JP2014504864A - Ｂｍ１表現型に関連する遺伝子及び変種、分子マーカー並びにそれらの使用 - Google Patents

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Abstract

本開示は、特異的な天然起源の変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子に関し、この変化した遺伝子は特定のトウモロコシ系統におけるｂｍ１トウモロコシ表現型に寄与する。一部の実施形態において、変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む核酸分子及び／又は変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカーを利用する組成物及び方法が提供される。

Description

優先権主張
本願は、「GENE AND VARIATIONS ASSOCIATED WITH BM1 PHENOTYPE, MOLECULAR MARKERS, AND THEIR USE」の２０１１年１月３日に出願された米国特許仮出願第６１／４２９，３９０号の出願日の利益を主張するものである。
本開示は、トウモロコシ褐色中肋（brown midrib）（ｂｍ）表現型に関する。特定の実施形態において、本開示は、一部のトウモロコシ品種におけるｂｍ１表現型に寄与する、トウモロコシにおける特定の変化したＣＡＤ２遺伝子、変化したＣＡＤ２遺伝子を含む核酸分子及び／又はこのような核酸分子の翻訳から得られるタンパク質産物に関する。
リグニンは、細胞壁においてヘミセルロース等の炭水化物と架橋結合を形成する、植物における遍在的な成分である。リグニン及びセルロースは、植物細胞壁の主要二成分である。植物細胞壁は、細胞外環境に対する天然の障壁を提供する。多くの研究により、生物的ストレス（例えば、病原体感染）又は非生物的ストレス（例えば、乾燥、機械的ストレス等）に対する植物の応答の一つが、特に植物細胞壁におけるリグニン含量を増加させることによる、植物細胞壁の強化からなることが立証された。多くの農学又は工業適用は、その収量が植物細胞壁におけるリグニンの含量及び／又は組成に直接的に連関する所望の植物生成物（例えば、紙生産、サイレージ生産及び例えばバイオ燃料の形態のエネルギーの生産において用いられる生成物）に関係する。
リグニンポリマーは、トウモロコシ植物における繊維の消化性を制限する。リグニンポリマーは、反芻動物における繊維消化を低下させ、木化（lignification）の程度は、飼料作物の消化性に反比例し得る。Cherney et al. (1991) Adv. Agron. 46:157-98。リグニン含量及び組成の調節は、飼料の消化性の増加に望ましくなり得る。リグニン含量調節はまた、例えば、植物壁を強化し、これによりストレスに対する抵抗性を改善するため、或いは逆に、セルロース又は他の化合物の抽出が容易となるよう植物壁を弱めるためにも望ましくなり得る。Baucher et al. (1998) Plant Mol. Biol. 39:437-47。
しかし、リグニン生合成経路を改変する仕方を解明し、改変の結果がいかなるものとなるか予測するのは困難である。その理由として、少なくとも一部には、リグニン生合成経路が、多数の酵素反応に関与する複雑な経路であることが挙げられる。例えば、Dixon et al. (2001) Phytochemistry 57(7):1069-84を参照されたい。例えば、経路における改変により導入された変化を代償するために、経路を生理的に変化させる可能性のある機序は、不明である。
リグニンは、フェニルプロパノイド経路に由来するアルコール又はモノリグノールの３種のモノマー、ｐ−クマリル（coumaryl）アルコール（Ｈサブユニット）、コニフェリルアルコール（Ｇサブユニット）及びシナピル（sinapyl）アルコール（Ｓサブユニット）の不溶性ポリマーである。Neish (1968) Constitution and Biosynthesis of Lignin, eds. New York, Springer Verlag 1-43。それぞれの型のサブユニットは、他のサブユニットと様々な結合を形成し、これによりリグニンを構成することができる。他の壁性（parietal）化合物（例えば、多糖類及びタンパク質）と他の結合を確立して、複雑な三次元ネットワークを形成することもできる。
複雑なリグニン生成経路における工程は、水酸化、芳香環のＯ−メチル化及びカルボキシル側鎖からアルコール官能基への変換を包含する。モノリグノール生合成経路に関する現在の仮説は、代謝ネットワークにおける側鎖の種々のレベルの酸化における連続的な水酸化及びＯ−メチル化反応による、Ｓ及びＧサブユニットの生成を包含する。ネットワークの酵素は、コーヒー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）；ヒドロキシシナメート（hydroxyxinamate）補酵素Ａリガーゼ（４ＣＬ）；チトクロムＰ４５０依存性フェルラ酸（ferulate）５−ヒドロキシラーゼ（Ｆ５Ｈ）；並びにシンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）及びシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（ＣＡＤ）の数種のアイソフォームを包含する。
数年の間、リグニン生合成経路の１又は複数の遺伝子を過剰発現又は過小発現させることにより、植物のリグニン含量及び組成を改変するための試みが為されてきた。Anterola and Lewis (2002) Phytochemistry 61:221-94。種々の戦略が思い描かれてきたが、リグニン生合成経路における１又は複数の酵素の過剰発現又は過小発現は、必ずしも信頼且つ予測できる結果をもたらすという訳ではなかった。
別の戦略は、選択スキームにおける、リグニン生合成経路における標的遺伝子の変異体の使用からなる。褐色中肋（ｂｍｒ）変異を含有する植物は、変化したリグニン組成及び消化性を示す。トウモロコシにおいて、少なくとも４種の独立した褐色中肋変異が同定されている。Kuc et al. (1968) Phytochemistry 7:1435-6。「ｂｍ１、ｂｍ２、ｂｍ３及びｂｍ４」と称されるこれら変異は全て、対照トウモロコシと比較して減少したリグニン含量を示す。褐色中肋トウモロコシ植物は、Ｖ４〜Ｖ６ステージの葉中肋における褐色の色素沈着と、タッセリング（tasselling）後の髄の淡褐色の呈色によって特徴づけられる。特徴づけられたｂｍｒ変異の一つは、ＣＯＭＴ酵素における挿入変異である（ｂｍ３）。
成熟ｂｍ１トウモロコシ植物は、１０〜２０％低下したリグニン含量を有し、フェルラ酸エステルが僅かに減少し、相当に低下したｐ−クマル酸（coumaric）エステル及びフェルラ酸エステル含量（ほぼ４０％）を有する。Provan et al. (1997) J. Agric. Food 73:133-42; Barriere et al. (2004) Comptes Rendus Biologie 327:847-60。ｐ−ヒドロキシフェニル、グアヤシル及びシリンギルチオ酸分解（thioacidolysis）モノマーの頻度は、ｂｍ１と野生型植物で類似しており、この結果は、ｂｍ１変異が、単一型のリグニンサブユニットに特異的に影響を及ぼさないことを示す。Guillaumie et al. (2007) Planta 226(1):235-50。ｂｍ１植物のリグニンは、炭素−炭素サブユニット間結合が相当に豊富であると考えられ（Halpin et al. (1998) Plant J. 14(5):545-53; Barriere et al. (2004)、上記）、ｂｍ１リグニンは、コニファーアルデヒド（coniferaldehyde）と、それ程ではないがシナプアルデヒド（sinapaldehyde）の相当な取り込みを有する。Kim et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:47412-9。
トウモロコシ（corn/maize）の農業上重要な用途として、サイレージが挙げられる。サイレージは、反芻動物に与えることのできる発酵した高水分の飼料である。これは、生牧草貯蔵法（ensilage）又はサイレージ作製（silaging）と呼ばれるプロセスにおいて発酵、貯蔵され、通常、トウモロコシ又はソルガム若しくは他の穀類等の他の牧草（grass）作物から緑色の植物全草（entire green plant）を用いて作製される。バルク（bulk）サイレージは一般に乳牛に与え、一方、ベール（baled）サイレージは、肉牛、ヒツジ及びウマに用いる傾向がある。サイレージは発酵過程を経るため、発酵性細菌によってエネルギーが利用され、飼料を保存する酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩及び酪酸塩等、揮発性脂肪酸が生成される。その結果、発酵性細菌が炭水化物の一部を用いて揮発性脂肪酸を生成するため、サイレージは元々の飼料よりもエネルギーが低くなる。トウモロコシサイレージは、エネルギー及び消化性が高く、立毛（stand-crop）から給餌時まで機械化に容易に適応されるため、反芻動物に一般的な飼料である。トウモロコシサイレージは一般に、やや褐色から濃緑色の色をしており、ほのかに快い香りがする。
褐色中肋トウモロコシ（ｂｍトウモロコシ）におけるリグニンの低下は、正常トウモロコシよりも消化し易い繊維を有するサイレージをもたらし、バイオ燃料変換率の改善を示す。ｂｍｒトウモロコシサイレージを泌乳期乳牛に給餌すると、乾物摂取量（ＤＭＩ）及び牛乳生産量が増加することが示された。Grant et al. (1995) J. Dairy Sci. 78:1970-80; Oba and Allen (2000) J. Dairy Sci. 83:1333-41; Oba and Allen (1999) J. Dairy Sci. 82:135-42。しかし、ｂｍｒトウモロコシサイレージは、従来のトウモロコシ品種から作製したトウモロコシサイレージと比較して、肉用牛における１日当たりの平均増体飼料効率（gain and feed efficiency）（Ｇ：Ｆ）を低下させた。Tjardes et al. (2000) J. Anim. Sci. 78:2957-65。褐色中肋雑種トウモロコシ系統は、多くの場合低収量であることも判明している。褐色中肋雑種トウモロコシは通常、飼料の倒伏（lodging）及び直立性（standability）の欠如にも関連づけられている。
本明細書において、トウモロコシ（corn/maize）におけるｂｍ１表現型に寄与する変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む核酸分子が記載されている。変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子に連鎖する、或いはその中に存する分子マーカーについても記載されている。驚くべきことに、リグニン生合成の入り組んだ経路は、変異体ＣＡＤ２遺伝子を含有する植物が野生型植物に見られるレベルよりも低いリグニンレベルを有するように、変異体ＣＡＤ２遺伝子の存在下で明らかに変化する。変異体ＣＡＤ２遺伝子の特性評価及び変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカーの同定は、植物生殖質におけるリグニン低下表現型の開発及び配備を大いに促進することができる。一部の実施形態において、変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子に連鎖する又はその中に存するマーカー、或いは変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子配列それ自体を用いて、他の生物、例えば、植物、酵母及び原核生物に変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を導入することができる。
特定の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子は、切断型ＣＡＤ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、ＣＡＤ２遺伝子のエクソン（例えば、エクソン３）又はイントロン（例えば、イントロン１）に挿入変異を含む変異体ＣＡＤ２遺伝子は、より短い遺伝子産物を生じる未成熟終止コドンを導入することができる。一部の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子は、１又は複数のトウモロコシ系統における天然起源の変異を含むことができる。一部の実施形態において、変異体ＣＡＤ２遺伝子は、公知のｂｍｒトウモロコシ品種、例えば５１５Ｄｂｍ１からクローニングされる。他の実施形態において、変異体ＣＡＤ２遺伝子は、これまで知られていないｂｍｒトウモロコシ品種、例えばＤＡＳｂｍ１からクローニングされる。本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子は、植物において発現すると、植物において表現型、例えば、植物の組織におけるＣＡＤ２ ＲＮＡレベルの低下及び／又は植物の組織におけるリグニン含量の低下を生じ得る。
本明細書においては、例えば（これらに限定されない）、リグニン低下表現型を有する植物を同定するために；変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を新しい植物遺伝子型に導入するために（例えば、マーカー支援育種又は遺伝子形質転換により）；野生型ＣＡＤ２遺伝子と、本開示に係る特定の変異体ＣＡＤ２遺伝子との間を区別するために；及び本開示に係る変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子に連鎖する、或いはその中に存する核酸分子マーカーを含む第一の植物と、変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を必要に応じて保有する第二の植物との交雑から植物体及び植物種子を作出するために、本開示に係る変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子に連鎖する、或いはその中に存する核酸分子マーカーを用いる方法も記載されている。一部の実施形態において、変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子は、トウモロコシ以外の植物種へと操作される。
変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を含む遺伝子組換え植物（例えば、トウモロコシ）を作出するための手段と、変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を保有する植物（例えば、トウモロコシ）を同定するための手段が更に記載されている。変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を含む遺伝子組換え植物を作出するための手段は、本開示に係る変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子に連鎖する、或いはその中に存するマーカーである。変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を保有する植物を同定するための手段は、本開示に係る変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子に連鎖する、或いはその中に存するマーカーと特異的にハイブリダイズするプローブである。
例えば、トウモロコシサイレージの増体：飼料比（gain to feed ratio）（Ｇ：Ｆ）を増加させることにより、サイレージを与える動物の肉の量を増加させるための方法が開示されている。一部の実施形態において、サイレージを与える動物の肉の量を増加させるための方法は、本開示に係る変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を含むトウモロコシから得られた植物材料を用意するステップと、該植物材料をトウモロコシサイレージの作製に用いるステップと、該トウモロコシサイレージを、反芻動物に給餌するための肥育仕上げ用飼料（finishing ration）に取り込むステップとを含むことができる。よって、本開示に係る又は本開示の方法に従って肥育仕上げ用飼料を与えた動物から作製された肉及び肉製品も提供される。
前述及び他の特色は、添付の図面を参照しつつ進行する、以下の数例の実施形態の詳細な説明から更に明らかとなるであろう。
７本の重複する５１５Ｄｂｍ１ ＣＡＤ２ ＰＣＲ断片の相対的な長さ及び位置を示すダイアグラムである。図１は、１３本の重複するＤＡＳｂｍ１ ＣＡＤ２ ＰＣＲ断片の相対的な長さ及び位置を示すダイアグラムも包含する。 ＤＡＳｂｍ１ ＣＡＤ２における挿入のゲノム構造を示すダイアグラムである。ＣＡＤ２の最初の２個の内在性エクソンのみを示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 公開受託番号（public accession）ＡＣ２３００３１のＢ７３配列を用いたＺｍＣＡＤ２ゲノム配列のアライメントを包含する図である。１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失並びにＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入が同定された。ＡＣ挿入は、５１５Ｄｂｍ１変異体のエクソン３のみに存在する。エクソンは、大文字フォントで示す。イントロン及びプロモーター領域は、小文字フォントで示す。 プライマー対ＣＶＦ／ＣＶＲにより、ＤＡＳｂｍ１、５１５Ｄｂｍ１及び野生型６ＸＮ４４２から増幅されたｃＤＮＡ配列を包含する（下線）、予測されるＺｍＣＡＤ２ ｃＤＮＡ配列のアライメントを包含する図である。ＤＡＳｂｍ１は、４０９ｂｐの挿入を含有する。 プライマー対ＣＶＦ／ＣＶＲにより、ＤＡＳｂｍ１、５１５Ｄｂｍ１及び野生型６ＸＮ４４２から増幅されたｃＤＮＡ配列を包含する（下線）、予測されるＺｍＣＡＤ２ ｃＤＮＡ配列のアライメントを包含する図である。ＤＡＳｂｍ１は、４０９ｂｐの挿入を含有する。 プライマー対ＣＶＦ／ＣＶＲにより、ＤＡＳｂｍ１、５１５Ｄｂｍ１及び野生型６ＸＮ４４２から増幅されたｃＤＮＡ配列を包含する（下線）、予測されるＺｍＣＡＤ２ ｃＤＮＡ配列のアライメントを包含する図である。ＤＡＳｂｍ１は、４０９ｂｐの挿入を含有する。 プライマー対ＣＶＦ／ＣＶＲにより、ＤＡＳｂｍ１、５１５Ｄｂｍ１及び野生型６ＸＮ４４２から増幅されたｃＤＮＡ配列を包含する（下線）、予測されるＺｍＣＡＤ２ ｃＤＮＡ配列のアライメントを包含する図である。ＤＡＳｂｍ１は、４０９ｂｐの挿入を含有する。 ５１５Ｄｂｍ１由来のＣＡＤ２が、フレームシフト及び未成熟終止コドンを生じるＡＣ挿入により１４７アミノ酸のみを有することを図示する、予測されるＺｍＣＡＤ２タンパク質配列のアライメントを包含する図である。６ＸＢ４４２由来のＣＡＤ２における３６７アミノ酸と比較して、ＤＡＳｂｍ１由来のＣＡＤ２は、４８アミノ酸のみを有する。同一性領域を太字フォントで示す。Ｂ７３ ＣＡＤ２のアミノ酸配列は、６ＸＮ４２２ ＣＡＤ２のアミノ酸配列と同一であり、従って、図示していない。 野生型、５１５Ｄｂｍ１及びＤＡＳｂｍ１トウモロコシ中肋及び葉におけるＣＡＤ２ ＲＮＡの相対発現レベルを示すデータを包含する図である。データは、野生型トウモロコシ６ＸＮ４４２の中肋におけるＲＮＡレベルに対し正規化される。データは、３株の植物の平均値を表し、エラーバーは、標準偏差を示す。 野生型、５１５Ｄｂｍ１及びＤＡＳｂｍ１トウモロコシにおける総リグニンの相対量を示すデータを包含する図である。データは、３株の植物の平均値を表し、植物１株当たり５個の試料が、葉及び節間部の両方から得られる。エラーバーは、標準偏差を示し、Ｐ値は、スチューデントＴ検定から得られた。 プライマー及び鋳型配列によるＫＡＳＰａｒアッセイ系のダイアグラムである。５１５Ｄｂｍ１（配列番号４５）及び６ＸＮ４４２（配列番号４６）の鋳型配列を示す。 ＫＡＳＰａｒアッセイｂｍ１アレル決定を示すデータを包含する図である。ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＫＬＩＭＳ）を用いて、プレートリーダーからの蛍光強度の生データを解析した。同様にＫＬＩＭＳを用いて、ＶＩＣのＲＦＵに対してプロットしたＦＡＭのＲＦＵを示すグラフを作成した。クラスター図（cluster view）に表示されているクラスター分離（cluster separation）に基づき遺伝子型決定を行った。 ＴａｑＭａｎ ＣＡＤ２アレル決定を示すデータを包含する図である。ＶＩＣの相対蛍光単位（ＲＦＵ）をｙ軸に表示し、ＦＡＭのＲＦＵをｘ軸に表示して、ｉＣｙｃｌｅｒ光学システムソフトウェアを用いてアレル識別を算出した。
配列表
添付の配列表に収載されている核酸配列は、米国特許施行規則第１．８２２条（37 C.F.R. § 1.822）に規定されているヌクレオチド塩基標準文字略語を用いて示す。各核酸配列の一方の鎖のみ示すが、表示されている鎖について言及する場合常に相補鎖が包含されていることが理解されよう。添付の配列表において、次の配列が記されている。
配列番号１は、５１５Ｄｂｍ１ ＣＡＤ２の５９２４ｂｐのゲノム配列を示す。
配列番号２は、５１５Ｄｂｍ１ ＣＡＤ２の１５１２ｂｐの予測されるｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号３は、５１５Ｄｂｍ１ ＣＡＤ２の１４７アミノ酸の予測される切断型タンパク質配列を示す。
配列番号４は、６ＸＮ４４２ ＣＡＤ２の５８９８ｂｐのゲノム配列を示す。
配列番号５は、６ＸＮ４４２ ＣＡＤ２の１５１０ｂｐの予測されるｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号６は、６ＸＮ４４２ ＣＡＤ２の３６７アミノ酸の予測されるタンパク質配列を示す。
配列番号７は、Ｂ７３ ＣＡＤ２の５９１６ｂｐのゲノム配列を示す。
配列番号８は、Ｂ７３ ＣＡＤ２の１５１０ｂｐの予測されるｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号９〜２２は、５１５Ｄｂｍ１変異体及び野生型６ＸＮ４４２トウモロコシの両方から７本の重複するＣＡＤ２断片を増幅するために用いたフォワード及びリバースプライマーを示す。
配列番号２３は、ＤＡＳｂｍ１ ＣＡＤ２の９３６０ｂｐのゲノム配列を示す。
配列番号２４は、プライマー対ＣＶＦ／ＣＶＲにより増幅されたＤＡＳｂｍ１ ＣＡＤ２の部分ｃＤＮＡ配列を示す。
配列番号２５は、ＤＡＳｂｍ１ ＣＡＤ２の４８アミノ酸の予測される切断型タンパク質配列を示す。
配列番号２６〜３４は、ＤＡＳｂｍ１変異体から部分ＣＡＤ２断片を増幅するために用いたフォワード及びリバースプライマーを示す。
配列番号３５及び３６は、部分ＣＡＤ２ ｃＤＮＡ断片を増幅するために用いたフォワード及びリバースプライマーを示す。
配列番号３７〜３９は、ＤＡＳｂｍ１変異体から部分ＣＡＤ２断片を増幅するために用いたフォワード及びリバースプライマーを示す。
配列番号４０は、ＤＡＳｂｍ１ ＣＡＤ２における３４４４ｂｐのトランスポゾン挿入を示す。
配列番号４１は、ＣＡＤ２の第一のイントロンからのＤＡＳｂｍ１トランスポゾン挿入における複製された１１ｂｐの配列を示す：ＴＡＣＴＧＡＴＡＴＣＴ。
配列番号４２〜４４は、ＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイにおいて、５１５Ｄｂｍ１アレルを他のｂｍ１及び野生型ＣＡＤ２アレルから区別するために用いたプライマーを示す。
配列番号４５及び４６は、ＫＡＳＰａｒアッセイにおいてプライマーがアニーリングする鋳型配列を示す。配列番号４５は、５１５Ｄｂｍ１のゲノム配列である。配列番号４６は、６ＸＮ４４２のゲノム配列である。
配列番号４７は、変異体ＤＡＳｂｍ１に特異的なプローブを示す。
配列番号４８は、野生型ＣＡＤ２アレルに特異的なプローブを示す。
配列番号４９〜５１は、ＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイにおいて、ＤＡＳｂｍ１及び野生型ＣＡＤ２アレルを区別するために用いたプライマーを示す。
配列番号５２は、変異体５１５Ｄｂｍ１に特異的なプローブを示す。
配列番号５３は、野生型ＣＡＤ２アレルに特異的なプローブを示す。
配列番号５４及び５５は、ＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイにおいて、５１５Ｄｂｍ１及び野生型ＣＡＤ２アレルを区別するために用いたプライマーを示す。
配列番号５６〜６１は、ＣＡＤ２及び対照のｑＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマー及びプローブを示す。
配列番号６２は、ＣＡＤ２の第一のエクソンのヌクレオチド配列を示す。
配列番号６３は、ＣＡＤ２の第二のエクソンのヌクレオチド配列を示す。
配列番号６４は、ＣＡＤ２の第三のエクソンのヌクレオチド配列を示す。
Ｉ．数例の実施形態の概要
ｂｍ１変異体は、ＣＡＤ遺伝子座と共局在する、以前に記載されていない変異を含む。Halpin et al. (1998)、上記；Guillaumie et al. (2007)、上記。本明細書において、ｂｍ１表現型に寄与するトウモロコシ（Zea mays）ＣＡＤ２コード配列内の特異的変異の同定について記載されている。一部の実施形態は、切断型ＣＡＤ２タンパク質を生じるＡＣ挿入を第３のエクソンに含有する、周知のｂｍ１トウモロコシ系統、５１５Ｄｂｍ１からクローニングされた変異体ＣＡＤ２遺伝子を包含する。一部の実施形態は、別個の切断型ＣＡＤ２タンパク質を生じるトランスポゾン挿入を含有する、新たに発見されたｂｍｒトウモロコシ系統、ＤＡＳｂｍ１からクローニングされた変異体ＣＡＤ２遺伝子を包含する。ＤＡＳｂｍ１植物は、野生型植物よりも有意に低いＣＡＤ２ ＲＮＡ発現レベルを有し、リグニン含量の低下も示す。各特異的変異に連鎖するハイスループットマーカーの開発、検証及び応用についても記載されている。
ｂｍ１表現型の分子基盤は、例えばｂｍ３ほどには理解されていない。Halpin et al. (1998)、上記は、ＣＡＤ活性、タンパク質レベル及び転写産物存在量の全てが、ｂｍ１遺伝子型において有意に低下し、後にＣＡＤ２であると同定されたＣＡＤ遺伝子が、ｂｍ１遺伝子座と密接に連鎖してマッピングされたことを示した。変異体植物においてある程度のＣＡＤタンパク質及びｍＲＮＡは検出できたため、この著者らは、ｂｍ１がＣＡＤ２の無発現変異ではなく、調節エレメントによりその発現に影響を及ぼしていると提唱した。Halpin et al. (1998)、上記。マイクロアレイを用いたその後の遺伝子発現試験は、単にＣＡＤ２のみならず、多数の遺伝子がｂｍ１植物において過小発現していることを示した。Guillaumie et al. (2007)、上記。このような多数の過小発現した遺伝子は、多くのリグニン生合成経路遺伝子及び転写因子を包含し、この結果は、恐らく転写因子のうちの１種が、ｂｍ１の根底にある遺伝子であるとの更なる推論を導いた。
ごく最近では、ソルガムＳｂＣＡＤ２遺伝子におけるナンセンス変異が、一部の品種におけるソルガムｂｍｒ変異体、ｂｍｒ６の根底にある機序であることが示された。Saballos et al. (2009) Genetics 181:783-95；Sattler et al. (2009) Plant Physiology 150:584-95。ナンセンス変異は、ＣからＴへの置換を含有し、この置換は、未成熟終止コドンを生じ、ＮＡＤＰＨ結合及びＣ末端触媒ドメインを欠く切断型ＳｂＣＡＤ２タンパク質をもたらす。Id。
前述を鑑みると、ｂｍ１表現型が、転写因子又は遺伝子調節エレメントにおける変異に起因し得るという現在受け入れられている理論には疑問があるため、研究を行って、トウモロコシＣＡＤ２における変異がｂｍ１表現型を生じ得るか決定した。ｂｍ１及びＣＡＤ２遺伝子座の領域におけるトウモロコシ遺伝子／物理地図の精密な検査は、トウモロコシＣＡＤ２が、５番染色体上のセントロメアのごく近傍に位置することを明らかにした。セントロメア領域周辺における公知の組換え抑制のため、このような近接は、高分解能遺伝子マッピングに重要な課題を課す。従って、伝統的な遺伝子マッピングアプローチが成功するかは、全く可能性がない訳ではないとしても、少なくとも予測不可能であるため、対象トウモロコシ品種におけるｂｍ１表現型の原因となり得るＺｍＣＡＤ２における任意の特異的変異を同定するために、ＰＣＲに基づく候補遺伝子クローニングアプローチを設計した。
よって、一部の実施形態において、特異的ＣＡＤ２変異体の同定は、ＰＣＲに基づく遺伝子クローニングアプローチを用いて行うことができる。一部の実施形態において、トウモロコシ（Zea mays）ＣＡＤ２は、ｂｍ１及び野生型生殖質の両方からクローニングして、ＣＡＤ２における特異的変異をｂｍ１生殖質から同定することができる。特定の実施形態において、フレームシフトを生じるＡＣジヌクレオチド挿入変異が、ｂｍ１生殖質内において同定される。更に別の実施形態において、ＣＡＤ２の第一のイントロンにおける３４４４塩基対のトランスポゾン挿入が、ｂｍ１生殖質内において同定される。本明細書に記載されているトウモロコシにおいてｂｍ１表現型を生じる特定の変異体ＣＡＤ２遺伝子は、ｂｍ１品種、５１５Ｄｂｍ１からクローニングされたＣＡＤ２遺伝子の第三のエクソンにＡＣジヌクレオチド挿入を含む。
本明細書に記載されているトウモロコシにおいてｂｍ１表現型を生じる更に別の変異体ＣＡＤ２遺伝子は、新規のｂｍ１品種、ＤＡＳｂｍ１のＣＡＤ２遺伝子におけるトランスポゾン挿入を含む。同定された挿入は、３４４４塩基対の長さであり、ＣＡＤ２とキメラｍＲＮＡを生成する３個のエクソン（４０９塩基対）にスプライスされる。キメラｍＲＮＡは、コード領域にフレームシフト及び未成熟終止コドンをもたらし、ほんの４８アミノ酸の切断型ＣＡＤ２タンパク質を生じる。この切断型タンパク質は、ＮＡＤＰＨ結合及びＣ末端触媒ドメインの両方を欠き、従って、細胞内で産生されたとしても非機能性である可能性が最も高い。
ＤＡＳｂｍ１植物は、５１５Ｄｂｍ１と同様に、有意に低下したＣＡＤ２ ＲＮＡレベル及び低下した総リグニン含量を有する。ＣＡＤ２は、これら天然起源の変異体におけるトウモロコシｂｍ１表現型の根底にある遺伝子であると決定され、観察されるｂｍｒ表現型の分子基盤を提供する。ＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入及び５１５Ｄｂｍ１におけるＡＣ挿入に基づき、これら特定のＣＡＤ２アレルを検出し、これらを野生型アレルから区別するためのハイスループットＫＡＳＰａｒ及びＴａｑＭａｎアッセイが決定され、評価された。アッセイは、ｂｍ１生殖質同定に用いる、ｂｍ１形質の遺伝子移入の加速に用いる並びに例えばサイレージ消化性及び／又はバイオ燃料のエタノール収量が改善された植物の分子育種の促進に用いることができる。変異したＣＡＤ２遺伝子配列を用いて、トランスジェニックアプローチにより、新たなトウモロコシ遺伝子型又は他の作物、例えば、ソルガムやスイッチグラス（switch grass）にｂｍ１表現型を導入することができる。ｂｍ１及び他のｂｍｒ表現型は、ＤＡＳ’ ＥＸＺＡＣＴ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙと組み合わせた場合、導入遺伝子の可視的選択マーカーとして用いることもできる。
ハイスループットＰＣＲマーカーは、とりわけ、トウモロコシにおけるｂｍ１表現型に寄与するＣＡＤ２変異の、生物における同定；トウモロコシにおけるｂｍ１表現型に寄与するＣＡＤ２変異の、生物（例えば、植物）への導入；及びｂｍ１トウモロコシのマーカー支援育種の促進に用いることができる。よって、ＣＡＤ２における特異的変異（例えば、フレームシフト変異及びトランスポゾン挿入）に基づく特定のハイスループットＰＣＲマーカーの開発、検証及び応用についても記載されている。
ＩＩ．略語
４ＣＬ ヒドロキシ桂皮酸（hydroxycinnamate）補酵素Ａリガーゼ
ＡＢＣトランスポーター ＡＴＰ結合カセットトランスポーター
ＡＧＯ アルゴノート（ARGONAUTE）
ＡＰＬ 変化した師部発達（ALTERED PHLOEM DEVELOPMENT）
ｂｍｒ 褐色中肋
ｂＺＩＰ 塩基性領域／ロイシンジッパーモチーフ
ＣＡＤ シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ
ＣＡＤ１ シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ１
ＣＡＤ２ シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２
ＣＣＲ シンナモイル−ＣｏＡレダクターゼ
ＣＯＭＴ コーヒー酸３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
ＣＯＶ１ 連続的維管束環（CONTINUOUS VASCULAR RING）
ＤＦＲ ジヒドロフラボノイド（dihydro-flavonoid）レダクターゼ
ＥｇＣＡＤ１型ＺｍＣＡＤ１ ＥｇＣＡＤ１型トウモロコシシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ１
ＥＳＴ 発現配列タグ
Ｆ５Ｈ チトクロムＰ４５０依存性フェルラ酸（ferulate）５−ヒドロキシラーゼ
ＦＡＭ フルオロフォア６−カルボキシフルオセイン
ＨＣＴ ヒドロキシシンナモイル−ＣｏＡトランスフェラーゼ２
ＫＬＩＭＳ ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ
ＬＩＭ ＬＩＭホメオドメイン
ＭＡＤＳボックス 保存されたＭＡＤＳ配列モチーフ（ＭＣＭ１、ＡＧＡＭＯＵＳ、ＤＥＦＩＣＩＥＮＳ、ＳＲＦ）
ＭＰ ＭＯＮＯＰＴＥＲＯＵＳ
ＯＭＴ Ｏ−メチルトランスフェラーゼ
ＯＲＦ オープンリーディングフレーム
ＰＡＬ フェニルアラニンアンモニアリアーゼ
ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＦＵ 相対蛍光単位
ＳＡＤ シナピル（sinapyl）アルコールデヒドロゲナーゼ
ＳＡＭＳ３ Ｓ−アデノシル−メチオニンシンターゼ３
ＶＩＣ（登録商標） ＶＩＣ（登録商標）フルオロフォア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
ＩＩＩ．用語
戻し交雑：戻し交雑法は、植物への核酸配列の導入に用いることができる。戻し交雑技法は、植物への新たな形質の導入に何十年もの間広く用いられてきた。Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988。典型的な戻し交雑プロトコールにおいて、対象とする本来の品種（反復親（recurrent parent））は、移入すべき対象遺伝子を保有する第二の品種（非反復親）と交雑させられる。次に、この交雑から得られた後代を反復親と再度交雑させ、転換植物において、非反復親から伝えられた遺伝子に加えて反復植物の所望の形態的及び生理的特徴の基本的に全てが回収された植物が得られるまで、このプロセスを反復させる。
トウモロコシ（corn）植物：本明細書において、用語「トウモロコシ（corn）植物」は、トウモロコシ（Zea mays）種の植物（maize）を意味する。
ＢＭトウモロコシ：本明細書において、用語「ＢＭトウモロコシ」（又は「ＢＭＲトウモロコシ」）は、褐色中肋変異を含有するトウモロコシ品種を意味する。ＢＭトウモロコシ品種は、通常、葉中肋に赤褐色の色素沈着を示す。ＢＭトウモロコシは、通常、より低いリグニン含量、より高い繊維消化性及びより高い乾物摂取量によっても特徴づけられる。ＢＭトウモロコシ品種の非限定的な例として、ｂｍ１トウモロコシ品種、例えば、５１５Ｄｂｍ１が挙げられる。
ｂｍ１表現型：本明細書において、用語「ｂｍ１表現型」は、ｂｍ１トウモロコシにおいて観察されてきた、変化したリグニン含量及び／又は組成のプロファイルを意味することができる。例えば、ｂｍ１表現型は、次の特徴のうち１又は複数によって特徴づけることができるが、これらに限定されない。同一種の野生型植物のリグニン含量と比較して１０〜２０％低下したリグニン含量（Guillaumie et al. (2007)、上記）；フェルラ酸エステルの減少（Id.）；フェルラ酸エーテル含量の低下（Id.）；ｐ−クマル酸（coumaric）エステル含量の低下（Marita et al. (2003) J. Agric. Food Chem. 51:1313-21）；アルデヒドレベルの増加（Id.）；炭素−炭素ユニット間（inter unit）サブユニット結合におけるリグニンの濃縮（Halpin et al. (1998)、上記；Barriere et al. (2004)、上記）；並びにリグニンへのコニファーアルデヒド（coniferaldehyde）及び／又はシナプアルデヒド（sinapaldehyde）の実質的な取り込み（Kim et al. (2002)、上記；及びBarriere et al. (2004)、上記）。
乾物：本明細書において、用語「乾物」は、飼料等、任意の家畜飼料を意味する。
ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ競合的アレル特異的ＰＣＲ ＳＮＰ遺伝子型判定システム（ＫＡＳＰａｒ（商標））：ＫＡＳＰａｒ（商標）は、ＳＮＰ遺伝子型を決定するための、市販されている均一蛍光システムである（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．、英国ホッデスドン）。ＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイは、３種の非標識プライマーを含有するＳＮＰ特異的「アッセイミックス」と、他のあらゆる必要な成分、例えば、ユニバーサル蛍光レポートシステム（universal fluorescent reporting system）を含有する「反応ミックス」とを含む。これらのミックスに加えて、使用者はとりわけ、ＦＲＥＴ対応プレートリーダー、マイクロタイタープレート（複数可）及び約５ｎｇ／Ｌ ＤＮＡを含有するＤＮＡ試料を用意する。
典型的なＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイは、アレル特異的プライマー設計のステップ（例えば、ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓウェブサイトからインターネットを通じて利用できる無料サービスである、ＰｒｉｍｅｒＰｉｃｋｅｒ（商標）を用いて）と、該アレル特異的プライマーを包含する反応ミックスの調製のステップと、マイクロタイタープレートにおいて該反応ミックスをＤＮＡ試料と混合するステップと、熱サイクル（thermocycling）のステップと、蛍光プレートリーダーで該プレートを読み取るステップと、蛍光データをプロットし点数化するステップとを含む。各試料からのデータは、共にｘ及びｙ軸がＦＡＭ及びＶＩＣ蛍光値に対応する２Ｄグラフにプロットする。同一ＳＮＰ遺伝子型を有する試料は、プロットにおいて共にクラスター形成する（即ち、Ａ／Ａ；Ａ／ａ；及びａ／ａ）。よくある問題の解決法の案内等、ＫＡＳＰａｒシステムに関する更なる技術情報は、ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌｔｄ．（例えば、ＫＡＳＰａｒ ＳＮＰ遺伝子型判定システム試薬マニュアル）から得られる。
連鎖する、密接に連鎖する及び非常に密接に連鎖する：本明細書において、遺伝子又はマーカー間の連鎖とは、染色体上の遺伝子又はマーカーが、次世代の個体に共に受け継がれる測定可能な確率を示す現象を意味することができる。２種の遺伝子又はマーカーが互いに近接すればするほど、この確率は、（１）により近くなる。よって、用語「連鎖する」は、ある遺伝子と共に０．５（この値は、マーカー／遺伝子が異なる染色体上に位置する独立的な振り分けから予想される）より高い確率で受け継がれる１又は複数の遺伝子又はマーカーを意味することができる。ある遺伝子の存在が、個体におけるある表現型に寄与する場合、該遺伝子に連鎖するマーカーは、該表現型と連鎖すると言うことができる。よって、用語「連鎖する」は、マーカーと遺伝子との間又はマーカーと表現型との間の関係性を意味することができる。
染色体上の２種の遺伝子又はマーカーの近接は、遺伝子又はマーカーが次世代の個体に共に受け継がれる確率に直接的に関係するため、用語「連鎖する」は、本明細書において、同一トウモロコシ染色体において互いの約２．０Ｍｂ以内に位置する１又は複数の遺伝子又はマーカーを意味することもできる。よって、２種の「連鎖する」遺伝子又はマーカーは、約２．１Ｍｂ；２．００Ｍｂ；約１．９５Ｍｂ；約１．９０Ｍｂ；約１．８５Ｍｂ；約１．８０Ｍｂ；約１．７５Ｍｂ；約１．７０Ｍｂ；約１．６５Ｍｂ；約１．６０Ｍｂ；約１．５５Ｍｂ；約１．５０Ｍｂ；約１．４５Ｍｂ；約１．４０Ｍｂ；約１．３５Ｍｂ；約１．３０Ｍｂ；約１．２５Ｍｂ；約１．２０Ｍｂ；約１．１５Ｍｂ；約１．１０Ｍｂ；約１．０５Ｍｂ；約１．００Ｍｂ；約０．９５Ｍｂ；約０．９０Ｍｂ；約０．８５Ｍｂ；約０．８０Ｍｂ；約０．７５Ｍｂ；約０．７０Ｍｂ；約０．６５Ｍｂ；約０．６０Ｍｂ；約０．５５Ｍｂ；約０．５０Ｍｂ；約０．４５Ｍｂ；約０．４０Ｍｂ；約０．３５Ｍｂ；約０．３０Ｍｂ；約０．２５Ｍｂ；約０．２０Ｍｂ；約０．１５Ｍｂ；約０．１０Ｍｂ；約０．０５Ｍｂ；約０．０２５Ｍｂ；及び約０．０１Ｍｂ離間することができる。トウモロコシにおけるｂｍ１表現型と「連鎖」し得るマーカーの特定の例として、トウモロコシゲノムの染色体５Ｌ上のヌクレオチド配列が挙げられる。
本明細書において、用語「密接に連鎖する」は、同一トウモロコシ染色体において互いの約０．５Ｍｂ以内に位置する１又は複数の遺伝子又はマーカーを意味することができる。よって、２種の「密接に連鎖する」遺伝子又はマーカーは、約０．６Ｍｂ；約０．５５Ｍｂ；０．５Ｍｂ；約０．４５Ｍｂ；約０．４Ｍｂ；約０．３５Ｍｂ；約０．３Ｍｂ；約０．２５Ｍｂ；約０．２Ｍｂ；約０．１５Ｍｂ；約０．１Ｍｂ；及び約０．０５Ｍｂ離間することができる。トウモロコシにおいてｂｍ１表現型と「密接に連鎖」し得るマーカーの特定の例として、トウモロコシゲノムのＣＡＤ２遺伝子座の近傍又はその中のヌクレオチド配列が挙げられる。
本明細書において、用語「非常に密接に連鎖する」は、同一トウモロコシ染色体において互いの約１００ｋｂ以内に位置する１又は複数の遺伝子又はマーカーを意味することができる。よって、２種の「非常に密接に連鎖する」遺伝子又はマーカーは、約１２５ｋｂ；約１２０ｋｂ；約１１５ｋｂ；約１１０ｋｂ；約１０５ｋｂ；１００ｋｂ；約９５ｋｂ；約９０ｋｂ；約８５ｋｂ；約８０ｋｂ；約７５ｋｂ；約７０ｋｂ；約６５ｋｂ；約６０ｋｂ；約５５ｋｂ；約５０ｋｂ；約４５ｋｂ；約４０ｋｂ；約３５ｋｂ；約３０ｋｂ；約２５ｋｂ；約２０ｋｂ；約１５ｋｂ；約１０ｋｂ；約５ｋｂ；及び約１ｋｂ離間することができる。トウモロコシにおけるｂｍ１表現型と「非常に密接に連鎖した」マーカーの特定の例として、ＣＡＤ２遺伝子のイントロン及びエクソンの中のヌクレオチド配列が挙げられる。
前述に鑑み、特定の遺伝子又は表現型に連鎖するマーカーが、該遺伝子又は表現型と密接に連鎖するマーカー及び非常に密接に連鎖するマーカーを包含することが認められよう。ｂｍ１表現型の連鎖する、密接に連鎖する及び非常に密接に遺伝子マーカーは、低下したリグニン含量及び改善した消化性を有するトウモロコシ品種を同定するため、並びに他のトウモロコシ品種にこれらの形質を生じさせるためのマーカー支援育種プログラムにおいて有用となり得る。
遺伝子座：本明細書において、用語「遺伝子座」は、測定可能な特徴（例えば、形質）と対応するゲノム上の位置を意味する。ＳＮＰ遺伝子座は、該遺伝子座の中に含有されるＤＮＡとハイブリダイズするプローブにより規定される。
マーカー：本明細書において、マーカーは、特定のアレルを有する植物の同定に用いることのできる遺伝子又はヌクレオチド配列を意味する。マーカーは、所定のゲノム遺伝子座における変種として説明することができる。遺伝子マーカーは、一塩基対変化（一塩基多型又は「ＳＮＰ」）の周囲の配列等、短いＤＮＡ配列であっても、長い配列、例えば、ミニサテライト／単純配列反復（「ＳＳＲ」）であってもよい。「マーカーアレル」は、特定の個体に存在するマーカーのバージョンを意味する。
本明細書における用語、マーカーは、トウモロコシ染色体ＤＮＡのクローニングされたセグメント（例えば、トウモロコシゲノムのＣＡＤ２遺伝子座の近傍又はその中のヌクレオチド配列）を意味することができ、更に、又は或いは、トウモロコシ染色体ＤＮＡのクローニングされたセグメントと相補的なＤＮＡ分子（例えば、トウモロコシゲノムのＣＡＤ２遺伝子座の近傍又はその中のヌクレオチド配列と相補的なＤＮＡ）を意味することができる。トウモロコシにおけるｂｍ１マーカーの特定の例として、ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド６６を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド２８４を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド４１５を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド４４３を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド７３５を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド７６０を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド１３４５を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド１４０８を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド１５８５を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド１６２７〜１６４０及び／又は１６４２〜１６４８のいずれかを包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド２２５２を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド２２６９を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド２７８６を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド２９６６を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド３２０５を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド３７１９を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド３７８３を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド３７９８を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド３８００を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド３９９４を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド４１４１を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド４３３８を包含する核酸配列；ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド４５８３を包含する核酸配列；及びＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド５４０３を包含する核酸配列が挙げられるがこれらに限定されない。前述のマーカーは、野生型トウモロコシ品種、Ｂ７３におけるヌクレオチドの位置によって同定される。
一部の実施形態において、植物におけるマーカーの存在は、核酸プローブの使用により検出することができる。プローブは、ＤＮＡ分子であっても、ＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡプローブは、本技術分野において公知の手段により、例えば、ＤＮＡ分子鋳型を用いて合成することができる。プローブは、マーカーのヌクレオチド配列の全体又は一部と、植物ゲノム由来の追加的な近接するヌクレオチド配列とを含有し得る。これは、本明細書において、「近接プローブ」と称される。追加的な近接するヌクレオチド配列は、従来理解されている通り、植物染色体由来の近接するヌクレオチド配列が、本来のマーカーの５’側にあるか３’側にあるかに応じて、本来のマーカーの「上流」又は「下流」と称される。当業者によって認識されている通り、マーカーに包含させるための追加的な近接するヌクレオチド配列を得るプロセスは、ほとんど無制限に反復することができ（染色体の長さによってのみ限定される）、これにより、染色体に沿って追加的なマーカーを同定することができる。上述のあらゆるマーカーは、本発明の一部の実施形態において用いることができる。
オリゴヌクレオチドプローブ配列は、合成により、或いはクローニングにより調製することができる。適切なクローニングベクターは、当業者にとって周知のものである。オリゴヌクレオチドプローブは、標識されていても標識されていなくてもよい。例えば、ニックトランスレーションによる放射標識；ランダムプライマー法（random priming）；末端デオキシトランスフェラーゼによるテイリング（tailing）；又は用いたヌクレオチドが例えば放射性３２Ｐで標識されるその他等が挙げられるがこれらに限定されない、核酸分子を標識するための多種多様な技法が存在する。用いることのできる他の標識として、例えば、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ及びＶＩＣ）；酵素；酵素基質；酵素補助因子；酵素阻害剤；その他が挙げられるがこれらに限定されない。或いは、単独で又は他の活性剤と併せて検出可能なシグナルを生じる標識の使用を、受容体と結合するリガンドに置き換えて、標識された（例えば、上に示す標識により）受容体が単独で又は他の試薬と併せて検出可能なシグナルを生じることができる。例えば、Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9を参照されたい。
プローブは、本来のマーカーのヌクレオチド配列に近接していないヌクレオチド配列を含有し得る。このプローブは、本明細書において「非近接プローブ」と称される。非近接プローブが、同遺伝子又は形質（例えば、ｂｍ１／リグニン含量低下）と遺伝的に連鎖することができるように、非近接プローブの配列は、ゲノム上の本来のマーカーの配列の十分に近くに位置する。例えば、一部の実施形態において、非近接プローブは、トウモロコシゲノム上の本来のマーカーの５００ｋｂ；４５０ｋｂ；４００ｋｂ；３５０ｋｂ；３００ｋｂ；２５０ｋｂ；２００ｋｂ；１５０ｋｂ；１２５ｋｂ；１００ｋｂ；０．９ｋｂ；０．８ｋｂ；０．７ｋｂ；０．６ｋｂ；０．５ｋｂ；０．４ｋｂ；０．３ｋｂ；０．２ｋｂ；又は０．１ｋｂ以内に位置する。
プローブは、検出すべきマーカーの正確なコピーとなり得る。プローブは、対象生物（例えば、トウモロコシ）の染色体ＤＮＡのクローニングされたセグメントと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む、或いはそれからなる核酸分子であってもよい。本明細書において、用語「実質的に同一」とは、８５％を超えて同一であるヌクレオチド配列を意味することができる。例えば、実質的に同一なヌクレオチド配列は、参照配列と８５．５％；８６％；８７％；８８％；８９％；９０％；９１％；９２％；９３％；９４％；９５％；９６％；９７％；９８％；９９％又は９９．５％同一となり得る。
プローブは、検出すべきマーカー（「ＤＮＡ標的」）の正確なコピーと「特異的にハイブリダイズ可能（hybridizable）」又は「特異的に相補的」な核酸分子であってもよい。「特異的にハイブリダイズ可能」及び「特異的に相補的」は、核酸分子とＤＮＡ標的との間で安定的且つ特異的な結合が生じるような、相補性の十分な程度を示す用語である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能となるべきその標的配列と１００％相補的である必要はない。特異的結合が望ましい条件下、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で非標的配列と核酸との非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合、核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能である。
特定の程度のストリンジェンシーを達成するハイブリダイゼーション条件は、選ばれたハイブリダイゼーション方法の性質並びにハイブリダイズする核酸配列の組成及び長さに応じて変動するであろう。洗浄回数もストリンジェンシーに影響するが、一般に、ハイブリダイゼーションの温度及びハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ＋及び／又はＭｇ＋＋濃度）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定するであろう。特定の程度のストリンジェンシーの達成に必要とされるハイブリダイゼーション条件に関する計算は、当業者にとって公知のものであり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; and Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985に記述されている。核酸のハイブリダイゼーションに関する更に詳細な指示及び指針は、例えば、Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993;及びAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995に見出すことができる。
本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的との間に５０％未満のミスマッチが存在する場合に限りハイブリダイゼーションが行われる条件を網羅する。「ストリンジェントな条件」は、更に特定のレベルのストリンジェンシーを包含する。よって、本明細書において、「中程度のストリンジェンシー」条件とは、５０％を超える配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高ストリンジェンシー」の条件とは、２０％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件であり、「非常に高ストリンジェンシー」の条件とは、１０％を超えるミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。
特定の実施形態において、ストリンジェントな条件は、メーカーの指示に従って希釈したＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子型判定マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ、カタログ＃４３７１３５５）における６０℃のハイブリダイゼーションを包含し得る。
次に、代表的で非限定的なハイブリダイゼーション条件を記す。
非常に高ストリンジェンシー（少なくとも９０％配列同一性を共有する配列を検出する）：５×ＳＳＣバッファーにおける６５℃、１６時間のハイブリダイゼーション；それぞれ２×ＳＳＣバッファーにおける室温、１５分間の洗浄２回；及びそれぞれ０．５×ＳＳＣバッファーにおける６５℃、２０分間の洗浄２回。
高ストリンジェンシー（少なくとも８０％配列同一性を共有する配列を検出する）：５×〜６×ＳＳＣバッファーにおける６５〜７０℃、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；それぞれ２×ＳＳＣバッファーにおける室温、５〜２０分間の洗浄２回；及びそれぞれ１×ＳＳＣバッファーにおける５５〜７０℃、３０分間の洗浄２回。
中程度のストリンジェンシー（少なくとも５０％配列同一性を共有する配列を検出する）：６×ＳＳＣバッファーにおける室温〜５５℃、１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；それぞれ２×〜３×ＳＳＣバッファーにおける室温〜５５℃、２０〜３０分間の洗浄少なくとも２回。
上に記されているプローブに関して、プローブは、追加的な核酸配列、例えば、プロモーター；転写シグナル；及び／又はベクター配列を含むことができる。上に記されているプローブのいずれかを用いて、ｂｍ表現型（例えば、ｂｍ１）に関与する遺伝子と密接に連鎖するマーカーを追加的に定義することができ、このように同定されたマーカーは、本開示において指名されている例示的なマーカーと均等となることができ、よって、これは本発明の範囲内に収まる。
マーカー支援育種：本明細書において、用語「マーカー支援育種」は、１又は複数の複合（complex）形質（例えば、ｂｍ１／リグニン含量低下）を直接的に育種するためのアプローチを意味することができる。現在の慣例において、植物育種家は、花色、種皮外観又は農学上所望の形質に連鎖するアイソザイムバリアント等、容易に検出可能な形質の同定を試みる。次に、植物育種家は、容易に検出可能な形質の分離を追跡することにより、分離した育種集団において農学的形質を追跡する。しかし、このような連鎖関係性のうち、植物育種において利用できるものは非常に少ない。
マーカー支援育種は、植物品種改良のために時間及び費用効率の良いプロセスを提供する。マーカー支援育種の応用の数例は、アイソザイムマーカーの使用を含む。例えば、Tanksley and Orton, eds. (1983) Isozymes in Plant Breeding and Genetics, Amsterdam: Elsevierを参照されたい。一例は、トマトにおける線虫害虫に対する抵抗性の遺伝子に関連するアイソザイムマーカーである。Ｍｉと命名された遺伝子によって制御される抵抗性は、トマトの６番染色体上に位置し、酸性ホスファターゼアイソザイムであるＡｐｓ１と非常に密接に連鎖する。Ｍｉ遺伝子を間接的に選択するためのＡｐｓ１アイソザイムマーカーの使用は、次の利点をもたらす。集団における分離は、標準電気泳動技法により明解に決定できる；アイソザイムマーカーは、実生組織において点数化でき、植物が成熟するまで維持する必要をなくすことができる；アイソザイムマーカーアレルの共優性は、ホモ接合体とヘテロ接合体との間の識別を可能にする。Rick (1983) in Tanksley and Orton、上記を参照。
肉：本明細書において、用語「肉」は、例えば、食品として用いられる動物組織を意味する。用語「肉」は通常、骨格筋及びそれに伴う脂肪を意味するが、肺、肝臓、皮膚、脳、骨髄、腎臓、精巣、腸等、非筋肉臓器を意味することもできる。
中性デタージェント繊維：本明細書において、用語「中性デタージェント繊維」（ＮＤＦ）は、広範な飼料に亘る徐々に消化される材料の尺度を意味する。飼料におけるＮＤＦレベルは、植物が成熟するにつれ増加する。牧草サイレージにおけるＮＤＦの平均レベルは、およそ５５パーセントＤＭ（５５０ｇ／ｋｇ ＤＭ）となり得る。総飼料（total ration）におけるＮＤＦの含量は、３５〜５０％ＤＭの間となり得る。３２パーセント未満のＮＤＦを有する食事は、アシドーシスによる問題を引き起こし得る。５０パーセントを超えるＮＤＦを含有する食事は、その摂取潜在能力において制限され得る。
核酸分子：本明細書において、用語「核酸分子」は、ポリマー型のヌクレオチドを意味することができ、これは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス及びアンチセンス鎖の両方並びに上述の合成型及び混在型のポリマーを包含し得る。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はいずれかの型のヌクレオチドの修飾型を意味することができる。本明細書における「核酸分子」は、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」と同義語である。核酸分子は通常、他に特段の定めがなければ、少なくとも１０塩基の長さである。この用語は、一本及び二本鎖型のＤＮＡを包含する。核酸分子は、天然起源及び／又は非天然起源のヌクレオチド結合により一体に連結した天然起源及び修飾されたヌクレオチドのいずれか一方又は両方を包含し得る。
当業者であれば容易に認められる通り、核酸分子は、化学的又は生化学的に修飾されていてもよく、或いは非天然又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有していてもよい。このような修飾として、例えば、標識、メチル化、天然起源のヌクレオチドの１又は複数のアナログによる置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、無電荷結合：例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバメート等；電荷結合：例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸等；懸垂部分：例えば、ペプチド；挿入剤：例えば、アクリジン、ソラレン等；キレート剤；アルキル化剤；及び修飾された結合：例えば、アルファアノマー核酸等）が挙げられる。用語「核酸分子」は、一本鎖、二本鎖、部分的二重鎖、三重鎖、ヘアピン型、環状及びパドロック型（padlocked）立体構造等、任意の位相幾何学的立体構造も包含する。
配列同一性：本明細書において、２種の核酸又はポリペプチド配列の文脈における用語「配列同一性」又は「同一性」は、指定された比較ウィンドウ（comparison window）に亘って最大一致となるよう整列したときに同一となる、該２配列における残基を意味することができる。
本明細書において、用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウに亘り２種の最適に整列された配列（例えば、核酸配列やアミノ酸配列）を比較することにより決定される値を意味することができ、比較ウィンドウにおける配列の一部は、該２配列の最適アライメントにおいて参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列において同一ヌクレオチド又はアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出される。
比較のために配列を整列させるための方法は、本技術分野において周知のものである。種々のプログラム及びアライメントアルゴリズムが、例えば：Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。配列アライメント方法及び相同性計算の詳細な考察は、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に見出すことができる。
国立バイオテクノロジー情報センター（The National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990)）は、数種の配列解析プログラムに関連して用いるために、国立バイオテクノロジー情報センター（メリーランド州ベテスダ）やインターネット経由等、いくつかの供給元から入手することができる。このプログラムを用いて配列同一性を決定する仕方の説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ヘルプ（help）」セクションにおいてインターネット経由で閲覧できる。核酸配列の比較のため、デフォルトパラメータに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを用いてＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能を利用することができる。この方法により評価された場合、参照配列に対し更に高い類似性を有する核酸配列は、増加するパーセンテージ同一性を示すであろう。
一塩基多型：本明細書において、用語「一塩基多型」（ＳＮＰ）は、ゲノム（又は他の共有される配列）における単一ヌクレオチドが、種内のメンバー間又は個体内の対になる染色体間で異なる場合に生じるＤＮＡ配列変種を意味することができる。集団内において、ＳＮＰは、特定の集団内で観察される遺伝子座における最小アレル頻度である、マイナー（minor）アレル頻度を割り当てることができる。これは単純に、一塩基多型の２種のアレル頻度のうち低い方である。異なる集団は、少なくとも僅かに異なるアレル頻度を示すと予想される。特定の集団は、有意に異なるアレル頻度を示し得る。一部の例において、ｂｍ１表現型と連鎖するマーカーは、ＳＮＰマーカーである。
ＳＮＰは、遺伝子のコード配列内、遺伝子の非コード領域内又は遺伝子同士の間の遺伝子間領域に含まれていてよい。コード配列内のＳＮＰは、産生されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させることができるが、これは遺伝暗号の縮重により必ず起こるというわけではない。どちらの形態も同一ポリペプチド配列を生じるＳＮＰは、「同義」と称される（サイレント変異と呼ばれることもある）。異なるポリペプチド配列が産生される場合、これは「非同義」と称される。非同義的変化は、ミスセンスであってもナンセンスであってもよく、ミスセンス変化は異なるアミノ酸を生じ、ナンセンス変化は未成熟終止コドンを生じる。タンパク質コード領域に存在しないＳＮＰであっても依然として、遺伝子スプライシング、転写因子結合又は非コードＲＮＡの配列に結果を生じ得る。ＳＮＰは通常、両アレル（biallelic）であり、よって、植物及び動物において容易にアッセイできる。Sachidanandam (2001) Nature 409:928-33。
サイレージ：本明細書において、用語「サイレージ」は、特定の種類の貯蔵飼料を意味する。一般に、サイレージは、生牧草貯蔵法と呼ばれるプロセスにおいて植物（例えば、トウモロコシ植物）から作製される。このプロセスにおいて、植物又は植物部分は、常在性微生物（例えば、乳酸細菌の１又は複数の株、例えば、ラクトバチルス属の種（Lactobacillus spec.））による嫌気性発酵が為されて糖を酸に変換し、作物材料中に存在するあらゆる酸素を使い切り、このような酸素の枯渇は、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩及び酪酸塩等、細菌の生成する揮発性脂肪酸と併せて飼料を保存する。サイレージは、乳牛や肉牛等、ミルク及び肉生産動物の給餌に広く用いられる。
用語「サイレージの作製」は、肉生産動物の給餌に適切なサイレージを得る仕方のプロセスを説明する。一般に、サイレージは、収穫した植物バイオマスを飼料収穫器（harvester）で切り刻むことにより、植物、例えばトウモロコシ植物から作製される。
繊維源：本明細書において、用語「繊維源」は、植物又は微生物ソースから得られる材料であって、食用繊維を含有する材料を意味する。繊維源の実際的な例であるが非限定的な例として、ダイズ由来又はイネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ等の穀物由来等、農業種子産物の種皮；このような穀物の茎（藁）；野菜／植物ベースのソープストック（soap stock）、通常、収穫されたトウモロコシ植物の茎、皮及び葉を包含するトウモロコシ茎葉（stover）；繊維が豊富な農産物の加工成分の画分、例えば、トウモロコシグルテン飼料；任意の植物源の葉材料；並びに乾燥した穀物蒸留かす（distillers dried grain）（その上で乾燥させた可溶性成分（soluble）を含有する又は含有しない）が挙げられる。よって、特定の例において、繊維源として、例えば、次のものの混合物を挙げることができる。アルファルファ、オオムギ産物（例えば藁）、ビートパルプ、ダイズ豆の皮、スイッチグラス、トウモロコシ繊維、ダイズ繊維、カカオ豆の皮、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ皮、トウモロコシ茎葉（stove）、コムギ藁、コムギもみ殻、稲藁、アマの外皮、ダイズミール、コーンミール、コムギ胚芽、トウモロコシ胚芽、低木及び草。本開示を明確にするため、乾燥した穀物蒸留かす（可溶性成分あり又はなし）及び穀物蒸留かす（可溶性成分あり又はなし）は、繊維を含有するが、「繊維源」として考慮しない。乾燥した穀物蒸留かす（可溶性成分ある又はなし）及び穀物蒸留かす（可溶性成分あり又はなし）は、次に説明する「トウモロコシ副産物」として考慮する。
トウモロコシ副産物：本明細書において、用語「トウモロコシ副産物」は、トウモロコシの湿式製粉又は乾式製粉後に残存する生成物を意味する。トウモロコシ副産物の非限定的な例として、トウモロコシグルテン、穀物蒸留かす、穀物蒸留かすプラス可溶性成分、乾燥した穀物蒸留かす、可溶性成分を含有する乾燥した穀物蒸留かす、濃縮した蒸留かすの可溶性成分、ふすま塊（bran cake）、改良型（modified）穀物蒸留かす、改良型穀物蒸留かすプラス可溶性成分が挙げられる。
サプリメント：本明細書において、用語「サプリメント」は、飼料混合物に包含されて飼料混合物の栄養価を増強する任意の成分を意味する。一般に用いられるサプリメントとして、タンパク質（例えば、ダイズミール又は尿素）、ミネラル（例えば、骨粉）、エネルギー（例えば、動物性脂肪）及びビタミンが挙げられる。
形質又は表現型：用語「形質」及び「表現型」は、本明細書において互換的に用いられている。本開示の目的において、特に興味深い形質は、ｂｍ１／リグニン含量低下である。
ＩＶ．ｂｍ１表現型に関連する遺伝子及び遺伝子変種並びにそれらの使用
本開示は、トウモロコシにおけるｂｍ１表現型に寄与する新規の変異体ＣＡＤ２遺伝子を提供する。本明細書に記載されている変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む植物（例えば、トウモロコシ）は、同一品種の野生型植物のものよりも低いリグニンレベルを有する細胞壁を有し得る。一部の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む核酸分子は、例えば、リグニン低下表現型の発達を支援するために生物に導入することができる。特定の実施形態において、生物は、植物（例えば、トウモロコシ）となり得る。しかし、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む核酸分子は、植物以外の生物、例えば、酵母又は原核生物に導入してもよい。一部の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を用いて、変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む植物又はｂｍ１若しくは他のリグニン低下表現型を有する可能性の高い植物を同定することができる。例えば、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の配列を用いて、植物又は植物から調製した試料における変異体ＣＡＤ２遺伝子の存在を検出するプローブを設計することができる。特定の例において、変異体ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、特定の野生型ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド配列とはハイブリダイズしない核酸プローブが提供される。
一部の実施形態において、本発明は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子と実質的に同一の配列であって、本明細書に記載されているＡＣジヌクレオチド挿入及び／又はトランスポゾン挿入を含んでいても含んでいなくてもよい配列を含む核酸分子も包含する。例えば、一部の実施形態において、核酸分子は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子と少なくとも約８５％同一の配列を含むことができる。よって、核酸分子は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子と８６％；８７％；８８％；８９％；９０％；９１％；９２％；９３％；９４％；９５％；９６％；９７％；９８％；９９％又は９９．５％同一である、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子と実質的に同一の配列を含むことができる。本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子と実質的に同一であるこのような核酸分子は、例えば、当業者であれば容易に入手できる様々な生物の全又は部分ゲノムから容易に同定及び単離することができる。
一部の実施形態は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の機能バリアントも包含する。本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の機能バリアントは、例えば、１又は複数のヌクレオチド置換、欠失又は挿入を含む本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を包含することができ、機能バリアントは、当業者に周知の日常的な技法によって測定できるｂｍ１又は他のリグニン低下表現型に寄与する。例えば、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の機能バリアントは、本明細書に記載されているＡＣジヌクレオチド挿入及び／又はトランスポゾン挿入を含むことができる。本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の特定のバリアントの、リグニン含量を低下させる又はｂｍ１表現型に寄与する能力は、植物に変異又は断片を日常的に導入し、続いてリグニン含量低下又はｂｍ１表現型の他の特徴に関して植物を日常的に観察することにより決定することができる。本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の機能バリアントは、部位特異的変異誘発、誘導変異によって作製することができる、或いはアレルバリアント（多型、例えばＳＮＰ）として生じ得る。
従って、一部の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の機能バリアントは、ＣＡＤ２遺伝子の追加的な変異、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の配列よりも小さい断片及び／又は本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を含むキメラタンパク質を含むことができ、機能バリアントは、変異体ＣＡＤ２遺伝子の特性を保持する。従って、このような変異及び断片は、本発明の範囲内に収まるものと考慮される。当業者であれば、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の追加的な変異又は断片が、変異体ＣＡＤ２遺伝子の特性を保持しているか容易に決定することができる。
一部の実施形態において、本開示の変異体ＣＡＤ２遺伝子を植物に導入し、植物において検出する能力は、変異体ＣＡＤ２遺伝子を有し、ｂｍ１又は他のリグニン低下表現型を有する可能性が高い植物のマーカー支援育種及び選択を容易にすることができる。特定の例において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を植物に導入し（例えば、遺伝子形質転換又は交雑等の伝統的な育種技法により）、続いて、植物における変異体ＣＡＤ２遺伝子の存在を検出するプローブを用いることにより、変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む植物を選択することができる。本開示の変異体ＣＡＤ２遺伝子が導入されている植物を、変異体ＣＡＤ２遺伝子を同様に含んでいても含んでいなくてもよい植物と交雑させて、続いて、植物における本開示の変異体ＣＡＤ２遺伝子の存在を検出するプローブを用いることにより後代を選択することができる。更に交雑を行って、所望の遺伝子型の植物を得ることができる。
核酸配列（例えば、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子）が、植物等の生物に「導入」される場合、特定の配列を含む核酸分子の導入に用いる技法又は方法論は本発明に必須ではなく、当業者にとって公知の任意の技法又は方法論により行うことができる。例えば、核酸分子は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介した植物組織の形質転換；微粒子銃；エレクトロポレーション等、直接的な形質転換方法により導入することができる。或いは、核酸分子は、後代がそのゲノムに組み入れられたヌクレオチド配列を有するように、特定のヌクレオチド配列を有する植物を別の植物と交雑することにより導入することができる。このような育種技法は、当業者にとって周知のものである。本明細書に開示されているマーカー支援育種技法は、このような交雑により本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の取り込みを大いに促進することができる。
本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子が生物に導入される実施形態において、変異体ＣＡＤ２遺伝子は、変異体ＣＡＤ２遺伝子が１又は複数の調節配列に作動可能に連結するような様式で導入される、例えば、所望の調節配列に作動可能に連結した本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を含むプラスミドの使用により導入されることが望ましくなり得る。異種核酸配列の発現において有用な調節配列は、本技術分野において周知のものであり、例えば、プロモーター（例えば、構成的プロモーター；組織特異的プロモーター；及び発生段階特異的プロモーター）；終結配列；エンハンサー配列；細胞内標的配列；安定化又はリーダー配列；並びにイントロンが挙げられるがこれらに限定されない。
本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子は、マーカーを含有する形質転換細胞を負の選択（即ち、選択可能マーカー遺伝子を含有しない細胞の増殖阻害）又は正の選択（即ち、遺伝子マーカーにコードされる産物のスクリーニング）のいずれかにより回収させることのできる、調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結した１又は複数のマーカー遺伝子と共に生物に導入することができる。形質転換のための多くの選択可能マーカー遺伝子は、形質転換技術分野において周知のものであり、例えば、抗生物質若しくは除草剤となり得る選択用化学薬品を代謝的に解毒する酵素をコードする遺伝子又は阻害剤に対し非感受性となり得る変化した標的をコードする遺伝子を包含する。いくつかの正の選択方法も本技術分野において公知のものである。植物細胞における使用に適切なマーカー遺伝子の例として、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803）；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Vanden Elzen et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:299）；ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼ及びブレオマイシン抵抗性決定因子（例えば、Hayford et al. (1988) Plant Physiol. 86:1216; Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86); Svab et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14:197;及びHille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171を参照）；グリホサート、グルホシネート又はブロモキシニル等、除草剤に対する抵抗性を付与する選択可能マーカー遺伝子（例えば、Comai et al. (1985) Nature 317:741-744; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618;及びStalker et al. (1988) Science 242:419-423を参照）；マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（Eichholtz et al. (1987) Somatic Cell Mol. Genet. 13:67）；植物５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（Shah et al. (1986) Science 233:478）；植物アセト乳酸シンターゼ（Charest et al. (1990) Plant Cell Rep. 8:643）を挙げることができるが、これらに限定されない。
植物形質転換に適切なマーカー遺伝子の別のクラスは、形質転換細胞の抗生物質等の毒性物質に対する抵抗性の直接的な遺伝子選択ではなく、形質転換されたと仮定される植物細胞のスクリーニングを利用する。これらの遺伝子は、特異的組織における遺伝子発現の空間的パターンの定量化又は可視化に特に有用であり、遺伝子発現を調べるために遺伝子又は遺伝子調節配列と融合することができるため、しばしば「レポーター遺伝子」と称される。形質転換細胞のスクリーニングに一般に用いられる遺伝子として、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。例えば、Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387; Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343; Koncz et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84:131;及びDeBlock et al. (1984) EMBO J. 3:1681を参照されたい。
近年、植物組織を破壊する必要がない、ＧＵＳ活性を可視化するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法が利用できるようになった。Molecular Probes publication 2908, Imagene Green.TM., p. 1-4, 1993;及びNaleway et al. (1991) J. Cell Biol. 115:151a。更に、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ及びＹＦＰ）をコードする遺伝子が、原核細胞及び真核細胞における遺伝子発現のマーカーとして利用されている。Chalfie et al. (1994) Science 263:802を参照されたい。蛍光タンパク質及び蛍光タンパク質の変異は、スクリーニング可能マーカーとして用いることができる。
一部の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子及び／又は本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の断片若しくはセグメントを用いて、トウモロコシ以外の生物から相同的変異体ＣＡＤ２遺伝子配列を同定することができる（例えば、配列比較により）。本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子と相同的なトウモロコシ以外の生物由来の配列は、周知の技法に従って、例えば、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子との配列相同性に基づき同定及び単離することができる。
よって、一部の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子のコード配列の全体又は一部は、日常的な技法に従って生物からクローニングされたゲノムＤＮＡ断片の集団（即ち、ゲノムライブラリー）に存在する他の配列と特異的にハイブリダイズするプローブとして用いることができる。よって、一部の実施形態において、本発明は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含する。
更に別の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子と相同的なトウモロコシ以外の生物由来の配列は、配列比較により同定及び単離することができる。例えば、生物の完全又は部分的に配列決定されたゲノムを、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の配列を用いて日常的な技法に従って検索して、変異体ＣＡＤ２遺伝子と高度な配列同一性を共有し、従って変異体ＣＡＤ２遺伝子のホモログである可能性が高い、生物のゲノム内の遺伝子を同定することができる。
例えば、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の全体又は一部は、「参照配列」として用いることができる。一般に、参照配列と比較される核酸配列（例えば、クローニングされた配列又はゲノムライブラリーのゲノムＤＮＡ断片）は、核酸配列の特異的な近接セグメントである「比較ウィンドウ」を含む。２配列の最適アライメントのため、比較ウィンドウは、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウは通常、近接するヌクレオチド少なくとも２０個の長さであるが、３０、４０、５０、１００又は２００以上のヌクレオチド長であってもよい。ポリヌクレオチド配列比較ウィンドウにおける欠失の包含による参照配列との高い類似性を回避するため、「ギャップペナルティ（gap penalty）」を導入して、ヌクレオチドマッチ数から差し引くことができる。
比較のために配列を整列する方法は、本技術分野において周知のものである。任意の２配列間のパーセント配列同一性の決定は、利用できる数学アルゴリズムを用いて達成することができる。このような数学アルゴリズムの非限定的な例は、Myers and Miller (1988), CABIOS 4:11-7のアルゴリズム；Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所アライメントアルゴリズム；Needleman and Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443-53の包括的アライメントアルゴリズム；Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8の局所アライメント検索方法；Karlin and Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264及びKarlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7のアルゴリズムである。
当業者であれば、配列を比較して配列同一性を決定するため、或いは参照配列と共有される配列同一性により多数の配列を含むデータベース（例えば、生物ゲノムデータベース）を検索するために、これらの数学アルゴリズムをコンピュータで実行することができる。このような実行として、ＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー）；及びＡＬＩＧＮプログラム並びにＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、ｖ．１０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡが挙げられるがこれらに限定されない。これらのプログラムを用いた配列アライメントは、それらのデフォルトパラメータを用いて行うことができる。或いは、一部の検索においてはデフォルトパラメータを修正することが望ましくなり得る（例えば、ギャップペナルティ値を変更）。配列同一性計算のための数学アルゴリズムの特定のコンピュータ実行の選択及び選択されたアルゴリズムにおいて用いるためのパラメータ値の選択は、当業者の裁量に任される。
一部の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子は、交雑により追加的な所望の遺伝子（例えば、変異体遺伝子若しくはマイナーアレル）又は表現型を含む植物に導入することができる。或いは、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子は、例えば、遺伝子形質転換により追加的な所望の遺伝子又は表現型を含む植物に導入することができる。特定の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子は、リグニン生合成又は代謝に関与する１又は複数の追加的な遺伝子に変異を含む植物に導入することができる。例えば、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子は、例えば、異なるＣＡＤ遺伝子；ＣＯＭＴ；４ＣＬ；Ｆ５Ｈ；ＥｇＣＡＤ１型ＺｍＣＡＤ１；ＳＡＤ；コリスミ酸ムターゼ遺伝子；ＰＡＬ；ＨＣＴ；ＯＭＴ；チトクロムＰ４５０遺伝子；ＳＡＭＳ３；ＣＣＲ；ＤＦＲ；カルコンシンターゼ遺伝子；ラッカーゼ遺伝子；ペルオキシダーゼ遺伝子；ＡＬＤＨ遺伝子（例えば、Skibbe et al. (2002) Plant Mol. Biol. 48:751-64に記載されている６種のトウモロコシＡＬＤＨ遺伝子のうち１種）；ＡＧＯ；ＭＹＢ転写因子遺伝子（例えば、ＺｍＭＹＢ３８；及びトウモロコシＡＰＬ）；ＬＩＭ転写因子遺伝子；トウモロコシｂＺＩＰ因子遺伝子；ＭＡＤＳボックス遺伝子（例えば、ＺｍＺＡＧ５）；ＭＰ遺伝子；ＡＢＣトランスポーター遺伝子；β−グルコシダーゼ遺伝子；グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＺｍＧＳＴ１７）；ノデュリンＭｔＮ２１様遺伝子；ＰＩＮＯＩＤオルソロガス遺伝子；ヒスチジンキナーゼ（例えば、ＺｍＨＫ１、ＺｍＨＫ２及びＺｍＨＫ３）；及び／又はＣＯＶ１オルソロガス遺伝子に変異を含む植物に導入することができるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、ｂｍ１又は他のリグニン低下表現型と、リグニン生合成又は代謝に関与しない１又は複数の望ましい形質（複数可）の両方を備える植物を作出するため、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子は、リグニン生合成又は代謝に関与しない１又は複数の望ましい形質（複数可）を含む植物に導入することができる。
リグニン生合成又は代謝経路における複数の変異体遺伝子を含有する上述及び他の実施形態の植物が、有用な新規の表現型、例えば、追加的なｂｍ表現型及び／又は他のリグニン表現型を示すであろうことが予想される。例えば、Marita et al. (2003)、上記を参照されたい。例えば、本出願人らは、ｂｍ１形質とｂｍ３形質とのスタッキング（stacking）が、サイレージ消化性の更なる増加と、前処理なしのバイオマス加水分解における発酵可能な糖の収量の非常に有意な改善をもたらしたことを観察した。
一部の実施形態は、変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を含む遺伝子組換え植物を作出するための手段及び／又は変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を保有する植物を同定するための手段を利用する。一部の例において、変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を含む遺伝子組換え植物を作出するための手段は、本開示に係る変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子内に位置するマーカーとなり得る。一部の例において、変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を保有する植物を同定するための手段は、本開示に係る変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子内に位置するマーカーと特異的にハイブリダイズするプローブとなり得る。本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子（変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を含む遺伝子組換え植物を作出するための手段及び変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を保有する植物を同定するための手段に関する）は、トウモロコシ自殖（inbred）系統５１５Ｄｂｍ１又は系統ＤＡＳｂｍ１のいずれかにおけるｂｍ１表現型に寄与する変異体ＣＡＤ２遺伝子である。これらの変異体ＣＡＤ２遺伝子は、切断型ＣＡＤ２タンパク質を生じるＣＡＤ２遺伝子の第三のエクソンにおけるフレームシフト変異又は切断型ＣＡＤ２タンパク質を生じるＣＡＤ２遺伝子の第一のイントロンにおける３４４４塩基対トランスポゾン挿入のいずれかによって特徴づけられる。よって、一部の実施形態において、変異体ＣＡＤ２遺伝子は、ゲノム上のＺｍＣＡＤ２遺伝子配列の第一のエクソン及び／又はゲノム上のＺｍＣＡＤ２遺伝子配列の第二のエクソンを含むことができるが、ゲノム上のＺｍＣＡＤ２遺伝子配列の第三のエクソンの全体又は一部を含む必要はない。
本明細書に開示されている変異体ＣＡＤ２遺伝子は、ｂｍｒ表現型に関与し得る、以前に記載されたＣＡＤ２変異とは異なる。例えば、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子は、次の特徴のうち１又は複数を有し得る。ＺｍＣＡＤ２遺伝子のエクソン（例えば、エクソン３）におけるジヌクレオチド挿入；フレームシフトを生じる変異；切断型タンパク質を生じるＺｍＣＡＤ２遺伝子のイントロンにおけるトランスポゾン挿入；切断型ＺｍＣＡＤ２酵素を生じる変異；ＺｍＣＡＤ２ ＮＡＤＰＨ結合及び／又はＣ末端触媒ドメイン（複数可）の不活性化（例えば、除去による）を生じる変異；自殖トウモロコシ系統５１５Ｄｂｍ１におけるｂｍ１表現型に寄与する変異；並びに自殖トウモロコシ系統ＤＡＳｂｍ１におけるｂｍ１表現型に寄与する変異。対照的に、以前に記載された天然起源の変異体ＣＡＤ２遺伝子は、遺伝子の第一のイントロンにおけるトランスポゾンの挿入（米国特許出願ＵＳ２０１０／０２０３１９６Ａ１）；全長ＣＡＤタンパク質の発現低下（Halpin et al. (1998)、上記）；ソルガム（Sorghum bicolor）ＣＡＤ２酵素の切断を生じる点変異（Saballos et al. (2009)、上記；Sattler et al. (2009)、上記；ソルガム（S. bicolor）ＣＡＤ２における補助因子結合部位における点変異（Id.）；ソルガム（S. bicolor）ＣＡＤ２における活性部位外側の二次構造の崩壊（Id.）；及び切断型酵素を生じるテーダマツ（Pinus taeda L.）ＣＡＤ遺伝子における２塩基対アデノシン挿入（米国特許第６，９２１，６４３号）によって特徴づけられる。
Ｖ．ｂｍ１表現型に関連する遺伝子及び遺伝子変種に連鎖する分子マーカー並びにその使用
本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖（例えば、密接に連鎖）する分子マーカーが提供される。本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖する分子マーカーは、一部には、トウモロコシ染色体５Ｌ上の特定の領域におけるその位置によって説明することができる。本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖する分子マーカーは、変異体ＣＡＤ２遺伝子の中に存在する、或いはその近傍に存するＳＮＰマーカーを包含し得る。例えば、一部の実施形態において、ｂｍ１トウモロコシ系統、５１５Ｄｂｍ１のＣＡＤ２遺伝子におけるヌクレオチド位置５４１０及びｂｍ１トウモロコシ系統、ＤＡＳｂｍ１におけるヌクレオチド位置８９０３に位置するＧ／Ａ ＳＮＰ（又はそれと均等なマーカー）は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖する分子マーカーとなり得る。一部の実施形態において、ｂｍ１トウモロコシ系統、５１５Ｄｂｍ１のＣＡＤ２遺伝子におけるヌクレオチド位置５４１０に位置するＧ／Ａ ＳＮＰは、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖する分子マーカーとなり得る。
追加的なマーカーは、例えば、該追加的なマーカーと、本開示に係るＣＡＤ２変異又は本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖する分子マーカー（例えば、ｂｍ１トウモロコシ系統、５１５Ｄｂｍ１におけるヌクレオチド位置５４１０に位置するＧ／Ａ ＳＮＰ）との間の組換え頻度を決定することにより同定することができる。このような決定は、Mather (1931), The Measurement of Linkage in Heredity, Methuen & Co., London、の方法に基づく直交性対比（orthogonal contrasts）の改良法を利用し、続いて最大尤度を検定して、組換え頻度を決定することができる。Allard (1956) Hilgardia 24:235-78。生物（例えば、トウモロコシ）における組換え頻度の値が、０．１０（即ち、１０％）以下である場合、追加的なマーカーは、変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖しており、本発明に開示されている方法において使用するための特定の参照マーカーの均等であると考慮される。
ｂｍ１又は他のリグニン低下表現型を有する植物を同定するために、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖する、或いはその中に存する核酸分子マーカーを用いる方法は、変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む植物を他の植物系統と交雑した後に交雑後代の表現型を決定する必要をなくすことができるため、植物開発者に経費削減をもたらすことができる。
変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を含む遺伝子組換え植物を作出するための手段は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカーである。よって、変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を含む遺伝子組換え植物を作出するための手段は、そのいずれかの検出が、核酸配列を含む植物が本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を含むことの少なくとも強力な指標を提供する、トウモロコシ植物由来の核酸配列を包含する。
変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子を保有する植物を同定するための手段は、本開示に係る変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子に連鎖する、或いはその中に存するマーカーと特異的にハイブリダイズするプローブである。従って、核酸の特異的なハイブリダイゼーションは、検出可能なシグナルであり、本開示に係る変異体トウモロコシＣＡＤ２遺伝子に連鎖する、或いはその中に存するマーカーと特異的にハイブリダイズする核酸プローブは、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を保有する植物から得られた試料に添加されると、検出可能なシグナルを呈する。
一部の実施形態において、生物のゲノムにおいて本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に隣接する連鎖マーカーを用いて、変異体ＣＡＤ２遺伝子を明確に含有するドナー親ＤＮＡのセグメント（複数可）を移入することができる。一部の実施形態において、変異体ＣＡＤ２遺伝子を明確に含有するドナー親ＤＮＡのセグメント（複数可）を移入するために、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に隣接する連鎖マーカーを用いるための方法は、変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカーと特異的にハイブリダイズ可能なプローブにより、２種の親植物のゲノムＤＮＡを解析するステップと、２種の親植物遺伝子型を有性交雑（sexually crossing）して後代集団を得て、これら後代を変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカーの存在に関して解析するステップと、変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカーを含有する後代を、レシピエント遺伝子型と戻し交雑して第一の戻し交雑集団を作出し、続いて、親遺伝子型及び変異体ＣＡＤ２遺伝子により示される任意の所望の形質（複数可）を含む最終的な後代が得られるまで戻し交雑プログラムを継続するステップとを含むことができる。特定の実施形態において、各交雑及び戻し交雑ステップにおいて得られた個々の後代は、連鎖マーカー解析により各世代で選択される。一部の実施形態において、変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカーと特異的にハイブリダイズ可能なプローブによる２種の親植物のゲノムＤＮＡの解析は、親植物の一方が、プローブが特異的にハイブリダイズする連鎖マーカーのより少ない方を含む、或いはプローブが特異的にハイブリダイズする連鎖マーカーを全く含まないことを明らかにする。
一部の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖する又はその中に存するマーカー、或いは変異体ＣＡＤ２遺伝子配列それ自体を用いて、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を遺伝子形質転換によりトウモロコシ植物に導入することができる。特定の実施形態において、マーカーとして、ｂｍ１トウモロコシ系統、５１５Ｄｂｍ１におけるヌクレオチド位置５４１０及びｂｍ１トウモロコシ系統、ＤＡＳｂｍ１におけるヌクレオチド位置８９０３に位置するＧ／Ａ ＳＮＰ又はそれと均等なマーカーが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を遺伝子組換えによりトウモロコシ植物に導入するための方法は、変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカー、或いは変異体ＣＡＤ２遺伝子それ自体と特異的にハイブリダイズ可能なプローブにより、植物（例えば、トウモロコシ植物）のゲノムＤＮＡを解析して、植物における変異体ＣＡＤ２遺伝子を同定するステップと、例えば、ゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを１又は複数の制限酵素で消化することにより、変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む植物のゲノムＤＮＡのセグメントを単離するステップと、単離されたＤＮＡセグメントを必要に応じて増幅するステップと、単離されたＤＮＡセグメントを宿主トウモロコシ植物の細胞又は組織に導入するステップと、変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカー又は変異体ＣＡＤ２遺伝子それ自体と特異的にハイブリダイズ可能なプローブにより、宿主トウモロコシ植物のＤＮＡを解析して、宿主トウモロコシ植物における変異体ＣＡＤ２遺伝子を同定するステップとを含むことができる。特定の実施形態において、単離されたＤＮＡセグメントは、宿主トウモロコシ植物のゲノム内に安定的に組み込まれるよう宿主トウモロコシ植物に導入することができる。
一部の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖する又はその中に存するマーカー、或いは変異体ＣＡＤ２遺伝子配列それ自体を用いて、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を他の生物、例えば植物に導入することができる。特定の実施形態において、マーカーとして、ｂｍ１トウモロコシ系統、５１５Ｄｂｍ１におけるヌクレオチド位置５４１０及びｂｍ１トウモロコシ系統、ＤＡＳｂｍ１におけるヌクレオチド位置８９０３に位置するＧ／Ａ ＳＮＰ又はそれと均等なマーカーが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子をトウモロコシ以外の生物（例えば、ダイズ；アルファルファ；コムギ；ナタネ；イネ；及びソルガム）に導入するための方法は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカー又は変異体ＣＡＤ２遺伝子それ自体と特異的にハイブリダイズ可能なプローブにより、トウモロコシ植物以外の植物のゲノムＤＮＡを解析して、植物における変異体ＣＡＤ２遺伝子を同定するステップと、例えば、ゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを１又は複数の制限酵素で消化することにより、変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む植物のゲノムＤＮＡのセグメントを単離するステップと、単離されたＤＮＡセグメントを必要に応じて増幅するステップと、単離されたＤＮＡセグメントをトウモロコシ以外の生物に導入するステップと、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカー又は変異体ＣＡＤ２遺伝子それ自体と特異的にハイブリダイズ可能なプローブにより、トウモロコシ以外の生物のＤＮＡを解析して、生物における変異体ＣＡＤ２遺伝子を同定するステップとを含むことができる。特定の実施形態において、単離されたＤＮＡセグメントは、生物のゲノム内に安定的に組み込まれるよう生物に導入することができる。
一部の実施形態において、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖する又はその中に存するマーカー、或いは変異体ＣＡＤ２遺伝子配列それ自体を用いて、ｂｍ１又は他のリグニン低下表現型を有する植物を同定することができる。特定の実施形態において、植物は、トウモロコシ植物である。一部の実施形態において、核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ）は、植物から抽出することができる。次に、抽出された核酸分子は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカー又は変異体ＣＡＤ２遺伝子それ自体と特異的にハイブリダイズ可能な１又は複数のプローブと接触させることができる。抽出された核酸分子と１又は複数のプローブとの特異的なハイブリダイゼーションは、植物におけるｂｍ１又は他のリグニン低下表現型の存在を示す。
プライマー設計及び連鎖スクリーニング
オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、プライマー）は、ｂｍ１変異に連鎖するＣＡＤ２の中に、その近傍に又はその間に物理的に位置するマーカーを特異的に検出するよう設計することができる。一般に、マーカーの一方のアレルのみと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。一部の実施形態において、２種のオリゴヌクレオチドプローブは、一方は、他方のプローブとは特異的にハイブリダイズしないｂｍ１アレルと特異的にハイブリダイズし、他方は、もう一方のプローブとは特異的にハイブリダイズしない野生型ＣＡＤ２アレル（又は異なるｂｍ１アレル）と特異的にハイブリダイズするように設計されて、ｂｍ１マーカーを検出する。当業者であれば理解できるように、特定のマーカーのオリゴヌクレオチドプローブの長さ又は組成は、プローブをマーカーの一方のアレルに非特異的にすることなく、確立された原理に応じて変動させてよい。
一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、プライマーとなり得る。特異的な実施形態において、プライマーは、ＫＡＳＰａｒ（商標）遺伝子型判定アッセイにおいてマーカーを検出するよう設計することができる。特定の実施形態において、プライマーは、ＫＡＳＰａｒ（商標）遺伝子型判定アッセイを用いて、トウモロコシにおけるｂｍ１表現型に連鎖するマーカーを検出するよう設計することができる。上述及び更に別の実施形態において、検出系は、マッピング集団における個体を遺伝子型判定するためのハイスループット且つ簡便な形式を提供することができ、この形式は、特定の遺伝子又は形質を保有する個体の同定を大いに容易にすることができ、マーカー支援選択プログラムの実行又は遂行を大いに容易にすることもできる。
特異的な実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子型判定アッセイにおいてマーカーを検出するよう設計されたプライマーとなることができる。本方法は、ｂｍ１変異に密接に連鎖するマーカーを含有するＤＮＡ領域を増幅するための特異的プライマーと、マーカーに特異的な蛍光標識プローブとを利用する。ｂｍ１アレルと特異的にハイブリダイズするプローブは、ＦＡＭ等、蛍光色素で標識することができるが、一方、野生型ＣＡＤ２アレル（又は異なるｂｍ１アレル）と特異的にハイブリダイズするプローブは、ＶＩＣ等、異なる蛍光色素で標識することができる。データは、蛍光色素シグナルの有無として解析される。検出系は、マッピング集団における個体を遺伝子型判定するためのマルチプレックス形式等、ハイスループット且つ簡便な形式を提供することができ、この形式は、特定の遺伝子又は形質を保有する個体の同定を大いに容易にすることができ、マーカー支援選択プログラムの実行又は遂行を大いに容易にすることもできる。
よって、一般に、ｂｍ１トウモロコシ又は推定ｂｍ１トウモロコシの接合性解析に有用な、遺伝子特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイも本明細書に記載されている。特定の実施形態において、遺伝子特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイを用いて、ｂｍ１変異に関してトウモロコシの接合状態を解析することができる。
遺伝子特異的エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイにおいて用いるためのプライマー及びプローブは、対象遺伝子における公知の変異に基づき設計することができる。例えば、ｂｍ１特異的アッセイのためのプライマー及びプローブは、ＣＡＤ２遺伝子の第一のイントロンにおける３４４４ｂｐ挿入に基づき設計することができる。同一アッセイにおいて変異（例えば、ｂｍ１）に特異的なオリゴヌクレオチド及び未崩壊の野生型遺伝子（例えば、ＣＡＤ２）が用いられるバイプレックス（biplex）反応において、特異的オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ試料に存在する変異型遺伝子及び／又は野生型遺伝子のいずれか一方又は両方に由来する配列を選択的に増幅させるであろう。
一部の実施形態において、ｂｍ１特異的アッセイは、野生型ゲノムのＣＡＤ２遺伝子内に挿入された３４４４ｂｐのヌクレオチド配列に特有の断片を増幅する。一部の実施形態において、野生型ＣＡＤ２遺伝子特異的アッセイは、３４４４ｂｐのヌクレオチド配列が野生型ＣＡＤ２遺伝子に挿入された接続部位を含むＣＡＤ２遺伝子の断片を増幅する。特定の実施形態において、標的特異的オリゴヌクレオチドプローブは、高ストリンジェンシー条件下において、ゲノムＤＮＡ試料における２種のＰＣＲプライマーの間の標的配列とハイブリダイズする。
標的特異的オリゴヌクレオチドは、例えば、蛍光色素（例えば、ＦＡＭ、ＶＩＣ及びＭＧＢＮＦＱ）で標識することができ、これにより、標的特異的蛍光シグナルの迅速な定量化を可能にすることができる。ＰＣＲ産物は、所定のサイクル数の後、例えば反応が対数期初期のときに測定することができる。陰性対照試料は、任意のトウモロコシ品種、例えばｂｍ１変異のない品種のゲノムＤＮＡを含むことができる。陽性対照試料は、ＣＡＤ２遺伝子におけるｂｍ１挿入変異等、ＢＭＲ変異を有するトウモロコシ品種のゲノムＤＮＡを含むことができる。対照ヘミ接合型試料は、ｂｍ１変異のヘミ接合型であると予め決定されたトウモロコシ品種のゲノムＤＮＡを含むことができる、或いはヘミ接合型試料は、陰性対照ＤＮＡと、ｂｍ１変異に関しホモ接合型であると予め決定されたトウモロコシ品種のＤＮＡとを等比率で含むことができる。
ＤＮＡは、当業者に公知の方法によりトウモロコシ植物組織から単離（例えば、抽出及び精製）することができる。ＤＮＡ単離のための市販のキットは、例えば、Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．から入手できる。一部の実施形態において、特定の植物のリーフディスクを穿孔器で作製し、収集チューブに移す。穿孔器は、各サンプリング後に７０％アルコールで消毒し、水でリンスし、乾燥させることができる。ＤＮＡ抽出バッファーは、メーカーの推奨するところに従って調製することができる。次に、ＤＮＡは、キットを用いてメーカーの指示に従って単離することができる。最後に、単離されたＤＮＡの濃度は、例えば、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｑｕａｎｔｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）及び分光光度計を用いて、或いはその他の適切な技法により決定することができる。
プライマー、プローブ及びゲノムＤＮＡ試料（複数可）を調製した後、或いは他の仕方で利用できるようにした後、ＰＣＲ反応を行って、ゲノムＤＮＡ試料（複数可）における対象核酸配列（例えば、ＢＭＲ変異に特定の配列）を同定することができる。特定の実施形態において、ゲノムＤＮＡ試料（複数可）以外のあらゆる反応成分を含有する個々のＰＣＲ反応混合物が調製される。ｂｍ１変異体及び野生型ＣＡＤ２トウモロコシのプライマー及び遺伝子特異的プローブを含むバイプレックス反応のため、反応混合物は、酵素、反応バッファー、ｂｍ１変異のフォワード及びリバースプライマー、野生型ＣＡＤ２遺伝子のフォワード及びリバースプライマー、ｂｍ１変異の遺伝子特異的プローブ、ＣＡＤ２遺伝子の遺伝子特異的プローブ並びに水を含むことができる。一部のＰＣＲアッセイ系（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ）において、酵素及びバッファーは、単一のキット成分（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）遺伝子型判定マスターミックス；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ、カタログ＃４３７１３５５）に存在することができる。
反応混合物が或いはそれ以外の仕方で調製された後、ゲノムＤＮＡ試料（複数可）を添加し、反応を開始することができる。試料におけるゲノムＤＮＡの量を正規化する必要はない。しかし、当業者であれば、相対的に等濃度のゲノムＤＮＡ試料を用いることにより、最良の結果を達成することができる。
一部の実施形態において、ＰＣＲアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ）は、適切な対照によりセットアップすることができる。例えば、（１）試薬を含有するがＤＮＡ試料を含有しない陰性対照（複数可）と、（２）ｂｍ１トウモロコシゲノムＤＮＡを含むホモ接合型陽性対照（複数可）と、（３）上に記されているヘミ接合型陽性対照（複数可）とを含む対照ウェルを備えるマルチウェルプレートにおいて、反応を行うことができる。次に、適切なサイクル条件下のＰＣＲによりＤＮＡを増幅する。例えば、ＧｅｎＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を用いる一部の実施形態において、最初の１回の変性サイクル、９５℃１５分間、続いて３０サイクルの変性（９２℃１５秒間）及びアニーリング／伸長（６０℃６０秒間）を行うことができる。当業者であれば、ＰＣＲサイクル条件が実験者の裁量に従って変動し、同等な結果が得られることを理解する。
ＰＣＲアッセイ（例えば、エンドポイントＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアッセイ）は、ＢＭＲトウモロコシ又は推定ＢＭＲトウモロコシの遺伝子型及び／又は接合状態解析に用いることができる。一部の実施形態において、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、レポーター（例えば、蛍光成分）で標識することができる。蛍光定量的検出を用いたアッセイのため、ＰＣＲ反応産物は、プローブ（複数可）の検出に適切な励起及び発光波長設定を用いて、分光蛍光光度計（例えば、Ｔｅｃａｎ ＧＥＮｉｏｓ（商標）；スイス、メンネドルフ）において解析することができる。例えば、蛍光色素ＦＡＭは、励起波長４８５ｎｍ及び発光波長５３５ｎｍにて測定することができる。或いは、蛍光色素ＶＩＣは、励起波長５２５ｎｍ及び発光波長５６０ｎｍにて測定することができる。
ＰＣＲ反応及びプローブ検出の完了後に、例えば、任意の適切なコンピュータグラフィックスソフトウェアを用いて表及び分布グラフを作成することができる。同様の遺伝子型バックグラウンドの野生型、ヘミ接合型及びホモ接合型ＤＮＡを用いて得られた結果は、陰性及び陽性対照とすることができる。分離集団において、データ点の３種のクラスターが得られ、試料結果が分離クラスターのうち１種に属する可能性が高いものとして視覚的に決定することができる。或いは、データ解析コンピュータソフトウェアを用いて、最も可能性が高いクラスターを試料指定として、試料結果が各分離クラスターに属する確率を算出することができる。視覚的決定が為される場合、例えば、データ点の３種のクラスターが明らかに可視的であれば、各クラスターの境界は任意でよい。
蛍光強度の生データは、ＫＬＩＭＳ（商標）（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）等、適切な解析パッケージを用いてプレートリーダーから直接的に解析することもできる。変異体アレルの特異的プローブによって生成された蛍光シグナルの相対蛍光単位（ＲＦＵ）が一方の軸にプロットされ、野生型アレルの特異的プローブによって生成された蛍光シグナルのＲＦＵが他方の軸にプロットされたグラフを作成することができる。次に、データのグラフ表示におけるクラスター分離に基づき、接合状態決定を行うことができる。
変異体ゲノムＤＮＡ（例えば、ＢＭＲ変異）を含有しない試料は、野生型ＰＣＲ産物の蛍光読み取り値のみを生じる。ヘミ接合型又はホモ接合型変異体ゲノムＤＮＡを含有する試料は、陰性バックグラウンド対照よりも高い変異体特異的プローブのＲＦＵ読み取り値を生じる。試料が妥当な結果を生じない場合、試料におけるゲノムＤＮＡは、妥当な質及び／又は量のものではない可能性があり、新たにＤＮＡ調製及び／又は新たにＰＣＲ反応を行うべきである。好ましくは、ＤＮＡ試料を含有しない陰性対照試料は、遺伝子特異的プローブ（複数可）の非常に低い検出を示す。公知のホモ接合型対照が、対照における変異体又は野生型ＤＮＡのみの高い検出を示し、公知のヘミ接合型対照が、変異体及び野生型ＤＮＡの両方の高い検出を示すことも好ましい。
ＰＣＲ方法並びに遺伝子型及び／又は接合状態決定の「テストラン（test run）」は、試料をスクリーニングする前に、あらゆる適切な対照を用いて行うことができる。使用間で異なる可能性のある成分（例えば、ゲノムＤＮＡ調製方法、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、オリゴヌクレオチド、実験機器等）に関し、方法の更なる最適化が望ましくなり得る。許容されるレベルのプローブ検出（例えば、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブの許容されるＲＦＵ）で、公知のゲノムＤＮＡ鋳型において変異体及び／又は野生型配列の両方を増幅するＰＣＲ及び熱サイクル条件を確立することができる。
ＶＩ．ＣＡＤ２活性が低下した生物及びその使用
Ａ．ＣＡＤ２活性が低下した生物
本発明の一部の実施形態は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む核酸分子、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な核酸配列又は本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の機能バリアントを包含する生物も提供する。適切な生物は、任意の適切な植物、酵母又は細菌となり得る。非限定的な例として、前述の配列を含む植物は、農学的価値を有する植物であってよく、例えば、トウモロコシ；ダイズ；アルファルファ；コムギ；ナタネ；イネ；ソルガム；テンサイ；キュウリ、トマト、トウガラシ（pepper）等、種々の野菜；リンゴ、セイヨウナシ、モモ、サクランボ（cherry）、アメリカスギ（redwood）、マツ、オーク等、種々の樹木；及び種々の鑑賞植物となり得るが、これらに限定されない。特定の実施形態において、生物は、サイレージの作製に用いられる植物となり得る。
本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な核酸配列又は本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の機能バリアントを含む植物細胞を培養し、植物組織培養細胞として維持することができる、或いは本技術分野において公知の特定の植物ホルモンを培地に添加して、これにより植物組織培養細胞を分化させて、ｂｍ１又は他のリグニン低下表現型を示し得る植物新品種を形成させてもよい。上述及び他の実施形態において有用なこのような植物培養方法は、日常的であり、本技術分野において周知のものである。
本発明の一部の実施形態は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な核酸配列又は本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子の機能バリアントを含むウイルス（例えば、バクテリオファージ又は植物ウイルス）を提供する。
Ｂ．ＣＡＤ２活性が低下した植物から作製されたサイレージ
サイレージを与える動物の肉の量を増加させるための方法であって、リグニン含量の低下を示す植物品種から作製されたサイレージを用いて、肥育仕上げ用飼料における従来のトウモロコシサイレージと比較して１日当たりの増体飼料効率を改善する方法が、本明細書に開示されている。このようなサイレージは、肉牛肥育仕上げ用飼料におけるトウモロコシ穀粒（grain corn）に効率的に取って代わることができる。一部の実施形態において、方法は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む植物品種から作製されたサイレージを用意するステップと、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む植物品種から作製されたサイレージを動物に給餌するステップと、動物から肉又は肉製品を作製するステップとを含む。上述及び更に別の実施形態において、サイレージを与える動物は、反芻動物となり得る。特定の実施形態において、サイレージを与える動物は、任意のサイレージを与える動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ、バイソン、ヤク、スイギュウ及びシカとなり得る。
一部の実施形態において、サイレージを与える動物の肉の量を増加させるために提供されている方法は、輸送用に構成された容器内にサイレージを配置するステップ及びサイレージを動物に投与する仕方を末端使用者に指示することのできる証印（indicia）をサイレージに添付（associating）するステップからなる群から選択される行為を更に含む。このように、末端使用者にサイレージを与える動物の肉の量の増加を達成させるような、サイレージを含むキットが提供される。
本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を含むトウモロコシサイレージを含む、肉牛肥育仕上げ用飼料も開示されている。このようなサイレージを与えた動物から調製された肉及び肉製品も開示されている。
ＣＡＤ２活性が低下した植物（例えば、トウモロコシ）からのサイレージの作製
生牧草貯蔵法の間、植物の細胞は、まだ生きており代謝的に活性があり、圧縮されたサイレージにおける植物細胞及び微生物による進行中の代謝は、サイロ貯蔵（ensile）植物材料内に閉じ込められた空気を用いて二酸化炭素及び熱を生成する。嫌気性代謝条件は、サイレージ内の二酸化炭素レベルが増加するにつれ発生する。望ましい細菌は、植物呼吸が停止すると発酵過程を始める。過剰量の空気が存在する場合、或いは二酸化炭素が漏れている場合、嫌気性条件は成立しない。この場合、呼吸が継続し、呼吸している植物細胞は、過剰量の糖及び炭水化物を用いるであろう。この状態は、望ましい細菌が、植物材料をサイレージとして保存するのに必要とされる栄養素を浪費し、劣ったサイレージを生じる可能性がある。このような望ましくない効果を回避するため、充填直後のサイレージの詰め込み及び覆いかけが重要となり得る。
植物細胞による呼吸が止むと、サイロ貯蔵トウモロコシにおいて利用できるデンプン及び単糖を糧にする細菌により酢酸及び乳酸が生成される。望ましい細菌の増殖を促進するため、サイレージは、少ない量の空気、８０°〜１００°Ｆの間の温度並びに糧としてのデンプン及び糖を含有し得る。発酵は、サイレージの酸性度が細菌増殖を停止するのに十分なほど高くなるまで継続し得る。一部の例において、所望の程度の酸性度は、ｐＨ約４．２である。この程度の酸性度は、サイロの充填後３週間以内に生じ得る。
飼料中の水分量が過剰に高い場合、漏出（Seepage）が生じ得る。漏出は、サイレージからの浸出液（サイレージ及びパルプからの過剰水分）の排水に関与し、これは一般に、深刻な汚染物質として環境中に進入する。漏出により、サイレージの望ましい成分（例えば、タンパク質等、窒素性化合物及びミネラル）は失われ得る。漏出は一般に、サイロ貯蔵後約４日目にピークに達する。従って、例えば、サイレージからの望ましいサイレージ成分の損失を回避するため、サイロに運ばれている飼料の含水量は、漏出損失を低下又は防止するため、十分に低くなるよう選ぶことができる。しかし、乾燥し過ぎたサイレージは、適切に詰め込むことができず、過剰な発酵及び成形（molding）の結果、サイレージからの望ましい成分の高い損失を同様に示し得る。
最適な発酵過程を可能にし、発酵における損失を最小化するため、植物は、約３０〜４０％の乾物含量でサイロ貯蔵することができる。約３０〜４０％の乾物含量に達するため、刈り取りの後、例えば飼料収穫器で切り刻む前に、植物材料を農場で乾燥させることが望ましくなり得る。サイレージを調製する際に、穀粒は、植物体の他の部分と共に収穫され得る。サイレージを与える動物の腸管における取り込みに関してサイレージにおける栄養素の有効性を増加させるため、切り刻み工程において穀粒を粉砕することが望ましくなり得る。
収穫された植物材料（例えば、トウモロコシ植物材料）は、サイロ内に移すことができる。サイレージ調製に有用となり得るサイロの非限定的な例として、バンカー（bunker）サイロ、サイレージヒープ（heap）、コンクリートステイブ（concrete stave）サイロ又はタワー（tower）サイロが挙げられる。植物材料は、サイロ内にぎっしり詰め込まれて、植物材料から空気を除去し、嫌気性発酵を可能にする。用いるサイロの種類に応じて、プラスチックサイレージフィルムでサイロを密封することが望ましくなり得る。トレンチサイロ、バンカーサイロ又は大型の直径のタワーサイロにおけるプラスチックカバーの使用は、飼料損失を物質的に削減することができる。通常、カバーは、サイロ内に植物材料の最後の装填が詰め込まれた直後にかけられ、プラスチックカバーに重りを付けて、サイレージ表面に堅持する。或いは、植物材料を俵に梱包（baling）し、密封のためサイレージフィルムで俵を包むことにより、植物材料は、サイロ貯蔵中の発酵に備えることができる。トレンチ又はバンカーサイロにおいて、飼料を山形に積み上げる又は凸状にすることが望ましくなり得る。この構成は、サイロからの雨水の排水を容易にすることができる。
植物材料に添加物を必要に応じて添加して、発酵を改善することができる。特定の用途において望ましくなり得る植物材料添加物の例として、ラクトバチルス属の菌種（Lactobacillus spp.）及び他の接種材料等、微生物添加物；プロピオン酸、酢酸若しくはギ酸等、酸；又は糖が挙げられる。当業者であれば容易に理解できるように、本明細書に特に列挙されている方法以外の、サイレージを作製するための他の方法を用いてもよい。
サイレージ生産の利点の一つは、このプロセスが、サイレージ作製に用いた植物材料内に含有されている栄養物質の組成、量又は有効性に影響を及ぼさないであろうことである。一方、このプロセスそれ自体の目的は一般に、サイレージ作製に用いる前の時点における植物材料の質の維持と、延長された期間における植物材料の有益な特性の保存の両方である。このようにして、植物材料は、植物材料が収穫された後に長時間飼料として用いることができる。
トウモロコシは、雌穂（ear）が十分にくぼみ形成（dented）した後、葉が褐色になるまで乾燥する前に、サイレージ用に収穫することができる。この成長段階において、雌穂は、その潜在的な飼料価値（feeding value）の多くを蓄積することができるが、葉及び茎からの損失もほとんどない。よって、トウモロコシサイレージの量及び質は、この段階において植物材料が収穫されたときにピークとなり得る。雌穂は通常、雌穂が３２〜３５％の間の水分のときに十分にくぼみ形成しているであろう。雌穂が十分にくぼみ形成した後、時間が経過するにつれ、農場損失（field loss）は増加し得る一方、植物材料の飼料価値は減少し得る。ミルクステージ（milk stage）（穀粒頭部（grain head）が開く際に白い液体を放出する）又はドウステージ（dough stage）（穀粒頭部の堅さが柔らかくなり始める）においてサイレージ用に収穫されたトウモロコシは、後の時期に収穫された場合よりも低いエーカー当たりの飼料栄養素を生じ得る。トウモロコシ由来の植物材料の早過ぎる収穫は、また、サイロ内での不適切な発酵をもたらし得る。
成熟は通常、雌穂が乾物生産潜在能力のほぼ全てを蓄積した時点を意味する。成長の間、特に秋の間の温度は、穀粒の成熟速度に影響し得る。例えば、雌穂の完全な乾物潜在能力は、過剰な寒冷温度及び／又は曇天が続く場合、達成されないことがある。遅い時期に切り取られ、褐色の死んだ葉や茎を有するトウモロコシサイレージは、妥当なサイレージを作製できるかもしれないが、エーカー当たりの総生産量は著しく低下し得る。サイレージが晩秋又は初冬に作製される場合、著しい農場損失が見られた。また、遅い時期に切り取られたサイレージに関して、サイロ内に貯蔵されている乾物量の低下が見られることがある。
例えば、乾燥、高温、胴枯れ病（blight）、霜又は雹により損傷を受けたトウモロコシは、サイレージ用にサルベージしてよい。しかし、このようなサルベージされたサイレージの質は、デントステージ（dent stage）に達した未損傷のトウモロコシから作製されたサイレージほど高くはない。サイレージの飼料価値は、トウモロコシの発達状態と、損傷を受けた後にトウモロコシがどのように取り扱われたかの両方に依存する。未成熟トウモロコシ由来のサイレージの一般的な観察として、より多量の水分；成熟トウモロコシとは異なる様式の発酵；酸っぱい匂い；及び下剤効果の増加が挙げられる。霜を経験したトウモロコシは通常、低いカロチン含量を有する。これは急速に乾ききり、葉を落とす。よって、霜が降りたトウモロコシに水を加え、強く乾燥することが望ましくなり得る。干ばつ被害のトウモロコシに水を加えることも望ましくなり得る。
超高温により損傷を受けた未成熟トウモロコシが、直ちにサイロ貯蔵されないことも望ましくなり得る。未成熟の熱損傷トウモロコシは、雌穂を生じない可能性が高いが、収穫を遅らせることにより更なる茎成長がなされ得る。更なる茎成長は、更なる飼料を生じるであろう。トウモロコシが、熱による損傷を広範に受けた後に直ちにサイレージ用に収穫される場合、茎は、高品質のサイレージを作製するには多過ぎる水分を有する。広範な熱損傷後に直ちに収穫された、過剰な水分を有するトウモロコシは、漏出により栄養素も失うであろう。
サルベージされたトウモロコシから作製されたサイレージに伴う可能性のある問題は、穀粒形成の低下によるエネルギー含量の欠如と、損傷植物の過剰な乾燥に起因する不適切な発酵を包含する。当業者にとって公知の通り、これらの問題は、それぞれ追加的なエネルギー源の補充及び水分の添加により少なくとも部分的に修正することができる。
トウモロコシサイレージは、１／２”〜３／４”の長さの粒子に切断することができる。このサイズの粒子は、より堅く詰め込むことができ、更には、サイレージを与える動物にとってより美味となり得る。１／２”よりも短い長さへと非常に細かく切断したサイレージは、再切断（recutter）により作製することができる。非常に細かく切断したサイレージの使用は、例えばサイロ内に貯蔵できる乾物量を増加させる。しかし、非常に細かく切断したサイレージは、サイレージを与えられる動物にとっての美味しさが低下し得る。
サイレージが乾燥し過ぎている場合、水を添加して、例えば、気密条件を確立することが望ましくなり得る。一般に、所望の含水量上昇１パーセント毎に０．９メートルトンのサイレージにつき３．７９リットルの水が添加され得る。程度の差はあれ水が必要とされ得ること、そしてサイロ貯蔵過程において測定が為されて、十分な量であって過剰な量ではない水が添加されるのを確実にできることが理解される。サイロが充填されている最中に水を添加することができる。サイロが充填された後に水が添加される場合、水はサイロ壁を伝ってしみ出る可能性があり、従ってサイレージ塊に浸透しない。この漏出は、サイレージ栄養素の浸出の原因となり得、気密性を崩壊させ、不適切な発酵を生じ得る。
高品質サイレージは、いかなる添加物又は保存料も添加することなく作製することができる。しかし、サイレージに添加物を加えて、サイレージの１又は複数の特徴を増加させてもよい。例えば、サイロ貯蔵時にトウモロコシ飼料に糖蜜及び穀粒を加えてよい。
大容量サイロ及び高速充填方法により、サイロ内におけるサイレージの分布及び詰め込みをモニターするべきである。不適切な分布及び詰め込みは、過剰な漏出、発酵不良及び／又は貯蔵能力の損失の原因となり得る。円筒状サイロの容量の半分は、サイロの最外側の縁にある。例えば、直径１４’の円筒状サイロに関し、その容量の半分は、その直径の最外側２’にある。この外側部分における材料が過剰に緩く詰め込まれている場合、サイロの容量は著しく低下し得る。よって、タワーサイロは、適切なサイレージ分布及び詰め込みを容易にする分配器（distributor）を備えることができる。
栄養素の損失は、発酵過程を行う生きた微生物の存在のため、サイロ貯蔵過程においてあらゆるサイレージで生じる。サイロ貯蔵過程において失われる栄養価の量は、とりわけ、充填の際の空気排除及び二酸化炭素損失の防止に依存する。二酸化炭素は、サイロ貯蔵された植物細胞の呼吸の停止；並びに漏出損失、望ましくない発酵及び／又は植物材料表面の曝露による損傷の防止に必要とされる。従って、優れたサイロ貯蔵の実施は一般に、最大の栄養素含量を有するより高品質のサイレージをもたらす。
肥育仕上げ用飼料におけるＣＡＤ２活性が低下した植物（例えば、トウモロコシ）由来のサイレージ
ＣＡＤ２活性が低下した植物由来のサイレージは、同一品種の野生型植物と比較して低下したリグニン含量を有し、加工されているか否かにかかわらず、正常サイレージよりも長い粒子へと切り刻むことができる。ｂｍ１サイレージのＮＤＦ消化性は、正常サイレージのものよりも高い。新しく作成されたサイレージの組成は、サイレージを与える動物が食すことになる飼料の組成に必ずしも反映しない。従って、発酵された試料は、サイロ内の期間の後に解析することができる。例えば、試料は、サイロ内における少なくとも２週間又は少なくとも２ヶ月後に解析することができる。
ＣＡＤ２活性が低下した植物由来のサイレージが調製され、サイレージを動物に与える準備ができたと決定されると、サイレージは、肉又は肉製品の生産に用いられることになる動物に与える肥育仕上げ用飼料中に包含される。一部の例において、サイレージを含む肥育仕上げ用飼料は、トウモロコシ穀粒、例えば、乾燥圧延（rolled）トウモロコシ又は粉砕トウモロコシを含まなくてよい。典型的な肥育仕上げ用飼料は、少なくとも約１１％タンパク質、約６０ＭＣａｌの正味エネルギー、約０．５％カルシウム、約０．３５％亜リン酸及び約０．６％カリウムを含む。一部の例において、肥育仕上げ用飼料がより高い飼料効率（Ｇ：Ｆ）を示すことは有利である。特定の例において、トウモロコシ穀粒を含まない肥育仕上げ用飼料は、肥育仕上げ用飼料を与えた動物において、エネルギー源としてトウモロコシ穀粒を用いた正常肥育仕上げ用飼料によってもたらされる平均１日増体量に匹敵する平均１日増体量をもたらし得る。
一部の例において、肥育仕上げ用飼料は、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む植物（例えば、トウモロコシ）由来のサイレージを用いて作製され、肥育仕上げ用飼料は、約１５％〜約３０％の間のサイレージを含む。よって、肥育仕上げ用飼料は、例えば、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％又は３３％サイレージを含むことができる。特定の例において、肥育仕上げ用飼料は、ｂｍ１トウモロコシサイレージを用いて作製される。一部の例において、少なくとも１種の繊維源を含む肥育仕上げ用飼料が作製される。よって、肥育仕上げ用飼料は、例えば、１、２、３、４又は５種以上の繊維源を含むことができる。一部の例において、少なくとも１種のトウモロコシ副産物を含む肥育仕上げ用飼料が作製される。よって、肥育仕上げ用飼料は、例えば、１、２、３、４又は５種以上のトウモロコシ副産物を含むことができる。一部の例において、６０％未満の乾物を含む肥育仕上げ用飼料が作製される。更に別の例において、肥育仕上げ用飼料は、５５％未満の乾物を含む。一部の特異的な例において、肥育仕上げ用飼料は、５０％未満の乾物を含む。よって、肥育仕上げ用飼料は、例えば、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％又は４０％乾物を含むことができる。
Ｃ．変異体ＣＡＤ２遺伝子と１又は複数の追加的な形質（複数可）とのスタッキング
一部の実施形態において、ｂｍ１又は他のリグニン低下表現型と、１又は複数の望ましい形質（複数可）の両方を有する植物を作製するため、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子は、１又は複数の望ましい形質（複数可）を含む植物に導入することができる。本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を、１又は複数の望ましい形質を含む植物に導入するプロセス（既存の植物系統に導入することによる、或いは変異体ＣＡＤ２遺伝子を、望ましい形質を付与する追加的な核酸分子と同時に植物に導入することによる）は、本明細書において、「スタッキング」と称される。一部の例において、変異体ＣＡＤ２遺伝子を１又は複数の望ましい形質とスタッキングすることにより、ｂｍ１又は他のリグニン低下表現型は、１又は複数の望ましい形質と組み合わせることができる。例えば、ｂｍ１形質とｂｍ３形質とのスタッキングは、サイレージ消化性の更なる増加及び前処理なしのバイオマス加水分解における発酵可能な糖の収量の非常に有意な改善をもたらし得る。
ｂｍ１又は他のリグニン低下表現型との組み合わせに望ましくなり得る形質の例として、細胞質雄性不稔；植物疾患抵抗性遺伝子（例えば、Jones et al. (1994) Science 266:789（クラドスポリウム・フルブム（Cladosporium fulvum）に対する抵抗性のためのトマトＣｆ−９遺伝子）；Martin et al. (1993) Science 262:1432（シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のためのトマトＰｔｏ遺伝子）；及びMindrinos et al. (1994) Cell 78:1089（シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のためのＲＳＰ２遺伝子）を参照）；害虫に対する抵抗性を付与する遺伝子；バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質、その誘導体又はそれをモデルとした合成ポリペプチド（例えば、Geiser et al. (1986) Gene 48:109（Ｂｔδ−エンドトキシン遺伝子；δ−エンドトキシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（バージニア州マナッサス）から、例えばＡＴＣＣ受託番号４００９８；６７１３６；３１９９５；及び３１９９８により購入することができる）を参照）；レクチン（例えば、Van Damme et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:25（ウケザキクンシラン（Clivia miniata）マンノース結合レクチン遺伝子）を参照）；ビタミン結合タンパク質、例えば、アビジン（国際ＰＣＴ公開ＵＳ９３／０６４８７（昆虫害虫に対する幼虫駆除剤としてのアビジン及びアビジンホモログの使用）を参照）；酵素阻害剤；プロテアーゼ又はプロテイナーゼ阻害剤（例えば、Abe et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:16793（イネシステインプロテイナーゼ阻害剤）；Huub et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:985（タバコプロテイナーゼ阻害剤Ｉ；及び米国特許第５，４９４，８１３号を参照）；アミラーゼ阻害剤（Sumitani et al. (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243（ストレプトマイセス・ニトロスポレウス（Streptomyces nitrosporeus）アルファ−アミラーゼ阻害剤）を参照）；昆虫特異的ホルモン又はフェロモン、例えば、エクジステロイド若しくは幼若ホルモン、そのバリアント、それに基づくミメティック又はそのアンタゴニスト若しくはアゴニスト（例えば、Hammock et al. (1990) Nature 344:458（幼若ホルモンの失活剤）を参照）；影響を受けた害虫の生理機能を崩壊させる昆虫特異的ペプチド又は神経ペプチド（例えば、Regan (1994) J. Biol. Chem. 269:9（昆虫利尿ホルモン受容体）；Pratt et al. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243（ジプロプテラ・プンタタ（Diploptera puntata）由来のアロスタチン（allostatin））；米国特許第５，２６６，３１７号（昆虫特異的麻痺性神経毒）を参照）；ヘビ、スズメバチその他の生物により天然に産生される昆虫特異的毒液（例えば、Pang et al. (1992) Gene 116:165（サソリ昆虫毒性（insectotoxic）ペプチド）を参照）；モノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体又は殺虫活性を有する別の非タンパク質分子の高度蓄積の原因である酵素；生物活性分子の翻訳後修飾等、修飾に関与する酵素、例えば、解糖系酵素；タンパク分解酵素；脂肪分解酵素；ヌクレアーゼ；シクラーゼ；トランスアミナーゼ；エステラーゼ；ヒドロラーゼ；ホスファターゼ；キナーゼ；ホスホリラーゼ；ポリメラーゼ；エラスターゼ；キチナーゼ；又はグルカナーゼ（天然であれ合成であれ）（国際ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０２１９７（カラーゼ（callase）遺伝子）；キチナーゼコード配列を含有するＤＮＡ分子（例えば、ＡＴＣＣ、受託番号３９６３７及び６７１５２における）；Kramer et al. (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691（タバコスズメガ（tobaccohornworm）キチナーゼ）；及びKawalleck et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:673（パセリｕｂｉ４−２ポリユビキチン遺伝子）を参照；シグナル伝達を刺激する分子（例えば、Botella et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:757（カルモジュリン）；及びGriess et al. (1994) Plant Physiol. 104:1467（トウモロコシカルモジュリン）を参照；疎水性モーメント（moment）ペプチド（例えば、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１６７７６（真菌性植物病原体を阻害するタキプレシンのペプチド誘導体）；及び国際ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１８８５５（疾患抵抗性を付与する合成抗菌ペプチド）を参照）；膜パーミアーゼ、チャネル形成薬（former）又はチャネル遮断薬（例えば、Jaynes et al. (1993) Plant Sci 89:43（シュードモナス・ソラナセアルム（Pseudomonas solanacearum）に対し抵抗性のトランスジェニック植物を提供するためのセクロピン−β溶解性ペプチドアナログ）を参照；ウイルス浸潤性タンパク質又はそれに由来する複合毒素（例えば、Beachy et al. (1990) Ann. rev. Phytopathol. 28:451（コートタンパク質を介在性の、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス、ジャガイモウイルスＸ、ジャガイモウイルスＹ、タバコエッチ病（etch）ウイルス、タバコ茎壊疽（rattle）ウイルス及びタバコモザイクウイルスに対する抵抗性）を参照）；昆虫特異的抗体又はそれに由来する免疫毒素（例えば、Taylor et al., Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions（スコットランド、エディンバラ）(1994)（単鎖抗体断片の産生による、酵素的不活性化）を参照；ウイルス特異的抗体（例えば、Tavladoraki et al. (1993) Nature 366:469（ウイルス攻撃からの保護のための組換え抗体遺伝子）を参照）；病原体又は寄生生物により天然に産生される発達停止（arrestive）タンパク質（例えば、Lamb et al. (1992) Bio/Technology 10:1436（真菌エンドα−１，４−Ｄ−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁の可溶化により真菌コロニー形成及び植物栄養素放出を容易にする、ホモ−α−１，４−Ｄ−ガラクツロナーゼ；Toubart et al. (1992) Plant J. 2:367（エンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質）を参照）；並びに植物により天然に産生される発達停止タンパク質（例えば、Logemann et al. (1992) Bio/Technology 10:305（真菌性疾患に対する抵抗性増加をもたらすオオムギリボソーム不活性化遺伝子）を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。
ｂｍ１又は他のリグニン低下表現型との組み合わせに望ましくなり得る形質の更に別の例として、除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子（Lee et al. (1988) EMBO J. 7:1241（変異体ＡＬＳ酵素）；Miki et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449（変異体ＡＨＡＳ酵素）；米国特許第４，９４０，８３５号及び第６，２４８，８７６号（グリホサート抵抗性を与える変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子）；米国特許第４，７６９，０６１号及びＡＴＣＣ受託番号３９２５６（ａｒｏＡ遺伝子）；グリホサートアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（グリホサート抵抗性）；ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）及びストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes））等、ストレプトマイセス属（Streptomyces）の種に由来する他のホスホノ（phosphono）化合物、例えば、欧州出願第０２４２２４６号及びDeGreef et al. (1989) Bio/Technology 7:61（グリホサート抵抗性を与えるグルホシネートホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）に記載；ピリジノキシ（pyridinoxy）又はフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキソン（cyclohexone）（グリホサート抵抗性）；欧州特許出願第０３３３０３３号及び米国特許第４，９７５，３７４号（Ｌ−ホスフィノトリシン等、除草剤に対する抵抗性を与えるグルタミンシンセターゼ遺伝子）；Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435（セトキシジム及びハロキシホップ等、フェノキシプロピオン酸及びシクロヘキソンに対する抵抗性を与えるＡｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２及びＡｃｃ１−Ｓ３遺伝子）；ＷＯ２００５０１２５１５（グリホサート抵抗性を与えるＧＡＴ遺伝子）；ＷＯ２００５１０７４３７（２，４−Ｄ、フォップ（fop）及びピリジルオキシ（pyridyloxy）オーキシン除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子）；及びトリアジン（ｐｓｂＡ及びｇｓ＋遺伝子）又はベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）等、光合成を阻害する除草剤（例えば、Przibila et al. (1991) Plant Cell 3:169（変異体ｐｓｂＡ遺伝子）を参照；ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第４，８１０，６４８号に開示されており、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ受託番号５３４３５、６７４４１及び６７４４２から入手できる；並びにHayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ））が挙げられるがこれらに限定されない。
ｂｍ１又は他のリグニン低下表現型との組み合わせに望ましくなり得る形質の更に別の例として、価値付加形質、例えば、改変された脂肪酸代謝（例えば、Knultzon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624（植物のステアリン酸含量を増加させるためのステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子）を参照）；フィチン酸含量の減少（例えば、Van Hartingsveldt et al. (1993) Gene 127:87（クロコウジカビ（Aspergillus niger）フィターゼ遺伝子は、フィチン酸の分解を増強し、より多くの遊離リン酸塩を形質転換植物に付加する）；及びRaboy et al. (1990) Maydica 35:383（低レベルのフィチン酸を有するトウモロコシ変異体の原因アレルに関連するＤＮＡのクローニング及び再導入）を参照）；並びに例えば、デンプンの分枝パターンを変化させる酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換することにより達成される、改変された炭水化物組成（例えば、Shiroza et al. (1988) J. Bacteol. 170:810（ストレプトコッカス属（Streptococcus）変異体フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子）；Steinmetz et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 20:220（レバンスクラーゼ（levansucrase）遺伝子）；Pen et al. (1992) Bio/Technology 10:292（α−アミラーゼ）；Elliot et al. (1993) Plant Molec. Biol. 21:515（トマトインベルターゼ遺伝子）；Sogaard et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22480（オオムギα−アミラーゼ遺伝子）；及びFisher et al. (1993) Plant Physiol. 102:1045（トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素ＩＩ）を参照）を付与又はそれに寄与する遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。
Ｄ．ＣＡＤ２活性が低下した植物の他の使用
サイレージ作製以外の多くの農学又は工業適用は、その収量が植物細胞壁におけるリグニンの含量及び／又は組成に直接的に連関する所望の植物生成物に関係する。このような生成物及び適用の例として、紙生産及び例えばバイオ燃料の形態のエネルギー生産において用いられる生成物が挙げられるがこれらに限定されない。本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む植物は、ｂｍ１又は他のリグニン低下表現型を有し得る。当業者であれば認められる通り、このような植物に由来する植物生成物は、同一品種の野生型植物から際立った、望ましくなり得る特徴を有することが予想され得る。よって、植物における予想されるｂｍ１又は他のリグニン低下表現型を活用する、本開示に係る変異体ＣＡＤ２遺伝子を含む植物のいかなる使用も、本開示の範囲内に収まる。
次に、ある特定の特色及び／又は実施形態を説明するために実施例を記載する。実施例は、例証されている特定の特色又は実施形態に本開示を限定するものと解釈するべきではない。
２種のｂｍ１系統由来のＣＡＤ２遺伝子のクローニング及び配列決定
自殖系統５１５Ｄｂｍ１（ｂｍ１変異体）、６ＸＮ４４２（野生型）及びＤＡＳｂｍ１からのトウモロコシ葉試料を用いた。ＤＡＳｂｍ１は、ＣＶ５１２３／ＧＲ８２０７の遺伝的背景において発見された新規の天然起源のｂｍｒ変異体である。ＤＡＳｂｍ１変異の元となる本来のＦ１世代は、２００３年夏に育種交雑区画において、雄性側としてＧＲ８２０７を用いてこれを雌性側ＣＶ５１２３と交雑することにより作出された。２００３年冬の苗床（nursery）においてこの交雑種を自家受粉して、次にＦ２雌穂が膨らんで（bulked）Ｆ２種子を付けた。２００４年夏にＦ２集団を植え、穀粒検定に進むための６０本の自家受粉した雌穂を選択した。これら６０本の雌穂を自家受粉のために２００４年冬の苗床に送って、次に進むべきＳ２雌穂選択を行った。次に、２００６年夏苗床にＳ２雌穂を植えた。
ｂｍｒ変異体の発見は、苗床を歩いて自殖系統を観察しつつ行った。明瞭なＢＭＲ表現型を示す作条を同定した。この作条は、ＣＶ５１２３／ＧＲ８２０７−Ｂ集団から選択された６０本の雌穂のうちの雌穂３１であり、ＢＭＲ形質に関する以外は、選択された他の５９本の雌穂と植物構造において極めて密接な類似点を示した。当初は、変異体がｂｍ３であるか、ｂｍ１であるか、或いは他の変異であるか決定できなかった。次に、Ｓ２植物を自家受粉させ、種子を採取、保存した。２００７年夏にＳ３種子を播種したところ、全植物が依然としてＢＭＲ形質を示した。Ｓ３植物を自家受粉させて、Ｓ４雌穂を作出し、この系統をサイレージ生産の対象候補として留意した。２００８年夏に、公知のｂｍ１及びｂｍ３自殖系統の両方と検定交雑を行って、ｂｍｒ変異体の背景を決定した。２００９年夏に、後代検定において検定交雑種子が十分に成長し、ｂｍ１自殖による後代検定における全植物は、ＢＭＲ形質を発現したが、ｂｍ３後代は、全植物が非ＢＭＲであることを示したため、この変異が新規のｂｍ１変異であることが決定された。次に、ＣＶ５１２３／ＧＲ８２０７ ＮＩＬ、５１５Ｄｂｍ１自殖並びに種々の遺伝的背景のヘテロ接合型及びヌル型植物から葉組織をサンプリングし、マーカー実験等、分子遺伝学的解析に付して、ＤＡＳｂｍ１ ｂｍｒ変異体の正確な性質を決定した。
Ｇｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ ２０００（ＳＰＥＸ ＣｅｒｔｉＰｒｅｐ、ニュージャージー州メタチェン）を用いて、トウモロコシ葉試料を微粉末に粉砕した。標準２．５％ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）ＤＮＡ抽出プロトコールによりＤＮＡを抽出した。ＰＣＲに先立ち、Ｑｕａｎｔ−ｉｔ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ定量化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いてメーカーの指示に従ってＤＮＡ試料を定量化した。
トウモロコシ自殖系統、トウモロコシＢ７３由来のＣＡＤ２ゲノム配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＣ２３００３１）から検索した。この配列は、およそ５．９ｋｂの長さであり、１．７ｋｂプロモーター、４個のエクソン、３個のイントロン及び短いターミネーターを包含する。Ｂ７３配列に基づきプライマーを設計し、ＡＢＩ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いてＰＣＲ反応を行った。反応液は、２．５ユニットのＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．、日本、滋賀県）、４００ｎＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭのフォワード及びリバースプライマー並びに３０ｎｇのゲノムＤＮＡを含有した。次のＰＣＲプログラムを用いた。ＰＣＲは、２分間９４℃の変性ステップから開始し、続いて、３０サイクルの９４℃４５秒間、５５℃４５秒間及び７２℃２分間を行った。ＰＣＲ産物を２％Ｅ−Ｇｅｌにおいて可視化し、次に、ＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）クイックゲル抽出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて抽出した。次に、精製ＰＣＲ産物は、直接配列決定のためにＥｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ（アラバマ州ハンツビル）に送った。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ４．８（ミシガン州アナーバー）を用いて配列を解析した。ｂｍｒ変異体及び６ＸＮ４４２から増幅されたＣＡＤ２配列を、トウモロコシＢ７３に関して記載されている配列と比較することにより変異を同定した。
３個の相当に長いイントロン及びいくつかの珍しい配列特色（例えば、イントロン３における８２ｂｐのＴＡ単純反復）の存在のため、１本の５．９ｋｂ断片にＣＡＤ２遺伝子を増幅する最初の試みは失敗した。その結果、一連のネステッドＰＣＲプライマーを設計（表１を参照）して用いたところ、５１５Ｄｂｍ１及び野生型系統から７本の重複するＣＡＤ２断片の増幅に成功した。図１。７本の断片から５１５Ｄｂｍ１及び野生型系統の全長ＣＡＤ２配列を組み立てた。５１５Ｄｂｍ１及び４ＸＮ４４２のゲノム、予測ｃＤＮＡ及びタンパク質配列を配列番号１〜６として収載する。
５１５Ｄｂｍ１変異体ＣＡＤ２と、野生型（６ＸＮ４４２）及びｂｍ１（Ｂ７３）のＣＡＤ２との比較は、１５個のＳＮＰ及び８個の挿入／欠失の存在を明らかにした。これらの変化の多くは、プロモーター領域又はイントロンに位置していたが、例外として、ＡＣジヌクレオチド挿入（５１５Ｄｂｍ１におけるヌクレオチド３９９４〜３９９５）は、ｂｍ１変異体のエクソン３に位置し、Ｇ／Ａ ＳＮＰ（５１５Ｄｂｍ１におけるヌクレオチド５４１０）は、第４のエクソンに位置していた。図３及び４を参照されたい。５１５Ｄｂｍ１におけるＡＣ挿入は、フレームシフト及び挿入の５２ｂｐ下流に未成熟終止コドンを生じ、この結果、非常に短いＣＡＤ２タンパク質（５１５Ｄｂｍ１ ＣＡＤ２の１４７アミノ酸、対、野生型ＣＡＤ２の３６７アミノ酸が得られる。図４。切断型５１５Ｄｂｍ１ ＣＡＤ２タンパク質は、ＮＡＤＰＨ結合及びＣ末端触媒ドメインを欠くため、産生されたとしても非機能性である可能性が最も高い。
表１に示すものと同じ７対のプライマー対を用いて、ＤＡＳｂｍ１から重複するＣＡＤ２断片の増幅を試みたところ、６対が予想される断片を増幅した。しかし、Ｆ５／Ｒ５対は、複数回試みた後であっても、予想される３３２７ｂｐ断片その他のいかなる特異的ＰＣＲ産物も増幅（amply）できなかった。従って、追加的なネステッドＰＣＲプライマーを設計し（表２を参照）、これらを用いて、欠落した３３２７ｂｐ断片のうち５’末端２７５７ｂｐの増幅に成功した。しかし、本出願人らは、多くのプライマー対及びＰＣＲ条件を用いても３'末端（およそ５７０ｂｐ）を増幅できなかった。欠落した５７０ｂｐギャップを除いて、ＤＡＳｂｍ１由来の増幅された５３４６ｂｐのＣＡＤ２ゲノム配列は、Ｂ７３の配列と同一であった。本出願人らは、これがＢＭＲ表現型の分子変化を含有した領域であったのではないかと考える。
予測されるエクソン１及びエクソン３を網羅するプライマーを設計し（ＣＶＦ：ＧＴＣＣＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＣ（配列番号３５）；及びＣＶＲ：ＧＧＣＣＧＴＣＣＡＴＣＡＧＴＧＴＡＧＡ（配列番号３６））、次に、これらを用いてＤＡＳｂｍ１、５１５Ｄｂｍ１及び６ＸＮ４４２からＣＡＤ２ ｃＤＮＡ断片を増幅した。予想した通り、５１５Ｄｂｍ１及び６ＸＮ４４２から３７５ｂｐの断片が増幅された。他方では、ＤＡＳｂｍ１由来のＰＣＲ産物は、有意により大きいことが判明した。配列決定の結果は、ＤＡＳｂｍ１由来のＣＡＤ２ ｃＤＮＡが、内在性エクソン１とエクソン２との間に余分な４０９ｂｐ挿入を含有することを明らかにした。図４。Ｂ７３ゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索は、ＤＡＳｂｍ１における４０９ｂｐのｃＤＮＡ挿入が、数個のイントロンを含有する１番染色体上に位置する推定トランスポゾン／反復遺伝子（ＧＲＭＺＭ２Ｇ０１７７３６）の部分からのＲＮＡスプライシングの結果である可能性が最も高いことを示唆した。
ＤＡＳｂｍ１及びその可能なゲノム源において観察された４０９ｂｐのｃＤＮＡ挿入に基づき、追加的なＰＣＲプライマーを設計し（表３を参照）、これらを用いてＤＡＳｂｍ１からＣＡＤ２のキメラゲノム領域を増幅した。図１。配列決定の結果は、ゲノム挿入が３４４４ｂｐの長さであり、ＤＡＳｂｍ１から増幅された全ゲノムＣＡＤ２が９３６０ｂｐであることを明らかにする。ＤＡＳｂｍ１、Ｂ７３、５１５Ｄｂｍ１及び６ＸＮ４４２由来のゲノムＣＡＤ２のアライメントを図３に示す。３４４４ｂｐ挿入を除いて、ＤＡＳｂｍ１由来の残りのＣＡＤ２配列は、Ｂ７３の配列と同一である。３４４４ｂｐのＤＡＳｂｍ１トランスポゾン挿入は、本明細書において配列番号４０と記述される。
ＤＡＳｂｍ１における挿入のゲノム上の性質
図２に示す通り、ＤＡＳｂｍ１における挿入部位は、ＣＡＤ２の内在性イントロン１に位置する。３４４４ｂｐ挿入配列のより精密な検査により、最後の１１塩基、配列ＴＡＣＴＧＡＴＡＴＣＴ（配列番号４１）が、挿入のすぐ上流に位置するＣＡＤ２のイントロン１の１１ｂｐ配列の直接の複製であることが明らかなった。図２。このような直接反復は、挿入が、ＤＮＡトランスポゾン活性によるものである可能性が高いことを示す。
３４３３ｂｐ挿入（１１ｂｐ直接反復なし）を用いたＢ７３ゲノム配列に対するＢＬＡＳＴ検索結果は、異なる染色体における多数の相同的ヒットを示し、これは配列の反復的性質を示す。しかし、１番染色体における唯一のヒット（トウモロコシＢ７３ ＲｅｆＧｅｎ＿ｖ１、ヌクレオチド位置１４８０８６１７６〜１４８０８９８５０）は、ＤＡＳｂｍ１挿入における２４２ｂｐの欠落したギャップを除いて、全長に亘り１００％同一であった。図４。他のヒットは、１００％未満の同一であり、挿入部分のみマッチする。ＣＡＤ２は、５番染色体上に位置するため、ＤＡＳｂｍ１における挿入は、１番染色体におけるその本来の位置から切り取られ、トランスポゾン活性によりＣＡＤ２に再挿入された可能性が最も高い。２４２ｂｐの欠落したギャップは、Ｂ７３及びＤＡＳｂｍ１（ＣＶ５１２３／ＧＲ８２０７）ゲノムの間の差を反映し得る、或いは転位の際の欠失によるものである可能性がある。
相当数の対応する全長ＥＳＴ（例えば、ＥＵ９７６７４６及びＥＵ９７６３３５）がデータベースに見られるため、予測される遺伝子（ＧＲＭＺＭ２Ｇ０１７７３６）は、３４３３ｂｐ挿入配列内に位置し、正常トウモロコシ植物において明らかに転写される。ＧＲＭＺＭ２Ｇ０１７７３６における予測されるＯＲＦは、通常、より大型のタンパク質であるトランスポサーゼの多くのｈＡＴ（ショウジョウバエ（Drosophila）のｈｏｂｏ、トウモロコシのＡｃ及びキンギョソウのＴａｍ３にちなむ）ファミリーと高度な相同性を示す、１６７アミノ酸の小型のタンパク質をコードする。切断型１６７アミノ酸タンパク質は、全長トランスポサーゼにおいて通常見られるＢＥＤジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン（Ｐｆａｍ０２８９２）を欠くため、３４３３ｂｐ断片は、転位のために他の位置にＡｃエレメントの存在を必要とするＤｓエレメントである可能性がより高い。
５番染色体上のＣＡＤ２遺伝子座において、挿入及びＣＡＤ２は、キメラ遺伝子を形成する。挿入は、４０９ｂｐの３個のエクソンにスプライスされ、内在性ＣＡＤ２エクソンとのキメラｍＲＮＡを形成する。図２及び４。この第一の１１５８ｂｐ断片の挿入は、キメライントロンとして５'末端の９２７ｂｐのＣＡＤ２の第一のイントロンと共にスプライスされ、ＧＲＭＺＭ２Ｇ０１７７３６の予測ＯＲＦ全体は、１２０４ｂｐイントロンの一部としてスプライスされ、挿入の最後の４６３ｂｐ断片は、キメライントロンとして３'末端の２３１ｂｐのＣＡＤ２の第一のイントロンと共にスプライスされる。図２。
トランスポゾン挿入はＤＡＳｂｍ１ ＣＡＤ２に未成熟ＳＴＯＰを生じる
上に記す通り、ＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入は、内在性ＣＡＤ２エクソン１とエクソン２との間に余分な４０９ｂｐを有するキメラｍＲＮＡとして転写されるキメラ遺伝子を生成する。図４。この余分な４０９ｂｐ配列は、４８アミノ酸しかない非常に短いＣＡＤ２タンパク質（ｖｓ．野生型タンパク質の３６７アミノ酸）をもたらすフレームシフト及び未成熟終止コドンを生じることが予測される。図５。５１５Ｄｂｍ１の切断型ＣＡＤ２タンパク質と同様に、４８アミノ酸ＤＡＳｂｍ１ ＣＡＤ２は、ＮＡＤＰＨ結合及びＣ末端触媒ドメインを欠くため、産生されたとしても非機能性である可能性が最も高い。
ＣＡＤ２アレル特異的ＰＣＲに基づくハイスループットアッセイの設計及び検証
５１５Ｄｂｍ１ ＺｍＣＡＤ２のエクソン３におけるＡＣ挿入に基づきＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイを設計して、野生型アレルから変異体アレルを識別した。メーカー（ＫＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、英国ハートフォードシャー州ホッデスドン）から入手できるプロトコールに従って、ｂｍ１変異なしの３２の野生型自殖系統及びｂｍ１変異を含有する分離集団を検定した。
５１５Ｄｂｍ１ ＣＡＤ２アレルを他のｂｍ１及び野生型ＣＡＤ２アレルから区別するよう用いることのできるハイスループットＫＡＳＰａｒ（商標）マーカーアッセイのため、ＡＣ挿入周囲の配列に基づき３種のオリゴ（oligo）を設計した（配列番号４２（ＡＣ＿Ｒ１）；ＴＣＡＧＴＣＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡＣＴＴＣＴＧＧ、配列番号４３（ＡＣ＿Ａ１）；ＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧＧＡＣＧＧＣＣＣＡＣＡ及び配列番号４４（ＡＣ＿Ａ２）；ＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＡＣＴＧＡＴＧＧＡＣＧＧＣＣＣＡＣＧ）。図８。
先ず、３２の野生型自殖のパネル及びｂｍ１変異体系統、５１５Ｄｂｍ１を用いてＫＡＳＰａｒ（商標）アッセイを検証した。この解析は、非ｂｍ１系統がＡＣ挿入を含有しないことを示した。次に、３種の遺伝子型：ホモ接合型野生型；ホモ接合型ｂｍ１（５１５Ｄｂｍ１ ＡＣ挿入を含有）；及びヘテロ接合型のうち１型を保有するｂｍ１トウモロコシ系統の分離集団においてアッセイを検証した。図９。ＫＡＳＰａｒマーカーは、ホモ接合型ｂｍ１及びヘテロ接合型集団内のｂｍ１ ＡＣ挿入を検出した。更に、このハイスループットアッセイは、ホモ接合型ｂｍ１、ヘテロ接合型及びホモ接合型野生型集団を互いに識別した。このように、上述等のマーカーを用いて、５１５Ｄｂｍ１由来のｂｍ１を含有すると疑われる植物におけるｂｍ１遺伝子型の接合状態の的確な同定を迅速に提供することができる。従って、アッセイをｂｍ１生殖質の同定に用いて、ｂｍ１形質の遺伝子移入と、サイレージの消化性を改善又はエタノール収量を増加するためのｂｍ１を用いた分子育種を加速させることができる。
本出願人らは、ＤＡＳｂｍ１、５１５Ｄｂｍ１及び野生型ＣＡＤ２アレル全ての間を識別するための新規ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイも開発した。ＤＡＳｂｍ１及び５１５Ｄｂｍ１に用いたプライマー及びプローブは、それぞれ表４及び表５に収載されている。ＤＡＳｂｍ１は、大型のトランスポゾン挿入を有するため、ＤＡＳｂｍ１（ＤＡＳｂｍ１＿Ｆ）及び野生型（Ｗｔ ＣＡＤ２＿Ｆ）に対し別個のフォワードプライマーを設計して、標準ＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ条件下で適切なＰＣＲ産物が増幅されるようにした。ＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入、５１５Ｄｂｍ１におけるＡＣ挿入及び野生型ＣＡＤ２配列に基づき、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３．０を用いてＴａｑＭａｎ（商標）アッセイのためのプライマー及びプローブを設計した。プライマー並びにＦＡＭ又はＶＩＣ及びＭｉｎｏｒ Ｇｒｏｖｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｎｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）Ｉ（ＭＧＢＮＦＱ）色素による二重標識プローブをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）により合成した。オリゴを１×Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡに溶解して１００μＭとした。全ＰＣＲ反応にＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子型判定マスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ、カタログ＃４３７１３５５）を用いた。ｉＣｙｃｌｅｒ（商標）光学システム（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）において９６ウェルプレートを用いて２５μｌ容量のリアルタイムＰＣＲ反応をセットアップし、推奨されている通り、１５分間９５℃の変性から始め、続いて５０サイクルの９２℃１５秒間及び６０℃１分間を行った。各サイクルの終わりに蛍光シグナルを記録した。
表４及び５に記されているプライマーを用いたアレル識別アッセイの結果を図１０に示す。これらのアッセイ及びＫＡＳＰａｒ（商標）マーカーは、ＣＡＤ２におけるｂｍ１変異に直接的に基づくため、利用できる間接的ｂｍ１マーカーよりも的確な遺伝子型判定を提供するであろう。
切断ＣＡＤ２変異を有するｂｍ１トウモロコシの特徴
ＤＡＳｂｍ１は、新規のｂｍ１変異を表すため、ＢＭＲ表現型を有すること以外はＤＡＳｂｍ１について何も分かっていない。本出願人らは、ＤＡＳｂｍ１植物におけるＲＮＡ発現レベル及びリグニン含量を調べ、これらを５１５Ｄｂｍ１及び野生型（６ＸＮ４４２）植物の結果と比較することにした。５１５Ｄｂｍ１及びＤＡＳｂｍ１植物が、これら２種のトウモロコシ系統のＣＡＤ２遺伝子における変異と、その結果としてのＣＡＤ２の未成熟終結により、有意に低下したＣＡＤ活性を有することが予想された。その上、５１５Ｄｂｍ１及びＤＡＳｂｍ１植物は、低下したＣＡＤ２転写産物存在量を有すると仮定された。
ＤＡＳｂｍ１、５１５Ｄｂｍ１及び６ＸＮ４４２植物を温室内で育成した。４週齢の植物から葉組織を収穫し、中肋組織を分離した。試料を液体窒素中で微粉末になるまで粉砕し、Ｑｉａｇｅｎ製ＲＮｅａｓｙ（商標）植物ミニキットを用いて抽出した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット及びＢｉｏＲａｄ製ｉＣｙｃｌｅｒ（商標）を定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いて、ＲＮＡ発現レベルを決定した。ＣＡＤ２の第四のエクソンに基づきＣＡＤ２特異的オリゴを設計し、Ｄｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ ＣＴ計算の対照としてトウモロコシインベルターゼを用いた。
ＣＡＤ２ ＲＮＡ発現レベルを比較するため、ＣＡＤ２の第四のエクソン及びトウモロコシインベルターゼに基づく次のプライマー／プローブを定量的ＲＴ−ＰＣＲ用に設計した。表６。
図６に示す通り、ｂｍ１植物は、根底にある変異に関係なく、残りの葉組織よりも非常に高レベルのＣＡＤ２発現を有する。その差は、６ＸＮ４４２、５１５Ｄｂｍ１及びＤＡＳｂｍ１に関しそれぞれ４．１、８．０及び３．４倍である。ＤＡＳｂｍ１の中肋における９１％及び葉における８９％；並びに５１５Ｄｂｍ１の中肋における８７％及び葉における９３％の平均低下のように、ＤＡＳｂｍ１及び５１５Ｄｂｍ１系統は両者共に有意に少ないＣＡＤ２発現を有する。しかし、２種のｂｍ１変異体間に有意差はない。図６。これらの結果は、トウモロコシｂｍ１（Halpin et al. (1998)、上記）及びソルガム変異体、ｂｍｒ６（Saballos et al. (2009)、上記）に関する文献における報告と一致する。ＲＮＡ発現の低下は、主として、５１５Ｄｂｍ１及びＤＡＳｂｍ１変異体における未成熟ＣＡＤ２タンパク質を生成するナンセンス変異によるＲＮＡ分解によるものである可能性が高く、これは、植物及び他の種において以前に観察された機序である。Conti and Izaurralde (2005) Curr Opin Cell Biol. 17:316-25。
変異体及び野生型植物の相対リグニン含量を比較するため、粉砕した葉及び節間部を、ＦＴＩＲ分光測定解析に付した。
ダイヤモンド結晶を備えるＡｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｔｏｔａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ（ＡＴＲ）Ｍｉｒａｃｌｅサンプリングアクセサリー（Ｐｉｋｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州マディソン）により、Ｂｒｕｋｅｒ Ｖｅｒｔｅｘ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ Ｉｎｃ、０１８２１マサチューセッツ州ビルリカ、マニングパーク、フォーチュンドライブ１９）を用いてフーリエ変換赤外測定を行った。分光計は、４ｃｍ−１分解能及び０．３２ｃｍ／ｓ反映速度（mirror velocity）で作動する重水素化硫酸トリグリシン（ＤＴＧＳ）検出器を備える。フーリエ変換前に２５６種のインターフェログラムが同時に加えられる（co-added）。大気中の二酸化炭素及び水蒸気によるスペクトル貢献を最小化させるため、スペクトルの取得前に機器を窒素ガス（グレード１）で５分間パージさせた。ＡＴＲ Ｍｉｒａｃｌｅ細胞サンプリングアクセサリーは、ＦＴＩＲ分光計における使用のために設計された単バウンドの（single-bounce）ダイヤモンドを有する。赤外線ビーム透過の深さは、１．４６ミクロンである。このアクセサリーの大きな利点は、複数バウンドの（multiple-bounce）ＨＡＴＲアクセサリーと比較してより少ない試料容量を必要とすることである。
シルキング（silking）直後の温室育成トウモロコシ植物から葉（第７及び第８、第９及び第１０）並びに節間部（第１及び第２、第７及び第８、第９及び第１０）を採取し、凍結乾燥し、微粉末になるよう粉砕した。データ取得のため、ＡＴＲのダイヤモンド結晶上にごく一部の試料を直接的に置いた。８００〜１８００ｃｍ−１のフィンガープリント領域におけるスペクトルを収集した。全試料の単一のビームスペクトルを得、スペクトルデータを、吸光度単位における空気のバックグラウンドスペクトルの比率として提示した。測定毎に、ＡＴＲ結晶を徹底的に洗浄して乾燥し、そのスペクトルを検査して、前の取得の試料残渣が結晶表面に残っていないことを確実にした。全スペクトルをベースライン補正し、範囲正規化して、いかなるスペクトルアーチファクトも排除した。
試料におけるリグニン含量は、ＦＴＩＲ相対吸光度に正比例する。予想した通り、両方の変異体におけるＣＡＤ２ ＲＮＡ発現の低下は、有意に低下したリグニン含量をもたらす。図７。平均して、野生型６ＸＮ４４２と比較すると、総リグニン含量低下は、ＤＡＳｂｍ１においてはおよそ２４％（Ｐ＝０．０３）であり、５１５Ｄｂｍ１においては３０％（Ｐ＝０．００６）であった。２種のｂｍ１変異体間に有意差はなかった（Ｐ＝０．４）。
トウモロコシにおけるｂｍ１変異は、リグニン含量の有意な低下及びリグニン組成の変化に伴い、葉中肋に赤褐色の色素沈着を呈す。この表現型は、Ｖ６からより後期段階の新たに発達した葉及び他の組織において目視できる。今回、本出願人らは、２種の独立的なｂｍ１変異体（ＤＡＳｂｍ１及び５１５Ｄｂｍ１）の分子基盤を同定した。特異的変異に基づき、本出願人らは、異なるアレルを検出するためのハイスループットＰＣＲアッセイも開発した。前述の結果は、ＺｍＣＡＤ２が、５１５Ｄｂｍ１及びＤＡＳｂｍ１におけるｂｍ１変異の根底にある遺伝子であることを立証し、観察された表現型の分子基盤を提供する。ｂｍｒ変異は、多くの単子葉植物種の間で共通するため、上述の変異及びマーカーは、他の作物；例えば、ソルガム、サトウキビ、キビ（millet）、イネ及びスイッチグラス等のバイオエネルギー用生物種において用いることもできる。
導入遺伝子の視覚的選択可能マーカーとしての褐色中肋１（ｂｍ１）
ＥＸＺＡＣＴ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙは、任意のＤＮＡ配列を正確に標的化し、遺伝子崩壊、編集又は遺伝子付加によりゲノムを的確に改変することが示された、ジンクフィンガー操作技術である。ＥＸＺＡＣＴ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ及び近年のｂｍ１発見に基づき、２通りの代替的アプローチを実行して、トランスジェニック植物をそのヌル型分離個体から区別するための視覚的選択可能マーカーを作製することができる。視覚的マーカーにより、この分野における育種家や科学者は、分離集団（例えばＴ１）におけるトランスジェニック個体を速やかに同定し、詳細な分子実験をすることなくこれらをヌル型と比較し、トランスジェニックパイプラインスクリーニングプロセスをスピードアップさせることができるであろう。ハイスループットアッセイを利用してもよく、必要であれば、これを用いて視覚的観察を確認することができる。
第一の代表的アプローチにおいて、変異体ｂｍ１トウモロコシ（ＤＡＳｂｍ１又は５１５Ｄｂｍ１）は、形質転換の標的生殖質として用いることができる。分子育種により、ＣＡＤ２に基づくマーカーを用いてｂｍ１変異を現在の形質転換生殖質（Ｂ１０４）に導入することができる。同一コンストラクトにおけるＷｔ ＣＡＤ２及び対象遺伝子（ＧＯＩ）は、ＥＸＺＡＣＴ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより内在性変異体ｃａｄ２遺伝子座を標的とする。ｂｍ１変異は劣性であるため、ＧＯＩ−ＷｔＣＡＤ２ホモ接合型又はヘテロ接合型の植物は、正常な色素沈着を呈し、一方、ヌル型分離個体は、褐色中肋表現型を有する。これは、ＥＸＺＡＣＴ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いなくても首尾よく行えるが、ゲノム内の導入遺伝子挿入部位はランダムとなる。代替的な実施形態は、内在性変異体ｃａｄ２遺伝子座においてＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入又は５１５Ｄｂｍ１におけるＡＣ挿入を欠失し、同時に近くの遺伝子座にＧＯＩを挿入する（ＧＯＩ及びｂｍ１マーカーの顕著な分離を防止するため）１又は複数のジンクフィンガータンパク質（複数可）の操作を包含する。この操作は、トランスジェニックコンストラクトにおけるＷｔ ＣＡＤ２の必要を排除する。
第二の代表的アプローチにおいて、Ｗｔ植物は、形質転換の標的生殖質として用いられる。ＧＯＩは、ＥＸＺＡＣＴ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いて内在性Ｗｔ ＣＡＤ２遺伝子座を標的とする。挿入部位は、ＤＡＳｂｍ１におけるトランスポゾン挿入、５１５Ｄｂｍ１におけるＡＣ挿入又はタンパク質非機能性を付与するＣＡＤ２遺伝子座内の任意の位置（ＣＡＤ２の周知の機能ドメイン）と同一でよい。この場合、導入遺伝子ホモ接合型の植物は、褐色中肋表現型を有するが、一方、ヘテロ接合型及びヌル型は、正常な色素沈着を呈する。褐色中肋及び関連する表現型は有益であり、ＥＸＺＡＣＴ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いて、ＢＭ１（ＣＡＤ２）及び／又はＢＭ３（コーヒー酸Ｏ−メチルトランスフェラーゼ）遺伝子座を標的化することができる。

Claims (77)

  1. 配列番号３と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
  2. 配列番号２５と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
  3. 配列番号１と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
  4. 配列番号２３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
  5. 配列番号２と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
  6. 配列番号２４と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
  7. 配列番号６２と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
  8. 配列番号６３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
  9. 配列番号６３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を更に含む、請求項７に記載の核酸分子。
  10. ＮＡＤＰＨ結合及びＣ末端触媒ドメインを欠く切断型ＣＡＤ２タンパク質をコードする、請求項７に記載の核酸分子。
  11. 配列番号１の変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＣＡＤ２）遺伝子からなる単離された核酸分子。
  12. 配列番号２３の変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＣＡＤ２）遺伝子からなる単離された核酸分子。
  13. 配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２タンパク質。
  14. 配列番号２５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２タンパク質。
  15. 配列番号３からなる変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２タンパク質。
  16. 配列番号２５からなる変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２タンパク質。
  17. トウモロコシ植物におけるＣＡＤ２遺伝子に未成熟終止コドンを導入するステップを含む、トランスジェニックトウモロコシ植物を作出するための方法。
  18. 未成熟終止コドンが、トウモロコシ植物におけるＣＡＤ２遺伝子のエクソン３にＡＣジヌクレオチド挿入を導入することにより導入される、請求項１６に記載の方法。
  19. 未成熟終止コドンが、トウモロコシ植物におけるＣＡＤ２遺伝子のイントロン１に挿入を導入することにより導入される、請求項１６に記載の方法。
  20. 請求項１に記載の核酸分子を含む植物。
  21. 請求項２に記載の核酸分子を含む植物。
  22. トウモロコシ（Zea mays）である、請求項２０に記載の植物。
  23. トウモロコシ（Zea mays）である、請求項２１に記載の植物。
  24. 変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＣＡＤ２）遺伝子を含む植物を同定するための方法であって、
    植物から核酸分子を単離するステップと、
    単離された核酸分子を、野生型ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド３９９４に対応する位置にＡＣジヌクレオチド挿入を含む核酸分子に関してスクリーニングするステップであって、野生型ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド３９９４に対応する位置におけるＡＣジヌクレオチド挿入の存在が、変異体ＣＡＤ２遺伝子を示すステップと
    を含む方法。
  25. 変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＣＡＤ２）遺伝子を含む植物を同定するための方法であって、
    植物から核酸分子を単離するステップと、
    単離された核酸分子を、野生型ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド２７８６に対応する位置にトランスポゾン挿入を含む核酸分子に関してスクリーニングするステップであって、野生型ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド２７８６に対応する位置におけるトランスポゾン挿入の存在が、変異体ＣＡＤ２遺伝子を示すステップと
    を含む方法。
  26. 単離された核酸分子をスクリーニングするステップが、ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項２４に記載の方法。
  27. 単離された核酸分子をスクリーニングするステップが、ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項２５に記載の方法。
  28. ポリメラーゼ連鎖反応が、配列番号１と特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも２種のプライマーを用いて行われる、請求項２６に記載の方法。
  29. プライマーが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号５２、配列番号５４及び配列番号５５からなる群から選択されるプライマーを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. ポリメラーゼ連鎖反応が、配列番号２３と特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも２種のプライマーを用いて行われる、請求項２７に記載の方法。
  31. プライマーが、配列番号４７、配列番号４９及び配列番号５０からなる群から選択されるプライマーを含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 請求項２４に記載の方法によって同定された植物。
  33. トウモロコシ（Zea mays）である、請求項３２に記載の植物。
  34. 請求項２５に記載の方法によって同定された植物。
  35. トウモロコシ（Zea mays）である、請求項３４に記載の植物。
  36. 褐色中肋表現型を有する、請求項３２に記載の植物。
  37. 褐色中肋表現型を有する、請求項３４に記載の植物。
  38. トウモロコシ（Zea mays）植物が、リグニンの低下、消化性の増加及びエタノール収量の増加からなる群から選択される少なくとも一つの形質を有する、請求項３６に記載の植物。
  39. トウモロコシ（Zea mays）植物が、リグニンの低下、消化性の増加及びエタノール収量の増加からなる群から選択される少なくとも一つの形質を有する、請求項３７に記載の植物。
  40. トウモロコシにおいて褐色中肋１（ｂｍ１）表現型を導入するための方法であって、
    ｂｍ１表現型を有するトウモロコシ植物を、ｂｍ１表現型を欠くトウモロコシ植物と交雑させて、Ｆ１トウモロコシ植物を作出するステップと、
    マーカー支援選択を用いて、野生型ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド３９９４に対応する位置にＡＣジヌクレオチド挿入を含むＦ１トウモロコシ植物を同定するステップと、
    同定されたＦ１トウモロコシ植物を繁殖させて、これによりトウモロコシにおいて褐色中肋１（ｂｍ１）表現型を導入するステップと
    を含む方法。
  41. トウモロコシにおいて褐色中肋１（ｂｍ１）表現型を導入するための方法であって、
    ｂｍ１表現型を有するトウモロコシ植物を、ｂｍ１表現型を欠くトウモロコシ植物と交雑させて、Ｆ１トウモロコシ植物を作出するステップと、
    マーカー支援選択を用いて、野生型ＣＡＤ２遺伝子のヌクレオチド２７８６に対応する位置にトランスポゾン挿入を含むＦ１トウモロコシ植物を同定するステップと、
    同定されたＦ１トウモロコシ植物を繁殖させて、これによりトウモロコシにおいて褐色中肋１（ｂｍ１）表現型を導入するステップと
    を含む方法。
  42. 請求項１に記載の核酸分子を生物に導入するステップを含む、遺伝子操作された生物を作製する方法。
  43. 生物が植物である、請求項４２に記載の方法。
  44. 植物がトウモロコシ（Zea mays）である、請求項４３に記載の方法。
  45. 請求項１に記載の核酸分子が、請求項１に記載の核酸分子を含むトウモロコシ（Zea mays）植物と交雑させることにより、トウモロコシ（Zea mays）植物に導入される、請求項４４に記載の方法。
  46. 請求項１に記載の核酸分子が、遺伝子形質転換により生物に導入される、請求項４２に記載の方法。
  47. 請求項１に記載の核酸が、生物のゲノム内に安定的に組み込まれる、請求項４６に記載の方法。
  48. 生物が植物である、請求項４６に記載の方法。
  49. 植物がトウモロコシ（Zea mays）である、請求項４８に記載の方法。
  50. 請求項２に記載の核酸分子を生物に導入するステップを含む、遺伝子操作された生物を作製する方法。
  51. 生物が植物である、請求項５０に記載の方法。
  52. 植物がトウモロコシ（Zea mays）である、請求項５１に記載の方法。
  53. 請求項２に記載の核酸分子が、請求項２に記載の核酸分子を含むトウモロコシ（Zea mays）植物と交雑させることにより、トウモロコシ（Zea mays）植物に導入される、請求項５２に記載の方法。
  54. 請求項２に記載の核酸分子が、遺伝子形質転換により生物に導入される、請求項５０に記載の方法。
  55. 請求項２に記載の核酸が、生物のゲノム内に安定的に組み込まれる、請求項５４に記載の方法。
  56. 生物が植物である、請求項５４に記載の方法。
  57. 植物がトウモロコシ（Zea mays）である、請求項５６に記載の方法。
  58. 変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＣＡＤ２）遺伝子を含む植物を同定するための方法であって、
    植物から核酸分子を単離するステップと、
    単離された核酸分子を、変異体ＣＡＤ２遺伝子を保有するトウモロコシ植物を同定するための手段と接触させて、植物における変異体ＣＡＤ２遺伝子の存在を示す検出可能なシグナルを生成するステップと
    を含む方法。
  59. トウモロコシ変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＣＡＤ２）遺伝子を移入するための方法であって、
    （ａ）ＣＡＤ２遺伝子に連鎖する少なくとも１種のマーカーと特異的にハイブリダイズ可能なプローブにより、第一の植物のゲノムＤＮＡ及び第二の植物のゲノムＤＮＡを解析するステップと、
    （ｂ）第一と第二の植物を有性交雑させて、後代集団を得るステップと、
    （ｃ）ＣＡＤ２遺伝子に連鎖する少なくとも１種のマーカーの存在に関して後代集団を解析するステップと、
    （ｄ）ＣＡＤ２遺伝子に連鎖する少なくとも１種のマーカーを含む後代集団由来の個体を、第一又は第二の植物と戻し交雑させて、次世代集団を作出するステップと、
    （ｅ）次世代集団のメンバーが、第一又は第二の植物由来の所望の形質及びＣＡＤ２遺伝子を含むか決定するステップと、
    （ｆ）次世代集団のメンバーが、第一又は第二の植物由来の所望の形質及びＣＡＤ２遺伝子を含まない場合、第一又は第二の植物由来の所望の形質及びＣＡＤ２遺伝子を含む個体が同定されるまでステップ（ｄ）及び（ｅ）を反復するステップと
    を含む方法。
  60. 各交雑及び戻し交雑ステップにおいて得られた個々の後代が、各世代においてＣＡＤ２マーカー解析により選択される、５９に記載の方法。
  61. トウモロコシ変異体シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＣＡＤ２）遺伝子を遺伝子形質転換により宿主生物に導入するための方法であって、
    変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカーと特異的にハイブリダイズ可能なプローブにより、トウモロコシ植物のゲノムＤＮＡを解析して、トウモロコシ植物における変異体ＣＡＤ２遺伝子を同定するステップと、
    変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカーと特異的にハイブリダイズ可能なプローブと特異的にハイブリダイズするトウモロコシ植物のゲノムＤＮＡのセグメントを単離するステップと、
    単離されたゲノムＤＮＡのセグメントを宿主生物に導入するステップと、
    変異体ＣＡＤ２遺伝子に連鎖するマーカーと特異的にハイブリダイズ可能なプローブにより宿主生物のＤＮＡを解析して、宿主生物における変異体ＣＡＤ２遺伝子を同定するステップと
    を含む方法。
  62. サイレージを与える動物に給餌する方法であって、
    請求項３３に記載のトウモロコシ植物から作製されたサイレージを用意するステップと、
    請求項３３に記載のトウモロコシ植物から作製されたサイレージを動物に給餌するステップと
    を含む方法。
  63. サイレージを与える動物に給餌する方法であって、
    請求項３５に記載のトウモロコシ植物から作製されたサイレージを用意するステップと、
    請求項３５に記載のトウモロコシ植物から作製されたサイレージを動物に給餌するステップと
    を含む方法。
  64. サイレージを与える動物が反芻動物である、請求項６２に記載の方法。
  65. サイレージを与える動物がウシである、請求項６４に記載の方法。
  66. サイレージを与える動物が反芻動物である、請求項６３に記載の方法。
  67. サイレージを与える動物がウシである、請求項６６に記載の方法。
  68. 請求項３３に記載のトウモロコシ植物から作製されたサイレージが、動物の食事における乾物の１５％を超える、請求項６２に記載の方法。
  69. 請求項３３に記載のトウモロコシ植物から作製されたサイレージが、動物の食事における乾物の少なくとも約２５％である、請求項６８に記載の方法。
  70. 請求項６２に記載の方法に従って給餌された動物から調製された肉製品。
  71. 請求項３３に記載のトウモロコシ植物から作製されたトウモロコシサイレージを含む肉牛肥育仕上げ用飼料。
  72. トウモロコシサイレージが、ｂｍ１トウモロコシサイレージである、請求項７１に記載の肉牛肥育仕上げ用飼料。
  73. 請求項３５に記載のトウモロコシ植物から作製されたサイレージが、動物の食事における乾物の１５％を超える、請求項６３に記載の方法。
  74. 請求項３５に記載のトウモロコシ植物から作製されたサイレージが、動物の食事における乾物の少なくとも約２５％である、請求項７３に記載の方法。
  75. 請求項６３に記載の方法に従って給餌された動物から調製された肉製品。
  76. 請求項３５に記載のトウモロコシ植物から作製されたトウモロコシサイレージを含む肉牛肥育仕上げ用飼料。
  77. トウモロコシサイレージが、ｂｍ１トウモロコシサイレージである、請求項７６に記載の肉牛肥育仕上げ用飼料。
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