BR102012000116B1 - métodos de fazer silagem de milho não transgênico e para identificar uma planta de milho não transgênica compreendendo um gene de álcool cinamílico desidrogenase 2 (cad2) mutante - Google Patents

métodos de fazer silagem de milho não transgênico e para identificar uma planta de milho não transgênica compreendendo um gene de álcool cinamílico desidrogenase 2 (cad2) mutante Download PDF

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Abstract

GENE E VARIAÇÕES ASSOCIADAS COM O FENÓTIPO BM1, MARCADORES MOLECULARES, E SEU USO. Esta invenção diz respeito a genes CAD2 de milho mutantes de ocorrência natural específicos, cujos genes alterados contribuem para o fenótipo de milho bm1 em linhagens particulares de milho. Em algumas modalidades, composições e métodos são fornecidos que utilizam uma molécula de ácido nucleico compreendendo um gene CAD2 mutante, e/ou marcadores ligados a um gene CAD2 mutante.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
[001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos Número de Série 61/429.390, depositado em 03 de janeiro de 2011, para "GENE E VARIAÇÕES ASSOCIADAS COM O FENÓTIPO BM1, MARCADORES MOLECULARES, E SEU USO".
CAMPO TÉCNICO
[002] A presente invenção refere-se a um fenótipo de midrib marrom de milho (bm). Em modalidades particulares, esta invenção diz respeito a genes CAD2 alterados particulares em milho, cujos genes alterados contribuem para o fenótipo bm1 em algumas variedades de milho, moléculas de ácido nucleico compreendendo um gene CAD2 alterado, e/ou produtos de proteína resultando da translação de tais moléculas de ácido nucleico.
ANTECEDENTES
[003] Ligninas são componentes universais em plantas que formam reticulações com carboidratos, tais como hemiceluloses na parede celular. Lignina e celulose são os dois componentes predominantes da parede de célula de planta. A parede de célula de planta fornece uma barreira natural contra o ambiente extracelular. Muitos estudos demonstraram que uma das respostas de plantas a estresses bióticos (por exemplo, infecção patogênica) ou estresses abióticos (por exemplo, estiagem, estresse mecânico, etc.) consiste em reforço da parede de célula de planta, em particular aumentando o teor de lignina na parede de célula de planta. Muitas aplicações agronômicas ou industriais dizem respeito a produtos de planta desejados (por exemplo, produtos usados em produção de papel, produção de ensilagem, e a produção de energia, por exemplo, na forma de biocombustíveis), as produções dos quais são diretamente ligados ao teor e/ou composição de lignina na parede de célula de planta.
[004] Polímeros de lignina limitam a digestibilidade da fibra na planta de milho. Polímeros de lignina reduzem a digestão de fibra em ruminates, e o grau de lignificações pode ser inversamente proporcional à digestibilidade da colheita de forragem. Cherney e outro, (1991) Adv. Agron. 46:157-98. Modulação do teor e composição de lignina pode ser desejável para aumentar a digestibilidade de forragem. A modulação do teor de lignina pode também ser desejável, por exemplo, para reforçar as paredes de planta, e desse modo melhorar a resistência a estresses; ou ao contrário para enfraquecer uma parede de planta a fim de facilitar a extração de celulose ou otros compostos químicos. Baucher e outro, (1998) Plant Mol. Biol. 39:437-47.
[005] É, entretanto, difícil saber quão modificar a trilha de biossíntese de lignina, e prever quais serão as conseqüências de modificações. Isto é pelo menos em parte, por que a trilha de biossíntese de lignina é uma trilha complexa envolvendo um grande número de reações enzimáticas. See, por exemplo, Dixon e outro, (2001) Phytochemistry 57(7):1069-84. Não são conhecidos possíveis mecanismos pelos quais a trilha pode ser alterada fisiologicamente, por exemplo, para compensar uma mudança introduzida por uma modificação na trilha.
[006] A lignina é um polímero insolúvel de 3 monômeros de alcoóis ou monolignóis: álcool p-cumarílico (subundiades H), álcool coniferílico (subunidades G), e álcool sinapílico (subundiades S), que são derivados da trilha de fenilpropanoide. Neish (1968) Constitution e Biosynthesis of Lignin, eds. Nova Iorque, Springer Verlag 1-43. Cada tipo de subunidade pode formar uma variedade de ligações com outros, e desse modo constituir a lignina. Outras ligações podem também ser estabelecidas com outros compostos parietais (por exemplo, polissacarídeos e proteínas) a fim de formar uma rede tridimensional complexa.
[007] As etapas na trilha de produção de lignina complexa incluem hidroxilação, O-metilação de anéis aromáticos, e a conversão de uma cadeia lateral de carboxila em uma função de álcool. A hipótese corrente para a trilha de biossíntese de monolignol inclui sucessivas reações de hidroxilação e O-metilação em vários níveis de oxidação das cadeias laterais em uma rede metabólica, desse modo resultando na formação de subunidades S e G. As enzimas da rede incluem 3-O-metiltransferase de ácido cafeico (COMT); hidroxixinamato coenzima A ligases (4CL); ferulato 5-hidrolases dependente de citocromo P450 (F5Hs); e diversas isoformas de cinamoil CoA redutase (CCR) e de álcool cinamílico desidrogenase (CAD).
[008] Durante diversos anos, tentativas foram feitas para modificar o teor e composição de lignina de plantas superexpressando ou subexpressando um ou mais genes da Trilha de biossíntese de lignina. Anterola e Lewis (2002) Phytochemistry 61:221-94. Embora várias estratégias tenham sido imaginadas, a superexpressão ou subexpressão de uma ou mais enzimas na trilha de biossíntese de lignina não fornece sempre resultados seguros e previsíveis.
[009] Outra estratégia consiste em uso, em seleção de esquemas, mutantes de um gene alvejado na trilha de biossíntese de lignina. Plantas contendo uma mutação de midrib marrom (bmr) exibem composição e digestibilidade de lignina alteradas. Em milho, pelo menos quatro mutações de midrib marrom independentes foram identificadas. Kuc e outro, (1968) Phytochemistry 7:1435-6. Estas mutações, denominadas "bm1, bm2, bm3, e bm4," todas exibem teor de lignina diminuído quando comparado ao milho de controle. Plantas de milho midrib marrom são caracterizadas por uma pigmentação marrom midrib de folha no estágio V4 a V6 e uma coloração marrom claro da medula da planta após o pendão. Uma mudação de bmr caracterizada é uma mutação de inserção na enzima COMT (bm3).
[0010] As plantas de milho bm1 maduras têm um teor de lignina que é reduzido em 10 a 20%, um ligeiro decréscimo em ésteres de ácido ferúlico, e um teor substancialmente reduzido (~ 40%) de ésteres p-cumáricos e éstseres de ácido ferúlico. Provan e outro, (1997) J. Agric. Food 73: 133-42; Barriére e outro, (2004) Comptes Rendus Biologie 327: 847-60. A frequência de p-hidroxifenila, guaiacila, e monômeros de tioacidólise de siringila é similar em bm1 e plantas do tipo selvagem, mostrando que a mutação de bm1 não afeta especificamente um único tipo de subunidade de lignina. Guillaumie e outro, (2007) Plant 226(1):235-50. As ligninas de plantas de bm1 parecem ser substancialmente enriquecidas em ligações de subunidade interna carbono-carbono (Halpin e outro, (1998) Plant J. 14(5):545-53; Barriére e outro, (2004), supra), e ligninas bm1 têm substancial incorporação de coniferaldeído e, em uma menor extensão, de sinapaldeído. Kim e outro, (2002) J. Biol. Chem. 277:47412-9.
[0011] Usos agricolamente importantes de milho (maize) incluem ensilagem. A ensilagem é forragem, com alto teor de umidade, fermentada, que pdoe ser alimentada a ruminantes. Ela é fermentada e armazenada em um processo chamado ensilagem ou silagem, e é usualmente feita de milho ou outras colheitas de grama, incluindo sorgo ou outros cereais, usando a planta verde inteira. A ensilagem de volume é comumente alimentada a gado leiteiro, enquando a ensilagem enfardada tende a ser usada para gado de engorda, ovelha e cavalos. Visto que a ensilagem passa por um processo de fermentação, a energia é usada por bactérias fermentativas para produzir ácidos graxos voláteis, tais como acetato, propionato, lactato, e butirato, que conservam a forragem. O resultado é que a ensilagem é menor em energia do que a forragem original, visto que a bacteria fermentativa usa alguns dos carboidratos para produzir os ácidos graxos voláteis. A ensilagem de milho é uma forragem popular para animais ruminantes por que ela é de alto teor de Energia e digestibilidade e é facilmente adaptada à mecanização da colheita de suporte até o momento da alimentação. A ensilagem de milho geralmente é de cor ligeiramente marrom a verde escuro, e tem um aroma agradável, leve.
[0012] A lignina reduzida milho midrib marrom (milho bm) resulta em ensilagem com fibra que é mais digerível do que o milho normal e exibe uma taxa melhorada de conversão de biocombustível. A alimentação de ensilagem de milho bmr à vacas leiteiras em lactação foi mostrada aumentar a ingestão de matéria seca e produção de leite. Grant e outro, (1995) J. Dairy Sci. 78:1970-80; Oba e Allen (2000) J. Dairy Sci. 83:1333-41; Oba e Allen (1999) J. Dairy Sci. 82:135-42. Entretanto, a ensilagem de milho bmr reduziu o ganho diário médio e eficiência de alimentação (G:F) em vacas de engorda, em comparação à ensilagem de milho de uma variedade de milho convencional. Tjardes e outro, (2000) J. Anim. Sci. 78:2957-65. As linhagens de milho híbrido midrib marrom são também frequentemente constatadas serem de baixa produção. O milho híbrido midrib marrom tem sito também tipicamente associado com alojamento de foragem e ausência de padronização.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0013] São descritas aqui moléculas de ácido nucleic compreendendo um gene CAD2 mutante que contribui para o fenótipo bm1 em milho (maize). São também descritos marcadores moleculares que são ligados a ou que residem dentro de um gene CAD2 de milho mutante. Surpreendentemente, a trilha complicada de biossíntese de lignina é aparentemente alterada na presença de um gene CAD2 mutante, tal que plantas contendo um gene CAD2 mutante tenham níveis de lignina que são menores do que aqueles encontrados em plantas do tipo selvagem. A caracterização de genes CAD2 mutantes e a identificação de marcadores ligados a genes CAD2 mutantes podem facilitar enormemente o desenvolvimento e disposição de fenótipos de lignina reduzidos em plant idioplasmas. Em algumas modalidades, marcadores que são ligados a ou que residem dentro de um gene CAD2 de milho mutante, ou uma própria sequência de CAD2 de gene de milho (maize) mutante, podem ser usados para introduzir um gene CAD2 de milho mutante em outros organismos, por exemplo, plantas, levedura, e procariotas.
[0014] Em modalidades particulares, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode compreender uma sequência de nucleotídeo codificando uma proteína CAD2 truncada. Por exemplo, um gene CAD2 mutante compreendendo uma mutação de inserção em um exon (por exemplo, exon 3) ou um íntron (por exemplo, íntron 1) do gene CAD2 pode introduzir um códon STOP prematuro que resulta em um produto de gene mais curto. Em algumas modalidades, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode compreender uma mutação de ocorrência natural em uma ou mais linhagens de milho. Em algumas modalidades, um gene CAD2 mutante é clonado de luma variedade de milho bmr conhecida; por exemplo, 515Dbm1. Em outras modalidades, um gene CAD2 mutante é clonado de uma variedade de milho bmr anteriormente desconhecida; por exemplo, DASbm1. Quando expresso em uma planta, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode resultar em um fenótipo na planta; por exemplo, níveis reduzidos de RNA de CAD2 em tecidos da planta, e/ou teor de lignina reduzido em tecidos da planta.
[0015] São também descritos aqui métodos de uso de marcadores moleculares de ácido nucleico que são ligados a ou que residem dentro de um CAD2 de gene de milho mutante de acordo com a invenção, por exemplo, e sem limitação: para identificar plantas plants tendo um fenótipo de lignina reduzida; para introduzir um gene CAD2 de milho mutante em novos genótipos de planta (por exemplo, por meio de reprodução assistida por marcador ou transformação genética); para diferenciar entre os genes CAD2 tipo selvagem e particulares genes CAD2 mutantes de acordo com a invenção; e para produzir plantas e sementes de planta de cruzamentos de uma primeira planta compreendendo marcadores moleculares de ácido nucleico que são ligados a ou que residem dentro de um gene CAD2 de milho mutante de acordo com a invenção e uma segunda planta opcionalmente transportando um gene CAD2 de milho mutante. Em algumas modalidades, a gene CAD2 de milho mutante é construído em espécies de planta exceto o milho.
[0016] São também descritos métodos para produzir uma planta geneticamente modificada (por exemplo, milho) compreendendo a gene CAD2 de milho mutante, e métodos para identificar plantas (por exemplo, milho) transportando um gene CAD2 de milho mutante. Um método para produzir uma planta geneticamente modificada compreendendo a gene CAD2 de milho mutante é um marcador que é ligado a ou que reside dentro de um gene CAD2 de milho mutante de acordo com a invenção. Um método para identificar plantas transportando um gene CAD2 de milho mutante é uma sonda que especificamente hibridiza para um marcador que é ligado a ou que reside dentro de um gene CAD2 de milho mutante de acordo com a invenção.
[0017] São descritos métodos para aumentar a quantidade de carne de um animal alimentado com ensilagem, por exemplo, aumentando a relação de ganho para alimentação (G:F) para ensilagem de milho. Em algumas modalidades, um método para aumentar a quantidade de carne de um animal alimentado com ensilagem pode compreender o fornecimento de material de planta obtido de milho compreendendo a gene CAD2 de milho mutante de acordo com a invenção, usando um material de planta para a produção de ensilagem de milho, e incorporação da ensilagem de milho em uma ração final para alimentação de um ruminante. Desse modo, carne e produtos de carne produzidos de um animal alimentado com uma ração final de acordo com a invenção ou de acordo com um metodo da invenção, são também fornecidos.
[0018] Os anteriores e outros aspectos tornar-se-ão mais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada de diversas modalidades, que prossegue com referência às figuras acompanhantes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0019] A figura 1 inclui um diagrama mostrando os comprimentos e posições relativos de sete fragmentos de PCR de CAD2 515Dbm1 de sobreposição. A figura 1 também inclui um diagrama mostrando os comprimentos e posições relativos of treze fragmentos de PCR de CAD2 DASbm1 de sobreposição.
[0020] A figura 2 inclui um diagrama mostrando a estrutura genômica da inserção em DASbm1 CAD2. Apenas os primeiros dois exons endógenos de CAD2 são mostrados.
[0021] A figura 3 inclui um alinhamento de sequências genômicas de ZmCAD2, usando uma sequência de B73 de acessão pública AC230031. 15 SNPs e 8 inserções/deleções são identificadas, bem como uma inserção de transposon em DASbm1. Uma inserção AC está presente apenas no mutante 515Dbm1 em exon 3. Exons são mostrados em fonte de caixa alta. Íntrons e uma região promotora são mostrados em fonte de caixa alta.
[0022] A figura 4 inclui um alinhamento de sequências de cDNA de ZmCAD2 preditas, incluindo sequências de cDNA amplificadas por par iniciador CVF/CVR de DASbm1, 515Dbm1, e 6XN442 tipo selvagem (sublinhadas). DASbm1 contém uma inserção de 409 bp.
[0023] A figura 5 inclui um alinhamento de sequências de protein ZmCAD2 preditas, ilustrando que CAD2 de 515Dbm1 tem apenas 147 aminoácidos devido a uma inserção de AC que cria uma modificação de estrutura e códon STOP prematuro. CAD2 de DASbm1 tem apenas 48 aminoácidos, comparado com 367 aminoácidos em CAD2 de 6XB442. Regiões de identidade são mostradas em fonte em negrito. A sequência de aminoácido CAD2 B73 é idêntica àquela de 6XN422 CAD2, e é, portanto, não mostrada.
[0024] A figura 6 inclui dados mostrando os níveis de expressão relativos de RNA de CAD2 em tipo selvagem, midribs e folhas de milho 515Dbm1, e DASbm1. Os dados são normalizados para o nível de RNA no midrib de milho 6XN442 do tipo selvagem. Os dados representam o valor médio de 3 plantas, e as barras de erro indicam o desvio padrão.
[0025] A figura 7 inclui dados mostrando as quantidades relativas de lignina total em milho 515Dbm1, e DASbm1, tipo selvagem. Os dados representam o Valor médio de 3 plantas, com cinco amostras por planta obtidas tanto de folhas quanto de internodos. As barras de erro indicam o desvio padrão, e os valores P foram gerados pelo teste T de Student.
[0026] A figura 8 inclui um diagrama de um sistema de ensaio KASPar com sequências iniciadoras e padrões. As sequências padrões para 515Dbm1 (SEQ ID NO:45) e 6XN442 (SEQ ID NO:46) são mostradas.
[0027] A figura 9 inclui dados mostrando a determinação de alelo bm1 de ensaio KASPar. Dados de intensidade de fluorescência bruta da leitora de placa foram analisados usando o KBioscience Laboratory Information Management System (KLIMS). Um gráfico mostrando o RFU de FAM plotado contra o RFU de VIC foi gerado, também usando KLIMS. A determinação do genótipo foi realizada com base nas separação de feixe como disposto na vista do feixe.
[0028] A figura 10 inclui dados mostrando a determinação de alelo de CAD2 TaqMan. A discriminação alélica foi calculada usando o software de sistema ótico iCycler com relative unidades de fluorescência (RFU) de VIC mostradas sobre o eixo-y e RFU de FAM mostradas sobre o eixo-x.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[0029] As sequências de ácido nucleico listadas na listagem de sequência de acompanhamento são mostradas usando abreviações de letra padrão para bases de nucleotídeo, como definido em 37 C.F.R. § 1.822. Apenas um filamento de cada sequência de ácido nucleico é mostrado, porém o filamento complementar é entendido ser incluído por qualquer referência ao filamento mostrado. Na listagem de sequência de acompanhamento:
[0030] SEQ ID NO:1 mostra uma sequência genômica de 5924 bp de 515Dbm1 CAD2.
[0031] SEQ ID NO:2 mostra uma uma sequência de cDNA predita de 1512 bp de 515Dbm1 CAD2.
[0032] SEQ ID NO:3 mostra uma sequência de proteína truncada predita de aminoácido 147 de 515Dbm1 CAD2.
[0033] SEQ ID NO:4 mostra uma sequência genômica de 5898 bp de 6XN442 CAD2.
[0034] SEQ ID NO:5 mostra uma sequência de cDNA predita de 1510 bp de 6XN442 CAD2.
[0035] SEQ ID NO:6 mostra uma sequência de proteína predita de aminoácido 367 de 6XN442 CAD2.
[0036] SEQ ID NO:7 mostra uma sequência genômica de 5916 bp de B73 CAD2.
[0037] SEQ ID NO:8 mostra uma sequência de cDNA predita de 1510 bp de B73 CAD2.
[0038] SEQ ID NOs:9-22 mostram iniciadores dianteiro e reverse usados para amplificar sete fragmentos de CAD2 em sobreposição de ambos os milhos 6XN442 do tipo selvagem e mutante de 515Dbm1.
[0039] SEQ ID NO:23 mostra uma sequência genômica de 9360 bp de DASbm1 CAD2.
[0040] SEQ ID NO:24 mostra uma sequência de cDNA parcial de CAD2 DASbm1 amplificada pelo par de iniciador CVF/CVR.
[0041] SEQ ID NO:25 mostra uma sequência de proteína truncada predita de aminoácido 48 de DASbm1 CAD2.
[0042] SEQ ID NOs:26-34 mostram iniciadores dianteiro e reverse usados para amplificar fragmentos de CAD2 parciais do mutante de DASbm1.
[0043] SEQ ID NOs:35 e 36 mostram um iniciador dianteiro e um reverso usados para amplificar um fragmento de cDNA de CAD2 parcial.
[0044] SEQ ID NOs:37-39 mostram iniciadores dianteiro e reverse usados para amplificar fragmentos de CAD2 parciais do mutante de DASbm1.
[0045] SEQ ID NO:40 mostra uma inserção de transposon de 3444 bp em DASbm1 CAD2.
[0046] SEQ ID NO:41 mostra uma uma sequência de 11 bp duplicada na inserção de transposon de DASbm1 do primeiro íntron de CAD2: TACTGATATCT.
[0047] SEQ ID NOs:42-44 mostram iniciadores usados em um ensaio KASPar™ para diferenciar o alelo 515Dbm1 de outros alelos de CAD2 de bm1 e do tipo selvagem.
[0048] SEQ ID NOs:45 e 46 mostram sequências padrões às quais os iniciadores anelam-se em um ensaio KASPar. SEQ ID NO: 45 é uma sequência genômica de 515Dbm1. SEQ ID NO: 46 é uma sequência genômica de 6XN442.
[0049] SEQ ID NO: 47 mostra uma sonda específica para DASbm1 mutante.
[0050] SEQ ID NO: 48 mostra uma sonda específica para o alelo CAD2 tipo selvagem.
[0051] SEQ ID NOs: 49-51 mostram iniciadores usados em um ensaio KASPar™ para diferenciar os alelos CAD2 tipo selvagem e DASbm1.
[0052] SEQ ID NO:52 mostra uma sonda específica para o  515Dbm1 mutante.
[0053] SEQ ID NO:53 mostra uma sonda específica para o alelo CAD2 tipo selvagem.
[0054] SEQ ID NOs: 54 e 55 mostram iniciadores usados em um ensaio KASPar™ para diferenciar os alelos CAD2 tipo selvagem e 515Dbm1.
[0055] SEQ ID NOs: 56-61 mostram iniciadores e sondas usados para qRT-PCR of CAD2 e controles.
[0056] SEQ ID NO: 62 mostra uma sequência de nucleotídeo do primeiro exon de CAD2.
[0057] SEQ ID NO: 63 mostra uma sequência de nucleotídeo do segundo exon de CAD2.
[0058] SEQ ID NO: 64 mostra uma sequência de nucleotídeo do terceiro exon de CAD2.
MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO I. Revisão de diversas modalidades
[0059] O mutante de bm1 envolve uma mutação anteriormente não descrita que co-localiza-se com o loco de CAD. Halpin e outro, (1998), supra; Guillaumie e outro, (2007), supra. É descrita aqui a identificação de mutações específicas dentro da sequência de codificação de CAD2 de Zea mays que contribuem para um fenótipo de bm1. Algumas modalidades incluem um gene CAD2 mutante clonado de uma cepa de milho pública bm1, 515Dbm1, que contém uma inserção de AC no terceiro exon, que resulta em uma proteína CAD2 truncada. Algumas modalidades incluem um gene CAD2 mutante clonado de uma cepa de milho bmr recentemente descoberta, DASbm1, que contém uma inserção de transposon, que resulta em uma proteína CAD2 truncada distinta. Plantas DASbm1 têm níveis de expressão de RNA de CAD2 significantemente menores do que as plantas do tipo selvagem, e também exibem teor de lignina reduzido. Desenvolvimento, validação, e aplicação de marcadores de alta produtividade ligados a cada mutação específica são também descritos.
[0060] A base molecular do fenótipo bm1 não é bem entendida como, por exemplo, bm3. Halpin e outro, (1998), supra, mostraram que as atividades de CAD, níveis de proteína, e abundância de transcrição, foram todos significantemente reduzidos em genótipos de bm1, e um gene CAD, posteriormente identificado ser CAD2, foi mapeado intimamente ligado ao loco de bm1. Por que alguma proteína de CAD e mRNA pode ser detectada em plantas mutantes, os autores propuseram que o bm1 não fosse uma mutação nula de CAD2, porém ao invés disso, realizassem sua expressão por meio de elementos regulatórios. Halpin e outro, (1998), supra. Subsequentes estudos de expressão de gene usando microdisposições mostraram que um grande número de genes além de meramente CAD2 foram sub-expresos em plantas de bm1. Guillaumie e outro, (2007), supra. Esta multidão de genes sub-expressos incluiu muitos genes de trilha biossintética de lignina e fatores de transcrição, levando a outra especulação de que talvez um dos fatores de transcrição fosse o gene subjacente para bm1.
[0061] Mais recentemente, mutações de não sentido no gene SbCAD2 de sorgo foram mostradas serem o mecanismo subjacente para o mutante bmr de sorgo, bmr6, em algumas variedades. Saballos e outro, (2009) Genetics 181:783-95; Sattler e outro, (2009) Plant Physiology 150:584-95. Uma mutação de não sentido contém uma substituição C a T, que cria um cóndon STOP prematuro e resulta em uma proteína SbCAD2 truncada que não possui a ligação de NADPH e domínios catalíticos de terminal C. Id.
[0062] Em vista dos anteriores, a teoria adotada de que o fenótipo bm1 é attribuível a uma mutação em um fator de transcrição ou elemento regulatório de gene foi desfiada, e uma investigação foi conduzida para determinar se uma mutação em CAD2 milho poderia produzir o fenótipo de bm1. Um exame íntimo do mapa genético/físico de milho na região dos locos de bm1 e CAD2 descreveu que o CAD2 de milho é localizado muito próximo ao centrômero sobre o cromossoma 5. Esta proximidade apresenta um desafio significante para mapeamento genético de alta resolução devido à supressão de recombinação conhecida que circunda as regiões de centrômero. Portanto, o sucesso dos métodos de mapeamento de gene tradicionais foi pelo menos não previsível, se não totalmente improvável, e um método de clonagem de gene candidato com base em foi designado para identificar quaisquer mutações específicas em ZmCAD2 que poderiam ser responsáveis pelo fenótipo bm1 em variedades de milho objeto.
[0063] Desse modo, em algumas modalidades, identificação de mutantes CAD2 específicos pode ser realizada usando um método de clonagem de gene com base em PCR. Em algumas modalidades, CAD2Zea mays pode ser clonado de ambos idioplasma de bm1 e tipo selvagem para identificar uma mutação específica em CAD2 de idioplasma de bm1. Em modalidades particulares, uma mutação de inserção de dinucleotídeo AC que leva a uma mudança de estrutura é identificada dentro do idioplasma de bm1. Em outras modalidades, uma inserção de transposon de 3444 pares de base no primeiro íntron de CAD2 é identificada dentro do idioplasma de bm1. Um gene CAD2 mutante particular que induz a um fenótipo de bm1 em milho descrito aqui compreende uma inserção de dinucleotídeo AC no terceiro exon de um gene CAD2 clonado da variedade bm1, 515Dbm1.
[0064] Outro gene mutante de CAD2 que induz a um fenótipo de bm1 em milho descrito aqui compreende uma inserção de transposon no gene de CAD2 de uma nova variedade de bm1, DASbm1. A inserção identificada é de 3444 pares de base de comprimento, e é unida em três exons (409 pares de base) que formam um mRNA quimérico com CAD2. O mRNA quimérico causa uma mudança de estrutura e um códon STOP prematuro na região de codificação que resulta em uma proteína CAD2 truncada de apenas 48 aminoácidos. Esta proteína truncada não possui nem a ligação de NADPH, nenm os domínios catalíticos de terminal C, e é, portanto, mais provavelmente não funcional, mesmo se ele for produzida na célula.
[0065] Plantas DASbm1, como 515Dbm1, têm níveis significantemente reduzidos de RNA de CAD2, e teor total de lignina reduzido. CAD2 foi determinado ser o gene subjacente para o fenótipo bm1 de milho nestes mutantes de ocorrência natural e fornece uma base molecular para o fenótipo de bmr observado. Com base na inserção de transposon em DASbm1 e a inserção de AC em 515Dbm1, ensaios de KASPar e TaqMan de alta produtividade para detecter estes alelos de CAD2 particulares e diferenciá-los de alelos do tipo selvagem foram determinados e avaliados. Os ensaios podem ser usados para identificação de idioplasma de bm1, para acelerar a introgressão da característica de bm1, e para facilitar a reprodução molecular de plantas tendo, por exemplo, digestibilidade de ensilagem melhorada e/ou produção de etanol para biocombustível. Sequências de gene de CAD2 mutadas podem ser usadas para introduzir um fenótipo de bm1 em novos genótipos de milho ou outras colheitas, por exemplo, sorgo e grama de manobra, usando métodos transgênicos. bm1 e outros fenótipos podem de bmr podem também ser usados como marcadores de seleção visíveis para transgenes quando combinados com DAS’ EXZACT Precision Technology.
[0066] Marcadores de PCR de alta produtividade que podem ser usados, entre outras coisas, para identificar em um organismo uma mutação de CAD2 que contribui para um fenótipo de bm1 em milho; para introduzir em um organismo (por exemplo, uma planta) uma mutação de CAD2 que contribui para um fenótipo de bm1 em milho; e para facilitar a reprodução assistida por marcador de milho de bm1. Desse modo, o desenvolvimento, validação e aplicação de marcadores de PCR de alta produtividade particulares com base em mutações específicas em CAD2 (por exemplo, uma mutação de mudança de estrutura, e uma inserção de transposon) são também descritas. II. Abreviações 4CL hidroxicinamato coenzima A ligases ABC-transporter AGO transportador de cassette de ligação de ATP ARGONAUTA APL DESENVOLVIMENTO DE FLOEMA ALTERADO bmr Midrib marrom bZIP região básica/motivo de fecho ecler de leucina CAD álcool cinamílico desidrogenase CAD1 álcool cinamílico desidrogenase 1 CAD2 álcool cinamílico desidrogenase 2 CCR cinamoil-CoA redutase COMT ácido cafeico 3-O-metiltransferase COV1 ANEL VASCULAR CONTÍNUO DFR diidro-flavonoide redutase EgCAD1-type ZmCAD1 álcool cinamílico de milho desidrogenase 1 do tipo EgCAD1 EST Rótulo de sequência expressa F5H citocromo ferulato 5-hidroxilases dependente de P450 de FAM 6-carboxifluoresceína de fluoroforo HCT hidroxicinamoil-CoA transferase 2 KLIMS System LIM KBioscience Laboratory Information Management homeodomínio de LIM MADS-box motivo de sequên Cia de MADS conservado  (MCM1, AGAMOUS, DEFICIENS, SRF) MP MONÓPTERO OMT O-metil transferase ORF estrutura de leitura aberta PAL ammonia de fenilalanina liase PCR reação de cadeia de polimerase RFU unidades de fluorescência relativa SAD álcool sinapílico desidrogenase SAMS3 S-adenosil-metionina sintase 3 VIC® VIC® fluorophore (Applied Biosystems)
III. Termos
[0067] Cruzamento reversível: Métodos de cruzamento reversível podem ser usados para introduzir uma sequência de ácido nucleico em plantas. A técnica de cruzamento reversível foi amplamente usada durante décadas para introduzir novas características em plantas. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. Em um protocolo de cruzamento reversível típico, a variedade original de interesse (origem recorrente) é cruzada com uma segunda variedade (origem não recorrente) que transporta um gene de interesse a ser transferido. A descendência resultante desta cruzamento é então cruzada novamente com a origem recorrente, e o processo é repetido até uma planta ser obtida na qual essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas da planta recorrente são recuperadas na planta convertida, em adição ao gene transferido da origem não recorrente.
[0068] Planta de milho: Como aqui usado, o termo "planta de milho"refere-se a uma planta da espécie, Zea mays (milho).
[0069] Milho BM: Como aqui usado, o termo "milho BM" (ou "milho BMR") refere-se a variedades de milho que contêm uma mutação de midrib marrom. Variedades de milho BM tipicamente exibem uma pigmentação marrom avermelhado do midrib de folha. O milho BM é também tipicamente caracterizado por menor teor de lignina, maior digestibilidade de fibra, e maior ingestão de matéria seca. Exemplos não limitantes de variedades de milho BM incluem variedades de milho de bm1; por exemplo, 515Dbm1.
[0070] Fenótipo de bm1: Como aqui usado, o termo "fenótipo de bm1" pode referir-se a um perfil de teor e/ou composição de lignina alterado que foi observado em milho de bm1. Por exemplo, e sem limitação, um fenótipo de bm1 pode ser caracterizado por uma ou mais das seguintes características: teor de lignina que é reduzido em 10 a 20%, quando comparado ao teor de lignina de uma planta do tipo selvagem da mesma espécie (Guillaumie e outro, (2007), supra); um decréscimo em ésteres de ácido ferúlico (Id.); teor reduzido de ésteres de ácido ferúlico (Id.); teor reduzido de ésteres p-cumáricos (Marita e outro, (2003) J. Agric. Food Chem. 51:1313-21); níveis aumentados de aldeído (Id.); enriquecimento de ligninas em ligações de subunidade de inter unidade de carbono-carbono (Halpin e outro, (1998), supra; Barriére e outro, (2004), supra); e substantial incorporação de coniferaldeído e/ou sinapaldeído em ligninas (Kim e outro, (2002), supra; e Barriére e outro, (2004), supra).
[0071] Matéria seca: Como aqui usado, o termo "matéria seca" refere-se a qualquer gênero alimentício, incluindo forragem.
[0072] KBiosciences Competitive Allele-Specific PCR SNP genotyping system (KASPar™): KASPar™ é um sistema fluorescente homegêneo comercialmente disponível para determinar genótipos de SNP (KBiosciences Ltd., Hoddesdon, UK). Um ensaio KASPar™ compreende uma "mistura de ensaio" específica de SNP, que contém três iniciadores não rotulados, e uma "mistura reacional," que contém todos os outros componentes requeridos; por exemplo, um sistema reporter fluorescente universal. Além dessas misturas, o usuário fornece, entre outras coisas, uma leitora de placa capaz de FRET, placa(s) de microtítulo, e amostras de DNA que contêm cerca de 5 ng/L DNA.
[0073] Um ensaio KASPar™ típico compreende as etapas de:planejamento de iniciador específico de alelo (por exemplo, usando PrimerPicker™, que é um serviço livre disponível pela internet na KBiosciences website); preparação de mistura reacional incluindo os iniciadores específicos de alelo; misturar a mistura reacional com as amostras de DNA em uma placa de microtítulo; termociclização; ler a placa em uma leitora de placa fluorescente; e plotar e classificar os dados fluorescentes. Os dados de cada amostra são plotados juntos em um gráfico 2-D, onde os eixos x e y correspondem aos valores de fluorescência FAM e VIC. Amostras tendo o mesmo feixe de genótipo de SNP juntos no plote (isto é, A/A; A/a; e a/a). Mais informação técnica sobre o sistema KASPar, incluindo um guia de soluções para problemas comuns, são obtidas de KBiosciences Ltd. (por exemplo, o KASPar SNP Genotyping System Reagent Manual).
[0074] Ligado, firmemente ligado, e extremamente firmemente ligado: Como aqui usado, a ligação entre genes ou marcadores pode referir-se ao fenômeno no qual os genes ou marcadores sobre um cromossoma mostram uma probabilidade mensurável de serem passados juntos para indivíduos na geração seguinte. Os dois genes ou marcdores mais próximos são mutuamente, o mais próximo para (1) esta probabilidade ocorrer. Desse modo, o termo "ligado" pode referir- se a um ou mais genes ou marcadores que são passasdos juntamente com um gene com uma probabilidade maior do que 0,5 (que é suposta de classificação independente onde marcadores/genes são localizados sobre diferentes cromossomas). Quando a presença de um gene contribui para um fenótipo em um indivíduo, marcadores que são ligados ao gene podem ser ditos serem ligados ao fenótipo. Desse modo, o termo "ligado" pode referir-se a uma ligação entre um marcador e um gene, ou entre um marcador e um fenótipo.
[0075] Por que a proximidade de dois genes ou marcadores sobre um cromossoma está diretamente relacionada com a probabilidade dos genes ou marcadores serem passados juntos para indivíduos na geração seguinte, o termo "ligado" pode também referir-se aqui a um ou mais genes ou marcadores que são localizados dentro de cerca de 2,0 Mb de um outro no mesmo cromossoma de milho. Desse modo, dois genes ou marcadores "ligados" podem ser separados por cerca de 2,1 Mb; 2,00 Mb; cerca de 1,95 Mb; cerca de 1,90 Mb; cerca de 1,85 Mb; cerca de 1,80 Mb; cerca de 1,75 Mb; cerca de 1,70 Mb; cerca de 1,65 Mb; cerca de 1,60 Mb; cerca de 1,55 Mb; cerca de 1,50 Mb; cerca de 1,45 Mb; cerca de 1,40 Mb; cerca de 1,35 Mb; cerca de 1,30 Mb; cerca de 1,25 Mb; cerca de 1,20 Mb; cerca de 1,15 Mb; cerca de 1,10 Mb; cerca de 1,05 Mb; cerca de 1,00 Mb; cerca de 0,95 Mb; cerca de 0,90 Mb; cerca de 0,85 Mb; cerca de 0,80 Mb; cerca de 0,75 Mb; cerca de 0,70 Mb; cerca de 0,65 Mb; cerca de 0,60 Mb; cerca de 0,55 Mb; cerca de 0,50 Mb; cerca de 0,45 Mb; cerca de 0,40 Mb; cerca de 0,35 Mb; cerca de 0,30 Mb; cerca de 0,25 Mb; cerca de 0,20 Mb; cerca de 0,15 Mb; cerca de 0,10 Mb; cerca de 0,05 Mb; cerca de 0,025 Mb; e cerca de 0,01 Mb. Exemplos particulares de marcadores que podem ser "ligados" a um fenótipo de bm1 em milho incluem sequências de nucleotídeo em cromossoma 5L do genoma de milho.
[0076] Como aqui usado, o termo "firmemente ligado" pode referir-se a um ou mais genes ou marcadores que são localizados dentro de cerca de 0,5 Mb de um outro no mesmo cromossoma de milho. Desse modo, dois genes ou marcadores "firmemente ligados" podem ser separados por cerca de 0,6 Mb; cerca de 0,55 Mb; 0,5 Mb; cerca de 0,45 Mb; cerca de 0,4 Mb; cerca de 0,35 Mb; cerca de 0,3 Mb; cerca de 0,25 Mb; cerca de 0,2 Mb; cerca de 0,15 Mb; cerca de 0,1 Mb; e cerca de 0,05 Mb. Exemplos particular de marcadores que podem ser "firmemente ligados" a um fenótipo de bm1 em milho incluem sequências de nucleotídeo próximas ou dentro do loco de CAD2 do genoma de milho.
[0077] Como aqui usado, o termo "extremamente firmemente ligado" pode referir-se a um ou mais genes ou marcadores que são localizados dentro de cerca de 100 kb de um outro no mesmo cromossoma de milho. Desse modo, dois genes ou marcadores "extremamente firmemente ligados" pode ser separado por cerca de 125 kb; cerca de 120 kb; cerca de 115 kb; cerca de 110 kb; cerca de 105 kb; 100 kb; cerca de 95 kb; cerca de 90 kb; cerca de 85 kb; cerca de 80 kb; cerca de 75 kb; cerca de 70 kb; cerca de 65 kb; cerca de 60 kb; cerca de 55 kb; cerca de 50 kb; cerca de 45 kb; cerca de 40 kb; cerca de 35 kb; cerca de 30 kb; cerca de 25 kb; cerca de 20 kb; cerca de 15 kb; cerca de 10 kb; cerca de 5 kb; e cerca de 1 kb. Exemplos particulares de marcadores que são "extremamente firmemente ligados" a um fenótipo de bm1 em milho incluem sequências de nucleotídeo dentro de íntrons e exons do gene CAD2.
[0078] Em vista dos anteriores, será apreciado que marcadores ligados a um gene ou fenótipo particular incluem aqueles marcadores que são firmemente ligados, e aqueles marcadores que são extremamente firmemente ligados, ao gene ou fenótipo. Marcadores genéticos ligados, firmemente ligados, e extramente firmemente ligados de um fenótipo de bm1 podem ser úteis em programas de reprodução assistida por marcador para identificar variedades de milho tendo um teor de lignina reduzido e digestibilidade melhorada, e para reproduzir estas características em outras variedades de milho.
[0079] Loco: Como aqui usado, o termo "loco" refere-se a uma posição no genoma que corresponde a uma característica mensurável (por exemplo, uma característica). Um loco de SNP é definido por uma sonda que hibridiza para o DNA contido no loco.
[0080] Marcador: Como aqui usado, um marcador refere-se a um gene ou sequência de nucleotídeo que pode ser usada para identificar plantas tendo um alelo particular. Um marcador pode ser descrito como uma variação em um determinado loco genômico. Um marcador genético pode ser uma sequência de DNA curta, tal como uma sequência circundando um único par de base muda (polimorfismo de nucleotídeo simples, ou "SNP"), ou alonga um, por exemplo, um minissatélite / repetição de sequência simples ("SSR"). Um "alelo marcador" refere-se à versão do marcador que está presente em um indivíduo particular.
[0081] O termo marcador como aqui usado pode referir-se a um segmento clonado de DNA cromossômico de milho (por exemplo, sequências de nucleotídeo próximas ou dentro do loco de CAD2 do genoma de milho), e pode também ou alternativamente referir-se a uma molécula de DNA que é complementar a um segmento clonado de DNA cromossômico de milho (por exemplo, DNA complementar a uma sequência de nucleotídeo próxima ou dentro do loco de CAD2 do genoma de milho). Exemplos particulares de marcadores de bm1 em milho incluem sem limitação sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 66 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 284 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 415 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 443 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 735 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 760 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 1345 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 1408 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 1585 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo quaisquer dos nucleotídeos 1627-1640 e/ou 1642-1648 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 2252 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 2269 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 2786 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 2966 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 3205 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 3719 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 3783 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 3798 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 3800 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 3994 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 4141 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 4338 do gene CAD2; sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 4583 do gene CAD2; e sequências de ácido nucleico incluindo nucleotídeo 5403 do gene CAD2. Os marcadores anteriores são identificadas por posição de nucleotídeo em variedade de milho do tipo selvagem, B73.
[0082] Em algumas modalidades, a presença de um marcador em uma planta pode ser detectada através do uso de uma sonda de ácido nucleico. Uma sonda pode ser uma molécula de DNA, ou uma molécula de RNA. As sondas de RNA podem ser sintetizadas por meios conhecidos na técnica, por exemplo, utilizando um modelo de molécula de DNA. Uma sonda pode conter toda ou uma parte da sequência de nucleotídeo do marcador e adicional, sequência de nucleotídeo contígua de um genoma de planta. Isto é referido aqui como uma "sonda contígua". A sequência de nucleotídeo contígua, adicional é referida como "a montante" ou "a jusante" do marcador original, dependendo se a sequência de nucleotídeo contígua de um cromossoma de planta está no lado 5’ ou 3’ do marcador original, como convencionalmente entendido. Como é reconhecido por aqueles versados na técnica, o processo de obter sequência de nucleotídeo contígua, adicional para inclusão em um marcador pode ser repetido quase indefinidamente (limitado apenas pelo comprimento do cromossoma), desse modo identificando marcadores adicionais ao longo do cromossoma. Todos os marcadores descritos acima podem ser utilizados em algumas modalidades da presente invenção.
[0083] Uma sonda de oligonucleotídeo de sequência pode ser preparada sinteticamente ou por clonagem. Os vetores de clonagem adequados são bem conhecidos por aqueles de experiência na técnica. Uma sonda de oligonucleotídeo pode ser rotulada ou não rotulada. Existe uma ampla variedade de técnicas para rotular moléculas de ácido nucleico, incluindo, por exemplo, e sem limitação: radiorrotulação por translação por entalhe; imprimação aleatória; caudamento com deoxitransferase terminal; ou similar, onde os nucleotídeos empregados são rotulados, por exemplo, com 32P radioativo. Outros rótulos que podem ser utilizados incluem, por exemplo, e sem limitação: fluoroforos (por exemplo, FAM e VIC); enzimas; substratos de enzima; cofatores de enzima; inibidores de enzima; e similares. Alternativamente, o uso de um rótulo que fornece um sinal detectável, sozinho ou em conjunto com outros agentes reativos, pode ser substituído por ligantes aos quais os receptores se ligam, onde os receptores são rotulados (por exemplo, pelos rótulos indicados acima) para fornecer sinais detectáveis, ou sozinhos, ou em conjunto com outros reagentes. Vide, por exemplo, Leary e outros, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4045-9.
[0084] Uma sonda pode conter uma sequência de nucleotídeo que não é contígua àquela do marcador original; esta sonda é referida aqui como uma "sonda não contígua". A sequência da sonda não contígua está localizada suficientemente próxima da sequência do marcador original no genoma de modo que a sonda não contígua seja geneticamente ligada ao mesmo gene ou traço (por exemplo, bm1/teor de lignina reduzido). Por exemplo, em algumas modalidades, uma sonda não contígua está localizada e 500 kb; 450 kb; 400 kb; 350 kb; 300 kb; 250 kb; 200 kb; 150 kb; 125 kb; 100 kb; 0,9 kb; 0,8 kb; 0,7 kb; 0,6 kb; 0,5 kb; 0,4 kb; 0,3 kb; 0,2 kb; ou 0,1 kb do marcador original no genoma de milho.
[0085] Uma sonda pode ser uma cópia exata de um marcador a ser detectado. Uma sonda pode também ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo, ou consistindo em, uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente idêntica a um segmento clonado do DNA cromossômico do organismo do indivíduo (por exemplo, milho). Como aqui usado, o termo "substancialmente idêntico" pode se referir às sequências de nucleotídeo que são mais do que 85% idênticas. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo substancialmente idêntica pode ser 85,5%; 86%; 87%; 88%; 89%; 90%; 91%; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% ou 99,5% idêntica à sequência dereferência.
[0086] Uma sonda pode também ser uma molécula de ácido nucleic que é "especificamente hibridizável" ou "especificamente complementar" a uma cópia exata do marcador a ser detectado ("DNA alvo"). "Especificamente hibridizável" e "especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementariedade tal que a ligação estável e específica ocorra entre uma molécula de ácido nucleico e o alvo de DNA. Uma molécula de ácido nucleico não necessita ser 100% complementar a sua sequência alvo a ser especificamente hibridizável. Uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando há um grau suficiente de complementariedade para evitar a ligação não específica do ácido nucleico às sequências não alvo sob condições onde a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições de hibridização rigorosa.
[0087] As condições de hibridização resultando em graus particulares de rigorosidade variarão dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e comprimento das sequências de ácido nucleico de hibridização. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridização determinarão a rigorosidade da hibridização, embora os tempos de lavagem também influenciem a rigorosidade. Os cálculos com respeito às condições de hibridização necessários para alcançar os graus particulares de rigorosidade são conhecidos por aqueles versados na técnica, e são descritos, por exemplo, em Sambrook e outro, (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11; e Hames e Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridisation, IRL Press, Oxford, 1985. Orientação e instrução mais detalhada com respeito à hibridização de ácidos nucléicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, "Overview of principles of hibridização and the strategy of nucleic acid probe assays," em Laboratory Techniques in Biochemistry e Molecular Biology- Hibridização with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel e outros, Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.
[0088] Como aqui usado, "condições rigorosas" abrange condições sob as quais a hibridização somente ocorrerá se houver menos do que 50% de desequilíbrio entre a molécula de hibridização e o alvo de DNA. As "Condições rigorosas" incluem níveis mais particulares de rigorosidade. Desse modo, como aqui usado, condições de "rigorosidade moderada" são aquelas sob as quais as moléculas com mais do que 50% de desequilíbrio de sequência mão hibridizarão; condições de "alta rigorosidade" são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 20% de desequilíbrio não hibridizarão; e condições de "rigorosidade muito elevada" são aquelas sob as quais as sequências com more do que 10% de desequilíbrio não hibridizarão.
[0089] Em modalidades particulares, condições rigorosas podem incluir hibridização a 60°C em mistura mestre de genotipagem TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA, Catálogo No. 4371355), diluída de acordo com as instruções do fabricante.
[0090] Os seguintes são condições de hibridização representativas, não limitantes.
[0091] Rigorosidade Muito Elevada (detecta as sequências que compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência): Hibridização em 5x de tampão SSC a 65°C durante 16 horas; lavado duas vezes em 2x de tampão SSC em temperatura ambiente durante 15 minutos cada; e lavado duas vezes em 0,5x de tampão SSC a 65°C durante 20 minutos cada.
[0092] Alta Rigorosidade (detecta sequências que compartilham pelo menos 80% de identidade de sequência): Hibridização em 5x-6x de tampão SSC a 65-70°C durante 16-20 horas; lavado duas vezes em 2x de tampão SSC em temperatura ambiente durante 5-20 minutos cada; e lavado duas vezes em 1x tampão SSC a 55-70°C durante 30 minutos cada.
[0093] Rigorosidade Moderada (detecta as sequências que compartilham pelo menos 50% de identidade de sequência): Hibridização em 6x de tampão SSC em temperatura ambiente a 55°C durante 16-20 horas; lavado pelo menos duas vezes em 2x-3x de tampão SSC em temperatura ambiente a 55°C durante 20-30 minutos cada.
[0094] Com respeito a todas as sondas descritas, supra, a sonda pode compreender sequências de ácido nucleico adicionais, por exemplo, promotores; sinais de transcrição; e/ou sequências de vetor. Quaisquer das sondas descritas, supra, podem ser utilizadas para definir adicionalmente marcadores que são firmemente ligados a um gene envolvido em um fenótipo bm (por exemplo, bm1), e marcadores identificados podem ser equivalentes aos marcadores exemplares nomeados na presente descrição, e desse modo estão no escopo da invenção.
[0095] Reprodução Assistida por Marcadores: Como aqui usado, o termo "reprodução assistida por marcadores" pode se referir a uma metodologia de reproduzir diretamente para um ou mais traços complexos (por exemplo, bm1/teor de lignina reduzido). Na prática corrente, os reprodutores de planta tentam identificar facilmente traços detectáveis, tais como cor da flor, aparência da casca da semente, ou variantes de isozima que são ligados a um traço agronomicamente desejado. Os reprodutores de planta então seguem o traço agronômico na segregação, reproduzindo populações seguindo-se a segregação do traço facilmente detectável. Entretanto, existem muito poucas dessas relações de ligação disponível para uso em reprodução de planta.
[0096] A reprodução assistida por marcadores fornece um processo rápido e econômico para melhoria de variedades de planta. Vários exemplos da aplicação de reprodução assistida por marcador envolve o uso de marcadores de isozima. Vide, por exemplo, Tanksley e Orton, eds. (1983) Isozymes in Plant Breeding e Genetics, Amsterdam: Elsevier. Um exemplo é um marcador de isozima associado com um gene para resistência a uma peste de nematódeo em tomate. A resistência, controlada por um gene designado Mi, está localizada no cromossoma 6 do tomate e é muito firmemente ligada a Aps1, um ácido fosfatase isozima. O uso do marcador de isozima Aps1 para indiretamente selecionar para o gene Mi forneceu as vantagens que a segregação em uma população pode ser determinada inequivocamente com técnicas eletroforéticas padrões; o marcador de isozima pode ser marcado no tecido da muda, tornando óbvia a necessidade de manter as plantas para maturidade; e codominância dos alelos de marcador de isozima permite a discriminação entre homozigotos e heterozigotos. Vide Rick (1983) em Tanksley e Orton, supra.
[0097] Carne: Como aqui usado, o termo "carne" se refere ao tecido animal usado, por exemplo, como comida. O termo "carne" tipicamente se refere au músculo esqueletal e gordura associada, porém pode também se referir aos órgãos de não músculo, incluindo pulmões, fígados, pele, cérebros, medula óssea, rins, testículos, intestinos, etc.
[0098] Fibra Detergente Neutra: como aqui usado o termo "fibra detergente neutra" (NDF) se refere a uma medição do material lentamente digerido através de uma ampla faixa de alimentos. Os níveis de NDF em forragem aumentam quando uma planta amadurece. Os níveis médios de NDF em ensilagem de grama podem ser aproximadamente 55 por cento de DM (550 g/kg de DM). O teor de NDF em uma relação total pode ser entre 35-50% de DM. As dietas com menos do que 32 por cento de NDF podem causar problemas com acidose. As dietas que contêm mais do que 50 por cento de NDF podem ser restritas em seu potencial de consumo.
[0099] Molécula de ácido nucleico: Como aqui usado, o termo "molécula de ácido nucleico" pode se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos, que podem incluir ambas as cepas de sentido e antissentido de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros misturados dos acima. Um nucleotídeo pode se referir a um ribonucleotídeo, deoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico" como aqui usado é sinônimo com "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". Uma molécula de ácido nucleico é geralmente pelo menos 10 bases em comprimento, a menos que de outro modo especificado. O termo inclui formas de cepa única e dupla de DNA. Uma molécula de ácido nucleico pode incluir qualquer um ou ambos os nucleotídeos de ocorrência natural e ligados modificados juntos por ligações de nucleotídeo de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural.
[00100] Moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente, ou podem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivadas, como será facilmente apreciado por aqueles de experiência na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, rótulos, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações de internucleotídeo (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; frações pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; queladores; alciladores; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de filamento único, filamento duplo, parcialmente em duplex, triplex, em forma de grampo de cabelo, circular, e em forma de cadeado.
[00101] Identidade de sequência: O termo "identidade de sequência" ou "identidade", como aqui usado no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo, pode se referir aos resíduos nas duas sequências que são as mesmas quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.
[00102] Como aqui usado, o termo "porcentagem de identidade de sequência" pode se referir ao valor determinado comparando-se duas sequências idealmente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico, e sequências de aminoácido) em uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, espaços vazios) quando comparada com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais os nucleotídeos idênticos ou resíduos de aminoácido ocorrem em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência.
[00103] Os métodos para alinhar sequências para comparações são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em, por exemplo: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet e outro, (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang e outro, (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson e outro, (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana e outro, (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia pode ser encontrada em, por exemplo, Altschul e outro, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.
[00104] O National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul e outro, (1990)) está disponível de várias fontes, incluindo o Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conjunto com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência utilizando este programa está disponível na internet na seção "ajuda" para BLAST™. Para comparações de sequências de ácido nucleico, a função das "sequências Blast 2" do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada utilizando a matriz de BLOSUM62 básico fixado para parâmetros básicos. As sequências de ácido nucleico com similaridade ainda maior com as sequências de referência mostrarão o aumento da porcentagem de identidade quando avaliado por este método.
[00105] Polimorfismo de nucleotídeo único: Como aqui usado, o termo "polimorfismo de nucleotídeo único" (SNP) pode se referir a uma variação da sequência de DNA ocorrendo quando um único nucleotídeo no genoma (ou outra sequência compartilhada) difere entre os membros de uma espécie ou cromossomas pareados em um indivíduo. Em uma população, SNPs podem ser atribuídos a uma menor frequência de alelo que é a frequência de alelo menor em um loco que é observado em uma população particular. Esta é simplesmente a menor das frequências de alelo para polimorfismos de nucleotídeo único. Populações diferentes são esperadas exibirem frequências de alelo pelo menos ligeiramente diferentes. As populações particulares podem exibir frequências de alelo significantemente diferentes. Em alguns exemplos, os marcadores ligados a um fenótipo bm1 são marcadores SNP.
[00106] SNPs podem se incluir nas sequências de codificação de genes, regiões de não codificação de genes, ou nas regiões intergênicas entre os genes. Os SNPs em uma sequência de codificação podem, porém não necessariamente, alteram a sequência de aminoácido da proteína que é produzida, devido a degeneração do código genético. Um SNP no qual ambas as formas levam a mesma sequência de polipeptídeo é chamado "sinônimo" (algumas vezes chamado uma mutação silenciosa). Se uma sequência de polipeptídeo diferente é produzida, elas são chamadas "não sinônimas". Uma alteração não sinônima pode ser de sentido incorreto ou não sentido, onde um sentido incorreto muda os resultados em um aminoácido diferente, e um não sentido muda os resultados em um códon de terminação prematuro. SNPs que não estão nas regiões de codificação de proteína podem ainda ter consequências para a divisão de gene, ligação do fator de transcrição de gene, ou a sequência de RNA de não codificação. Os SNPs são geralmente bialélicos e desse modo facilmente ensaiados em plantas e animais. Sachidanandam (2001) Nature 409:928-33.
[00107] Ensilagem: Como aqui usado, o termo "ensilagem" se refere a um certo tipo de forragem de armazenamento. Geralmente, ensilagem é feito de plantas (por exemplo, plantas de milho) em um processo chamado ensilagem. Durante este processo, as plantas ou partes da planta passam por fermentação anaeróbica causada por microorganismos nativos (por exemplo, uma ou mais cepas de bactérias de ácido láctico, por exemplo, Lactobacillus spec.) convertendo açúcares em ácidos e exaurindo qualquer oxigênio presente no material de colheita, cuja depleção de oxigênio preserva a forragem em conjunto com ácidos graxos voláteis gerados por bactérias, tais como acetato, propionato, lactato, e butirato. A ensilagem é amplamente utilizada para alimentar animais produtores de leite e carne, tais como gado leiteiro e gado de corte.
[00108] O termo "produção de ensilagem" descreve o processo de como se obter ensilagem adequada para alimentar a um animal de produção de carne. Geralmente, a ensilagem é produzida de plantas, por exemplo, plantas de milho, cortando-se a biomassa da planta colhida com uma colhedora de forragem.
[00109] Fonte de fibra: Como aqui usado, o termo "fonte de fibra" se refere a um material obtido de uma fonte de planta ou microbiana, cujo material contém fibras comestíveis. Exemplos práticos, porém não limitantes de fontes de fibras incluem, as cascas de produtos de semente agrícola tais como de soja, ou de grão tais como arroz, trigo, milho, cevada; os caules de tais grãos (palha); matéria-prima de sabão com base em vegetais/plantas, palha de milho, que tipicamente inclui as palhas, cascas e folhas de uma planta de milho colhida; frações de componente processados de produtos agrícolas que são enriquecidos em fibra, por exemplo, alimento de glúten de milho; material de folha de qualquer fonte de planta, e grãos secos de destilaria com ou sem solúveis secos neles. Desse modo, em exemplos particulares, uma fonte de fibra pode incluir, por exemplo, misturas dos seguintes: produtos de alfafa, cevada (por exemplo, palha), polpa de beterraba, casca de soja, capim, fibra de milho, fibra de soja, casca de coco, espigas de milho, palha de milho, fogão de milho, palha de trigo, trigo palha, palha de arroz, casca de linho, farinha de soja, farinha de milho, gérmen de trigo, gérmen de milho, arbustos, e gramíneas. Para o propósito de clareza na presente descrição, os grãos secos de destilaria (com ou sem solúveis) e grãos de destilaria(com ou sem solúveis) contêm fibra, porém não são considerados "fontes de fibra". Os grãos secos de destilaria (com ou sem solúveis) e grãos de destilaria (com ou sem solúveis) são considerados "coprodutos de milho", como apresentado abaixo.
[00110] Coproduto de milho: Como aqui usado o termo "coproduto de milho" se refere aos produtos que permanecem seguinte a moagem úmida ou moagem seca do milho. Os exemplos não limitantes de coprodutos de milho incluem glúten de milho, glúten de grãos de milho, grãos de destilaria, grãos de destilaria mais solúveis, grãos secos de destilaria, grãos secos de destilaria com solúveis, solúveis de destilaria condensados, farelo de bolo, grãos de destilaria modificados, grãos de destilaria modificados mais solúveis.
[00111] Suplemento: Como aqui usado, o termo "suplemento" se refere a qualquer ingrediente incluído em uma mistura alimentícia para realçar o valor nutricional da mistura alimentícia. Os suplementos geralmente utilizados incluem proteína (por exemplo, uréia ou farelo de soja), minerais (por exemplo, farelo do osso), energia (por exemplo, gordura animal), e vitaminas.
[00112] Traço ou fenótipo: Os termos "traço" e "fenótipo" são utilizados alternadamente aqui. Para os propósitos da presente descrição, um traço de interesse particular é bm1/teor de lignina reduzido.
IV. Gene e variações de gene associados com fenótipo bm1, e usos dos mesmos
[00113] Esta descrição fornece novos genes CAD2 mutantes que contribuem para um fenótipo bm1 em milho. Plantas (por exemplo, milho) que compreendem um gene CAD2 mutante descrito aqui podem ter paredes celulares com níveis de lignina que são menores do que aqueles encontrados em plantas do tipo selvagem da mesma variedade. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico compreendendo um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser introduzida em um organismo, por exemplo, para ajudar no desenvolvimento de fenótipos de Lignina reduzidos. Em modalidades particulares, o organismo pode ser uma planta (por exemplo, milho). Entretanto, uma molécula de ácido nucleico compreendendo um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser introduzida em um organismo que não seja uma planta, por exemplo, levedura, ou procariotas. Em algumas modalidades, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser utilizado para identificar plantas compreendendo um gene CAD2 mutante, ou plantas prováveis de ter um bm1 ou outro fenótipo de Lignina reduzido. Por exemplo, a sequência de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser utilizada para designar sondas que detectam a presença de um gene CAD2 mutante em uma planta, ou em uma amostra preparada de uma planta. Em exemplos particulares, uma sonda de ácido nucleico que hibridiza para a sequência de nucleotídeo de um gene CAD2 mutante, porém não um gene CAD2 tipo selvagem particular, é fornecida.
[00114] Em algumas modalidades, a invenção também inclui aquelas moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência que é substancialmente idêntica a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, cuja sequência pode ou não compreender uma inserção de dinucleotídeo AC e/ou uma inserção de elementos transponíveis como descrito aqui. Por exemplo, em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência que é pelo menos cerca de 85% idêntica à um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção. Desse modo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência que é substancialmente idêntica a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção que é 86%; 87%; 88%; 89%; 90%; 91%; 92%; 93%; 94%; 95%; 96%; 97%; 98%; 99% ou 99,5% idêntica à um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção. Tais moléculas de ácido nucleico que são substancialmente idênticas a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção podem ser facilmente identificadas e isoladas, por exemplo, de qualquer genoma completo ou parcial facilmente disponível por aqueles de experiência na técnica para uma variedade de organismos.
[00115] Algumas modalidades também incluem variantes funcionais de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção. As variantes funcionais de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode incluir, por exemplo, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção compreendendo um ou mais substituições de nucleotídeo, deleções, ou inserções, em que a variante funcional contribui com um bm1 ou outro fenótipo de Lignina reduzido, como pode ser medido por técnicas de rotina bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, uma variante funcional de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode compreender uma inserção de dinucleotídeo AC e/ou uma inserção de transposon como descrito aqui. A capacidade de uma variante particular de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção de reduzir teor de Lignina ou contribuir para um fenótipo de bm1 pode ser determinada por introdução de rotina da mutação ou fragmento em uma planta, seguida por observação de rotina da planta quanto ao teor de Lignina reduzido ou outras características de um fenótipo de bm1. As variantes funcionais de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção podem ser criadas por mutagênese direcionado ao sítio, mutação induzida, ou elas podem ocorrer como variantes alélicas (polimorfismos, por exemplo, SNPs).
[00116] Em algumas modalidades, portanto, as variantes funcionais de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção podem compreender mutações adicionais de um gene CAD2, fragmentos menores do que a sequência de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, e/ou proteínas quiméricas que compreendem um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, ao qual as variantes funcionais retêm as propriedades do gene CAD2 mutante. Tais mutações e fragmentos são, portanto, considerados estarem dentro do escopo da invenção. Alguém versado na técnica pode facilmente determinar se uma mutação ou fragmento adicional de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção retêm as propriedades do gene CAD2 mutante.
[00117] Em algumas modalidades, a capacidade de se introduzir em uma planta, e detectar na planta, um gene CAD2 mutante da descrição pode facilitar a reprodução assistida do marcador e a seleção de plantas tendo um gene CAD2 mutante, cujas plantas podem também ser prováveis de ter um bm1 ou outro fenótipo de Lignina reduzido. Em exemplos particulares, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser introduzido na planta (por exemplo, por transformação genética, ou técnicas de reprodução tradicionais como cruzamento), e uma planta compreendendo o gene CAD2 mutante pode em seguida ser selecionada usando-se uma sonda que detecta a presença do gene CAD2 mutante na planta. As plantas em que um gene CAD2 mutante da descrição foi introduzido podem ser cruzadas com plantas que podem ou não podem também compreender um gene CAD2 mutante, e a progênie pode ser em seguida selecionada usando-se uma sonda que detecta a presença do gene CAD2 mutante da descrição na planta. Além disso, os cruzamentos podem ser feitos para obter uma planta de um genótipo desejado.
[00118] Quando uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção) é "introduzida" em um organismo, tal como uma planta, a técnica ou metodologia usada para a introdução de uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência particular não é essencial para a invenção, e pode correr por qualquer técnica ou metodologia conhecida versada na técnica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida por métodos de transformação diretos, tais como transformação mediada por Agrobacterium de tecido de planta; bombardeio de micro-projétil; eletroporação; etc. Alternativamente, uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida por cruzamento de uma planta tendo a sequência de nucleotídeo particular com outra planta, de modo que a progênie tenha a sequência de nucleotídeo incorporada em seu genoma. Tais técnicas de reprodução são bem conhecidas por alguém versado na técnica. As técnicas de reprodução assistida do marcador, como descritas aqui, podem grandemente facilitar a incorporação de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção através de tais cruzamentos.
[00119] Em modalidades em que um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção é introduzido em um organismo pode ser desejável para o gene CAD2 mutante ser introduzido de tal maneira que o gene CAD2 mutante é operavelmente ligado a um ou mais sequências reguladoras, por exemplo, introdução por meio do uso de um plasmídeo compreendendo o gene CAD2 mutante de acordo com a invenção operavelmente ligado às sequências reguladoras desejadas. As sequências reguladoras úteis na expressão de sequências de ácido nucleico heterólogas são bem conhecidas na técnica, e incluem, por exemplo, e sem limitação: Promotores (por exemplo, promotores constitutivos; promotores específicos de tecido; e promotores de estágio específico de desenvolvimento); sequências de terminação; sequências realçadoras; sequências de alvejamento subcelulares; sequências estabilizadoras ou líder; e instruções.
[00120] Um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser introduzido em um organismo com um ou mais genes marcadores operavelmente ligados a um elemento regulador (um promotor, por exemplo) que permite que as células transformadas contendo o marcador sejam recuperadas por seleção negativa (isto é, inibição de crescimento de células que não contêm o gene marcador selecionável) ou por seleção positiva (isto é, análise do produto codificado pelo marcador genético). Muitos genes marcadores selecionáveis para transformação são bem conhecidos nas técnicas de transformação e incluem, por exemplo, genes que se codificam para enzimas que metabolicamente desintoxicam um agente químico seletivo que pode ser um antibiótico ou um herbicida, ou genes que codificam um alvo alterado que pode ser insensível ao inibidor. Alguns métodos de seleção positiva são também conhecidos na técnica. Os exemplos de genes marcadores adequados para uso em células de planta podem incluir, por exemplo, e sem limitação: O gene de neomicina fosfotransferase II (nptII) (Fraley e outro, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos da América 80:4803); o gene de higromicina fosfotransferase (Vanden Elzen e outro, (1985) Plant Mol. Biol. 5:299); gentamicina acetil transferase, estreptomicina fosfotransferase, aminoglicosídeo-3'-adenil transferase, e o determinante de resistência de bleomicina (Vide, por exemplo, Hayford e outro, (1988) Plant Physiol. 86:1216; Jones e outro, (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86); Svab e outro, (1990) Plant Mol. Biol. 14:197; e Hille e outro, (1986) Plant Mol. Biol. 7:171); genes marcadores selecionáveis que concedem resistência a herbicidas, tais como glifosato, glifosinato ou bromoxinila (Vide, por exemplo, Comai e outro, (1985) Nature 317:741-744; Gordon-Kamm e outro, (1990) Plant Cell 2:603-618; e Stalker e outro, (1988) Science 242:419-423); diidrofolato reductase de camundongo (Eichholtz e outro, (1987) Somatic Cell Mol. Genet. 13:67); 5-enolpiruvinilchiquimato-3-fosfato sintase de planta (Shah e outro, (1986) Science 233:478); acetolactato sintase de planta (Charest e outro, (1990) Plant Cell Rep. 8:643).
[00121] Outra classe de genes marcadores adequados para transformação de planta emprega análise de células de planta presumidamente transformadas em vez de seleção genética direta de células transformadas para resistência a uma substância tóxica, tal como um antibiótico. Estes genes são particularmente úteis para quantificar ou visualizar o modelo especial de expressão de um gene em tecidos específicos, e são frequentemente referidos como "genes reportes", por que eles podem ser fundidos a um gene ou sequência reguladora do gene para a investigação de expressão de gene. Os genes comumente usados para analisar as células transformadas incluem β-glicuronidase (GUS), β-galactosidase, luciferase e cloranfenicol acetiltransferase. Vide, por exemplo, Jefferson (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387; Teeri e outro, (1989) EMBO J. 8:343; Koncz e outro, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci estados Unidos da América 84:131; e DeBlock e outro, (1984) EMBO J. 3:1681.
[00122] Recentemente, os métodos in vivo para visualização de atividade de GUS que não requer destruição de tecido de planta foram disponibilizados. Publicação Molecular probes, publicação 2908, Imagene Green.TM., páginas de 1 a 4, 1993; e Naleway e outro, (1991) J. Cell Biol. 115:151a. Além disso, os genes que codificam as proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP, EGFP, EBFP, ECFP, e YFP) foram disponibilizados como marcadores para expressão de gene em células procarióticas e eucarióticas. Vide Chalfie e outro, (1994) Science 263:802. As proteínas fluorescentes e as mutações de proteínas fluorescentes podem ser usadas como marcadores analisáveis.
[00123] Em algumas modalidades, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção e/ou fragmentos ou segmentos de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção podem ser usados para identificar sequências de gene CAD2 mutante homólogas a partir de organismos diferentes de milho (por exemplo, por comparação de sequência). As sequências de organismos diferentes de milho que são homólogas a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção podem ser identificadas e isoladas de acordo com técnicas bem conhecidas, por exemplo, com base na homologia de sequência a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção.
[00124] Desse modo, em algumas modalidades, toda ou parte de uma sequência de codificação de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser usada como uma sonda que especificamente se hibridiza com outras sequências presentes em uma população de fragmentos de DNA genômicos clonados (isto é, biblioteca genômica) de um organismo de acordo com técnicas de rotina. Desse modo, em algumas modalidades, a invenção inclui aquelas sequências de nucleotídeo que especificamente se hibridizam para um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção.
[00125] Em outras modalidades, as sequências de organismos diferentes de milho que são homólogos a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção podem ser identificadas e isoladas por comparação de sequência. Por exemplo, o genoma sequenciado completo ou parcial de um organismo pode ser pesquisado de acordo com as técnicas de rotina com a sequência de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção para identificar genes dentro do genoma do organismo que compartilham um alto grau de identidade de sequência com o gene CAD2 mutante, e são, consequentemente, igualmente homólogos do gene CAD2 mutante.
[00126] Por exemplo, todo ou parte de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser usada como uma "sequência de referência". Geralmente, as sequências de ácido nucleico (por exemplo, fragmentos de DNA clonados ou genômicos de biblioteca genômica) que são comparadas com a sequência de referência compreendem uma "janela de comparação", que é um segmento contíguo específico da sequência de ácido nucleico. A janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, espaços vazios) comparadas à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. A janela de comparação é tipicamente pelo menos de 20 nucleotídeos contíguos em comprimento, porém pode ser de 30, 40, 50, 100, ou 200 nucleotídeos em comprimento, ou mais. Para evitar uma alta similaridade com a sequência de referência devido à inclusão de deleções na janela de comparação de sequência de polinucleotídeo, uma "penalidade de espaço vazio" pode ser introduzida para ser subtraída pelo número de pareamentos de nucleotídeo.
[00127] Os métodos de sequências de alinhamento para comparação são bem conhecidos na técnica. A determinação de identidade de sequência percentual entre quaisquer das duas sequências pode ser realizada usando algoritmos matemáticos. Os exemplos não limitantes de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (1988), CABIOS 4:11-7; o algoritmo de alinhamento local de Smith e outro, (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443-53; o método de alinhamento local para pesquisa de Pearson e Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos da América 85:2444-8; o algoritmo de Karlin e Altschul (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos da América 87:2264, e Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos da América 90:5873-7.
[00128] Alguém versado na técnica pode implementar estes algoritmos matemáticos em um computador para comparação de sequências para determinar a identidade de sequência, ou pesquisar um banco de dados compreendendo uma pluralidade de sequências (por exemplo, uma base de dados de genoma de organismo) de acordo com a identidade de sequência compartilhada com uma sequência de referência. Tais implementações incluem, porém não são limitadas a, CLUSTAL no programa de PC/Gene (Intelligenetics, Mountain View, CA); e o programa de ALIGN e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no Software GCG Wisconsin Genetics Software Package, volume 10 (Accelrys Inc., San Diego, Califórnia). Os alinhamentos de sequência usando estes programas podem ser realizados usando seus parâmetros básicos. Alternativamente, pode ser desejável modificar os parâmetros básicos em algumas pesquisas (por exemplo, alterando o valor da uma penalidade de espaço vazio). A seleção de uma implementação de computador particular de algoritmos matemáticos para cálculo de identidade de sequência e uma seleção de valores de parâmetro para uso e um algoritmo selecionado estão dentro da discrição de alguém versado na técnica.
[00129] Em algumas modalidades, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser introduzido em uma planta compreendendo um gene desejado adicional (por exemplo, um gene mutante ou alelo menor) ou fenótipo por cruzamento. Alternativamente, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser introduzido em uma planta compreendendo um gene desejado adicional ou fenótipo, por exemplo, por transformação genética. Em certas modalidades, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser introduzido em uma planta compreendendo uma mutação em um ou mais genes adicionais envolvidos em biossíntese ou metabolismo da Lignina. Por exemplo, e sem limitação, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser introduzido em uma planta compreendendo uma mutação em, por exemplo, um gene de CAD diferente; COMT; 4CL; F5H; ZmCAD1 tipo EgCAD1; SAD; um gene de corismato mutase; PAL; HCT; OMT; um gene de citocromo de P450; SAMS3; CCR; DFR; um gene de calcona sintase; um gene de lacase; um gene de peroxidase; um gene de ALDH (por exemplo, um de seis genes ALDH de milho descrito no Skibbe e outro, (2002) Plant Mol. Biol. 48:751-64); AGO; um gene de fator de transcrição de MYB (por exemplo, ZmMYB38; e APL de milho); um gene de fator de transcrição de LIM; um gene fator de bZIP de milho; um gene de MADS-box (por exemplo, ZmZAG5); um gene de MP gene; um gene transportador de ABC; um gene de β-glicosidase; um gene de glutationa S-transferase (por exemplo, ZmGST17); um gene tipo MtN21 de nodulina; um geen ortólogo de PINOID; um gene de histidina quinase (por exemplo, ZmHK1, ZmHK2, e ZmHK3); e/ou um gene ortólogo de COV1. Em algumas modalidades, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser introduzido em uma planta compreendendo uma ou mais características desejadas que estejam envolvidas na biossíntese ou metabolismo da Lignina, para produzir uma planta tanto com um bm1 ou outro fenótipo de Lignina reduzido quanto com uma ou mais características desejadas que não esteja envolvidas na biossíntese ou metabolismo da Lignina.
[00130] Espera-se que as plantas destas e outras modalidades que contêm múltiplos genes mutantes nas séries de reações biossintéticas ou metabólicas da Lignina apresentem fenótipos novos úteis, por exemplo, fenótipos de bm adicionais, e/ou outros fenótipos de Lignina. Vide, por exemplo, Marita e outro, (2003), supra. Por exemplo, observamos que empilhando as características de bm1 com as características de bm3 resulta em outros aumentos em digestibilidade de ensilagem, e uma melhora muito significante na produção de açúcares fermentáveis em hidrólise de biomassa sem pré-tratamento.
[00131] Algumas modalidades utilizam meios para produção de uma planta geneticamente modificada compreendendo um gene CAD2 de milho mutante, e/ou meios para identificação de plantas transportando um gene CAD2 de milho mutante. Em alguns exemplos, um meio para a produção de uma planta geneticamente modificada compreendendo um gene CAD2 de milho mutante pode ser um marcador que está localizado dentro de um gene CAD2 de milho mutante de acordo com a invenção. Em alguns exemplos, um meio para identificação de plantas transportando um gene CAD2 de milho mutante pode ser uma sonda que especificamente se hibridiza com um marcador que está localizado dentro de um gene CAD2 de milho mutante de acordo com a invenção. Os genes CAD2 mutantes de acordo com a invenção (em relação a um meio para produção de uma planta geneticamente modificada compreendendo um gene CAD2 de milho mutante, e um meio para identificação de plantas transportando um gene CAD2 de milho mutante) são aqueles genes CAD2 mutantes que contribuem para um fenótipo de bm1 em linhagem congênita de milho, 515Dbm1, ou linhagem, DASbm1. Estes genes CAD2 mutantes são caracterizados por mutação de mudança de estrutura no terceiro exon de um gene CAD2 que resulta em uma proteína de CAD2 truncada, ou uma inserção de transposon de par de base 3444 no primeiro íntron de um gene CAD2 que resulta em uma proteína truncada de CAD2. Desse modo, em algumas modalidades, um gene CAD2 mutante pode compreender o primeiro exon da sequência de gene ZmCAD2 genômica e/ou do segundo exon da sequência de ZmCAD2 genômica, porém pode não compreender todo ou parte do terceiro exon da sequência de gene ZmCAD2 genômica.
[00132] Os genes CAD2 mutantes descritos aqui são diferentes das mutações de CAD2 anteriormente descritas que podem estar envolvidas em fenótipos de bmr. Por exemplo, um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ter uma ou mais das seguintes características: uma inserção de dinucleotídeo em um exon de um gene de ZmCAD2 (por exemplo, exon 3); uma mutação resultando em uma mudança de estrutura; uma inserção de transposon em um íntron de um gene de ZmCAD2 que resulta em uma proteína truncada; uma mutação resultando em uma enzima de ZmCAD2 truncada; uma mutação resultando na inativação (por exemplo, por remoção) do(s) domínio(s) de ligação de NADPH de ZmCAD2 e/ou catalítico(s) de terminal C; uma mutação que contribui com um fenótipo de bm1 em 515Dbm1 de linhagem de milho congênita; e uma mutação que contribui com um fenótipo de bm1 em DASbm1 de linhagem de milho congênita. Em contraste, genes CAD2 mutantes de ocorrência natural anteriormente descritos são caracterizados pela inserção de um transposon no primeiro íntron do gene (Pedido de patente dos Estados unidos 2010/0203196 A1); expressão reduzida de uma proteína de CAD de tamanho natural (Halpin e outro, (1998), supra); uma mutação de ponto levando à truncação da enzima de CAD2 sorgo bicolor (Saballos e outro, (2009), supra; Sattler e outro, (2009), supra; uma mutação de ponto no sítio de ligação de co-fator no S. bicolor CAD2 (Id.); estrutura secundária rompida fora do sítio ativo no S. bicolor CAD2 (Id.); e uma inserção de adenosina de dois pares base em um gene de CAD Pinus taeda L. que resulta em uma enzima truncada (Patente dos Estados Unidos 6.921.643).
V. Marcadores Moleculares ligados a um gene e variações de gene associadas com um fenótipo de bm1, e usos dos mesmos
[00133] Os marcadores celulares que são ligados (por exemplo, firmemente ligados) a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção são fornecido. Um marcador molecular ligado a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção pode ser descrito em parte, por sua posição em uma região particular no cromossoma de milho 5L. Os marcadores celulares que são ligados a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção podem incluir marcadores SNP que estão dentro, ou que residem próximo, do gene CAD2 mutante. Por exemplo, em algumas modalidades, um SNP DE G/A SNP na posição de nucleotídeo 5410 no gene CAD2 de linhagem de milho de bm1, 515Dbm1, e na posição de nucleotídeo 8903 na linhagem de milho de bm1, DASbm1 (ou um marcador equivalente a este), pode ser um marcador molecular que está ligado a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, um SNP DE G/A localizado na posição de nucleotídeo 5410 no gene CAD2 de linhagem de milho de bm1, 515Dbm1, pode ser um marcador molecular que está ligado a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção.
[00134] Os marcadores adicionais podem ser identificados, por exemplo, determinando-se a frequência A de recombinação entre o marcador adicional e uma mutação de CAD2 de acordo com a invenção, ou um marcador molecular que está ligado a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção (por exemplo, o SNP DE G/A localizado na posição de nucleotídeo 5410 na linhagem de milho de bm1, 515Dbm1). Tais determinações podem utilizar um método melhorado de contrastes ortogonais com base no método de Mather (1931), The Measurement of Linkage in Heredity, Methuen & Co., London, seguido por um teste de probabilidade máxima para determinar uma frequência de recombinação. Allard (1956) Hilgardia 24:235-78. Se o valor da frequência de recombinação for menos do que ou igual a 0,10 (isto é, 10%) no organismo (por exemplo, milho), então o marcador adicional é considerado estar ligado ao gene CAD2 mutante, e o equivalente ao marcador de referência particular para os propósitos de uso nos métodos presentemente descritos.
[00135] Os métodos de uso de marcadores celulares de ácido nucleico que estão ligados a ou que residem dentro de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção para identificar plantas com um bm1 ou outro fenótipo de Lignina reduzido podem resultar em uma economia de custos para desenvolvedores de planta, porque tais métodos podem eliminar a necessidade de cruzar plantas compreendendo um gene CAD2 mutante com outras linhagens de planta, e em seguida o fenótipo das progênies do cruzamento.
[00136] Um meio para produção de uma planta geneticamente modificada compreendendo um gene CAD2 de milho mutante é um marcador que está ligado a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção. Desse modo, um meio para produção de uma planta geneticamente modificada compreendendo um gene CAD2 de milho mutante inclui sequências de ácido nucleico de plantas de milho, a detecção de quaisquer das sequências de ácido nucleico fornece pelo menos uma forte indicação de que uma planta compreendendo a sequência de ácido nucleico compreende um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção.
[00137] Um meio para identificação de plantas transportando um gene CAD2 de milho mutante é uma sonda que especificamente se hibridiza com um marcador que está ligado a ou que reside dentro de um gene CAD2 de milho mutante de acordo com a invenção. A hibridização específica de ácidos nucleicos é um sinal detectável, e uma sonda de ácido nucleico que especificamente se hibridiza com um marcador que está ligado a ou que reside dentro de um gene CAD2 de milho mutante de acordo com a invenção, consequentemente, apresenta um sinal detectável quando adicionada a uma amostra obtida de uma planta transportando um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção.
[00138] Em algumas modalidades, os marcadores ligados flanqueando um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção em um genoma do organismo podem ser usados para transferir segmento(s) de DNA origem de doador que inequivocadamente contém o gene CAD2 mutante. Em algumas modalidades, um método de usar marcadores ligados flanqueando um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção para transferir segmento(s) de DNA origem de doador que inequivocadamente contém o gene CAD2 mutante pode compreender analisar o DNA genômico de plantas de duas origens com sondas que são especificamente hibridizáveis com marcadores ligados ao gene CAD2 mutante; sexualmente cruzar genótipos de planta de duas origens para obter uma população de descendência, e analisar aquelas progênies quanto à presença dos marcadores ligados ao gene CAD2 mutante; retrocruzar a progênie que contém os marcadores ligados ao gene CAD2 mutante para o genótipo recipiente produzir uma primeira população de retrocruzamento, e em seguida continuar com um programa de retrocruzamento até uma progênie final ser obtido que compreenda qualquer característica(s) desejada(s) apresentada(s) pelo genótipo origem e o gene CAD2 mutante. Em modalidades particulares, a progênie individual obtida em cada etapa de cruzamento e retrocruzamento são selecionadas por análise de marcador ligado em cada geração. Em algumas modalidades, a análise do DNA genômico das plantas de duas origens com sondas que são especificamente hibridizáveis com marcadores ligados ao gene CAD2 mutante revela que uma das plantas origens compreende menos dos marcadores ligados aos quais as sondas especificamente se hibridizam, ou nenhum dos marcadores ligados aos quais as sondas especificamente se hibridizam.
[00139] Em algumas modalidades, os marcadores que estão ligados ou que residem dentro de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, ou a sequência de gene CAD2 mutante por si só, podem ser usados para introduzir o gene CAD2 mutante de acordo com a invenção em uma planta de milho por transformação genética. Em modalidades particulares, os marcadores incluem sem limitação o SNP de G/A localizado na posição de nucleotídeo 5410 na linhagem de milho de bm1, 515Dbm1, e na posição de nucleotídeo 8903 na linhagem de milho de bm1, DASbm1, ou um marcador equivalente a este. Em algumas modalidades, um método de introduzir um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção em uma planta de milho por recombinação genética pode compreender analisar o DNA genômico de uma planta (por exemplo, uma planta de milho) com sondas que são especificamente hibridizáveis com marcadores ligados ao gene CAD2 mutante ou com o gene CAD2 mutante por si só para identificar o gene CAD2 mutante na planta; isolar um segmento do DNA genômico da planta compreendendo o gene CAD2 mutante, por exemplo, extraindose o DNA genômico e digerindo o DNA genômico com um ou mais enzimas endonuclease de restrição; opcionalmente amplificando-se o segmento isolado de DNA; introduzindo-se o segmento isolado de DNA em uma célula ou tecido de uma planta de milho hospedeira; e analisando-se o DNA da planta de milho hospedeira com sondas que são especificamente hibridizáveis com marcadores ligados ao gene CAD2 mutante ou com o gene CAD2 mutante por si só para identificar o gene CAD2 mutante na planta de milho hospedeira. Em modalidades particulares, o segmento isolado de DNA pode ser introduzido na planta de milho hospedeira de modo que ela seja estavelmente integrada no genoma da planta de milho hospedeira.
[00140] Em algumas modalidades, os marcadores que estão ligados ou que residem dentro de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, ou a sequência de gene CAD2 mutante por si só, podem ser usados para introduzir um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção em outros organismos, por exemplo, plantas. Em modalidades particulares, os marcadores incluem sem limitação o SNP DE G/A localizado na posição de nucleotídeo 5410 na linhagem de milho de bm1, 515Dbm1, e na posição de nucleotídeo 8903 na linhagem de milho de bm1, DASbm1, ou um marcador equivalente a este. Em algumas modalidades, um método para introduzir o gene CAD2 mutante de acordo com a invenção em organismos diferentes de milho (por exemplo, feijão de soja; alfalfa; trigo; colza; arroz; e sorgo) pode compreender analisar o DNA genômico de uma planta diferente de uma planta de milho com sondas que são especificamente hibridizáveis com marcadores ligados ao gene CAD2 mutante de acordo com a invenção ou com o gene CAD2 mutante por si só para identificar o gene CAD2 mutante na planta; isolar um segmento do DNA genômico da planta compreendendo o gene CAD2 mutante, por exemplo, extraindo-se o DNA genômico e digerindo o DNA genômico com um ou mais enzimas endonuclease de restrição; opcionalmente amplificando-se o segmento isolado de DNA; introduzindo-se o segmento isolado de DNA em um organismo diferente do de milho; e analisando-se o DNA dos organismos diferentes de milho com sondas que são especificamente hibridizáveis com marcadores ligados ao gene CAD2 mutante de acordo com a invenção ou com o gene CAD2 mutante por si só para identificar o gene CAD2 mutante no organismo. Em modalidades particulares, o segmento isolado de DNA pode ser introduzido no organismo de modo que ele seja estavelmente integrado no genoma do organismo.
[00141] Em algumas modalidades, os marcadores que estão ligados ou que residem dentro de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, ou a sequência de gene CAD2 mutante por si só, podem ser usados para identificar uma planta com um bm1 ou outro fenótipo de Lignina reduzido. Em modalidades particulares, uma planta é uma planta de milho. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou mRNA genômico) podem ser extraídas de uma planta. As moléculas de ácido nucleico extraídas podem em seguida ser contactadas com uma ou mais sondas que são especificamente hibridizáveis com marcadores ligados a um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção ou com o gene CAD2 mutante por si só. A hibridização específica de uma ou mais sondas com as moléculas de ácido nucleico extraídas é indicativa da presença de um bm1 ou outro fenótipo de Lignina reduzido na planta.
Planejamento de iniciador e análise de ligação
[00142] As sondas de oligonucleotídeos (por exemplo, iniciadores) podem ser planejadas para especificamente detectar os marcadores que estão fisicamente localizados em, próximo, ou entre os CAD2 que estão ligados a uma mutação de bm1. Em geral, uma sonda de oligonucleotídeo pode ser planejada para que especificamente se hibridize com apenas um alelo de um marcador. Em algumas modalidades, duas sondas de oligonucleotídeos são projetadas para detectar um marcador de bm1, de modo que uma especificamente se hibridize com o alelo de bm1 ao qual a outra sonda não especificamente se hibridiza, e a outra especificamente se hibridiza com o alelo de CAD2 do tipo selvagem (ou alelo de bm1 diferente) ao qual a outra sonda não especificamente se hibridiza. Como é entendido por aqueles versados na técnica, o comprimento ou composição de sondas de oligonucleotídeos para um marcador particular pode ser variada de acordo de acordo com os princípios estabelecidos sem tornar a sonda não específica para um alelo do marcador.
[00143] Em algumas modalidades, as sondas de oligonucleotídeos podem ser iniciadores. Em modalidades especificas, os iniciadores podem ser planejados para detectar marcadores em um ensaio de genotipagem KASPar™. Em modalidades particulares, os iniciadores podem ser planejados para detectar marcadores ligados ao fenótipo de bm1 em milho usando um ensaio de genotipagem KASPar™. Nestas e outras modalidades, o sistema de detecção pode fornecer uma alta produtividade e formato conveniente para indivíduos de genotipagem em um mapeamento de população, que podem facilitar muito a identificação de indivíduos transportando um gene característica particular, e podem também facilitar muito a implementação ou execução de um programa de seleção assistido pelo marcador.
[00144] Em modalidades especificas, as sondas de oligonucleotídeos podem ser iniciadores planejados para detectar marcadores em um ensaio de genotipagem TAQMAN®. Este método utiliza iniciadores específicos para amplificar uma região de DNA contendo um marcador firmemente ligado a uma mutação de bm1 e sondas rotuladas fluorescentes específicas para o marcador. A sonda que especificamente se hibridiza com o alelo de bm1 pode ser rotulada com uma tinta fluorescente tal como FAM, ao mesmo tempo em que a sonda que especificamente se hibridiza com o alelo de CAD2 do tipo selvagem (ou alelo de bm1 diferente) pode ser rotulada com uma tinta fluorescente diferente tal como VIC. Os dados são analisados como a presença ou ausência de um sinal fluorescente de tinta. O sistema de detecção pode fornecer uma alta produtividade e formato conveniente, tal como multiplexação para indivíduos de genotipagem em um mapeamento de população, que podem facilitar muito a identificação de indivíduos transportando um gene ou característica particular, e podem também facilitar muito a implementação ou execução de um programa de seleção assistido pelo marcador.
[00145] Desse modo, é também descrito aqui um ensaio de PCR TaqMan® de finalidade específica, geralmente útil para análise de zigosidade de milho de bm1 ou milho de bm1 Iputativo. Em modalidades particulares, um ensaio de PCR TaqMan® de finalidade específica pode ser usado para analisar a zigosidade de milho para uma mutação de bm1.
[00146] Os iniciadores e sondas para uso em um ensaio de PCR TaqMan® de finalidade específica podem ser planejados com base em uma mutação conhecida no gene de interesse. Por exemplo, os iniciadores e sondas para um ensaio específico de bm1 podem ser planejados com base em uma inserção de 3444-bp no primeiro íntron do gene CAD2. Em reações biplex, em que os oligonucleotídeos específicos para a mutação (por exemplo, bm1) e o gene do tipo selvagem não rompido (por exemplo, CAD2) são usados no mesmo ensaio, os oligonucleotídeos específicos seletivamente amplificarão a sequência de cada ou ambos dos gene mutado e/ou e/ou gene do tipo selvagem que está presente em uma amostra de DNA genômico.
[00147] Em algumas modalidades, um ensaio específico de bm1 amplifica um segmento que é único para a sequência de nucleotídeo de 3444 bp que foi inserida no gene CAD2 genômico do tipo selvagem. Em algumas modalidades, um ensaio específico de gene CAD2 do tipo selvagem amplifica um segmento do gene CAD2 que compreende o sítio de junção onde o sequência de nucleotídeo de 3444 bpfoi inserido no gene CAD2 do tipo selvagem. Em certas modalidades, uma sonda de oligonucleotídeo específica do alvo se hibridiza sob condições de alta rigorosidade para uma sequência alvo em uma amostra de DNA genômico entre dois iniciadores de PCR.
[00148] Os oligonucleotídeos específicos do alvo podem ser rotulados, por exemplo, com tintas fluorescentes (por exemplo, FAM, VIC, e MGBNFQ), que podem permitir quantificação rápida de um sinal fluorescente específico do alvo. Os produtos de PCR podem ser medidos após um número predeterminado de ciclos, por exemplo, quando a reação é na fase exponencial inicial. As amostras de controle negativo podem compreender DNA genômico de qualquer variedade de milho, por exemplo, sem uma mutação de bm1. As amostras e controle positivo podem compreender DNA genômico de uma variedade de milho com uma mutação de BMR, tal como uma mutação de inserção de bm1 no gene CAD2. As amostras hemizigóticas de controle podem compreender cada DNA genômico de uma variedade de milho predeterminada a ser hemizigótica para uma mutação de bm1; ou uma amostra hemizigótica pode compreender porções iguais de DNA de controle negativo a DNA de uma variedade de milho predeterminado a ser hemizigótica parar uma mutação de bm1.
[00149] O DNA pode ser isolado (por exemplo, extraído, e purificado) de tecido de planta de milho por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Os kits comerciais para isolamento de DNA estão disponíveis, por exemplo, por Qiagen, Inc. Em algumas modalidades, os discos de folha de uma planta particular são puncionados e transferidos em tubos de coleta. O punçador pode ser limpo após cada amostragem com 70% álcool, enxaguando com água, e secando. Os tampões de extração de DNA podem ser preparados de acordo com as recomendações do fabricante. O DNA pode em seguida ser isolado usando o kit de acordo com as instruções do fabricante. Finalmente, as concentrações do DNA isolado podem ser determinada usando, por exemplo, Um kit de Quantificação Quant-iT™ PicoGreen® (Invitrogen, Carlsbad, CA) e um espectrofotômetro, ou por qualquer outra técnica adequada.
[00150] Uma vez que a(s) amostra(s) de iniciadores, sondas, e DNA genômico foram preparadas ou de outro modo disponibilizadas, uma reação de PCR pode ser conduzida para identificar as sequências de ácido nucleico de interesse (por exemplo, sequências particulares a uma mutação de BMR) na(s) amostra(s) de DNA genômico. Em modalidades particulares, misturas reacionais de PCR individuais são preparadas que contêm todos os componentes de reação, exceto a(s) amostra(s) de DNA genômico. Para uma reação biplex compreendendo iniciadores e sondas específicas do gene para mutante de bm1 e milho de CAD2 do tipo selvagem, a mistura reacional pode compreender enzima, tampão de reação, iniciadores dianteiros e reversos para a mutação de bm1, iniciadores dianteiros e reversos para o gene CAD2 do tipo selvagem, uma sonda específica do gene para a mutação de bm1, uma sonda específica do gene para o gene CAD2, e água. Em alguns sistemas de ensaio de PCR (por exemplo, ensaios de PCR TaqMan®), enzima e tampão podem estar presente em um componente de kit único (por exemplo, TaqMan® genotyping master mix; Applied Biosystems, Foster City, CA, Catalog # 4371355).
[00151] Uma vez que a mistura reacional é de outro modo preparado, a(s) de amostra(s) de DNA genômico pode ser adicionada, e a reação comercializada. Não é necessário normalizar as quantidades de DNA genômico em uma amostra. Entretanto, o técnico versado pode atingir os melhores resultados usando Amostras de DNA genômico com concentrações relativamente iguais.
[00152] Em algumas modalidades, um ensaio de PCR (por exemplo, um ensaio de PCR TaqMan®) pode ser estabelecido com controles apropriados. Por exemplo, uma reação em uma placa de múltiplas cavidades pode ser realizada com cavidades de controle compreendendo: (1) controle(s) negativo(s) com reagentes, porém nenhuma amostra de DNA; (2) controle(s) positivo(s) homozigótico(s) compreendendo DNA genômico de milho de bm1; (3) e controle(s) positivo(s) hemizigótico(s), como descrito acima. O DNA é em seguida amplificado por PCR sob condições de ciclo adequadas. Por exemplo, em algumas modalidades usando um Sistema de PCR GenAmp® PCR 9700, pode haver uma ciclo de desnaturação inicial único a 95° C durante 15 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturação (92° C durante 15 segundos) e anelamento/extensão (60° C durante 60 segundos). Aqueles versados na técnica entendem que as condições de ciclo de PCR podem ser variadas de acordo com a descrição do médico, e resultados comparáveis obtidos.
[00153] Um ensaio de PCR (por exemplo, um ensaio de PCR de finalidade de TaqMan®) pode ser usado para genótipo e/ou análise de zigosidade de milho de BMR ou milho de BMR putativo. Em algumas modalidades, uma sonda de oligonucleotídeo específica do gene pode ser rotulada com um repórter (por exemplo, uma porção fluorescente). Para ensaios usando detecção fluorométrica, os produtos de reação de PCR podem ser analisados em um espectrofluorômetro (por exemplo, Tecan GENios™; Mannedorf, Suíça) usando fixações de comprimento de onda de excitação e emissão apropriadas para a detecção da(s) sonda(s). Por exemplo, a tinta fluorescente, FAM, pode ser medida com um comprimento de onda de 485 nm, e um comprimento de onda de 535 nm. Alternativamente, a tinta fluorescente, VIC, pode ser medida com um comprimento de onda de 525 nm, e um comprimento de onda de 560 nm.
[00154] Após a conclusão d reação de PCR e a detecção de sonda, uma tabela e um gráfico podem ser gerados usando, por exemplo, qualquer software de gráficos de computador adequado. Os resultados obtidos com DNA do tipo selvagem, hemizigótico, e homozigótico de base genotípica similar podem servir como controles negativos e positivos. Em uma segregação da população, três grupos de pontos de dados podem ser obtidos permitindo a determinação visual de um resultado de amostra como provavelmente pertencente a um dos grupos segregados. Alternativamente, o software de computador de análise de dados pode ser usado para calcular a probabilidade em que um resultado de amostra pertence a cada grupo segregado, com o grupo mais provável servindo como a designação de amostra. Quando uma determinação visual é feita, o limite de cada grupo pode ser arbitrário, por exemplo, quando três grupos de pontos de dados são claramente visíveis.
[00155] Os dados de intensidade de fluorescência brutos podem também ser analisados diretamente de uma leitora de placa usando pacote de análise adequada, tal como KLIMS™ (KBioscience laboratory information management system). Um gráfico com as unidades de fluorescência relativas (RFU) de um sinal de fluorescência gerado por uma sonda específica para um alelo mutante plotado em um eixo, e o RFU de um sinal de fluorescência gerado por uma sonda específica para o alelo do tipo selvagem plotado em outro eixo pode ser gerado. As determinações de zigosidade podem em seguida ser feitas com base na separação de grupo em uma apresentação gráfica dos dados.
[00156] As amostras que não contêm DNA genômico mutante (por exemplo, uma mutação de BMR) podem apenas resultar em leituras de fluorescência do produto de PCR do tipo selvagem. As amostras contendo DNA genômico mutante hemizigótico ou homozigótico podem resultar em leituras de RFU para a sonda específica do mutante maior do que aquela de um controle de base negativa. Se uma amostra não produz nenhum resultado adequado, o DNA genômico na amostra pode não ser de qualidade e/ou quantidade adequada, e a nova preparação de DNA e/ou nova reação de PCR deve ser realizada. Preferivelmente, uma amostra de controle negativo não contendo nenhuma amostra de DNA mostra detecção muito baixa de sonda(s) específica(s) do gene. É também preferível que controles homozigóticos conhecidos mostrem apenas alta detecção do DNA mutante ou do tipo selvagem no controle, e que os controles hemizigóticos conhecidos mostrem alta detecção tanto de DNA mutante quanto do tipo selvagem.
[00157] Um "ciclo de teste" do método de PCR e determinação de genótipo e/ou zigosidade pode ser realizado com todos os controles apropriados antes da análise das amostras. Outra otmização dos métodos pode ser desejável para componentes que podem diferir entre usos (por exemplo, método de preparação de DNA genômico, Taq DNA polimerase, oligonucleotídeos, equipamento de laboratório, etc.). As condições de PCR e ciclismo térmico podem ser estabelecidas, que amplificam tanto as sequências mutantes quanto as do tipo selvagem em um padrão de DNA genômico conhecido com níveis aceitáveis de detecção de sonda (por exemplo, RFU aceitável para sondas de oligonucleotídeos fluorescentemente rotuladas).
VI. Organismos tendo atividade de CAD2 reduzida e usos da mesma A. Organismos tendo atividade de CAD2 reduzida
[00158] Algumas modalidades da presente invenção também fornecem um organismo incluindo uma molécula de ácido nucleico compreendendo um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, uma sequência de ácido nucleico que é especificamente hibridizáveis com um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, ou uma variante funcional de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção. Um organismo adequado pode ser qualquer planta, levedura, ou bactéria adequada. Por meio de exemplo não limitante, uma planta compreendendo as sequências acima mencionadas pode ser uma planta de valor agronômico, por exemplo, e sem limitação: milho; feijão de soja; alfalfa; trigo; colza; arroz; sorgo; beterraba; vários vegetais incluindo pepino, tomate, pimentas, etc.; várias arvores incluindo maçã, pêra, pêssego, cerejeira, pau-brasil, pinheiro, carvalho, etc.; e várias plantas ornamentais. Em modalidades particulares, o organismo pode ser uma planta que é usada para produzir ensilagem.
[00159] As células de planta compreendendo um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, uma sequência de ácido nucleico que é especificamente hibridizáveis com um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, ou uma variante funcional de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, podem ser cultivadas e mantidas como células de cultura de tecido de planta, ou certos hormônios de planta conhecidos na técnica podem ser adicionados ao meio de cultura, desse modo, causando células de cultura de tecido diferenciar-se e formarem uma variedade de planta nova, em que a nova variedade de planta pode apresentar um bm1 ou outro fenótipo de Lignina reduzido. Tais métodos de cultura de planta úteis nestas e outras modalidades são rotina e bem conhecidos na técnica.
[00160] Algumas modalidades da invenção fornecem um vírus (por exemplo, um bacteriófago, ou vírus de planta) compreendendo um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, uma sequência de ácido nucleico que é especificamente hibridizáveis com um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, ou uma variante funcional de um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção.
B. Ensilagem produzida de plantas tendo atividade de CAD2 reduzida
[00161] São descritos aqui os métodos para aumentar a quantidade de carne de um animal alimentado com ensilagem que usa ensilagem produzida de variedades de planta apresentando teor de Lignina reduzido para melhorar o ganho diário e eficácia de alimento quando comparada com ensilagem de milho convencional em uma ração de acabamento. Tal ensilagem pode efetivamente substituir milho em grão na ração com acabamento de carne. Em algumas modalidades, o método compreende fornecer ensilagem produzida de uma planta variedade compreendendo um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, alimentação do animal com a ensilagem produzida de uma variedade de planta compreendendo um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, e produzindo carne ou produtos de carne do animal. Nestas e outras modalidades, o animal alimentado de ensilagem pode ser um ruminante. Em modalidades particulares, o animal alimentado de ensilagem pode ser qualquer animal alimentado de ensilagem, por exemplo, gado vacum, carneiro, suíno, cavalos, bodes, bisão, iaques, búfalo d’água, e veado.
[00162] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos para aumentar a quantidade de carne de um animal alimentado com ensilagem também compreendem um ato selecionado do grupo consistindo em: colocar a ensilagem em um recipiente configurado para expedição, e associar indícios com the ensilagem, em que os indícios são capazes de direcionar um usuário final sobre como administrar a ensilagem ao animal. Desse modo, os kits compreendendo ensilagem são fornecidos, de modo que os kits permitam um usuário final aumentar a quantidade de carne de um animal alimentado com ensilagem.
[00163] São também descritas rações com acabamento de carne, em que a ração com acabamento de carne compreende ensilagem de milho compreendendo um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção. São também descritos carne e produtos de carne preparados a partir de um animal que foi alimentado com tal ensilagem.
Produção de ensilagem de plantas (por exemplo, milho) tendo atividade de CAD2 reduzida.
[00164] Durante a ensilagem, as células de uma planta estão ainda vivas e metabolicamente ativas, e o metabolismo em andamento por células de planta e microorganismos na ensilagem compressada formam dióxido de carbono e aquecem o ar capturado no material de planta ensilado. As condições metabólicas anaeróbicas desenvolvem- se quando o nível de dióxido de carbono na ensilagem aumenta. As bactérias desejáveis iniciam o processo de fermentação quando a respiração da planta para. Se também mais ar estiver presente, ou se o dióxido de carbono escapar, uma condição anaeróbia pode deixar de se desenvolver. Neste caso, a respiração pode continuar, e a respiração das células da planta pode usar também muito açúcar e carboidratos. Isto pode consumir ingredientes necessários para bactérias desejáveis preservarem o material de planta como ensilagem, e pode produzir ensilagem inferior. Para evitar este efeito indesejável, embalagem e cobertura da ensilagem imediatamente após o enchimento pode ser importante.
[00165] Uma vez que a respiração pelas células da planta cessa, ácido acético e láctico são produzidos por bactérias que alimentam dos amidos e açúcares simples no milho ensilado. Para promover o crescimento de bactérias desejáveis, a ensilagem pode conter uma baixa quantidade de ar, temperaturas entre 80° e 100° F, e amidos e açúcares para alimento. A fermentação pode continuar até a acidez da ensilagem ser alta o bastante para interromper o crescimento bacteriano. Em alguns exemplos, o grau desejado de acidez é um pH de cerca de 4,2. Este grau de acidez pode ocorrer dentro de 3 semanas após o silo é carregado.
[00166] Infiltração pode ocorrer se a mistura na forragem for extensivamente alta. A infiltração envolve a drenagem de lixiviado (mistura em excesso de ensilagem e suspensão) fora da ensilagem, que geralmente entra no ambiente como um grave poluente. Através da infiltração, os componentes desejáveis (por exemplo, compostos de nitrogênio, tais como proteína; e minerais) da ensilagem pode ser perdidos. A infiltração geralmente alcança seu auge a cerca do quarto dia após ensilagem. Portanto, para evitar, por exemplo, a perda de componentes de ensilagem desejáveis da ensilagem, o teor de umidade de forragem em funcionamento no silo pode ser escolhido ser suficientemente baixo para reduzir e prevenir a perda de infiltração. Entretanto, a ensilagem que é também seca pode não o ponto máximo adequadamente, e pode também apresentar uma alta perda de componentes desejáveis da ensilagem como uma consequência de fermentação excessiva e moldagem.
[00167] As plantas podem ser ensiladas em um teor de matéria seca de cerca de 30 a 40% para permitir um processo de fermentação ideal, e minimizar as perdas durante a fermentação. Para alcançar um teor de matéria seca de cerca de 30 a 40%, pode ser desejável deixar um material de planta secar em um campo após corte e antes ceifamento com, por exemplo, uma colheitadeira de forragem. Quando apreparação de ensilagem, o grão pode ser colhido junto com o resto da planta. Para aumentar a disponibilidade de nutrientes na ensilagem para captação no trato intestinal de um animal alimentado com ensilagem, pode ser desejável esmagar o grão durante o processo de ceifamento.
[00168] O material de planta colhido (por exemplo, material de planta de milho) pode ser transferido em um silo. Os exemplos não limitantes de silos que podem ser úteis para preparação de ensilagem incluem: um silo de casamata, um monte de ensilagem, um silo de aduela concreto, ou um silo de torre. Um material de planta é compactado no silo para remover o ar de um material de planta, e permitir fermentação anaeróbica. Pode ser desejável selar o silo com uma película de ensilagem plástica, dependendo do tipo de silo usado. O uso de uma cobertura plástica sobre um silo de trincheira, um silo de casamata, ou um silo de torre de diâmetro grande, pode materialmente cortar as perdas em alimentação. Tipicamente, a cobertura é aplicada imediatamente após o último carregamento de material de planta ser embalado no silo, e as coberturas plásticas são sobrecarregadas para mantê-las firmemente sobre a superfície da ensilagem. Alternativamente, o material de planta pode ser preparado para fermentação durante a ensilagem enfardando-se o material de planta, e embrulhando-se os fardos em película de ensilagem para selagem. Nos silos de trincheira ou casamata silos, pode ser desejável amontoar ou coroar a forragem. Isto pode facilitar a drenagem de água da chuva fora do silo.
[00169] Os aditivos podem opcionalmente ser adicionados ao material de planta para melhorar a fermentação. Os exemplos de aditivos de material de planta que podem ser desejáveis em aplicações particulares incluem aditivos microbianos, tais como Lactobacillus spp. e outros inoculantes; ácidos tais como ácido propiônico, ácido acético ou ácido fórmico; ou açúcares. Como será facilmente entendido por aqueles versados na técnica, outros métodos para produção de ensilagem diferentes daqueles especificamente recitados aqui podem também ser usados.
[00170] Uma vantagem de produção de ensilagem é que o processo pode ter não ter nenhuma influência sobre a composição, a quantidade, ou disponibilidade de substância de substâncias nutritivas contidas dentro do material de planta usado para a produção da ensilagem. Ao contrário, os propósitos do próprio processo são geralmente tanto manter a qualidade do material de planta como ele era antes do uso de tal material para a produção de ensilagem, quanto preservar as propriedades positivas do material de planta durante um período prolongado de tempo. Nesta maneira, o material de planta pode ser usado como forragem muito tempo depois do material de planta ter sido colhido.
[00171] Milho pode ser colhido para ensilagem após a espiga ser bem dentada, porém antes das folhas secarem até o ponto que elas se tornam marrons. Neste estágio de crescimento, a espiga pode ter acumulado a maioria de seu valor de alimentação potencial, porém neste contexto pode também ter havido pouca perda das folhas e caules. Desse modo, a quantidade e qualidade ensilagem do milho podem ser em seu pico quando um material de planta é colhido durante este estágio. As espigas geralmente serão bem dentadas quando as espigas são entre 32 a 35% de umidade. Quando o tempo passa após a espiga ter se tornado bem dentada, o valor de alimentação de um material de planta pode diminuir ao mesmo tempo em que perdas de campo podem aumentar. O milho colhido para ensilagem no estágio de leite (a cabeça do grão libera um líquido branco quando aberto) ou estágio pastoso (a cabeça do grão começa a tornar-se de uma consistência pastosa) pode produzir menos nutrientes alimentícios por acre do que se ele fosse colhido depois. Material de planta de milho pode também fermentar inadequadamente em um silo se ele for colhido muito rapidamente.
[00172] Maturidade geralmente refere-se ao momento quando a espiga acumulou quase todo o seu potencial de produção de matéria. As temperaturas durante o crescimento podem influenciar a taxa do grão, particularmente durante o outono. Por exemplo, o potencial de material seca não pode ser obtido se existirem temperaturas excessivamente frias e/ou tempo nublado. Ensilagem do milho que é cortada posteriormente e tem folhas e caules marrons e mortos pode tornar a ensilagem adequada, porém a produção total por acre pode ser bruscamente reduzida. Perdas significantes foram descobertas quando ensilagem é feita posteriormente no outono ou inverno prematuro. Além disso, uma redução na quantidade de matéria seca armazenada no silo pode ser descoberta com respeito à ensilagem que é cortada posteriormente.
[00173] O milho que foi danificado, por exemplo, por estiagem, temperaturas elevadas, ferrugem, geada, ou granizo, pode ser recuperado para ensilagem. Entretanto, a qualidade de tal ensilagem recuperada pode não ser tão elevada quanto da ensilagem produzida a partir do milho não danificado que alcançou o estágio de dente. O valor de alimentação da ensilagem pode depender tanto do estágio do estágio de desenvolvimento do milho, quanto de como o milho é manuseado após ele ter sido danificado. Observações comuns de ensilagem de milho imaturo incluem: umidade elevada; fermentação de uma maneira diferente daquelas do milho maduro; odor azedo; e efeito laxativo aumentado. Milho que já experimentou geada tipicamente tem um baixo teor de caroteno. Ele secará rapidamente e perderá as folhas. Desse modo, pode ser desejável adicionar água ao milho que congelou e tornou-se muito seco. Pode também ser desejável adicionar água ao milho de estiagem.
[00174] Pode ser desejado que o milho imaturo que foi danificado por temperaturas altamente elevadas não seja ensilado imediatamente. Milho danificado por calor, imaturo pode nunca produzir espigas, porém algum crescimento de caule adicional. O crescimento de caule adicional resultará em alimentação adicional. Se milho for colhido para ensilagem imediatamente após as plantas terem sido extensivamente danificadas por aquecimento, o caule poderá ter muito mais umidade para produzir uma ensilagem de qualidade elevada. Milho colhido imediatamente após dano por calor extensivo que tem muito mais umidade pode também perder nutrientes através de infiltração.
[00175] Problemas possíveis com ensilagem feita a partir de milho recuperado incluem sua falta de teor de energia devido à formação de grão reduzida, e fermentação resultando de secura excessiva da planta danificada. Como é conhecida por aqueles versados na técnica, estes problemas podem ser corrigidos, pelo menos em parte, por suplementação com uma fonte de energia adicional, e adição de umidade, respectivamente.
[00176] A ensilagem de milho pode ser cortada em partículas que são de 1/2" a 3/4" em comprimento. Partículas deste tamanho podem acondicionarem-se mais firmemente, e podem adicionalmente ser mais palatáveis para animais alimentados por ensilagem. Ensilagem cortada muito finamente que é menor do que 1/2" em comprimento pode ser feita com um recortador. Uso de ensilagem muito finamente cortada aumenta a quantidade da matéria seca que pode ser armazenada, por exemplo, em um silo. Entretanto, ensilagem muito finamente cortada pode ser muito menos palatável para um animal que deve ser alimentado com a ensilagem.
[00177] Se a ensilagem for muito seca, pode ser desejável adicionar água, por exemplo, para estabelecer as condições herméticas. Geralmente, quarto galões de água podem ser adicionados por tonelada de ensilagem para cada 1 por cento de aumento desejado em teor de umidade. Entende-se que mais ou menos água pode ser requerida, e medidas pode ser tiradas durante o processo de ensilagem para garantir que água suficiente, porém não muita, seja adicionada. A água pode ser adicionada quando o silo está sendo carregado. Se a água é adicionada após o silo ser carregado, pode ser exudada das paredes do silo, e, portanto, não permeia a massa de ensilagem. Esta exudação pode causar lixiviação de nutrientes de ensilagem, e pode romper o selo de ar e induzir à fermentação imprópria.
[00178] A ensilagem de qualidade elevada pode ser feita sem a adição de quaisquer aditivos ou conservantes. Entretanto, aditivos podem ser aditivos à ensilagem para aumentar uma ou mais características da ensilagem. Por exemplo, melaço e grão podem ser adicionados milho forragem no mento da ensilagem.
[00179] Silos de grande capacidade, métodos de carregamento de velocidade elevada, distribuição e empacotamento de ensilagem em silos devem ser monitorados. Empacotamento e distribuição imprópria podem causar exudação excessiva, fraca fermentação, e/ou perdas em capacidade de armazenagem. Metade da capacidade de um silo cilíndrico é na borda de superior do silo. Por exemplo, para um silo cilíndrico que é de 14’ em diâmetro, a metade de sua capacidade está na parte superior 2’ de seu diâmetro. Se o material esta área externa for empacotado muito ligeiramente, a capacidade do silo pode se significantemente reduzida. Desse modo, silos em torre podem ser equipados com um distribuidor que facilita a distribuição e empacotamento apropriados.
[00180] Uma perda de nutrientes ocorre em toda a ensilagem durante o processo de ensilagem, devido à presença de microorganismos vivos que realizam o processo de fermentação. A quantidade de perda de valor nutricional durante o processo de ensilagem depende da, entre outras coisas, da exclusão de ar durante o carregamento, e da prevenção de perda de dióxido de carbono. Dióxido de carbono é necessário para interromper a respiração das células de plantas ensiladas; e prevenir perda de exudação, fermentação indesejada, e/ou deterioração devido à exposição de uma superfície de um material de planta. Portanto, boas práticas de ensilagem geralmente induzem à ensilagem de qualidade com um teor de nutriente máximo.
[00181] Ensilagem de plantas (por exemplo, milho) tendo atividade de CAD2 reduzida em uma ração final.
[00182] A ensilagem de plantas tendo atividade de CAD2 reduzida tem um teor de lignina quando comparada às plantas do tipo selvagem da mesma variedade, e pode ser cortada em partículas mais longas do que a ensilagem normal, se ela for processada ou não. A digestibilidade de NDF de ensilagem bm1 ensilagem pode ser mais elevada do que com normal ensilagem. A composição de ensilagem recentemente feita não é necessariamente refletiva da composição de alimentação que o animal alimentado com ensilagem comerá. Portanto, amostras fermentadas podem ser analisadas após um período de tempo após pelo menos duas semanas, ou pelo menos dois meses, no silo.
[00183] Visto que a ensilagem de plantas tendo atividade de CAD2 reduzida foi preparada, e a ensilagem foi determinada ser pronta para ser alimentada a um animal, a ensilagem pode ser incluída em uma ração final a ser alimentada a um animal que será usado para produção de carne, ou produto de carne. Em alguns exemplos, a ração final compreendendo a ensilagem podem não compreender milho em grão, por exemplo, milho revolvido seco, ou milho moído. Rações finais típicas compreendem pelo menos cerca de 11% de proteína, cerca de 60 MCal de energia líquida, cerca de 0,5% de cálcio, cerca de 0,35% de fósforo, e cerca de 0,6% de potássio. Em alguns exemplos, é uma vantagem que uma ração final exiba uma eficácia de alimentação elevada (G:F). Em exemplos particulares, uma ração final que não compreende um milho em grão pode resultar em ganhos diários médios em um animal alimentado com a ração final que são comparáveis aos ganhos diários médios que podem resultar de rações finais normais que usam grão de milho como uma fonte de.
[00184] Em alguns exemplos, uma ração final é produzida usando ensilagem de plantas (por exemplo, milho) compreendendo um gene CAD2 mutante de acordo com a invenção, em que a ração final compreende entre cerca de 15% e cerca de 30% de ensilagem. Desse modo, uma ração final pode compreender, por exemplo, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, ou 33% de ensilagem. Em exemplos particulares, uma ração final é produzida usando ensilagem de milho bm1. Em alguns exemplos, uma ração final compreendendo pelo menos uma fonte de fibra e produzida. Desse modo, uma ração final pode compreender, por exemplo, uma, duas, três, quatro, ou mais do que quatro fontes de fibra. Em alguns exemplos, uma ração final compreendendo pelo menos um coproduto de milho. Desse modo, uma ração final pode compreender, por exemplo, um, dois, três, quatro, ou mais do que quatro coprodutos de milho. Em alguns exemplos, uma ração final compreendendo menos do que 60% matéria seca é produzida. Em outros exemplos, uma ração final compreende menos do que 55% matéria seca. Em algumas modalidades específicas, uma ração final compreende menos do que 50% matéria seca. Desse modo, uma ração final pode compreender, por exemplo, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, ou 40% matéria seca.
C. Empilhamento de um gene CAD2 mutante com uma ou mais características adicionais
[00185] Em algumas modalidades, um gene CAD2 mutante de acordo com a presente invenção pode ser introduzido em uma planta compreendendo um ou mais trações desejáveis, a fim de produzir uma planta tanto com um bm1 quanto outro fenótipo de lignina reduzida, e uma ou mais características desejáveis. O processo de introdução de um gene CAD2 mutante de acordo com a presente invenção em uma planta compreendendo uma ou mais características desejáveis (por introdução em uma linhagem de planta existente, ou por introdução do gene CAD2 mutante na planta ao mesmo tempo como uma molécula de ácido nucleico adicional que fornece um traço desejado) é referido aqui como "empilhamento." Em alguns exemplos, empilhando-se um gene CAD2 mutante com uma ou mais características desejáveis, um fenótipo de bm1 ou outra lignina reduzida pode ser combinado com uma ou mais características desejáveis. Por exemplo, empilhamento da característica de bm1 com a característica de bm3 pode resultar e outros aumentos na digestibilidade de ensilagem, e uma melhora significante na produção de açúcares fermentados em hidrólise de biomassa sem pré-tratamento.
[00186] Exemplos de características que podem ser desejáveis para combinação com um bm1 ou outro fenótipo de Lignina reduzida incluem, sem limitação: esterilidade masculina citoplásmica; genes de resistência de doença de planta (Vide, por exemplo, Jones e outro, (1994) Science 266:789 (gene tomate Cf-9 para resistência à Cladosporium fulvum); Martin e outro, (1993) Science 262:1432 (gene tomate Pto para resistência à Pseudomonas syringae); e Mindrinos e outro, (1994) Cell 78:1089 (RSP2 gene para resistência à Pseudomonas syringae)); um gene que confere resistência a uma peste; uma proteína Bacillus thuringiensis, um derivado do mesmo, ou um polipeptídeo sintético modelado nela (Vide, por exemplo, Geiser e outro, (1986) Gene 48:109 (gene Bt δ-endotoxina; moléculas de DNA codificando genes de δ-endotoxina podem ser adquiridos de Coleção de Cultura do Tipo Americano (Manassas, VA), por exemplo, sob acessos ATCC n°s 40098; 67136; 31995; e 31998)); uma lectina (Vide, por exemplo, Van Damme e outro, (1994) Plant Molec. Biol. 24:25 (genes de lectina de ligação de Clivia miniata manose)); uma proteína de ligação de vitamina, por exemplo, avidina (Vide, Publicação PCT Internacional US93/06487 (uso de avidina e homólogos de avidina como larvicidas contra pestes de inseto)); um inibidor de enzima; um inibidor de protease ou proteinase (Vide, por exemplo, Abe e outro, (1987) J. Biol. Chem. 262:16793 (inibidor de cisteína proteinase de arroz); Huub e outro, (1993) Plant Molec. Biol. 21:985 (inibidor I de proteinase de batata; e Patente dos Estados Unidos n° 5.494.813); um inibidor de amilase (Vide, Sumitani e outro, (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (inibidor de Streptomyces nitrosporeus alfa-amilase)); um feromônio ou hormônio específico de inseto, por exemplo, um hormônio ecdisteroide ou juvenil, uma variante do mesmo, um mimético com base no mesmo, ou um antagonista ou agonista do mesmo (Vide, por exemplo, Hammock e outro, (1990) Nature 344:458 (inativador de hormônio juvenil)); um neuropeptídeo ou peptídeo específico de inseto que interrompe a fisiologia da peste afetada (Vide, por exemplo, Regan (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (receptor de hormônio diurético de inseto); Pratt e outro, (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (alostatina de Diploptera puntata); Patente dos Estados Unidos n° 5.266.317 (neurotoxinas paralíticas específicas de inseto)); um veneno específico de inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, ou qualquer outro organismo (Vide, por exemplo, Pang e outro, (1992) Gene 116:165 (um peptídeo insetotóxico de escorpião)); uma enzima responsável por um hiperacúmulo de um monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou outra molécula de não proteína com atividade inseticida; uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-translacional, de uma molécula biologicamente ativa, por exemplo, uma enzima glicolítica; uma enzima proteolítica; uma enzima lipolítica; uma nuclease; uma ciclase; uma transaminase; uma esterase; uma hidrolase; uma fosfatase; uma cinase; a fosforilase; uma polimerase; uma elastase; uma quitinase; ou uma glicanase, seja natural ou sintética (Vide, Publicação PCT Internacional WO 93/02197 (um gene calase); moléculas de DNA que contêm sequências codificando a quitinase (por exemplo, do ATCC, sob os n°s de acesso 39637 e 67152); Kramer e outro, (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (quitinase de larva de chifre do Tabaco); e Kawalleck e outro, (1993) Plant Molec. Biol. 21:673 (gene ubi4-2 poliubiquitina de salsa); uma molécula que estimula a transdução de sinal (Vide, por exemplo, Botella e outro, (1994) Plant Molec. Biol. 24:757 (calmodulina); e Griess e outro, (1994) Plant Physiol. 104:1467 (calmodulina de milho); um peptídeo de momento hidrofóbico (Vide, por exemplo, Publicação PCT Internacional WO 95/16776 (derivados de peptídeo de Tachyplesin que inibe os patógenos de planta fúngica); e Publicação PCT Internacional WO 95/18855 (peptídeos antimicrobianos que conferem resistência à doença)); uma membrana permease, um formador de canal, ou um bloqueador de canal (Vide, por exemplo, Jaynes e outro, (1993) Plant Sci 89:43 (um análogo de peptídeo lítico de cecropina-β para tornar plantas transgênicas resistentes à Pseudomonas solanacearum); uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa deles (Vide, por exemplo, Beachy e outro, (1990) Ann. rev. Phytopathol. 28:451 (resistência mediada por proteína de revestimento contra virus mosaico de alfafa, vírus mosaico de pepino, vírus da estria de tabaco, vírus X de batata, vírus Y de batata, vírus de gravação de tabaco, vírus da crepitação de tabaco e vírus mosaico de tabaco)); um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada deles (Vide, por exemplo, Taylor e outro, Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Escócia) (1994) (inativação enzimática por meio de fragmentos de anticorpo de cadeia simples); um anticorpo específico de vírus (Vide, por exemplo, Tavladoraki e outro, (1993) Nature 366:469 (genes de anticorpo recombinante para a proteção de ataque de vírus)); uma proteína atrativa de desenvolvimento produzida na natureza por patógeno ou um parasita (Vide, por exemplo, Lamb e outro, (1992) Bio/Technology 10:1436 (endo α-1,4-D-poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e liberação de nutriente de planta por solubilização de homo-α -1,4-D-galacturonase de parede celular da planta; Toubart e outro, (1992) Plant J. 2:367 (proteína de inibição de endopoligalacturonase)); e uma proteína atrativa de desenvolvimento produzida na natureza por uma planta (Vide, por exemplo, Logemann e outro, (1992) Bio/Technology 10:305 (gene inativação de ribossoma de cevada provendo resistência aumentada às doenças fúngicas)).
[00187] Outros exemplos de características que podem ser desejáveis para combinação com um bm1 ou outro fenótipo de lignina reduzida incluem, sem limitação, genes que conferem resistência a um herbicida (Lee e outro, (1988) EMBO J. 7:1241 (enzima ALS mutante); Miki e outro, (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449 (enzima AHAS mutante); Patente dos Estados Unidos n°s 4.940.835 e 6.248.876 (genes mutantes de 5-enolpiruvilshiquimato -3-fosfato sintase (EPSPs) provendo resistência ao glifosato); Patente dos Estados Unidos n° 4,769,061 e ATCC accession number 39256 (genes de aroA); genes de glifosato acetil transferase (resistência a glifosato); outros compostos de fosfono de espécies de Streptomyces, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromogenes) tais como aqueles descritos no Pedido Europeu n° No. 0 242 246 e DeGreef e outro, (1989) Bio/ Technology 7:61 (genes de glufosinato fosfinotricina acetil transferase (PAT) provendo resistência a glifosato);"acido propiônicos de piridinóxi ou fenóxi e cicloexanos (resistência a glifosato); Pedido de Patente Européia n° 0 333 033 e Patente dos Estados Unidos n° 4.975.374 (genes de glutamina sintetase provendo resistência a herbicidas tal como L-fosfinotricina); Marshall e outro, (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435 (genes Acc1-S1, Acc1-S2, e Acc1-S3 provendo resistência a ácidos propiônicos de fenóxi e cicloexonas, tais como setoxidim e haloxifop); WO 2005012515 (genes de GAT provendo resistência a glifosato); WO 2005107437 (Genes conferindo resistência a herbicidas de 2,4-D, fop e piridilóxi auxina); e um herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (genes de psbA e gs+) ou uma benzonitrila (gene nitrilase) (Vide, por exemplo, Przibila e outro, (1991) Plant Cell 3:169 (genes psbA mutantes); sequências de nucleotídeo para genes nitrilase são descritas na Patente dos Estados Unidos n° 4.810.648, e moléculas de DNA contendo estes genes estão disponíveis sob o acesso ATCC n°s. 53435, 67441, e 67442; e Hayes e outro, (1992) Biochem. J. 285:173 (glutationa S-transferase)).
[00188] Outros exemplos de características que podem ser desejáveis para combinação com um bm1 ou outro fenótipo de lignina reduzida incluem, sem limitação, genes que conferem ou contribuem para uma característica adicionada ao valor, por exemplo, metabolismo de ácido graxo modificado (Vide, por exemplo, Knultzon e outro, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624 (um gene antissentido de estearil-ACP desaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta)); teor de fitato diminuído (Vide, por exemplo, Van Hartingsveldt e outro, (1993) Gene 127:87 (um gene Aspergillus niger fitase realça a interrupção de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada); e Raboy e outro, (1990) Maydica 35:383 (clonagem e reintrodução de DNA associada com um alelo responsável por mutantes de milho tendo baixos níveis de ácido fítico)); e composição de carboidrato modificado realizada, por exemplo, transformando plantas com uma codificação de gene para uma enzima que altera o padrão de ramificação de amido (Vide, por exemplo, Shiroza e outro, (1988) J. Bacteol. 170:810 (gene Streptococcus fructosiltransferase mutante); Steinmetz e outro, (1985) Mol. Gen. Genet. 20:220 (gene levansucrase); Pen e outro, (1992) Bio/Technology 10:292 (α-amilase); Elliot e outro, (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (gene invertase de tomate); Sogaard e outro, (1993) J. Biol. Chem. 268:22480 (gene α-amilase de cevada); e Fisher e outro, (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima II de ramificação de amido de endosperma de milho)).
D. Outros usos de uma planta tendo atividade de CAD2 reduzida
[00189] Muitas aplicações agronômicas ou industriais além da produção de ensilagem envolvem produtos de planta desejados, as produções dos quais são diretamente ligados ao teor e/ou composição de Lignina na parede de célula de planta. Exemplos de tais produtos e aplicações incluem sem limitação: produtos usados em produção de papel, e a produção de energia, por exemplo, na forma de biocombustíveis. Plantas compreendendo um gene CAD2 mutante de acordo com a presente invenção podem ter um bm1 ou outro fenótipo de lignina reduzida. Como será apreciado por aqueles versados na técnica, produtos de planta derivados de tais plantas podem pode ser esperados ter características de distinção de uma planta do tipo selvagem da mesma variedade, cujas características de distinção podem ser desejáveis. Desse modo, qualquer uso de uma planta compreendendo um gene CAD2 mutante de acordo com a presente invenção que tira vantagem de um bm1 ou outro fenótipo de Lignina reduzida esperado em uma planta está no escopo da invenção.
[00190] Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar certos aspectos e/ou modalidades particulares. Os exemplos não devem ser construídos para limitar a invenção aos aspectos ou modalidades particulares exemplificados.
EXEMPLOS Exemplo 1: Clonagem e sequenciamento de genes CAD2 a partir de duas linhagens de bm1
[00191] Amostras de folha de milho de linhagens inatas 515Dbm1 (bm1 mutante), 6XN442 (tipo selvagem), e DASbm1 foram usadas. DASbm1 é um mutante de bmr de ocorrência natural, novo descoberto em uma base genética CV5123/GR8207. A geração de F1 original a partir do qual a mutação de DASbm1 originada foi criada em um bloco de cruzamento de reprodução no versão de 2003 usando GR8207 como o macho, e cruzando-o a CV5123 fêmea. Este cruzamento foi autopolinizada na sementeira de inverno de 2003 e as espigas de F2 foram em seguida avolumadas para gerar sementes de F2. A população de F2 foi plantada no verão de 2004, e 60 espigas autopolinizadas foram selecionadas antecipadamente no teste de grão. Estas 60 espigas foram enviadas para sementeira de inverno em 2004 para autopolinização para criar uma seleção de espiga S2 contínua. As espigas de S2 foram em seguida plantadas na sementeira de verão de 2006.
[00192] A descoberta de um mutante de bmr foi feita ao mesmo tempo em que caminhando na sementeira olhando em linhagens inatas. Uma fileira mostrando um fenótipo de BMR pronunciado foi identificada. Esta fileira foi de 31 das 60 espigas selecionadas da população de CV5123/GR8207-B, e mostrou semelhança muito próxima em estrutura de planta às outras 59 espigas selecionadas exceto quanto tendo a característica de BMR. Ela não poderia inicialmente ser determinada se o mutante fosse um bm3, bm1, ou outra mutação. Plantas S2 foram em seguida autopolinizadas, e as sementes foram coletadas e recuperadas. No verão de 2007, as sementes de S3 foram plantadas, e todas as plantas ainda mostraram a característica de BMR. As plantas S3 foram autopolinizadas para criar S4 espigas, e a linhagem foi observada como de possível interesse para produção de ensilagem. No verão de 2008, cruzamentos teste foram feitos tanto para linhagens inatas de bm1 quanto bm3 conhecidas para determinar a base do mutante de bmr. No verão de 2009, as sementes de cruzamento teste foram desenvolvidas em um teste de progênie, e foi determinada a mutação que foi uma nova mutação de bm1, como todas as plantas no teste de progênie com o bm1 inato expresso na característica de BMR, ao mesmo tempo em que a progênie de bm3 mostrou todas as plantas serem não BMR. Tecidos de folhas foram em seguida amostrados a partir do CV5123/GR8207 NIL, 515Dbm1 inato, bem como as plantas heterozigotas e nulas de várias bases genéticas, e submetidos à análise genética molecular incluindo preparação marcadora para determinar a natureza exata de DASbm1 bmr mutante.
[00193] Amostras de folha de milho foram moídas em um pó fino usando o Genogrinder 2000 (SPEX CertiPrep, Metuchen, NJ). DNA foi extraído com um protocolo de extração de DNA de CTAB a 25% (brometo de trimetilamônio de cetila) padrão. Antes de PCR, as amostras de DNA foram quantificadas com Kit de quantificação Quant-it PicoGreen (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante.
[00194] A sequência de CAD2 genômica, de linhagem de milho inata, Milho B73, foi recuperada de Genbank (Genbank Acesso n° AC230031). Esta sequência foi de aproximadamente 5,9 kb em comprimento e incluía um promotor de 1.7 kb, quatro exons, três íntrons e um terminador curto. Os iniciadores foram designados com base na sequência B73, e uma reação de PCR foi realizada usando o ABI GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). As reações continham 2,5 unidades de TaKaRa LA Taq (Takara Bio Inc., Shiga, Japão), 400 nM de dNTP, 200 nM de iniciador dianteiro e reverso, e 30 ng de DNA genômico. O seguinte programa de PCR foi usado: PCR iniciou com uma etapa de desnaturação de 2 minutos a 94 °C; seguido por 30 ciclos de 94 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 45 segundos e 72 °C durante 2 minutos. Os produtos de PCR foram visualizados em um 2% E-Gel e em seguida extraídos usando kit de extração de gel rápida PURELINK™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Produtos de PCR purificados foram em seguida enviados para Eurofins MWG Operon (Huntsville, AL) para sequenciamento direto. As sequências foram analisadas usando Sequencher 4.8 (Ann Arbor, MI). As mutações foram identificadas comparando-se as sequências de CAD2 amplificadas a partir de mutantes de bmr e 6XN442 à sequência listada para Milho B73.
[00195] Devido à presença de três íntros bem grande e alguns aspectos de sequência não usuais (por exemplo, uma repetição simples 82 bp TA no íntron 3), as tentativas iniciais para amplificar o gene CAD2 em um fragmento de 5.9 kb falharam. Consequentemente, uma série de iniciadores de PCR aninhados foi designada (veja, Tabela 1) e usada para amplificar de forma bem sucedida sete fragmentos de CDA2 de sobreposição de 515Dbm1 e a linhagem do tipo selvagem. Figura 1. Sequências de CDA2 de tamanho natural para 515Dbm1 e a linhagem do tipo selvagem foram agrupadas a partir dos sete fragmentos. Sequências de proteína e cDNA preditas, genômicas para 515Dbm1 e 4XN442 são listadas como SEQ ID NO: 1-6.Tabela 1. Informação de iniciador e comprimento par aos sete fragmentos de PCR de CAD2 genômicos de sobreposição.
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[00196] Uma comparação de mutante de 515Dbm1 de CAD2 com aquele do tipo selvagem (6XN442) e bm1 (B73) descreveu a presença de 15 SNPs e oito inserções/deleções. A maioria destas mudanças foram localizadas na rgião iniciadora ou íntrons, com a exceção de uma inserção de di-nucleotídeo AC (nucleotídeo 3994-3995 in 515Dbm1) localizada no exon 3 do mutante de bm1, e a G/A SNP (nucleotídeo 5410 in 515Dbm1) localizada no 4° exon. Vide, as figuras 3 e 4. A inserção de AC em 515Dbm1 cria uma mudança de estrutura e um códon STOP prematuro 52-bp a jusante da inserção que resultou em uma proteína de CAD2 muito curta (147 aminoácidos para 515Dbm1 CAD2, versus 367 aminoácidos para CAD2 do tipo selvagem. Figura 4. A proteína de CADC de 515Dbm1 truncada é mais provavelmente não funcional mesmo se ela for produzida, porque ela não possui a ligação de NADPH e domínios catalíticos de terminal C.
[00197] Os mesmos sete pares de iniciador mostrados na tabela 1 foram usados para tentativa de amplificar os fragmentos de CAD2 de sobreposição de DASbm1, e 6 pares amplificaram os fragmentos esperados. Entretanto, o par de F5/R5 falhou em amplificar o fragmento 3327-bp esperado, ou ainda quaisquer produto de PCR específicos, mesmo após múltiplas tentativas. Portanto, iniciadores de PCR aninhados adicionais foram designados (veja, Tabela 2), e usados para amplificar de forma bem sucedida a 2757 de extremidade 5’ do fragmento 3327-bp ausente. Entretanto, fomos incapazes de amplificar a extremidade 3’ (aproximadamente 570 bp) usando a maioria dos pares de iniciadores e condições de PCR. Com a exceção do gap de 570-bp ausente, a sequência genômica de CAD2 de 5346-bp amplificado de DASbm1 é idêntica àquela de B73. Suspeitamos que esta foi a região que continha mudança moleculares para o fenótipo BMR.Tabela 2. Iniciadores para a extremidade 5’ de um fragmento de PCR de CAD2 genômico de DASbml ausente.
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[00198] Os iniciadores que abrangem o exon e o exon 3 preditos foram designados (CVF: GTCCGAGAGGAAGGTGGTC (SEQ ID NO:35); e CVR: GGCCGTCCATCAGTGTAGA (SEQ ID NO:36)), e em  seguida usados para amplificar um fragmento de cDNA de cDNA de CAD2 de DASbm1, 515Dbm1 e 6XN442. Como esperado, um fragmento de 375-bp foi amplificado de 515Dbm1 e 6XN442. Por outro lado, o produto de PCR de DASbm1 foi descoberto ser significantemente maior. Resultados de sequenciamento revelaram que o cDNA de CAD2 de DASbm1 contém uma inserção de 409-bp extra entre o exon 1 e exon 2 endógenos. Figura 4. Uma pesquisa de BLAST contra o genoma B73 sugeriu que a inserção 409-bp de cDNA em DASbm1 é mais provável resultar de ligação de RNA de parte de um gene transponível/repetitivo (GRMZM2G017736) localizado em cromossoma 1 que contém diversos íntrons.
[00199] Com base na inserção de cDNA de 409-bp observada em DASbm1 e sua fonte provavelmente genômica, iniciadores de PCR adicionais foram designados (veja, Tabela 3), e usados para amplificar a região genômica quimérica de CAD2 de DASbm1. Figura 1. Os resultados de sequenciamento revelam que a inserção genômica é 3444-bp em comprimento, e o CAD2 genômico total amplificado de DASbm1 é 9360 bp. O alinhamento de CAD2 genômico de DASbm1, B73, 515Dbm1, e 6XN442 é mostrado na figura 3, com a exceção da inserção de 3444-bp, a sequência de CAD2 restante de DASbm1 é idêntica àquela de B73. A inserção transponível de 3444-bp DASbm1é mencionada aqui como SEQ ID NO: 40. Tabela 3. Iniciadores de PCR para região genômica quimérica de CAD2 de DASbml.
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Natureza genômica da inserção em DASbml.
[00200] Como mostrado na figura 2, o sítio de inserção em DASbm1 é localizado no íntron 1 endógeno de CAD2. Um exame mais íntimo da sequência de 3444-bp de inserção descreveu que as últimas 11 bases, com a sequência TACTGATATCT (SEQ ID NO:41) foi uma duplicação direta de uma sequência de 11-bp de íntron 1 de CAD2 localizado imediatamente da inserção. Figura 2. Estas repetições diretas indicam que a inserção é provável devido às atividades transponíveis de DNA.
[00201] Resultados de pesquisa de BLAST usando a inserção de 3433-bp (sem a repetição direta de 11-bp) contra as sequências de genoma B73 mostraram numerosos hits homólogos em diferentes cromossomas, indicando a natureza de repetição da sequência. Entretanto, apenas um hit no cromossoma 1 (Milho B73 RefGen_v1, posições de nucleotídeo 148086176 -148089850) é 100% idêntico além do comprimento total, com a exceção de um gap ausente de 242-bp na inserção de DASbm1. Figura 4. Outros hits são menos do que 100% idênticos, e apenas uma parte de pareamento da inserção. Visto que o CAD2 está localizado no cromossoma 5, a inserção de DASbm1 é mais provavelmente exercida a partir de sua localização original no cromossoma 1 e re-inserida em CAD2 por meio de atividades de transposon. O gap ausente de 242-bp pode refletir a diferença entre os genomas B73 e DASbm1 (CV5123/GR8207), ou ele pode ser devido à deleção durante a transposição.
[00202] Um gene predito (GRMZM2G017736) é localizado na sequência de inserção de 3433-bp e é aparentemente transcrito em plantas de milho normal, visto que quite bem poucos ESTs de tamanho natural correspondentes (por exemplo, EU976746 e EU976335) são encontrados nos bancos de dados. O ORF predito em GRMZM2G017736 codifica uma pequena proteína de 167 aminoácidos que mostram graus elevados de homologia com a maioria da família de hAT (após hobo de Drosofila, Ac de milho, e Tam3 de boca-de-leão) de transposases que são geralmente proteínas maiores. Porque a proteína de aminoácido 167 não tem o domínio de ligação de DNA de ligador de zinco (Pfam02892) normalmente encontrados nas transposases de tamanho natural, o fragmento 3433-bp é mais provavelmente um elemento de Ds que requer a presença de um elemento de Ac em qualquer outra parte para transposição.
[00203] Visto que no local de CAD2 no cromossoma 5, a inserção e CAD2 formam um gene quimérico. A inserção é ligada nos 3 exons de 409-bp e forma um mRNA quimérico com exons de CAD2 endógenos. Figuras 2 e 4. O primeiro fragmento de 1158-bp da inserção são ligada juntamente com o 927bp de extremidade 5’ do primeiro íntron de CAD2 como um íntron quimérico, o ORF predito total de GRMZM2G017736 é ligado como uma parte de um íntron de 1204-bp, e o último fragmento de 463-bp da inserção é ligado juntamente com 231 bp de extremidade 3’ do primeiro íntron CAD2 como um íntron quimérico. Figura 2.
A inserção de transposon cria um STOP prematura em CDA2 de DASbml
[00204] Como acima descrito, a inserção de transposon em DASbm1 cria um gene quimérico que é transcrito como um mRNA quimérico com um 409 bp extra entre o exon1 e exon 2 de CAD2 endógeno. Figura 4. Esta sequência de 409-bp extra é predito para criar uma mudança de estrutura e um códon de STOP prematuro que resulta em uma proteína de CAD2 muito mais curta de apenas 48 aminoácidos (vs. 367 aminoácidos para a proteína do tipo selvagem). Figura 5. Similar à proteína de CAD2 truncada de 515Dbm1, o CAD2 de DASbm1 de 48 aminoácidos é mais provavelmente não funcionais mesmo se ela for produzida, por que ele não tem a ligação de NADPH e domínios catalíticos de terminal C.
Exemplo 2: projeto e validação de produtividade elevada com base em PCR específico de Alelo de CAD2.
[00205] Um ensaio de KASPar™ foi designado na inserção de AC no exon 3 de 515Dbm1 ZmCAD2 para distinguir o alelo mutante do alelo do tipo selvagem. Trinta e duas linhagens inatas do tipo selvagem, sem a mutação de bm1, bem como populações de segregação contendo a mutação de bm1, foram testadas seguindo um protocolo obtido do fabricante (KBioSciences, Hoddesdon, Hertfordshire, UK).
[00206] Com base nas sequências circundando a inserção de AC, três oligos foram designados (SEQ ID NO:42 (AC_R1);TCAGTCTCAAGAACTCACTTCTGG, SEQ ID NO: 43 (AC_A1); GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTGATGGACGGCCCACA e SEQ ID NO: 44 (AC_A2); GAAGGTCGGAGTCAACGGATT ACTGATGGACGGCCCACG) para um ensaio marcador de KASPar™ de produtividade elevada que pode ser usado para diferenciar o alelo de CAD2 de 515Dbm1 de outros alelos de CAD2 do tipo selvagem e bm1. Figura 8.
[00207] O ensaio KASPar™ foi primeiro validado com um painel de 32 tipos de inatos selvagens e a linhagem de mutante de bm1, 515Dbm1. Esta análise indicou que as linhagens de não bm1 não conteria a inserção de AC. O ensaio foi em seguida validado em populações de segregação de linhagens de milho bm1 que possuíam um de três genótipos: homozigota do tipo selvagem; bm1 homozigota (contendo a inserção de AC de 515Dbm1); e heterozigota. Figura 9. O marcador de KASPar detectou a inserção de AC de bm1 nas populações de bm1 homozigotas e heterozigotas. Entretanto, este ensaio de produtividade elevada distinguiu as populações de bm1 homozigotas, heterozigotas, e homozigotas do tipo selvagem umas das outras. Como tal, marcadores tais como estes podem ser usados para fornecer rapidamente uma identificação exata de zigosidade para o genótipo de bm1 em plantas suspeitas de conter bm1 de 515Dbm1. O ensaio pode, portanto, ser usado para a identificação de germoplasma de bm1, acelerando a introgressão da característica de bm1 e reprodução molecular usando bm1 para melhorar a digestibilidade de ensilagem ou aumentar a produção de etanol.
[00208] Também desenvolvemos novos ensaios de TaqMan™ para discriminar entre todos os alelos de DASbm1, 515Dbm1, e CAD2 do tipo selvagem. Iniciadores e sondas que foram usados para DASbm1 e 515Dbm1 são listados na Tabela 4 e Tabela 5, respectivamente. Por que DASbm1 tem uma grande inserção de transposon, iniciadores dianteiros separados para DASbm1 (DASbm1_F) e do tipo selvagem (Wt CAD2_F) foram designados de modo que os produtos de PCR apropriados sejam amplificados sob as condições de ensaio TaqMan™ padrão. Com base na inserção de transposon em DASbm1, inserção de AC em 515Dbm1, e sequência de CAD2 do tipo selvagem, iniciadores e sondas para ensaios TaqMan™ foram designados usando Primer Express 3.0. Iniciadores e sondas rotuladas duais com FAM ou VIC e tinturas Minor Grove Binding Non Fluorescence Quencher™ I (MGBNFQ) foram sintetizados por Applied Biosystems (Foster City, CA). Oligos foram dissolvidos em 1x Tris-EDTA para 100 μM. Mistura mestre de genotipagem TaqMan™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, Catálogo # 4371355) foi usado para todas as reações de PCR. Reações de PCR de tempo real em 25 μl de volume foram estabelecidas usando uma placa de 96 cavidades em um sistema ótico iCycler™ (BioRad, Hercules, CA) iniciando com 15 minutos de desnaturação a 95 °C como recomendado, seguido por 50 ciclos de 92 °C durante 15 segundos, e 60 °C durante 1 minuto. Sinais de fluorescência foram registrados no final de cada ciclo.Tabela 4. Iniciadores e sondas para ensaios TaqMan™ para discriminar DASbml e do tipo selvagem.
Figure img0005
Tabela 5. Iniciadores e sondas para ensaios TaqMan™ para discriminar 515Dbm1 e e do tipo selvagem.
Figure img0006
[00209] Os resultados de ensaios de discriminação alélica usando os iniciadores mencionados nas tabelas 4 e 5 são mostrados na figura 10. Porque estes ensaios e marcadores KASPar™ são baseados diretamente em mutações de bm1 em CAD2, eles fornecerão genotipagem mais exata do que marcadores de bm1 indiretos disponíveis.
Exemplo 3: Características de milho bm1 com truncamento de mutações de CAD2
[00210] Por que DASbm1 representa uma nova mutação de bm1, nada é conhecido sobre DASbm1, exceto que tem um fenótipo de BMR. Decidimos investigar os níveis de expressão de RNA e teores de Lignina em plantas de DASbm1, e compará-los àqueles de plantas 515Dbm1 e do tipo selvagem (6XN442). Esperou-se que as plantas 515Dbm1 e DASbm1 tivessem atividades de CAD significantemente reduzidas devido à mutações no gene CAD2s destas duas linhagens de milho, e o término prematuro consequente de CAD2. Além disso, plantas 515Dbm1 e DASbm1 foram supostas ter abundância de transcrição de CAD2 reduzida.
[00211] As plantas DASbm1, 515Dbm1, e 6XN442 foram desenvolvidas em uma estufa. Tecidos de folha foram colhidos de plantas de quatro semanas de idade e tecidos de midrib foram separados. As amostras foram moídas em pó fino em nitrogênio líquido e extraídas com mini kit de planta Qiagen's RNeasy™. Kit SuperScript™ III One-Step RT-PCR de Invitrogen e BioRad's iCycler™ foram usados por RT-PCR quantitativa para determinar os níveis de expressão de RNA. Oligos específicos de CAD2 foram designados com base no quarto exon de CAD2, e milho invertase foi usado como um controle para o cálculo de Delta-Delta CT.
[00212] Para comparar os níveis de expressão de RNA de CAD2, os seguintes iniciadores/sondas com base no quarto exon de CAD2 e milho invertase foram designados por RT-PCR quantitativa. Tabela 6. Tabela 6. Iniciadores e sondas para CAD2 qRT-PCR.
Figure img0007
[00213] Como mostrado na figura 6, plantas bm1 têm nível muito mais elevado de expressão de CAD2 do que o resto dos tecidos de folha independente da mutação subjacente. As diferenças são de 4,1, 8,0, e 3,4 vezes para 6XN442, 515Dbm1, e DASbm1, respectivamente. Tanto linhagens de DASbm1 quanto 515Dbm1 têm significantemente menos expressão de CAD2, com uma redução média de 91% no midrib, e 89% na folha, para DASbm1; e 87% no midrib, e 93% na folha, para 515Dbm1. Entretanto, não existe nenhuma diferença significante entre os dois mutantes de bm1. Figura 6. Estes resultados são consistentes com o que foi reportado na literatura para Milho Bm1 (Halpin e outro, (1998), supra), bem como mutante de sorgo, bmr6 (Saballos e outro, (2009), supra). A redução na expressão de RNA é mais provável devido á degradação de RNA mediada por mutações de não sentido que criam proteínas de CAD2 prematuras nos mutantes de 515Dbm1 e DASbm1, um mecanismo já observado em plantas e outras espécies. Conti e Izaurralde (2005) Curr Opin Cell Biol. 17:316-25.
[00214] Para comparar os teores de Lignina relativos de plantas mutantes e do tipo selvagem, folhas moídas e internodes foram submetidos à análise de espectroscopia de FTIR.
[00215] Avaliações de infravermelho de transformação Fourier foram realizadas usando espectrômetro Bruker Vertex (Bruker Optics Inc, 19 Fortune Drive, Manning Park, Billerica MA 01821), com um acessório de amostragem de Milagre de Refletância Total Atenuada (ATR) com cristal de diamante (Pike Technologies, Madison , WI ). O espectrômetro é equipado com um detector de sulfato de triglicina deuterado (DTGS), operando em resolução de 4 cm-1 e velocidade de espelho de 0,32 cm/s. duzentos e cinquenta e seis interferogramas foram co-adicionados antes da transformação Fourier. O instrumento foi deixado purgar durante 5 minutos com gás de nitrogênio (grau 1) antes da aquisição de espectros para minimizar a contribuição devido o dióxido de carbono atmosférico e vapor de água. O acessório de amostragem de célula Milagre ATR tem um diamante de bounce único designado para uso no espectrômetro de FTIR. A profundidade de penetração de feixe de infravermelho é de é 1,46 mícrons. Uma vantagem principal deste acessório é que ele requer volumes de amostra menores em comparação ao acessório HATR acessório de HATR de bounce múltiplo.
[00216] Folhas (7a, 8a, 9a e 10 a) e internodes (1° e 2°, 7°, 8°, 9° e 10°) foram coletados de plantas de milho desenvolvidas em estufa após ficar sedosas, liofilizadas, e moídas em pós finos. Uma pequena porção das amostras foi colocada diretamente no cristal de diamante de ATR para a aquisição de dados. Os espectros foram coletados na região de impressão digital de 800-1800 cm-1. Espectros de feixe individual de todas as amostras foram obtidos, e dados espectrais são apresentados como a relação do espectro de base de ar e unidades de absorção. Após cada avaliação, cristal de ATR foi completamente limpo e secado, e seu espectro foi examinado para garantir que os resíduos de amostra da aquisição anterior não fossem mantidos na superfície de cristal. Todos os espectros foram corrigidos na base e área normalizada para eliminar quaisquer artefatos espectrais.
[00217] Os teores de lignina nas amostras são diretamente proporcionais à absorção relativa de FTIR. Como esperado, a redução em expressão de CAD2 RNA em ambos os mutantes resulta nos teores de lignina significantemente reduzidos. Figura 7. Em média, a redução de teor de lignina total foi de aproximadamente 24% em DASbm1 (P=0,03) e 30% em 515Dbm1 (P=0,006) quando comparada ao 6XN442 do tipo selvagem. Não existe nenhuma diferença significante entre os dois mutantes de bm1 (P=0.4).
[00218] Mutações de bm1 em milho exibem uma pigmentação marrom avermelhado do midrib de folha associado com teor de lignina significantemente reduzido e composição de Lignina alterada. Este fenótipo é visível de V6 até estágios posteriores em folhas e outros tecidos recentemente desenvolvidos. Identificamos recentemente as bases moleculares de dois mutantes de bm1 independentes (DASbm1 e 515Dbm1). Com base nas mutações específicas, desenvolvemos também ensaios de PCR de produtividade elevada para detecção de alelos diferentes. Os resultados antecedentes demostram que ZmCAD2 é o gene subjacente para a mutação de bm1 em 515Dbm1 e DASbm1, e fornecem uma base molecular para o fenótipo observado. Por que as mutações de bmr são comuns entre muitas espécies de monocotilédone, as mutações descritas acima e marcadores podem também ser usados em outras colheitas; por exemplo, sorgo, cana-de- açúcar, milho miúdo, arroz, e espécie de bioenergia tal como grama de manobra.
Exemplo 4: midrib 1 marrom (bm1) como um marcador selecionável visual para transgenes.
[00219] Tecnologia de Precisão Exata é uma tecnologia de engenharia de ligador de zinco que foi mostrado alvejar precisamente qualquer sequência de DNA e modificar exatamente o genoma através da ruptura de gene, edição ou adição de gene. Com base em Tecnologia de Precisão Exata e descobertas recentes de bm1, dois métodos alternativos podem ser implementados para criar um marcador selecionável visual para diferenciar plantas transgênicas de seus segregantes nulos. Um marcador visual possibilitará os criadores e cientistas no campo identificar rapidamente indivíduos transgênicos em uma população de segregação (T1, por exemplo) e compará-los aos nulos sem detalhar o trabalho molecular e apressar o processo de avaliação de pipelina transgênica. Ensaios de produtividade elevada são também disponíveis e podem ser usados para confirmar a observação visual se necessário.
[00220] No primeiro método representativo, mutante de milho bm1 (DASbm1 ou 515Dbm1) pode ser usado como o germoplasma alvo para transformação. Através de reprodução molecular, a mutação de bm1 pode ser introduzida em germoplasma de transformação atual (B104) usando marcadores com base em CAD2. Um CAD2 de Wt e um gene de interesse (GOI) na mesma construção são alvejados para o local de CAD2 endógeno mutante por Tecnologia de Precisão Exata. Por que a mutação de bm1 é recessiva, plantas homozigotas para GOI-WtCAD2 ou heterozigotas têm pigmentação normal visto que os segregantes nulos têm fenótipo midrib marrom. Isto também funciona sem Tecnologia de Precisão Exata, porém inserção de no genoma é aleatória. Uma modalidade alternativa inclui engenharia de uma ou mais proteínas de ligador de zinco que deletam a inserção de transposon em DASbm1 ou a inserção de AC em 515Dbm1 no local de CDA2 mutante endógeno e ao mesmo tempo inserem o GOI into a nearby locus (para prevenir a segregação significante de GOI e marcador de bm1). Isto elimina a necessidade de um CAD2 de Wt na construção transgênica. [00221] Em um segundo método representativo, plantas Wt são usadas como o germoplasma alvo para a transformação. O GOI pode ser alvejado para o local de CAD2 de Wt usando Tecnologia de Precisão Exata. O sítio de inserção pode ser o mesmo como a inserção de transposon em DASbm1, inserção de AC em 515Dbm1 ou qualquer posição do local de CAD2 que produz a proteína não funcional (domínios funcionais de CAD2 bem conhecidos). Neste caso plantas homozigotas para transgene têm fenótipo de midrib marrom visto que heterozigotas e nulos têm pigmentação normal. Fenótipos de midrib marrom e associados são benéficos e Tecnologia de Precisão Exata podem ser usados para alvejar os locais de bm1 (CAD2) e/ou BM3 (O-Metiltransferase de ácido cafeico).

Claims (15)

1. Método de fazer silagem de milho não transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende a. colheita e processamento de plantas de milho não transgênica compreendendo uma sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 23; e b. ensilagem e fermentação da planta de milho colhida e processada para produzir silagem.
2. Método para identificar uma planta de milho não transgênica compreendendo um gene de álcool cinamílico desidrogenase 2 (CAD2) mutante, caracterizado pelo fato de que compreende: isolar moléculas de ácido nucleico de uma planta de milho não transgênica; e avaliar as moléculas de ácido nucleico isoladas para um gene CAD2 mutante compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 23.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico codifica SEQ ID NO: 25.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que avaliar as moléculas de ácido nucleico compreende a reação em cadeia de polimerase.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que avaliar as moléculas de ácido nucleico compreende a reação em cadeia de polimerase.
6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que reação de cadeia de polimerase é realizada usando pelo menos dois iniciadores que são capazes de especificamente hibridizar à SEQ ID NO: 1.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que os iniciadores compreendem iniciadores selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, e SEQ ID NO: 55.
8. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a reação em cadeia de polimerase é realizada com pelos menos dois iniciadores selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, e SEQ ID NO: 50.
9. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido nucleico codifica SEQ ID NO: 3.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que avaliar as moléculas de ácido nucleico compreende a reação de cadeia de polimerase.
11. Método de alimentação de um animal alimentado com ensilagem, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer ensilagem de milho não transgênico produzida como definido na reivindicação 1; e alimentar o animal com a ensilagem produzida da planta de milho como definida na reivindicação 1.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o animal alimentado com ensilagem é um ruminante.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o animal alimentado com ensilagem é uma vaca.
14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a ensilagem é mais de 15% da matéria seca da dieta do animal.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a ensilagem pelo menos 25% da matéria seca da dieta do animal.
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