KR20140036140A - Bm1 표현형과 관련된 유전자와 변이, 분자 마커, 및 그들의 용도 - Google Patents

Bm1 표현형과 관련된 유전자와 변이, 분자 마커, 및 그들의 용도 Download PDF

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Abstract

본원 개시는 특이적 자연발생 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자에 관한 것으로, 그 개변 유전자는 특정 옥수수 계통에서 bm1 옥수수 표현형에 기여한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CAD2 유전자, 및/또는 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커를 포함하는 핵산 분자를 사용하는 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

BM1 표현형과 관련된 유전자와 변이, 분자 마커, 및 그들의 용도{GENE AND VARIATIONS ASSOCIATED WITH BM1 PHENOTYPE, MOLECULAR MARKERS, AND THEIR USE}
본 출원은 "BM1 표현형과 관련된 유전자와 변이, 분자 마커, 및 그들의 용도(GENE AND VARIATIONS ASSOCIATED WITH BM1 PHENOTYPE, MOLECULAR MARKERS, AND THEIR USE)에 대하여 2011년 1월 3일에 출원된 미국 가출원 61/429,390를 우선권 주장한다.
본원 개시(開示)는 옥수수 갈색 주맥(主脈)(brown midrib, bm) 표현형에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본원 개시는 옥수수에서의 특정의 개변 CAD2 유전자(그 개변 유전자는 일부 옥수수 품종에서 bm1 표현형에 기여한다), 개변 CAD2 유전자를 포함하는 핵산 분자, 및/또는 그러한 핵산 분자의 번역으로부터 생성되는 단백질 산물에 관한 것이다.
리그닌은 세포벽중의 헤미셀룰로스와 같이, 탄수화물과 가교결합을 형성하는 식물에서의 보편적인 성분이다. 리그닌과 셀룰로스는 식물 세포벽의 두 우점 성분이다. 식물 세포벽은 세포외 환경에 맞서는 천연 방벽을 제공한다. 다수의 연구에 따르면 생물적 스트레스(예를 들어, 병원성 감염) 또는 비생물적 스트레스(예를 들어, 가뭄, 기계적 스트레스 등)에 대한 식물의 반응중 하나는 특히 식물 세포벽중의 리그닌 함량을 증가시킴에 의한 식물 세포벽의 강화로 이루어짐을 입증해 보였다. 다수의 농학적 또는 공업적 적용은 목적하는 식물 산물(예를 들어, 제지에 사용되는 산물, 사일리지(silage) 생산, 및 예를 들어 바이오연료의 형태로 에너지의 생산)에 관계하며, 이들 산물의 수율은 식물 세포벽중의 리그닌 함량 및/또는 조성과 직접적으로 관련이 있다.
리그닌 폴리머는 옥수수 식물에서의 섬유의 소화율을 제한한다. 리그닌 폴리머는 반추 동물에서의 섬유 소화를 저하시키며, 목질화의 정도는 사료 작물 소화율에 반비례할 수 있다. [Cherney et al. (1991) Adv. Agron. 46:157-98]. 리그닌 함량 및 조성의 조절은 마초의 소화율을 증가시키는 데 바람직할 수 있다. 리그닌 함량 조절은 또한 예를 들어, 식물벽을 강화하고 그에 따라 스트레스에 대한 내성을 향상시키거나; 또는 반대로 식물벽을 약화시켜 셀룰로스 또는 기타 화학적 화합물의 추출을 촉진하는 데에도 바람직할 수 있다. [Baucher et al. (1998) Plant Mol. Biol. 39:437-47].
그러나, 어떻게 리그닌 생합성 경로를 변경시킬 것인지 알기란, 그리고 변경의 결과가 어떻게 나타날 것인지 예측하기란 어렵다. 이러한 이유는 적어도 부분적으로는 리그닌 생합성 경로가 다수의 효소반응이 관여하는 복잡한 경로이기 때문이다. 예를 들어, 문헌[Dixon et al. (2001) Phytochemistry 57(7):1069-84] 참조. 경로를 생리학적으로 개변시켜 예를 들어, 그 경로에 변경에 의해 도입된 변화를 상쇄할 수 있는 가능한 메커니즘은 알려져 있지 않다.
리그닌은 페닐프로파노이드 경로로부터 유래하는, 알콜 또는 모노리그놀의 3종 모노머: p-쿠마릴 알콜(H 서브유닛), 코니페릴 알콜(G 서브유닛), 및 시나필 알콜(S 서브유닛)로 이루어진 불용성 폴리머이다. [Neish (1968) Constitution and Biosynthesis of Lignin, eds. New York, Springer Verlag 1-43]. 각 유형의 서브유닛은 다른 유형과 다양한 결합을 형성할 수 있고, 그에 따라 리그닌을 구성할 수 있다. 또한 다른 측막(parietal) 화합물(예를 들어, 폴리사카라이드 및 단백질)과의 다른 결합이 설정되어 복합 3차원 네트워크를 형성할 수도 있다.
복합 리그닌 생성 경로에서의 단계로는 방향족 환의 히드록실화, O-메틸화, 및 카르복실 측쇄의 알콜 기능으로의 전환을 포함한다. 모노리그놀 생합성 경로에 대한 현재의 가설은 대사 네트워크에서 측쇄 산화의 다양한 수준에서의 연속하는 히드록실화 및 O-메틸화 반응을 포함하며, 그에 따라 S 및 G 서브유닛의 형성이 초래된다. 네트워크의 효소에는 카페인산 3-O-메틸트랜스페라제(COMT); 히드록시진나메이트 조(助)효소 A 리가제(4CL); 시토크롬 P450-의존성 페룰레이트 5-히드록실라제(F5H); 및 신나모일 CoA 리덕타제(CCR)와 신나밀 알콜 데히드로게나제(CAD)의 몇몇 이소형이 포함된다.
수년 동안, 리그닌 생합성 경로의 1종 이상 유전자를 과발현 또는 과소발현시킴으로써 식물의 리그닌 함량 및 조성을 변경시키고자 시도되어 왔다. [Anterola and Lewis (2002) Phytochemistry 61:221-94]. 비록 다양한 전략이 꾀해졌지만, 리그닌 생합성 경로에서의 1종 이상 효소의 과발현 또는 과소발현이 항상 신뢰할만하고 예측가능한 결과를 제공하는 것은 아니다.
또 다른 전략은, 선택 계획(selection scheme)에서, 리그닌 생합성 경로에 표적화된 유전자의 돌연변이체를 사용하는 것으로 이루어진다. 갈색 주맥(bmr) 돌연변이를 함유하는 식물은 개변된 리그닌 조성 및 소화율을 보인다. 옥수수에서는 적어도 4종의 독립적인 갈색 주맥 돌연변이가 동정되었다. [Kuc et al. (1968) Phytochemistry 7:1435-6]. 이들 돌연변이는 "bm1, bm2, bm3, 및 bm4"로 명명되었는데, 모두가 대조군 옥수수와 비교시 감소된 리그닌 함량을 보인다. 갈색 주맥 옥수수 식물은 V4 내지 V6기에서 잎 주맥에 갈색 색소침착 및 태슬링(tasselling)후 수(髓)의 담갈색 착색을 특징으로 한다. 하나의 특징을 나타내는 bmr 돌연변이는 COMT 효소에서의 삽입 돌연변이(bm3)이다.
성숙 bm1 옥수수 식물은 10 내지 20%까지 감소되는 리그닌 함량, 페룰산 에스테르의 경미한 감소, 및 p-쿠마르산 에스테르와 페룰산 에스테르의 실질적으로 감소된 함량(약 40%)을 보인다. [Provan et al. (1997) J. Agric. Food 73:133-42]; 및 [Barriere et al. (2004) Comptes Rendus Biologie 327:847-60]. p-히드록시페닐, 구아이아실, 및 시린질 티오산분해(thioacidolysis) 모노머의 빈도는 bm1 및 야생형 식물에서 유사한데, 이는 bm1 돌연변이가 단일 유형의 리그닌 서브유닛에 확실하게 한정하여 영향을 미치지는 않음을 보여준다. [Guillaumie et al. (2007) Planta 226(1):235-50]. bm1 식물의 리그닌은 탄소-탄소 서브유닛간 결합에 실질적으로 농축되어 있는 것으로 보이며([Halpin et al. (1998) Plant J. 14(5):545-53]; 및 [Barriere et al. (2004), 상기 참조]), bm1 리그닌은 코니퍼알데히드의 상당한 혼입 및 보다 덜한 정도로 시냅알데히드의 상당한 혼입을 보인다. [Kim et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:47412-9].
옥수수의 농업적으로 중요한 용도는 사일리지를 포함한다. 사일리지는 반추 동물에 급식할 수 있는 발효 고-수분 마초이다. 사일리지는 엔사일리지(ensilage) 또는 사일리징(silaging)으로 불리는 과정으로 발효 및 저장되고, 보통은 옥수수나 수수 또는 다른 곡류를 비롯한 기타 사료용 농작물로부터, 전체 녹색 식물을 사용하여 만들어진다. 벌크 사일리지는 일반적으로 착유우에게 먹이는 반면, 꾸러미로 만든(baled) 사일리지는 비육우, 양, 및 말에 사용되는 경향이 있다. 사일리지는 발효 과정을 거치므로, 에너지는 발효성 박테리아에 의해 사용되어 아세테이트, 프로피오네이트, 락테이트, 및 부티레이트와 같은 휘발성 지방산을 생성하고, 이들은 마초를 보존한다. 결과적으로 사일리지는 최초의 마초보다는 에너지가 낮은데, 그 이유는 발효성 박테리아가 탄수화물의 일부를 사용하여 휘발성 지방산을 생성하기 때문이다. 옥수수 사일리지는 에너지와 소화율이 높고, 아직 베어내지 않은 농작물(stand-crop)로부터 급식시(time of feeding)까지로의 기계화에 용이하게 적응되기 때문에 반추 동물용으로 인기있는 마초이다. 옥수수 사일리지는 일반적으로 색상이 약간 갈색 내지는 암녹색을 띠며, 은은하고 기분 좋은 냄새를 풍긴다.
갈색 주맥 옥수수(bm 옥수수)에서의 감소된 리그닌은 보통 옥수수보다 더 소화가 잘 되고 향상된 바이오연료 전환율을 보이는 섬유를 갖는 사일리지를 초래한다. bmr 옥수수 사일리지를 비유기 착유우에게 먹이면 건물 섭취량(dry matter intake, DMI)과 산유량을 증가시키는 것으로 나타났다. [Grant et al. (1995) J. Dairy Sci. 78:1970-80]; [Oba and Allen (2000) J. Dairy Sci. 83:1333-41]; 및 [Oba and Allen (1999) J. Dairy Sci. 82:135-42]. 그러나, 통상적인 옥수수 품종으로부터의 옥수수 사일리지와 비교하여, bmr 옥수수 사일리지는 육용우에서 평균1일증가와 사료 효율(G:F)을 감소시켰다. [Tjardes et al. (2000) J. Anim. Sci. 78:2957-65]. 갈색 주맥 잡종 옥수수 계통은 또한 빈번하게 저-수확성인 것으로 나타났다. 갈색 주맥 잡종 옥수수는 또한 전형적으로 마초 도복(lodging) 및 기립성 결여와 연관이 있다.
옥수수에서 bm1 표현형에 기여하는 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 핵산 분자가 본원에 기재된다. 또한, 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자와 연관되어 있거나 또는 그 안에 주재하는 분자 마커가 기재된다. 놀랍게도, 리그닌 생합성의 복잡한 경로는 돌연변이체 CAD2 유전자의 존재하에서 명백히 개변되어, 돌연변이체 CAD2 유전자를 함유하는 식물은 야생형 식물에서 발견되는 것들보다 낮은 리그닌 수준을 갖게 된다. 돌연변이체 CAD2 유전자의 특징해석 및 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커의 동정은 식물 배형질에서의 감소된 리그닌 표현형의 발생과 배치를 대폭 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자와 연관되어 있거나 또는 그 안에 주재하는 마커, 또는 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자 서열 그 자체를 사용하여 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 타 생물, 예를 들어 식물, 효모, 및 원핵생물중으로 도입시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자는 단축 CAD2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, CAD2 유전자의 엑손(예를 들어, 엑손　3) 또는 인트론(예를 들어, 인트론 1)에 삽입 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 CAD2 유전자는 좀더 짧은 유전자 산물을 초래하는 미성숙 종결 코돈을 도입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자는 1종 이상의 옥수수 계통에서의 자연발생 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CAD2 유전자는 기지의 bmr 옥수수 품종; 예를 들어 515 Dbm1로부터 클로닝된다. 다른 실시양태에서, 돌연변이체 CAD2 유전자는 이전에 알려지지 않은 bmr 옥수수 품종; 예를 들어 DASbm1로부터 클로닝된다. 식물에서 발현되는 경우, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자는 그 식물에서 소정의 표현형; 예를 들어, 식물의 조직에서 CAD2 RNA의 감소된 수준, 및/또는 식물의 조직에서 감소된 리그닌 함량을 초래할 수 있다.
또한 본원 개시에 따른 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자와 연관되어 있거나 또는 그 안에 주재하는 핵산 분자 마커를 사용하여, 예를 들어 및 제한 없이: 감소된 리그닌 표현형을 갖는 식물을 동정하고; 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 새로운 식물 유전자형에 도입하고(예를 들어, 마커-조력 육종 또는 형질전환을 통해); 야생형 CAD2 유전자와 본원 개시에 따른 특정 돌연변이체 CAD2 유전자간을 구별하며; 본원 개시에 따른 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자와 연관되어 있거나 또는 그 안에 주재하는 핵산 분자 마커를 포함하는 제1 식물과 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 임의로 휴대하는 제2 식물의 교잡으로부터 식물 및 식물 종자를 생성하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자는 옥수수 이외의 식물종내로 조작되어 들어간다.
돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 포함하는 유전자조작 식물(예를 들어, 옥수수)을 생성하는 수단, 및 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 휴대하는 식물(예를 들어, 옥수수)을 동정하는 수단이 추가로 기재된다. 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 포함하는 유전자조작 식물을 생성하는 수단은 본원 개시에 따른 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자와 연관되어 있거나 또는 그 안에 주재하는 마커이다. 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 휴대하는 식물을 동정하는 수단은 본원 개시에 따른 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자와 연관되어 있거나 또는 그 안에 주재하는 마커와 특이적으로 하이브리드화하는 프로브이다.
예를 들어 옥수수 사일리지에 대한 증가:사료 비율(G:F)을 증가시킴으로써 사일리지-급식 동물의 육류량을 증가시키는 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, 사일리지-급식 동물의 육류량을 증가시키는 방법은 옥수수 사일리지의 생산, 및 반추 동물 급식용 마무리 일량사료(finishing ration)에 옥수수 사일리지의 혼입을 위한 식물 물질을 사용하는, 본원 개시에 따른 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 포함하는 옥수수로부터 수득된 식물 물질을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 본원 개시에 따른 또는 본원 개시의 방법에 따른 마무리 일량사료를 급식한 동물로부터 생산된 육류 및 육제품이 또한 제공된다.
전술한 특징 및 기타 특징은 첨부 도면을 참조로 진행되는 하기 몇몇 실시양태의 상세한 설명으로부터 좀더 명확해질 것이다.
도 1은 7개 중첩성 515 Dbm1 CAD2 PCR 단편의 상대적인 길이와 위치를 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 1은 또한 13개 중첩성 DASbm1 CAD2 PCR 단편의 상대적인 길이와 위치를 나타내는 다이어그램을 포함한다.
도 2는 DASbm1 CAD2중 삽입물의 게놈 구조를 나타내는 다이어그램을 포함한다. CAD2의 처음 두 내재성 엑손만이 나타나있다.
도 3은 공공 등록(public accession) AC230031으로부터의 B73 서열을 사용하는, ZmCAD2 게놈 서열의 정렬을 포함한다. DASbm1에서 트랜스포손 삽입뿐만 아니라, 15개 SNP와 8개 삽입/결실이 동정된다. AC 삽입은 515 Dbm1 돌연변이체중 엑손 3에서만 존재한다. 엑손은 대문자체로 나타내었다. 인트론 및 프로모터 영역은 소문자체로 나타내었다.
도 4는 DASbm1, 515 Dbm1, 및 야생형 6XN442(밑줄 표시)로부터 프라이머 쌍 CVF/CVR에 의해 증폭된 cDNA 서열을 비롯하여, 예측된 ZmCAD2 cDNA 서열의 정렬을 포함한다. DASbm1은 409-bp 삽입물을 함유한다.
도 5는 예측된 ZmCAD2 단백질 서열의 정렬을 포함하며, 515 Dbm1로부터의 CAD2은 프레임 시프트와 미성숙 종결 코돈을 생성하는 AC 삽입에 기인하여 불과 147개의 아미노산을 가짐을 예시한다. 6XB442로부터의 CAD2에서 367개 아미노산인 것과 비교하여, DASbm1로부터의 CAD2은 불과 48개의 아미노산을 가진다. 동일성의 영역은 볼드체로 나타내었다. B73 CAD2 아미노산 서열은 6XN422 CAD2의 서열과 동일하고, 따라서 도시하지 않았다.
도 6은 야생형, 515 Dbm1, 및 DASbm1 옥수수 주맥과 잎에서 CAD2 RNA의 상대적인 발현 수준을 나타내는 데이터를 포함한다. 데이터는 야생형 옥수수 6XN442의 주맥에서의 RNA 수준으로 정규화한다. 데이터는 3개 식물의 평균치를 나타내고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 7은 야생형, 515 Dbm1, 및 DASbm1 옥수수에서의 총 리그닌의 상대적인 양을 나타내는 데이터를 포함한다. 데이터는 3개 식물의 평균치를 나타내고, 잎과 절간(節間) 둘 모두로부터 식물당 5개 샘플이 수득되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타내고, P 값은 스튜던트 T 검정에 의해 생성되었다.
도 8은 프라이머 및 주형 서열을 가지고 행한 카스파(KASPar) 검정 시스템의 다이어그램을 포함한다. 515 Dbm1(서열 45) 및 6XN442(서열 46)에 대한 주형 서열을 나타낸다.
도 9는 카스파 검정 bm1 대립유전자 결정을 나타내는 데이터를 포함한다. 플레이트 판독기로부터의 미처리 형광강도 데이터를 케이바이오사이언스 래보러토리 인포메이션 매니지먼트 시스템(KBioscience Laboratory Information Management System, KLIMS)을 이용하여 분석하였다. VIC로부터의 RFU에 대하여 플로팅한 FAM의 RFU을 나타내는 그래프를 또한 KLIMS을 이용하여 작도하였다. 유전자형 결정은 클러스터 뷰(cluster view)로 나타낸 바와 같이 클러스터 분리에 기반하여 수행하였다.
도 10은 택맨(TaqMan) CAD2 대립유전자 결정을 보여주는 데이터를 포함한다. 대립유전자 식별은 y축에 나타낸 VIC의 상대적인 형광 단위(RFU) 및 x축에 나타낸 FAM의 RFU를 가지고 아이사이클러(iCycler) 광학 시스템 소프트웨어를 이용하여 계산하였다.
서열 목록
첨부 서열 목록에 수록된 핵산 서열을, 37 C.F.R. § 1.822에서 정의된 바와 같이, 뉴클레오티드 염기에 대한 표준 약호를 사용하여 나타낸다. 각 핵산 서열의 한 가닥만을 나타내지만, 상보쇄는 나타낸 가닥을 참조하여 포함되어 있는 것으로 이해하기로 한다. 첨부 서열 목록에서:
서열 1은 515 Dbm1 CAD2의 5924-bp 게놈 서열을 나타낸다.
서열 2는 515 Dbm1 CAD2의 1512-bp 예측된 cDNA 서열을 나타낸다.
서열 3은 515 Dbm1 CAD2의 147 아미노산 예측된 단축 단백질 서열을 나타낸다.
서열 4는 6XN442 CAD2의 5898-bp 게놈 서열을 나타낸다.
서열 5는 6XN442 CAD2의 1510-bp 예측된 cDNA 서열을 나타낸다.
서열 6은 6XN442 CAD2의 367 아미노산 예측된 단백질 서열을 나타낸다.
서열 7은 B73 CAD2의 5916-bp 게놈 서열을 나타낸다.
서열 8은 B73 CAD2의 1510-bp 예측된 cDNA 서열을 나타낸다.
서열 9 내지 22는 515 Dbm1 돌연변이체 및 야생형 6XN442 옥수수 둘 모두로부터 7종의 중첩성 CAD2 단편을 증폭하는 데 사용된 순방향 및 역방향 프라이머를 나타낸다.
서열 23은 DASbm1 CAD2의 9360-bp 게놈 서열을 나타낸다.
서열 24는 프라이머 쌍 CVF/CVR에 의해 증폭된 DASbm1 CAD2의 부분 cDNA 서열을 나타낸다.
서열 25는 DASbm1 CAD2의 48 아미노산 예측된 단축 단백질 서열을 나타낸다.
서열 26 내지 34는 DASbm1 돌연변이체로부터 부분 CAD2 단편을 증폭하는 데 사용된 순방향 및 역방향 프라이머를 나타낸다.
서열 35 및 36은 부분 CAD2 cDNA 단편을 증폭하는 데 사용된 순방향 및 역방향 프라이머를 나타낸다.
서열 37 내지 39는 DASbm1 돌연변이체로부터 부분 CAD2 단편을 증폭하는 데 사용된 순방향 및 역방향 프라이머를 나타낸다.
서열 40은 DASbm1 CAD2에서의 3444-bp 트랜스포손 삽입을 나타낸다.
서열 41은 CAD2의 제1 인트론으로부터의 DASbm1 트랜스포손 삽입중 중복된 11-bp 서열을 나타낸다: TACTGATATCT.
서열 42 내지 44는 515 Dbm1 대립유전자를 다른 bm1 및 야생형 CAD2 대립유전자와 구별하기 위하여 카스파TM 검정에 사용된 프라이머를 나타낸다.
서열 45 및 46은 카스파 검정에서 프라이머가 어닐링하는 주형 서열을 나타낸다. 서열 45는 515 Dbm1로부터의 게놈 서열이다. 서열 46은 6XN442로부터의 게놈 서열이다.
서열 47은 돌연변이체 DASbm1에 특이적인 프로브를 나타낸다.
서열 48은 야생형 CAD2 대립유전자에 특이적인 프로브를 나타낸다.
서열 49 내지 51은 DASbm1와 야생형 CAD2 대립유전자를 구별하기 위하여 카스파TM 검정에 사용된 프라이머를 나타낸다.
서열 52는 돌연변이체 515 Dbm1에 특이적인 프로브를 나타낸다.
서열 53은 야생형 CAD2 대립유전자에 특이적인 프로브를 나타낸다.
서열 54 및 55는 515 Dbm1와 야생형 CAD2 대립유전자를 구별하기 위하여 카스파TM 검정에 사용된 프라이머를 나타낸다.
서열 56 내지 61은 CAD2 및 대조군의 qRT-PCR에 사용된 프라이머와 프로브를 나타낸다.
서열 62는 CAD2의 제1 엑손의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 63은 CAD2의 제2 엑손의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 64는 CAD2의 제3 엑손의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
I. 몇몇 실시양태의 개관
bm1 돌연변이체는 CAD 좌위(座)와 공-배치되는(co-localize) 이전에는 기재된 바가 없는 돌연변이를 수반한다. [Halpin et al. (1998), 상기 참조]; 및 [Guillaumie et al. (2007), 상기 참조]. bm1 표현형에 기여하는 지아 메이스(Zea mays) CAD2 코딩 서열내 특이적 돌연변이의 동정이 본원에 기재된다. 일부 실시양태는 제3 엑손에 AC 삽입물을 함유하고 그에 따라 단축 CAD2 단백질을 초래하는 공공(public) bm1 옥수수 계통 515 Dbm1으로부터 클로닝된 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함한다. 일부 실시양태는 트랜스포손 삽입을 함유하고 그에 따라 전혀 별개의 단축 CAD2 단백질을 초래하는 새로 발견된 bmr 옥수수 계통 DASbm1으로부터 클로닝된 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함한다. DASbm1 식물은 야생형 식물보다 현저히 더 낮은 CAD2 RNA 발현 수준을 가지며, 또한 감소된 리그닌 함량을 보인다. 각각의 특이적 돌연변이와 연관된 고-처리량 마커의 개발, 검증, 및 적용이 또한 기재된다.
bm1 표현형의 분자 기반은 예를 들어 bm3만큼 잘 규명되어 있지는 않다. 문헌[Halpin et al. (1998), 상기 참조]은 CAD 활성, 단백질 수준, 및 전사산물량(transcript abundance)이 모두 bm1 유전자형에서 현저히 감소하였으며, CAD 유전자(나중에 CAD2인 것으로 확인)가 bm1 좌위에 밀접하게 연관되어 위치되었음을 보여주었다. 일부 CAD 단백질 및 mRNA가 돌연변이체 식물에서 검출될 수 있었기 때문에, 저자들은 bm1이 CAD2의 널(null) 돌연변이가 아니었으며, 대신 조절 요소를 통해 그의 발현에 영향을 주었다고 제안하였다. [Halpin et al. (1998), 상기 참조]. 마이크로어레이를 사용한 후속 유전자 발현 연구는 단지 CAD2 외에도 다수의 유전자가 bm1 식물에서 과소발현되었음을 보여주었다. [Guillaumie et al. (2007), 상기 참조]. 이 다수의 과소발현된 유전자는 다수의 리그닌 생합성 경로 유전자 및 전사인자를 포함하였고, 이는 아마도 전사인자중 하나가 bm1에 대한 원인 유전자(underlying gene)이었다는 추가의 추론으로 인도한다.
좀더 최근에 와서는, 수수 SbCAD2 유전자에서의 넌센스 돌연변이가 일부 품종에서 수수 bmr 돌연변이체 bmr6에 대한 발증 메커니즘인 것으로 나타났다. [Saballos et al. (2009) Genetics 181:783-95]; 및 [Sattler et al. (2009) Plant Physiology 150:584-95]. 그 넌센스 돌연변이는 C → T 치환을 함유하는데, 이러한 치환은 미성숙 종결 코돈을 생성하고, NADPH-결합 및 C-말단 촉매 도메인이 결여된 단축 SbCAD2 단백질을 초래한다. 동서(同書)
상기의 관점에서, bm1 표현형이 전사인자 또는 유전자 조절 요소에서의 돌연변이에 기인한다는 종래의 이론(accepted theory)이 도전을 받았으며, 옥수수 CAD2에서의 돌연변이가 bm1 표현형을 생성할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 조사가 수행되었다. bm1 및 CAD2 좌위의 영역에서 옥수수 유전자/물리적 지도의 면밀한 검사는 옥수수 CAD2이 5번 염색체상의 동원체에 매우 근접하여 위치하고 있음을 밝혀주었다. 이러한 근접성은 동원체 영역을 둘러싸는 기지의 재조합 억제에 기인하여 고분해능 유전자 지도작성에 대한 중요한 과제를 제기한다. 따라서, 완전히 가능성이 없는 것이 아니라면 전통적인 유전자 지도작성법의 성공은 최소한 예측할 수 없으며, 대상체 옥수수 품종에서 bm1 표현형의 원인이 될 수 있는 ZmCAD2에서의 임의의 특이적 돌연변이를 동정하기 위하여 PCR-기반 후보 유전자 클로닝법을 설계하였다.
따라서, 일부 실시양태에서, 특이적 CAD2 돌연변이체의 동정은 PCR-기반 유전자 클로닝법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 지아 메이스 CAD2를 bm1 및 야생형 배형질 둘 모두로부터 클로닝시켜 bm1 배형질로부터 CAD2에서의 특이적 돌연변이를 동정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 프레임 시프트를 유도하는 AC 디뉴클레오티드 삽입 돌연변이가 bm1 배형질내에서 동정된다. 추가 실시양태에서, CAD2의 제1 인트론에서의 3444 염기쌍 트랜스포손 삽입이 bm1 배형질내에서 동정된다. 본원 기재의 옥수수에서 bm1 표현형을 유도하는 특정 돌연변이체 CAD2 유전자는 bm1 품종 515 Dbm1로부터 클로닝된 CAD2 유전자의 제3 엑손에 AC 디뉴클레오티드 삽입을 포함한다.
본원 기재의 옥수수에서 bm1 표현형을 유도하는 추가 돌연변이체 CAD2 유전자는 신규 bm1 품종 DASbm1의 CAD2 유전자에 트랜스포손 삽입을 포함한다. 동정된 삽입은 3444 염기쌍 길이이고, CAD2와의 키메라 mRNA를 형성하는 3개 엑손(409 염기쌍)중으로 스플라이싱된다. 키메라 mRNA는 코딩 영역에 프레임 시프트와 미성숙 종결 코돈을 유발하고 그에 따라 단지 48개 아미노산으로 된 단축 CAD2 단백질이 초래된다. 당해 단축 단백질은 NADPH-결합 및 C-말단 촉매 도메인 둘 모두를 결여하며, 따라서 세포에서 생성된다 치더라도 십중팔구 비-기능성이다.
515 Dbm1처럼, DASbm1 식물은 현저히 감소된 수준의 CAD2 RNA, 및 감소된 총 리그닌 함량을 갖는다. CAD2은 이들 자연발생 돌연변이체에서 옥수수 bm1 표현형에 대한 원인 유전자인 것으로 결정되었으며, 관찰된 bmr 표현형에 대한 분자 기반을 제공한다. DASbm1에서의 트랜스포손 삽입 및 515 Dbm1에서의 AC 삽입에 기반하여, 이들 특정 CAD2 대립유전자를 검출하고 그들을 야생형 대립유전자와 구별하기 위한 고-처리량 카스파 및 택맨 검정이 결정되고 평가되었다. 검정은 bm1 배형질 동정, bm1 형질의 유전자이입 촉진, 및 예를 들어 사일리지 소화율 및/또는 바이오연료에 대한 에탄올 수율이 향상된 식물의 분자 육종 촉진에 사용될 수 있다. 트랜스제닉 연구방법을 이용하여, bm1 표현형을 새로운 옥수수 유전자형 또는 다른 농작물, 예를 들어 수수 및 스위치그래스에 도입시키는 데에 돌연변이된 CAD2 유전자 서열이 사용될 수 있다. 다스 이그잭트 프리시전 테크놀러지(DAS' EXZACT Precision Technology)와 병용될 때, bm1 및 다른 bmr 표현형도 또한 트랜스진에 대한 가시적인 선별 마커로서 사용될 수 있다.
고-처리량 PCR 마커는 그 중에서도, 옥수수에서 bm1 표현형에 기여하는 CAD2 돌연변이를 생물에서 동정하고; 옥수수에서 bm1 표현형에 기여하는 CAD2 돌연변이를 생물(예를 들어, 식물)중으로 도입하고; bm1 옥수수의 마커-조력 육종을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 따라서, CAD2에서의 특이적 돌연변이(예를 들어, 프레임 시프트 돌연변이, 및 트랜스포손 삽입)에 기반한 특정 고-처리량 PCR 마커의 개발, 검증 및 적용이 또한 기재된다.
II . 약어
4CL 히드록시신나메이트 조효소 A 리가제
ABC-트랜스포터 ATP-결합 카세트 트랜스포터
AGO 아고너트(Argonaute)
APL 개변된 체관부 발달
bmr 갈색 주맥
bZIP 염기성 영역/루이신 지퍼 모티프
CAD 신나밀 알콜 데히드로게나제
CAD1 신나밀 알콜 데히드로게나제 1
CAD2 신나밀 알콜 데히드로게나제 2
CCR 신나모일-CoA 리덕타제
COMT 카페인산 3-O-메틸트랜스페라제
COV1 연속 혈관륜
DFR 디히드로-플라보노이드 리덕타제
EgCAD1-타입 ZmCAD1 EgCAD1-타입 옥수수 신나밀 알콜 데히드로게나제 1
EST 발현된 서열 태그
F5H 시토크롬 P450-의존성 페룰레이트 5-히드록실라제
FAM 플루오로포어 6-카르복시플루오레신
HCT 히드록시신나모일-CoA 트랜스페라제 2
KLIMS 케이바이오사이언스 래보러토리 인포메이션 매니지먼트 시스템
LIM LIM 호메오도메인
MADS-박스 보존된 MADS 서열 모티프(MCM1,AGAMOUS, DEFICIENS, SRF)
MP 모노프테러스(MONOPTEROUS)
OMT O-메틸 트랜스페라제
ORF 개방 판독 프레임
PAL 페닐알라닌 암모니아 리아제
PCR 폴리머라제 연쇄 반응
RFU 상대적인 형광 단위
SAD 시나필 알콜 데히드로게나제
SAMS3 S-아데노실-메티오닌 신타제 3
VIC® VIC® 플루오로포어(어플라이드 바이오시스템즈, Applied Biosystems)
III . 용어
여교잡(backcrossing): 여교잡법을 이용하여 핵산 서열을 식물중으로 도입시킬 수 있다. 여교잡 기술은 새로운 형질을 식물중으로 도입시키는 데 수십 년간 널리 사용되어 왔다. [Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988]. 전형적인 여교잡 프로토콜에서, 관심의 대상이 되는 원품종(반복양친, recurrent parent)을 전달시키고자 하는 관심의 대상이 되는 유전자를 휴대하는 제2 품종(비-반복양친)과 교잡시킨다. 당해 교잡으로부터의 생성되는 자손을 이어서 반복양친과 다시 교잡하고, 비-반복양친으로부터의 전달된 유전자 외에도, 본질적으로 반복 식물(recurrent plant)의 목적하는 형태학적 및 생리학적 특징의 전부가 전환 식물(converted plant)에서 회복되는 식물이 수득될 때까지 그 과정을 반복한다.
옥수수 식물: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "옥수수 식물"이란 지아 메이스(옥수수) 종의 식물을 언급한다.
BM 옥수수: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "BM 옥수수" (또는 "BMR 옥수수")란 갈색 주맥 돌연변이를 함유하는 옥수수 품종을 언급한다. BM 옥수수 품종은 전형적으로 잎 주맥의 적갈색 색소침착을 보인다. BM 옥수수는 또한 전형적으로 좀더 낮은 리그닌 함량, 좀더 높은 섬유 소화율, 및 좀더 높은 건물 섭취량을 특징으로 한다. BM 옥수수 품종의 비-제한적인 예는 bm1 옥수수 품종; 예를 들어 515Dbm1을 포함한다.
bm1 표현형: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "bm1 표현형"이란 bm1 옥수수에서 관찰되는 개변된 리그닌 함량 및/또는 조성의 프로파일을 언급할 수 있다. 예를 들어 및 제한 없이, bm1 표현형은 하기 특징중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다: 동일 종의 야생형 식물의 리그닌 함량과 비교시 10 내지 20%까지 감소되는 리그닌 함량(Guillaumie et 　 al. (2007), 상기 참조); 페룰산 에스테르의 감소(동서); 페룰산 에테르의 감소된 함량(동서); p-쿠마르산 에스테르의 감소된 함량(Marita et al. (2003) J. Agric. Food Chem. 51:1313-21); 증가된 알데히드 수준(동서); 탄소-탄소 단위간 서브유닛 결합에 리그닌의 농축(Halpin et al. (1998), 상기 참조; 및 Barriere et al. (2004), 상기 참조); 및 리그닌중으로 코니퍼알데히드 및/또는 시냅알데히드의 상당한 혼입(Kim et al. (2002), 상기 참조; 및 Barriere et al. (2004), 상기 참조).
건물(dry matter): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "건물"이란 마초를 포함한 임의의 가축 사료를 언급한다.
케이바이오사이언시즈 컴페터티브 얼릴-스페시픽 PCR SNP 유전자형결정 시스템(KBiosciences Competitive Allele-Specific PCR SNP genotyping system, KASParTM): 카스파TM은 SNP 유전자형을 결정하기 위한 시판하고 있는 균질 형광 시스템이다(케이바이오사이언시즈 리미티드(KBiosciences Ltd.), 영국 호디스던). 카스파TM 검정은 3종의 비-표지 프라이머를 함유하는 SNP-특이적 "검정 믹스", 및 모든 기타 필요 성분; 예를 들어, 범용 형광 리포팅 시스템을 함유하는 "반응 믹스"를 포함한다. 이들 믹스 외에도, 사용자는 그중에서도 FRET-대응(capable) 플레이트 판독기, 미세역가 플레이트(들), 및 약 5 ng/L DNA를 함유하는 DNA 샘플을 제공한다.
전형적인 카스파TM 검정은 대립유전자-특이적 프라이머 설계(예를 들어, 케이바이오사이언시즈 웹사이트에서 인터넷을 통해 이용가능한 무료 서비스인 프라이머피커(PrimerPicker)TM 이용); 대립유전자-특이적 프라이머를 포함하는 반응 믹스의 제조; 미세역가 플레이트에서 DNA 샘플에 반응 믹스의 혼합; 열 사이클링(thermocycling); 형광 플레이트 판독기에서 플레이트의 판독; 및 형광 데이터의 플로팅 및 채점 단계를 포함한다. 각 샘플로부터의 데이터를 2-D 그래프상에 함께 플로팅하며, 여기에서 x축 및 y축은 FAM 및 VIC 형광 값에 대응한다. 동일한 SNP 유전자형을 갖는 샘플을 플롯상에 함께 클러스터링 한다(즉, A/A; A/a; 및 a/a). 일반 문제점에 대한 해결책의 안내를 포함하여 카스파 시스템에 관한 더 많은 기술 정보는 케이바이오사이언시즈 리미티드(예를 들어, 카스파 SNP 유전자형결정 시스 템 시약 매뉴얼)로부터 입수가능하다.
연관된, 긴밀하게 연관된, 및 극도로 긴밀하게 연관된: 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 또는 마커간의 연관이란 염색체상의 유전자 또는 마커가 후대의 개체에 함께 전승되는 측정가능한 확률을 나타내는 현상을 언급할 수 있다. 두 유전자 또는 마커가 상호 더 근접할수록, 이 확률은 (1)에 가까워진다. 따라서, 용어 "연관된"이란 어떤 유전자와 함께 (마커/유전자가 상이한 염색체상에 위치하는 독립적인 구색(independent assortment)으로부터 기대되는) 0.5보다 큰 확률로 전승되는 1종 이상의 유전자 또는 마커를 언급할 수 있다. 유전자의 존재가 개체에서의 표현형에 기여할 때, 그 유전자와 연관되어 있는 마커는 그 표현형과 연관되어 있다고 말할 수 있다. 따라서, 용어 "연관된"이란 마커와 유전자간, 또는 마커와 표현형간의 관계를 언급할 수 있다.
염색체상 두 유전자 또는 마커의 근접성은 그 유전자 또는 마커가 후대의 개체에 함께 전승될 확률과 직접 관계되기 때문에, 용어 "연관된"이란 또한 본원에서는 동일 옥수수 염색체상에서 상호간에 약 2.0 Mb 이내에 위치하는 1종 이상의 유전자 또는 마커를 언급할 수도 있다. 따라서, 두 "연관된" 유전자 또는 마커는 약 2.1 Mb; 2.00 Mb; 약 1.95 Mb; 약 1.90 Mb; 약 1.85 Mb; 약 1.80 Mb; 약 1.75 Mb; 약 1.70 Mb; 약 1.65 Mb; 약 1.60 Mb; 약 1.55 Mb; 약 1.50 Mb; 약 1.45 Mb; 약 1.40 Mb; 약 1.35 Mb; 약 1.30 Mb; 약 1.25　Mb; 약 1.20 Mb; 약 1.15 Mb; 약 1.10 Mb; 약 1.05 Mb; 약 1.00　Mb; 약 0.95 Mb; 약 0.90 Mb; 약 0.85 Mb; 약 0.80 Mb; 약 0.75　Mb; 약 0.70 Mb; 약 0.65 Mb; 약 0.60 Mb; 약 0.55 Mb; 약 0.50　Mb; 약 0.45 Mb; 약 0.40 Mb; 약 0.35 Mb; 약 0.30 Mb; 약 0.25　Mb; 약 0.20 Mb; 약 0.15 Mb; 약 0.10 Mb; 약 0.05 Mb; 약 0.025　Mb; 및 약 0.01 Mb로 분리될 수 있다. 옥수수에서의 bm1 표현형과 "연관"될 수 있는 마커의 특정 예는 옥수수 게놈의 5L 염색체상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "긴밀하게 연관된"이란 동일 옥수수 염색체상에서 상호간에 약 0.5 Mb 내에 위치하는 1종 이상의 유전자 또는 마커를 언급할 수 있다. 따라서, 두 "긴밀하게 연관된" 유전자 또는 마커는 약 0.6 Mb; 약 0.55 Mb; 0.5 Mb; 약 0.45 Mb; 약 0.4 Mb; 약 0.35 Mb; 약 0.3 Mb; 약 0.25 Mb; 약 0.2 Mb; 약 0.15 Mb; 약 0.1 Mb; 및 약 0.05　Mb로 분리될 수 있다. 옥수수에서의 bm1 표현형과 "긴밀하게 연관"될 수 있는 마커의 특정 예는 옥수수 게놈의 CAD2 좌위 부근 또는 그 안의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "극도로 긴밀하게 연관된"이란 동일 옥수수 염색체상에서 상호간에 약 약 100 kb 내에 위치하는 1종 이상의 유전자 또는 마커를 언급할 수 있다. 따라서, 두 "극도로 긴밀하게 연관된" 유전자 또는 마커는 약 125 kb; 약 120 kb; 약 115 kb; 약 110 kb; 약 105 kb; 100 kb; 약 95 kb; 약 90 kb; 약 85 kb; 약 80 kb; 약 75 kb; 약 70 kb; 약 65 kb; 약 60 kb; 약 55 kb; 약 50 kb; 약 45 kb; 약 40 kb; 약 35　kb; 약 30 kb; 약 25 kb; 약 20 kb; 약 15 kb; 약 10 kb; 약 5 kb; 및 약 1 kb로 분리될 수 있다. 옥수수에서의 bm1 표현형과 "극도로 긴밀하게 연관"되는 마커의 특정 예는 CAD2 유전자의 인트론 및 엑손내 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
전술한 관점에서, 특정 유전자 또는 표현형과 연관된 마커는 그 유전자 또는 표현형과 긴밀하게 연관된 그들 마커, 및 그 유전자 또는 표현형과 극도로 긴밀하게 연관된 그들 마커를 포함함이 인식될 것이다. bm1 표현형의 연관된, 긴밀하게 연관된, 및 극도로 긴밀하게 연관된 유전자 마커는 감소된 리그닌 함량 및 향상된 소화율을 지닌 옥수수 품종을 동종하고, 이들 형질을 다른 옥수수 품종에 육종하기 위한 마커-조력 육종 프로그램에 유용할 수 있다.
좌위: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "좌위"는 측정가능한 특징(예를 들어, 형질)에 대응하는 게놈상의 위치를 언급한다. SNP 좌위는 그 좌위 내에 함유된 DNA와 하이브리드화하는 프로브에 의해 규정된다.
마커: 본원에서 사용되는 바와 같이, 마커는 특정 대립유전자를 갖는 식물을 동정하는 데에 사용될 수 있는 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 언급한다. 마커는 주어진 게놈 좌위에서의 변이로서 기재될 수 있다. 유전자 마커는 짧은 DNA 서열, 예컨대 단일 염기쌍 변화(단일 뉴클레오티드 다형, 즉 "SNP")를 둘러싸는 서열, 또는 긴 서열, 예를 들어 미니새털라이트/단순 서열 반복체("SSR")일 수 있다. "마커 대립유전자"는 특정 개체에 존재하는 마커의 별형을 언급한다.
본원에서 사용되는 바의 용어 마커는 옥수수 염색체 DNA의 클로닝된 세그멘트(예를 들어, 옥수수 게놈의 CAD2 좌위 부근 또는 그 내부의 뉴클레오티드 서열)를 언급할 수 있으며, 또한 또는 택일적으로 옥수수 염색체 DNA의 클로닝된 세그멘트에 상보적인 DNA 분자(예를 들어, 옥수수 게놈의 CAD2 좌위 부근 또는 그 내부의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 DNA)를 언급할 수 있다. 옥수수에서의 bm1 마커의 특정 예는 제한 없이, CAD2 유전자의 뉴클레오티드 66을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 284을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 415을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 443을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 735을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 760을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 1345을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 1408을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 1585을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 1627-1640 및/또는 1642-1648중 어느 것을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 2252을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 2269을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 2786을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 2966을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 3205을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 3719을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 3783을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 3798을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 3800을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 3994을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 4141을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 4338을 포함하는 핵산 서열; CAD2 유전자의 뉴클레오티드 4583을 포함하는 핵산 서열; 및 CAD2 유전자의 뉴클레오티드 5403을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. 전술한 마커는 야생형 옥수수 품종 B73에서 뉴클레오티드 위치에 의해 동정된다.
일부 실시양태에서, 식물에서의 마커의 존재는 핵산 프로브의 사용을 통해 검출될 수 있다. 프로브는 DNA 분자, 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 프로브는 당업계 공지의 수단에 의해, 예를 들어 DNA 분자 주형을 사용하여 합성될 수 있다. 프로브는 마커의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부와 식물 게놈으로부터의 부가적인 연속한 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이는 본원에서 "연속한 프로브(contiguous probe)"로서 언급된다. 통상적으로 이해되는 바와 같이, 식물 염색체로부터의 연속한 뉴클레오티드 서열이 최초 마커의 5'측에 있느냐 또는 3'측에 있느냐에 따라, 부가적인 연속한 뉴클레오티드 서열은 최초 마커의 "상류" 또는 "하류"로서 언급된다. 당업자에 의해 인지되고 있듯이, 마커에 포함시키기 위한 부가적인 연속한 뉴클레오티드 서열을 수득하는 과정은 거의 무한정 반복될 수 있으며(염색체의 길이에 의해서만 제한됨), 그에 따라 염색체에 따라서 부가적인 마커가 동정된다. 모든 전술한 마커는 본 발명의 일부 실시양태에 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프로브 서열은 합성적으로 또는 클로닝에 의해 제조될 수 있다. 적합한 클로닝 벡터는 당업자에게 주지이다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 표지되거나 또는 비-표지될 수 있다. 예를 들어 및 제한 없이 다음의 것들을 포함하여, 핵산 분자를 표지하기 위한 다종다양한 기술이 존재한다: 닉 번역(nick translation)에 의한 방사성표지; 랜덤 프라이밍; 말단 데옥시트랜스페라제로의 테일링(tailing) 등(여기에서, 사용되는 뉴클레오티드는 예를 들어 방사성 32P로 표지된다). 사용될 수 있는 다른 표지물로는 예를 들어 및 제한 없이 다음의 것들을 포함한다: 플루오로포어(예를 들어, FAM 및 VIC); 효소; 효소 기질; 효소 보조인자; 효소 억제제 등. 이와 달리, 단독으로 또는 다른 반응제와 공동으로 검출가능한 신호를 제공하는 표지물의 사용을 수용체가 결합하는 리간드로 대신할 수 있으며, 여기에서 수용체는 (예를 들어, 전술한 표지물에 의해) 표지되어 그들 단독으로 또는 다른 시약과 공동으로 검출가능한 신호를 제공한다. 예를 들어 문헌[Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9] 참조.
프로브는 최초 마커의 뉴클레오티드 서열에 연속하지 않는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다; 당해 프로브는 본원에서 "비-연속한 프로브"로 언급된다. 비-연속한 프로브가 동일 유전자 또는 형질(예를 들어, bm1/감소된 리그닌 함량)과 유전적으로 연관되도록 비-연속한 프로브의 서열은 게놈상 최초 마커의 서열에 충분히 근접하여 위치된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 비-연속한 프로브는 옥수수 게놈상 최초 마커의 500 kb; 450 kb; 400 kb; 350 kb; 300 kb; 250 kb; 200 kb; 150 kb; 125 kb; 100 kb; 0.9 kb; 0.8 kb; 0.7 kb; 0.6 kb; 0.5 kb; 0.4 kb; 0.3 kb; 0.2 kb; 또는 0.1 kb 내에 위치한다.
프로브는 검출하고자 하는 마커의 정확한 복사물일 수 있다. 프로브는 또한 대상체 생물(예를 들어, 옥수수) 염색체 DNA의 클로닝된 세그멘트와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 그로 이루어지는 핵산 분자일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한"이란 85%보다 많게 동일한 뉴클레오티드 서열을 언급할 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열은 참조 서열과 85.5%; 86%; 87%; 88%; 89%; 90%; 91%; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% 또는 99.5% 동일할 수 있다.
프로브는 또한 검출하고자 하는 마커의 정확한 복사물("DNA 표적")과 "특이적으로 하이브리드화가능한" 또는 "특이적으로 상보적인" 핵산 분자일 수 있다. "특이적으로 하이브리드화가능한" 및 "특이적으로 상보적인"은 핵산 분자와 DNA 표적간에 안정하고 특이적인 결합이 일어나도록 하는 충분한 정도의 상보성을 표현하는 용어이다. 핵산 분자는 특이적으로 하이브리드화가능하기 위해 그의 표적 서열과 100% 상보적일 필요는 없다. 특이적 결합을 소망하는 조건하에서, 예를 들어 엄중한 하이브리드화 조건하에서 비-표적 서열에의 핵산의 비-특이적 결합을 피하기 위한 충분한 정도의 상보성이 존재할 때 핵산 분자는 특이적으로 하이브리드화가능하다.
특별한 정도의 엄중성을 도출하는 하이브리드화 조건은 특선한 하이브리드화 방법의 특성 및 하이브리드화하는 핵산 서열의 조성과 길이에 따라 변동할 것이다. 비록 세척 횟수 또한 엄중성에 영향을 주기는 하지만, 일반적으로 하이브리드화의 온도와 하이브리드화 완충제의 이온 강도(특히 Na+ 및/또는 Mg++ 농도)가 하이브리드화의 엄중성을 결정하게 된다. 특별한 정도의 엄중성을 성취하는 데 요구되는 하이브리드화 조건에 관한 산정은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11]; 및 문헌[Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985]에 논의되어 있다. 핵산의 하이브리드화에 관하여 좀더 상세한 지시사항과 안내는 예를 들어 문헌[Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993]; 및 문헌[Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995]에서 찾아볼 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "엄중한 조건"은 하이브리드화 분자와 DNA 표적간의 미스매치가 50% 미만인 경우에만 하이브리드화가 일어나게 될 조건을 포함한다. "엄중한 조건"은 좀더 특별한 수준의 엄중성을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "보통의 엄중성" 조건은 서열 미스매치가 50%를 넘는 분자는 하이브리드화하지 않는 조건이고; "높은 엄중성"의 조건은 미스매치가 20%를 넘는 서열이 하이브리드화하지 않는 조건이며; "매우 높은 엄중성"의 조건은 미스매치가 10%를 넘는 서열이 하이브리드화하지 않는 조건이다.
특정 실시양태에서, 엄중한 조건은 제조업자의 지시에 따라 희석한 택맨® 유전자형결정 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터시티, 카탈로그 번호 4371355)중 60℃에서의 하이브리드화를 포함할 수 있다.
다음은 대표적인 비-제한 하이브리드화 조건이다.
매우 높은 엄중성(적어도 90% 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출한다): 5x SSC 완충제중 65℃에서 16시간 동안 하이브리드화; 각각 2x SSC 완충제중 실온에서 15분 동안 2회 세척; 및 각각 0.5x SSC 완충제중 65℃에서 20분 동안 2회 세척.
높은 엄중성(적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출한다): 5x-6x SSC 완충제중 65-70℃에서 16-20시간 동안 하이브리드화; 각각 2x SSC 완충제중 실온에서 5-20분 동안 2회 세척; 및 각각 1x SSC 완충제중 55-70℃에서 30분 동안 2회 세척.
보통의 엄중성(적어도 50% 서열 동일성을 공유하는 서열을 검출한다): 6x SSC 완충제중 실온 내지 55℃에서 16-20시간 동안 하이브리드화; 각각 2x-3x SSC 완충제중 실온 내지 55℃에서 20-30분 동안 적어도 2회 세척.
상기 논의된 모든 프로브에 관하여, 프로브는 부가적인 핵산 서열, 예를 들어 프로모터; 전사 신호; 및/또는 벡터 서열을 포함할 수 있다. 상기 논의된 프로브중 어떤 것은 bm 표현형에 관여하는 유전자(예를 들어, bm1)와 긴밀하게 연관되어 있는 마커를 부가적으로 규정하는 데 사용될 수 있으며, 그렇게 하여 동정된 마커는 본원 개시에서 호명되는 예시적인 마커와 동등할 수 있으며, 따라서 본 발명의 범위내에 들어온다.
마커-조력 육종(marker-assisted breeding): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "마커-조력 육종"은 직접적으로 1종 이상의 복합 형질(예를 들어, bm1/감소된 리그닌 함량)에 대한 육종에의 연구법을 언급할 수 있다. 현행 실무에서, 식물 육종가는 용이하게 검출가능한 형질, 예컨대 화색, 종피 외관, 또는 농학적으로 목적하는 형질과 연관되어 있는 아이소자임 변이체를 동정하고자 시도한다. 그러므로 식물 육종가들은 용이하게 검출가능한 형질의 분리를 추적함으로써 분리하는 육종 집단에서의 농업 형질을 추적한다. 그러나, 식물 육종에서의 사용에 이용가능한 이러한 연관 관계는 극소수이다.
마커-조력 육종은 식물 품종의 개량을 위한 시간- 및 비용 효과적인 과정을 제공한다. 마커-조력 육종 적용의 몇몇 예는 아이소자임 마커의 사용을 수반한다. 예를 들어 문헌[Tanksley and Orton, eds. (1983) Isozymes in Plant Breeding and Genetics, Amsterdam: Elsevier] 참조. 일례는 토마토에서 선충류 해충 내성에 대한 유전자와 관련된 아이소자임 마커이다. 그러한 내성은, Mi로 명명된 유전자에 의해 조절되는데, 토마토의 6번 염색체상에 위치하고 산 포스파타제 아이소자임인 Aps1와 매우 긴밀하게 연관되어 있다. Mi 유전자를 간접적으로 선발하기 위한 Aps1 아이소자임 마커의 사용은 집단에서의 분리가 표준 전기영동 기술로 명확하게 측정될 수 있으며; 아이소자임 마커가 묘목 조직에서 채점평가될 수 있으며, 따라서 식물을 성숙 상태로 유지할 필요성이 제거되며; 아이소자임 마커 대립유전자의 공우성(共優性)은 동형접합체와 이형접합체간의 식별을 가능하게 해준다는 장점을 제공하였다. 문헌[Rick (1983) in Tanksley and Orton, 상기 참조] 참조.
육류: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "육류"란 예를 들어 음식으로서 사용되는 동물 조직을 말한다. 용어 "육류"란 전형적으로 골격근 및 관련 지방을 언급하지만, 또한 폐, 간, 피부, 뇌, 골수, 신장, 고환, 장 등을 포함한 비-근육 기관을 언급할 수도 있다.
중성세제 섬유(neutral detergent fibre): 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "중성세제 섬유"(NDF)란 광범위의 사료를 가로질러 서서히 소화되는 물질의 척도를 언급한다. 식물이 성숙함에 따라 마초에서의 NDF 수준은 증가한다. 목초 사일리지중 NDF의 평균 수준은 대략 55% DM(550 g/kg DM)일 수 있다. 총 일량사료중 NDF의 함량은 35 내지 50% DM일 수 있다. NDF가 32% 미만인 식이는 산혈증과 관련된 문제점을 초래할 수 있다. NDF가 50%를 넘는 식이는 그들의 섭취량 퍼텐셜에 있어서 제한이 따를 수 있다.
핵산 분자: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산 분자"란 뉴클레오티드의 폴리머 형태를 언급할 수 있으며, 여기에는 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 및 이들의 합성 형태와 혼합 폴리머의 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드의 어느 한쪽 유형의 변형된 형태를 언급할 수 있다. 본원에서 사용되는 바의 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 특별히 달리 규정하지 않는 한 핵산 분자는 보통 적어도 10 염기 길이이다. 그 용어는 DNA의 단일- 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 핵산 분자는 자연발생 및/또는 비-자연발생 뉴클레오티드 결합에 의해 함께 연결된 자연발생 및 변형 뉴클레오티드중 어느 한쪽 또는 양쪽 모두를 포함할 수 있다.
당업자에 의해 쉽사리 이해되는 것처럼, 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형시킬 수 있거나, 또는 비-천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 그러한 변형은 예를 들어, 표지물, 메틸화, 자연발생 뉴클레오티드의 1개 이상을 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형(예를 들어, 비-하전 결합: 예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등; 하전 결합: 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 펜던트 모이어티: 예를 들어 펩티드; 삽입제: 예를 들어 아크리딘, 프소랄렌(psoralen) 등; 킬레이트화제; 알킬화제; 및 변형 결합: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 단일-가닥, 이중-가닥, 부분 이중나선, 삼중나선, 헤어핀, 환형, 및 패드록(padlocked) 구조를 비롯하여 임의의 위상 기하학적 구조를 포함한다.
서열 동일성: 두 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 관련하여 본원에서 사용되는 바의 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 특정된 비교 윈도우 위에서 최대 일치가 되게 정렬될 때 동일한 두 서열에서의 잔기를 언급할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 동일성의 %"는 비교 윈도우 위에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열(예를 들어, 핵산 서열, 및 아미노산 서열)을 비교함으로써 결정된 값을 언급할 수 있으며, 여기에서 두 서열의 최적 정렬을 위한 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여, 비교 윈도우에서의 서열의 일부는 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. %는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열 모두에서 발생하여 매치된 위치의 개수를 산출하는 위치의 개수를 측정하고, 매치된 위치의 개수를 비교 윈도우에서의 위치의 총수로 나눈 다음, 나온 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 %를 산출함으로써 계산된다.
비교를 위한 서열을 정렬하는 방법은 당업계에 주지이다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 예를 들어 하기 문헌에 기재되어 있다: [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]; [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]; [Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444]; [Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44]; [Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3]; [Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90]; [Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65]; [Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31]; [Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50]. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 자세한 고찰은 예를 들어 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]에서 찾아볼 수 있다.
내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(NCBI) 베이식 로컬 얼라인먼트 서치 툴(Basic Local Alignment search Tool, 블라스트(BLAST)TM; Altschul et al. (1990))은 몇몇 서열 분석 프로그램에 관하여 사용하기 위하여, 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(미국 메릴랜드주 베테스다)을 비롯한 몇몇 소스로부터, 및 인터넷상에서 이용가능하다. 당해 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 측정하는 방법의 설명은 인터넷상에서 블라스트TM에 대한 "도움받기(help)" 섹션에서 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라미터에 세팅한 디폴트 블로섬62(BLOSUM62) 매트릭스를 사용하여 블라스트TM(블라스튼, Blastn) 프로그램의 "블라스트 2 서열" 기능이 활용될 수 있다. 참조 서열과의 유사성이 한층 더 큰 핵산 서열은 당해 방법에 의해 평가될 때 증가하는 %동일성을 나타낼 것이다.
단일 뉴클레오티드 다형: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단일 뉴클레오티드 다형"(SNP)이란 종의 구성원간에 또는 어떤 개체에서 쌍을 이룬(paired) 염색체간에 게놈 (또는 다른 공유 서열)중의 단일 뉴클레오티드가 상이할 때 발생하는 DNA 서열 변이를 언급할 수 있다. 집단 내에서, SNP는 특정 집단에서 관찰되는 좌위에서 최저 대립유전자 빈도인 마이너 대립유전자 빈도가 할당될 수 있다. 이것은 명료하게 단일 뉴클레오티드 다형에 대한 두 대립유전자 빈도의 보다 적은 것이다. 상이한 집단은 적어도 약간 상이한 대립유전자 빈도를 보일 것으로 기대된다. 특정 집단은 현저히 상이한 대립유전자 빈도를 보일 수 있다. 일부 예에서, bm1 표현형과 연관된 마커는 SNP 마커이다.
SNP는 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 영역, 또는 유전자들 사이의 유전자간(intergenic) 영역에 들어올 수 있다. 코딩 서열내의 SNP는, 반드시 그런다는 것은 아니지만, 단백질의 아미노산 서열을 변화시킬 수 있는데, 이러한 변화는 유전 코드의 축퇴성에 기인하여 생긴다. 두 형태 모두가 동일 폴리펩티드 서열로 인도하는 SNP는 "동의(synonymous)"(종종 사일런트 돌연변이로 불림)라고 명명한다. 상이한 폴리펩티드 서열이 생성되는 경우, 그들은 "비-동의"라고 명명한다. 비-동의 변화는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 여기에서 미스센스 변화는 상이한 아미노산을 초래하고, 넌센스 변화는 미성숙 종결 코돈을 초래한다. 단백질-코딩 영역에 있지 않은 SNP는 여전히 유전자 스플라이싱, 전사인자 결합, 또는 비-코딩 RNA의 서열을 위한 중요성을 가질 수 있다. SNP는 보통은 쌍대립유전자성(biallelic)이고 따라서 식물 및 동물에서 용이하게 검정된다. [Sachidanandam (2001) Nature 409:928-33].
사일리지: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "사일리지"는 저장 마초의 특정 유형을 말한다. 일반적으로, 사일리지는 식물(예를 들어, 옥수수 식물)로부터 엔사일리지(ensilage)라 불리는 과정으로 제조된다. 당해 과정 동안, 식물 또는 식물 부분은 자생 미생물(예를 들어, 유산균의 1종 이상의 균주, 예를 들어 락토바실러스(Lactobacillus) 종)이 일으키는 혐기성 발효를 거치게 되고, 그에 따라 당을 산으로 전환시키고 농작물 물질에 존재하는 임의의 산소를 고갈시키는데, 산소의 고갈은 아세테이트, 프로피오네이트, 락테이트, 및 부티레이트와 같은 박테리아-생성 휘발성 지방산과 공동으로 마초를 보존한다. 사일리지는 우유- 및 육류-생산 동물, 예컨대 착유우 및 비육우의 급식에 널리 사용된다.
용어 "사일리지를 생산하는"은 육류-생산 동물에 급식하기에 적합한 사일리지를 어떻게 수득하는지의 과정을 기술한다. 일반적으로, 사일리지는 식물, 예를 들어 옥수수 식물로부터, 수확한 식물 바이오매스를 마초 수확기로 세단(chopping)함으로써 생산된다.
섬유원: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "섬유원"이란 식물 또는 미생물원으로부터 수득된 물질을 말하며, 그러한 물질은 식용 섬유를 함유하고 있다. 섬유원의 실용적인 비-제한적인 예로는 종자 농산물의 겉껍질, 예컨대 대두로부터, 또는 곡물, 예컨대 벼, 밀, 옥수수, 보리로부터의 것들; 그러한 곡물로부터의 줄기 (짚); 채소/식물-기재 소우프 스톡(soap stock), 옥수수 마초(전형적으로 수확한 옥수수 식물로부터의 줄기, 껍질 및 잎을 포함한다); 섬유질을 높인 농산물의 가공 성분 분획, 예를 들어 옥수수 글루텐 사료; 임의의 식물 공급원으로부터의 잎 물질, 및 건조된 가용분(soluble)을 함유하거나 함유하지 않는 증류기 건조 곡물을 포함한다. 따라서, 특정 예에서, 섬유원은 예를 들어 다음과 같은 것들의 혼합물을 포함할 수 있다: 자주개자리, 보리 산물(예를 들어, 짚), 비트 펄프, 콩깍지, 스위치그래스, 옥수수 섬유, 대두 섬유, 코코아 겉껍질, 옥수수속, 옥수수 껍질, 옥수수 마초, 밀짚, 밀 왕겨, 볏짚, 아마 겉껍질, 대두박, 옥수수 가루, 밀싹, 옥수수싹, 관목, 및 목초. 본원 개시에서 명확을 기하기 위하여, 증류기 건조 곡물(가용분 함유 또는 비-함유) 및 증류기 곡물(가용분 함유 또는 비-함유)은 섬유를 함유하지만, "섬유원"으로 여겨지지 않는다. 증류기 건조 곡물(가용분 함유 또는 비-함유) 및 증류기 곡물(가용분 함유 또는 비-함유)은 후술되는 바와 같이 "옥수수 부산물"로 여겨진다.
옥수수 부산물: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "옥수수 부산물"이란 옥수수의 습식 제분 또는 건식 제분 뒤에 남는 산물을 언급한다. 옥수수 부산물의 비-제한적인 예는 옥수수 글루텐, 증류기 곡물, 증류기 곡물+가용분, 증류기 건조 곡물, 증류기 건조 곡물+가용분, 응축 증류기 가용분, 왕겨 케이크, 변형된 증류기 곡물, 변형된 증류기 곡물+가용분을 포함한다.
보충물: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보충물"이란 사료 믹스의 영양가를 높이기 위하여 그 사료 믹스에 포함되는 임의 성분을 말한다. 통용되는 보충물로는 단백질(예를 들어, 대두박 또는 요소), 미네랄(예를 들어, 골분), 에너지(예를 들어, 동물성 지방), 및 비타민이 포함된다.
형질 또는 표현형: 용어 "형질" 및 "표현형"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본원 개시의 목적상, 특별한 관심의 대상이 되는 형질은 bm1/감소된 리그닌 함량이다.
IV . bm1 표현형과 관련된 유전자 및 유전자 변이, 및 그들의 용도
본원 개시는 옥수수에서 bm1 표현형에 기여하는 신규 돌연변이체 CAD2 유전자를 제공한다. 본원 기재의 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 식물(예를 들어, 옥수수)은 동일 품종의 야생형 식물에서 발견되는 것들보다 낮은 리그닌 수준을 지닌 세포벽을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 핵산 분자를 생물중으로 도입시켜, 예를 들어 감소된 리그닌 표현형의 발생에 조력할 수 있다. 특정 실시양태에서, 생물은 식물(예를 들어, 옥수수)일 수 있다. 그러나, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 핵산 분자를 식물이 아닌 생물, 예를 들어 효모 또는 원핵생물중으로 도입시킬 수도 있다. 일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자는 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 식물, 또는 bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형을 보유할 것 같은 식물의 동정에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 서열은 식물에서 또는 식물로부터 준비된 샘플에서 돌연변이체 CAD2 유전자의 존재를 검출하는 프로브의 설계에 사용될 수 있다. 특정 예에서, 돌연변이체 CAD2 유전자의 뉴클레오티드 서열과는 하이브리드화하지만, 특정 야생형 CAD2 유전자의 것과는 하이브리드화하지 않는 핵산 프로브가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 실질적으로 동일한 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하며, 그 서열은 본원 기재의 AC 디뉴클레오티드 삽입 및/또는 트랜스포손 삽입을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 적어도 약 85% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 핵산 분자는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 86%; 87%; 88%; 89%; 90%; 91%; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% 또는 99.5% 동일한, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 실질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다. 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 실질적으로 동일한 그러한 핵산 분자는 예를 들어, 다양한 생물에 대한 당업자에게 쉽사리 이용가능한 임의의 완전 또는 부분 게놈으로부터 용이하게 동정 및 단리될 수 있다.
일부 실시양태는 또한 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 기능성 변이체를 포함한다. 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 기능성 변이체 는 예를 들어, 1개 이상의 뉴클레오티드 치환, 결실, 또는 삽입을 포함하는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함할 수 있고, 여기에서 기능성 변이체는 당업자에 주지의 일상적인 기술로 측정될 수 있는 bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형에 기여한다. 예를 들어, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 기능성 변이체는 본원 기재의 AC 디뉴클레오티드 삽입 및/또는 트랜스포손 삽입을 포함할 수 있다. 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 특정 변이체가 리그닌 함량을 감소시키는 능력 또는 bm1 표현형에 기여하는 능력은 식물중으로 그 돌연변이 또는 단편의 일상적인 도입에 이어서, bm1 표현형의 감소된 리그닌 함량 또는 다른 특징에 대한 식물의 일상적인 관찰에 의해 측정될 수 있다. 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 기능성 변이체는 유발 돌연변이인 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 생성시킬 수 있거나, 또는 그들은 대립 유전자 변이체(다형, 예를 들어, SNP)로서 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, 따라서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 기능성 변이체는 CAD2 유전자의 부가적인 돌연변이, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 서열보다 작은 단편, 및/또는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 키메라 단백질을 포함할 수 있고, 그 기능성 변이체는 돌연변이체 CAD2 유전자의 특성을 보유한다. 그러한 돌연변이 및 단편은 따라서 본 발명의 범위내에 있는 것으로 여겨진다. 당업자는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 부가적인 돌연변이 또는 단편이 돌연변이체 CAD2 유전자의 특성을 보유하는지 여부를 수월하게 측정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원 개시의 돌연변이체 CAD2 유전자를 식물중으로 도입하고 그 식물에서 검출하는 능력은 돌연변이체 CAD2 유전자를 지닌 식물의 마커-조력 육종 및 선택을 수월하게 할 수 있으며, 그 식물은 또한 bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형을 지니고 있을 가능성이 있을 수 있다. 특정 예에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 식물에 (예를 들어, 형질전환, 또는 전통적인 육종 기술, 예컨대 교잡에 의해) 도입시킬 수 있고, 이어서 그 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 식물은 식물에서 돌연변이체 CAD2 유전자의 존재를 검출하는 프로브를 사용하여 선별해낼 수 있다. 본원 개시의 돌연변이체 CAD2 유전자가 도입된 식물을 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수도 있는 식물과 교잡시킬 수 있고, 이어서 자손은 식물에서 본원 개시의 돌연변이체 CAD2 유전자의 존재를 검출하는 프로브를 사용하여 선별해낼 수 있다. 추가 교잡을 행하여 목적하는 유전자형의 식물을 수득할 수 있다.
핵산 서열(예를 들어, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자)을 식물과 같은 생물중으로 "도입"시킬 때, 특정 서열을 포함하는 핵산 분자의 도입에 사용되는 기술 또는 방법론은 본 발명에 필수가 아니며, 그러한 도입은 당업자에게 알려진 임의의 기술 또는 방법론에 의해 일어날 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 직접 형질전환법, 예컨대 식물 조직의 애그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환; 마이크로프로젝타일 충격(microprojectile bombardment); 일렉트로포레이션 등에 의해 도입시킬 수 있다. 이와 달리, 핵산 분자는 특정 뉴클레오티드 서열을 갖는 식물을 또 다른 식물과 교잡시킴으로써 도입될 수 있으며, 그에 따라 자손은 그들의 게놈에 혼입된 뉴클레오티드 서열을 갖게 된다. 그러한 육종 기술은 당업자에게 주지이다. 마커-조력 육종 기술은, 본원에 개시된 바와 같이, 그러한 교잡을 통해 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 혼입을 대폭 촉진시킬 수 있다.
본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자가 생물중으로 도입되는 실시양태에서, 돌연변이체 CAD2 유전자가 1개 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 방식으로 돌연변이체 CAD2 유전자가 도입되는 것이 바람직할 수 있으며, 예를 들어, 목적하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 플라스미드의 사용을 통해 도입된다. 이종 핵산 서열의 발현에 유용한 조절 서열은 당업계에 주지이며, 예를 들어 및 제한 없이 다음을 포함한다: 프로모터(예를 들어, 구성적 프로모터; 조직-특이적 프로모터; 및 발생기-특이적 프로모터); 종결 서열; 인핸서 서열; 아세포 표적화 서열; 안정화 또는 리더 서열; 및 인트론.
본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자는 마커를 함유하는 형질전환된 세포를 음성 선택(즉, 선별 마커 유전자를 함유하지 않은 세포의 성장 억제)에 의해 또는 양성 선택(즉, 유전자 마커에 의해 코딩된 산물의 스크리닝)에 의해 회수되도록 해주는 조절 요소(예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 1종 이상의 마커 유전자를 갖는 생물중으로 도입시킬 수 있다. 형질전환을 위한 다수의 선별 마커 유전자가 형질전환 분야에 주지이며, 그러한 마커 유전자로는 예를 들어, 항생제 또는 제초제일 수 있는 선택적 화학약품을 대사적으로 해독하는 효소를 코딩하는 유전자, 또는 억제제에 무감각할 수 있는 개변된 표적을 코딩하는 유전자가 포함된다. 몇몇 양성 선택법이 또한 당해분야에 공지되어 있다. 식물 세포에 사용하기에 적합한 마커 유전자의 예로는 예를 들어 및 제한 없이 다음의 것들이 포함될 수 있다: 네오마이신 포스포트랜스페라제 II(nptII) 유전자(Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803); 하이그로마이신 포스포트랜스페라제 유전자(Vanden Elzen et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:299); 젠타마이신 아세틸 트랜스페라제, 스트렙토마이신 포스포트랜스페라제, 아미노글리코시드-3'-아데닐 트랜스페라제, 및 블레오마이신 내성 결정인자(예를 들어, 문헌[Hayford et al. (1988) Plant Physiol. 86:1216]; [Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86)]; [Svab et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:197]; 및 [Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171] 참조); 글리포세이트, 글루포시네이트 또는 브로목시닐과 같은 제초제에 대한 내성을 부여하는 선별 마커 유전자(예를 들어, 문헌[Comai et al. (1985) Nature 317:741-744]; [Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618]; 및 [Stalker et al. (1988) Science 242:419-423] 참조); 마우스 디히드로폴레이트 리덕타제(Eichholtz et al. (1987) Somatic Cell Mol. Genet. 13:67); 식물 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제(Shah et al. (1986) Science 233:478); 식물 아세토락테이트 신타제(Charest et al. (1990) Plant Cell Rep. 8:643).
식물 형질전환에 적합한 마커 유전자의 또 다른 부류는 항생제와 같은 독물에 대한 내성에 대하여 형질전환된 세포의 직접적인 유전자 선택(genetic selection)보다는 추정적으로 형질전환된 식물 세포의 스크리닝을 채용한다. 이들 유전자는 특이적 조직에서의 유전자 발현의 공간적 패턴을 정량하거나 가시화하는 데에 특히 유용하고, 빈번하게는 "리포터 유전자"로서 호칭되는데, 그 이유는 그들이 유전자 발현의 조사를 위한 유전자 또는 유전자 조절 서열에 융합될 수 있기 때문이다. 형질전환된 세포의 스크리닝을 위한 통용되는 유전자로는 β-글루쿠로니다제(GUS), β-갈락토시다제, 루시페라제 및 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제가 포함된다. 예를 들어, 문헌[Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387]; [Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343]; [Koncz et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84:131]; 및 [DeBlock et al. (1984) EMBO J. 3:1681] 참조.
최근에 와서, 식물 조직의 파괴를 요하지 않는 GUS 활성을 가시화하는 생체내 방법이 이용할 수 있게 되었다. [Molecular Probes publication 2908, Imagene Green.TM., p. 1-4, 1993]; 및 [Naleway et al. (1991) J. Cell Biol. 115:151a]. 또한, 형광 단백질(예를 들어, GFP, EGFP, EBFP, ECFP, 및 YFP)을 코딩하는 유전자가 원핵생물 및 진핵생물 세포에서의 유전자 발현용 마커로서 이용되어 왔다. 문헌[Chalfie et al. (1994) Science 263:802] 참조. 형광 단백질 및 형광 단백질의 돌연변이가 스크리닝가능한 마커로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자 및/또는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 단편 또는 세그멘트를 사용하여 옥수수 이외의 생물로부터 상동 돌연변이체 CAD2 유전자 서열을 (예를 들어, 서열 비교에 의해) 동정할 수 있다. 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 상동인 옥수수 이외의 생물로부터의 서열은 주지 기술에 따라, 예를 들어 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와의 그들의 서열 상동성에 기초하여 동정 및 단리될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자로부터의 코딩 서열의 전부 또는 일부가 일상적인 기술에 따라 생물로부터의 클로닝된 게놈 DNA 단편의 집단(즉, 게놈 라이브러리)에 존재하는 다른 서열과 특이적으로 하이브리드화하는 프로브로서 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 특이적으로 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 상동인 옥수수 이외의 생물로부터의 서열은 서열 비교에 의해 동정 및 단리될 수 있다. 예를 들어, 생물의 완전 또는 부분 서열분석된 게놈을 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 서열을 가지고 일상적인 기술에 따라 검색하여 돌연변이체 CAD2 유전자와 고도의 서열 동일성을 공유하고 따라서 돌연변이체 CAD2 유전자의 동족체일 가능성이 있는 생물의 게놈내 유전자를 동정할 수 있다.
예를 들어, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 전부 또는 일부가 "참조 서열"로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 참조 서열과 비교되는 핵산 서열(예를 들어, 게놈 라이브러리의 클로닝된 또는 게놈 DNA 단편)은 그 핵산 서열의 특이적 연속한 세그멘트인 "비교 윈도우"를 포함한다. 비교 윈도우는 두 서열의 최적 정렬을 위해 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 윈도우는 전형적으로 적어도 20개의 연속한 뉴클레오티드 길이이지만, 30, 40, 50, 100, 또는 200 뉴클레오티드 길이, 또는 그보다 더 길 수도 있다. 폴리뉴클레오티드 서열 비교 윈도우에 결실의 포함에 기인한 참조 서열과의 높은 유사성을 피하기 위하여, 뉴클레오티드 매치의 개수에서 공제되도록 "갭 페널티(gap penalty)"가 도입될 수 있다.
비교를 위한 서열을 정렬하는 방법은 당업계에 주지이다. 임의의 두 서열간 % 서열 동일성의 측정은 이용가능한 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 그러한 수학적 알고리즘의 비-제한적인 예는 문헌[Myers and Miller (1988), CABIOS 4:11-7]의 알고리즘; 문헌[Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]의 국소 정렬 알고리즘; 문헌[Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443-53]의 전역 정렬 알고리즘; 문헌[Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8]의 국소-정렬 검색법; 문헌[Karlin and Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264]의 알고리즘, 및 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7]의 알고리즘이다.
서열 동일성을 측정하거나, 또는 참조 서열과의 공유된 서열 동일성에 따라 복수개의 서열을 포함하는 데이터베이스(예를 들어, 생물 게놈 데이터베이스)를 검색하기 위한 서열의 비교를 위해, 당업자는 이들 수학적 알고리즘을 컴퓨터상에서 실행할 수 있다. 그러한 실행은 다음을 포함하며 그들에 한정되지 않는다: 피시/진(PC/Gene) 프로그램에서 클루스탈(CLUSTAL)(인텔리제네틱스(Intelligenetics), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰); 및 지시지 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 v. 10(GCG Wisconsin Genetics Software Package, v. 10)에서 얼라인(ALIGN) 프로그램 및 갭(GAP), 베스트핏(BESTFIT), 블라스트, 패스타(FASTA), 및 티패스타(TFASTA)(액설리스 인코포레이티드(Accelrys Inc.), 미국 캘리포니아주 샌디에고). 이들 프로그램을 사용한 서열 정렬은 그들의 디폴트 파라미터를 이용하여 수행될 수 있다. 이와 달리, 일부 검색에서는 디폴트 파라미터를 변경시키는 것이 바람직할 수 있다(예를 들어, 갭 페널티의 값을 변경). 서열 동일성의 계산을 위한 수학적 알고리즘의 특정 컴퓨터 실행의 선택 및 선택된 알고리즘에 사용하기 위한 파라미터 값의 선택은 당업자의 자유 재량내에 있다.
일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자는 부가적인 목적 유전자(예를 들어, 돌연변이체 유전자 또는 마이너 대립유전자) 또는 표현형을 포함하는 식물중으로 교잡에 의해 도입시킬 수 있다. 이와 달리, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자는 부가적인 목적 유전자 또는 표현형을 포함하는 식물중으로 예를 들어 형질전환에 의해 도입시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자는 리그닌 생합성 또는 대사에 관여하는 1개 이상의 부가적인 유전자에 돌연변이를 포함하는 식물중으로 도입시킬 수 있다. 예를 들어 및 제한 없이, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자는 예를 들어 상이한 CAD 유전자; COMT; 4 CL; F5H; EgCAD1-타입 ZmCAD1; SAD; 코리스메이트(chorismate) 뮤타제 유전자; PAL; HCT; OMT; 시토크롬 P450 유전자; SAMS3; CCR; DFR; 캘콘(chalcone) 신타제 유전자; 락카제 유전자; 퍼옥시다제 유전자; ALDH 유전자(예를 들어, 문헌[Skibbe et al. (2002) Plant Mol. Biol. 48:751-64]에 기재된 6개 옥수수 ALDH 유전자중 하나); AGO; MYB 전사인자 유전자(예를 들어, ZmMYB38; 및 옥수수 APL); LIM 전사인자 유전자; 옥수수 bZIP 인자 유전자; MADS -박스 유전자(예를 들어, ZmZAG5); MP 유전자; ABC 트랜스포터 유전자; β-글루코시다제 유전자; 글루타치온 S-트랜스페라제 유전자(예를 들어, ZmGST17); 노둘린 MtN21-유사 유전자; PINOID 오르토로고스 유전자(orthologous gene); 히스티딘 키나제(예를 들어, ZmHK1, ZmHK2, 및 ZmHK3); 및/또는 COV1 오르토로고스 유전자에 돌연변이를 포함하는 식물중으로 도입시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 리그닌 생합성 또는 대사에 관여하지 않는 1개 이상의 바람직한 형질(들)을 포함하는 식물중으로 도입시켜 bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형과 리그닌 생합성 또는 대사에 관여되지 않는 1개 이상의 바람직한 형질(들) 양쪽 모두를 지닌 식물을 생성시킬 수 있다.
리그닌 생합성 또는 대사 경로에 다중 돌연변이체 유전자를 함유하는 이들 및 기타 실시양태의 식물은 유용한 신규 표현형, 예를 들어 부가적인 bm 표현형, 및/또는 다른 리그닌 표현형을 나타낼 것으로 기대된다. 예를 들어 문헌[Marita et al. (2003), 상기 참조] 참조. 예를 들어, 본 발명자들은 bm1 형질과 bm3 형질을 스태킹(stacking)하면 사일리지 소화율이 추가로 증가하고, 바이오매스 가수분해에서 전처리 없이도 발효가능한 당의 수율이 매우 현저히 향상됨을 관찰하였다.
일부 실시양태는 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 포함하는 유전자조작 식물을 생성하는 수단, 및/또는 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 휴대하는 식물을 동정하는 수단을 이용한다. 일부 예에서, 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 포함하는 유전자조작 식물을 생성하는 수단은 본원 개시에 따른 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자내에 위치하는 마커일 수 있다. 일부 예에서, 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 휴대하는 식물을 동정하는 수단은 본원 개시에 따른 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자내에 위치하는 마커와 특이적으로 하이브리드화하는 프로브일 수 있다. 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자(돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 포함하는 유전자조작 식물을 생성하는 수단, 및 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 휴대하는 식물을 동정하는 수단에 관하여)는 옥수수 동계교배 계통 515 Dbm1, 또는 계통 DASbm1에서 bm1 표현형에 기여하는 그들 돌연변이체 CAD2 유전자이다. 이들 돌연변이체 CAD2 유전자는 단축 CAD2 단백질을 초래하는 CAD2 유전자의 제3 엑손에서의 프레임 시프트 돌연변이, 또는 단축 CAD2 단백질을 초래하는 CAD2 유전자의 제1 인트론에서의 3444 염기쌍 트랜스포손 삽입을 특징으로 한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CAD2 유전자는 게놈 ZmCAD2 유전자 서열의 제1 엑손 및/또는 게놈 ZmCAD2 유전자 서열의 제2 엑손을 포함할 수 있지만, 게놈 ZmCAD2 유전자 서열의 제3 엑손의 전부 또는 일부를 포함하지 않을 수 있다.
본원 개시의 돌연변이체 CAD2 유전자는 bmr 표현형에 관여될 수 있는 이전에 기재된 CAD2 돌연변이와는 상이하다. 예를 들어, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자는 다음의 특징중 1개 이상을 보유할 수 있다: ZmCAD2 유전자의 엑손(예를 들어, 엑손 3)에서의 디뉴클레오티드 삽입; 프레임 시프트를 초래하는 돌연변이; 단축 단백질을 초래하는 ZmCAD2 유전자의 인트론에서의 트랜스포손 삽입; 단축 ZmCAD2 효소를 초래하는 돌연변이; ZmCAD2 NADPH-결합 및/또는 C-말단 촉매 도메인(들)의 불활성화(예를 들어, 제거에 의해)를 초래하는 돌연변이; 동계교배 옥수수 계통 515Dbm1에서의 bm1 표현형에 기여하는 돌연변이; 및 동계교배 옥수수 계통 DASbm1에서의 bm1 표현형에 기여하는 돌연변이. 이와는 대조적으로, 이전에 기재된 자연발생 돌연변이체 CAD2 유전자는 유전자의 제1 인트론에서의 트랜스포손 삽입(미국 특허출원 US 2010/0203196 A1); 전장(全長) CAD 단백질의 감소된 발현(Halpin et al. (1998), 상기 참조); 솔검 바이컬러(Sorghum bicolor ) CAD2 효소의 단축으로 인도하는 점 돌연변이([Saballos et al. (2009), 상기 참조]; 및 [Sattler et al. (2009), 상기 참조]); 솔검 바이컬러 CAD2중 보조 인자 결합 부위에서의 점 돌연변이(동서); 솔검 바이컬러 CAD2중 활성부위 외측의 붕괴된 2차 구조(동서); 및 단축 효소를 초래하는 파이누스 테다 엘(Pinus taeda L.) CAD 유전자에서의 2-염기쌍 아데노신 삽입(미국 특허 6,921,643)을 특징으로 한다.
V. bm1 표현형과 관련된 유전자 및 유전자 변이와 연관된 분자 마커 , 및 그의 용도
본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관되어 있는 (예를 들어, 긴밀하게 연관되어 있는) 분자 마커가 제공된다. 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 분자 마커는 부분적으로는 5L 옥수수 염색체상 특정 영역에서의 그의 위치에 의해 기재될 수 있다. 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관되어 있는 분자 마커는 돌연변이체 CAD2 유전자내에 있거나, 또는 그 근처에 주재하는 SNP 마커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, bm1 옥수수 계통 515 Dbm1로부터의 CAD2 유전자중 뉴클레오티드 위치 5410에, 및 bm1 옥수수 계통 DASbm1중 뉴클레오티드 위치 8903에 위치한 G/A SNP (또는 그와 동등한 마커)는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관되어 있는 분자 마커일 수 있다. 일부 실시양태에서, bm1 옥수수 계통 515 Dbm1로부터의 CAD2 유전자중 뉴클레오티드 위치 5410에 위치한 G/A SNP는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관되어 있는 분자 마커일 수 있다.
부가적인 마커는 예를 들어, 부가적인 마커와 본원 개시에 따른 CAD2 돌연변이, 또는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관되어 있는 분자 마커(예를 들어, bm1 옥수수 계통 515 Dbm1중 뉴클레오티드 위치 5410에 위치한 G/A SNP)간의 재조합 빈도를 측정함으로써 동정될 수 있다. 그러한 측정은 문헌[Mather (1931), The Measurement of Linkage in Heredity, Methuen & Co., London]의 방법에 기반한 직교 대비(orthogonal contrast)의 개량 방법을 이용할 수 있으며, 이어서 재조합 빈도를 측정하기 위한 최대 우도 검정이 따른다. [Allard (1956) Hilgardia 24:235-78]. 재조합 빈도의 값이 생물(예를 들어, 옥수수)에서 0.10(즉, 10%) 이하이면, 따라서 부가적인 마커는 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관되어 있고, 당해 개시 방법에 사용하는 목적상 특정 참조 마커와 동등한 것으로 여겨진다.
본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관되어 있거나 또는 그 안에 주재하는 핵산 분자 마커를 사용하여 bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형을 지닌 식물을 동정하는 방법은 식물 개발자들에게 원가 절감을 가져올 수 있는데, 이유는 그러한 방법은 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 식물을 타 식물 계통과 교잡하고, 이어서 교잡의 자손의 표현형을 결정할 필요성을 제거할 수 있기 때문이다.
돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 포함하는 유전자조작 식물을 생성하는 수단은 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관되어 있는 마커이다. 따라서, 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 포함하는 유전자조작 식물을 생성하는 수단은 옥수수 식물로부터의 핵산 서열을 포함하고, 그 핵산 서열중 어느 것의 검출은 그 핵산 서열을 포함하는 식물이 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하고 있다는 강력한 표시를 최소한 제공한다.
돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자를 휴대하는 식물을 동정하는 수단은 본원 개시에 따른 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자와 연관되어 있거나 또는 그 안에 주재하는 마커와 특이적으로 하이브리드화하는 프로브이다. 핵산의 특이적 하이브리드화는 검출가능한 신호이며, 본원 개시에 따른 돌연변이체 옥수수 CAD2 유전자와 연관되어 있거나 또는 그 안에 주재하는 마커와 특이적으로 하이브리드화하는 핵산 프로브는 따라서 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 휴대하는 식물로부터 수득한 샘플에 첨가시 검출가능한 신호를 제시한다.
일부 실시양태에서, 생물 게놈중 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 플랭킹하는 연관된 마커를 사용하여 돌연변이체 CAD2 유전자를 분명하게 함유하는 도너 양친 DNA의 세그멘트(들)을 전달시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 플랭킹하는 연관된 마커를 사용하여 돌연변이체 CAD2 유전자를 분명하게 함유하는 도너 양친 DNA의 세그멘트(들)을 전달하는 방법은 두 양친 식물의 게놈 DNA를 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커와 특이적으로 하이브리드화가능한 프로브로 분석하는 단계; 두 양친 식물 유전자형을 유성생식 교잡하여 자손 집단을 수득한 다음, 그들 자손을 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커의 존재에 대하여 분석하는 단계; 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커를 함유하는 자손을 수용(recipient) 유전자형과 여교잡하여 제1 여교잡 집단을 생성한 다음, 이어서 양친 유전자형 및 돌연변이체 CAD2 유전자에 의해 보이는 임의의 목적 형질(들)을 포함하는 최종 자손이 수득될 때까지 여교잡 프로그램으로 지속하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 교잡 및 여교잡 단계에서 수득된 개개의 자손은 각 세대에서의 연관된 마커 분석에 의해 선별된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커와 특이적으로 하이브리드화가능한 프로브로 두 양친 식물의 게놈 DNA를 분석하면 양친 식물중 한쪽은 프로브가 특이적으로 하이브리드화하는 연관된 마커를 좀더 적은 수로 포함하고 있거나, 또는 프로브가 특이적으로 하이브리드화하는 연관된 마커를 전혀 포함하고 있지 않음을 밝혀준다.
일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관되어 있거나 또는 그 안에 주재하는 마커, 또는 돌연변이체 CAD2 유전자 서열 그 자체를 사용하여 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 옥수수 식물중으로 형질전환에 의해 도입시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 마커는 제한 없이, bm1 옥수수 계통 515 Dbm1중 뉴클레오티드 위치 5410에, 및 bm1 옥수수 계통 DASbm1중 뉴클레오티드 위치 8903에 위치한 G/A SNP, 또는 그와 동등한 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 옥수수 식물중으로 유전자 재조합에 의해 도입하는 방법은 식물(예를 들어, 옥수수 식물)의 게놈 DNA를 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커 또는 돌연변이체 CAD2 유전자 그 자체와 특이적으로 하이브리드화가능한 프로브로 분석하여 식물에서 돌연변이체 CAD2 유전자를 동정하는 단계; 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 식물의 게놈 DNA의 세그멘트를, 예를 들어 그 게놈 DNA를 추출한 다음 게놈 DNA를 1종 이상의 제한 엔도뉴클레아제 효소로 소화시킴으로써 단리하는 단계; 임의로는 DNA의 단리 세그멘트를 증폭하는 단계; DNA의 단리 세그멘트를 숙주 옥수수 식물의 세포 또는 조직중으로 도입하는 단계; 및 숙주 옥수수 식물의 DNA를 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커 또는 돌연변이체 CAD2 유전자 그 자체와 특이적으로 하이브리드화가능한 프로브로 분석하여 숙주 옥수수 식물에서 돌연변이체 CAD2 유전자를 동정하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA의 단리 세그멘트는 이것이 숙주 옥수수 식물의 게놈중으로 안정하게 통합되도록 숙주 옥수수 식물중으로 도입시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관되어 있거나 또는 그 안에 주재하는 마커, 또는 돌연변이체 CAD2 유전자 서열 그 자체를 사용하여 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 다른 생물, 예를 들어 식물중으로 도입시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 마커는 제한 없이, bm1 옥수수 계통 515 Dbm1중 뉴클레오티드 위치 5410에, 및 bm1 옥수수 계통 DASbm1중 뉴클레오티드 위치 8903에 위치한 G/A SNP, 또는 그와 동등한 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 옥수수 이외의 생물(예를 들어, 대두; 자주개자리; 밀; 평지; 벼; 및 수수)중으로 도입하는 방법은 옥수수 식물 이외의 식물의 게놈 DNA를 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커 또는 돌연변이체 CAD2 유전자 그 자체와 특이적으로 하이브리드화가능한 프로브로 분석하여 식물에서 돌연변이체 CAD2 유전자를 동정하는 단계; 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 식물의 게놈 DNA의 세그멘트를, 예를 들어 그 게놈 DNA를 추출한 다음 게놈 DNA를 1종 이상의 제한 엔도뉴클레아제 효소로 소화시킴으로써 단리하는 단계; 임의로는 DNA의 단리 세그멘트를 증폭시키는 단계; DNA의 단리 세그멘트를 옥수수 이외의 생물중으로 도입시키는 단계; 및 옥수수 이외의 생물의 DNA를 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커 또는 돌연변이체 CAD2 유전자 그 자체와 특이적으로 하이브리드화가능한 프로브로 분석하여 생물에서 돌연변이체 CAD2 유전자를 동정하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA의 단리 세그멘트는 이것이 생물의 게놈중으로 안정하게 통합되도록 생물중으로 도입시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관되어 있거나 또는 그 안에 주재하는 마커, 또는 돌연변이체 CAD2 유전자 서열 그 자체를 사용하여 bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형을 지닌 식물을 동정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 식물은 옥수수 식물이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자(예를 들어, 게놈 DNA 또는 mRNA)는 식물로부터 추출될 수 있다. 추출된 핵산 분자는 이어서 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커 또는 돌연변이체 CAD2 유전자 그 자체와 특이적으로 하이브리드화가능한 1종 이상의 프로브와 접촉시킬 수 있다. 1종 이상의 프로브와 추출된 핵산 분자의 특이적 하이브리드화는 식물에서 bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형의 존재를 나타내는 것이다.
프라이머 설계 및 연관 스크리닝
올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들어, 프라이머)는 bm1 돌연변이와 연관되어 있는 CAD2중에, 그 근처에, 또는 그 사이에 물리적으로 위치하는 마커를 특이적으로 검출하도록 설계될 수 있다. 일반적으로, 마커의 오직 하나의 대립유전자와 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서, 두 올리고뉴클레오티드 프로브는, 하나는 다른 하나의 프로브가 특이적으로 하이브리드화하지 않는 bm1 대립유전자와 특이적으로 하이브리드화하고, 나머지 하나는 다른 하나의 프로브가 특이적으로 하이브리드화하지 않는 야생형 CAD2 대립유전자 (또는 상이한 bm1 대립유전자)와 특이적으로 하이브리드화하도록, bm1 마커를 검출하도록 설계된다. 당업자에 의해 이해되듯이, 특정 마커를 위한 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이 또는 조성은 프로브를 마커의 1개 대립유전자에 대하여 비-특이적이 되게 하지 않고도 확립된 원리에 따라 변동시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 프라이머일 수 있다. 구체적 실시양태에서, 프라이머는 카스파TM 유전자형결정 검정에서 마커를 검출하도록 설계될 수 있다. 특정 실시양태에서, 프라이머는 카스파TM 유전자형결정 검정을 이용하여 옥수수에서 bm1 표현형과 연관된 마커를 검출하도록 설계될 수 있다. 이들 및 추가 실시양태에서, 검출 시스템은 지도작성 집단에서 개체의 유전자형결정을 위한 고-처리량의 편리한 포맷을 제공할 수 있으며, 이러한 포맷은 특정 유전자 또는 형질을 휴대하는 개체의 동정을 대폭 촉진할 수 있고, 또한 마커-조력 선택 프로그램의 실행 또는 실시를 대폭 촉진할 수 있다.
구체적 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 택맨® 유전자형결정 검정에서 마커를 검출하도록 설계된 프라이머일 수 있다. 당해 방법은 특이적 프라이머를 사용하여 bm1 돌연변이와 밀접하게 연관된 마커 및 그 마커에 특이적인 형광-표지 프로브를 함유하는 DNA의 영역을 증폭시킨다. bm1 대립유전자와 특이적으로 하이브리드화하는 프로브는 FAM와 같은 형광 염료로 표지할 수 있으며, 반면에 야생형 CAD2 대립유전자 (또는 상이한 bm1 대립유전자)와 특이적으로 하이브리드화하는 프로브는 VIC와 같은 상이한 형광 염료로 표지할 수 있다. 데이터는 형광 염료 신호의 존부로서 분석된다. 검출 시스템은 지도작성 집단에서 개체의 유전자형결정을 위한 다중화(multiplexing)와 같이 고-처리량의 편리한 포맷을 제공할 수 있으며, 이러한 포맷은 특정 유전자 또는 형질을 휴대하는 개체의 동정을 대폭 촉진할 수 있고, 또한 마커-조력 선택 프로그램의 실행 또는 실시를 대폭 촉진할 수 있다.
따라서, 일반적으로 bm1 옥수수 또는 추정상 bm1 옥수수의 접합성(zygosity) 분석에 유용한 유전자-특이적 엔드포인트 택맨® PCR 검정이 또한 본원에 기재된다. 특정 실시양태에서, 유전자-특이적 엔드포인트 택맨® PCR 검정을 이용하여 bm1 돌연변이에 대한 옥수수의 접합성을 분석할 수 있다.
유전자-특이적 엔드포인트 택맨® PCR 검정에 사용하기 위한 프라이머 및 프로브는 관심의 대상이 되는 유전자에서의 기지의 돌연변이에 기반하여 설계될 수 있다. 예를 들어, bm1 -특이적 검정을 위한 프라이머 및 프로브는 CAD2 유전자의 제1 인트론에서의 3444-bp 삽입에 기반하여 설계될 수 있다. 돌연변이(예를 들어, bm1) 및 비-붕괴 야생형 유전자(예를 들어, CAD2)에 특이적인 올리고뉴클레오티드가 동일 검정에 사용되는 이중쇄(biplex) 반응에서, 특이적 올리고뉴클레오티드는 게놈 DNA 샘플에 존재하는 돌연변이된 유전자 및/또는 야생형 유전자중 어느 일방 또는 양방으로부터의 서열을 선택적으로 증폭시킬 것이다.
일부 실시양태에서, bm1 -특이적 검정은 야생형 게놈 CAD2 유전자중으로 삽입된 3444-bp의 뉴클레오티드 서열에 특유한 단편을 증폭시킨다. 일부 실시양태에서, 야생형 CAD2 유전자-특이적 검정은 3444-bp의 뉴클레오티드 서열이 야생형 CAD2 유전자중으로 삽입된 접합 부위를 포함하는 CAD2 유전자의 단편을 증폭시킨다. 특정 실시양태에서, 표적-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 고-엄중성 조건하에서 게놈 DNA 샘플중 두 PCR 프라이머 사이의 표적 서열과 하이브리드화한다.
표적-특이적 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 형광 염료(예를 들어, FAM, VIC, 및 MGBNFQ)로 표지시킬 수 있으며, 그러면 표적-특이적 형광 신호의 고속 정량을 할 수 있게 된다. PCR 산물은 소정 횟수의 사이클 후에, 예를 들어 반응이 대수기 초기에 있을 때 측정될 수 있다. 음성 대조군 샘플은 예를 들어 bm1 돌연변이가 없는 임의의 옥수수 품종으로부터의 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 양성 대조군 샘플은, CAD2 유전자에서의 bm1 삽입 돌연변이와 같이, BMR 돌연변이를 지닌 옥수수 품종으로부터의 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 대조군 반접합성 샘플은 bm1 돌연변이에 대하여 반접합성이 되도록 미리결정된 옥수수 품종으로부터의 게놈 DNA를 포함할 수 있거나; 또는 반접합성 샘플은 bm1 돌연변이에 대하여 동형접합성이 되도록 미리결정된 옥수수 품종으로부터의 DNA와 동등한 비율의 음성 대조군 DNA를 포함할 수 있다.
DNA는 옥수수 식물 조직으로부터 당업자 공지의 방법으로 단리(예를 들어, 추출, 및 정제)될 수 있다. DNA 단리를 위한 시판 키트는 예를 들어 카이아진 인코포레이티드(Qiagen, Inc.)로부터 입수가능하다. 일부 실시양태에서, 특정 식물로부터의 엽편(leaf disc)을 천공하여 수집관으로 옮긴다. 천공기는 각각 70% 알콜로 샘플링, 물에서 세정, 및 건조 후 소제할 수 있다. DNA 추출 완충제는 제조업자의 권장사항에 따라 제조될 수 있다. DNA를 이어서 제조업자의 지시에 따라 키트를 사용하여 단리할 수 있다. 마지막으로, 단리 DNA의 농도는 예를 들어 퀀트-잇TM 피코그린® 퀀티피케이션 키트(Quant-iTTM PicoGreen® Quantfication Kit, 인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드) 및 분광 광도계를 사용하거나, 또는 여타 적합한 기술에 의하여 측정될 수 있다.
일단 프라이머, 프로브, 및 게놈 DNA 샘플(들)이 준비되었거나 또는 이용가능해지면, PCR 반응을 수행하여 게놈 DNA 샘플(들)에서 관심의 대상이 되는 핵산 서열(예를 들어, BMR 돌연변이에 특유한 서열)을 동정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 게놈 DNA 샘플(들)을 제외한 모든 반응 성분을 함유하는 개별 PCR 반응 혼합물을 제조한다. bm1 돌연변이체 및 야생형 CAD2 옥수수에 대한 프라이머 및 유전자-특이적 프로브를 포함하는 이중쇄 반응을 위하여, 반응 혼합물은 효소, 반응 완충제, bm1 돌연변이를 위한 순방향 및 역방향 프라이머, 야생형 CAD2 유전자를 위한 순방향 및 역방향 프라이머, bm1 돌연변이를 위한 유전자-특이적 프로브, CAD2 유전자를 위한 유전자-특이적 프로브, 및 물을 포함할 수 있다. 일부 PCR 검정 시스템(예를 들어, 택맨® PCR 검정)의 경우, 효소와 완충제는 단일 키트 성분(예를 들어, 택맨® 유전자형결정 마스터 믹스; 어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터시티, 카탈로그 번호 4371355)으로 존재할 수 있다.
일단 반응 혼합물이 준비되면, 게놈 DNA 샘플(들)을 첨가할 수 있으며, 반응을 개시하였다. 샘플중 게놈 DNA의 양을 정규화할 필요는 없다. 그러나, 숙련된 기술자는 상대적으로 동등한 농도의 게놈 DNA 샘플을 사용하여 최상의 결과를 달성할 수 있다.
일부 실시양태에서, PCR 검정(예를 들어, 택맨® PCR 검정)은 적당한 대조군으로 셋업될 수 있다. 예를 들어, 다중웰 플레이트에서의 반응은, 전술한 바와 같은, (1) 시약은 포함하되 DNA 샘플은 포함하지 않는 음성 대조군(들); (2) bm1 옥수수 게놈 DNA를 포함하는 동형접합성 양성 대조군(들); 및 (3) 반접합성 양성 대조군(들)을 포함하는 대조군 웰로 수행될 수 있다. DNA를 이어서 PCR로 적합한 사이클 조건하에서 증폭시킨다. 예를 들어, 진앰프® 피시알 시스템 9700(GenAmp® PCR System 9700)을 사용하는 일부 실시양태의 경우에, 95℃에서 15분 동안 단일 초기 변성 사이클, 이어서 변성(92℃, 15초) 및 어닐링/신장(60℃, 60초)의 30 사이클이 후속될 수 있다. 당업자라면 PCR 사이클 조건이 실습자의 재량에 따라 변동될 수 있음을 이해할 것이며, 필적하는 결과가 수득되었다.
PCR 검정(예를 들어, 엔드포인트 택맨® PCR 검정)은 BMR 옥수수 또는 추정상 BMR 옥수수의 유전자형 및/또는 접합성 분석에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브는 리포터(예를 들어, 형광 모이어티)로 표지시킬 수 있다. 형광검출을 이용한 검정의 경우, PCR 반응 산물은 프로브(들)의 검출에 적당한 여기 및 방출 파장 세팅을 사용하여 형광광도계(예를 들어, 테칸 진아이오스(Tecan GENios)TM; 스위스 맨도르프)에서 분석될 수 있다. 예를 들어, 형광 염료 FAM는 485 nm의 여기 파장 및 535 nm의 방출 파장으로 측정될 수 있다. 이와 달리, 형광 염료 VIC는 525 nm의 여기 파장 및 560 nm의 방출 파장으로 측정될 수 있다.
PCR 반응 및 프로브 검출의 완료 후, 표 및 분포 그래프는 예를 들어 임의의 적합한 컴퓨터 그래픽 소프트웨어를 이용하여 작성될 수 있다. 유사한 유전자형 배경의 야생형, 반접합성, 및 동형접합성 DNA로 수득한 결과는 음성 및 양성 대조군으로서의 역할을 할 수 있다. 분리 집단에서, 데이터 포인트의 3개 클러스터가 수득될 수 있는데, 분리된 클러스터중 하나에 속할 가능성이 있으므로 샘플 결과의 가시적 측정을 가능하게 해준다. 이와 달리, 데이터 분석 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 샘플 결과가 각각의 분리된 클러스터에 속하게 될 확률을 계산해낼 수 있으며, 가장 신빙성 있는 클러스터가 샘플 명칭으로서 작용한다. 가시적 측정이 행해지는 경우, 예를 들어 데이터 포인트의 3개 클러스터가 명백하게 가시적일 때 각 클러스터의 경계는 임의적일 수 있다.
미처리 형광강도 데이터는 또한 KLIMSTM(케이바이오사이언스 래보러토리 인포메이션 매니지먼트 시스템)와 같은 적합한 분석 패키지를 이용하여 플레이트 판독기로부터 직접 분석될 수도 있다. 돌연변이체 대립유전자에 대한 특이적 프로브에 의해 생성된 형광 신호의 상대적인 형광 단위(RFU)를 하나의 축상에 플로팅하고, 야생형 대립유전자에 대한 특이적 프로브에 의해 생성된 형광 신호의 RFU를 다른 하나의 축상에 플로팅한 그래프가 작성될 수 있다. 이어서 데이터의 그래프 표시에서의 클러스터 분리에 기반하여 접합성 측정이 행해질 수 있다.
돌연변이체 게놈 DNA(예를 들어, BMR 돌연변이)를 함유하지 않는 샘플은 단지 야생형 PCR 산물의 형광 판독을 도출할 수 있을 뿐이다. 반접합성 또는 동형접합성 돌연변이체 게놈 DNA를 함유하는 샘플은 음성 백그라운드 대조군의 것보다 높은 돌연변이체-특이적 프로브에 대한 RFU 판독을 도출할 수 있다. 샘플이 어떠한 알맞은 결과도 산출하지 않는 경우, 샘플중의 게놈 DNA는 알맞은 품질 및/또는 양이 아닐 수 있으며, 새로운 DNA 준비 및/또는 새로운 PCR 반응을 수행하여야 한다. 바람직하게는, DNA 샘플을 함유하지 않는 음성 대조군 샘플은 유전자-특이적 프로브(들)의 매우 낮은 검출을 보인다. 기지의 동형접합성 대조군은 대조군에서 오직 돌연변이체 또는 야생형 DNA의 높은 검출을 나타내고, 기지의 반접합성 대조군은 돌연변이체 및 야생형 DNA 둘 모두의 높은 검출을 나타내는 것이 또한 바람직하다.
PCR 방법 및 유전자형 및/또는 접합성 측정의 "시험 시행"은 샘플의 스크리닝에 앞서 모든 적당한 대조군으로 수행될 수 있다. 사용별로(예를 들어, 게놈 DNA 제조방법, Taq DNA 폴리머라제, 올리고뉴클레오티드, 실험 장치 등) 상이할 수 있는 성분에 대하여 방법의 추가 최적화가 바람직할 수 있다. 기지의 게놈 DNA 주형중의 돌연변이체 및/또는 야생형 서열 둘 모두를 허용가능한 수준의 프로브 검출(예를 들어, 형광-표지 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 허용가능한 RFU)로 증폭하는 PCR 및 열 사이클링 조건이 확립될 수 있다.
VI . 감소된 CAD2 활성을 갖는 생물 및 그의 용도
A. 감소된 CAD2 활성을 갖는 생물
본 발명의 일부 실시양태는 또한 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 핵산 분자, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 특이적으로 하이브리드화가능한 핵산 서열, 또는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 기능성 변이체를 포함하는 생물을 제공한다. 적합한 생물은 임의의 적합한 식물, 효모, 또는 박테리아일 수 있다. 비-제한적인 예로써, 전술한 서열을 포함하는 식물은 농학적 가치가 있는 식물일 수 있으며, 예를 들어 및 제한 없이 다음의 것들을 포함한다: 옥수수; 대두; 자주개자리; 밀; 평지; 벼; 수수; 비트; 오이, 토마토, 고추 등을 비롯한 각종 채소; 사과, 배, 복숭아, 체리, 미국삼나무, 소나무, 오크 등을 비롯한 각종 수목; 및 각종 관상 식물. 특정 실시양태에서, 생물은 사일리지 생산에 사용되는 식물일 수 있다.
본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 특이적으로 하이브리드화가능한 핵산 서열, 또는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 기능성 변이체를 포함하는 식물 세포는 배양하여 식물 조직 배양 세포로서 유지시킬 수 있거나, 또는 당업계에 공지된 특정 식물 호르몬을 배양 배지에 첨가할 수 있으며, 이에 따라 식물 조직 배양 세포의 분화를 초래하여 식물 신품종을 형성하게 되며, 그 식물 신품종은 bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형을 보일 수 있다. 이들 및 기타 실시양태에 유용한 그러한 식물 배양법은 당업계에서는 일상적이며 주지이다.
본 발명의 일부 실시양태는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자와 특이적으로 하이브리드화가능한 핵산 서열, 또는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자의 기능성 변이체를 포함하는 바이러스(예를 들어, 박테리오파지, 또는 식물 바이러스)를 제공한다.
B. 감소된 CAD2 활성을 갖는 식물로부터 생산된 사일리지
마무리 일량사료에 통상의 옥수수 사일리지와 비교하여 1일 증가 및 사료 효율을 향상시키기 위하여 감소된 리그닌 함량을 보이는 식물 품종으로부터 생산된 사일리지를 사용하는 사일리지-급식 동물의 육류량을 증가시키는 방법이 본원에 개시된다. 그러한 사일리지는 식용우 마무리 일량사료에서의 알곡 옥수수를 효과적으로 대체할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 식물 품종으로부터 생산된 사일리지를 제공하는 단계, 동물을 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 식물 품종으로부터 생산된 사일리지로 급식하는 단계, 및 육류 또는 육제품을 동물로부터 생산하는 단계를 포함한다. 이들 및 추가 실시양태에서, 사일리지-급식 동물은 반추 동물일 수 있다. 특정 실시양태에서, 사일리지-급식 동물은 임의의 사일리지-급식 동물, 예를 들어, 소, 양, 돼지, 말, 염소, 들소, 야크, 물소, 및 사슴일 수 있다.
일부 실시양태에서, 사일리지-급식 동물의 육류량을 증가시키기 위해 제공되는 방법은 사일리지를 선적용으로 조형된 컨테이너에 적재하고, 사일리지를 동물에 투여하는 방법에 관하여 최종 사용자에게 직접 안내할 수 있는 표시를 사일리지에 첨부하는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 행위를 추가로 포함한다. 따라서, 사일리지를 포함하는 키트가 제공되고, 그에 따라 키트는 최종 사용자로 하여금 사일리지-급식 동물의 식육량을 증가시키게 해준다.
또한 식용우 마무리 일량사료가 개시되며, 여기에서 식용우 마무리 일량사료는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 옥수수 사일리지를 포함한다. 또한 그러한 사일리지를 급식한 동물로부터 제조된 육류 및 육제품이 개시된다.
감소된 CAD2 활성을 갖는 식물(예를 들어, 옥수수)로부터 사일리지의 생산
엔사일리지 동안, 식물의 세포는 여전히 생존해 있으며 대사적으로 활성을 띠고, 압축 사일리지에서의 식물 세포 및 미생물에 의한 진행 중인 대사는 엔사일링된 식물 물질에 포획된 공기를 이용하여 이산화탄소와 열을 형성한다. 사일리지중 이산화탄소의 수준이 증가함에 따라 혐기성 대사 조건이 발달하게 된다. 바람직한 박테리아는 식물 호흡이 정지되면 발효 과정을 시작한다. 지나치게 많은 공기가 존재하는 경우, 또는 이산화탄소가 빠져나가는 경우, 혐기성 조건이 발달하지 못할 수도 있다. 이 경우에, 호흡이 지속될 수 있으며, 호흡하는 식물 세포는 지나치게 많은 당과 탄수화물을 사용할 수 있다. 이렇게 되면 식물 물질을 사일리지로서 보존하기 위하여 바람직한 박테리아에 의해 필요로 하는 영양물을 낭비하게 될 수 있고, 열등한 사일리지를 산출할 수 있다. 이러한 바람직하지 못한 효과를 피하기 위해서는, 충진 직후 사일리지의 패킹 및 커버링이 중요할 수 있다.
일단 식물 세포에 의한 호흡이 정지하면, 엔사일링된 옥수수중의 이용가능한 전분 및 단순 당을 먹이로 하는 박테리아에 의해 아세트산 및 락트산이 생성된다. 바람직한 박테리아의 성장을 촉진하기 위하여, 사일리지는 소량의 공기, 80℉ 내지 100℉의 온도, 및 먹이로 전분과 당을 함유할 수 있다. 발효는 사일리지의 산도가 박테리아 성장을 멈추게 하기에 충분히 높을 때까지 계속될 수 있다. 일부 예에서, 목적하는 정도의 산도는 pH 약 4.2이다. 이 정도의 산도는 사일로를 충진한 후 3주 안에 일어날 수 있다.
마초중의 수분이 과도하게 높을 경우 삼출이 발생할 수 있다. 삼출은 사일리지로부터 침출액(사일리지 및 펄프로부터의 과잉 수분)의 배수를 수반하는데, 그러한 침출액은 일반적으로 심각한 오염 물질로서 주변환경으로 유입된다. 삼출을 통하여, 사일리지의 바람직한 성분(예를 들어, 질소질 화합물, 예컨대 단백질; 및 미네럴)이 손실될 수 있다. 삼출은 일반적으로 엔사일링 후 약 제4일차에 피크에 이른다. 따라서 예를 들어 사일리지로부터 바람직한 사일리지 성분의 손실을 피하기 위해서는, 사일로에 들어가는 마초의 함수량을 삼출 손실을 줄이거나 또는 방지하게 충분히 낮도록 선택될 수 있다. 그러나, 지나치게 건조한 사일리지는 충분하게 패킹되지 못할 수 있고, 또한 과도한 발효와 곰팡이 번식의 결과로 사일리지로부터 바람직한 성분의 높은 손실을 보일 수도 있다.
식물은 최적 발효 과정을 가능케 하고 발효중 손실을 최소화하기 위하여 약 30 내지 40%의 건물 함량으로 엔사일링될 수 있다. 약 30 내지 40%의 건물 함량에 이르기 위해서는, 베어낸 후 및 예를 들어 마초 수확기로 세단하기 전 식물 물질을 필드에서 건조되도록 놔두는 것이 바람직할 수 있다. 사일리지 제조시, 알곡은 식물의 잔여물과 함께 수확될 수 있다. 사일리지-급식 동물의 장관에서의 섭취를 위해 사일리지중 영양물의 이용도를 증가시키기 위해서는, 세단 과정중에 알곡을 분쇄하는 것이 바람직할 수 있다.
수확한 식물 물질(예를 들어, 옥수수 식물 물질)은 사일로에 이송될 수 있다. 사일리지 제조에 유용할 수 있는 사일로의 비-제한적인 예로는 벙커 사일로, 사일리지 힙(heap), 콘크리트 스테이브 사일로, 또는 타워 사일로가 포함된다. 식물 물질을 사일로에 압축해 채워넣어 식물 물질로부터 공기를 제거하고 혐기성 발효가 가능하게 한다. 사용되는 사일로의 유형에 따라서는 사일로를 플라스틱 사일리지 필름으로 밀봉하는 것이 바람직할 수 있다. 트렌치 사일로, 벙커 사일로, 또는 대직경 타워 사일로상에 플라스틱 덮개의 사용은 사료 손실을 상당히 줄일 수 있다. 전형적으로, 식물 물질의 최종 적재분량을 사일로에 채워넣은 직후 덮개로 덮으며, 플라스틱 덮개는 그들이 사일리지의 표면을 견고하게 누르도록 무겁게 한다. 이와 달리, 식물 물질을 꾸러미로 만든 다음, 꾸러미를 밀봉을 위해 사일리지 필름으로 포장함으로써 식물 물질은 엔사일링 동안 발효가 준비될 수 있다. 트렌치 또는 벙커 사일로상에 마초를 쌓아올리거나 또는 꼭대기에 얹어 놓는 것이 바람직할 수 있다. 이렇게 하면 사일로로부터 빗물의 배수를 촉진할 수 있다.
첨가제를 임의로는 식물 물질에 가하여 발효를 개선할 수 있다. 특정 적용에 바람직할 수 있는 식물 물질 첨가제의 예로는 미생물 첨가제, 예컨대 락토바실러스 종 및 기타 접종물; 산, 예컨대 프로피온산, 아세트산 또는 포름산; 또는 당이 포함된다. 당업자에 의해 쉽사리 이해되는 바와 같이, 본원에 구체적으로 열거된 것들 이외의 사일리지를 생산하는 다른 방법이 또한 사용될 수 있다.
사일리지 생산의 한 가지 장점은 그 과정이 사일리지 생산에 사용된 식물 물질에 함유된 영양물의 조성, 양, 또는 이용도에 영향을 미치지 않을 수 있다는 것이다. 반대로, 과정 자체의 목적은 일반적으로 식물 물질의 품질을 사일리지 생산을 위해 그러한 물질을 사용하기에 앞서 그대로 유지시키고, 식물 물질의 긍정적인 특성을 장기간 동안 보존하는 것이다. 이러한 식으로, 식물 물질은 그 식물 물질을 수확하고 난 후에도 마초로서 오래 사용될 수 있다.
옥수수는 이삭이 잘 패인 후(well-dented), 그러나 잎이 그들이 갈색으로 변하는 시점까지 건조되기 전에 사일리지용으로 수확될 수 있다. 이러한 생육 단계에서, 이삭은 그의 잠재적인 사양가치(feeding value)의 대부분을 축적할 수 있지만, 또한 잎과 줄기로부터 약간의 손실은 있을 수 있다. 따라서, 옥수수 사일리지의 양과 질은 식물 물질이 이 단계 동안에 수확될 때 정점에 있을 수 있다. 이삭은 보통은 이삭이 32 내지 35% 수분에 있을 때 잘 패일 것이다. 이삭이 잘 패인 후 시간이 경과함에 따라, 식물 물질의 사양가치는 감소할 수 있는 반면에 필드 손실은 증가할 수 있다. 유숙기(milk stage)(그레인 헤드(grain head)가 개방시 백색 액체를 방출함) 또는 호숙기(dough stage)(그레인 헤드가 밀가루 반죽같은 점조도로 변하기 시작함)에서 사일리지용으로 수확한 옥수수는 나중에 수확한 경우보다 에이커당 더 적은 사료 영양물을 산출할 수 있다. 옥수수로부터의 식물 물질은 너무 이르게 수확하는 경우에는 또한 사일로에서 부적절하게 발효가 될 수 있다.
성숙은 보통 이삭이 그의 건물 생산 포텐셜의 거의 전부를 축적할 때의 시간을 언급한다. 생육중의 온도는 특히 가을 동안에 알곡의 성숙율에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 과도하게 추운 온도 및/또는 흐린 날씨가 존재하면 이삭의 완전한 건물 포텐셜은 달성되지 못할 수 있다. 늦게 베어내고 갈색 및 죽은 잎과 줄기가 있는 옥수수 사일리지는 알맞은 사일리지를 만들 수 있을지는 몰라도, 에이커당 총 생산은 급격히 감소될 수 있다. 사일리지를 가을 또는 초겨울까지 늦게 만들면 현저한 필드 손실이 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 늦게 베어낸 사일리지와 관련해서는 사일로에 저장된 건물의 양의 감소가 나타날 수 있다.
예를 들어 가뭄, 고온, 마름병, 서리, 또는 우박으로 피해를 입은 옥수수는 사일리지용으로 회수이용(salvaged)될 수 있다. 그러나, 그러한 회수이용된 사일리지의 품질은 황숙기(dent stage)에 이른 피해를 입지 않은 옥수수로부터 생산된 사일리지만큼은 높지 않을 수 있다. 사일리지의 사양가치는 옥수수의 발육 상태, 및 피해를 입은 후 옥수수를 어떻게 취급하느냐 둘 모두에 좌우될 수 있다. 미숙한 옥수수로부터의 사일리지에서 공통으로 관찰되는 점으로는 좀더 높은 수분; 성숙 옥수수와는 상이한 방식으로의 발효; 산패(酸敗) 냄새; 및 증가된 완하제 효과가 포함된다. 서리를 맞은 옥수수는 전형적으로 낮은 카로틴 함량을 갖는다. 급속히 완전히 말라버리고 잎이 떨어져 나갈 것이다. 따라서, 상해를 입고 지나치게 건조해진 옥수수에는 물을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 가뭄 옥수수에 물을 첨가하는 것이 또한 바람직할 수 있다.
극단적으로 높은 온도로 피해를 입은 미숙한 옥수수는 곧바로 엔사일링하지않도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 미숙한 더위 피해를 입은 옥수수는 결코 이삭을 낼 수 없지만, 수확의 지연으로부터 일부 부가적인 줄기 성장이 일어날 수 있다. 부가적인 줄기 성장은 가외의 사료를 산출할 것이다. 옥수수를 더위로 광범위하게 피해를 입은 후 너무 일찍 사일리지용으로 수확하면, 줄기가 너무 많은 수분을 보유하여 고품질 사일리지를 생산하지 못할 수도 있다. 광범위한 더위 피해 후 너무 일찍 수확한, 지나치게 많은 수분을 보유한 옥수수는 또한 삼출을 통해 영양물을 상실할 수도 있다.
회수이용된 옥수수로 만든 사일리지와 관련된 있을 수 있는 문제점으로는 감소된 알곡 형성에 기인한 에너지 함량의 부족, 및 피해를 입은 식물의 과도한 건조성에 기인하는 부적절한 발효가 포함된다. 당업자에 의해 알려져 있듯이, 이들 문제점은 적어도 부분적으로는, 각각 부가적인 에너지원으로의 보충, 및 수분의 첨가에 의해 교정될 수 있다.
옥수수 사일리지는 1/2" 내지 3/4" 길이의 입자로 절단할 수 있다. 이러한 크기의 입자는 좀더 견고하게 채워넣을 수 있고, 부가적으로는 사일리지-급식 동물에게 더 맛있을 수 있다. 1/2" 길이보다 짧은 매우 잘게 절단한 사일리지는 리커터(recutter)로 만들 수 있다. 매우 잘게 절단한 사일리지의 사용은 예를 들어 사일로에 저장할 수 있는 건물의 양을 증가시킨다. 그러나, 매우 잘게 절단한 사일리지는 그 사일리지를 급식하게 되는 동물에게는 덜 맛이 있을 수 있다.
사일리지가 너무 건조하면, 예를 들어 공기가 통하지 않는 조건을 확립하기 위하여 물을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로, 함수량에 있어서 각각 1%의 목적하는 상승을 위하여 사일리지 0.9 미터톤당 3.79 리터의 물이 첨가될 수 있다. 다소간의 물이 요구될 수 있으며, 충분하되 지나치게 많지 않은 물이 첨가되는 것을 보장하기 위하여 엔사일링 과정 동안 계량이 행해질 수 있음이 이해된다. 사일로를 충진하면서 물이 첨가될 수 있다. 사일로가 충진된 후 물이 첨가되면, 사일로 벽에서 물이 새어나올 수 있고, 따라서 사일리지 매스에 골고루 스며들지 않을 수 있다. 이러한 삼출은 사일리지 영양물의 침출을 초래할 수 있고, 에어 시일(air seal)을 파괴하여 부적절한 발효를 유발할 수 있다.
고품질 사일리지를 어떠한 첨가제 또는 보존제도 가하지 않고 제조할 수 있다. 그러나, 첨가제를 사일리지에 첨가하여 사일리지의 1가지 이상의 특징을 증대시킬 수도 있다. 예를 들어, 당밀 및 알곡을 엔사일링할 때 옥수수 마초에 첨가할 수 있다.
대용량 사일로 및 고속 충진 방법의 경우, 사일로내 사일리지의 분포 및 패킹을 모니터링하여야 한다. 부적절한 분포 및 패킹은 과도한 삼출, 불량 발효, 및/또는 저장 용량의 손실을 초래할 수 있다. 원통형 사일로의 용량의 절반은 사일로의 최외연에 있다. 예를 들어, 14' 직경의 원통형 사일로의 경우, 그의 용량 절반은 그의 직경의 최외각 2'에 있다. 이 외측 영역에서의 물질이 너무 느슨하게 채워지면, 사일로의 용량이 현저히 감소할 수 있다. 따라서, 타워 사일로에는 적절한 사일리지 분포 및 패킹을 조성하는 분배기가 구비될 수 있다.
발효 과정을 수행하는 생존 미생물의 존재에 기인하여, 엔사일링 과정중에 모든 사일리지에서 영양물의 손실이 발생한다. 엔사일링 과정 동안에 손실되는 영양가의 양은 특히 충진하는 동안의 배제 공기, 및 이산화탄소 손실의 방지에 좌우된다. 이산화탄소는 엔사일링된 식물 세포의 호흡을 저지시키고; 삼출 손실, 바람직하지 못한 발효, 및/또는 식물 물질 표면의 노출에 기인한 손상을 방지하는 데 필요하다. 따라서, 양호한 엔사일링 실시는 일반적으로 최대 영양물 함량을 갖는 좀더 고품질의 사일리지로 인도한다.
마무리 일량사료중 감소된 CAD2 활성을 갖는 식물(예를 들어, 옥수수)로부터의 사일리지
감소된 CAD2 활성을 갖는 식물로부터의 사일리지는 동일 품종의 야생형 식물과 비교하여 감소된 리그닌 함량을 가지며, 가공 여부를 떠나서 표준 사일리지보다는 좀더 긴 입자로 세단될 수 있다. bm1 사일리지의 NDF 소화율은 표준 사일리지의 것보다 높을 수 있다. 새로 만들어진 사일리지의 조성은 반드시 사일리지-급식 동물이 먹게 될 사료의 조성을 반영하는 것은 아니다. 따라서, 발효된 샘플은 사일로에서 소정의 기간 경과 후에 분석될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 사일로에서 적어도 2주, 또는 적어도 2개월 후에 분석될 수 있다.
일단 감소된 CAD2 활성을 갖는 식물로부터 사일리지가 제조되고, 사일리지가 동물에의 급식 준비가 결정되면, 사일리지를 육류 또는 육제품 생산용으로 사용될 동물에 급식될 마무리 일량사료에 포함시킬 수 있다. 일부 예에서, 사일리지를 포함하는 마무리 일량사료는 알곡 옥수수, 예를 들어, 건식 롤링 옥수수, 또는 분쇄 옥수수를 포함하지 않을 수 있다. 전형적인 마무리 일량사료는 적어도 약 11% 단백질, 약 60 MCal의 순 에너지, 약 0.5% 칼슘, 약 0.35% 인, 및 약 0.6% 칼륨을 포함한다. 일부 예에서, 마무리 일량사료는 좀더 높은 사료 효율(G:F)을 보인다는 것이 장점이다. 특정 예에서, 알곡 옥수수를 포함하지 않는 마무리 일량사료는 마무리 일량사료를 급식한 동물에서, 알곡 옥수수를 에너지원으로 이용하는 표준 마무리 일량사료로부터 생기게 될 평균1일증가에 필적하는 평균1일증가를 도출할 수 있다.
일부 예에서, 마무리 일량사료는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 식물(예를 들어, 옥수수)로부터의 사일리지를 사용하여 생산되며, 여기에서 마무리 일량사료는 약 15% 내지 약 30% 사일리지를 포함한다. 따라서, 마무리 일량사료는 예를 들어 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 또는 33% 사일리지를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 마무리 일량사료는 bm1 옥수수 사일리지를 사용하여 생산된다. 일부 예에서, 적어도 1종의 섬유원을 포함하는 마무리 일량사료가 생산된다. 따라서, 마무리 일량사료는 예를 들어, 1종, 2종, 3종, 4종, 또는 4종보다 많은 섬유원을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 적어도 1종의 옥수수 부산물을 포함하는 마무리 일량사료가 생산된다. 따라서, 마무리 일량사료는 예를 들어, 1종, 2종, 3종, 4종, 또는 4종보다 많은 옥수수 부산물을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 60% 미만의 건물을 포함하는 마무리 일량사료가 생산된다. 추가의 예에서, 마무리 일량사료는 55% 미만의 건물을 포함한다. 일부 구체적 예에서, 마무리 일량사료는 50% 미만의 건물을 포함한다. 따라서, 마무리 일량사료는 예를 들어, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 또는 40% 건물을 포함할 수 있다.
C. 돌연변이체 CAD2 유전자와 1종 이상 부가적인 형질(들)의 스태킹
일부 실시양태에서, 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 1종 이상의 바람직한 형질(들)을 포함하는 식물에 도입시켜 bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형과 1종 이상의 바람직한 형질(들) 둘 모두를 갖는 식물을 생성할 수 있다. 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 1종 이상의 바람직한 형질을 포함하는 식물에(현존 식물 계통중으로의 도입에 의해, 또는 돌연변이체 CAD2 유전자를 바람직한 형질을 제공하는 부가적인 핵산 분자와 동시에 식물중으로 도입시킴으로써) 도입하는 과정을 본원에서는 "스태킹"으로 언급한다. 일부 예에서, 돌연변이체 CAD2 유전자를 1종 이상의 바람직한 형질과 스태킹함으로써, bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형을 1종 이상의 바람직한 형질과 조합시킬 수 있다. 예를 들어, bm1 형질을 bm3 형질과 스태킹하면 사일리지 소화율의 추가 증가, 및 바이오매스 가수분해에서 전처리 없이 발효가능한 당의 수율의 매우 현저한 향상이 일어날 수 있다.
bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형과의 조합에 바람직할 수 있는 형질의 예로는 제한 없이 다음의 것들이 포함된다: 세포질 웅성 불임; 식물 내병성 유전자(예를 들어, 문헌[Jones et al. (1994) Science 266:789 (클라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum)에 대한 내성을 위한 토마토 Cf -9 유전자)]; 문헌[Martin et al. (1993) Science 262:1432 (슈도모나스 시린지(Pseudomonas syringae)에 대한 내성을 위한 토마토 Pto 유전자)]; 및 문헌[Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089 (슈도모나스 시린지에 대한 내성을 위한 RSP2 유전자)] 참조); 해충에 대한 내성을 부여하는 유전자; 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 단백질, 그의 유도체, 또는 그것에 관하여 모델로 한 합성 폴리펩티드(예를 들어, 문헌[Geiser et al. (1986) Gene 48:109 (Bt δ-내독소 유전자; δ-내독소 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(미국 버지니아주 매나서스)으로부터 예를 들어, ATCC 수탁번호 40098; 67136; 31995; 및 31998하에 구매할 수 있다)] 참조); 렉틴(예를 들어, 문헌[Van Damme et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:25 (클리비아 미니아타(Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자)] 참조); 비타민-결합 단백질, 예를 들어 아비딘(국제 PCT 공개 US93/06487(해충에 대한 살유충제로서 아비딘 및 아비딘 동족체의 용도) 참조); 효소 억제제; 프로테아제 또는 프로테이나제 억제제(예를 들어, 문헌[Abe et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:16793 (벼 시스테인 프로테이나제 억제제)]; 문헌[Huub et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:985 (담배 프로테이나제 억제제 I)]; 및 문헌[미국 특허 5,494,813] 참조); 아밀라제 억제제(문헌[Sumitani et al. (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (스트렙토마이시즈 니트로스포레우스(Streptomyces nitrosporeus) 알파-아밀라제 억제제)] 참조); 곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예를 들어 엑디스테로이드 또는 유약(juvenile) 호르몬, 그의 변이체, 그것에 관하여 기반한 모방물, 또는 그의 길항제 또는 효능제(예를 들어, 문헌[Hammock et al. (1990) Nature 344:458 (유약 호르몬의 불활성화제)] 참조); 감염 해충의 생리기능을 붕괴시키는 곤충-특이적 펩티드 또는 뉴로펩티드(예를 들어, 문헌[Regan (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (곤충 이뇨 호르몬 수용체)]; 문헌[Pratt et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (디플롭테라 펀타타(Diploptera puntata)로부터의 알로스타틴)]; 문헌[미국 특허　5,266,317 (곤충-특이적 마비성 신경독)] 참조); 뱀, 말벌, 또는 여타 생물에 의해 자연에서 생성되는 곤충-특이적 독액(예를 들어, 문헌[Pang et al. (1992) Gene 116:165 (전갈 곤충독성 펩티드)] 참조); 살충제 활성을 지닌 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 또 다른 비-단백질 분자의 과축적의 원인이 되는 효소; 번역후 변형을 포함하여 생물학적 활성 분자의 변형에 관여하는 효소, 예를 들어 당분해효소; 단백질 분해 효소; 지질분해 효소; 뉴클레아제; 사이클라제; 트랜스아미나제; 에스테라제; 하이드롤라제; 포스파타제; 키나제; 포스포릴라제; 폴리머라제; 엘라스타제; 키티나제; 또는 천연 또는 합성 상관없이, 글루카나제(문헌[국제 PCT 공개 WO　93/02197 (칼라제 유전자)] 참조); 키티나제-코딩 서열을 함유하는 DNA 분자(예를 들어, ATCC, 수탁번호 39637 및 67152); 문헌[Kramer et al. (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (담배 박각시나방 키티나제); 및 문헌[Kawalleck et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:673 (파슬리 ubi4-2 폴리유비퀴틴 유전자)]; 신호 전달을 자극하는 분자(예를 들어, 문헌[Botella et 　 al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:757 (캘모둘린)]; 및 문헌[Griess et al. (1994) Plant Physiol. 104:1467 (옥수수 캘모둘린)] 참조; 소수성 모멘트 펩티드(예를 들어, 문헌[국제 PCT 공개 WO 95/16776 (진균성 식물 병원체를 억제하는 타키플레신(Tachyplesin)의 펩티드 유도체)]; 및 문헌[국제 PCT 공개 WO 95/18855 (내병성을 부여하는 합성 항미생물 펩티드)] 참조); 막 투과효소, 채널 형성제, 또는 채널 차단제(예를 들어, 문헌[Jaynes et al. (1993) Plant Sci 89:43 (트랜스제닉 식물을 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 내성을 띠게 해주는 세크로핀-β 분해 펩티드 유사체)]참조); 바이러스-침투성 단백질 또는 그로부터 유래하는 복합 독소(예를 들어, 문헌[Beachy et al. (1990) Ann. rev. Phytopathol. 28:451 (자주개자리 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 담배 줄무늬 바이러스, 감자 바이러스 X, 감자 바이러스 Y, 담배 식각 바이러스, 담배 얼룩 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스에 대한 외피 단백질-매개 내성)] 참조); 곤충-특이적 항체 또는 그로부터 유래하는 면역독소(예를 들어, 문헌[Taylor et al., Abstract #497, 분자 식물-미생물 상호작용에 관한 제7회 국제 심포지엄(Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions), 영국 스코틀랜드 에든버러, 1994) (단일쇄 항체 단편의 생성을 통한 효소 불활성화)] 참조); 바이러스-특이적 항체(예를 들어, 문헌[Tavladoraki et al. (1993) Nature 366:469 (바이러스 공격으로부터의 보호를 위한 재조합 항체 유전자)] 참조); 병원체 또는 기생충에 의해 자연에서 생성되는 발생-저지 단백질(예를 들어, 문헌[Lamb et al. (1992) Bio/Technology 10:1436 (진균 엔도 α-1,4-D-폴리갈락투로나제는 식물 세포벽 호모-α-1,4-D-갈락투로나제를 가용화시킴으로써 진균 콜로니화 및 식물 영양물 방출을 촉진한다)]; 문헌[Toubart et al. (1992) Plant J. 2:367 (엔도폴리갈락투로나제-억제 단백질)] 참조); 및 식물에 의해 자연에서 생성되는 발생-저지 단백질(예를 들어, 문헌[Logemann et 　 al. (1992) Bio/Technology 10:305 (진균성 질환에 대한 증가된 내성을 제공하는 보리 리보솜-불활성화 유전자)] 참조).
bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형과의 조합에 바람직할 수 있는 형질의 추가 예는 제한 없이 다음의 것들을 포함한다: 제초제에 대한 내성을 부여하는 유전자(문헌[Lee et al. (1988) EMBO J. 7:1241 (돌연변이체 ALS 효소)]; 문헌[Miki et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449 (돌연변이체 AHAS 효소)]; 문헌[U.S. 특허 4,940,835 및 6,248,876 (글리포세이트 내성을 제공하는 돌연변이체 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPs) 유전자)]; 문헌[미국 특허 4,769,061 및 ATCC 수탁번호 39256 (aroA 유전자)]; 글리포세이트 아세틸 트랜스페라제 유전자 (글리포세이트 내성); 스트렙토마이시즈 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토마이시즈 비리디크로모진스(Streptomyces viridichromogenes)를 포함한 스트렙토마이시즈 종으로부터의 기타 포스포노 화합물), 예컨대 문헌[유럽 출원 0 242 246] 및 문헌[DeGreef et al. (1989) Bio/Technology 7:61 (글리포세이트 내성을 제공하는 글루포시네이트 포스피노트리신 아세틸 트랜스페라제(PAT) 유전자); 피리디녹시 또는 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손 (글리포세이트 내성); 문헌[유럽 특허출원 0 333 033] 및 문헌[미국 특허 4,975,374 (L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 내성을 제공하는 글루타민 신세타제 유전자)]; 문헌[Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435 (세톡시딤 및 할록시폽과 같은 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손에 대한 내성을 제공하는 Acc1-S1, Acc1-S2, 및 Acc1-S3 유전자)]; 문헌[WO 2005012515(글리포세이트 내성을 제공하는 GAT 유전자)]; 문헌[WO 2005107437(2,4-D, fop 및 피리딜옥시 옥신 제초제에 대한 내성을 부여하는 유전자)에 기재된 것들; 및 광합성을 억제하는 제초제, 예컨대 트리아진 (psbA 및 gs+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자) (예를 들어, 문헌[Przibila et al. (1991) Plant Cell 3:169 (돌연변이체 psbA 유전자)]; (니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 4,810,648에 개시되어 있으며, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 수탁번호 53435, 67441, 및 67442하에 입수가능하다); 및 문헌[Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173 (글루타치온 S-트랜스페라제) 참조).
bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형과의 조합에 바람직할 수 있는 형질의 추가 예는 제한 없이 다음의 것들을 포함한다: 부가 가치 형질, 예를 들어 변경된 지방산 대사를 부여하거나 또는 그에 기여하는 유전자(예를 들어, 문헌[Knultzon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624 (식물의 스테아르산 함량을 증가시키기 위한 스테아릴-ACP 데새튜라제의 안티센스 유전자)] 참조); 감소된 파이테이트(phytate) 함량(예를 들어, 문헌[Van Hartingsveldt et al. (1993) Gene 127:87 (아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 피타제 유전자는 파이테이트의 분해를 증진하여, 더 많은 유리 포스페이트를 형질전환된 식물에 첨가한다)]; 및 문헌[Raboy et al. (1990) Maydica 35:383 (낮은 수준의 피틴산을 갖는 옥수수 돌연변이체의 원인이 되는 대립유전자와 관련된 DNA의 클로닝 및 재도입)] 참조); 및 예를 들어 식물을 전분의 분지화 패턴을 개변시키는 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환시킴으로써 달성된 변경된 탄수화물 조성(예를 들어, 문헌[Shiroza et al. (1988) J. Bacteol. 170:810 (스트렙토코커스 돌연변이체 프럭토실트랜스페라제 유전자)]; 문헌[Steinmetz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 20:220 (레반수크라제 유전자)]; 문헌[Pen et al. (1992) Bio/Technology 10:292 (α-아밀라제)]; 문헌[Elliot et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (토마토 인버타제 유전자)]; 문헌[Sogaard et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (보리 α-아밀라제 유전자)]; 및 문헌[Fisher et 　 al. (1993) Plant Physiol. 102:1045 (옥수수 내배유 전분 분지화 효소 II)] 참조).
D. 감소된 CAD2 활성을 갖는 식물의 기타 용도
사일리지의 생산 이외의 다수의 농학적 또는 공업적 적용은 수율이 식물 세포벽중 리그닌의 함량 및/또는 조성과 직접적으로 연관되어 있는 목적하는 식물 산물에 관계한다. 그러한 산물 및 적용의 예는 제한 없이, 제지에 사용된 산물, 및 예를 들어 바이오연료의 형태로 에너지의 생산을 포함한다. 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 식물은 bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형을 가질 수 있다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 그러한 식물로부터 유래하는 식물 산물은 동일 품종의 야생형 식물과는 구별되는 특징을 가질 것으로 기대될 수 있으며, 그 구별되는 특징은 바람직할 수 있다. 따라서, 식물에서의 기대된 bm1 또는 다른 감소된 리그닌 표현형을 이용하는 본원 개시에 따른 돌연변이체 CAD2 유전자를 포함하는 식물의 어떠한 용도도 본원 개시의 범위내에 들어온다.
하기 실시예는 특정의 특별한 특징 및/또는 실시양태를 설명하기 위하여 제공된다. 실시예는 예시된 특정 특징 또는 실시양태에 대한 개시내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
실시예
실시예 1: 두 bm1 계통으로부터 CAD2 유전자의 클로닝 및 서열분석
동계교배 계통 515 Dbm1 ( bm1 돌연변이체), 6XN442(야생형), 및 DASbm1로부터의 옥수수잎 샘플을 사용하였다. DASbm1은 CV5123/GR8207 유전적 배경에서 발견된 신규의 자연발생 bmr 돌연변이체이다. DASbm1 돌연변이가 기원한 최초의 F1 세대가 GR8207을 웅주(雄株)로 사용하여 그를 자주(雌株) CV5123와 교잡함으로써 2003년 여름 육종 교잡 블록에서 생성되었다. 당해 잡종을 2003년의 겨울 육묘장에서 자가수분시키고, 이어서 F2 이삭을 증대시켜 F2 종자를 생성하였다. F2 집단을 2004년 여름에 심은 다음, 알곡 시험으로의 전진을 위해 60개의 자가수분 이삭을 선발하였다. 이들 60개 이삭을 2004년에 자가수분을 위해 겨울 육묘장으로 보내 고-포워드(go-forward) S2 이삭 선발을 하였다. S2 이삭을 이어서 2006년 여름 육묘장에 심었다.
bmr 돌연변이체는 육묘장을 거닐면서 동계교배 계통을 관찰하다가 발견되었다. 뚜렷한 BMR 표현형을 나타내는 열이 동종되었다. 당해 열은 CV5123/GR8207-B 집단으로부터 선발된 60개 이삭중의 이삭 31이었고, BMR 형질을 갖는다는 것을 제외하면 선발된 다른 59개 이삭과 식물 구조에 있어서 매우 흡사하였다. 처음에는 그 돌연변이체가 bm3, bm1, 또는 다른 돌연변이인지를 결정할 수 없었다. S2 식물을 이어서 자가수분하고, 채종하여 보관하였다. 2007년 여름, S3 종자를 심었으며, 모든 식물은 여전히 BMR 형질을 나타내었다. S3 식물을 자가수분시켜 S4 이삭을 생성하였으며, 그 계통은 사일리지 생산용으로 가능한 중요성이 있어 보였다. 2008년 여름에, 기지의 bm1 및 bm3 동계교배 계통 둘 모두에 대하여 검정 교잡을 행하여 bmr 돌연변이체의 백그라운드를 측정하였다. 2009년 여름에, 검정 교잡 종자를 후대 검정에서 성장시켰으며, bm1 동계교배를 가지고 행한 후대 검정에서 모든 식물이 BMR 형질을 발현하였고, 반면에 bm3 자손은 모든 식물이 비-BMR인 것으로 나타났으므로 그 돌연변이는 새로운 bm1 돌연변이인 것으로 결정되었다. 이어서 CV5123/GR8207 NIL, 515 Dbm1 동계교배, 및 다양한 유전적 배경으로부터의 이형접합성 및 널 식물로부터 잎 조직을 샘플링하여, 마커 작업을 포함한 분자유전학적 분석에 투입하여 DASbm1 bmr 돌연변이체의 정확한 특질을 측정하였다.
옥수수잎 샘플을 지노그라인더 2000(Genogrinder 2000, 스펙스 서티프렙(SPEX CertiPrep), 미국 뉴저지주 메투첸)을 사용하여 고운 분말로 분쇄하였다. DNA를 표준 2.5% CTAB(세틸 트리메틸암모니움 브로마이드) DNA 추출 프로토콜로 추출하였다. PCR에 앞서, DNA 샘플을 제조업자의 지시에 따라 퀀트-잇 피코그린 퀀티피케이션 키트(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드)로 정량하였다.
옥수수 동계교배 계통인 옥수수 B73로부터의 CAD2 게놈 서열을 진뱅크(Genbank)(진뱅크 수탁번호 AC230031)로부터 입수하였다. 당해 서열은 대략 5.9 kb 길이이고 1.7 kb 프로모터, 4개 엑손, 3개 인트론 및 짧은 터미네이터를 포함하였다. 프라이머를 B73 서열에 기반하여 설계하고, PCR 반응을 에이비아이 진앰프 피시알 시스템 9700(ABI GeneAmp PCR System 9700, 어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터시티)을 사용하여 수행하였다. 반응은 2.5 단위의 다카라 라 택(TaKaRa LA Taq, 다카라 바이오 인코포레이티드(Takara Bio Inc.), 일본 시가), 400 nM의 dNTP, 200 nM의 순방향 및 역방향 프라이머, 및 30 ng의 게놈 DNA를 함유하였다. 하기 PCR 프로그램이 사용되었다: PCR을 94℃에서 2분 동안의 변성 단계로 개시한 다음; 이어서 94℃에서 45초, 55℃에서 45초 및 72℃에서 2분 동안의 30 사이클이 후속되었다. PCR 산물을 2% 이-겔(E-Gel)상에서 가시화하고, 이어서 퓨어링크(PURELINK)TM 고속 겔 추출 키트(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 추출하였다. 정제된 PCR 산물을 이어서 직접 서열분석을 위해 유로핀스 엠더블유지 오페론(Eurofins MWG Operon, 미국 앨라배마주 헌츠빌)으로 보냈다. 서열은 시?처 4.8(Sequencher 4.8, 미국 미시간주 앤 아버)을 사용하여 분석하였다. 돌연변이는 bmr 돌연변이체 및 6XN442로부터 증폭시킨 CAD2 서열을 옥수수 B73에 대해 수록된 서열과 비교함으로써 동정하였다.
3개의 상당히 큰 인트론 및 일부 독특한 서열 특징(예를 들어, 인트론 3에서의 82-bp TA 단순 반복체)의 존재에 기인하여, 하나의 5.9 kb 단편내 CAD2 유전자를 증폭하려는 초기 시도는 실패하였다. 그에 따라, 일련의 네스팅(nested) PCR 프라이머를 설계하고(표 1 참조) 이를 사용하여 515 Dbm1 및 야생형 계통으로부터 7종의 중첩성 CAD2 단편을 성공적으로 증폭시켰다. 도 1. 7종의 단편으로부터 515Dbm1 및 야생형 계통에 대한 전장 CAD2 서열을 조립하였다. 515 Dbm1 및 4XN442에 대한 게놈의 예측된 cDNA 및 단백질 서열을 서열 1 내지 6으로서 수록하였다.
7종의 중첩성 게놈 CAD2 PCR 단편에 대한 프라이머 및 길이 정보
단편 순방향 프라이머 역방향 프라이머 단편 길이 (bp)
F5-R5 서열 9 AATGCACGATGTCAACTCTCTTGCCTATAA 서열 10 AATTTTCTCATGAAAACGCTGAAACTGC 3327
2933F-2933R 서열 11 TGAGCACAAACGGTTAACACAC 서열 12 ATTGTATCAGTTCACGGTGGTG 566
3268F-3268R 서열 13 CACACCAACCACAATAATAAGCTAATACTC 서열 14 AACGATCACCCCGACGCCTACC 426
3479F-3479R 서열 15 CCACCGTGAACTGATACAATAACAATAAAG 서열 16 ACACTGCATGCAAGATAACGCTGAAAATAA 427
3742F-3742R 서열 17 TGCAACAAGAAGATCTGGTCAT 서열 18 TCATACCGTACTTTCCACATCAA 500
3996F-3996R 서열 19 TTTTGCGAGAAGTGGACGAGATAAGGT 서열 20 AATGTTGTTGGAGGTAGGTGGTGTGGTTT 468
BM11C1-R14 서열 21 GAGAAATGAGGATAACTTTCTCCATCGTT 서열 22 CTATAGACGAGACAGAAGGGAACGGATTTG 1364
515 Dbm1 돌연변이체 CAD2을 야생형(6XN442) 및 bm1(B73)의 것들과 비교한 결과 15개 SNP 및 8개 삽입/결실이 존재하는 것으로 밝혀졌다. bm1 돌연변이체의 엑손 3에 위치한 AC 디뉴클레오티드 삽입(515 Dbm1중 뉴클레오티드 3994-3995), 및 제4 엑손에 위치한 G/A SNP(515 Dbm1중 뉴클레오티드 5410)을 제외하고는, 이들 변화의 대부분은 프로모터 영역 또는 인트론에 위치하였다. 도 3 및 4 참조. 515 Dbm1중의 AC 삽입은 삽입의 52-bp 하류에 프레임 시프트 및 미성숙 종결 코돈을 생성하며, 이는 야생형 CAD2 경우의 367개 아미노산과 대비하여 훨씬 더 짧은 CAD2 단백질(515 Dbm1 CAD2의 경우 147개 아미노산)을 초래하였다. 도 4. 단축 515 Dbm1 CAD2 단백질은 생성된다 치더라도 십중팔구 비-기능성인데, 그 이유는 NADPH-결합 및 C-말단 촉매 도메인이 결여되어 있기 때문이다.
표 1에 나타낸 동일한 7종 프라이머 쌍을 사용하여 DASbm1로부터 중첩성 CAD2 단편을 증폭시키고자 시도하였으며, 6쌍이 기대된 단편을 증폭하였다. 그러나, 심지어는 여러 번의 시도 후에도, F5/R5 쌍은 기대된 3327-bp 단편, 또는 심지어는 어떠한 특이적 PCR 산물도 증폭시키지 못하였다. 따라서, 부가적인 네스팅 PCR 프라이머를 설계하여(표 2 참조), 결여된 3327-bp 단편의 5' 말단 2757-bp을 성공적으로 증폭시켰다. 그러나, 본 발명자들은 다수의 프라이머 쌍 및 PCR 조건을 사용하고도 3' 말단(대략 570-bp)을 증폭시킬 수 없었다. 결여된 570-bp 갭을 제외하고는, DASbm1로부터의 증폭된 5346-bp CAD2 게놈 서열은 B73의 것과 동일하다. 본 발명자들은 이것이 BMR 표현형에 대한 분자적 변화를 함유한 영역이라고 생각했다.
결여된 DASbm1 게놈 CAD2 PCR 단편의 5' 말단에 대한 프라이머
단편 순방향 프라이머 역방향 프라이머 단편 길이 (bp)
F5-149R 서열 9 AATGCACGATGTCAACTCTCTTGCCTATAA 서열 26 TGGGTTGAGAAATTGGGTAAGTGC 837
547F-547R 서열 27 TGCCCGGTCCAATCTTTCTTA 서열 28 CGTCTTTCGAGGAGGTCTAC 657
1022F-1022R 서열 29 CGTTTGGTATCGTCCGAGTTGTGT 서열 30 GCCGGGTAGTGCGATCTTTCTGG 626
1501F-1501R 서열 31 AGATCATGCTGGAAAGGTAGTAGG 서열 32 TGATCGAAAATATGCCCCAAGTC 600
1955F-1955R 서열 33 ACGCGCCTCCTCCAGTAGTTCTCC 서열 34 CAAGTTCACACGCTGCTGGGTCTG 763
예측된 엑손 1 및 엑손 3을 포함하는 프라이머를 설계한 다음(CVF: GTCCGAGAGGAAGGTGGTC(서열 35); 및 CVR: GGCCGTCCATCAGTGTAGA(서열 36)), 이어서 이들을 사용하여 DASbm1, 515 Dbm1 및 6XN442로부터 CAD2 cDNA 단편을 증폭시켰다. 예상한 대로, 375-bp의 단편이 515 Dbm1 및 6XN442로부터 증폭되었다. 한편, DASbm1로부터의 PCR 산물은 현저히 더 큰 것으로 밝혀졌다. 서열분석 결과는 DASbm1로부터의 CAD2 cDNA은 내재성 엑손 1과 엑손 2 사이에 가외의 409-bp 삽입을 함유하고 있음을 밝혀주었다. 도 4. B73 게놈에 대한 블라스트 검색은 DASbm1중의 409-bp cDNA 삽입이 십중팔구, 몇몇 인트론을 함유하고 있는 1번 염색체상에 위치한 추정상의 트랜스포손/반복성 유전자(GRMZM2G017736)의 부분으로부터의 RNA 스플라이싱의 결과임을 시사하였다.
DASbm1 및 그의 가능성 있는 게놈 공급원에서 관찰된 409-bp cDNA 삽입에 기반하여, 부가적인 PCR 프라이머를 설계하여(표 3 참조), 이들을 사용하여 DASbm1로부터 CAD2의 키메라 게놈 영역을 증폭시켰다. 도 1. 서열분석 결과는 게놈 삽입이 3444-bp 길이이고, DASbm1로부터 증폭된 총 게놈 CAD2이 9360-bp임을 보여준다. DASbm1, B73, 515 Dbm1, 및 6XN442로부터의 게놈 CAD2의 정렬을 도 3에 나타내었다. 3444-bp 삽입을 제외하고는, DASbm1로부터의 나머지 CAD2 서열은 B73의 것과 동일하다. 3444-bp DASbm1 트랜스포손 삽입은 본원에서 서열 40으로서 기재된다.
DASbm1 CAD2의 키메라 게놈 영역에 대한 PCR 프라이머
단편 순방향 프라이머 역방향 프라이머 단편 길이 (bp)
2687F-2643R 서열 37 TATGGGTACTGCTCCTGCAC 서열 38 CCTTGCAGCAGAACCACTG 2725
2132F-R5 서열 39 AGAATATCATTAGCAGCCAGA 서열 10 AATTTTCTCATGAAAACGCTGAAACTGC 1890
DASbm1 중 삽입의 게놈 특질
도 2에 나타낸 바와 같이, DASbm1중 삽입의 부위는 CAD2의 내재성 인트론 1에 위치한다. 3444-bp 삽입 서열을 좀더 면밀히 검사한 결과 서열 TACTGATATCT(서열 41)를 갖는 마지막 11개 염기는 삽입의 바로 상류에 위치한 CAD2의 인트론 1로부터의 11-bp 서열의 직접적인 복제품임이 밝혀졌다. 도 2. 이들 직접 반복물은 그 삽입이 십중팔구 DNA 트랜스포손 활성에 기인함을 나타낸다.
B73 게놈 서열에 대한 3433-bp 삽입(11-bp 직접 반복물 없음)을 사용한 블라스트 검색 결과는 상이한 염색체상에서의 다수 상동성 히트(homologous hit)를 보여주며, 이는 서열의 반복적 특질을 나타내는 것이다. 그러나, DASbm1 삽입물중 242-bp 미싱 갭(missing gap)을 제외하고는, 1번 염색체상에서의 오직 하나의 히트(옥수수 B73 RefGen_v1, 뉴클레오티드 위치 148086176-148089850)만이 전체 길이에 걸쳐서 100% 동일하다. 도 4. 다른 히트는 100% 미만으로 동일하고, 단지 삽입물의 일부와 매치될 뿐이다. CAD2는 5번 염색체상에 위치하므로, DASbm1 중의 삽입물은 십중팔구 1번 염색체중의 그의 최초 위치로부터 절단되어 트랜스포손 활성을 통해 CAD2중으로 재삽입된다. 242-bp 미싱 갭은 B73 게놈과 DASbm1 (CV5123/GR8207) 게놈간의 차이를 반영할 수 있거나, 또는 전좌 도중의 결실에 기인한 것일 수 있다.
다수의 상응하는 전장 ESTs(예를 들어, EU976746 및 EU976335)이 데이터베이스에서 발견되므로, 예측된 유전자(GRMZM2G017736)는 3433-bp 삽입 서열내에 위치하고 정상 옥수수 식물에서 명백하게 전사된다. GRMZM2G017736중의 예측된 ORF은 일반적으로 좀더 큰 단백질인 트랜스포사제의 다수의 hAT(초파리로부터의 h obo, 옥수수로부터의 A c, 및 금어초로부터의 T am3의 앞글자를 딴 두문자어) 일족과 고도의 상동성을 보이는 167개 아미노산으로 이루어진 소형 단백질을 코딩한다. 단축 167 아미노산 단백질은 전장 트랜스포사제에서 정상적으로 발견되는 BED 징크-핑거 DNA 결합 도메인(Pfam02892)이 결여되어 있기 때문에, 3433-bp 단편은 좀더 그럴싸하게는 전좌를 위해 다른 곳에 Ac 요소의 존재를 요하는 Ds 요소이다.
일단 5번 염색체상의 CAD2 좌위에서, 삽입과 CAD2는 키메라 유전자를 형성한다. 삽입은 409-bp의 3개 엑손중으로 스플라이싱되어 내재성 CAD2 엑손과의 키메라 mRNA를 형성한다. 도 2 및 4. 삽입의 처음 1158-bp 단편은 CAD2의 제1 인트론의 5' 말단 927-bp와 함께 키메라 인트론으로서 스플라이싱되며, GRMZM2G017736의 완전한 예측된 ORF는 1204-bp 인트론의 일부로서 스플라이싱되고, 삽입의 마지막 463-bp 단편은 CAD2의 제1 인트론의 3' 말단 231-bp와 함께 키메라 인트론으로서 스플라이싱된다. 도 2.
트랜스포손 삽입은 DASbm1 CAD2에서 미성숙 종결을 일으킨다.
전술한 바와 같이, DASbm1에서의 트랜스포손 삽입은 내재성 CAD2 엑손 1과 엑손 2 사이에 가외의 409-bp를 갖는 키메라 mRNA로서 전사되는 키메라 유전자를 생성한다. 도 4. 이 가외의 409-bp 서열은 프레임 시프트 및 미성숙 종결 코돈을 생성할 것으로 예측되며, 이는 (야생형 단백질의 경우 367개 아미노산에 대비하여) 단지 48개 아미노산으로 이루어진 훨씬 더 짧은 CAD2 단백질을 초래하게 된다. 도 5. 515 Dbm1의 단축 CAD2 단백질과 마찬가지로, 48개 아미노산 DASbm1 CAD2는 생성된다손 치더라도 십중팔구 비-기능성인데, 그 이유는 NADPH-결합 및 C-말단 촉매 도메인을 결여하고 있기 때문이다.
실시예 2: CAD2 대립유전자-특이적 PCR -기반 고-처리량 검정 설계 및 검증
돌연변이체 대립유전자를 야생형 대립유전자와 구별하기 위하여 515 Dbm1 ZmCAD2의 엑손 3에서의 AC 삽입에 기반하여 카스파TM 검정을 설계하였다. bm1 돌연변이를 갖지 않는 32개 야생형 동계교배 계통, 및 bm1 돌연변이를 함유하는 분리 집단을 제조업자(케이바이오사이언시즈, 영국 허트포드셔 호디스던)로부터 입수한 프로토콜에 따라 시험하였다.
AC 삽입을 둘러싸는 서열에 기반하여, 515 Dbm1 CAD2 대립유전자를 다른 bm1 및 야생형 CAD2 대립유전자와 구별하는 데 사용될 수 있는 고-처리량 카스파TM 마커 검정을 위하여 3종의 올리고를 설계하였다(서열 42 (AC_R1); TCAGTCTCAAGAACTCACTTCTGG, 서열 43 (AC_A1); GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTGATGGACGGCCCACA 및 서열 44 (AC_A2); GAAGGTCGGAGTCAACGGATT ACTGATGGACGGCCCACG). 도 8.
카스파TM 검정을 먼저 32개 야생형 동계교배 및 bm1 돌연변이체 계통 515 Dbm1의 패널로 검증하였다. 당해 분석은 비-bm1 계통이 AC 삽입을 함유하고 있지 않음을 나타내었다. 검정을 이어서 3종의 유전자형: 동형접합성 야생형; (515 Dbm1 AC 삽입을 함유하는) 동형접합성 bm1; 및 이형접합성중 하나를 보유한 bm1 옥수수 계통의 분리 집단에서 검증하였다. 도 9. 카스파 마커는 동형접합성 bm1 및 이형접합성 집단내 bm1 AC 삽입을 검출하였다. 더욱이, 당해 고-처리량 검정은 동형접합성 bm1, 이형접합성, 및 동형접합성 야생형 집단을 상호간에 구별해내었다. 이에 따라, 이들과 같은 마커를 사용하여 515 Dbm1로부터의 bm1을 함유하는 것으로 추정되는 식물에서 bm1 유전자형에 대한 접합성의 정확한 동정을 신속하게 제공할 수 있다. 따라서 검정을 bm1 배형질의 동정, bm1 형질의 유전자이입 촉진 및 사일리지의 소화율을 향상시키거나 또는 에탄올 수율을 증가시기기 위하여 bm1을 사용하는 분자 육종에 사용할 수 있다.
본 발명자들은 또한 DASbm1, 515 Dbm1, 및 야생형 CAD2 대립유전자의 전부를 상호 식별하기 위한 새로운 택맨TM 검정을 개발하였다. DASbm1 및 515 Dbm1을 위해 사용된 프라이머 및 프로브를 각각 표 4 및 표 5에 수록하였다. DASbm1는 대형 트랜스포손 삽입을 보유하고 있기 때문에, 적당한 PCR 산물이 표준 택맨TM 검정 조건하에서 증폭되도록 DASbm1(DASbm1_F) 및 야생형(Wt CAD2_F)에 대한 별도의 순방향 프라이머를 설계하였다. DASbm1중 트랜스포손 삽입, 515 Dbm1중 AC 삽입, 및 야생형 CAD2 서열에 기반하여, 택맨TM 검정을 위한 프라이머 및 프로브를 프라이머 익스프레스 3.0(Primer Express 3.0)을 사용하여 설계하였다. 프라이머 및 FAM 또는 VIC와 마이너 그로우브 바인딩 넌 플루오레슨스 ?처TM(Minor Grove Binding Non Fluorescence Quencher)TM I (MGBNFQ) 염료로 이중-표지한 프로브를 어플라이드 바이오시스템즈(미국 캘리포니아주 포스터시티)에서 합성하였다. 올리고를 1x 트리스(Tris)-EDTA에 100　μM이 되도록 용해시켰다. 택맨TM 유전자형결정 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터시티, 카탈로그 번호 4371355)를 모든 PCR 반응에 사용하였다. 아이사이클러(iCycler)TM 광학 시스템(바이오래드(BioRad), 미국 캘리포니아주 허큘리즈)상에서 96-웰 플레이트를 사용하여, 권장하는 대로 95℃에서 15분의 변성반응으로 개시하고 이어서 92℃에서 15초 및 60℃에서 1분으로 이루어지는 50 사이클을 수행하는, 25 ㎕ 용적에서의 실시간 PCR 반응을 셋업하였다. 형광 신호를 각 사이클의 말기에서 기록하였다.
DASbm1와 야생형을 식별하기 위한 택맨TM 검정에 대한 프라이머 및 프로브
올리고뉴클레오티드 서열
DASbm1_프로브 6FAM - AGGCTTACTGATATCTG (서열 47)- MGBNFQ
Wt CAD2_프로브 VIC - CTGCAGATATCAGTAGTTACG (서열 48)- MGBNFQ
DASbm1_F GCCGGATTGTGACCCATTAT (서열 49)
DASbm1_R CGCGACAGGCGGTAGGTA (서열 50)
Wt CAD2_F GCAGCGTGTGAACTTGTAGGTAA (서열 51)
515 Dbm1와 야생형을 식별하기 위한 택맨TM 검정에 대한 프라이머 및 프로브
올리고뉴클레오티드 서열
515Dbm1_프로브 6FAM - ACGGCCCACACGC (서열 52)- MGBNFQ
Wt CAD2_프로브 VIC - ACGGCCCACGCAGG (서열 53)- MGBNFQ
bm1_F GGTCATACAACGACGTCTACACTGA (서열 54)
bm1_R ATGGTGGAGGCGAATCCA (서열 55)
표 4 및 5에 기재된 프라이머를 사용한 대립유전자 식별 검정의 결과를 도 10에 도시하였다. 이들 검정 및 카스파TM 마커는 직접적으로 CAD2중 bm1 돌연변이에 기반하기 때문에, 그들은 이용가능한 간접 bm1 마커보다 좀더 정확한 유전자형결정을 제공할 것이다.
실시예 3: 단축성 CAD2 돌연변이를 보유한 bm1 옥수수의 특징
DASbm1은 신규 bm1 돌연변이를 나타내기 때문에, BMR 표현형을 가진다는 것을 제외하고는 DASbm1에 관해서는 아무것도 알려진 바가 없다. 본 발명자들은 DASbm1 식물에서의 RNA 발현 수준과 리그닌 함량을 조사하여, 515 Dbm1 및 야생형(6XN442) 식물의 것들과 비교하기로 하였다. 515 Dbm1 및 DASbm1 식물은 이들 두 옥수수 계통의 CAD2 유전자에서의 돌연변이, 및 그에 따른 CAD2의 미성숙 종결에 기인하여 현저히 감소된 CAD 활성을 가질 것으로 기대되었다. 또한, 515 Dbm1 및 DASbm1 식물은 감소된 CAD2 전사산물량을 가질 것으로 가정하였다.
DASbm1, 515 Dbm1, 및 6XN442 식물을 온실에서 생육시켰다. 잎 조직을 4주령 식물로부터 수확하여 주맥 조직을 분리하였다. 샘플을 액체 질소에서 고운 분말로 분쇄한 다음 카이아진 알엔이지(Qiagen's RNeasy)TM 식물 미니 키트로 추출하였다. 인비트로젠사의 수퍼스크립트TM III 원-스텝 알티-피시알(SuperScriptTM III One-Step RT-PCR) 키트 및 바이오래드사의 아이사이클러TM를 정량적 RT-PCR에 사용하여 RNA 발현 수준을 측정하였다. CAD2의 제4 엑손에 기반하여 CAD2 -특이적 올리고를 설계하였고, 옥수수 인버타제를 델타-델타 CT 계산을 위한 대조군으로 사용하였다.
CAD2 RNA 발현 수준을 비교하기 위하여, CAD2의 제4 엑손 및 옥수수 인버타제에 기반한 하기 프라이머/프로브를 정량적 RT-PCR용으로 설계하였다. 표 6.
CAD2 qRT-PCR용 프라이머 및 프로브
올리고뉴클레오티드 서열
CAD2_F CCACATGGGCGTGAAGGTA (서열 56)
CAD2_R TTCTTGGACGACGAGCTGATC (서열 57)
CAD2_E프로브 6FAM - ATGGGCCACCACGTGA (서열 58) - MGBNFQ
INV59F ATGGTGGAGGCGAATCCA (서열 59)
INV59R TGCCGTCCGTGCCCT (서열 60)
INV_프로브 VIC - CCGTGTACTTCTACCTGC (서열 61) - MGBNFQ
도 6에 나타낸 바와 같이, bm1 식물은 원인(underlying) 돌연변이와는 관계없이 잎 조직의 나머지보다 훨씬 더 높은 수준의 CAD2 발현을 보인다. 그 차이는 6XN442, 515 Dbm1, 및 DASbm1에 대하여 각각 4.1, 8.0, 및 3.4배이다. DASbm1 및 515Dbm1 계통 둘 모두는 현저히 더 적은 CAD2 발현을 보이는데, DASbm1의 경우 주맥에서 91% 및 잎에서 89%의 평균 감소를 보이고; 515 Dbm1의 경우 주맥에서 87%, 및 잎에서 93%의 평균 감소를 보인다. 그러나, 두 bm1 돌연변이체간에 유의차는 없다. 도 6. 이들 결과는 옥수수 bm1(Halpin et al. (1998), 상기 참조), 및 수수 돌연변이체 bmr6(Saballos et al. (2009), 상기 참조)에 대하여 문헌에 보고된 것과 일치한다. RNA 발현의 감소는 십중팔구, 식물 및 기타 종에서 이전에 관찰된 메커니즘인, 515 Dbm1 및 DASbm1 돌연변이체에서 미성숙 CAD2 단백질을 생성하는 넌센스 돌연변이에 의해 매개된 RNA 분해에 기인한다. [Conti and Izaurralde (2005) Curr Opin Cell Biol. 17:316-25].
돌연변이체 및 야생형 식물의 상대적인 리그닌 함량을 비교하기 위하여, 분쇄된 잎과 절간을 FTIR 분광 분석에 투입하였다.
브루커 버텍스(Bruker Vertex) 분광계(브루커 옵틱스 인코포레이티드(Bruker Optics Inc.), 미국 매사추세츠주 01821 빌레리카 매닝 파크 포츈 드라이브 19)를, 다이아몬드 결정을 갖춘 감쇠 전반사(Attenuated Total Reflectance, ATR) 미러클(Miracle) 샘플링 액세서리(파이크 테크놀로지스(Pike Technologies), 미국 위스콘신주 매디슨)와 같이 사용하여 푸리에 변환 적외선 측정을 수행하였다. 분광계에는 4 cm-1 해상력 및 0.32 cm/s 미러 속도로 작동하는 중수소화 트리글라이신 술페이트(DTGS) 검출기가 장착된다. 푸리에 전환에 앞서 256개 간섭그림(interferogram)을 함께 가하였다. 장치를 스펙트럼의 획득에 앞서 5 min 동안 질소 가스(1등급)로 퍼지시켜 대기 이산화탄소 및 수증기에 기인한 스펙트럼 기여를 최소화하였다. ATR 미러클 세포 샘플링 액세서리는 FTIR 분광계에 사용하기 위해 설계된 단일-바운스 다이아몬드를 구비한다. 적외선 빔의 침투 깊이는 1.46 미크론이다. 이 액세서리의 주요 장점은 다중-바운스 HATR 액세서리에 비하여 좀더 작은 샘플 용적을 요한다는 것이다.
잎(7번째와 8번째, 9번째와 10번째) 및 절간(1번째와 2번째, 7번째와 8번째, 9번째와 10번째)을 온실 재배된 옥수수 식물로부터 개화(開花) 직후 채집하고, 동결건조한 다음, 고운 분말로 분쇄하였다. 소량의 샘플을 데이터 획득을 위해 직접 ATR의 다이아몬드 결정 위에 올려놓았다. 스펙트럼을 800 내지 1800 cm-1의 지문 영역에서 수집하였다. 모든 샘플의 단일-빔 스펙트럼을 수득하였으며, 스펙트럼 데이터는 공기의 백그라운드 스펙트럼의 비율로서 흡광도 단위로 제시된다. 매 측정 후, ATR 결정을 철저히 소제하여 건조시키고, 그의 스펙트럼을 검사하여 이전 획득으로부터의 샘플 잔사가 결정 표면상에 보유되지 않도록 보장하였다. 모든 스펙트럼을 베이스라인 보정하고, 면적을 정규화하여 있을지도 모르는 스펙트럼 인공물(artifact)을 제거하였다.
샘플중의 리그닌 함량은 FTIR 상대적인 흡광도와 직접 비례한다. 예상대로, 두 돌연변이체 모두에서 CAD2 RNA 발현의 감소는 현저히 감소된 리그닌 함량을 초래한다. 도 7. 평균하여, 야생형 6XN442와 비교시 총 리그닌 함량 감소는 DASbm1에서 대략 24%(P=0.03) 및 515 Dbm1에서 30%(P=0.006)이었다. 두 bm1 돌연변이체간에 유의차는 없었다(P=0.4).
옥수수에서의 bm1 돌연변이는 현저히 감소된 리그닌 함량 및 개변된 리그닌 조성과 관련이 있는 잎 주맥의 적갈색 색소침착을 보인다. 이 표현형은 새로 나온 잎 및 기타 조직에서 V6기부터 더 나중의 기에 걸쳐서 알아볼 수 있다. 본 발명자들은 이제 두 독립적인 bm1 돌연변이체(DASbm1 및 515 Dbm1)의 분자 기반을 확인하였다. 특이적 돌연변이에 기반하여, 본 발명자들은 또한 상이한 대립유전자를 검출하기 위한 고-처리량 PCR 검정을 개발하였다. 전술한 결과는 ZmCAD2이 515 Dbm1 및 DASbm1에서의 bm1 돌연변이에 대한 원인 유전자임을 입증해보이고, 관찰된 표현형에 대한 분자 기반을 제공한다. bmr 돌연변이는 다수의 단자엽식물 종 사이에서 일반적이기 때문에, 전술한 돌연변이 및 마커는 또한 다른 농작물; 예를 들어, 수수, 사탕수수, 기장, 벼, 및 바이오에너지 종, 예컨대 스위치그래스에도 사용될 수 있다.
실시예 4: 트랜스진에 대한 가시적인 선별 마커로서 갈색 주맥1( bm1 )
이그잭트 프리시전 테크놀러지(EXZACT Precision Technology)는 임의의 DNA 서열을 정밀하게 표적화하고 유전자 붕괴, 편집 또는 유전자 첨가를 통해 게놈을 정확하게 변형시키는 것으로 나타난 징크-핑거 조작 기술이다. 이그잭트 프리시전 테크놀러지 및 최근의 bm1 발견을 토대로, 두 택일적 연구법을 실행하여 트랜스제닉 식물을 그들의 널 분리체(null segregant)와 구별하기 위한 가시적인 선별 마커를 생성할 수 있다. 가시적인 마커는 그 분야의 육종가 및 과학자로 하여금 분리 집단(예를 들어, T1)에서 트랜스제닉 개체를 신속하게 동정해내고 그들을 세부적인 분자 작업 및 스피드업 트랜스제닉 파이프라인 스크리닝 과정 없이 널과 비교할 수 있게 해줄 것이다. 고-처리량 검정이 또한 이용가능하며 필요하다면 가시적인 관찰의 확인에 이용될 수 있다.
첫 번째 대표적인 연구법에서는, 돌연변이체 bm1 옥수수(DASbm1 또는 515Dbm1)를 형질전환을 위한 표적 배형질로서 사용할 수 있다. 분자 육종을 통해, bm1 돌연변이를 CAD2-기재 마커를 사용하여 현재의 형질전환 배형질(B104)중으로 도입시킬 수 있다. 동일 구축물중의 Wt CAD2 및 관심의 대상이 되는 유전자(GOI)는 이그잭트 프리시전 테크놀러지에 의해 내재성 돌연변이체 cad2 좌위에로 표적화된다. bm1 돌연변이는 열성이기 때문에, GOI-WtCAD2에 대하여 동형접합성 또는 이형접합성인 식물은 정상적인 색소침착을 보이는 반면에, 널 분리체는 갈색 주맥 표현형을 보인다. 이는 또한 이그잭트 프리시전 테크놀러지 없이도 효과가 있지만, 게놈중 트랜스진 삽입 부위는 무작위적이다. 대체 실시양태는 DASbm1중의 트랜스포손 삽입 또는 515Dbm1중 내재성 돌연변이체 cad2 좌위에서의 AC 삽입을 결실시키고 이와 동시에 (GOI와 bm1 마커의 현저한 분리를 방지하기 위하여) 인접한 좌위중으로 GOI을 삽입시키는 1종 이상의 징크-핑거 단백질(들)의 조작을 포함한다. 이렇게 하면 트랜스제닉 구축물에서의 Wt CAD2에 대한 필요성이 제거된다.
두 번째 대표적인 연구법에서는, Wt 식물을 형질전환을 위한 표적 배형질로서 사용한다. GOI는 이그잭트 프리시전 테크놀러지를 이용하여 내재성 Wt CAD2 좌위에로 표적화시킬 수 있다. 삽입의 부위는 DASbm1에서의 트랜스포손 삽입, 515Dbm1에서의 AC 삽입 또는 단백질을 비-기능성이 되게 하는 CAD2 좌위내 임의 위치와 동일할 수 있다(CAD2의 기능성 도메인은 주지임). 이 경우에, 트랜스진에 대해 동형접합성인 식물은 갈색 주맥 표현형을 보이는 반면에 이형접합체와 널은 정상적인 색소침착을 보인다. 갈색 주맥 및 관련된 표현형은 유익하고, 이그잭트 프리시전 테크놀러지를 사용하여 BM1(CAD2) 및/또는 BM3(카페인산 O-메틸트랜스페라제) 좌위를 표적화할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow Agrosciences Chen, Wei Van Opdorp, Nathan Kumpatla, Siva P Friedmann, Peter Greene, Thomas W Fitzl, Dennis <120> GENE AND VARIATIONS ASSOCIATED WITH BM1 PHENOTYPE, MOLECULAR MARKERS, AND THEIR USE <130> 2971-p10109.1US <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5924 <212> DNA <213> Zea mays <400> 1 aatgcacgat gtcaactctc ttgcctataa ttatgttcaa actctcgtca ataatagtag 60 ctagtgctgt tattgtaaag tatcgctaaa atatgcatat atacttataa cttatccatg 120 ttaaagaaaa tcgaatatgc tagcaaagac atatgggccc gttgaggaga gctacgttac 180 atttgatttc taggagaaag cagagtgaag agctggtgaa aatcgattct ctattatctt 240 cactagaata taaatgaagc acatttttag ctccagctct tagtgcaaat agagaaactc 300 tcctaattgt agcatgaatg agatgacatt ataaaagcct ttgatgagat tttcttccga 360 gaagctgaag ctcctcagat agcccaatga tatgtatgta agtgtatttt tttttaaaaa 420 aagcgggcaa atgaaactaa atcatcctat cccctttaat atactgagat gccaattagt 480 tggttgccag ccggagtatg gtggatggga tcctcctatt ggttaaatta tgaatgaatt 540 gtttggttgc ccggtccaat ctttcttatg 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Ser Ser Thr Arg 130 135 140 Ser Leu Trp 145 <210> 4 <211> 5898 <212> DNA <213> Zea mays <400> 4 aatgcacgat gtcaactctc ttgcctataa ttatgttcaa actctcgtca ataatagtag 60 ctagtactgt tattgtaaag tatcgctaaa atatgcatat atacttataa cttatccatg 120 ttaaagaaaa tcgaatatgc tagcaaagac atatgggccc gttgaggaga gctacgttac 180 atttgatttc taggagaaag cagagtgaag agctggtgaa aatcgattct ctattatctt 240 cactagaata taaatgaagc acatttttag ctccagctct tagtgcaaat agagaaactc 300 tcctaattgt agcatgaatg agatgacatt ataaaagcct ttgatgagat tttcttccga 360 gaagctgaag ctcctcagat agcccaatga tatgtatgta agtgtatttt ttttaaaaaa 420 agcgggcaaa tgaaactaaa tcgtcctatc ccctttaata tactgagatg ccaattagtt 480 ggttgccagc cggagtatgg tggatgggat cctcctattg gttaaattat gaatgaattg 540 tttggttgcc cggtccaatc tttcttatgt ctgtttcgtt tagatcgtgt acaccacttc 600 ttattgttta aatggccaat ttaatcgggg cctaaacgac atatgtgcct caatttacca 660 taccaatgat gccgcttacg tgaatagttg aataccgata ctactactac cgcacgcgtc 720 atggtttaac cttttaacag ttggattgaa acatcagcga ccactcggca cttgggtgac 780 aatttgtcac acacctcgta gtcgagtgga aatgcactta cccaatttct caacccataa 840 gactatttcc agcatctcga ttaatcccca tatttaaaat caactttcat agtttatatt 900 gtgaagtgtt ttatgtgacg acattagtgg atttatggac acggtctaag gacccgtgac 960 ttgtattttt cttcattgac ctagctagct agctagctag catcgtgaag ccacgcccat 1020 gcgtttggta tcgtccgagt tgtgtacaat ttccagccag tggaatcaca gttattggat 1080 cattttggta cgtataacgt attctttttg tatttcctgt ctaaagacat taatttcaga 1140 gaagccgggt ctattttaga agggcttggc ttcttcccgt ttggtagacc tcctcgaaag 1200 acgaaagtct tacttcctct ggtttcctat tagttatcgt tttgaataaa gttcgagtca 1260 aacttataaa attttgacta caaataacta ttttgttatt tagttttgga acctaatatt 1320 tatatgcacc aatttgttat aaaaagtact tttataaaag tataaatgta ttaagagttc 1380 atttgtattt taacaaaaaa tattggtcaa agttatattt tggagaccgt gtcgttgtcc 1440 taaacgacaa ctaataggaa accggaggga gtactgattt tctcctgcag cgggcacaga 1500 agatcatgct ggaaaggtag taggtacagg tagcctggag cggaggagtt gccactttgc 1560 acagtgccga tcgagctcgc agcccctata tagcacgcac cctgctcaag catcttttcc 1620 ttaccctata tagctcgcgc ggctttcttt cccaactccg acgaaggcta gctacaccac 1680 ctggtgcggg ctcgtctcca tcgcccgcca cccgctccgt cgtcgtcgtc cccgccgcgc 1740 cgatcccgaa tcgaatgggg agcctggcgt ccgagaggaa ggtggtcggg tgggccgcca 1800 gggacgccac cggacacctc tccccctact cctacaccct caggtactac gccgcgccgg 1860 cgccctcgtg tttgtcctct cctccagtcc ctcccgtctg tatatgtccg actgtctccg 1920 cccttttgca aacacgcaaa tggatggatc caggaggacg agagacggtt agtttctgca 1980 cgcgcctcct ccagtagttc tccgagttct cgggaagaac agaaaatttg attgatgttt 2040 tttttgatga aaaataaaaa gggacttggg gcatattttc gatcaacttg caacggaaga 2100 tgactaggag tacgtacgta gcgtagcggc ggcgggtttt aatttggggg agcactctgt 2160 tagtctgttg catatatggg agtacctgat tcgttgcagt tattattatc tatacgcgta 2220 cgatatgttt taggggtgtt tggttgctcc tgctaaagtt tagtccgggt cacatcaagc 2280 gttttacttt taaataggag tatgaaatat agacccaacc aactagacta gattcgtctc 2340 gtcttttaat cttcggctga caaattagtt ttataatccg actacattta atacccggaa 2400 cagaggttca aacattcgat gggacagaga ctaaatttta gcagggtgta accaaacacc 2460 cccttagtcc acaacaagag cattatgcgc tgtgttgcat catgcatata tgatacgtct 2520 tcaacttctt gcggtccaac tctagatagt gcacatgcat atgccaaata cggatactgg 2580 acaagatagc acacaagcag agcaggttgg gcgagcgtac actgcacgta tgcttctctt 2640 ctacatggca ttttgtttcg aacattaata tatgggtact gctcctgcac agcactgcac 2700 gtgcttgacg tctcgtacag acccagcagc gtgtgaactt gtaggtaaga tacgtaacta 2760 ctgatatctg cagctaccta ccgcctgtcg cgatcaccat ccatttgtac tcgcagtaat 2820 aataccgatt acccttttat tattatttct catgccatcg acgactacta gcactatcca 2880 acgtacaact gtggcgcgat tcatatatgc ataattctac atggtgctag tcttcggcaa 2940 gaaaaaaaac taacacttgt ctctttttca tatgggatgt gttgtggtgg tgacaacagg 3000 aacacaggcc ctgaagatgt ggtggtgaag gtgctctact gcgggatctg ccacacggac 3060 atccaccagg ccaagaacca cctcggggct tcaaagtatc ctatggtccc tgggtgagca 3120 caaacggtta acacacacac gcacccagcg atttttcagg acccttgggg atccagtata 3180 tatatatgct ccgtgtacgg tccagaatat acgtactgaa tttccaagtg tcctattatt 3240 caatttgtct caaaactata aaggatatat atagtgacat gcagtttcag cgttttcatg 3300 agaaaattac acatgcagac aaattcaggt ataattattt gattcatgac gaccagcata 3360 tagattggta gatagagtgc acatttgtca accacaaacg ttagcatccc agtccggagc 3420 tatcccctgg gttacaggtg gcaaatacac accaaccaca ataataagct aatactctta 3480 cgtctgtagt tggttgccaa ttactgatca gattacttga atcacaagag cttgttgtgt 3540 ctaatttgta caggctattt atatcatgat agctaaagag ctgctgaaat gagtagcaag 3600 gaaacctcac cggccgtcct atacttttct ctgacatgac gacaggacaa ccactccacc 3660 accgtgaact gatacaataa caataaagtc ctttagtcca agtaaattag aataggctag 3720 aaactaaaat ccaacagaga gacgaaatca tggctttggt ttggtaataa ctgatactgt 3780 cgcaggcacg aggtggtcgg cgaggtggtg gaggtcgggc ccgaggtggc caagtacggc 3840 gtcggcgacg tggtaggcgt cggggtgatc gttgggtgct gccgcgagtg cagcccctgc 3900 aaggccaacg ttgagcagta ctgcaacaag aagatctggt catacaacga cgtctacact 3960 gatggacggc ccacgcaggg tggattcgcc tccaccatgg tcgtcgacca gaagtgagtt 4020 cttgagactg aaaactaatc ttttcactgg tttaattatt ttcagcgtta tcttgcatgc 4080 agtgttgtag agataataat ctcttttttt attaaaaaaa atgtttggtc tgaaaaaagc 4140 tagaaatata tagttgaact tcaattatat ttcaactttt gcgagaagtg gacgagataa 4200 ggtccaatcc ttctagaaaa ggtgcaggaa agtatatata tatatatata tatatatata 4260 tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatgggga 4320 taaaatatga tcgagaaagt ccatcatcat ctagctgcaa gtcgttgtat ggatgtctta 4380 tggtgaccag gcaagagtgt tgatgtggaa agtacggtat gatttggtgt gctttacttg 4440 cttgactttg tgaggttgaa ccaccaccac agaagccgaa tcctcaccta ctcttgattg 4500 aagattggcc acccaaacca tcaccggttg ttgggagaaa tgaggataac tttctccatc 4560 gtttgctcca aaacctgtct acactttagt gtactgtctt tttcagtcag tgcgcaaacc 4620 acaccaccta cctccaacaa cattttgaga tagcgatttc ttttttcttt ttttaaaggc 4680 actccgtgtg tgaattatga tagaacagta acttttcaag caattttctt tgctgccagt 4740 caattttgga agaaaaaaaa aggcaacctc ggtaacacga atttaggttc ctattttgtt 4800 cttggtaaaa aaaaactaaa tacctagttc cacgtaagtt gatagttaat gcattttgtt 4860 tcaggtttgt ggtgaagatc ccggcgggtc tggctccgga gcaagcggcg ccgctgctgt 4920 gcgctggcgt gacggtgtac agcccgctga agcactttgg gctgacgacc ccgggcctcc 4980 gtggcggcat cctgggcctc ggcggcgtgg gccacatggg cgtgaaggta gccaaggcca 5040 tgggccacca cgtgacggtg atcagctcgt cgtccaagaa gcgcgcggag gcaatggacc 5100 acctcggcgc ggacgcgtac ctagtgagct cggacgccgc ggccatggcg gcggccgccg 5160 actcgctgga ctacatcatc gacacggtgc ccgtgcacca cccgctggag ccgtacctgg 5220 cgctgctgaa gctggacggc aagctcgtgc tgctgggcgt catcggcgag cccctgagct 5280 tcgtgtcgcc catggtgatg ctggggcgga aggccatcac ggggagcttc atcggcagca 5340 tcgacgagac cgctgaggtg cttcagttct gcgtcgacaa ggggctcacc tcccagatcg 5400 aggtggtcaa gatggggtac gtgaacgagg cgctggagcg gctggagcgc aacgacgtcc 5460 gctaccgctt cgtcgtcgac gtcgccggta gcaacgtcga ggcggaggcg gcggcggcgg 5520 atgcggccag caactgatgg caccgcgtcg tcgagtcgaa ccacgtctgt gcgccgcgtg 5580 caacgttcgt tcgggtcgag tctgcgtgca acgttctgct tcctttacta gttgttgtct 5640 ttccgccttc ttgccgttct gttctgggct ttgagatgag acgatggatg gtcagttttt 5700 aatgtcagac tgaataacta cgtatagtac tgtagtatta ctcggagtac gccagaatgt 5760 ggtgtggtgt cagtctcacc agcaatctgg atttgccaag tgtttctatt ttttcttcgg 5820 tttgcccgag tgtttgtgat tgttaagaac tacgttatta cggatcgtca aatccgttcc 5880 cttctgtctc gtctatag 5898 <210> 5 <211> 1510 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Predicted cDNA sequence of 6XN442 CAD2 <400> 5 gtgcgggctc gtctccatcg cccgccaccc gctccgtcgt cgtcgtcccc gccgcgccga 60 tcccgaatcg aatggggagc ctggcgtccg agaggaaggt ggtcgggtgg gccgccaggg 120 acgccaccgg acacctctcc ccctactcct acaccctcag gaacacaggc cctgaagatg 180 tggtggtgaa ggtgctctac tgcgggatct gccacacgga catccaccag gccaagaacc 240 acctcggggc ttcaaagtat cctatggtcc ctgggcacga ggtggtcggc gaggtggtgg 300 aggtcgggcc cgaggtggcc aagtacggcg tcggcgacgt ggtaggcgtc ggggtgatcg 360 ttgggtgctg ccgcgagtgc agcccctgca aggccaacgt tgagcagtac tgcaacaaga 420 agatctggtc atacaacgac gtctacactg atggacggcc cacgcagggt ggattcgcct 480 ccaccatggt cgtcgaccag aagtttgtgg tgaagatccc ggcgggtctg gctccggagc 540 aagcggcgcc gctgctgtgc gctggcgtga cggtgtacag cccgctgaag cactttgggc 600 tgacgacccc gggcctccgt ggcggcatcc tgggcctcgg cggcgtgggc cacatgggcg 660 tgaaggtagc caaggccatg ggccaccacg tgacggtgat cagctcgtcg tccaagaagc 720 gcgcggaggc aatggaccac ctcggcgcgg acgcgtacct agtgagctcg gacgccgcgg 780 ccatggcggc ggccgccgac tcgctggact acatcatcga cacggtgccc gtgcaccacc 840 cgctggagcc gtacctggcg ctgctgaagc tggacggcaa gctcgtgctg ctgggcgtca 900 tcggcgagcc cctgagcttc gtgtcgccca tggtgatgct ggggcggaag gccatcacgg 960 ggagcttcat cggcagcatc gacgagaccg ctgaggtgct tcagttctgc gtcgacaagg 1020 ggctcacctc ccagatcgag gtggtcaaga tggggtacgt gaacgaggcg ctggagcggc 1080 tggagcgcaa cgacgtccgc taccgcttcg tcgtcgacgt cgccggtagc aacgtcgagg 1140 cggaggcggc ggcggcggat gcggccagca actgatggca ccgcgtcgtc gagtcgaacc 1200 acgtctgtgc gccgcgtgca acgttcgttc gggtcgagtc tgcgtgcaac gttctgcttc 1260 ctttactagt tgttgtcttt ccgccttctt gccgttctgt tctgggcttt gagatgagac 1320 gatggatggt cagtttttaa tgtcagactg aataactacg tatagtactg tagtattact 1380 cggagtacgc cagaatgtgg tgtggtgtca gtctcaccag caatctggat ttgccaagtg 1440 tttctatttt ttcttcggtt tgcccgagtg tttgtgattg ttaagaacta cgttattacg 1500 gatcgtcaaa 1510 <210> 6 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Predicted protein sequence of 6XN442 CAD2 <400> 6 Met Gly Ser Leu Ala Ser Glu Arg Lys Val Val Gly Trp Ala Ala Arg 1 5 10 15 Asp Ala Thr Gly His Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Thr Leu Arg Asn Thr 20 25 30 Gly Pro Glu Asp Val Val Val Lys Val Leu Tyr Cys Gly Ile Cys His 35 40 45 Thr Asp Ile His Gln Ala Lys Asn His Leu Gly Ala Ser Lys Tyr Pro 50 55 60 Met Val Pro Gly His Glu Val Val Gly Glu Val Val Glu Val Gly Pro 65 70 75 80 Glu Val Ala Lys Tyr Gly Val Gly Asp Val Val Gly Val Gly Val Ile 85 90 95 Val Gly Cys Cys Arg Glu Cys Ser Pro Cys Lys Ala Asn Val Glu Gln 100 105 110 Tyr Cys Asn Lys Lys Ile Trp Ser Tyr Asn Asp Val Tyr Thr Asp Gly 115 120 125 Arg Pro Thr Gln Gly Gly Phe Ala Ser Thr Met Val Val Asp Gln Lys 130 135 140 Phe Val Val Lys Ile Pro Ala Gly Leu Ala Pro Glu Gln Ala Ala Pro 145 150 155 160 Leu Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Ser Pro Leu Lys His Phe Gly 165 170 175 Leu Thr Thr Pro Gly Leu Arg Gly Gly Ile Leu Gly Leu Gly Gly Val 180 185 190 Gly His Met Gly Val Lys Val Ala Lys Ala Met Gly His His Val Thr 195 200 205 Val Ile Ser Ser Ser Ser Lys Lys Arg Ala Glu Ala Met Asp His Leu 210 215 220 Gly Ala Asp Ala Tyr Leu Val Ser Ser Asp Ala Ala Ala Met Ala Ala 225 230 235 240 Ala Ala Asp Ser Leu Asp Tyr Ile Ile Asp Thr Val Pro Val His His 245 250 255 Pro Leu Glu Pro Tyr Leu Ala Leu Leu Lys Leu Asp Gly Lys Leu Val 260 265 270 Leu Leu Gly Val Ile Gly Glu Pro Leu Ser Phe Val Ser Pro Met Val 275 280 285 Met Leu Gly Arg Lys Ala Ile Thr Gly Ser Phe Ile Gly Ser Ile Asp 290 295 300 Glu Thr Ala Glu Val Leu Gln Phe Cys Val Asp Lys Gly Leu Thr Ser 305 310 315 320 Gln Ile Glu Val Val Lys Met Gly Tyr Val Asn Glu Ala Leu Glu Arg 325 330 335 Leu Glu Arg Asn Asp Val Arg Tyr Arg Phe Val Val Asp Val Ala Gly 340 345 350 Ser Asn Val Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ser Asn 355 360 365 <210> 7 <211> 5916 <212> DNA <213> Zea mays <400> 7 aatgcacgat gtcaactctc ttgcctataa ttatgttcaa actctcgtca ataatagtag 60 ctagtactgt tattgtaaag tatcgctaaa atatgcatat atacttataa cttatccatg 120 ttaaagaaaa tcgaatatgc tagcaaagac atatgggccc gttgaggaga gctacgttac 180 atttgatttc taggagaaag cagagtgaag agctggtgaa aatcgattct ctattatctt 240 cactagaata taaatgaagc acatttttag ctccagctct tagcgcaaat agagaaactc 300 tcctaattgt agcatgaatg agatgacatt ataaaagcct ttgatgagat tttcttccga 360 gaagctgaag ctcctcagat agcccaatga tatgtatgta agtgtatttt ttttaaaaaa 420 agcgggcaaa tgaaactaaa tcatcctatc ccctttaata tactgagatg ccaattagtt 480 ggttgccagc cggagtatgg tggatgggat cctcctattg gttaaattat gaatgaattg 540 tttggttgcc cggtccaatc tttcttatgt ctgtttcgtt tagatcgtgt acaccacttc 600 ttattgttta aatggccaat ttaatcgggg cctaaacgac atatgtgcct caatttacca 660 taccaatgat gccgcttacg tgaatagttg aataccgata ctactactac cgcacgcgtc 720 atggtttaac cttttaacag ttggattgaa acatcagcga ccactcggca cttgggtgac 780 aatttgtcac acacctcgta gtcgagtgga aatgcactta cccaatttct caacccataa 840 gactatttcc agcatctcga ttaatcccca tatttaaaat caactttcat agtttatatt 900 gtgaagtgtt ttatgtgacg acattagtgg atttatggac acggtctaag gacccgtgac 960 ttgtattttt cttcattgac ctagctagct agctagctag catcgtgaag ccacgcccat 1020 gcgtttggta tcgtccgagt tgtgtacaat ttccagccag tggaatcaca gttattggat 1080 cattttggta cgtataacgt attctttttg tatttcctgt ctaaagacat taatttcaga 1140 gaagccgggt ctattttaga agggcttggc ttcttcccgt ttggtagacc tcctcgaaag 1200 acgaaagtct tacttcctct ggtttcctat tagttatcgt tttgaataaa gttcgagtca 1260 aacttataaa attttgacta caaataacta ttttgttatt tagttttgga acctaatatt 1320 tatatgcacc aatttgttat aaaacgtact tttataaaag tataaatgta ttaagagttc 1380 atttgtattt taacaaaaaa tattggtcaa agttatattt tggagaccgt gtcgttgtcc 1440 taaacgacaa ctaataggaa accggaggga gtactgattt tctcctgcag cgggcacaga 1500 agatcatgct ggaaaggtag taggtacagg tagcctggag cggaggagtt gccactttgc 1560 acagtgccga tcgagctcgc agccactata tagcacgcac cctgctcaag catcttttcc 1620 ttacccagaa agatcgcact acccggcgct cgcgcggctt tctttcccaa ctccgacgaa 1680 ggctagctac accacctggt gcgggctcgt ctccatcgcc cgccacccgc tccgtcgtcg 1740 tcgtccccgc cgcgccgatc ccgaatcgaa tggggagcct ggcgtccgag aggaaggtgg 1800 tcgggtgggc cgccagggac gccaccggac acctctcccc ctactcctac accctcaggt 1860 actacgccgc gccggcgccc tcgtgtttgt cctctcctcc agtccctccc gtctgtatat 1920 gtccgactgt ctccgccctt ttgcaaacac gcaaatggat ggatccagga ggacgagaga 1980 cggttagttt ctgcacgcgc ctcctccagt agttctccga gttctcggga agaacagaaa 2040 atttgattga tgtttttttt gatgaaaaat aaaaagggac ttggggcata ttttcgatca 2100 acttgcaacg gaagatgact aggagtacgt acgtagcgta gcggcggcgg gttttaattt 2160 gggggagcac tctgttagtc tgttgcatat atgggagtac ctgattcgtt gcagttatta 2220 ttatctatac gcgtacgata tgttttaggg ggtgtttggt tgctcctgct aaagtttagt 2280 ccgggtcaca tcaagcgttt tacttttaaa taggagtatg aaatatagac ccaaccaact 2340 agactagatt cgtctcgtct tttaatcttc ggctgacaaa ttagttttat aatccgacta 2400 catttaatac ccggaacaga ggttcaaaca ttcgatggga cagagactaa attttagcag 2460 ggtgtaacca aacaccccct tagtccacaa caagagcatt atgcgctgtg ttgcatcatg 2520 catatatgat acgtcttcaa cttcttgcgg tccaactcta gatagtgcac atgcatatgc 2580 caaatacgga tactggacaa gatagcacac aagcagagca ggttgggcga gcgtacactg 2640 cacgtatgct tctcttctac atggcatttt gtttcgaaca ttaatatatg ggtactgctc 2700 ctgcacagca ctgcacgtgc ttgacgtctc gtacagaccc agcagcgtgt gaacttgtag 2760 gtaagatacg taactactga tatctgcagc tacctaccgc ctgtcgcgat caccatccat 2820 ttgtactcgc agtaataata ccgattaccc ttttattatt atttctcatg ccatcgacga 2880 ctactagcac tatccaacgt acaactgtgg cgcgattcat atatgcataa ttctacatgg 2940 tgctagtctt cggcaagaaa aaaaaactaa cacttgtctc tttttcatat gggatgtgtt 3000 gtggtggtga caacaggaac acaggccctg aagatgtggt ggtgaaggtg ctctactgcg 3060 ggatctgcca cacggacatc caccaggcca agaaccacct cggggcttca aagtatccta 3120 tggtccctgg gtgagcacaa acggttaaca cacacacgca cccagcgatt tttcaggacc 3180 cttggggatc cagtatatat atatatgctc cgtgtacggt ccagaatata cgtactgaat 3240 ttccaagtgt cctattattc aatttgtctc aaaactataa aggatatata tagtgacatg 3300 cagtttcagc gttttcatga gaaaattaca catgcagaca aattcaggta taattatttg 3360 attcatgacg accagcatat agattggtag atagagtgca catttgtcaa ccacaaacgt 3420 tagcatccca gtccggagct atcccctggg ttacaggtgg caaatacaca 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tatatatata 4320 tatatatata tatggggata aaatatgatc gagaaagtcc atcatcatct agctgcaagt 4380 cgttgtatgg atgtcttatg gtgaccaggc aagagtgttg atgtggaaag tacggtatga 4440 tttggtgtgc tttacttgct tgactttgtg aggttgaacc accaccacag aagccgaatc 4500 ctcacctact cttgattgaa gattggccac ccaaaccatc accggttgtt gggagaaatg 4560 aggataactt tctccatcgt tcgctccaaa acctgtctac actttagtgt actgtctttt 4620 tcagtcagtg cgcaaaccac accacctacc tccaacaaca ttttgagata gcgatttctt 4680 ttttcttttt ttaaaggcac tccgtgtgtg aattatgata gaacagtaac ttttcaagca 4740 attttctttg ctgccagtca attttggaag aaaaaaaaag gcaacctcgg taacacgaat 4800 ttaggttcct attttgttct tggtaaaaaa aaactaaata cctagttcca cgtaagttga 4860 tagttaatgc attttgtttc aggtttgtgg tgaagatccc ggcgggtctg gctccggagc 4920 aagcggcgcc gctgctgtgc gctggcgtga cggtgtacag cccgctgaag cactttgggc 4980 tgacgacccc gggcctccgt ggcggcatcc tgggcctcgg cggcgtgggc cacatgggcg 5040 tgaaggtagc caaggccatg ggccaccacg tgacggtgat cagctcgtcg tccaagaagc 5100 gcgcggaggc aatggaccac ctcggcgcgg acgcgtacct agtgagctcg gacgccgcgg 5160 ccatggcggc ggccgccgac tcgctggact acatcatcga cacggtgccc gtgcaccacc 5220 cgctggagcc gtacctggcg ctgctgaagc tggacggcaa gctcgtgctg ctgggcgtca 5280 tcggcgagcc cctgagcttc gtgtcgccca tggtgatgct ggggcggaag gccatcacgg 5340 ggagcttcat cggcagcatc gacgagaccg ctgaggtgct tcagttctgc gtcgacaagg 5400 gactcacctc ccagatcgag gtggtcaaga tggggtacgt gaacgaggcg ctggagcggc 5460 tggagcgcaa cgacgtccgc taccgcttcg tcgtcgacgt cgccggtagc aacgtcgagg 5520 cggaggcggc ggcggcggat gcggccagca actgatggca ccgcgtcgtc gagtcgaacc 5580 acgtctgtgc gccgcgtgca acgttcgttc gggtcgagtc tgcgtgcaac gttctgcttc 5640 ctttactagt tgttgtcttt ccgccttctt gccgttctgt tctgggcttt gagatgagac 5700 gatggatggt cagtttttaa tgtcagactg aataactacg tatagtactg tagtattact 5760 cggagtacgc cagaatgtgg tgtggtgtca gtctcaccag caatctggat ttgccaagtg 5820 tttctatttt ttcttcggtt tgcccgagtg tttgtgattg ttaagaacta cgttattacg 5880 gatcgtcaaa tccgttccct tctgtctcgt ctatag 5916 <210> 8 <211> 1510 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Predicted cDNA sequence of B73 CAD2 <400> 8 gtgcgggctc gtctccatcg cccgccaccc gctccgtcgt cgtcgtcccc gccgcgccga 60 tcccgaatcg aatggggagc ctggcgtccg agaggaaggt ggtcgggtgg gccgccaggg 120 acgccaccgg acacctctcc ccctactcct acaccctcag gaacacaggc cctgaagatg 180 tggtggtgaa ggtgctctac tgcgggatct gccacacgga catccaccag gccaagaacc 240 acctcggggc ttcaaagtat cctatggtcc ctgggcacga ggtggtcggc gaggtggtgg 300 aggtcgggcc cgaggtggcc aagtacggcg tcggcgacgt ggtaggcgtc ggggtgatcg 360 ttgggtgctg ccgcgagtgc agcccctgca aggccaacgt tgagcagtac tgcaacaaga 420 agatctggtc atacaacgac gtctacactg atggacggcc cacgcagggt ggattcgcct 480 ccaccatggt cgtcgaccag aagtttgtgg tgaagatccc ggcgggtctg gctccggagc 540 aagcggcgcc gctgctgtgc gctggcgtga cggtgtacag cccgctgaag cactttgggc 600 tgacgacccc gggcctccgt ggcggcatcc tgggcctcgg cggcgtgggc cacatgggcg 660 tgaaggtagc caaggccatg ggccaccacg tgacggtgat cagctcgtcg tccaagaagc 720 gcgcggaggc aatggaccac ctcggcgcgg acgcgtacct agtgagctcg gacgccgcgg 780 ccatggcggc ggccgccgac tcgctggact acatcatcga cacggtgccc gtgcaccacc 840 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<212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer 3996F <400> 19 ttttgcgaga agtggacgag ataaggt 27 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer 3996R <400> 20 aatgttgttg gaggtaggtg gtgtggttt 29 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer BM11 C1 <400> 21 gagaaatgag gataactttc tccatcgtt 29 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer BM11 R14 <400> 22 ctatagacga gacagaaggg aacggatttg 30 <210> 23 <211> 9360 <212> DNA <213> Zea mays <400> 23 aatgcacgat gtcaactctc ttgcctataa ttatgttcaa actctcgtca ataatagtag 60 ctagtactgt tattgtaaag tatcgctaaa atatgcatat atacttataa cttatccatg 120 ttaaagaaaa tcgaatatgc tagcaaagac atatgggccc gttgaggaga gctacgttac 180 atttgatttc taggagaaag cagagtgaag agctggtgaa aatcgattct ctattatctt 240 cactagaata taaatgaagc acatttttag ctccagctct tagcgcaaat agagaaactc 300 tcctaattgt agcatgaatg agatgacatt ataaaagcct ttgatgagat tttcttccga 360 gaagctgaag ctcctcagat agcccaatga tatgtatgta agtgtatttt ttttaaaaaa 420 agcgggcaaa tgaaactaaa tcatcctatc ccctttaata tactgagatg ccaattagtt 480 ggttgccagc cggagtatgg tggatgggat cctcctattg gttaaattat gaatgaattg 540 tttggttgcc cggtccaatc tttcttatgt ctgtttcgtt tagatcgtgt acaccacttc 600 ttattgttta aatggccaat ttaatcgggg cctaaacgac atatgtgcct caatttacca 660 taccaatgat gccgcttacg tgaatagttg aataccgata ctactactac cgcacgcgtc 720 atggtttaac cttttaacag ttggattgaa acatcagcga ccactcggca cttgggtgac 780 aatttgtcac acacctcgta gtcgagtgga aatgcactta cccaatttct caacccataa 840 gactatttcc agcatctcga ttaatcccca tatttaaaat caactttcat agtttatatt 900 gtgaagtgtt ttatgtgacg acattagtgg atttatggac acggtctaag gacccgtgac 960 ttgtattttt cttcattgac ctagctagct agctagctag catcgtgaag ccacgcccat 1020 gcgtttggta tcgtccgagt tgtgtacaat ttccagccag tggaatcaca gttattggat 1080 cattttggta cgtataacgt attctttttg tatttcctgt ctaaagacat taatttcaga 1140 gaagccgggt ctattttaga agggcttggc ttcttcccgt ttggtagacc tcctcgaaag 1200 acgaaagtct tacttcctct ggtttcctat tagttatcgt tttgaataaa gttcgagtca 1260 aacttataaa attttgacta caaataacta ttttgttatt tagttttgga acctaatatt 1320 tatatgcacc aatttgttat aaaacgtact tttataaaag tataaatgta ttaagagttc 1380 atttgtattt taacaaaaaa tattggtcaa agttatattt tggagaccgt gtcgttgtcc 1440 taaacgacaa ctaataggaa accggaggga gtactgattt tctcctgcag cgggcacaga 1500 agatcatgct ggaaaggtag taggtacagg tagcctggag cggaggagtt gccactttgc 1560 acagtgccga tcgagctcgc agccactata tagcacgcac cctgctcaag catcttttcc 1620 ttacccagaa agatcgcact acccggcgct cgcgcggctt tctttcccaa ctccgacgaa 1680 ggctagctac accacctggt gcgggctcgt ctccatcgcc cgccacccgc tccgtcgtcg 1740 tcgtccccgc cgcgccgatc ccgaatcgaa tggggagcct ggcgtccgag aggaaggtgg 1800 tcgggtgggc cgccagggac gccaccggac acctctcccc ctactcctac accctcaggt 1860 actacgccgc gccggcgccc tcgtgtttgt cctctcctcc agtccctccc gtctgtatat 1920 gtccgactgt ctccgccctt ttgcaaacac gcaaatggat ggatccagga ggacgagaga 1980 cggttagttt ctgcacgcgc ctcctccagt agttctccga gttctcggga agaacagaaa 2040 atttgattga tgtttttttt gatgaaaaat aaaaagggac ttggggcata 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attttataaa 3780 ttgcagtact aaactgtttt agtctatagt tcctttttag atgactaaaa gggattaaac 3840 aaaaaagaca cccgtaaatt aatcagtcgt taaacagtgc tagtactatg catttcatcg 3900 cgtaaattaa tcaattgaat ggtttcaatt ggtgattttg cagcctaggc catggagggg 3960 gtatcatcag ctccagaaat ggacgaggct atctcaactg accaatcaag cagatcaaca 4020 aaaagaaggg ctaaagtgtg ggatcatgtt gattcagagc taatagatgg gaaagagaag 4080 gcggtttgca aatactgtaa ggcccactta tcttctgctg cgggtaaagg tacaactcat 4140 ctaaataggc atatttctgt gtattgccat gcaattccac cagaagagag acaaaggttc 4200 ttagcgaccc aaaaaacaaa gcctgatgtt gctcatgttt tcgacccagt agtctttcgt 4260 ggtctaatag ccaagtactt ccttagcgca gagatttcat tttgaaagtg tgaagatcca 4320 tcctggaaag aaatgataag ttattgtcaa ccatcttttc gattagtcgg tcgacagact 4380 gtccgttcag attgtatgtt gttgtatgaa gaggagaagt tgcagttaat tgagcagttt 4440 acaaagttga aatctcatgt tagtttgact gctgatcttt ggtcctctaa ccaaaacctt 4500 ggatatcttg gtgtaacagc acatttcatt agtgaagatt ttgagttgca caaaaagatt 4560 attgcattca agaagatttc cttcccacat acatcttatg ctgtgcaaga tggtattacc 4620 tcttgtttgc tagagtgggg attggttggt gatttgttta ccctgacttt ggataatgct 4680 agtgtaaaca atagagcaat gaaagatatg cgagatgctt tgggcagcca gatgtttttc 4740 agtggtgaac acctccatgt gaggtgttct tctcatgtgc tcaacatcat ggttcaagct 4800 ggactaaagg tcgttccaaa tgcagaatat cattagcatt atatagttta tcttttgtct 4860 taatcaccaa agatgttttt cagaatatca ttagcagcca gatgtttttg tcttaatctc 4920 aacatcattt tcttaatcac caaagtttta tcttttgtct gttcttctct aatatccatg 4980 catctaaata agccctaata gtatctctca ttctcttgtt actattagta tttaaactta 5040 ttactattag tatttaagcg tgaataatta tcattagcat ttaagttaca ttttataaac 5100 caaacgacac ctaaagtgct ccgtcatagt tggctacttg ccagccgatt atttagcacg 5160 caagccatgc tcgatggata caatagtata tgaccaatat agatgaccta cgtacatgtg 5220 ttctatgctt cagcaagcat aatatgtttc ttgccttcgc atcaactcaa gtgtgtgatg 5280 atatgttgct gtctagtact aactctgaat caattaactc tgaatttgtc caggctaagg 5340 agttccttgg tgcttccggt gacaagcgaa aggaagtcaa ttaactctga atcagtggtt 5400 ctgctgcaag gtaaattgcc tgtatataat tatccatgtc agaaccaact ttatctacca 5460 ggattaattt ttagtctccc aattttatgc cccagttata ttttatccta gtgaagtttt 5520 actgctctca tatacttaga tgaactaaag ttgatcattt tgtgctcgga acaactctgt 5580 ataacagtct atatagttta acagtctata tagtttgcat gcaggttaca cacaacattt 5640 tattgaatgg aaagaggaca ctcggtgacc acaagatcat cagatgatca tttgttgagc 5700 tctggaacta aatcctctcc gcaggtggta accaggcggg ttcccatccg agttccgagg 5760 tcactgtaat gctaaattgt caagttcagt tatctgaatt cagtttgagt tataattctc 5820 atcaagcatc aatgtcacca actgtgtaga aatactgaat tttagcatgg agcgtcttta 5880 taaacatttt agcatggagc agtttctcat cgatcatggc tgtcaagttc tatttctcta 5940 cacagttgca ctttgtggtt gttttctatc atttgtttgt gagcccatgg attttactaa 6000 tttattagct tgtggtggtg cttgcttgta tatgaaggcc cttggattgg cccgtggatt 6060 tttaaaagga tcgaggcgga ttaggatgtc ggggcattaa aaaacggatt gaattgagtt 6120 gtatcaaatc aatttggatt taagtagggc tgggttcact ttttaaactt ataggattgg 6180 agtggggttg gggccggatt gtgacccatt atcaggctta ctgatatctg cagctaccta 6240 ccgcctgtcg cgatcaccat ccatttgtac tcgcagtaat aataccgatt acccttttat 6300 tattatttct catgccatcg acgactacta gcactatcca acgtacaact gtggcgcgat 6360 tcatatatgc ataattctac atggtgctag tcttcggcaa gaaaaaaaaa ctaacacttg 6420 tctctttttc atatgggatg tgttgtggtg gtgacaacag gaacacaggc cctgaagatg 6480 tggtggtgaa ggtgctctac tgcgggatct gccacacgga catccaccag gccaagaacc 6540 acctcggggc ttcaaagtat cctatggtcc ctgggtgagc acaaacggtt aacacacaca 6600 cgcacccagc gatttttcag gacccttggg gatccagtat atatatatat gctccgtgta 6660 cggtccagaa tatacgtact gaatttccaa gtgtcctatt attcaatttg tctcaaaact 6720 ataaaggata tatatagtga catgcagttt cagcgttttc atgagaaaat tacacatgca 6780 gacaaattca ggtataatta tttgattcat gacgaccagc atatagattg gtagatagag 6840 tgcacatttg tcaaccacaa acgttagcat cccagtccgg agctatcccc tgggttacag 6900 gtggcaaata cacaccaacc acaataataa gctaatactc ttacgtctgt agttggttgc 6960 caattactga tcagattact tgaatcacaa gagcttgttg tgtctaattt gtacaggcta 7020 tttatatcat gatagctaaa gagctgctga aatgagtagc aaggaaacct caccggccgt 7080 cctatacttt tctctgacat gacgacagga caaccactcc accaccgtga 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ccacccaaac 7980 catcaccggt tgttgggaga aatgaggata actttctcca tcgttcgctc caaaacctgt 8040 ctacacttta gtgtactgtc tttttcagtc agtgcgcaaa ccacaccacc tacctccaac 8100 aacattttga gatagcgatt tcttttttct ttttttaaag gcactccgtg tgtgaattat 8160 gatagaacag taacttttca agcaattttc tttgctgcca gtcaattttg gaagaaaaaa 8220 aaaggcaacc tcggtaacac gaatttaggt tcctattttg ttcttggtaa aaaaaaacta 8280 aatacctagt tccacgtaag ttgatagtta atgcattttg tttcaggttt gtggtgaaga 8340 tcccggcggg tctggctccg gagcaagcgg cgccgctgct gtgcgctggc gtgacggtgt 8400 acagcccgct gaagcacttt gggctgacga ccccgggcct ccgtggcggc atcctgggcc 8460 tcggcggcgt gggccacatg ggcgtgaagg tagccaaggc catgggccac cacgtgacgg 8520 tgatcagctc gtcgtccaag aagcgcgcgg aggcaatgga ccacctcggc gcggacgcgt 8580 acctagtgag ctcggacgcc gcggccatgg cggcggccgc cgactcgctg gactacatca 8640 tcgacacggt gcccgtgcac cacccgctgg agccgtacct ggcgctgctg aagctggacg 8700 gcaagctcgt gctgctgggc gtcatcggcg agcccctgag cttcgtgtcg cccatggtga 8760 tgctggggcg gaaggccatc acggggagct tcatcggcag catcgacgag accgctgagg 8820 tgcttcagtt ctgcgtcgac aagggactca cctcccagat cgaggtggtc aagatggggt 8880 acgtgaacga ggcgctggag cggctggagc gcaacgacgt ccgctaccgc ttcgtcgtcg 8940 acgtcgccgg tagcaacgtc gaggcggagg cggcggcggc ggatgcggcc agcaactgat 9000 ggcaccgcgt cgtcgagtcg aaccacgtct gtgcgccgcg tgcaacgttc gttcgggtcg 9060 agtctgcgtg caacgttctg cttcctttac tagttgttgt ctttccgcct tcttgccgtt 9120 ctgttctggg ctttgagatg agacgatgga tggtcagttt ttaatgtcag actgaataac 9180 tacgtatagt actgtagtat tactcggagt acgccagaat gtggtgtggt gtcagtctca 9240 ccagcaatct ggatttgcca agtgtttcta ttttttcttc ggtttgcccg agtgtttgtg 9300 attgttaaga actacgttat tacggatcgt caaatccgtt cccttctgtc tcgtctatag 9360 <210> 24 <211> 784 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> partial DASbm1 CAD2 cDNA amplified by primer pair CVF/CVR <400> 24 gtccgagagg aaggtggtcg ggtgggccgc cagggacgcc accggacacc tctcccccta 60 ctcctacacc ctcagcctag gccatggagg gggtatcatc agctccagaa atggacgagg 120 ctatctcaac tgaccaatca agcagatcaa caaaaagaag ggctaaagtg tgggatcatg 180 ttgattcaga gctaatagat gggaaagaga aggcggtttg caaatactgt aaggcccact 240 tatcttctgc tgcgggtaaa ggctaaggag ttccttggtg cttccggtga caagcgaaag 300 gaagtcaatt aactctgaat cagtggttct gctgcaaggt tgcatgcagg ttacacacaa 360 cattttattg aatggaaaga ggacactcgg tgaccacaag atcatcagat gatcatttgt 420 tgagctctgg aactaaatcc tctccgcagg tggtaaccag gcgggttccc atccgagttc 480 cgaggaacac aggccctgaa gatgtggtgg tgaaggtgct ctactgcggg atctgccaca 540 cggacatcca ccaggccaag aaccacctcg gggcttcaaa gtatcctatg gtccctgggc 600 acgaggtggt cggcgaggtg gtggaggtcg ggcccgaggt ggccaagtac ggcgtcggcg 660 acgtggtagg cgtcggggtg atcgttgggt gctgccgcga gtgcagcccc tgcaaggcca 720 acgttgagca gtactgcaac aagaagatct ggtcatacaa cgacgtctac actgatggac 780 ggcc 784 <210> 25 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Predicted truncated protein sequence of DASbm1 CAD2 <400> 25 Met Gly Ser Leu Ala Ser Glu Arg Lys Val Val Gly Trp Ala Ala Arg 1 5 10 15 Asp Ala Thr Gly His Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Thr Leu Ser Leu Gly 20 25 30 His Gly Gly Gly Ile Ile Ser Ser Arg Asn Gly Arg Gly Tyr Leu Asn 35 40 45 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer 149R <400> 26 tgggttgaga aattgggtaa gtgc 24 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer 547F <400> 27 tgcccggtcc aatctttctt a 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer 547R <400> 28 cgtctttcga ggaggtctac 20 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer 1022F <400> 29 cgtttggtat cgtccgagtt gtgt 24 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer 1022R <400> 30 gccgggtagt gcgatctttc tgg 23 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer 1501F <400> 31 agatcatgct ggaaaggtag tagg 24 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer 1501R <400> 32 tgatcgaaaa tatgccccaa gtc 23 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer 1955F <400> 33 acgcgcctcc tccagtagtt ctcc 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer 1955R <400> 34 caagttcaca cgctgctggg tctg 24 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer CVF <400> 35 gtccgagagg aaggtggtc 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer CVR <400> 36 ggccgtccat cagtgtaga 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer 2687F <400> 37 tatgggtact gctcctgcac 20 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer 2643R <400> 38 ccttgcagca gaaccactg 19 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer 2132F <400> 39 agaatatcat tagcagccag a 21 <210> 40 <211> 3444 <212> DNA <213> Zea mays <400> 40 aggcctggga atgggccata taaactcatg ggcagaaagg ggctccaaac ttgtgggcta 60 acaaatttga gtttttttgg gctttccact gattagggca ggcggcgtca ggctgatcgg 120 ggtggcgcgc ggcgccgggg agcgccccat cgtattcgtg cctctcaagg tcacaccgcc 180 tcgcgctcgt ctcctctcct tgtcgcttcg attcgttccc ctcccgctcc cgctcgccct 240 cgccatgaat gatgtcgcct gaatctggtt ctgggggttt cggtagctac tacttggccg 300 gcttgccgcc tcttcttctt tgcgttgctg ctctgccatt ttcctattgt agtagcggcg 360 ccatgcgaga acgagatgag ccaactgcag aggttggctt ggcttctgcc attttcttct 420 ttgctgcaga ggttcgcgga cgcaggtcgg accactgccg cgcccttcct cttcctgccg 480 gccgccgcac tcccgccagc gccgtactac ttactacctg catactgtat tctgtagtag 540 tatgaaaagg taaaggcggc gtactgctat agtatctctg cagaatgttc ggaggaggag 600 tacaccaact gaaagaggtt taggaaagtt gcaccgtgga tctagaattc tagatgcatt 660 agtgtagcct acagtagccc tgtacacaca taaaggcatt tttcttataa aattgtctcg 720 caaaatggga tttttttgtg ctaattatag ggtgctttag cgccacctgg gatttttttg 780 tgctaattat atgcagcttc catagaccac cacaggcatt cccgcatgca gttcgctctg 840 aatgcctcct ttcattctat tactatccct gaacgacgac ccatctcagg gaaatagcca 900 ttaaatgata gcagcctttt ttaaagtatg gcttggtttg cgatgttatt atggttcgaa 960 aagttgctct attttagtct catttatttt ataaattgca gtactaaact gttttagtct 1020 atagttcctt tttagatgac taaaagggat taaacaaaaa agacacccgt aaattaatca 1080 gtcgttaaac agtgctagta ctatgcattt catcgcgtaa attaatcaat tgaatggttt 1140 caattggtga ttttgcagcc taggccatgg agggggtatc atcagctcca gaaatggacg 1200 aggctatctc aactgaccaa tcaagcagat caacaaaaag aagggctaaa gtgtgggatc 1260 atgttgattc agagctaata gatgggaaag agaaggcggt ttgcaaatac tgtaaggccc 1320 acttatcttc tgctgcgggt aaaggtacaa ctcatctaaa taggcatatt tctgtgtatt 1380 gccatgcaat tccaccagaa gagagacaaa ggttcttagc gacccaaaaa acaaagcctg 1440 atgttgctca tgttttcgac ccagtagtct ttcgtggtct aatagccaag tacttcctta 1500 gcgcagagat ttcattttga aagtgtgaag atccatcctg gaaagaaatg ataagttatt 1560 gtcaaccatc ttttcgatta gtcggtcgac agactgtccg ttcagattgt atgttgttgt 1620 atgaagagga gaagttgcag ttaattgagc agtttacaaa gttgaaatct catgttagtt 1680 tgactgctga tctttggtcc tctaaccaaa accttggata tcttggtgta acagcacatt 1740 tcattagtga agattttgag ttgcacaaaa agattattgc attcaagaag atttccttcc 1800 cacatacatc ttatgctgtg caagatggta ttacctcttg tttgctagag tggggattgg 1860 ttggtgattt gtttaccctg actttggata atgctagtgt aaacaataga gcaatgaaag 1920 atatgcgaga tgctttgggc agccagatgt ttttcagtgg tgaacacctc catgtgaggt 1980 gttcttctca tgtgctcaac atcatggttc aagctggact aaaggtcgtt ccaaatgcag 2040 aatatcatta gcattatata gtttatcttt tgtcttaatc accaaagatg tttttcagaa 2100 tatcattagc agccagatgt ttttgtctta atctcaacat cattttctta atcaccaaag 2160 ttttatcttt tgtctgttct tctctaatat ccatgcatct aaataagccc taatagtatc 2220 tctcattctc ttgttactat tagtatttaa acttattact attagtattt aagcgtgaat 2280 aattatcatt agcatttaag ttacatttta taaaccaaac gacacctaaa gtgctccgtc 2340 atagttggct acttgccagc cgattattta gcacgcaagc catgctcgat ggatacaata 2400 gtatatgacc aatatagatg acctacgtac atgtgttcta tgcttcagca agcataatat 2460 gtttcttgcc ttcgcatcaa ctcaagtgtg tgatgatatg ttgctgtcta gtactaactc 2520 tgaatcaatt aactctgaat ttgtccaggc taaggagttc cttggtgctt ccggtgacaa 2580 gcgaaaggaa gtcaattaac tctgaatcag tggttctgct gcaaggtaaa ttgcctgtat 2640 ataattatcc atgtcagaac caactttatc taccaggatt aatttttagt ctcccaattt 2700 tatgccccag ttatatttta tcctagtgaa gttttactgc tctcatatac ttagatgaac 2760 taaagttgat cattttgtgc tcggaacaac tctgtataac agtctatata gtttaacagt 2820 ctatatagtt tgcatgcagg ttacacacaa cattttattg aatggaaaga ggacactcgg 2880 tgaccacaag atcatcagat gatcatttgt tgagctctgg aactaaatcc tctccgcagg 2940 tggtaaccag gcgggttccc atccgagttc cgaggtcact gtaatgctaa attgtcaagt 3000 tcagttatct gaattcagtt tgagttataa ttctcatcaa gcatcaatgt caccaactgt 3060 gtagaaatac tgaattttag catggagcgt ctttataaac attttagcat ggagcagttt 3120 ctcatcgatc atggctgtca agttctattt ctctacacag ttgcactttg tggttgtttt 3180 ctatcatttg tttgtgagcc catggatttt actaatttat tagcttgtgg tggtgcttgc 3240 ttgtatatga aggcccttgg attggcccgt ggatttttaa aaggatcgag gcggattagg 3300 atgtcggggc attaaaaaac ggattgaatt gagttgtatc aaatcaattt ggatttaagt 3360 agggctgggt tcacttttta aacttatagg attggagtgg ggttggggcc ggattgtgac 3420 ccattatcag gcttactgat atct 3444 <210> 41 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Duplicated region of transposon insertion sequence <400> 41 tactgatatc t 11 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide AC_R1 <400> 42 tcagtctcaa gaactcactt ctgg 24 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide AC_A1 <400> 43 gaaggtgacc aagttcatgc tactgatgga cggcccaca 39 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide AC_A2 <400> 44 gaaggtcgga gtcaacggat tactgatgga cggcccacg 39 <210> 45 <211> 76 <212> DNA <213> Zea mays <400> 45 actgatggac ggcccacacg cagggtggat tcgcctccac catggtcgtc gaccagaagt 60 gagttcttga gactga 76 <210> 46 <211> 74 <212> DNA <213> Zea mays <400> 46 actgatggac ggcccacgca gggtggattc gcctccacca tggtcgtcga ccagaagtga 60 gttcttgaga ctga 74 <210> 47 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DASbm1-specific probe <400> 47 aggcttactg atatctg 17 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Wild-type CAD2 specific probe <400> 48 ctgcagatat cagtagttac g 21 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer DASbm1_F <400> 49 gccggattgt gacccattat 20 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer DASbm1_R <400> 50 cgcgacaggc ggtaggta 18 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer Wt CAD2_F <400> 51 gcagcgtgtg aacttgtagg taa 23 <210> 52 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 515Dbm1-specific probe <400> 52 acggcccaca cgc 13 <210> 53 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Wt CAD2-specific probe <400> 53 acggcccacg cagg 14 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer bm1_F <400> 54 ggtcatacaa cgacgtctac actga 25 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer bm1_R <400> 55 atggtggagg cgaatcca 18 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer CAD2_F <400> 56 ccacatgggc gtgaaggta 19 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer CAD2_R <400> 57 ttcttggacg acgagctgat c 21 <210> 58 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe CAD2_Eprobe <400> 58 atgggccacc acgtga 16 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer INV59F <400> 59 atggtggagg cgaatcca 18 <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer INV59R <400> 60 tgccgtccgt gccct 15 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Probe INV_probe <400> 61 ccgtgtactt ctacctgc 18 <210> 62 <211> 160 <212> DNA <213> Zea mays <400> 62 gtgcgggctc gtctccatcg cccgccaccc gctccgtcgt cgtcgtcccc gccgcgccga 60 tcccgaatcg aatggggagc ctggcgtccg agaggaaggt ggtcgggtgg gccgccaggg 120 acgccaccgg acacctctcc ccctactcct acaccctcag 160 <210> 63 <211> 114 <212> DNA <213> Zea mays <400> 63 gaacacaggc cctgaagatg tggtggtgaa ggtgctctac tgcgggatct gccacacgga 60 catccaccag gccaagaacc acctcggggc ttcaaagtat cctatggtcc ctgg 114 <210> 64 <211> 228 <212> DNA <213> Zea mays <400> 64 gcacgaggtg gtcggcgagg tggtggaggt cgggcccgag gtggccaagt acggcgtcgg 60 cgacgtggta ggcgtcgggg tgatcgttgg gtgctgccgc gagtgcagcc cctgcaaggc 120 caacgttgag cagtactgca acaagaagat ctggtcatac aacgacgtct acactgatgg 180 acggcccacg cagggtggat tcgcctccac catggtcgtc gaccagaa 228

Claims (77)

  1. 서열 3과 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 핵산 분자.
  2. 서열 25와 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 핵산 분자.
  3. 서열 1과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 핵산 분자.
  4. 서열 23과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 핵산 분자.
  5. 서열 2와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 핵산 분자.
  6. 서열 24와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 핵산 분자.
  7. 서열 62와 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 핵산 분자.
  8. 서열 63과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리 핵산 분자.
  9. 제7항에 있어서, 서열 63과 적어도 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 핵산 분자.
  10. 제7항에 있어서, 핵산 분자는 NADPH-결합 및 C-말단 촉매 도메인을 결여한 단축 CAD2 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
  11. 서열 1의 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2(CAD2) 유전자로 이루어지는 단리 핵산 분자.
  12. 서열 23의 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2(CAD2) 유전자로 이루어지는 단리 핵산 분자.
  13. 서열 3과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2 단백질.
  14. 서열 25와 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2 단백질.
  15. 서열 3으로 이루어지는 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2 단백질.
  16. 서열 25로 이루어지는 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2 단백질.
  17. 미성숙 종결 코돈을 옥수수 식물내 CAD2 유전자중으로 도입시키는 단계를 포함하는, 트랜스제닉 옥수수 식물을 생성하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, AC 디뉴클레오티드 삽입을 옥수수 식물내 CAD2 유전자의 엑손 3중으로 도입시킴으로써 미성숙 종결 코돈이 도입되는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 삽입을 옥수수 식물내 CAD2 유전자의 인트론 1중으로 도입시킴으로써 미성숙 종결 코돈이 도입되는 방법.
  20. 제1항의 핵산 분자를 포함하는 식물.
  21. 제2항의 핵산 분자를 포함하는 식물.
  22. 제20항에 있어서, 식물은 지아 메이스(Zea mays)인 식물.
  23. 제21항에 있어서, 식물은 지아 메이스인 식물.
  24. 핵산 분자를 식물로부터 단리하는 단계; 및
    단리 핵산 분자를 야생형 CAD2 유전자의 뉴클레오티드 3994에 대응하는 위치에 AC 디뉴클레오티드 삽입을 포함하는 핵산 분자에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함하고, 여기에서 야생형 CAD2 유전자의 뉴클레오티드 3994에 대응하는 위치에 AC 디뉴클레오티드 삽입의 존재는 돌연변이체 CAD2 유전자를 표시하는 것인, 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2(CAD2) 유전자를 포함하는 식물을 동정하는 방법.
  25. 핵산 분자를 식물로부터 단리하는 단계; 및
    단리 핵산 분자를 야생형 CAD2 유전자의 뉴클레오티드 2786에 대응하는 위치에 트랜스포손 삽입을 포함하는 핵산 분자에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함하고, 여기에서 야생형 CAD2 유전자의 뉴클레오티드 2786에 대응하는 위치에 트랜스포손 삽입의 존재는 돌연변이체 CAD2 유전자를 표시하는 것인, 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2(CAD2) 유전자를 포함하는 식물을 동정하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 단리 핵산 분자를 스크리닝하는 단계는 폴리머라제 연쇄 반응을 포함하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 단리 핵산 분자를 스크리닝하는 단계는 폴리머라제 연쇄 반응을 포함하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 폴리머라제 연쇄 반응은 서열 1과 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 적어도 2종의 프라이머를 사용하여 수행되는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 프라이머는 서열 43, 서열 44, 서열 52, 서열 54, 및 서열 55로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머를 포함하는 방법.
  30. 제27항에 있어서, 폴리머라제 연쇄 반응은 서열 23과 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 적어도 2종의 프라이머를 사용하여 수행되는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 프라이머는 서열 47, 서열 49, 및 서열 50으로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머를 포함하는 방법.
  32. 제24항에 따른 방법으로 동정된 식물.
  33. 제32항에 있어서, 식물은 지아 메이스인 식물.
  34. 제25항에 따른 방법으로 동정된 식물.
  35. 제34항에 있어서, 식물은 지아 메이스인 식물.
  36. 제32항에 있어서, 식물은 갈색 주맥 표현형을 가지는 식물.
  37. 제34항에 있어서, 식물은 갈색 주맥 표현형을 가지는 식물.
  38. 제36항에 있어서, 지아 메이스 식물은 감소된 리그닌, 증가된 소화율, 및 에탄올 수율로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 형질을 가지는 식물.
  39. 제37항에 있어서, 지아 메이스 식물은 감소된 리그닌, 증가된 소화율, 및 에탄올 수율로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 형질을 가지는 식물.
  40. bm1 표현형을 갖는 옥수수 식물을 bm1 표현형을 결여한 옥수수 식물과 교잡하여 F1 옥수수 식물을 생성하는 단계;
    마커-조력 선택을 이용하여 야생형 CAD2 유전자의 뉴클레오티드 3994에 대응하는 위치에 AC 디뉴클레오티드 삽입을 포함하는 F1 옥수수 식물을 동정하는 단계; 및
    동정된 F1 옥수수 식물을 번식시켜 갈색 주맥 1(bm1) 표현형을 옥수수에 도입시키는 단계를 포함하는, 갈색 주맥 1(bm1) 표현형을 옥수수에 도입하는 방법.
  41. bm1 표현형을 갖는 옥수수 식물을 bm1 표현형을 결여한 옥수수 식물과 교잡하여 F1 옥수수 식물을 생성하는 단계;
    마커-조력 선택을 이용하여 야생형 CAD2 유전자의 뉴클레오티드 2786에 대응하는 위치에 트랜스포손 삽입을 포함하는 F1 옥수수 식물을 동정하는 단계; 및
    동정된 F1 옥수수 식물을 번식시켜 갈색 주맥 1(bm1) 표현형을 옥수수에 도입시키는 단계를 포함하는, 갈색 주맥 1(bm1) 표현형을 옥수수에 도입하는 방법.
  42. 제1항의 핵산 분자를 생물중으로 도입하는 단계를 포함하는, 유전자 조작 생물을 생산하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 생물은 식물인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 식물은 지아 메이스인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 제1항의 핵산 분자를 포함하는 지아 메이스 식물과 교잡함으로써 제1항의 핵산 분자를 지아 메이스 식물중으로 도입시키는 방법.
  46. 제42항에 있어서, 제1항의 핵산 분자를 형질전환에 의해 생물중으로 도입시키는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 제1항의 핵산은 생물의 게놈중으로 안정하게 통합되는 방법.
  48. 제46항에 있어서, 생물은 식물인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 식물은 지아 메이스인 방법.
  50. 제2항의 핵산 분자를 생물중으로 도입시키는 단계를 포함하는, 유전자 조작 생물을 생산하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 생물은 식물인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 식물은 지아 메이스인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 제2항의 핵산 분자를 포함하는 지아 메이스 식물과 교잡시킴으로써 제2항의 핵산 분자를 지아 메이스 식물중으로 도입시키는 방법.
  54. 제50항에 있어서, 제2항의 핵산 분자를 형질전환에 의해 생물중으로 도입시키는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 제2항의 핵산이 생물의 게놈중으로 안정하게 통합되는 방법.
  56. 제54항에 있어서, 생물은 식물인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 식물은 지아 메이스인 방법.
  58. 핵산 분자를 식물로부터 단리하는 단계; 및
    단리 핵산 분자를 돌연변이체 CAD2 유전자를 휴대하는 옥수수 식물을 동정하는 수단과 접촉시켜 식물중에 돌연변이체 CAD2 유전자의 존재를 표시하는 검출가능한 신호를 생성하는 단계를 포함하는, 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2(CAD2) 유전자를 포함하는 식물을 동정하는 방법.
  59. (a) CAD2 유전자와 연관되어 있는 적어도 1종의 마커와 특이적으로 하이브리드화가능한 프로브로 제1 식물의 게놈 DNA 및 제2 식물의 게놈 DNA를 분석하는 단계;
    (b) 제1 및 제2 식물을 유성생식 교잡하여 자손 집단을 수득하는 단계;
    (c) 자손 집단을 CAD2 유전자와 연관되어 있는 적어도 1종의 마커의 존재에 대하여 분석하는 단계;
    (d) CAD2 유전자와 연관되어 있는 적어도 1종의 마커를 포함하는 자손 집단으로부터의 개체를 제1 또는 제2 식물과 여교잡하여 후대 집단을 생성하는 단계;
    (e) 후대 집단의 구성원이 제1 또는 제2 식물 및 CAD2 유전자로부터의 목적하는 형질을 포함하는지 여부를 측정하는 단계; 및
    (f) 후대 집단의 어느 구성원도 제1 또는 제2 식물 및 CAD2 유전자로부터의 목적하는 형질을 포함하지 않는 경우, 제1 또는 제2 식물 및 CAD2 유전자로부터의 목적하는 형질을 포함하는 개체가 동정될 때까지 단계 (d)와 (e)를 반복하는 단계를 포함하는, 옥수수 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2(CAD2) 유전자를 전달하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 각각의 교잡 및 여교잡 단계에서 수득된 개개의 자손은 각각의 세대에서 CAD2 마커 분석에 의해 선발되는 방법.
  61. 옥수수 식물의 게놈 DNA를 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커와 특이적으로 하이브리드화가능한 프로브로 분석하여 옥수수 식물중 돌연변이체 CAD2 유전자를 동정하는 단계;
    돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커와 특이적으로 하이브리드화가능한 프로브와 특이적으로 하이브리드화하는 옥수수 식물의 게놈 DNA의 세그멘트를 단리하는 단계;
    게놈 DNA의 단리 세그멘트를 숙주 생물중으로 도입시키는 단계; 및
    숙주 생물의 DNA를 돌연변이체 CAD2 유전자와 연관된 마커와 특이적으로 하이브리드화가능한 프로브로 분석하여 숙주 생물중 돌연변이체 CAD2 유전자를 동정하는 단계를 포함하는, 옥수수 돌연변이체 신나밀 알콜 데히드로게나제 2(CAD2) 유전자를 숙주 생물중으로 형질전환에 의해 도입시키는 방법.
  62. 제33항의 옥수수 식물로부터 생산된 사일리지를 제공하는 단계; 및
    동물에 제33항의 옥수수 식물로부터 생산된 사일리지로 급식하는 단계를 포함하는, 사일리지-급식 동물에 급식하는 방법.
  63. 제35항의 옥수수 식물로부터 생산된 사일리지를 제공하는 단계; 및
    동물에 제35항의 옥수수 식물로부터 생산된 사일리지로 급식하는 단계를 포함하는, 사일리지-급식 동물에 급식하는 방법.
  64. 제62항에 있어서, 사일리지-급식 동물은 반추 동물인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 사일리지-급식 동물은 소인 방법.
  66. 제63항에 있어서, 사일리지-급식 동물은 반추 동물인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 사일리지-급식 동물은 소인 방법.
  68. 제62항에 있어서, 제33항의 옥수수 식물로부터 생산된 사일리지는 동물의 식이 중 건물의 15%를 넘는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 제33항의 옥수수 식물로부터 생산된 사일리지는 동물의 식이 중 건물의 적어도 약 25%인 방법.
  70. 제62항의 방법에 따라 급식한 동물로부터 제조된 육제품.
  71. 제33항의 옥수수 식물로부터 생산된 옥수수 사일리지를 포함하는 식용우 마무리 일량사료.
  72. 제71항에 있어서, 옥수수 사일리지는 bm1 옥수수 사일리지인 식용우 마무리 일량사료.
  73. 제63항에 있어서, 제35항의 옥수수 식물로부터 생산된 사일리지는 동물의 식이 중 건물의 15%를 넘는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 제35항의 옥수수 식물로부터 생산된 사일리지는 동물의 식이 중 건물의 적어도 약 25%인 방법.
  75. 제63항의 방법에 따라 급식한 동물로부터 제조된 육제품.
  76. 제35항의 옥수수 식물로부터 생산된 옥수수 사일리지를 포함하는 식용우 마무리 일량사료.
  77. 제76항에 있어서, 옥수수 사일리지는 bm1 옥수수 사일리지인 식용우 마무리 일량사료.
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