘附近具有一些深色粘性固体的澄清橙色溶液。将反应物略微冷却，然后将热溶液倾析离开胶状物进入500ml圆底烧瓶中。搅拌溶液并冷却到室温，然后经由逐滴加入50％NaOH水溶液碱化(pH12)。加入二氯甲烷；将混合物充分搅拌，且然后转移到分液漏斗中。分离有机层并用另外的二氯甲烷反复萃取水层(直到TLC分析指示已经从水层萃取出所有产物)。合并有机萃取物，用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发，留下2.53g呈淡褐色粉末状的粗产物。LCMS：甲酸，[M+H++Na+]＝208；1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.31(d，J＝7.8Hz，1H)，7.24-7.15(m，2H)，4.79(s，1H)，4.20(s，1H)，4.01(s，1H)，2.92(d，J＝15.3Hz，1H)，2.73(d，J＝16.2Hz，1H)，2.15-1.43(s，2H)。手性HPLC(Chiralpak AD4.6×250柱，用95/5/0.1％己烷/EtOH/DEA以2.0ml/min运行45分钟洗脱)展示80％的ee。
步骤3和4：(1R，2S)-1-氨基-5-氯二氢化茚-2-醇(5)的手性拆分。
在回流下，向含有rel-(1R，2S)-1-氨基-5-氯二氢化茚-2-醇(3)(2.53g，13.8mmol)在甲醇(100mL)中的溶液的烧瓶中在搅拌下加入D-(-)-扁桃酸(2.09g，13.8mmol)。在回流约15分钟之后，移除加热套并将溶液在搅拌下冷却到室温。在移除热源后约15分钟固体开始沉淀。将所得混合物在室温下搅拌过夜。然后将混合物过滤，用甲醇(10mL)、然后用二乙醚(15mL)洗涤并真空干燥以提供2.50g中间盐。将滤液浓缩到约1/3体积并冷藏过夜，在此期间沉淀出更多产物。再次地，将混合物过滤并用甲醇(7.5mL)、然后用二乙醚(10mL)洗涤并真空干燥以提供另外的0.60g中间盐。总共收集3.1g。
将中间盐在乙酸乙酯(50ml)和NaOH水溶液(0.2M，60ml)的混合物中搅拌直至完全溶解。将混合物转移至分液漏斗中并分离有机层。将水层用乙酸乙酯(3×50ml)进一步萃取。将合并的有机层用盐水洗涤直至洗液为中性，然后经硫酸钠干燥，过滤并蒸发留下浅棕褐色固体。在高真空下进一步干燥，得到1.42g(56％收率)呈浅棕褐色粉末的标题化合物。标题化合物的分析数据：1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.31(d，J＝7.9Hz，1H)，7.24-7.15(m，2H)，4.83(s，1H)，4.20(t，J＝3.9Hz，1H)，4.00(d，J＝4.5Hz，1H)，2.92(dd，J＝16.2，4.9Hz，1H)，2.73(d，J＝15.2Hz，1H)，1.85(s，2H)。手性HPLC(Chiralpak AD4.6×250柱上，用95/5/0.1％己烷/EtOH/DEA以2.0ml/min运行45分钟洗脱)展示>99％的ee。
步骤5：2-[(1R，2S)-5-氯-2-羟基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(6)。
在1L圆底烧瓶中，将N，N-二异丙基乙胺(15.2mL，0.0871mol)加入至(1S，2R)-1-氨基-5-氯二氢化茚-2-醇(16.0g，0.0871mol)和邻苯二甲酸酐(14.2g，0.0958mol)在甲苯(473mL，4.44mol)中的悬浮液中并将反应混合物加热回流18小时。将反应物冷却至室温，此时沉淀出大量固体。将固体(其为所需产物)过滤，用EtOAc洗涤并收集。将滤液冷却至0℃，过滤，并将固体用EtOAc洗涤且与第一批合并。将滤液转移到分液漏斗中并用H2O(200mL)稀释。分离各层，并用EtOAc(3×200mL)萃取水层。将合并的有机层用1×盐水(100mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将所得灰白色固体悬浮在EtOAc中，用超声处理破碎大块并将悬浮液冷却至0℃。将固体过滤并与先前的2批合并。将滤液真空浓缩并将所得白色固体最后一次悬浮在Et2O(100mL)中，过滤并与先前的3批合并。所有四个批次的固体的总收率为25.3g(92％)。LCMS：(FA)ES+分子离子314，主要电离167；1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.83(s，4H)，7.33(s，1H)，7.27(d，J＝8.2，1H)，7.19(dd，J＝2.0，8.1，1H)，5.52(d，J＝7.4，1H)，5.34(d，J＝5.2，1H)，4.64(dt，J＝6.9，12.7，1H)，3.21(dd，J＝7.4，16.1，1H)，3.02(dd，J＝6.1，16.1，1H)。
步骤6：2-[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(7)
向2-[(1R，2S)-5-氯-2-羟基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(25.8g，0.0822mol)在四氢呋喃(186mL，2.29mol)中的溶液中加入碘甲烷(20.5mL，0.329mol)并在0℃下搅拌所述溶液。经由加料漏斗在1小时内向所述溶液中逐滴加入1.00M叔丁醇钾于四氢呋喃中的溶液(90.4mL，0.0904mol)。经由加入0.1N HCl(250mL)淬灭反应并转移至含有EtOAc(600mL)的分液漏斗中。分离各层，并用1N NaOH(每次2×100mL)和盐水(100mL)洗涤有机层。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到2-[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(25.8g，96％)，其未经进一步纯化用于下一步骤。
步骤7：(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基二氢化茚-1-胺(8)
向2-[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮(7)(25.8g，0.0787mol)在乙醇(260mL，4.4mol)的悬浮液中加入肼(4.94mL，0.157mol)并将烧瓶附接回流冷凝器并加热至90℃的浴温度。在搅拌数分钟之后开始形成沉淀，并在加热1小时之后混合物变成粘稠的浆液/固体。将反应物冷却至室温并将固体反应副产物过滤并用CH2Cl2(约300mL)洗涤。从滤液中真空除去挥发物，并将残余物悬浮在CH2Cl2(250mL)中，此时再次通过过滤除去固体副产物。真空除去挥发物并将残余物再次悬浮在CH2Cl2(约50mL)中。最后一次通过过滤除去固体副产物以得到呈红色/橙色蜡状固体的(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基二氢化茚-1-胺(15.5g，99％)。LCMS：(FA)ES+分子离子198，主要电离181；1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.30(d，J＝7.9，1H)，7.25-7.16(m，2H)，4.14(d，J＝4.9，1H)，3.89(td，J＝2.8，4.9，1H)，3.29(s，3H)，2.89(ddd，J＝3.8，16.4，21.3，2H)，2.04(s，2H)。手性HPLC(Chiralpak AD4.6×250柱，用95/5/0.1％己烷/EtOH/DEA以1.0ml/min洗脱运行30分钟)展示>99％的ee。
实例2.氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)的合成
步骤1：rel-(1R，5R)-5-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)环戊-2-烯-1-醇(10)。
在0℃下于氮气气氛下向rel-(1R，5R)-5-(羟基甲基)环戊-2-烯-1-醇(47.20g，0.4135mol)、N，N-二甲基氨基吡啶(2.52g，0.0207mol)和1H-咪唑(30.97g，0.4549mol)在二氯甲烷(800mL，10mol)中的溶液中加入叔丁基二甲基氯硅烷(28.0g，0.186mol)。将反应物搅拌在0℃下搅拌2.5h，此时加入叔丁基二甲基氯硅烷(28.0g，0.186mol)。将反应物搅拌另外2小时。通过加入饱和NaCl水溶液(200mL)和水(200mL)淬灭反应物。分离各层并用水(3×200mL)和盐水(1×200mL)洗涤有机层，经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。此物质未经进一步纯化即用于下一步骤中。
步骤2：(1S，5S)-5-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)环戊-2-烯-1-醇(11)
向rel-(1R，5R)-5-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-环戊-2-烯-1-醇(来自先前步骤的粗制物(10))和在丙烯酸树脂(24.9g；10，800单位/g)上的南极假丝酵母(CandidaAntarctica)在甲基叔丁基醚(1500mL，10mol)中的悬浮液中加入乙酸乙烯基酯(190mL，2.05mol)并将反应物搅拌过夜。通过过滤除去固体并真空除去挥发物以提供澄清无色的油(143克)，将其通过柱色谱法(1千克硅胶柱，洗脱液0-30％Et2O：己烷)纯化以得到所需的对映体(1S，5S)-5-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)环戊-2-烯-1-醇(37.5克，79.5％)。手性HPLC；Chiral Technologies Chiralpak AS RH(4.6X150mm)5微米柱，洗脱液-55％(0.1％甲酸在99：1H2O/CH3CN中)，45％(0.1％甲酸在95：5CH3CN/H2O中)指示>99％的ee。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.96-5.91(m，1H)，5.86-5.80(m，1H)，4.87(dd，J＝2.3，4.9，1H)，3.87(dd，J＝4.7，10.1，1H)，3.79(dd，J＝7.7，10.1，1H)，2.50-2.40(m，1H)，2.35(ddt，J＝2.0，8.4，16.8，1H)，2.23-2.14(m，1H)，0.90(s，9H)，0.08(s，3H)，0.07(s，3H)。将不需要的对映体分离成相应的乙酸酯，收率为81.6％。
步骤3：叔丁基[((1S，2S)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}环戊-3-烯-1-基)甲氧基]二甲基甲硅烷(12)
在氮气下冷却的经烘箱干燥的2L两颈烧瓶中，向(1S，5S)-5-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)环戊-2-烯-1-醇(11)(98.07g，0.3864mol)在二氯甲烷(500mL，8mol)中的溶液中加入1H-咪唑(31.57g，0.4637mol)。经由加料漏斗在约30分钟内向所得黄色溶液中加入叔丁基二甲基氯硅烷(58.2g，0.386mo)在二氯甲烷(300mL，5mol)中的溶液。将混合物机械搅拌18小时。经由加入水(500mL)淬灭反应并分离各层。将有机层用水洗涤(2×500ml)，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩以得到呈粗残余物的叔丁基[((1S，2S)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}环戊-3-烯-1-基)甲氧基]二甲基甲硅烷(143.3g)，其不经进一步纯化即使用。
步骤4：(1R，3S，4S)-3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)环戊醇(13)
在2L圆底烧瓶中，将叔丁基[((1S，2S)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}环戊-3-烯-1-基)甲氧基]二甲基甲硅烷(12)(12.08g粗残余物)与甲苯共沸三次，在真空下干燥30分钟并在氩气气氛下溶解于无水四氢呋喃(402.7mL)中。向所述溶液中逐滴加入儿茶酚硼烷在四氢呋喃中的溶液(1.00M，88.1mL，0.0881mol)。然后将氩气鼓泡通入20分钟以使反应溶液脱氧。然后加入三(三苯基膦)氯化铑(I)(3.26g，0.00352mol)并在氩气下于室温将反应物搅拌18小时。向反应中加入1.00M氢氧化钠水溶液(528.8mL，0.5288mol)，随后小心地加入过氧化氢溶液(35重量％水溶液，30.79mL，0.3525mol)并将混合物在室温下搅拌4小时。经由加入饱和的Na2S2O3(500mL)淬灭反应，分离各层并用EtOAc(2×300mL)萃取水层。将合并的有机部分用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将褐色油通过柱色谱法(洗脱液：于己烷中的0％至20％醚)纯化以得到(1R，3S，4S)-3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)环戊醇(7.78g，2步收率一66％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.50(d，J＝4.3，1H)，4.34(td，J＝2.7，4.8，1H)，3.71(dd，J＝7.0，10.0，1H)，3.53(dd，J＝7.0，10.0，1H)，2.32-2.20(m，1H)，2.04(ddd，J＝2.6，6.7，13.9，1H)，1.85(ddd，J＝7.1，10.3，13.5，1H)，1.73(dt，J＝4.8，13.9，1H)，1.63(ddd，J＝2.1，7.9，13.5，1H)，1.35(s，1H)，0.88(s，9H)，0.86(s，9H)，0.04(s，3H)，0.03(s，9H)。
步骤5：4-{[(1R，3S，4S)-3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)环戊基]氧基}-6-氯嘧啶(14)
向经火焰干燥的50mL圆底烧瓶中装载氢化钠(0.322g，0.008mol)和四氢呋喃(20mL，0.3mol)并在氮气气氛下将所得悬浮液冷却至0℃。在0℃下向所述悬浮液中逐滴加入含(1R，3S，4S)-3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)环戊醇(13)(1.45g，0.004mol)于0.5mL THF中的溶液。将混合物在0℃下搅拌10分钟，此时加入4，6-二氯嘧啶(0.659g，0.004mol)并将混合物升温至室温并搅拌18小时。经由加入饱和NH4Cl水溶液(25mL)淬灭反应并转移到分液漏斗中。分离各层，并用tert-BuOMe(3×25mL)萃取水层。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。将所得油状物通过硅胶色谱(洗脱液-于己烷中的0-10％EtOAc)纯化，以得到4-{[(1R，3S，4S)-3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)环戊基]氧基}-6-氯嘧啶(1.75g，92％收率)。LCMS：(FA)ES+473；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.55(d，J＝0.7，1H)，6.69(d，J＝0.8，1H)，5.61-5.49(m，1H)，4.36(dd，J＝4.6，6.8，1H)，3.73(dd，J＝7.0，10.0，1H)，3.57(dd，J＝6.7，9.9，1H)，2.36-2.13(m，2H)，2.10-1.73(m，3H)，0.89(s，9H)，0.88(s，9H)，0.08-0.00(m，12H)。
步骤6：{(1S，2S，4R)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-[(6-氯嘧啶-4-基)氧基]环戊基}甲醇(15)
在2L圆底烧瓶中，将4-{[(1R，3S，4S)-3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]-氧基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)环戊基]氧基}-6-氯嘧啶(14)(20.5g，0.0433mol)溶解于乙醇(647.2mL，11.08mol)中，并冷却至-45℃的内部温度。向其中加入预冷却(-20℃)的2％浓HCl在EtOH中的溶液(326mL，0.0516mol，通过将6.5mL浓HCl在319.5mL乙醇中稀释制备)。将反应混合物升温至-25℃(以防止在给烧瓶加盖时发生压力积聚)，然后加盖并置于-35℃的冰箱中。将反应物在-35℃下静置18小时。用碳酸钠(13.78g，0.1300mol)(相对于HCl约3当量)在水(40mL，2mol)中的溶液淬灭反应。真空除去挥发物，并将反应混合物用CH2Cl2(750mL)稀释。过滤固体并搁置，并从滤液中真空除去挥发物。将所得水性混合物用EtOAc(500mL)和水(200mL)稀释并转移至分液漏斗中。分离各层，并用EtOAc(2×250mL)萃取水层。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗残余物通过柱色谱法(用约50mL CH2Cl2施加至柱，400g柱，洗脱液0-40％EtOAc：己烷，历时40分钟)纯化以得到{(1S，2S，4R)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-[(6-氯嘧啶-4-基)氧基]环戊基}甲醇(11.2g，72％)。LCMS：(FA)ES+359；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.56(app d，J＝0.6，1H)，6.70(app d，J＝0.8，1H)，5.62-5.54(m，1H)，4.56(dd，J＝5.6，10.9，1H)，3.86-3.78(m，1H)，3.70(ddd，J＝6.0，7.6，11.3，1H)，2.48(dd，J＝4.6，7.6，1H)，2.42-2.31(m，1H)，2.23(ddd，J＝6.3，9.8，14.2，1H)，2.15-2.09(m，2H)，1.89(ddd，J＝1.9，8.0，14.3，1H)，0.91(s，9H)，0.12(s，3H)，0.11(s，3H)。
步骤7：{(1S，2S，4R)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]环戊基}甲醇(16)
向在350mL可密封的反应容器中的{(1S，2S，4R)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-[(6-氯嘧啶-4-基)氧基]环戊基}甲醇(15)(11.2g，0.0312mol)和N，5-二氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺(9.00g，0.0384mol)在1-丁醇(99.2mL，1.09mol)的溶液中加入三乙胺(21.7mL，0.156mol)。将容器密封，并然后在油浴中搅拌加热至148℃保持72小时。将容器冷却至室温并真空除去挥发物并将Et2O(200mL)加入至所得残余物中。将固体通过超声处理均化，过滤并用Et2O(50mL)洗涤。向滤液中加入
Figure BDA0000495144480000431
(100mL)并真空除去挥发物。将吸附到上的产物加入至干燥装载盒中并经由柱色谱法(400g柱，洗脱液0-80％EtOAc：己烷，历时80分钟)纯化，以得到{(1S，2S，4R)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]环戊基}甲醇(11.5g，71％)。LCMS：(FA)ES+520；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.31(s，1H)，7.24-7.13(m，3H)，5.75(s，1H)，5.56(s，1H)，5.45(dt，J＝2.9，5.8，2H)，4.57(dd，J＝5.9，11.2，1H)，4.19(td，J＝1.3，4.7，1H)，3.84-3.77(m，1H)，3.75-3.65(m，1H)，3.37(s，3H)，3.10(d，J＝16.6，1H)，2.97(dd，J＝4.5，16.7，1H)，2.58(dd，J＝4.8，7.4，1H)，2.43-2.32(m，1H)，2.23-2.06(m，3H)，1.90(dd，J＝8.0，14.2，1H)，0.91(s，9H)，0.11(s，3H)，0.10(s，3H)。
步骤8：氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)
向{(1S，2S，4R)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]环戊基}甲醇(16)(11.5g，0.0221mol)在N，N-二甲基乙酰胺(160mL，1.7mol)中的溶液中加入氨基磺酰氯(6.64g，0.0575mol)并将反应物在室温下搅拌1小时。然后将反应混合物冷却至0℃，此时经由加料漏斗在25分钟内逐滴加入12M盐酸(90mL，1.1mol)，保持内部反应温度低于50℃。一旦完成加入，移除冷浴并将反应物升温至室温同时搅拌2小时。然后经由缓慢加入碳酸钠(70.30g，0.6633mol)在水(200.0mL，11.10mol)中的悬浮液小心淬灭反应。将所得悬浮液过滤并用EtOAc洗涤固体(3次洗涤，总共-800mL)。搁置固体，并将滤液转移至分液漏斗中并分离各层。将水层用3×EtOAc萃取(总共EtOAc-2000mL)，并将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将粗残余物经由柱色谱法(用CH2Cl2施加，400g柱，洗脱液0-10％MeOH：CH2Cl2保持80分钟，然后10％MeOH：CH2Cl2保持20分钟)纯化，以得到氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(10.3g，96％)。LCMS：(FA)ES+485；1H NMR(400MHz，MeOD)δ8.16(s，1H)，7.25(s，1H)，7.22-7.13(m，2H)，5.98(s，1H)，5.52(d，J＝32.8，1H)，5.34(s，1H)，4.43-4.35(m，1H)，4.32(dd，J＝7.5，9.8，1H)，4.22(td，J＝2.5，5.0，1H)，4.16(dd，J＝7.3，9.8，1H)，3.34(s，4H)，3.10(dd，J＝2.1，16.6，1H)，3.02(dd，J＝4.8，16.6，1H)，2.58-2.46(m，1H)，2.28(ddd，J＝2.2，6.9，14.8，1H)，2.12-1.90(m，4H)。
步骤9：氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯HC1盐(I-216HCl形式I)
将氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯(I-216)(24.1g，0.0497mol)置于配有搅拌棒的500-mLrbf中。在搅拌下加入乙腈(500mL)。将混合物超声处理1分钟，然后在氮气气氛下于室温搅拌1小时以确保固体完全分散。在缓慢流中加入盐酸水溶液(6.0M，9.15mL，0.0549mol)，溶液变得较自由的流动但是未出现总体溶液的情况。将混合物用先前制备的I-216HCl盐的一些晶体(如以下实例3中所述制备)引晶并将混合物超声处理1分钟，然后在氮气气氛下于室温下搅拌2小时；在白色固体从溶液中析出期间混合物变得非常粘稠。将搅拌的混合物用二乙醚(500mL)稀释，并然后在冰箱中储存过夜。在烧结的玻璃漏斗上收集沉淀，用醚洗涤，然后在40℃下真空干燥过夜得到呈蓬松的白色结晶粉末的标题化合物，24.37g(94％收率)。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.44(s，1H)，8.38(s，2H)，7.43(s，2H)，7.36(s，1H)，7.23(dd，J＝20.1，8.1Hz，3H)，6.22(s，1H)，5.68(s，1H)，5.26(s，1H)，4.31-4.12(m，4H)，4.09-3.92(m，1H)，3.05(s，3H)，2.36(dt，J＝18.8，7.6Hz，1H)，2.21(dd，J＝14.0，6.5Hz，1H)，2.05-1.93(m，2H)，1.89(dd，J＝13.3，8.3Hz，1H)。LCMS：甲酸，[M+H+]＝485.3。手性HPLC(Chiralcel OJ4.6×250柱，用60/40/0.1％己烷/EtOH/DEA以0.75ml/min洗脱运行60分钟)指示产物为99.7％ee。HPLC分析指示产物为99.2％纯。在本实例2中制备的I-216HCl形式I的XRPD数据展示于图7。在图7中鉴别的峰包括列于表5的那些。
表5
在本实例2中制备的I-216HCl形式I的DSC数据展示于图8，并且在本实例2中制备的I-216HCl形式I的TGA数据展示于图9。
实例3.氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯盐酸盐(I-216HCl)的合成。
将氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯I-216(4.44g，0.00916mo1)置于配有搅拌棒的250-ml圆底烧瓶中。在搅拌下加入乙腈(82.5mL)。将混合物搅拌并超声处理几分钟(固体未完全溶解)。将烧瓶浸入冰浴中，且然后在搅拌下，于缓慢流中加入盐酸水溶液(6.0M，1.69mL，0.0101mol)，在此期间固体部分溶解。移除冰浴并在氮气气氛下于室温下将反应混合物搅拌2小时，期间形成稠密的白色沉淀。在搅拌下加入二乙醚(82.5mL)并将所得混合物在冰箱中储存过夜。在多孔漏斗上收集沉淀产物，用冷醚洗涤，然后在高真空下于42℃下干燥24小时以得到3.84g(80％收率)呈蓬松的白色粉末的标题化合物。LCMS：甲酸，[M+H+]一485.2。1H NMR(400MHz，MeOD)δ8.42(s，1H)，7.30(s，1H)，7.27-7.18(m，2H)，6.26(s，1H)，5.78(s，1H)，5.30(s，1H)，4.46-4.38(td，J＝5.2，2.0Hz，1H)，4.39-4.25(m，2H)，4.23-4.13(dd，J＝9.9，7.4Hz，1H)，3.37(s，3H)，3.18-3.04(m，2H)，2.62-2.47(m，1H)，2.42-2.31(ddd，J＝15.0，6.9，2.0Hz，1H)，2.24-2.14(dt，J＝15.0，4.6Hz，1H)，2.14-2.02(dd，J＝10.3，5.9Hz，2H)。
实例4.(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺盐酸盐(20)的合成
步骤1：5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-酮(18)
将配有温度探针、氮气入口、冷却浴和顶置式机械搅拌器的22L多颈反应器中装载甲醇(2400mL)并冷却至-20℃。经由加料漏斗在1小时内装载硫酸(384mL，7.22mol)。将温度保持在约-25℃并在-18℃的最高点下持续约5分钟。在10分钟内加入原甲酸三甲酯(906mL，8.3mol)，随后加入呈固体的5-氯-2，3-二氢-1H-茚-1-酮(17)(600.00g，3.61mol)。内部温度略微增加2℃。在20分钟内将科泽试剂(1553g，3.97mol)溶解于甲醇(2400mL)中，将其在1小时15分钟内加入至反应容器中。加入是放热的并内部温度保持在约-20℃。一旦完成加入，将深红色溶液在-20℃下搅拌1小时，此时HPLC分析指示完全转化为所需产物。分小份加入水(7200mL)。在加入少量水(约50mL)之后，产物突然沉淀。搅动变得缓慢且困难。将混合物在0℃到10℃下搅拌1小时并通过3000mL粗多孔漏斗过滤。在2小时内完成过滤并用水(7200mL)洗涤滤饼直至滤液的pH值达到约5。将湿饼加回至反应器中并加入庚烷(3000mL)。将混合物在-20℃下搅拌1h并过滤。将滤饼用庚烷(1200mL)洗涤并处理30分钟。将湿饼在高真空下干燥3天以完全除去庚烷并将水含量降低至<2％。材料具有99％(AUC，通过HPLC)和通过重量％测定93重量％(622.88g，88％)的纯度。1H NMR(300MHz，CDCl3，δ)：7.69(m，1H)，7.43(s，1H)，7.38(m，1H)，4.18(m，1H)，3.63(s，3H)，3.47(m，1H)和2.99(m，1H)。
步骤2：(R，E)-N-((S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-亚基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(19)
将配有冷凝器、氮气入口、加热套和顶置式机械搅拌器的22L多颈反应器中装载5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-酮(18)(622.88g，3.17mol)和(R)-叔丁基亚磺酰胺(460.7g，3.8mol)。将四氢呋喃(3100mL)加入至混合物中并将温度降低至9℃。在10分钟内加入Ti(OEt)4(985mL，4.76mol)。将混合物加热至68℃并在约35℃下将所有固体溶解。在5小时之后，反应达到50％收率，如通过HPLC重量％测定来确定。将反应物在68℃下另外搅拌5小时直至不需要的非对映体分解至小于5％(AUC)。在2小时内将反应物冷却至环境温度并搅拌16小时。HPLC分析指示在此期间反应情况无明显变化。此粗反应混合物用于下一步骤而无需进一步纯化。
步骤3和4：(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺盐酸盐(20)
将配有氮气入口、冷却浴和顶置式机械搅拌器的22L多颈反应器中装载含存于四氢呋喃(4000mL)中的粗制(R，E)-N-((S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-亚基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(21)[约475g，约1.58mol]。分小份加入甲醇(9300mL)。未观察到明显的温度变化。使用丙酮/干冰浴将混合物冷却至-24℃。将2L的三颈圆底烧瓶中装载三甘醇二甲醚(528mL)并冷却至9℃。分小份加入NaBH4(60.2g，1.58mol)。温度略微升高1℃。将混合物升温至环境温度并搅拌2小时直至所有固体溶解以得到略微浑浊的溶液。在-24℃下在50分钟内将NaBH4溶液装载至22L反应器中。通过加入速率来控制放热。未明显观察到气体放出。在完成加入时，将混合物在-24℃另外搅拌2小时，此时HPLC分析指示完成反应和92％dr。在3小时内将混合物升温至环境温度并搅拌16小时。将反应物再次冷却至约7℃并将水(950mL)分批加入，导致内部温度升高5℃。加入硅藻土(475g)并将混合物搅拌1小时。然后将混合物通过大的桌上型过滤器(内径：19英寸)过滤并将滤饼用甲醇(4000mL)洗涤。最后部分的滤液的HPLC分析指示没有大量的产物。将合并的滤液在减压下浓缩至约6L的体积。加入乙酸异丙酯(950mL)并使各层分离。将水层用乙酸异丙酯(900mL)萃取并将合并的有机层用饱和的盐水(2000mL)洗涤。然后将溶液经硫酸钠干燥并浓缩至约2L。然后将混合物与四氢呋喃(3000mL×2)共沸蒸馏。卡尔-费休(Karl-Fisher)分析指示水含量为约0.2％。
将配有氮气入口、冷却浴和顶置式机械搅拌器的22L多颈反应器中装载粗制的磺酰基中间体(约475g，约1.58mol)和2-甲基-四氢呋喃(9500mL)。将溶液冷却至-20℃并在40分钟内加入4M盐酸的二噁烷溶液(800mL，3.16mol)。放热并不明显。在加入结束时沉淀出产物。将混合物在-20℃下搅拌另外1小时，此时HPLC分析指示完全转化。将混合物通过大的布氏漏斗(Büchner funnel)(内径：11英寸)过滤。过滤进行2小时。将滤饼用丙酮(1000mL)洗涤并处理1小时。然后将固体转移回至反应器并加入丙酮(3500mL)。将混合物在环境温度下搅拌16小时，且然后过滤。将滤饼用丙酮(500mL)洗涤，且然后在真空下干燥16小时。得到约293g呈灰白色固体的产物。HPLC分析指示96％纯度和96％ee。将配有冷凝器、氮气入口、加热套和顶置式机械搅拌器的22L多颈反应器中装载(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺盐酸盐(20)(290g，1.24mol)和乙醇(5200mL)。将混合物搅拌1小时并得到略微浑浊的溶液。将混合物通过细多孔漏斗过滤并将澄清的滤液装回至反应器中。将溶液加热至55℃并搅拌30分钟。在1.5小时内加入2-甲氧基-2-甲基丙烷(5200mL)并在加入期间将温度保持在55℃。在加入结束时沉淀出固体。将所得白色悬浮液在55℃下搅拌1小时并在2小时内缓慢冷却至环境温度。将混合物在环境温度下搅拌2天，且然后通过大布氏漏斗(内径：11英寸)过滤。将滤饼用MTBE(1000mL)洗涤并真空干燥16小时。得到呈白色固体的产物(184.4g，50％，>99％AUC，>99％ee)。1H NMR(300MHz，CD3OD，δ)：7.50(m，1H)，7.37(m，2H)，4.78(m，1H)，4.40(m，1H)，3.51(s，3H)和3.19(m，1H)。
实例5.氨基磺酸((1S，2S，4R)-4-(6-((1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基氨基)嘧啶-4-基氧基)-2-羟基环戊基)甲酯盐酸盐形式I(I-216HCl形式I)的合成
步骤1：((1R，4S)-4-(苄氧基)-3-(苄氧基甲基)环戊-2-烯基氧基)三甲基甲硅烷(22)
在氮气保护下于-15℃下将2.50M在己烷中的正丁基锂(567mL，1.42mol)在10分钟内缓慢加入至二丙胺(212mL，1.55mol)在2-甲氧基-2-甲基丙烷(2000mL)中的溶液中，保持低于-10℃的温度。将所得白色悬浮液在-15℃下搅拌30分钟。在30分钟内，向此悬浮液中缓慢加入(1S，2R，3S，5R)-3-(苄氧基)-2-(苄氧基甲基)-6-氧杂双环[3.1.0]己烷(21)(400.00g，1.29mol)在甲基叔丁基醚(1200mL)中的溶液，保持低于-10℃的内部温度。将反应混合物在-15℃下搅拌30分钟。TLC分析指示无剩余的起始物质(20％乙酸乙酯/庚烷)。加入三甲基氯硅烷(204mL，1.61mol)同时保持低于-10℃的温度。将混合物升温至0℃并搅拌30分钟。TLC分析指示无醇中间体(20％乙酸乙酯/庚烷)。将反应混合物用缓慢加入水(4L)淬灭同时保持低于8℃的内部温度。分离水层并将有机层用水(3×4L)萃取3次并且用饱和氯化钠水溶液(4L)萃取一次。将有机层减压浓缩以得到橙色油状物(480g，97.4％)，其不经进一步纯化即使用。1H NMR(300MHz，CD3OD，δ)：7.18(m，10H)，5.65(s，1H)，4.55(t，1H)，4.30(m，5H)，4.02(s，2H)，2.58(m，1H)，1.47(m，1H)和0.00(s，9H)。
步骤2：(1S，3S，4S)-3-(苄氧基)-4-(苄氧基甲基)环戊醇(23)
向((1R，4S)-4-(苄氧基)-3-(苄氧基甲基)环戊-2-烯基氧基)三甲基甲硅烷(22)(478.00g，1.2494mol)在四氢呋喃(9.6L)中的溶液中加入5wt％在硫酸钡上的Pd(265.9g，0.1249mol)并将混合物在100psi的氢气下于环境温度下搅拌18小时，以200rpm进行搅拌。在18小时后的HPLC分析指示起始物质被消耗。将反应混合物通过中等多孔漏斗过滤并用四氢呋喃(2000mL)洗涤床。将滤液浓缩，得到黄色油状物。将所得油状物吸收于乙酸乙酯(2000mL)中，向其加入2.0M盐酸水溶液(2000mL)，并将两相混合物搅拌1小时。分离有机层并用饱和碳酸氢钠水溶液(2000mL)萃取一次，用2.0M氢氧化钠水溶液(2000mL)萃取两次以及最后用饱和氯化钠水溶液(2000mL)萃取。将有机层浓缩，得到褐色油状物(344g，88％)，其不经进一步纯化即使用。1H NMR(300MHz，CD3OD，δ)：7.18(m，10H)，4.38(m，4H)，4.12(m，1H)，3.85(t，1H)，3.68(m，1H)，3.44(m，1H)，2.00(m，3H)，1.75(m，1H)和1.42(m，1H)。
步骤3：(1R，3S，4S)-3-(苄氧基)-4-(苄氧基甲基)环戊醇(24)
在氮气保护下于0℃下，向(1S，3S，4S)-3-(苄氧基)-4-(苄氧基甲基)环戊醇(23)(340.00g，1088.3mmol)在二氯甲烷(3400mL)和三乙胺(455.08mL，3265.0mmol)中的溶液中缓慢加入甲磺酰氯(92.661mL，1197.2mmol)，保持低于10℃的温度。将反应物升温至环境温度并搅拌1小时。HPLC指示起始物质完全消耗。将反应混合物冷却至0℃并用水(1700mL)淬灭，保持低于10℃的温度。分离有机层并用水(1700mL)萃取两次以及用饱和碳酸氢钠水溶液(1700mL)萃取两次。加入硫酸钠(50g)并将混合物搅拌10分钟。将浆液过滤并将滤液浓缩得到褐色油状物。将油状物吸收于四氢呋喃(3400m)中，向其中加入四丁基乙酸铵(656.28g，2176.7mmol)并且将混合物在环境温度下搅拌20小时。HPLC指示起始物质完全消耗。将反应混合物浓缩至约2体积(700mL)并且加入乙酸乙酯(3400mL)，并将混合物用水(1700mL)萃取三次并用饱和氯化钠水溶液(1700mL)萃取一次。将有机物浓缩并将所得残余物通过硅胶柱塞(1kg)用0-20％乙酸乙酯/己烷[乙酸乙酯(4L)+己烷(16L)]洗脱。将所需部分合并并浓缩以得到褐色残余物。向所得残余物中加入甲醇(4000mL)，随后加入氢氧化钠(130.59g，3265.0mmol)在水(2000mL)中的混合物并将反应混合物在环境温度下搅拌1小时。HPLC分析指示起始物质完全消耗。浓缩反应混合物中的大部分甲醇并加入水(1700mL)。将混合物用乙酸乙酯萃取三次(3×1700mL)。将合并的有机物用饱和氯化钠水溶液(1700mL)洗涤并经硫酸钠(50g)干燥。将所得浆液过滤并浓缩以得到浅褐色油状物(238g，70％)。1H NMR(300MHz，CD3OD，δ)：7.28(m，10H)，4.50(m，3H)，4.38(m，2H)，4.12(t，1H)，3.70(m，1H)，3.45(m，1H)，2.52(m，1H)，2.11(m，1H)和1.75(m，3H)。
步骤4：4-((1R，3S，4S)-3-(苄氧基)-4-(苄氧基甲基)环戊基氧基)-6-氯嘧啶(25)
在氮气保护下，于0℃向(1R，3S，4S)-3-(苄氧基)-4-(苄氧基甲基)环戊醇(24)(226.500g，725.026mmol)在四氢呋喃(1150mL)中的溶液中分批加入60％在矿物油中的NaH(86.995g，2175.1mmol)，维持低于10℃的温度。然后，在30分钟内加入4，6-二氯嘧啶(118.81g，797.53mmol)在四氢呋喃(1150mL)中的溶液，保持低于5℃的温度。将混合物升温至环境温度并搅拌24小时。HPLC分析指示反应混合物含有74％起始物质。用水(1150mL)和饱和氯化铵水溶液(1150ml)的混合物淬灭反应混合物，保持低于10℃的温度。分离四氢呋喃层并浓缩至约2体积(500mL)。用乙酸乙酯(1150mL)将水层萃取两次。合并有机层并用水(1150mL)洗涤两次以及用饱和氯化钠水溶液(1150mL)洗涤一次。然后浓缩有机物。将残余物吸收于四氢呋喃(2300mL)中并在氮气保护下冷却至0℃。分批加入60％于矿物油中的NaH(86.995g，2175.1mmol)，保持低于10℃的温度。将混合物升温至环境温度并搅拌16小时。HPLC分析指示反应完全。用水(1150mL)和饱和氯化铵水溶液(1150mL)的混合物淬灭反应混合物。将四氢呋喃层分离并浓缩至约2体积(500mL)。用乙酸乙酯(1150mL)将水层萃取两次。合并有机层并用水(1150mL)洗涤两次以及用饱和氯化钠水溶液(1150mL)洗涤一次。然后将有机物浓缩以得到粗中间体4-((1R，3S，4S)-3-(苄氧基)-4-(苄氧基甲基)环戊基氧基)-6-氯嘧啶。此粗反应混合物无需进一步纯化即用于下一步骤。
步骤5：(1S，2S，4R)-4-(6-氯嘧啶-4-基氧基)-2-(羟甲基)环戊醇(26)
将粗中间体4-((1R，3S，4S)-3-(苄氧基)-4-(苄氧基甲基)环戊基氧基)-6-氯嘧啶(25)吸收于二氯甲烷(3000mL)中并将混合物冷却至0℃。缓慢加入1.0M在二氯甲烷中的三氯硼烷(1087.538mL，1087.538mmol)，保持<10℃。将所得混合物在0℃搅拌1小时。HPLC分析指示起始物质被消耗。将反应混合物缓慢加入至饱和碳酸氢钠水溶液(2300mL)中并将两相混合物搅拌20分钟。将二氯甲烷层分离并用二氯甲烷(2300mL)萃取水层两次。合并有机物并浓缩。将残余物通过硅胶(1kg)柱塞用50％到100％乙酸乙酯/己烷(己烷(6L)+乙酸乙酯(14L))洗脱来纯化。将所需部分合并并浓缩以得到红色固体(124g，70％)。1H NMR(300MHz，CD3OD，δ)：8.58(s，1H)，6.91(s，1H)，5.61(m，1H)，4.39(t，1H)，3.75(m，1H)，3.61(m，1H)，2.25(m，3H)和2.00(m，2H)。
步骤6：(1S，2S，4R)-4-(6-((1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基氨基)嘧啶-4-基氧基)-2-(羟甲基)环戊醇(27)
向500ml帕尔(Parr)压力容器中加入在N-甲基吡咯烷酮(200mL)中的(1S，2S，4R)-4-(6-氯嘧啶-4-基氧基)-2-(羟甲基)环戊醇(26)(25.00g，102.2mmol)。向此混合物中加入(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-胺盐酸盐(31.10g，132.8mmol)，随后加入N，N-二异丙基乙胺(88.99mL，510.9mmol)。然后将容器密封，用30psi的氮气加压并加热至130℃保持22小时。当达到反应温度时压力增加至50psi并在反应过程保持在此压力下。在22小时之后，将反应物冷却至环境温度并放空压力。将二氯甲烷(250mL)加入至反应混合物中，且然后将其用饱和碳酸氢钠水溶液(250mL)萃取。然后将有机层用水(250mL)萃取四次并用饱和氯化钠水溶液(250mL)萃取一次。然后将有机层经硫酸钠(7.5g)干燥，过滤并浓缩。向黑色半固体油状物中加入乙腈(250mL)并将混合物在环境温度下搅拌2小时。在此期间析出米黄色固体并将其过滤，在40℃下减压干燥保持16小时。得到浅米黄色固体(17g，41％)。1H NMR(300MHz，CD3OD，δ)：8.19(s，1H)，7.25(s，1H)，7.18(m，2H)，5.97(s，1H)，5.58(m，1H)，5.30(m，1H)，4.41(m，1H)，4.22(m，1H)，3.76(m，1H)，3.61(m，1H)，3.30(s，3H)，3.05(m，2H)，2.30(m，2H)和1.97(m，3H)。
步骤7：氨基磺酸((1S，2S，4R)-4-(6-((1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基氨基)嘧啶-4-基氧基)-2-羟基环戊基)甲酯(I-216)
在3L反应器中，将(1S，2S，4R)-4-(6-((1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基氨基)嘧啶-4-基氧基)-2-(羟甲基)环戊醇(27)(85.00g，209.4mmol)溶解于N-甲基吡咯烷酮(510mL)中。向此溶液中一次性加入(4-氮杂-1-氮鎓双环[2.2.2]辛-1-基磺酰基)(叔丁氧基羰基)氮烷化物-1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(1：1)盐酸盐(如实例6所述制备)(368g，838mmol)，随后缓慢加入乙腈(255ml)。将所得浓浆液在环境温度下搅拌3小时。反应完成后，在环境温度下缓慢加入水(595mL)。将乙酸乙酯(1.70L)加入至所得混合物中。分离有机层并用水(2×595mL)洗涤两次以及用饱和氯化钠水溶液(595mL)洗涤一次。将合并的水层用乙酸乙酯(850mL)萃取三次。将合并的有机层经硫酸钠(20g)干燥，过滤并浓缩。将残留物吸收于乙腈(680mL)中并将所得溶液冷却至低于5℃的温度。缓慢加入12.0M盐酸水溶液(255mL，3060mmol)，保持低于10℃的内部温度并将所得混合物在环境温度下搅拌13小时。HPLC指示无剩余的Boc保护中间体。将反应混合物缓慢加入至饱和碳酸钠水溶液(850mL)和水(850mL)的混合物中，保持<20℃。然后加入乙酸乙酯(850mL)。分离有机层并用水(850mL)萃取两次以及用饱和氯化钠水溶液(850mL)萃取一次。合并水层并用乙酸乙酯萃取两次(850mL)。合并有机物并经硫酸钠(20g)干燥，过滤并浓缩。将所得残余物溶解于二氯甲烷(170mL)中并通过硅胶柱塞(1Kg)用4L二氯甲烷、4L二氯甲烷/乙酸乙酯(1：1)和最后8L乙酸乙酯洗脱。将所需部分合并并浓缩以得到含有残留的NMP的黄色半固体(71g)。1H NMR(300MHz，CD3OD，δ)：8.19(s，1H)，7.25(s，1H)，7.18(m，2H)，5.97(s，1H)，5.58(m，1H)，5.35(m，1H)，4.35(m，2H)，4.15(m，2H)，3.30(s，3H)，3.05(m，2H)，2.51(m，1H)，2.30(m，2H)和2.00(m，2H)。
步骤8：氨基磺酸((1S，2S，4R)-4-(6-((1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基氨基)嘧啶-4-基氧基)-2-羟基环戊基)甲酯盐酸盐形式I(I-216HCl形式I)的制备
在3-颈3L反应器中，将来自步骤7的粗制物I-216(142.00g，292.81mmol)于异丙醇(710mL)中浆液化并将混合物加热至60℃保持20分钟。然后非常缓慢地加入6.0M盐酸水溶液(97.604mL，585.62mmo1)并将混合物在60℃下搅拌10分钟。在加入10ml6M HCl之后观察到完全溶解，其中有7℃的放热。将反应混合物冷却至50℃并用先前制备的I-216HCl形式I(如以下实例7所述制备)(100mg)引晶。固体开始缓慢地沉淀并将此浆液在50℃下搅拌60分钟。在1小时内缓慢加入乙酸异丙酯(1420mL)，保持>45℃。将混合物冷却至环境温度并搅拌2小时，冷却至<5℃并搅拌2小时。过滤固体并用乙酸1-甲基乙基酯(710mL)重力洗涤此床。在45℃下将固体减压干燥16小时，获得白色固体(113.5g，51％，2个步骤)。1H NMR(300MHz，CD3OD，δ)：8.48(s，1H)，7.33(s，1H)，7.22(m，2H)，6.30(m，1H)，5.82(m，1H)，5.31(m，1H)，4.44(t，1H)，4.30(m，2H)，4.18(m，1H)，3.35(s，3H)，3.15(m，2H)，2.55(m，1H)，2.38(m，1H)和2.17(m，3H)。LCMS：Rf＝9.30分钟，ES+＝485(FA)。形式I的XRPD数据展示于图4。形式I的DSC数据展示于图5，并且形式I的TGA数据展示于图6。
实例6：(4-氮杂-1-氮鎓双环[2.2.2]辛-1-基磺酰基)(叔丁氧基羰基)氮烷化物-1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(1：1)盐酸盐的合成
将氯磺酰异氰酸酯(45.2Kg，319.4mo1)加入至甲苯(194.2Kg)并将所得溶液冷却至约0-6℃。然后在90分钟期间加入叔丁醇(23.6Kg，318.4mo1)在甲苯(48.0Kg)中的溶液，将温度保持在约0-6℃之间。然后搅拌混合物直至叔丁醇完全消耗(大约80分钟)。然后在2.5小时期间将三亚乙基二胺(DABCO，71.4Kg，636.5mo1)在甲苯(293.0Kg)中的溶液加入至混合物，将温度保持在约0-6℃。然后将混合物升温至20-25℃并搅拌8小时。在氮气气氛下通过离心过滤分离固体产物并用甲苯(180.8Kg)且然后用叔丁基甲基醚(51.0加仑)洗涤并旋转直至未进一步观察到有液体排出(约60分钟)。然后将固体在真空下进一步干燥以得到132.9Kg(4-氮杂-1-氮鎓双环[2.2.2]辛-1-基磺酰基)(叔丁氧基羰基)氮烷化物-1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(1：1)盐酸盐。
实例7：在实例5中使用的晶种I-216盐酸盐形式I的合成
步骤1：[({(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲氧基)磺酰基]氨基甲酸叔丁酯
在500mL反应器中，向(4-氮杂-1-氮鎓双环[2.2.2]辛-1-基磺酰基)(叔丁氧基羰基)氮烷化物-1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(1：1)盐酸盐(43.4g，98.6mmo1)在乙腈(30mL)中的溶液中加入在N-甲基吡咯烷酮(60mL)中的(1S，2S，4R)-4-(6-((1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基氨基)嘧啶-4-基氧基)-2-(羟甲基)环戊醇(27)(10g，24.6mmol)。将所得浓浆液在环境温度下搅拌3小时。反应完成后，在环境温度下缓慢加入水(66.6mL)。将乙酸乙酯(66.7mL)加入至所得混合物中。将水层用乙酸乙酯(3×66.6mL)萃取三次。将合并的有机层用水(66.7mL)洗涤一次并用饱和氯化钠水溶液(66.7mL)洗涤一次。将合并的有机层经硫酸镁(3g)干燥，过滤并浓缩。此产物未经进一步纯化即用于下一步骤。
步骤2：氨基磺酸((1S，2S，4R)-4-(6-((1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基氨基)嘧啶-4-基氧基)-2-羟基环戊基)甲酯盐酸盐形式I(I-216H-HCl形式I)的制备
将来自步骤1的残余物(10g)溶于乙腈(81.5mL)中并将所得溶液冷却至低于5℃的温度。缓慢加入12.0M盐酸(27.7mL，904mmol)，保持低于10℃的内部温度并将所得混合物在0℃下搅拌4小时，然后升温至室温并搅拌15h。HPLC指示无剩余的Boc保护中间体。向反应混合物中加入水(20mL，1110mmol)并将温度升高到60℃。一旦在此温度下，将反应物用如实例8所述制备的材料引晶。保持引晶并将反应物缓慢冷却至室温并搅拌16h。将反应物过滤并用水(66mL)洗涤并减压干燥过夜。这样得到白色固体产物(5.3g，9.8mmol)，60％收率。1H NMR(300MHz，CD3OD，δ)：8.19(s，1H)，7.25(s，1H)，7.18(m，2H)，5.97(s，1H)，5.58(m，1H)，5.35(m，1H)，4.35(m，2H)，4.15(m，2H)，3.30(s，3H)，3.05(m，2H)，2.51(m，1H)，2.30(m，2H)和2.00(m，2H)。
实例8：在实例7中使用的晶种I-216盐酸盐形式I的合成
将[({(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲氧基)磺酰基]氨基甲酸叔丁酯(1g；以与实例7步骤1中所述类似的方式制备)溶于乙腈(8.12mL)中并将所得溶液冷却至低于5℃的温度。缓慢加入12.0M盐酸(2.7mL，89mmol)，保持低于10℃的内部温度并将所得混合物在0℃下搅拌4小时，然后升温至室温并搅拌15h。HPLC指示无剩余的Boc保护中间体。向反应混合物中加入少量的水和碳酸氢钠进行中和，但此量并不完全中和此溶液。将反应混合物在40℃下浓缩，且然后将溶液冷却至室温并搅拌过夜。进一步加入水并将溶液再搅拌一小时。将反应物过滤并用水洗涤，且减压干燥过夜以得到白色固体产物(0.598g，1.15mmol)，收率为68％。1H NMR(300MHz，CD3OD，δ)：8.19(s，1H)，7.25(s，1H)，7.18(m，2H)，5.97(s，1H)，5.58(m，1H)，5.35(m，1H)，4.35(m，2H)，4.15(m，2H)，3.30(s，3H)，3.05(m，2H)，2.51(m，1H)，2.30(m，2H)和2.00(m，2H)。
将此白色固体(250mg，0.479mmol)悬浮于异丙醇(2.5mL，32.6mmol)中并加热至60℃。加入8.0M HC1水溶液(0.120mL，0.959mmol)并发生一些溶解。在15分钟之后，去除加热，并将悬浮液冷却至室温并搅拌过夜。将固体过滤并用5％IPA水溶液洗涤，且减压干燥过夜。这样得到标题化合物(0.204g，0.391mmol)，收率为81.6％。1H NMR(300MHz，CD3OD，δ)：8.19(s，1H)，7.25(s，1H)，7.18(m，2H)，5.97(s，1H)，5.58(m，1H)，5.35(m，1H)，4.35(m，2H)，4.15(m，2H)，3.30(s，3H)，3.05(m，2H)，2.51(m，1H)，2.30(m，2H)和2.00(m，2H)。
实例9：氨基磺酸((1S，2S，4R)-4-(6-((1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基氨基)嘧啶-4-基氧基)-2-羟基环戊基)甲酯盐酸盐形式II(I-216HCl形式II)的制备
将I-216HCl形式I(0.5g，如以上实例5所述制备)在环境温度下于水(10mL)中浆液化，保持18小时。将所得固体过滤，用水(2.5mL)洗涤并在环境温度下减压下干燥16h。这样得到呈白色固体的I-216HCl形式II(0.45g)，收率为90％。1H NMR(300MHz，CD3OD，δ)：8.35(s，1H)，7.30(s，1H)，7.21(m，2H)，6.17(m，1H)，5.65(m，1H)，5.35(m，1H)，4.41(t，1H)，4.30(m，2H)，4.17(m，1H)，3.36(s，3H)，3.10(m，2H)，2.55(m，1H)，2.35(m，1H)和2.10(m，3H)。LCMS：Rf=9.29分钟，ES+＝485(FA)。形式II的XRPD数据示于图10。
实例10：活体内肿瘤药效动力学模型
将在100μL磷酸盐缓冲盐水中的HCT116肿瘤细胞(2×106)(ATCC编号CCL-247)使用26规格针无菌注射到雌性Ncr裸小鼠(5-8周龄，查理士河(Charles River))的右侧背部中的皮下空间中。在接种后第7天开始，使用游标卡尺每周两次测量肿瘤。使用标准程序(0.5×(长度×宽度2))计算肿瘤体积。当肿瘤达到大约3-700mm3的体积时，将小鼠随机分组并皮下注射不同剂量的化合物抑制剂(200μL)。收获肿瘤并在考沃瑞斯(Covaris)袋中粉碎，且然后转移至在干冰上的玻璃管，用于在考沃瑞斯E200中进行超声处理。补充有以下物质(终浓度)的哺乳动物蛋白质提取试剂(MPER)裂解缓冲液(皮尔斯(Pierce)，78501)：1x蛋白酶抑制剂混合物(卡尔生物化学(Calbiochem)，539134)、5mM在二甲基亚砜(DMSO)中的邻菲咯啉(西格玛(Sigma)，#P1294和西格玛DMSO#D2650)、10mM碘乙酰亚胺(iodoacetimide)(西格玛)、2mM原钒酸钠(西格玛，#S6508)、25mM氟化钠和25mMβ-磷酸甘油酯。在超声处理之前，将冷的裂解缓冲液(300-800μL)加入至肿瘤。超声处理步骤为：10秒，1％500mV50，20秒，20％500mV50，20秒10％500mV50。在超声处理之后，将样品置于湿冰上，倾倒于埃彭道夫(Eppendorf)管中并在4℃下于微量离心管中以14000rpm离心20分钟。将上清液转移至新试管中并使用皮尔斯二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂和蛋白质标准物测定蛋白质浓度。将肿瘤裂解物存储在-80℃下。
对于类泛素化的滞蛋白的定量分析，程序如下：将20μg具有十二烷基硫酸锂(LDS)上样缓冲液和样品还原剂(英杰(Invitrogen)NP0007和NP0004)的肿瘤裂解物上样至4-12％bis-tris凝胶，1.5mM，10孔凝胶(英杰NP0315Box)。在150V下将凝胶在2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)电泳缓冲液(英杰NP0002)中进行电泳。在合适的分子量标志物处切割凝胶并使用半干转移设备(安玛西亚生物科技(Amersham Biosciences)，TE70)将凝胶转移至PVDF-FL(密理博(Millipore)，IPFL00010)。在转移之后，将膜在奥德赛(Odyssey)封闭剂(LI-COR生物科技(LI-COR Biosciences)#927-40000)中进行封闭，然后在4℃下与初级抗体在奥德赛封闭剂+0.1％吐温-20(西格玛#P7949)中培育过夜。在具有吐温-20(TBST)的tris缓冲盐水中将膜洗涤三次，然后与阿莱福路(Alexa Fluor)680标记的山羊抗兔免疫球蛋白G重链和轻链(IgG(H+L))抗体(分子探针(Molecular Probes)，目录号A-21109)一起培育。在暗处与二级抗体培育1小时之后，避光下将膜用TBST洗涤5次并用tris缓冲盐水(TBS)洗涤一次。将膜干燥至少一小时，然后用奥德赛红外成像系统(LI-COR生物科技)扫描。使用以下初级抗体：抗-Nedd-8(MIL10克隆52-9-5，由宜佰康(Epitomics)研制，1：4000稀释液)。以1：2000使用二级抗体。西方(Western)印迹上的信号的定量用奥德赛软件进行。
本文所提及的专利和科学文献建立了所属领域技术人员可获得的知识。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本文引用的授权专利、申请案和参考文献据此以引用方式并入，引用程度就如每一者具体地且个别地指示通过以并入方式本文一样。在不一致的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
尽管已经描述了本发明的多个实施例，但是显而易见，所提供的基本实例可经改变以表达利用本发明的化合物、方法等的其它实施例。因此，应理解本发明的范围已经通过本文的实例呈现且并不打算受具体的实施例的限制。

Claims (22)

1.一种化学实体，其包含化合物氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯。
2.根据权利要求1所述的化学实体，其中所述化学实体为其盐酸盐或医药学上可接受的溶剂化物。
3.根据权利要求2所述的化学实体，其中所述化学实体为实质上结晶形式I。
4.根据权利要求2所述的化学实体，其中至少70重量％为结晶形式I。
5.根据权利要求2所述的化学实体，其中至少80重量％为结晶形式I。
6.根据权利要求2所述的化学实体，其中至少90重量％为结晶形式I。
7.根据权利要求2所述的化学实体，其中至少95重量％为结晶形式I。
8.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的化学实体，其中形式I的特征在于在4.5°、15.2°、21.3°、21.8°和24.0°的2θ角度处具有峰的x射线粉末衍射XRPD谱图。
9.根据权利要求8所述的化学实体，其中形式I的特征在于在4.5°、7.5°、14.4°、14.6°、15.2°、15.9°、19.5°、21.3°、21.8°、22.4°、22.7°、24.0°和24.8°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。
10.根据权利要求8所述的化学实体，其中形式I的特征在于在4.5°、7.5°、8.9°、9.8°、13.3°、14.4°、14.6°、15.2°、15.9°、17.2°、19.5°、20.0°、21.3°、21.8°、22.4°、22.7°、24.0°、24.8°、25.7°和26.4°的2θ角度处具有峰的XRPD谱图。
11.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的化学实体，其中形式I的特征在于具有2θ角度为4.5±0.3°的参考峰且相对于所述参考峰在10.7°、16.8°、17.3°和19.5°的2θ角度处具有峰的x射线粉末衍射XRPD谱图。
12.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的化学实体，其中形式I的特征在于具有2θ角度为4.5±0.3°的参考峰且相对于所述参考峰在3.0°、9.9°、10.1°、10.7°、11.4°、15.0°、16.8°、17.3°、17.9°、18.2°、19.5°和20.3°的2θ角度处具有峰的x射线粉末衍射XRPD谱图。
13.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的化学实体，其中形式I的特征在于具有2θ角度为4.5±0.3°的参考峰且相对于所述参考峰在3.0°、4.4°、5.3°、8.8°、9.9°、10.1°、10.7°、11.4°、12.7°、15.0°、15.5°、16.8°、17.3°、17.9°、18.2°、19.5°、20.3°、21.2°和21.9°的2θ角度处具有峰的x射线粉末衍射XRPD谱图。
14.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的化学实体，其中形式I的特征在于实质上如图4中所示的XRPD谱图。
15.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的化学实体，其中形式I的特征在于差示扫描量热DSC热谱图，其特征为在约135.7℃下具有峰的吸热，其中在约129.6℃下开始。
16.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的化学实体，其中形式I的特征在于实质上如图5中所示的DSC热谱图。
17.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的化学实体，其中形式I的特征在于热重分析TGA热谱图，其特征为从约100℃到约150℃有约3.7％的重量减轻。
18.根据权利要求3到7中任一权利要求所述的化学实体，其中形式I的特征在于实质上如图中6所示的TGA热谱图。
19.一种化学实体的前药，其中：
所述化学实体为化合物氨基磺酸{(1S，2S，4R)-4-[(6-{[(1R，2S)-5-氯-2-甲氧基-2，3-二氢-1H-茚-1-基]氨基}嘧啶-4-基)氧基]-2-羟基环戊基}甲酯或其医药学上可接受的盐；并且
所述前药为所述化学实体的-NH-基团的氨基甲酸酯或酰胺，或所述化学实体的-OH基团的醚或酯。
20.一种组合物，其包含根据权利要求1到18中任一权利要求所述的化学实体或根据权利要求19所述的前药以及医药学上可接受的载剂。
21.根据权利要求20所述的组合物，其适用于口服投与。
22.一种治疗癌症的方法，其包含向需要所述治疗的受试者投与根据权利要求1到18所述的化学实体中的任一者或根据权利要求19所述的前药。
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