KR20140020867A - 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체 - Google Patents

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KR20140020867A
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마모루 타카이시
타스쿠 이시다
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에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, Aβ 생산 저해 효과 및 BACE1 저해 효과를 가지며, 알츠하이머형 치매로 대표되는 Aβ에 의해 초래되는 신경퇴행성 질환의 예방학적 또는 치료학적 제제로서 유용한, 식 (I)의 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:
Figure pct00047

상기 식 (I)에서,
X는 수소 또는 불소이고;
R은 모노플루오로메틸 또는 디플루오로메틸이다.

Description

융합된 아미노디하이드로티아진 유도체 {FUSED AMINODIHYDROTHIAZINE DERIVATIVES}
본 발명은 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체 및 이의 약제학적 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 아밀로이드-β (이하, Aβ라고 함) 단백질에 대한 생산 저해 효과 또는 베타-사이트 아밀로이드-β 전구체 단백질 절단 효소 1 (이하, BACE1 또는 β-세크리타제라 함)에 대한 저해 효과를 가지며, Aβ 단백질에 의해 야기되는 신경퇴행성 질환, 특히, 알츠하이머형 치매, 다운 증후군 등을 치료하는데 효과적인, 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체, 및 활성 성분으로서 상기 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머 질환은 신경의 변성 및 소실과 더불어 노인반 및 신경섬유다발의 형성을 특징으로 하는 질환이다. 현재, 알츠하이머 질환은 아세틸콜린 에스테라제 저해제로 대표되는 증상 개선제를 이용한 대증 요법으로만 치료되고 있으며, 질병의 진행을 억제하는 근본적인 요법은 아직 개발되지 않았다. 알츠하이머 질환의 근본적인 요법을 창출하기 위해서는 질환의 발병 요인을 방제하기 위한 방법이 개발되어야 된다.
Aβ-단백질은 아밀로이드 전구체 단백질 (이하, APP라 함)의 절단 산물로서, 신경의 변성과 소실, 및 치매 증상의 발병에 크게 관여하는 것으로 추측된다. Aβ-단백질로는, 주성분으로서, 아미노산 40개로 이루어진 Aβ40과 C-말단에 2개의 아미노산이 추가된 Aβ42이 있다. Aβ40과 Aβ42는 응집되는 경향이 강하며, 노인반의 주요 구성 성분인 것으로 알려져 있다. 아울러, 가족형 알츠하이머 질환에서 관찰되는 APP 및 프레세닐린 유전자 (presenilin gene)의 변이가, Aβ40 및 Aβ42를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, Aβ40 및 Aβ42의 생성을 감소시키는 화합물은, 알츠하이머 질환의 진행 저해제 또는 예방제로서 기대된다.
Aβ는 APP가 β-세크레타제(BACE1)에 의해 절단된 다음 γ-세크레타제에 의해 절단되어 생성된다. 이러한 이유로, Aβ 생성을 낮추기 위해, γ-세크레타제와 β-세크레타제의 저해제를 만들고자 하는 시도가 이루어지고 있다.
공개된 국제 특허 출원 WO2011/005738 (Eli Lilly and Company)에서는 식 (A)의 화합물과 이의 BACE 저해제로서의 용도가 개시되어 있다:
Figure pct00001
상기 식 (A)에서, R1, R2, R3, X, m, n 및 p는 상기 특허 공개 문헌에 정의되어 있다.
식 (B)의 융합된 아미노디하이드로티아진 화합물은 공개된 국제 특허 출원 WO2009/091016 (Eisai R&D Management Co., Ltd.)에 이미 개시된 바 있다:
Figure pct00002
상기 식 (B)에서, 고리 A는 C6-14 아릴기 등이고; L은 -NReCO- [여기에서, Re는 수소 원자 등임] 등이고; 고리 B는 C6-14 아릴기 등이고; X는 C1-3 알킬렌기 등이고; Y는 단일 결합 등이고; Z는 C1-3 알킬렌기 등이고; R1 및 R2은 독립적으로 수소 원자 등이고; R3, R4, R5 및 R6는 독립적으로 수소 원자, 할로겐 원자 등이다.
아울러, 식 (C)의 융합된 아미노디하이드로티아진 화합물도 공개된 국제 특허 출원 WO2010/038686 (Eisai R&D Management Co., Ltd.)에 개시된 바 있다:
Figure pct00003
상기 식에서, 고리 A는 C6-14 아릴기 등이고; L은 -NReCO- [여기에서, Re는 수소 원자 등임] 등이고; 고리 B는 C6-14 아릴기 등이고; X는 C1-3 알킬렌기 등이고; Y는 단일 결합 등이고; Z는 산소 원자 등이고; R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 원자 등이고; 및 R3, R4, R5 및 R6는 각각 독립적으로는 수소 원자, 할로겐 원자 등이다.
본 발명은 WO2009/091016에 개시된 화합물 군 (genus)으로부터 선택된다.
본 발명의 과제는 Aβ 생산 저해 효과 또는 BACE1 저해 효과를 가지며, Aβ에 의해 야기되는 신경퇴행성 질환, 대표적으로 알츠하이머형 치매에 대한 예방학적 제제 또는 치료학적 제제로서 유용한, 추가적인 화합물, 즉, 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체를 제공하는 것이다.
이에, 본 발명은 식 (I)의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
Figure pct00004
상기 식 (I)에서,
X는 수소 또는 불소이고;
R은 모노플루오로메틸 또는 디플루오로메틸이다.
본 발명의 일 구현예에서, X는 수소이다.
본 발명의 다른 구현예에서, R은 모노플루오로메틸이다.
본 발명의 구체적인 화합물은 다음과 같다:
N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4,5-디플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드:
Figure pct00005
;
N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4-플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드:
Figure pct00006
;
N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4-플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드:
Figure pct00007
;
N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4,5-디플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드:
Figure pct00008
;
및 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
일 구현예에서, 본 발명은 N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4-플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 화합물을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4,5-디플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 화합물을 제공한다.
식 (I)의 화합물은 특정 이성체로 한정되지 않으며, 모든 가능한 이성체 (예, 케토-에놀 이성체, 이민-엔아민 이성체, 부분입체이성체 및 로타머(rotamer)) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 식 (I)의 화합물은 아래 호변이성체들을 포함한다:
Figure pct00009
본 발명의 화합물은 식 (I)에서 테트라하이드로퓨로-티아지닐 고리에 위치한 키랄 센터 3개를 포함한다. 이들 키랄 센터 각각에서의 입체 화학 배위는, 바람직하게는 S이며, 즉, 이들은 (4aS,5S,7aS) 입체이성체들이다. 의심의 여지를 피하기 위해, 본 발명의 (4aS,5S,7aS) 입체이성체들은 다른 가능한 입체이성체들 중 하나 이상과의 혼합으로서, 예컨대 라세믹 혼합물로서 존재할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 (4aS,5S,7aS) 키랄 센터들에서 입체화학적으로 순수한 식 (I)의 화합물을 제공한다. 본 발명의 설명에서, 용어 입체화학적으로 순수한은 (4aS,5S,7aS) 입체이성체가 80 중량% 이상이고, 기타 입체 이성체가 20 중량% 미만인 화합물을 지칭한다. 추가적인 구현예에서, 식 (I)의 화합물은 (4aS,5S,7aS) 입체이성체가 90 중량% 이상이고, 기타 입체 이성체가 10 중량% 미만이다. 다른 추가적인 구현예에서, 식 (I)의 화합물은 (4aS,5S,7aS) 입체이성체가 95 중량% 이상이고, 기타 입체 이성체가 5 중량% 미만이다. 또 다른 추가적인 구현예에서, 식 (I)의 화합물은 (4aS,5S,7aS) 입체이성체가 97 중량% 이상이고, 기타 입체 이성체가 3 중량% 미만이다.
본원에서, 화합물의 결정 다형체들이 존재할 수 있지만, 화합물은 이로 한정되지 않으며, 단결정 형태 또는 단결정 형태들의 혼합물로 존재할 수 있다. 화합물은 무수물 또는 수화물일 수 있다. 이들 임의의 형태들은 본원의 청구 범위에 포함된다.
또한, 본 발명은, 하나 이상의 원자가 자연에서 통상적으로 발견되는 원자 질량 또는 질량수와는 상이한 원자 질량 또는 질량수를 가진 원자로 치환된 것을 제외하고는, 식 (I)의 화합물과 동일한, 동위원소로 표지된 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 혼입될 수 있는 동위원소의 예로는, 수소, 탄소, 질소, 산소, 불소, 인, 염소, 테크네튬 및 요오드, 예컨대 2H, 3H, 11C, 14C, 13N, 15O, 18F, 32P, 99mTc, 123I 및 131I가 있다.
전술한 동위원소 및/또는 다른 원자의 다른 동위원소를 포함하는, 본 발명의 화합물 및 상기 화합물의 약제학적으로 허용가능한 유도체 (예, 염)도, 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 동위원소로 표지된 화합물, 예컨대, 3H 및/또는 14C와 같은 방사성 동위원소가 혼입된 화합물은, 약물 및/또는 기질 조직 분포 분석에 유용하다. 3H 및 14C는 제조 용이성과 검출성 때문에 유용한 것으로 간주된다. 11C, 15O와 18F 동위원소는 PET(양전자 방출 단층 촬영)에 유용한 것으로 간주되며, 99mTc, 123I 및 125I 동위원소는 SPECT(단일 광자 방출 단층 촬영)에 유용한 것으로 간주되는데, 이들 모두 뇌 촬영에 사용가능하다. 2H와 같이 좀더 무거운 동위원소로 치환하면, 보다 높은 대사 안정성, 예컨대 생체내 반감기 증가 또는 필요량 감소가 이루어지는 특정한 치료학적 이점이 있으므로, 일부 경우에서는 유용한 것으로 간주된다. 본 발명의 식 (I)의 동위원소 표지된 화합물들은 일반적으로 하기 방법 및/또는 실시예에 기술된 공정을 수행함으로써 동위원소 비표지된 반응물질을 쉽게 이용가능한 동위원소로 표지된 반응물질로 치환함으로써, 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 식 (I)의 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체는 약제학적으로 허용가능한 염일 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 Berge, Bighley and Monkhouse, J. Pharm. Sci., 1977, 766, 1-19에 기술된 것을 포함한다. 약제학적으로 허용가능한 염에 대한 구체적인 예로는, 무기산 염 (예, 설페이트, 나이트레이트, 퍼클로레이트, 포스페이트, 카보네이트, 바이카보네이트, 하이드로플루오라이드, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드 및 하이드로아이오다이드), 유기 카복실레이트 (예, 아세테이트, 옥살레이트, 말리에이트, 타르트레이트, 퓨마레이트, 사이트레이트, 말로네이트 및 락테이트), 유기 설포네이트 (예, 메탄설포네이트, 트리플루오로메탄설포네이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트 및 캄포설포네이트), 아미노산 염 (예, 아스파르테이트 및 글루타메이트), 4급 아민 염, 알칼리 금속 염 (예, 소듐 염 및 포타슘 염), 알카리 토금속 염 (예, 마그네슘 염 및 칼슘 염)이 있다.
본 발명에 따른 식 (I)의 화합물은 필요에 따라 통상적인 방법을 통해 약제학적으로 허용가능한 염으로 변환될 수 있다. 염은 전형적으로 유기 합성 화학 등의 분야에서 사용되는 방법들을 적절하게 조합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 방법에 대한 구체적인 예로는 본 발명의 화합물의 유리 용액(free solution)을 산성 용액으로 중화 적정하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 식 (I)의 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체 또는 약제학적으로 허용가능한 염은 이의 용매화물일 수 있다. 용매화물의 예는 수화물을 포함한다.
본 발명에 따른 식 (I)의 화합물은 화합물을 필요에 따라 자체 공지된 용매화물 생성 반응을 수행함으로써 용매화물로 변환될 수 있다.
본 발명은 치료(therapy)에 사용하기 위한 식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 추가로 제공한다.
본 발명에 따른, 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 우수한 Aβ 생산 저해 효과 또는 BACE1 저해 효과를 가지며, Aβ에 의해 야기되는 신경퇴행성 질환, 대표적으로 알츠하이머형 치매에 대한 예방학적 제제 또는 치료학적 제제로서 유용하다. 본 발명의 화합물은 Aβ40 및 Aβ42 둘다를 감소시킨다. 아울러, 본 발명의 화합물은 BACE 2 저해 효과를 가질 수 있다.
이에, 다른 측면에서, 본 발명은, 아밀로이드-β 단백질 생성을 저해하기 위한, 본 발명은 상기와 같이 정의되는 식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 베타-사이트 아밀로이드-β 전구체 단백질 절단 효소 1 (BACE 1)을 저해하기 위한, 상기와 같이 정의되는 식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한, 상기와 같이 정의되는 식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 신경퇴행성 질환의 예로는, 알츠하이머형 치매 (AD), 다운 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA), 가벼운 인지 장애 (MCI), 기억상실, 초로성 치매, 노인성 치매, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈 (hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis), 및 기타 퇴행성 치매, 예컨대 혼성 혈관 및 퇴행성 기원의 치매, 핵상 마비성 치매, 피질 기저 퇴행성 치매, 파킨슨 질환 (PD)성 치매 및 AD의 미만성 루이소체 타입의 치매를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머형 치매 (AD)이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 알츠하이머형 치매 (AD), 다운 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA), 가벼운 인지 장애 (MCI), 기억상실, 초로성 치매, 노인성 치매, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈, 및 기타 퇴행성 치매, 예컨대 혼성 혈관 및 퇴행성 기원의 치매, 핵상 마비성 치매, 피질 기저 퇴행성 치매, 파킨슨 질환 (PD)성 치매 및 AD의 미만성 루이소체 타입의 치매 등의 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제 제조에 있어서의, 상기와 같이 정의되는 식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머형 치매 또는 다운 증후군이다. 다른 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머형 치매 (AD)이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 알츠하이머형 치매 (AD), 다운 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA), 가벼운 인지 장애 (MCI), 기억상실, 초로성 치매, 노인성 치매, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈, 및 기타 퇴행성 치매, 예컨대 혼성 혈관 및 퇴행성 기원의 치매, 핵상 마비성 치매, 피질 기저 퇴행성 치매, 파킨슨 질환 (PD)성 치매 및 AD의 미만성 루이소체 타입의 치매와 같은, 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제 제조에 있어서의, 전술한 바와 같이 정의되는 식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머형 치매 (AD)이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 치료학적 또는 예방학적 유효량으로 증상을 앓고 있는 인간 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머형 치매 (AD), 다운 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA), 가벼운 인지 장애 (MCI), 기억상실, 초로성 치매, 노인성 치매, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈, 및 기타 퇴행성 치매, 예컨대 혼성 혈관 및 퇴행성 기원의 치매, 핵상 마비성 치매, 피질 기저 퇴행성 치매, 파킨슨 질환 (PD)성 치매 및 AD의 미만성 루이소체 타입의 치매와 같은, 신경퇴행성 질환을 치료 또는 예방하거나, 및/또는 아밀로이드-β 단백질의 생성을 저해하는 방법을 제공한다. 신경퇴행성 질환의 예로는 전술한 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머형 치매 (AD)이다. "유효량"은 개체에게 유익할 만큼 충분하거나, 또는 적어도 개체의 증상에 변화를 야기할 만큼 적어도 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 화합물에 의해 치료할 수 있는 추가적인 증상으로는, 2형 당뇨병, 크로이츠펠트-야콥병 (CJD), 말초 신경 손상, 말초 신경 병증, 진행성 핵상 마비, 뇌졸증, 근위축성 측색 경화증 (ALS), 자가면역 질환, 염증, 동맥혈전, 불안 장애, 정신 장애, 간질, 발작(seizures), 경련, 스트레스 장애, 혈관 아밀로이드증, 통증, 거스트만-슈트라우슬러-샤인커 증후군 (Gerstmann-Straeussler-Scheinker syndrome), 이질, 뇌병증, 척수 소뇌성 실조증 (spino cerebellar ataxia), 윌슨 질환, 그레이브 질환, 헌팅턴 질환, 휘플 질환, 코스트만 질환, 녹내장, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈, 아밀로이드증성 뇌출혈, 혈관 아밀로이드증, 뇌 염증, 취약 X 증후군 (fragile X syndrome), 뇌졸증(stroke), 투렛 증후군, 포함체 근육염 (inclusion body myositis), 스트레스 장애, 우울증, 조울증 및 강박 장애 (obsessive compulsive disorder)를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 2형 당뇨병을 치료하기 위한 전술한 바와 같이 정의되는 식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 추가로 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 2형 당뇨병을 치료 또는 예방하는 약제를 제조하기 위한 전술한 바와 같이 정의되는 식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도를 추가로 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 치료학적 또는 예?학적으로 유효한 양으로 증상을 앓고 있는 인간 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드-β 단백질의 생성을 저해하거나, 및/또는 2형 당뇨병을 치료 또는 예방하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여, 활성 성분으로서 전술한 바와 같이 정의되는 식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 조성물은 의도한 투여 방법에 따라 임의의 적합한 형태를 취할 수 있다. 이는, 예를 들어, 경구 투여용 정제, 캡슐 또는 액체 형태이거나, 또는 비경구 투여를 위한 용액 또는 현탁액일 수 있다.
본 발명에 따른 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 통상적인 방법에 의해 제형화할 수 있다. 투약 형태 (dosage form)에 대한 바람직한 예로는 정제, 필름 정제 및 당-코팅 정제 등의 코팅 정제, 미립제, 과립제, 산제, 캡슐제, 시럽제, 트로키제, 흡입제, 좌제, 주사제, 연고제, 점안제, 점비제, 점이제, 피부 접착 패치제(cataplasm) 및 로션제를 포함한다.
정제, 캡슐제, 과립제 및 산제와 같은 이들 고형 조제물은 통상적으로 본 발명에 따른 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 활성 성분으로서 0.01 - 100 wt%이고, 바람직하게는 0.1 - 100 wt%로 포함할 수 있다.
활성 성분은 약학 조제물에 대한 재료로서 통상적으로 사용되는 성분들을 혼합하고, 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 착색제 및 교정제 (corrective)를 첨가하고, 필요에 따라 예컨대 안정화제, 유화제, 흡수 촉진제, 계면 활성제, pH 조절제, 방부제 및 항산화제를 첨가하여, 통상적인 방법을 이용하여 조제할 수 있다. 이러한 성분의 예들로는 대두유, 우지, 합성 글리세라이드 등의 동식물성 오일; 액체 파라핀, 스쿠알랜, 고형 파라핀 등의 탄화수소; 미리스틴산 옥틸도데실, 미리스트산 이소프로필 등의 에스테르유; 세토스테아릴 알코올, 베헤닐알코올 등의 고급 알코올; 실리콘 수지; 실리콘유; 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세롤 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머 등의 계면활성제; 하이드록시에틸셀룰로스, 폴리아크릴산, 카르복시비닐 폴리머, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로스 등의 수용성 폴리머; 에탄올, 이소프로판올 등의 저급 알코올; 글리세롤, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨 등의 다가 알코올; 포도당, 자당 등의 당; 무수 규산, 규산 알루미늄 마그네슘, 규산 알루미늄 등의 무기 분말; 정제수 등을 들 수 있다. 부형제로서는, 예를 들면 유당, 옥수수 전분, 사카로스, 포도당, 만니톨, 소르비톨, 결정 셀룰로스, 이산화규소를 들 수 있다. 사용되는 결합제로서는, 예를 들면, 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 아라비안 검, 트라가칸트, 젤라틴, 셸락, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리프로필렌글리콜-폴리옥시에틸렌 블록 코폴리머 및 메글루민을 포함한다. 사용되는 붕해제로서는, 예를 들면 전분, 한천, 젤라틴 분말, 결정 셀룰로스, 탄산칼슘, 중탄산나트륨, 구연산 칼슘, 덱스트린, 펙틴 및 카르복시메틸셀룰로스 칼슘을 포함한다. 사용되는 윤활제로서는, 예를 들면 스테아르산 마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 수소화된 식물성 오일을 포함한다. 사용되는 착색제의 예로는 의약품에 대한 첨가가 허가된 것을 포함한다. 사용되는 교정제의 예로는 코코아 분말, 멘톨, 엠파슴(empasm), 박하유, 용뇌, 신나몬 분말을 들 수 있다. 명확하게는, 이들 성분들은 전술한 첨가제 성분들로 한정되지 않는다.
예를 들어, 경구 제제는 활성 성분으로서 본 발명에 따른 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 부형제 및 필요에 따라, 결합제, 붕해제, 윤활제, 착색제, 교정제 등을 첨가한 후, 통상적 방법에 의해, 이 혼합물을 산제, 미립제, 과립제, 정제, 코팅 정제, 캡슐제 등으로 제제화함으로써, 제조한다. 명확하게는 정제 또는 과립제는 필요한 경우 적절하게 코팅, 예컨대 당 코팅될 수 있다.
예를 들어, 시럽제나 주사용 제제는, pH 조절제, 가용화제, 등장화제 (isotonizing agent) 등과, 필요에 따라 가용화제, 안정화제 등을 가하여, 통상적 방법으로 제조한다. 주사제는 미리 제조된 용액이거나, 사용 전에 용해되는 분말 자체, 또는 적정 첨가제가 포함된 분말일 수 있다. 주사제는 활성 성분을 통상적으로 0.01 내지 100 wt%, 바람직하게는 0.1 내지 100 wt%로 포함할 수 있다. 아울러, 현탁제 또는 시럽제 등의 경구 투여용 액체 제제는 활성 성분을 통상적으로 0.01 내지 100 wt%, 바람직하게는 0.1 내지 100 wt%로 포함할 수 있다.
예컨대, 외용제는 특별한 제한없이 임의의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 의약품, 의약외품, 화장품 등에 통상 사용되는 다양한 물질들 중 임의의 것을 베이스 물질로서 사용할 수 있다. 베이스 물질의 예로는 동식물 오일, 미네랄 오일, 에스테르유, 왁스류, 고급 알코올류, 지방산류, 실리콘유, 계면활성제, 인지질, 알코올, 다가 알코올, 수용성 폴리머, 점토 미네랄 및 정제수 등의 물질을 포함한다. 필요에 따라, pH 조절제, 항산화제, 킬레이트제, 방부제, 살진균제, 착색제, 향료 등을 첨가할 수 있다. 아울러, 필요에 따라 분화 유도 작용을 가진 성분, 혈류 촉진제, 살세균제, 소염제, 세포 활성화제, 비타민, 아미노산, 보습제, 각질용해제 등의 성분을 배합할 수도 있다.
본 발명에 따른 융합된 아미노디하이드로티아진 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 투여량은, 예를 들면, 증상의 정도, 연령, 성별, 체중, 투여 방식, 염의 종류 및 질환의 특정한 유형에 따라 달라진다. 전형적으로, 활성 성분은, 성인에 대해, 단회 투약으로 또는 수회에 나누어서, 1일 당 30 ㎍ 내지 10 g, 바람직하게는 100 ㎍ 내지 5 g, 더 바람직하게는 100 ㎍ 내지 1 g을 경구로 투여되거나, 또는, 성인에 대해, 1일 당 약 30 ㎍ 내지 1 g, 바람직하게는 100 ㎍ 내지 500 mg, 보다 바람직하게는 100 ㎍ 내지 300 mg을 주사에 의해 투여된다.
식 (I)의 화합물은 다른 치료 제제, 예컨대 알츠하이머 질환 등의 신경퇴행성 질환의 질환 변형 또는 증상 치료제로서 유용한 것으로 주장되는 약제와 조합하여 사용할 수 있다. 즉, 다른 측면에서, 본 발명은, 식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 제1 활성 성분과, 적어도 신경퇴행성 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 추가적인 활성 성분을 조합으로 포함하는, 약제학적 제품을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머형 치매 (AD)이다. 이러한 추가적인 활성 성분에 대한 적절한 예는, 대증제(symptomatic agent), 예컨대 콜린 전달(cholinergic transmission)을 변형시키는 것으로 공지된 물질, 예를 들어, M1 및 M3 무스카린성 수용체 작용제 또는 알로스테릭 조절제, M2 무스카린성 길항제, M4 작용제 또는 파지티브 알로스테릭 조절제 (PAMs), 아세틸콜린에스테라제 저해제 (예, 테트라하이드로아미노아크리딘, 도네페질 하이드로클로라이드 및 리바스티그민), 니코틴 수용체 작용제 또는 알로스테릭 조절제 (예, α7 작용제 또는 알로스테릭 조절제 또는 α4β2 작용제 또는 알로스테릭 조절제), PPAR 작용제 (예, PPARγ 작용제), 5-HT4 수용체 작용제 또는 부분 작용제, 히스타민 H3 길항제, 5-HT6 수용체 길항제 또는 5HT1A 수용체 리간드 및 NMDA 수용체 길항제 또는 조절제, 5-HT2A 길항제, 5-HT7 길항제, D1 작용제 또는 PAM, D4 작용제 또는 PAM, D5 작용제 또는 PAM, GABA-A α5 인버스 작용제 또는 네거티브 알로스테릭 조절제 (NAM), GABA-A α2/3 작용제 또는 PAM, mGluR2 조절제 (PAM 또는 NAM), mGluR3 PAM, mGluR5 PAM, PDE 1 저해제, PDE 2 저해제, PDE 4 저해제, PDE 5 저해제, PDE 9 저해제, PDE 10 저해제, GlyT1 저해제, DAAO 저해제, ASC1 저해제, AMPA 조절제, SIRT1 활성화제 또는 저해제, AT4 길항제, GalR1 길항제, GalR3 리간드, 아데노신 A1 길항제, 아데노신 A2a 길항제, α2A 길항제 또는 작용제, 선택적 및 비선택적 노르에피네프린 재흡수 저해제 (SNRI), 또는 잠재 질환 개변제, 예컨대, γ 세크레타제 저해제 또는 조절제, α 세크레타제 활성화제 또는 조절제, 아밀로드 응집 저해제, 아밀로이드 항체, tau 응집 저해제 또는 tau 인산화/키나제 저해제, tau 탈인산화/포스파타제 활성화제, 미토겐-활성화된 단백질 키나제 키나제 4 (MKK4/MEK4/MAP2K4) 저해제, c-Jun N-말단 키나제 (JNK) 저해제, 카세인 키나제 저해제, MK2 (미토겐-활성화된 단백질 키나제-활성화된 단백질 키나제 2) 저해제, MARK (미세소관 친화성 조절 키나제) 저해제, CDK5 (사이클린 의존형 키나제 5) 저해제, GSK-3 (글리코젠 신타제 키나제-3) 저해제 및 tau-튜불린 키나제-1 (TTBK1) 저해제일 수 있다. 이러한 다른 치료학적 제제에 대한 다른 예는, 칼슘 채널 차단제, HMG-CoA (3-하이드록시-3-메틸-글루타릴-CoA) 리덕타제 저해제 (스타틴류) 및 지질 저하제, NGF (신경 성장 인자) 모방체, 항산화제, GPR3 리간드, 플라스민 활성화제, 네프릴라이신 (NEP) 활성화제, IDE (인슐린 분해 효소) 활성화제, 멜라토닌 MT1 및/또는 MT2 작용제, TLX/NR2E1 (tailless X 수용체) 리간드, GluR1 리간드, RAGE (진보된 글리케이션 최종 산물용 수용체) 길항제, EGFR (상피 성장 인자 수용체) 저해제, FPRL-1 (포르밀 펩타이드-유사 수용체-1) 리간드, GABA 길항제, 및 MICAL (casL과 상호작용하는 분자) 저해제, 예컨대 옥소리덕타제 저해제, CB1 길항제/인버스 작용제, 비-스테로이드계 항-염증제 (NSAID), 항-염증제 (예, 신경염증을 강화 또는 저하시킴으로써 신경염증을 치료하는데 사용될 수 있는 제제), 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 리간드, 항-아밀로이드백신 및/또는 항체, 아밀로이드 유출 및/또는 소거를 촉진 또는 강화하는 제제, 히스톤 탈아세틸효소 (HDAC) 저해제, EP2 길항제, 11-β HSD1 (하이드록시스테로이드 탈수소효소) 저해제, 간 X 수용체 (LXR) 작용제 또는 PAM, 지단백질 수용체-관련 단백질 (LRP) 모방체 및/또는 리간드 및/또는 강화제 및/또는 저해제, 부티릴 콜린에스테라제 저해제, 키누린산 길항제 및/또는 키누레닌 아미노트랜스퍼라제 (KAT)의 저해제, 오르파닌 FQ / 노시셉틴 (NOP) / 오파오이드-유사 수용체 1 (ORL1) 길항제, 흥분성 아미노산 수송체 (EAAT) 리간드 (활성화제 또는 저해제), 및 플라스미노겐 활성화제 저해제-1 (PAI-1) 저해제, 니액신(niacin) 및/또는 GPR109 작용제 또는 콜레스테롤 강하제와 조합한 PAM 및/또는 HMGCoA 리덕타제 저해제 (스타틴류), 디메볼린(dimebolin) 또는 유사 제제, 항히스타민, 금속 결합 제제/ 킬레이트제, 항생제, 성장 호르몬 분비촉진제, 콜레스테롤 강하제, 비타민 E, 콜레스테롤 흡수 저해제, 콜레스테롤 유출 프로모터 및/또는 활성화제, 및 인슐린 상향조절제일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은, 식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 제1 활성 성분과 하기로부터 선택되는 하나 이상의 다른 활성 성분을 조합하여 포함하는 약제학적 제품을 제공한다:
- 콜린에스테라제 저해제, 예, 도네페질, 갈란타민, 리바스티그아민, 테트라하이드로아미노아크리딘 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염,
- 5-HT6 길항제, 예, SB-742457 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염,
- HMGCoA 리덕타제 저해제, 예, 로바스타틴, 로수바스타틴, 아토르바스타틴, 심바스타틴, 플루바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
상기한 조합의 개개 성분들은 분리하여 순차적으로 또는 동시에, 또는 조합한 약제 제형으로서 투여될 수 있다. 따라서, 상기 제약학적 제품은, 예를 들어, 제1 활성 성분과 다른 활성 성분을 혼합물로서 포함하는 약학 조성물일 수 있다. 다른 예로, 약제학적 제품은 제1 활성 성분과 다른 활성 성분을 이를 필요로 하는 환자에게 동시, 순차적 또는 개별 투여하기 적합한 별개의 약학 조제물로서 포함할 수 있다.
조합물은 약학 제형 형태로 편리하게 제공될 수 있으며, 따라서 전술한 조합을 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 약학 제형은 본 발명의 다른 측면을 포함한다.
식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 제2의 치료학적 활성 제제와 조합하여 사용되는 경우, 각 화합물의 용량은 화합물을 단독 사용하는 경우와 상이할 수 있다. 적정 용량은 당해 기술 분야의 당업자라면 쉽게 알 것이다.
따라서, 본 발명의 추가적인 측면은, 전술한 바와 같이 정의되는 하나 이상의 식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 보강제, 희석제 또는 담체, 및/또는 하나 이상의 다른 치료학적 또는 예방학적 활성 제제와 혼합하는 단계를 포함하는, 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은, 식 (I)의 화합물, 대증제와 같은 하나 이상의 다른 알츠하이머 질환의 치료제, 예컨대, 콜린 전달을 변형시키는 것으로 공지된 물질들, 예를 들어, M1 및 M3 무스카린 수용체 작용제 또는 알로스테릭 조절제, M2 무스카린 길항제, 아세틸콜린에스테라제 저해제 (예, 테트라하이드로아미노아크리딘, 도네페질 하이드로클로라이드 및 리바스티그민), 니코틴 수용체 작용제 또는 알로스테릭 조절제 (예, α7 작용제 또는 알로스테릭 조절제 또는 α4β2 작용제 또는 알로스테릭 조절제), PPAR 작용제 (예, PPARγ 작용제), 5-HT4 수용체 작용제 또는 부분 작용제, 히스타민 H3 길항제, 5-HT6 수용체 길항제 또는 5HT1A 수용체 리간드 및 NMDA 수용체 길항제 또는 조절제, 5-HT2A 길항제, 5-HT7 길항제, D1 작용제 또는 파지티브 알로스테릭 조절제 (PAMs), D4 작용제 또는 PAM, GABA-A α5 인버스 작용제 또는 네거티브 알로스테릭 조절제 (NAM), GABA-A α2/3 작용제 또는 PAM, mGluR2 조절제 (PAM 또는 NAM), mGluR3 PAM, mGluR5 PAM, PDE 1 저해제, PDE 2 저해제, PDE 4 저해제, PDE 5 저해제, PDE 9 저해제, PDE 10 저해제, GlyT1 저해제, DAAO 저해제, ASC1 저해제, AMPA 조절제, SIRT1 활성화제 또는 저해제, AT4 길항제, GalR1 길항제, GalR3 리간드, 아데노신 A1 길항제, 아데노신 A2a 길항제, α2A 길항제 또는 작용제, 선택적인 및 비선택적인 노르에피네프린 재흡수 저해제 (SNRIs), 또는 잠재적인 질환 변형제, 예컨대 γ 세크레타제 저해제 또는 조절제, α 세크레타제 활성화제 또는 조절제, 아밀로이드 응집 저해제, 아밀로이드 항체, tau 응집 저해제 또는 tau 인산화 저해제를, 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 포함하는, 약학 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과, 순차적 또는 동시 투여를 위한 전술한 다른 치료학적 제제를 별개 또는 조합된 약학 제형으로서 포함하는 조합물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 전술한 약학 조성물 또는 전술한 바와 같이 정의되는 식 (I)의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 치료학적 또는 예방학적 유효량으로 증상을 앓고 있는 인간 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드-β 단백질의 생산 저해 방법, 및/또는 알츠하이머형 치매 (AD), 다운 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA), 가벼운 인지 장애 (MCI), 기억상실, 초로성 치매, 노인성 치매, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈, 및 기타 퇴행성 치매, 예컨대 혼성 혈관 및 퇴행성 기원의 치매, 핵상 마비성 치매, 피질 기저 퇴행성 치매, 파킨슨 질환 (PD)성 치매 및 AD의 미만성 루이소체 타입의 치매와 같은 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. "유효량"은 개체에게 유익하거나 또는 개체의 증상에 변화를 적어도 야기하는데 충분한 양을 의미한다.
알츠하이머 질환 (AD)은, 다양한 길이의 아밀로이드(Aβ) 펩타이드들, 예컨대, 예컨대 42 아미노산 (Aβ42) 및 40 아미노산 (Aβ40)으로 구성된, 신경섬유다발 (NTF) 및 플라그의 존재에 의해 병리학적으로 특정된다. 이러한 병리학적 마커들 외에도, 뇌 위축증도 또한 명확하게 나타난다. 플라그의 형성은 Aβ 펩타이드의 응집이 원인인 것으로 간주된다. Aβ 펩타이드는 β-세크레타제(BACE1)와 γ-세크레타제에 의한 아밀로이드전구체 단백질 (APP)의 순차적인 절단에 의해 뇌에서 형성된다. 따라서, BACE-1 또는 γ-세크레타제를 저해함으로써 아밀로이드 형성을 저해하고자 하는 잠재적인 AD 약물은, AD에 대한 효과를 발휘하기 위해, 뇌에서 적절한 노출을 달성할 수 있어야 한다.
BACE-1은 아밀로이드 펩타이드의 생성을 정지 또는 서행시키기 위한 매력적인 타겟임에도 불구하고, 다양한 연구 그룹들이 중추 신경계 (CNS)를 침투할 수 있으므로, 따라서 작용 부위에서 효소를 저해할 수 있는, BACE-1 저해제를 동정하기 위한 기회를 가지게 되었다.
뇌는 혈관 뇌 장벽 (BBB) 등의 수개의 장벽들과 수송체들에 의해 보호된다 (Hitchcock and Pennington, J Med Chem 2006, 29, 7559; Ueno, Curr. Med. Chem. 2007, 14, 1199; Gloor et al., Brain Res. Rev. 2001, 36, 258). 화합물이 뇌에 도입되는 것을 방지하는 몇몇 유출 수송체들이 특정화되었다. 제노바이오틱스의 CNS 침투를 방지하는 가장 잘 특정화되고 가장 우수한 것은 P-당단백질 (Pgp)이다 (Kusuhara and Sugiyama, Drug Discovery Today, 2001, 6, 150; Mahar Doan et al., J. Pharm. Expt. Ther. 2002, 303, 1029; Lin, Drugs of Today 2004, 40, 5; Lin & Yamazaki, Clin Pharmacokinet. 2003, 42, 59; Schinkel, Adv. Drug Deliv. Rev. 1999, 36, 179). Pgp 유출은 BACE-1 저해제에 가장 중요한 것으로 확인되었다 (Hussain et al., J. Neurochem. 2007, 100, 802). 따라서, Pgp 유출을 해결하는 것이 중요하다.
당해 기술 분야의 당업자는, 시험관내 또는 생체내에서 CNS 침투를 측정 또는 예측하는 몇가지 방법들이 있다는 것을 알 것이다. CNS 침투 가능성은, 즉, 시험관내 Pgp 분석을 수행함으로써 화합물이 Pgp 유출되게 할 수 있는지를 결정함으로써, 시험관내에서 평가할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 여러가지 세포주들을 이용할 수 있으며, 세포주의 선택이 분석 결과에 영향을 미치거나 미치지 않을 수 있다는 것을 알 것이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 시험관내 Pgp 분석이 생체내 CNS 침투를 예측하는 분석이라는 것을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자는, 화합물의 생체내 CNS 침투를 평가하기 위한 다수의 방법들이 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 혈액 또는 혈장 및 뇌에서의 화합물 농도를 정량하여, 뇌:혈액 (Br:Bl) 또는 뇌:혈장 (Br:Pl) 비율을 계산할 수 있다. 이러한 방법은 역사적으로 사용되고 있으며, CNS 침투를 확인하는 방법으로서 널리 용인되어 있다 (Summerfield et al., J Pharmacol. Expt. Ther. 2007, 322, 205). 당해 기술 분야의 당업자라면, 이러한 타입의 분석이 정상 상태(steady state)에서, 단회 포인트, 다중 시간 포인트에서 수행될 수 있거나, 또는 곡선 하 면적 (AUC) 비율을 인용함으로써 행해질 수 있다는 것을 알 것이다. 모든 방법들은 동등하게 유효하지만, 각각은 당해 기술 분야의 당업자가 인지하는 특정한 단서 조항이 있을 수 있다. 최근 문헌들은, 생체내 유리 농도를 고려하는 것이 중요하며, 뇌로부터 유출이 이루어지지 않은 경우, 유리 혈장 농도가 뇌에서의 유리 농도와 동일하거나 등가여야 한다는 것을 발표하였다 (Kalvass and Maurer, Biopharmaceutics & Drug Disposition 2002, 23, 327; Mauer et al, Drug Metab. Disposition 2005, 33, 175; Trainor Expert Opin. Drug Discov. 2007, 2, 51). 따라서, CNS를 자유롭게 침투할 수 있으며, 예컨대 Pgp 또는 다른 수송체에 의한 활성형 유출을 일으키지 않는 화합물은, 유리 뇌 : 유리 혈장 (Brfr : Plfr) 또는 비결합형 뇌 : 비결합형 혈장 (Bru : Plu)이 대략 1:1이어야 한다. 당해 기술 분야의 당업자는, 총 뇌 농도 또는 총 혈장 농도를 후술되는 분석에 의해 측정할 수 있는 뇌 조직 또는 혈장에서의 비결합된 비율로 곱하여, 유리형 또는 비결합형 농도를 계산할 수 있음을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자는, 비결합형 비율을 실험적인 인자들, 예컨대 농도 또는 온도 등을 이용하여 변화시킬 수 있다는 것을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자는 이를 분석하여, 가장 적합한 조건 세트를 선정할 수 있을 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 또한, 스크리닝하는 각 화합물에 대한 조건이 동일한 한, 분석을 통해 테스트한 다양한 화합물들에 대해 일관된 데이타가 제공될 것이며, 따라서 어떠한 차이도 최소화할 것이라는 것을 알 것이다. 또한, 뇌로부터 활성적으로 유출되지 않는 화합물인 경우, 뇌척수액 (CSF)의 약물 농도는 뇌내 유리형 농도와 동일하다는 것이 제안되었다 (He et al., Xenobiotica 2009, 39, 687). 따라서, CNS 침투를 확인하는 다른 방법은, CSF:혈장내 유리형 (CSF : Plfr) 또는 CSF : 혈장내 비결합형 (CSF : Plu)를 평가하는 것일 것이다. 만약 혈장내 유리형 약물이 CNS로 침투하여 유입 또는 유출이 활발하게 이루어지지 않는다면, CSF:Plfr 또는 CSF:Plu는 대략 1:1이어야 한다. 당해 기술 분야의 당업자는, CSF 약물 농도 확인 및 CSF 추출과 관련된 쟁점들을 인지할 것이며, 예컨대 CSF는 폐기 방법에 따라 혈액으로 오염될 수 있으며, 또한 CSF 농도는 사용되는 용량에 따라 정확성이 낮을 수 있다.
따라서, CNS 노출성이 낮은 GlaxoSmithKline (GSK188909)의 BACE 저해제, BACE-1 IC50 5nM는 급성 투여시 (인간 APPsweK595N/M596I 및 PS-1M146V을 둘다 과다 발현하는) TASTPM 마우스의 뇌에서의 Aβ 40 생산을 저하하는데 효과가 없다는 것이 입증되었다 (Hussain et al., J. Neurochem. 2007, 100, 802 - 809). 경구 용량 250 mg/kg을 투여한 후, TASTPM 마우스에서 뇌내 GSK188909 농도는 0.62 uM이었다. Pgp 저해제 (GF120918)를 GSK188909의 경구 투여하기 5시간 전에 투여하였을 경우, 뇌내 GSK188909 농도는 경구 용량 250 mg/kg 투여 후 5.43 uM인 것으로 확인되었으며, 즉, Pgp의 병용-투여가 CNS 침투를 거의 9배 증가시켰으며, 이는 Pgp 유출이 BACE 저해제가 CNS를 침투하지 못하도록 방지하는데 중요한 기전임을 보여준다. 아울러, Pgp 저해제가 없는 경우, GSK188909는 250 mg/kg의 경구 용량에서 TASTPM 마우스에서의 뇌 Aβ40 수준에 어떠한 영향도 미치지 않는데 반해, Pgp 저해제를 병용-투여한 경우 (GSK188909 투여하기 5시간 전 투여)에는, 비히클 처리한 마우스에 비해 뇌 Aβ 40 수준의 68% 감소가 관찰되었다.
다른 논문에서는 Bristol-Myers Squibb 사의 3종의 BACE-1 저해제들을 이용하여 비슷한 효과를 보고하였다 (Meredith et al., J. Pharm. Expt. Ther. 2008, 326, 502-513). 이들 보고된 3종의 화합물들은 시험관내에서 Pgp 기질인 것으로 확인되었다. 마우스에 투여시, 이들 3종의 화합물들은 낮은 CNS 침투성을 나타내었으며, 뇌내 아밀로이드 수준을 낮추진 않았지만, 혈장내 아밀로이드 수준을 낮출 순 있었다. 동일한 이들 3종의 화합물을 Pgp 낫아웃 (KO) 마우스에 투여하였을 때에는, CNS 침투율이 증가하였으며, 이들 화합물은 뇌에서 아밀로이드 수준을 낮출 수 있었다.
또한, Schering-Plough 사의 연구자들 역시 시리즈 유래 BACE-1 저해제들이 (예, 상기 언급된 문헌의 실시예 11)이, 랫에서 낮은 Br:Pl (<0.1) 비율을 나타내는 것으로 확인되어, Pgp를 유출시킨다는 것을 확인한 논문을 발표하였다 (Iserloh et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 418).
상기에 인용된 문헌은 Pgp 유출을 수행하지 않는 BACE-1 저해제를 동정하는데 있어 어려움을 강조하고 있다. 이러한 저해제가 매우 적합할 것으로 보이며, 많은 연구 그룹들에서 이러한 화합물들을 발굴하고자 하였지만 성공하지 못하였다. 즉, Pgp 기질이 아니며, 따라서 CNS를 쉽게 침투하여 뇌내 아밀로이드 수준을 낮출 수 있는 BACE-1 저해제가 바람직할 것이다.
최근 들어, Wyeth의 연구자들은 사이클릭 아실구아니딘 BACE-1 저해제 시리즈들에서 Pgp 유출을 해결하기 위한 광범위한 연구를 보고하였다 (Malamas et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 6597). 약한 Pgp 기질이며 Br:Pl이 1:1인 화합물들이 발굴되었다. 그러나, Pgp 유출이 감소된 주된 2가지 예들 (상기 언급된 문헌에서 84 및 89)은 Tg2576 마우스에서 30 mg/kg 경구 투여 후 8시간 경과시 뇌에서의 Aβ40을 낮추지 못하였다. 효과 결핍은 화합물이 높은 뇌 조직 결합성을 나타내었기 때문이었다. 따라서, Pgp 기질은 아니면서 여전히 뇌 조직에서 합리적인 비결합형 비율을 유지하며 뇌에서 아밀로이드 수준을 낮출 수 있는 BACE-1 저해제를 발굴하는 것이 중요하다.
또한, 시험관내에서 Pgp 기질이 아닌 BACE 저해제가 CNS를 침투할 수 있으며, APP-YAC 마우스와 원숭이의 뇌에서 Aβ40의 수준을 낮출 수 있다는 것이 확인되었다 (Sankaranarayanan et al., J. Pharmacol. Expt. Ther. 2009, 328, 131-140). 즉, 시험관내 Pgp 분석에서는 TC-1이 Pgp 기질이 아니며, TC-1을 APP-YAC 마우스 (100mg/kg i.p.)에 투여하였을 때, 뇌 농도 및 뇌:혈장 비율로 입증되는 바와 같이 일부가 CNS를 침투할 수 있으며, 이러한 능력으로 인해 뇌 아밀로이드의 일부 감소가 이루어진다는 것이 확인되었다.
시간 혈장 농도 (μM) 뇌 농도 (μM) Br:Pl 뇌에서의 Aβ40 감소율 (%)
2h 25 1.6 0.06 26
4h 13 1.8 0.14 29
APP-YAC 마우스에서, 100 mg/kg을 i.p. 투여한 후 TC-1의 뇌 및 혈장내 농도 및 뇌 Aβ 40 수준에 대한 효과.
별개의 실험에서, TC-1을 CYP3A4 저해제 (리토나비르)와 병용-투여하였을 때, TC-1이 원숭이의 CSF에 침투할 수 있는 것으로 확인되었다. 이들 실험에서, TC-1의 평균 혈장 농도는 2.7 uM로 확인되었으며, CSF 농도는 0.025 uM로 확인되었다. 그러나, TC-1의 ~99%가 혈장 단백질에 결합된 형태이므로, 혈장내 유리형의 농도는 ~0.027 nM로 계산되었다. CSF Aβ40 수준은 비히클 처리한 대조군 대비 42% 감소된 것으로 확인되었다. 따라서, 자유롭게 CNS를 침투할 수 있는 BACE 저해제는 CNS에서 아밀로이드 수준을 낮출 수 있을 것으로 기대될 것이다. CYP3A4 저해제와 병용-투여하지 않는 것이 유리할 것이다.
본 발명의 화합물은 동물에서 Aβ 생성을 낮추는 능력과 관련있는 세포 분석에서 Aβ 생산을 낮추는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 화합물은 인간에서 Aβ 생산 저하에 유용성이 있을 것이며, 이에 알츠하이머 질환 등의 신경퇴행성 질환을 치료하는데 유용할 것이다.
랫에서의 생체내 CNS 침투
수컷 스프레그 다우리 랫을 Charles River UK Ltd. (Margate, UK)로부터 입수하였으며, UK 홈 오피스 가이드라인에 따라 사육하였다. 약물은 0.5% 메틸 셀룰로스 중에 적정 농도로 만들었다. 동물에 아래 표 1 내지 4에 개략적으로 나타낸 용량을 위관 영양을 통해 경구 투여하였다 (2mL/kg).
투여 후, 아래 표 1 - 4에 명시된 여러 시간대에, 소듐 펜토바르비톤을 i.p. 주사로 동물에 투여하였다 (최종 마취(terminal anaesthesia)를 위해 약 330 mg/kg).
단두대를 이용하여 동물의 목을 자르고, 100 IU 헤파린이 든 15 ml 팔콘 튜브에 동맥 혈액을 채혈하였다. 혈액을 볼텍싱한 다음 5분간 4℃에서 6000 rpm으로 원심분리하였다. DMPK 및 ELISA 분석을 위해 혈장을 수집하여, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다. 뇌를 적출하여, 중심선을 따라 나눈 후 무게를 측정하고, 이후 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
혈장, 뇌 및 CSF 샘플에 대한 분석 방법
아세토니트릴 작용 용액의 제조
시험 화합물은 DMSO 중에 1 mg 유리 염기/mL 용액으로서 준비하고, 볼텍싱한 다음 5분간 초음파처리하였다. 10 ㎕를 아세토니트릴 990 ㎕에, 30 ㎕를 아세토니트릴 970 ㎕에 각각 첨가함으로써, 1 mg/mL DMSO 용액을 아세토니트릴 10 및 30 ㎍/mL 스톡 용액으로 희석하였다. 아세토니트릴 10 및 30 ㎍/mL 스톡 용액을 1:9 (v/v)로 연속 희석하여 (100 ㎕ 스톡을 900 ㎕ 아세토니트릴에 첨가함), 다음과 같은 용액을 제조하였다: 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 및 30 ㎍/mL 아세토니트릴.
혈장 표준물질, 블랭크 및 샘플의 준비
대조군 수컷 스프레그 다우리 랫 혈장 및 실험 혈장 샘플은 분석 당일에 실온에서 해동시킬 때까지 -80℃에 보관하였다. 대조군 혈장을 원심분리 (10분간 2,000g)하고, 표준물질 및 블랭크 샘플 제조를 위한 에펜도르프 튜브에 (90 ㎕) 분액하여 넣었다. 실험 샘플은 혈장을 채집한 즉시 에펜도르프 튜브에 미리 분액하여 넣었다 (100 ㎕).
적정 아세토니트릴 스톡 용액의 분액 (10 ㎕)을 대조군 혈장에 (최종 부피 100 ㎕로) 첨가하여, 1 - 3000 ng/mL 범위를 포괄하는 필요한 캘리브레이션 표준을 수득하였다. 이중 블랭크 및 블랭크 샘플들은 블랭크 혈장 90 ㎕에 아세토니트릴 10 ㎕를 첨가하여 준비하였다.
뇌 표준 물질, 블랭크 및 샘플의 준비
대조군 수컷 스프라그 다울리 랫 뇌 및 실험 뇌 샘플을 채집한 후 무게를 측정한 다음, 이를 실온에서 해동시켜 분석하는 당일까지 -80℃에 보관하였다. 일단 해동시킨 뇌를 물로 희석하고 (조직 g 당 4 mL), 기계적 호모게나이저를 이용하여 균질화하였다. 각 실험 샘플의 분액 (100 ㎕)을 분석을 위해 준비한 마이크로닉스 튜브에 넣고, 뇌 균질물의 충분한 분액(90 ㎕)을 표준 물질과 블랭크의 제조를 위해 준비하였다.
적합한 아세토니트릴 스톡 분액 (10 ㎕)을 대조군 뇌 균질물에 (최종 부피 100 ㎕로) 첨가하여, 1.5 - 5000 ng/g 범위를 포괄하는 필요한 캘리브레이션 표준을 구축하였다. 이중 블랭크 및 블랭크 샘플들은 블랭크 뇌 균질물 90 ㎕에 아세토니트릴 10 ㎕를 첨가하여 준비하였다.
혈장 및 뇌 샘플, 표준 물질 및 블랭크의 추출
각 혈장 및 뇌 균질물 샘플, 표준 물질 및 블랭크 (100 ㎕)를 (0.1% 포름산 및 100 ng/mL의 적정 내부 표준물질 포함하는) 아세토니트릴 분액 (300 ㎕)으로 추출하였다. 이중 블랭크는 0.1% 포름산이 함유된 아세토니트릴 분액 (300 ㎕)으로 추출하였다. 그런 후, 모든 샘플, 표준물질 및 블랭크는 볼텍스 혼합하고, 원심분리하였다 (2000g, 15분). 제조되는 상층액 분액 (50 ㎕)을 2 mL 96-딥 웰 플레이트에 넣어, 아세토니트릴:물 (50:50 v/v) (150 ㎕)로 희석하여, 특정 LC-MS/MS 방법으로 분석하기 위해 준비하였다.
CSF 샘플, 표준물질 및 블랭크의 준비
대조군 수컷 스프레그 다우리 랫 CSF 및 실험 CSF 샘플은 분석 당일에 실온에서 해동시킬 때까지 -80℃에 보관하였다. 각 실험 샘플의 분액 (50 ㎕)을 분석을 위해 준비한 마이크로닉스 튜브에 넣고, 대조군 CSF의 충분한 분액(45 ㎕)을 표준 물질과 블랭크의 제조를 위해 준비하였다.
적정 아세토니트릴 스톡 용액의 분액 (5 ㎕)을 대조군 CSF에 (최종 부피 50 ㎕로) 첨가하여, 1 - 1000 ng/mL 범위를 포괄하는 필요한 캘리브레이션 표준을 수득하였다. 이중 블랭크 및 블랭크 샘플들은 블랭크 CSF 45 ㎕에 아세토니트릴 5 ㎕를 첨가하여 준비하였다.
CSF 샘플, 표준 물질 및 블랭크의 추출
각 CSF 샘플, 표준 물질 및 블랭크 (50 ㎕)를 (0.1% 포름산 및 100 ng/mL의 적정 내부 표준물질 포함하는) 아세토니트릴 분액 (150 ㎕)으로 추출하였다. 이중 블랭크는 0.1% 포름산이 함유된 아세토니트릴 분액 (150 ㎕)으로 추출하였다. 그런 후, 모든 샘플들을 볼텍스 혼합하고, 각 분액 (50 ㎕)을 2 mL 96-딥 웰 블럭에 넣어, 아세토니트릴:물 (50:50 v/v) 150 ㎕로 희석하여, LC-MS/MS 방법으로 분석하기 위해 준비하였다.
그런 후, 모든 샘플들을 Waters Xevo TQ 질량 분광측정기와 연계된 Waters Acquity UPLC로 분석하였다.
LC 조건:
컬럼: Acquity UPLC BEH C18, 1.7 um, 2.1 x 50 mm, 40℃로 유지
이동상: A = 95% 물 : 5% MeOH, 0.01M 암모늄 아세테이트 함유
B = 5% 물 : 95% MeOH, 0.01M 암모늄 아세테이트 함유
농도구배:
시간 (분) B (%)
0 5
1.2 95
1.5 95
1.7 5
2.0 5
유속 : 0.6 mL/min; 주입 부피 5 ㎕; 자동샘플러 온도 6℃
LC 흐름은 각 주입 후 처음 0.3분간을 폐기하는 것으로 우회하였다.
MS/MS 전이(transition)는 Waters QuanOptimise 소프트웨어로 자동 최적화되었다.
아밀로이드 검출
랫 뇌 유래 Aβ 펩타이드의 DEA/ NaCl 추출:
50 mM NaCl (pH 10) 중의 차가운 0.2% 디에틸 아민 (DEA) 용액 100 ml을 신선하게 준비하고, 뇌 조직 1 ml/25 mg을 각 반구 (즉, 40x 뇌 체적)에 첨가하였다. 뇌를 Polytron PT 1200을 사용하여 1.5분간 즉시 균질화하고, 균질화 후 1시간 동안 얼음 위에 샘플을 두어 인큐베이션하였다. 균질물 3 ml을 폴리알로머 튜브 (Beckman #362333)로 옮겨, 4℃에서 45분간 133000 x g (55,000rpm)로 회전시켰다. 상층액에 1/10 부피의 0.5M Tris/HCl, pH 6.8을 첨가하여 pH 8-8.3로 중화하였다. 샘플을 신선하게 사용하거나 또는 드라이아이스에서 급속 냉동시키고, 분석을 위해 필요해질 때까지 -80℃에 보관할 수 있다.
인간/랫 β아밀로이드(40) ELISA (Wako 키트)
Wako Aβ40 ELISA 키트 (Code No. 294-62501)는 에피토프 Aβ(11-28)에 대해 생성된 단일클론 항체 BNT77과, Aβ40의 C-말단부를 특이적으로 검출하는 단일클론 항체 BA27을 이용한다. 이 키트는 인간 또는 랫 Aβ(1-40)와, 또한 조직 배양 배지, 조직 균질물, CSF 및 혈장 등의 생물학적 매트릭스에서의 N-말단이 절단된 Aβ40 종(Aβ(x-40))을 정량적으로 검출하는데 사용된다.
분석을 위해, 혈장 및 뇌 샘플들은 키트에 포함된 표준 희석제로 1:1로 희석하고, CSF 샘플은 키트에 포함된 표준 희석제로 1:8로 희석하였다. 분석은 제조사의 지침에 따라 수행하며, 샘플은 2세트로 분석한다. 데이타는 마이크로소프트 웩셀 2003으로 분석하고, 통계 분석은 Genstat 9th Edition으로 수행한다.
즉, 비교예 1를 10 mg/kg 용량으로 p.o.로 투여하고, 혈장, 뇌 및 CSF 샘플을 투여 후 2, 4, 6 및 8시간째에 수집하였을 때, 아래 농도들이 측정되었다 (표 1):
표 1: 비교예 1의 데이타 (WO2009/091016의 실시예 73)
시간 (h) [Pl] (nM) 1[Plu] (nM) [Br] (nM) 2[Bru] (nM) [CSF] (nM) Brtot:Pltot Bru:Plu CSF:Plu
2 1257 440 971 65 104 0.8 0.15 0.24
4 1162 407 874 59 88 0.7 0.14 0.22
6 834 292 570 38 63 0.7 0.13 0.22
8 484 169 368 25 26 0.8 0.15 0.15
1 [Pl] x Pl Fu로 계산됨.
2 [Br] x Br Fu로 계산됨.
상기 실험에서, 비교예 1은 뇌에서 4시간 및 6시간째에 각각 59% 및 64%의 Aβ40 감소율을 나타내었으며; CSF에서는 4시간 및 6시간째에 각각 76^ 및 70%의 Aβ40 감소율을 나타내었다.
본 발명의 특정 화합물들을 랫에서 생체내 평가하여, CNS 침투 수준을 확인하였으며; 이들 데이타는 아래 표에 나타낸다.
놀랍게도, 본 발명의 화합물 예들은 CNS 침투를 확인하는 전술한 공지된 임의의 방법들을 이용한 경우, WO2009/091016의 화합물에 비해, 랫에서 증가된 CNS 침투성을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 화합물은, 작용 부위, 뇌를 보다 쉽게 타겟팅하다는 점에서 개선된 프로파일을 나타낼 수 있으며, 그러므로, 선호적인 CNS 분배 방식에 의해, 또는 이러한 측면들 중 임의의 측면이나 모든 측면들의 조합에 의해, 개선된 효능 또는 낮은 농도나 용량에서의 개선된 효능을 나타내거나, 또는 지엽적으로 매개되는 부작용의 감소를 나타낼 수 있다.
이에, 실시예 4를 용량 10 mg/kg으로 p.o.로 투여하고, 투여 후 2, 4, 6 및 8시간째에 혈장 및 뇌 샘플을 수집하였을 때, 다음과 같은 농도가 측정되었다 (표 2):
표 2: 실시예 4의 데이타
시간 (h) [Pl] (nM) 1[Plu] (nM) [Br] (nM) 2[Bru] (nM) [CSF] (nM) Brtot:Pltot Bru:Plu CSF:Plu
2 392 51 1470 31 33 3.8 0.6 0.6
4 482 63 1616 34 40 3.4 0.5 0.6
6 162 21 609 13 13 3.8 0.6 0.6
8 105 14 385 8 8 3.7 0.6 0.6
1 [Pl] x Pl Fu로 계산됨.
2 [Br] x Br Fu로 계산됨.
상기 실험에서, 실시예 4는 뇌에서 4 및 6시간째에 각각 51% 및 42%의 Aβ40 감소율을 나타내었고, CSF에서는 4 및 6시간째에 각각 67% 및 63%의 Aβ40 감소율을 나타내었다.
즉, 본 발명의 화합물은 Pgp 침투 증가를 나타내며, CNS에서의 효능이 확인된다. 따라서, 효능은 낮은 순환성 혈장 농도로 달성된다.
본 발명의 실시예 3을 용량 10 mg/kg으로 p.o.로 투여하고, 투여 후 2, 4, 6 및 8시간째에 혈장, 뇌 및 CSF 샘플을 수집하였을 때, 다음과 같은 농도가 측정되었다 (표 3):
표 3: 실시예 3의 데이타
시간 (h) [Pl] (nM) 1[Plu] (nM) [Br] (nM) 2[Bru] (nM) [CSF] (nM) Brtot:Pltot Bru:Plu CSF:Plu
2 385 55 1087 38 34 2.8 0.7 0.6
4 226 32 576 20 16 2.5 0.6 0.5
6 232 33 561 20 15 2.4 0.6 0.5
8 85 12 257 9 9 3.0 0.7 0.7
1 [Pl] x Pl Fu로 계산됨.
2 [Br] x Br Fu로 계산됨.
상기 실험에서, 실시예 3은 뇌에서 4 및 6시간째에 각각 58% 및 61%의 Aβ40 감소율을 나타내었고, CSF에서는 4 및 6시간째에 각각 75% 및 71%의 Aβ40 감소율을 나타내었다. 즉, 본 발명의 화합물은 Pgp 유출성이 낮았으며, CNS에서의 효능이 확인되었다. 따라서, 낮은 순환성 혈장 농도에서 효능이 달성된다.
실시예 2를 용량 10 mg/kg으로 p.o.로 투여하고, 투여 후 2, 4, 6 및 8시간째에 혈장, 뇌 및 CSF 샘플을 수집하였을 때, 다음과 같은 농도가 측정되었다 (표 4):
표 4: 실시예 2의 데이타
시간 (h) [Pl] (nM) 1[Plu] (nM) [Br] (nM) 2[Bru] (nM) [CSF] (nM) Brtot:Pltot Bru:Plu CSF:Plu
2 850 214 1781 118 133 2.1 0.6 0.6
4 645 163 1338 88 201 2.1 0.5 1.2
6 353 89 703 46 60 2.0 0.5 0.7
8 224 56 479 32 68 2.1 0.6 1.2
1 [Pl] x Pl Fu로 계산됨.
2 [Br] x Br Fu로 계산됨.
상기 실험에서, 실시예 2는 뇌에서 4 및 6시간째에 각각 63% 및 65%의 Aβ40 감소율을 나타내었고, CSF에서는 4 및 6시간째에 각각 85% 및 69%의 Aβ40 감소율을 나타내었다. 즉, 본 발명의 화합물은 Pgp 유출성 증가를 나타내며, CNS에서의 효능이 확인되었다. 따라서, 낮은 순환성 혈장 농도에서 효능이 달성된다.
혈장 단백질 결합 (PPB) 및 뇌 조직 결합 (BTB) 확인 방법
화합물 준비
화합물을 DMSO에 용해하여, 1 mg 유리 염기/mL 용액을 수득한 다음, 이를 아세토니트릴에 100 ㎍/mL로 희석(1 mg/mL 용액 100 ㎕를 아세토니트릴 900 ㎕에 첨가)하였다.
매트릭스 준비
투석 당일 오전에, -80℃에 보관 중인 대조군 수컷 스프라그 다울리 랫 혈장과 뇌를 실온에서 해동하였다. 혈장의 pH를 체크하고, 필요에 따라 1 M HCl을 사용하여 pH 7.4로 조정하였다. 그런 후, 혈장을 원심분리 (2000 g, 10분)하고, 뇌를 조직 g 당 포스페이트 완충액화된 염수 (pH 7.4) 2 mL로 희석한 다음, 기계적 호모게나이저를 사용하여 균질화하였다. 100 ㎍/mL의 아세토니트릴 화합물 용액의 분액 (10 ㎕)을 혈장 및 뇌 균질물 1 mL에 첨가하고, 이를 볼텍스 혼합하여, 매트릭스 중의 최종 화합물 농도 1 ㎍/mL을 달성하였다.
RED 플레이트 준비
신속 평형 투석(Rapid Equilibrium Dialysis: RED) 플레이트 (Thermo Scientific)를 제조사의 가이드라인에 따라 준비하였으며, 즉, 베이스 플레이트를 10분간 20% (v/v) 에탄올에 침지한 다음 탈이온수로 2회 세척한 후, 건조하였다. 이 베이스 플레이트에 적당 수의 일회용 인서트 (화합물 당 n=3)(Thermo Scientific)를 충진하고, 1 ㎍/mL 화합물이 함유된 매트릭스를 인서트의 매트릭스 챔버에 넣고(200 ㎕), PBS 분액 (350 ㎕)을 완충액 챔버에 넣었다. 플레이트를 접착제로 덮고, 130 rpm으로 교반하면서 6시간 동안 37℃에서 공기 중에 인큐베이션하였다.
샘플링
6시간 인큐베이션한 후, 봉인을 제거하고, PBS 챔버에서 분액 (50 ㎕)을 취하여 마이크로닉스 튜브에 넣었다. 또한, 매트릭스 챔버에서 분액 (50 ㎕)을 취하여, 다른 마이크로닉스 튜브에 넣었다. 그런 후, 혈장과 뇌를 약물-무첨가 PBS 50 ㎕와 매트릭스 매칭시키고, PBS 샘플은 대응되는 약물-무첨가 매트릭스 50 ㎕와 매칭시켜, 동일한 최종 조성물 및 체적을 구축하였다 (100 ㎕).
샘플 분석
샘플을 볼텍싱 혼합하고, 0.1% 포름산과 100 ng/mL의 적정 내부 표준물질이 함유된 아세토니트릴 분액 (300 ㎕)을 첨가하였다. 그런 후, 샘플을 혼합 및 원심분리 (2000 g, 15분)하고, 상층액 분액 (100 ㎕)을 96-딥 웰 플레이트로 옮기고, 동일 부피의 물로 희석하여, LC-MS/MS 분석용으로 준비하였다.
아래 데이타는 상기 분석을 통해 하기 화합물들에서 수득한 것이다 (표 5).
표 5:
화합물 랫 PPB (%) 랫 혈장 fu 랫 BTB (%) 랫 뇌 fu
비교예 1 65.0 0.350 93.3 0.067
실시예 4 87.0 0.130 97.9 0.021
실시예 3 85.7 0.143 96.5 0.035
실시예 2 74.9 0.252 93.4 0.066
데이타는 n=3 삼배수 샘플의 평균이다.
fu = 비결합 분획
상기 나타낸 데이타에서, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 화합물들이 비교예 1과 비슷한 수준의 뇌 Aβ40 저하를 달성하지만, 혈장내 농도와 혈장내 유리 농도가 더 낮다는 것을 인지할 것이다. 이는, 본 발명의 화합물이 WO2009/091016의 화합물들 보다 낮은 농도에서 비슷하거나 보다 우수한 효능을 가지며, 따라서 심혈관 작용, 인지질 축적증(phospholipidosis), 간 독성, 신장 독성 및 위장 독성 등의 말초적으로 매개되는 원치않은 부작용을 야기할 가능성이 낮을 것이라는 점에서 유리하며, 이러한 점을 시사한다.
CNS 침투성 향상 외에도, 본 발명의 화합물은 아래 표에 개략적으로 나타낸 바와 같이 WO2009/091016에 언급된 화합물에 비해 개선된 대산 안정성을 나타내었다 (표 6):
표 6:
화합물 HLM 안정성1
비교예 2
(WO2009/092016의 실시예 107)		 0.3
비교예 3
(WO2009/092016의 실시예 177)		 1.5
실시예 2 82.0
실시예 3 73.3
실시예 4 78.6
1. 후술되는 분석에서 인간 간 미소체 (HLM)와 30분 인큐베이션하였을 때 모 화합물의 잔류율
인간 간 미소체 안정성 분석
화합물을 DMSO에 용해하여, 1 mmol/L DMSO 용액을 제조하였다. DMSO 용액을 증류수로 희석하여, 1 μmol/L 화합물 투여 용액 (DMSO 농도: 0.1%)을 제조하였다.
반응 완충액(1 mol/L 포스페이트 완충액 (pH 7.4)/1 mmol/L EDTA (pH = 1/1/5, v/v/v) 105 ㎕, 1 μmol/L 화합물 투여 용액 15 ㎕ 및 랫 또는 인간의 간 미소체 (5 mg/mL)를 혼합하고, 5분간 37℃에서 예비인큐베이션하였다. 대사 반응은, NADPH 발생 시스템 (3.3 mmol/L 베타-NADPH+, 80 mmol/L 글루코스 6-포스페이트, 1 unit/mL 글루코스 6-포스페이트 탈수소효소, 60 mmol/L MgCl2) 15 ㎕를 첨가하여 개시하였다. 대조군 샘플의 경우, NADPH 발생 시스템을60 mmol/L MgCl2로 교체하였다. 반응 혼합물 (최종 화합물 농도: 0.1 μmol/L, 최종 DMSO 농도: 0.01%) 150 ㎕를 30분간 37℃에서 인큐베이션하고, 적합한 내부 표준물질 화합물이 함유된 메탄올/아세토니트릴 용액 150 ㎕를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 샘플을 볼텍싱, 원심분리하고, 수득되는 상층액으로 LC/MS 분석을 수행하였다.
다음으로, 본 발명에 따른 식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 제조 방법을 설명한다.
A. 일반 제조 방법 A:
Figure pct00010
상기 식에서, X 및 R은 상기 정의된 바와 같이 정의되며, PG는 보호기 (예, 트리틸)이다.
일반 제조 방법 A는 원료로서 화합물 A-(1)으로부터 공정 A-(i) 내지 공정 A-(xii)의 다단계 공정을 통해, 본 발명에 따른 화합물 (I)에 해당되는 화합물 A-(13)의 제조 방법이다.
화합물 A-(1)은 WO2009/091016에 언급된 바와 같은 거울이성체적으로 순수한 형태로 또는 실시예들에 기술된 바와 같이 라세믹 형태로서 제조될 수 있다.
공정 A-(i):
본 공정은, 화합물 A-(1)에 아릴리튬 시약 또는 그리냐드 시약을 첨가하여 화합물 A-(2)를 수득하는 공정이다.
본 공정의 단계는, 예를 들어 J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 5376-5383; Bull. Chem. Soc. Jpn., 1993, 66, 2730-2737 and Synlett. 2004, No. 8, pp 1408-1413에 기술된 조건과 동일한 조건에서 수행할 수 있다.
아릴리튬 시약 또는 그리냐드 시약은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 구체적으로, 해당 아릴리튬 시약 또는 아릴 (헤테로사이클릭 포함) 마그네슘 시약은, n-, sec- 또는 tert-부틸리튬과 같은 알킬리튬 시약 또는 이소프로필마그네슘 브로마이드와 같은 그리냐드 시약 등의 시판 유기금속 시약, 또는 금속 마그네슘과 아릴할라이드 화합물 간의 할로겐-금속 교환을 통해, 제조할 수 있다.
본 공정에 사용되는 용매는 출발 물질과 사용 시약에 따라 달라지며, 반응을 저해하지 않고 출발 물질이 일정 수준으로 용해되고 반응 중에 항상 불활성인 한, 특별히 한정되지 않는다. 용매의 바람직한 예로는 유기 용매, 예컨대 디에틸 에테르, 테트라하이드로푸란, 1,4-디옥산, 1,2-디메톡시에탄, 벤젠 및 톨루엔, 및 이들의 혼합 용매를 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.1 내지 48시간이며, 바람직하게는 0.1 내지 12시간이다. 반응 온도는 출발 물질, 사용 시약 등에 따라 달라지며, 바람직하게는, 2가지 성분들의 반응성에 따라, 예컨대 유기금속 시약이 그리냐드 시약인 경우, 온도 최대 0℃, 10℃ 또는 심지어 실온이 적용될 수 있지만, 부산물의 형성을 최소화하기 위해, 낮게, 예컨대 -78℃로 유지된다.
수율 개선 및 반응 시간 단축 등의 우호적인 결과는, 예컨대 첨가제로서 TMEDA (테트라메틸에틸렌디아민), HMPA (헥사메틸포스포르아미드) 또는 루이스 산, 예컨대 보론 트리플루오라이드-디에틸 에테르 착제 (BF3·OEt2)의 첨가에 의해 달성될 수 있다.
공정 A-(ii):
본 공정은, 화합물 A-(2)에 대해 N-O 결합의 환원적인 절단 반응을 수행함으로써, 화합물 A-(3)을 수득하는 공정이다.
N-O 결합의 환원적인 절단 반응은, 예를 들어 아연-아세트산, 금속 촉매, 예를 들어 수소-플래티늄 산화물 또는 리튬 알루미늄 수화물을 이용한 조건 하에 수행될 수 있다.
아연-아세트산 등의 아연을 이용한 반응은, 예컨대 J. Org. Chem. 2003, 68, 1207-1215 및 Org. Lett. 2005, 7, 5741-5742에 기술된 바와 동일한 조건에서 수행될 수 있다. 사용되는 산의 예로는 아세트산, 포름산 및 염산을 포함한다. 본 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않으며 출발 물질이 어느 정도로 용해되는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 메탄올, 에탄올, 1,4-디옥산, THF 및 물을 포함한다. 또한, 상기 산은 용매로서 이용될 수 있다. 반응 온도는 통상 -20℃ 내지 용매 환류 온도이며, 바람직하게는 빙랭 온도 내지 용매 환류 온도이다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 5분 내지 48시간, 바람직하게는 5분 내지 24시간이다.
수소-플래티늄 산화물과 같은 금속 촉매를 이용한 반응은 예컨대 Tetrahedron: Asymmetry, 1994, 5, 1018-1028 및 Tetrahedron, 1997, 53, 5752-5746에 기술된 바와 동일한 조건에서 수행될 수 있다. 화합물 A-(3)은 예를 들어 화합물 A-(2)를 메탄올 등의 용매 중에서 촉매로서 플래티늄 산화물을 이용한 수소화에 의해 수득할 수 있다.
리튬 알루미늄 수화물을 이용한 반응은 예를 들어 Bull. Chem. Soc. Jpn., 1993, 66, 2730-2737에 기술된 바와 동일한 조건에서 수행될 수 있다. 화합물 A-(3)은 예컨대 에테르 등의 용매 중에서 리튬 알루미늄 수화물을 이용하여 화합물 A-(2)를 환원시킴으로써 수득할 수 있다.
공정 A-(iii):
본 공정은, 화합물 A-(3)으로부터 화합물 A-(4)를 수득하는 공정이다. 티오우레아 유도체 A-(4)는 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 방법에 의해 화합물 A-(3)으로부터 수득할 수 있다.
화합물 A-(4)는 디클로로메탄, 톨루엔 또는 에틸 아세테이트 등의 용매 중에서 화합물 A-(3)을 벤조일 이소티오시아네이트와 반응시킴으로써, 본 공정에서 수득할 수 있다. 이러한 반응은 예컨대 J. Med. Chem. 1990, 33, 2393-2407에 기술된 바와 동일한 조건에서 수행될 수 있다. 본 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않으며 출발 물질이 어느 정도로 용해되는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 디클로로메탄, 클로로포름, 톨루엔, 1,4-디옥산, THF 및 에틸 아세테이트를 포함한다. 반응 온도는 통상 -20℃ 내지 용매 환류 온도이며, 바람직하게는 빙랭 온도 내지 실온이다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 5분 내지 48시간, 바람직하게는 5분 내지 24시간이다.
공정 A-(iv):
본 공정은 화합물 A-(4)의 고리화에 의해 화합물 A-(5)를 수득하는 방법이다.
이 반응에서, 화합물 A-(4)은 화합물 A-(4)의 알코올을 활성화함으로써 화합물 A-(5)를 수득하기 위한 다양한 조건 하에서 고리화될 수 있다.
예컨대, 화합물 A-(5)는 예컨대 진한 염산 등의 산의 존재 하에 메탄올 등의 용매 중에서 화합물 A-(4)를 가열함으로써 본 반응에서 수득할 수 있다. 본 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않으며 출발 물질이 어느 정도로 용해되는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올 및 물, 이들의 혼합 용매 등의 용매 및 용매로서 사용되는 산을 포함한다. 반응은 용매의 존재 또는 부재 하에 작용하기 위한 적정 산의 1당량 내지 과량을 사용함으로써 수행될 수 있다. 사용되는 산의 예로는 진한 염산, 하이드로브롬산, 황산, 트리플루오로아세트산, 메탄설폰산, 트리플루오로메탄설폰산 및 이의 혼합물을 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다. 반응 온도는 통상 빙랭 온도 내지 용매 환류 온도이다.
다른 예로, 화합물 A-(5)는, 피리딘과 같은 염기의 존재 하에 디클로로메탄 등의 용매 중에서 화합물 A-(4)를 트리플루오로메탄설폰 무수물과 반응시킴으로써, 수득할 수 있다. 본 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않으며 출발 물질이 어느 정도로 용해되는 한 특별히 한정되지 않는다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 용매가 항상 필요한 것은 아니며, 예컨대 염기가 피리딘인 경우에 반응이 역시 용매의 부재 하에 이루어질 수 있다는 것을 알 것이다. 용매의 예로는 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, THF, 1,2-디메톡시에탄 및 톨루엔, 및 이들의 혼합 용매 등의 용매를 포함한다. 반응은 용매 중에서 적정 염기 1 내지 20 당량을 사용하여 수행할 수 있다. 사용되는 염기의 예로는 피리딘, 2,6-루티딘, 소듐 카보네이트, 포타슘 카보네이트 및 이의 혼합물을 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 24시간, 바람직하게는 0.5 내지 12시간이다. 반응 온도는 통상 -78℃ 내지 실온이다.
공정 A-(v):
본 공정은, 화합물 A-(5)의 알코올 보호기를 탈보호화함으로써 화합물 A-(6)를 수득하는 방법이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 다양한 적정 알코올 보호기가 선택될 수 있으며, 보호기의 선택은 탈보호에 필요한 조건과 화학적 안정성에 의해 영향을 받는다는 것을 알 것이다. 적합한 보호기는 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Chemistry, Third Edition", John Wiley & Sons (1999)에 기술되어 있다.
보호기가 트리틸 (트리페닐메틸)인 경우, 탈보호에 적합한 조건은 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Chemistry, Third Edition", John Wiley & Sons (1999), P. 102-104에서 확인할 수 있다.
예컨대, 화합물 A-(6)는 산 처리에 의해 화합물 A-(5)에서 트리틸 보호기를 제거함으로써 제조할 수 있다. 선택되는 산에 따라, 이것이 용매로 작용하거나, 또는 용매가 또한 첨가될 수 있다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않고 출발 물질을 어느 정도 용해시킬 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 알코올 용매, 예컨대 메탄올 및 에탄올을 포함하며, 이는 물과 조합하여 사용되거나 사용되지 않을 수 있다. 적합한 용매 시스템의 예는 메탄올 수용액이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 화합물 A-(5)가 용매에 용해는지 용해되지 않는지, 또는 일부 용해되는지를 알 것이다. 사용되는 산은 특별히 한정되지 않는다. 산의 예로는 미네랄 강산, 예컨대 농축 염산을 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다. 반응 온도는 통상 빙랭 온도 내지 용매 환류 온도이며, 바람직하게는 실온이다.
다른 예로, 반응은 용매없이 산과 수행될 수 있다. 이러한 산의 예로는 포름산을 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.1 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.1 내지 24시간이다. 반응 온도는 통상 빙랭 온도 내지 용매 환류 온도이며, 바람직하게는 실온이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이러한 조건에서 원하는 알코올 외에도 포르메이트 에스테르가 동시에 만들어질 수 있음을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면 반응의 모니터링 방법과 전술한 포르메이트 에스테르의 제조 방식을 알 것이다. 또한, 당해 기술 분야의 당업자는, 포르메이트 에스테르를 원하는 알코올로 변환하는 방법을 인지할 것이다. 예를 들어, 포르메이트 에스테르는 에스테르를, 예를 들어 알코올, 예컨대 메탄올 또는 에탄올을 염기, 예로 트리에틸아민의 존재 하에 이용하여 가수분해함으로써, 알코올로 변환시킬 수 있다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.1 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.1 내지 24시간이다. 반응 온도는 통상 빙랭 온도 내지 용매 환류 온도이다.
공정 A-(vi):
본 공정은, 공정 A-(vi)-a에 개괄된 바와 같이 화합물 A-(6)의 일차 알코올을 CH2F로, 또는 공정 A-(vi)-b 및 c에 개괄된 바와 같이 CHF2로 변환시킴으로써, 화합물 A-(6)로부터 화합물 A-(7)을 수득하는 방법이며, 이때 R은 화합물 -(I)에서 정의된 바와 동일하다.
공정 A-(vi)-a
본 공정은, 알코올의 활성화에 의해 화합물 A-(6)의 일차 알코올을 CH2F로 변환하고 플루오라이드 등가체로 치환함으로써, R = CH2F인 화합물 A-(6)로부터 화합물 A-(7)을 수득하는 공정이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 상기 알코올의 활성화와 플루오라이드 등가체에 의한 치환이 하나의 시약을 이용하여 수행될 수 있다는 것을 알 것이다. 이러한 시약의 예로는 디에틸아미노설퍼 트리플루오라이드 (DAST, J. Org. Chem. 1975, 40, 574), 비스-(2-메톡시에틸)아미노설퍼 트리플루오라이드 (deoxo-fluor, Synthesis, 2002, 17, 2561; J. Org. Chem. 1999, 64, 7048; Chem. Commun. 1999, 215), 디에틸아미노디플루오로설피늄 테트라플루오로보레이트 (XtalFluor-E, J. Org. Chem. 2010, 75, 3401), 모르폴리노디플루오로설피늄 테트라플루오로보레이트 (XtalFluor-M, J. Org. Chem. 2010, 75, 3401) 및 퍼플루오로-1-부탄설포닐 플루오라이드 (PBSF, Tetrahedron Lett. 1995, 36, 2611)가 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 일부 경우에, 다른 소스의 플루오라이드를 제공하기 위해 부가적인 시약을 첨가하는 것이 필연적이거나 유익할 수 있음을 알 것이며, 이러한 시약의 예로는 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드 (TEA.3HF), 트리에틸아민 디하이드로플루오라이드 (TEA.2HF) 및 수소 플루오라이드가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않고 출발 물질을 어느 정도 용해시킬 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 용매, 예컨대 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, THF, 및 이들의 혼합 용매를 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 24시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 12시간이다. 반응 온도는 통상 0℃ 내지 실온이다.
공정 A-(vi)-b 및 c
이 공정은, 알코올의 알데하이드로의 산화에 의해 화합물 A-(6)의 일차 알코올의 CHF2로의 변환 (공정 b)을 통해, 그리고 불소화 시약과의 반응에 의해 알데하이드의 디플루오로메틸 모이어티 (공정 c)로의 변환을 통해, R = CHF2인 화합물 A-(6)로부터 화합물 A-(7)을 수득하는 공정이다.
공정 A-(vi)-b
본 공정은, 화합물 A-(6)를 산화 반응에 투입함으로써, 알코올 A-(6)를 알데하이드로 변환하는 공정이다. 일차 알코올을 알데하이드로 변환하는 산화 조건은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 조건과 시약의 예로는, 적정 용매, 예컨대 DCM 중에서, 적정 반응 온도, 예컨대 0℃ - 실온에서의, 데스-마틴 페리오디난과의 반응을 포함한다 (J. Org. Chem. 1983, 48, 4155; Org. Synth. Coll. Vol. 10, 696). 당해 기술 분야의 당업자라면 다양한 대체적인 조건으로, 예컨대 TPAP (Synthesis 1994, 639), Swern 산화 (Synthesis 1981, 165-185; Org. React. 39: 297-572; Synthesis 1990: 857-870), Parikh-Doering 산화 (J. Am. Chem. Soc., 1967, 89: 5505-5507), Corey-Kim 산화 (J. Am. Chem. Soc 1972, 94, 7586), Pfitzner-Moffatt (J. Am. Chem. Soc. 1963,85, 3027)를 이용하거나, 또는 피리디늄 클로로크로메이트 (PCC) (Tetrahedron 1990, 46: 4417-4420; Tetrahedron Lett., 1975, 16, 2647-2650)를 이용함으로써, 반응을 수행할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
당해 기술 분야의 당업자라면 특정 알데하이드 취급시 주의가 요구됨을 알 것이다.
공정 A-(vi)-c
본 공정은 알데하이드를 디플루오로메틸기로 변환하는 공정이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 알데하이드의 디플루오로메틸기로의 변환이 불화 시약(fluorinating reagent)을 이용하여 수행될 수 있다는 것을 알 것이다. 이러한 시약의 예로는 디에틸아미노설퍼 트리플루오라이드 (DAST, J. Org. Chem. 1975, 40, 574), 비스-(2-메톡시에틸)아미노설퍼 트리플루오라이드 (deoxo-fluor, Synthesis, 2002, 17, 2561; J. Org. Chem. 1999, 64, 7048; Chem. Commun. 1999, 215), 디에틸아미노디플루오로설피늄 테트라플루오로보레이트 (XtalFluor-E, J. Org. Chem. 2010, 75, 3401) 및 모르폴리노디플루오로설피늄 테트라플루오로보레이트 (XtalFluor-M, J. Org. Chem. 2010, 75, 3401)가 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 일부 경우에, 다른 플루오라이드 소스를 제공하기 위해 부가적인 시약을 첨가하는 것이 필연적이거나 유익할 수 있다는 것을 알 것이며, 이러한 시약의 예로는 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드 (TEA.3HF), 트리에틸아민 디하이드로플루오라이드 (TEA.2HF) 및 하이드로겐 플루오라이드가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않고 출발 물질을 어느 정도 용해시킬 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 용매, 예컨대 디클로로메탄 (DCM), 디클로로에탄 (DCE), 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, THF, 및 이들의 혼합 용매를 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 24시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 12시간이다. 반응 온도는 통상 0℃ 내지 용매 환류 온도이며, 바람직하게는 0℃ 내지 실온이다.
공정 A-(vii)
본 공정은, 화합물 A-(7)의 보호기를 탈보호함으로써 화합물 A-(8)을 수득하는 방법이다. 화합물 A-(8)은 벤조일기를 제거하기 위해 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 탈보호 조건 하에 수득할 수 있다. 예를 들어, 화합물 A-(8)은, 예를 들어 DBU와 같은 염기의 존재 하에 메탄올 등의 용매 중에서 화합물 A-(7)을 가열함으로써 본 반응에서 수득할 수 있다. 본 반응은, 예를 들어 Synth. Commun. 2002, 32 (2), 265-272에 기술된 바와 동일한 조건에서 수행될 수 있다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않으며 출발 물질이 어느 정도로 용해되는 한, 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 메탄올, 에탄올 및 1-프로판올 등의 용매를 포함한다. 반응은 이러한 용매 중에서 적정 염기 1 내지 20 당량을 이용하여 수행할 수 있다. 사용되는 염기의 예로는 DBU를 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 24시간, 바람직하게는 0.5 내지 12시간이다. 반응 온도는 통상 실온 내지 용매 환류 온도이다.
다른 예로, 화합물 A-(8)은, 예를 들어, 화합물 A-(7)을 포타슘 카보네이트와 같은 무기 염기와 함께 가열함으로써 본 반응에서 수득할 수 있다. 본 반응에 사용되는 용매는, 반응을 저해하지 않으며 출발 물질이 어느 정도로 용해되는 한, 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 메탄올, 에탄올 및 1-프로판올 등의 용매를 포함한다. 반응은 이러한 용매 중에서 적정 염기 1 내지 20 당량을 이용하여 수행될 수 있으며, 바람직하게는 약간 과량으로 사용된다. 사용되는 염기의 예로는 포타슘 카보네이트를 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 24시간, 바람직하게는 0.5 내지 12시간이다. 반응 온도는 통상 실온 내지 용매 환류 온도이며, 바람직하게는 50 - 100℃이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 선택된 용매가 반응 온도를 이의 환류 온도까지로 제한할 것임을 알 것이다. 적정 용매의 예로는 환류성 메탄올을 포함한다.
공정 A-(viii):
본 공정은 화합물 A-(8)의 질화 반응에 의해 화합물 A-(9)을 수득하는 공정이다. 이러한 질화 반응에서, 화합물 A-(9)은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 방법에 의해 화합물 A-(8)으로부터 수득할 수 있다. 반응에 사용되는 질화제의 예로는 포타슘 나이트레이트/진한 황산, 발연 질산/진한 황산 및 발연 질산/무수 아세트산을 포함한다. 반응에 적합한 용매로는 트리플루오로아세트산을 포함한다. 반응 온도는 특별히 한정되지 않으며, 통상 -20℃ 내지 실온이며, 바람직한 반응 온도는 0 - 10℃를 포함한다.
공정 A-(ix):
본 공정은, 화합물 A-(9)의 아미노기를 t-부톡시카르보닐화함으로써, 화합물 A-(10)을 수득하는 공정이다.
본 반응은, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Chemistry, Third Edition", John Wiley & Sons (1999), P. 518-525 등의 문헌에 기술된 조건과 같은, 아미노 화합물의 t-부톡시카르보닐화에 일반적으로 사용되는 조건과 동일한 조건 하에 수행될 수 있다. 화합물 A-(11)은, 예를 들어, 테트라하이드로퓨란과 같은 용매 중에서 화합물 A-(9)을 디-tert-부틸 디카보네이트와 반응시켜, 수득할 수 있다. 다른 용매로는 아세토니트릴 및 DMF를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 반응 혼합물에 필수적인 것은 아니나 염기를 첨가할 수 있다. 적정 염기의 예로는 트리에틸아민과 디이소프로필에틸아민이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 반응 온도는 특별히 한정되지 않으며, 통상 실온 내지 환류이며, 바람직하게는 실온 내지 60℃이다.
공정 A-(x):
본 공정은 화합물 A-(10)으로부터 화합물 A-(11)을 수득하는 공정이다.
화합물 A-(11)은, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 합성 방법으로 니트로 화합물 A-(10)을 환원함으로써, 합성된다. 이러한 방법의 예로는 귀금속 촉매, 예컨대 라니 니켈(Raney nickel), 팔라듐, 루테늄, 로듐 또는 플래티늄을 이용한 촉매적 수소화에 의한 환원을 포함한다. 그외 환원제로는 주석 클로라이드를 예로 포함한다. 용매의 예로는 알코올성 용매, 예컨대 메탄올, 에탄올 및 1-프로판올을 포함하며, 바람직하게는 에탄올이다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 24시간, 바람직하게는 0.5 내지 18시간이다. 반응 온도는 통상 실온이다. 다른 환원 반응 조건으로는, 철과, 암모늄 클로라이드 또는 염산과 같은 첨가제를, 에탄올과 같은 알코올성 용매 중에서, 적정 반응 온도, 예컨대 65℃에서 반응시키는 것을 포함한다.
공정 A-(xi):
본 공정은 화합물 A-(11)을 카르복실산 및 축합제와 축합함으로써, 화합물 A-(11)으로부터 화합물 A-(12)을 수득하는 공정이다. 축합 반응은 아래 문헌에 기술되어 있으며 통상적으로 사용되는 조건과 동일한 조건에서 수행될 수 있다. 공지 방법의 예로는 J. Med. Chem., 1991, 34 (1), 227-234, Heterocycles, 1991, 32 (10), 1968-1972, 및 J. Med. Chem., 1994, 37 (7), 998-1014에 기술된 방법을 포함한다.
화합물 A-(11)은 유리 형태 또는 염일 수 있다.
본 반응에서의 용매는 반응을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 테트라하이드로퓨란, 1,4-디옥산, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, N,N-디메틸포름아미드, 톨루엔, 아세토니트릴 및 자일렌을 포함한다. 축합제의 예로는, CDI (N,N'-카르보닐디이미다졸), Bop (1H-1,2,3-벤조트리아졸-1-일옥시(트리(디메틸아미노))포스포늄 헥사플루오로포스페이트), DCC (N,N-디사이클로헥실카르보디이미드), 디에틸포스포릴 시아니드, PyBOP (벤조트리아졸-1-일옥시트리(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트) 및 WSC / EDC·HCl (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드)를 포함한다. 적합한 조건은 N,N'-카르보닐 디이미다졸 등의 산을 활성화하는 제제를 포함한다. 산은 화합물 A-(11)에 대해 1 당량 내지 과량으로 사용될 수 있다. 트리에틸아민 또는 N,N-디이소프로필에틸아민과 같은 유기 염기가 필요에 따라 1 당량 내지 다량으로 첨가될 수 있다.
반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다. 반응 온도는 사용되는 원료 물질, 용매 등에 따라 달라지며, 특별히 한정되지 않는다. 빙랭 온도 내지 용매 환류 온도가 가능하며, 빙랭 내지 실온이 바람직하다.
다른 예로, 화합물 A-(12)은, 바람직한 카르복실산을 대응되는 산 클로라이드로 변환시킨 다음, 산 클로라이드를 화합물 A-(11)과 반응시킴으로써, 수득할 수 있다. 산 클로라이드는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 카르복실산은, 용매, 예컨대 디클로로메탄, N,N'-디메틸이미다졸린-2-온, NMP 또는 DMF의 존재 또는 부재 하에 티오닐 클로라이드와 반응시킴으로써, 대응되는 산 클로라이드로 변환시킬 수 있다. 바람직한 카르복실산에 대해 티오닐 클로라이드 1 내지 2 당량이 사용될 수 있다. 반응 온도는 -30℃ 내지 환류이며, 바람직하게는 -10℃ 내지 실온이다. 카르보닐 디이미다졸과 같은 첨가제도 사용될 수 있다. 산 클로라이드는, 또한, 산에 옥살릴 클로라이드를 디클로로메탄과 같은 용매 중에서 DMF의 존재 하에 처리함으로써, 형성시킬 수 있다. 반응 온도는 -30℃ 내지 실온이며, 바람직하게는 -10℃ 내지 실온이다.
다른 예로, 화합물 A-(12)은, 바람직한 카르복실산을 혼성 산 무수물로 변환시킨 다음, 혼성 산 무수물을 화합물 A-(11)과 반응시킴으로써, 수득할 수 있다. 혼성 산 무수물은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 합성할 수 있다. 합성은, 바람직한 카르복실산을 예컨대 트리에틸아민 등의 염기의 존재 하에 에틸 클로로포르메이트 또는 이소프로필 클로로포르메이트 등의 클로로포르메이트와 반응시켜, 수행된다. 바람직한 카르복실산에 대해 클로로포르메이트와 염기는 1 내지 2 당량으로 사용된다. 반응 온도는 -30℃ 내지 실온이고, 바람직하게는 -20℃ 내지 실온이다.
상기 혼성 산 무수물을 화합물 A-(11)과 축합하는 단계는, 혼성 산 무수물을 화합물 A-(11)과 예컨대 디클로로메탄, 테트라하이드로퓨란 또는 N,N-디메틸포름아미드 등의 용매 중에서 반응시킴으로써, 수행된다. 화합물 A-(11)에 대해 바람직한 카르복실산이 1 당량 내지 과량으로 사용된다.
반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 48시간, 바람직하게는 0.5 내지 12시간이다. 반응 온도는 -20℃ 내지 50℃이고, 바람직하게는 -20℃ 내지 실온이다.
다른 예로, 화합물 A-(12)은, 바람직한 카르복실산을 활성형 에스테르로 변환시킨 후 활성형 에스테르를 화합물 A-(11)과 반응시킴으로써, 수득할 수 있다. 활성형 에스테르를 수득하는 공정은, 예를 들어 바람직한 카르복실산을 활성형 에스테르 합성 시약과 1,4-디옥산, 테트라하이드로퓨란 또는 N,N-디메틸포름아미드 등의 용매 중에서 DOC 등의 축합제의 존재 하에 반응시킴으로써, 수행된다. 활성형 에스테르 합성 시약의 예로는 N-하이드록시숙신이미드를 포함한다. 화합물 A-(11)에 대해 활성형 에스테르 합성 시약 및 축합제는 1 내지 1.5 당량이 사용된다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 48시간, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다.
반응 온도는 -20℃ 내지 50℃이고, 바람직하게는 -20℃ 내지 실온이다.
활성형 에스테르를 화합물 A-(11)과 축합하는 공정은, 예를 들어, 디클로로메탄, 테트라하이드로퓨란 또는 N,N-디메틸포름아미드와 같은 용매 중에서, 활성형 에스테르를 화합물 A-(11)과 반응시킴으로써, 수행된다. 화합물 A-(11)에 대해 활성형 에스테르가 1 당량 내지 과량으로 사용된다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 48시간, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다. 반응 온도는 -20℃ 내지 50℃이고, 바람직하게는 -20℃ 내지 실온이다.
공정 A-(xii):
본 공정은 화합물 A-(12)의 t-부톡시카르보닐기를 탈보호함으로써 화합물 A-(13)을 수득하는 공정이다.
반응은 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Chemistry, Third Edition", John Wiley & Sons (1999), P. 518-525 등의 문헌에 기술된 조건과 같이, t-부톡시카르보닐기의 탈보호 반응에 통상적으로 사용되는 조건과 동일한 조건 하에 수행될 수 있다. 화합물 A-(13)은 화합물 1-(12)을 강산, 예컨대 트리플루오로아세트산과 함께 용매의 존재 하에 또는 부재 하에 반응시켜, 수득할 수 있다. 적정 용매로는 디클로로메탄을 포함한다. 다른 산으로는 메탄올, 디에틸 에테르 또는 디옥산 등의 적정 용매 중의 염산을 예로 포함한다.
반응 온도는 정상적으로는 빙랭 내지 80℃이며, 바람직하게는 실온이다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 5분 내지 48시간, 바람직하게는 5분 내지 12시간이다.
B. 일반 제조 방법 B:
식에서, X 및 R은 상기 정의된 바와 같이 정의된다.
일반 제조 방법 B는 공정 B-(i)에서 공정 B-(ii)로 구성된 다단계를 통해 원료 화합물 A-(9)으로부터 본 발명에 따른 화합물 (I)의 유도체인 화합물 A-(13)을 제조하는 대안적인 방법이다.
화합물 A-(9)은 일반 제조 방법 A 또는 실시예들에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
Figure pct00011
공정 B-(i):
본 공정은 화합물 A-(9)으로부터 화합물 A-(14)을 수득하는 공정이다.
화합물 A-(14)은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 합성 방법으로 니트로 화합물 A-(9)을 환원함으로써 합성된다. 환원 반응 조건은 에탄올과 같은 알코올 용매 중에서, 적정 반응 온도에서, 예컨대 실온 내지 용매 환류 온도, 바람직하게는 승온된 온도, 예컨대 55 - 65℃에서, 암모늄 클로라이드 또는 염산 등의 첨가제를 이용한, 철과의 반응을 포함한다. 방법의 다른 예로는, 라니 니켈, 팔라듐, 루테늄, 로듐 또는 플래티늄 등의 귀금속 촉매를 이용한 촉매적 수소화에 의한 환원을 포함한다. 다른 환원제로는 주석 클로라이드 또는 AcOH 중의 Zn과의 반응을 포함한다. 용매의 예로는 알코올 용매, 예컨대 메탄올, 에탄올 및 1-프로판올을 포함하며, 바람직하게는 에탄올이다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 24시간, 바람직하게는 0.5 내지 18시간이다. 반응 온도는 통상 실온이다.
공정 B-(ii):
본 공정은 화합물 A-(14)을 카르복실산 클로라이드와 축합함으로써, 화합물 A-(14)으로부터 화합물 A-(13)을 수득하는 공정이다.
화합물 A-(13)은, 바람직한 카르복실산을 대응되는 산 클로라이드로 변환시킨 다음, 산 클로라이드를 화합물 A-(14)과 반응시킴으로써, 수득할 수 있다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 48시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 12시간이다. 산 클로라이드는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 카르복실산은, 용매, 예컨대 디클로로메탄, N,N'-디메틸이미다졸린-2-온, NMP 또는 DMF의 존재 또는 부재 하에 티오닐 클로라이드와 반응시킴으로써, 대응되는 산 클로라이드로 변환시킬 수 있다. 바람직한 카르복실산에 대해 티오닐 클로라이드 1 내지 2 당량이 사용될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 사용되는 반응 조건의 선택이 반응 성과에 영향을 미칠 수 있음을, 예컨대, 조건이 산 클로라이드가 이소티오우레아 모이어티와 반응하는지에 영향을 미칠 수 있다는 것을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 티오닐 클로라이드의 카르복실산의 반응으로 바람직한 산 클로라이드의 형성 외에도 1 당량의 염산이 동시에 형성된다는 것을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 현 조건이 이렇게 형성된 염산을 제거하는 방법을 채택하지 않는다는 것을 알 것이다. 이 반응에서 형성되는 염산은 유리한 결과일 수 있거나 아닐 수 있는 반응의 선택성에 영향을 미치거나 미치지 않을 수 있다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 48시간, 바람직하게는 0.5 내지 12시간이다. 반응 온도는 -30℃ 내지 환류이며, 바람직하게는 -10℃ 내지 실온이다. 산 클로라이드는, 또한, 산에 옥살릴 클로라이드를 디클로로메탄과 같은 용매 중에서 DMF의 존재 하에 처리함으로써, 형성시킬 수 있다. 반응 온도는 -30℃ 내지 실온이며, 바람직하게는 -10℃ 내지 실온이다.
C. 일반 제조 방법 C:
Figure pct00012
식에서, X는 전술한 바와 같이 정의된다.
일반 제조 방법 C는 공정 C-(i)에서 공정 C-(ix)으로 구성된 다단계 공정을 통해 원료 화합물 A-(15)으로부터, 본 발명에 따른, R이 CH2F일 경우, 화합물 A-(7)의 유도체인, 화합물 A-(24)를 제조하는 대안적인 방법이다.
화합물 A-(15)은 상업적으로 구입가능하다.
공정 C-(i):
본 공정은, 에폭사이드 A-(15)를 플루오라이드 등가체로 개환하여 화합물 A-(16)를 수득함으로써, 화합물 A-(16)을 수득하는 공정이다.
구체적으로, 에폭사이드 A-(15)는 에폭사이드에 피리딘 하이드로플루오라이드를 처리함으로써 개환할 수 있다. 바람직하게는, 반응은 실온 미만의 온도에서, 바람직하게는 -30 내지 4℃에서 수행되어야 한다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않고 출발 물질을 어느 정도 용해시킬 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 적정 용매의 예로는 디클로로메탄이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 염기를 첨가하는 것이 유익하거나 유리할 수 있다. 염기에 대한 적정 예로는 피리딘이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 5분 내지 24시간이며, 바람직하게는 0.5 - 6시간이다.
공정 C-(ii):
본 공정은, 3단계 연속 공정으로 알코올 A-(16)으로부터 화합물 A-(17)을 수득하는 공정이다.
1차 단계로, 화합물 A-(16)에 용매 중에 염기를 처리하여, 대응되는 (S)-2-(플루오로메틸)옥시란을 제조한다. 본 반응에 적합한 용매의 예로는 THF를 포함한다. 적합한 염기의 예로는 포타슘 헥사메틸디실라자이드를 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다. 반응 온도는 통상 -20℃ 내지 실온이다.
2차 및 3차 단계로, 에폭사이드를 설포늄 일라이드로 개환하여, 중간산물 알릴 알콕사이드를 제조한 다음, 이를 알킬화하여 화합물 A-(17)을 수득함으로써, 중간산물 (S)-2-(플루오로메틸)옥시란을 대응되는 알릴 알코올로 변환한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이러한 변환은 하나의 포트에서 수행되거나 또는 2가지의 별개의 반응으로 수행할 수 있음을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자는, 2가지의 별개의 반응을 수행하는 것에 비해 하나의 포트 반응의 이점과 문제점을 알 것이며, 요건에 따라 최상의 방법을 선택할 것이다.
구체적으로, 중간산물 에폭사이드 (S)-2-(플루오로메틸)옥시란을 트리메틸설포늄 요오드화물의 음이온에 의해 개환하고 디메틸설파이드가 결과적으로 소실됨으로써, 대응되는 알릴 알콕사이드를 수득할 수 있다. 트리메틸설포늄 요오드화물은 적정 염기, 예컨대 부틸 리튬 또는 리튬 헥사메틸디실라자이드로 탈보호화할 수 있다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 간섭하지 않는 한 특별히 한정되지 않는다. 적정 용매의 예로는 THF를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이 경우에, 용어 용매가 반응이 수행되고 시약이 용해되지 않을 수 있는 액체를 지칭한다. 바람직하게는, 반응은 실온 미만의 온도에서, 바람직하게는 -30 내지 20℃에서 수행되어야 한다. 첨가 후, 반응물을 실온으로 가온하여 반응을 촉진시킬 수 있다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 5분 내지 24시간이며, 바람직하게는 1 - 6시간이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 이러한 반응으로 제조되는 중간산물 알콕사이드를 tert-부틸 브로모아세테이트와 같은 알킬화제와 직접 반응시킬 수 있으며, 이러한 반응이 부가적인 용매를 첨가하거나 첨가하지 않고 진행될 수 있다는 것을 알 것이다. 부가적인 용매가 반응 촉진을 위해 필요한 경우, 용매, 예컨대 DMF 또는 NMP가 적합하다. 반응 온도는 특별히 한정되지 않는다. 적정 반응 온도는 실온 내지 80℃, 바람직하게는 실온이다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 5분 내지 1주일, 바람직하게는 1 - 48시간이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 중간산물 알콕사이드를 퀀칭, 분리 및 정제한 다음, 독립적인 알킬화 조건에 투입할 수 있음을 알 것이다. 이 반응은 알코올 화합물의 O-알킬화 반응에 통상적으로 사용되는 동일한 조건에서 수행할 수 있다 (예, Tetrahedron Lett. 2005, 46, 7751-7755에 기술된 조건). 이 반응에서, 화합물 A-(17)은, 예컨대 수소화나트륨와 같은 염기를 THF 중의 중간산물 알코올 용액에 첨가하여 알콕사이드를 제조한 다음, 알콕사이드를 tert-부틸 브로모아세테이트와 반응시킴으로써, 수득할 수 있다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않고 출발 물질을 어느 정도 용해시킬 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 THF, DMF 및 디메틸 설폭사이드와 같은 용매를 포함한다. 반응은 이러한 용매의 존재 하에 1 내지 3당량의 적정 염기를 작용하도록 함으로써, 수행할 수 있다. 사용되는 염기의 예로는 수소화나트륨, 수소화칼륨 및 t-부톡시포타슘을 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 12시간이다. 반응 온도는 통상 -20℃ 내지 50℃이다.
이 반응에 테트라부틸암모늄 요오드화물 등의 염을 첨가함으로써, 수율 개선 등의 보다 바람직한 결과를 달성할 수 있다.
다른 예로, 화합물 A-(17)은 상 전이 조건에서 알킬화 반응을 수행함으로써 중간산물 알릴 알코올로부터 수득할 수 있다. 반응의 용매는 반응을 간섭하지 않고 물과 혼합되지 않는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매에 대한 적합한 예로는 디클로로메탄과 클로로포름이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 사용되는 염기는 수용성일 수 있으며, 이러한 염기의 예로는 수산화나트륨 수용액 및 수산화칼륨 수용액이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 아울러, 반응에는 상 전이 촉매를 첨가하여야 한다. 적합한 상 전이 촉매의 예로는 테트라부틸암모늄염, 예컨대 테트라부틸암모늄 수소 설페이트가 있으나, 이로 한정되지 않는다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다. 반응 온도는 통상 빙랭 내지 40℃이다
공정 C-(iii):
본 공정은, 에스테르기를 탈보호화한 다음 Weinreb 아미드를 형성함으로써, 화합물 A-(17)으로부터 화합물 A-(18)을 수득하는 2단계 순차적인 반응이다.
구체적으로, 화합물 A-(17)의 tert-부틸 에스테르는 tert-부틸 에스테르 화합물의 탈보호화에 일반적으로 사용되는 조건과 동일한 조건에서 탈보호화할 수 있다 (예, T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Chemistry, Third Edition", John Wiley & Sons (1999), p. 404-408 문헌에 기술된 조건). 이 반응에서, 화합물 A-(17)은 예를 들어 용매 및 산으로서 포름산과 같은 적정 용매 중에서 적정 산과 반응시킬 수 있다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않고 출발 물질을 어느 정도 용해시킬 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다. 반응 온도는 통상 빙랭 온도 내지 60℃이다.
그런 후, 표준적인 아미드 형성 조건 하에 N,O-디메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드의 반응에 의해, 즉, 중간산물 산을 N,O-디메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드와 축합제를 이용하여 축합함으로써, 중간산물 산을 Weinreb 아미드 (Tetrahedron Lett. 1981, 22, 3815)로 변환할 수 있다. 다른 예로, 이 공정은 중간산물 산을 N,O-디메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드와 아실화 반응에 의해 축합하여, 화합물 A-(18)을 수득하는 공정이다.
중간산물 산과 N,O-디메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드의 축합제를 이용한 축합 반응은 아래 문헌에 언급되고 통상적으로 사용되는 조건과 동일한 조건에서 수행할 수 있다. 공지 방법의 예로는 J. Med. Chem., 1991, 34 (1), 227-234; Heterocycles, 1991, 32 (10), 1968-1972 and J. Med. Chem., 1994, 37 (7), 998-1014의 방법을 포함한다.
N,O-디메틸하이드록실아민은 유리 형태 또는 염일 수 있다.
본 반응에서 용매는 반응을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 테트라하이드로푸란, 1,4-디옥산, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, N,N-디메틸포름아미드, 톨루엔, 아세토니트릴 및 자일렌을 포함한다. 축합제의 예로는 CDI (N,N'-카르보닐디이미다졸), Bop (1H-1,2,3-벤조트리아졸-1-일옥시(트리(디메틸아미노))포스포늄 헥사플루오로포스페이트), DCC (N,N-디사이클로헥실카르보디이미드), 디에틸포스포릴 시아니드, PyBOP (벤조트리아졸-1-일옥시트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트) 및 WSC / EDC·HCl (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 하이드로클로라이드)를 포함한다. 적정 조건은 N,N'-카르보닐 디이미다졸과 같은 산을 활성화하기 위한 제제를 포함한다. 중간산물 산에 대해 N,O-디메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드는 1 당량 내지 과량으로 사용된다. 트리에틸아민 등의 유기 염기가 1 당량 내지 과량으로 필요에 따라 첨가될 수 있다.
반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다. 반응 온도는 사용되는 원료, 용매 등에 따라 달라지며, 특별히 한정되지 않는다. 빙랭 온도 내지 용매 환류 온도가 허용되며, 빙랭 내지 실온이 바람직하다.
공정 C-(iv):
본 공정은, Tetrahedron Lett. 1981, 22, 3815에 언급된 바와 같이 유기금속 (아릴리튬 시약 또는 그리냐드 시약) 시약을 Weinreb 아미드, A-(18)과 반응시켜 화합물 A-(19)을 수득하는 공정이다.
본 공정에서 반응은 예로 Tetrahedron Lett. 1981, 22, 3815에 기술된 조건과 동일한 조건에서 수행할 수 있다.
아릴리튬 시약 또는 그리냐드 시약은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 구체적으로, 해당 페닐 리튬 시약 또는 페닐 마그네슘 (그리냐드) 시약은, 예로, n-, sec- 또는 tert-부틸리튬과 같은 알킬리튬 시약 또는 이소프로필마그네슘 브로마이드와 같은 그리냐드 시약 등의 시판 유기금속 시약, 또는 금속성 마그네슘과 아릴 할라이드 화합물 간의 할로겐-금속 교환을 통해, 제조할 수 있다.
본 공정에 사용되는 용매는 출발 물질과 사용되는 시약에 따라 달라지며, 반응을 저해하지 않고 출발 물질이 일정 수준으로 용해되고 반응 중에 항상 불활성인 한, 특별히 한정되지 않는다. 용매의 바람직한 예로는 유기 용매, 예컨대 디에틸 에테르, 테트라하이드로푸란, 1,4-디옥산, 1,2-디메톡시에탄, 벤젠 및 톨루엔, 및 이들의 혼합 용매를 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.1 내지 48시간이며, 바람직하게는 0.1 내지 12시간이다. 반응 온도는 출발 물질, 사용 시약 등에 따라 달라지며, 예로 유기금속 시약이 그리냐드 시약인 경우, 2가지 성분들의 반응성에 따라, 최대 0℃, 10℃ 또는 심지어 실온이 적용될 수 있지만, 바람직하게는 낮게, 예로 -78 내지 -60℃로 유지된다.
공정 C-(v):
본 공정은 화합물 A-(19)의 옥심화에 의해 화합물 A-(20)를 수득하는 공정이다.
본 공정에서 반응은 Org. Lett. 2007, 9, 753-756; Tetrahedron: Asymmetry 1994, 5, 1018-1028 및 Tetrahedron, 1998, 54, 5868-5882에 언급된 조건과 같이, 카르보닐 화합물의 옥심화 반응에 통상 사용되는 조건과 동일한 조건으로 수행할 수 있다.
구체적으로, 화합물 A-(20)는 예로, 화합물 A-(19)을 하이드록실아민 또는 하이드록실아민 염 (예, 하이드록실아민 하이드로클로라이드 또는 하이드록실아민 설페이트)와 염기의 존재 또는 부재하에 반응시켜 수득할 수 있다.
이 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 바람직한 예로는 유기 용매, 예컨대 에탄올, 메탄올, 테트라하이드로푸란, 1,4-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 및 디클로로메탄, 및 이들 용매와 물의 혼합물을 포함한다. 사용되는 염기의 예로는 소듐 아세테이트, 피리딘, 수산화나트륨, 세슘 하이드록사이드, 바륨 하이드록사이드 및 2,6-루티딘을 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 5분 내지 24시간이며, 바람직하게는 5분 내지 12시간이다. 반응 온도는 통상 -20℃ 내지 용매 환류 온도이며, 더 바람직하게는 0℃ 내지 용매 환류 온도이다.
공정 C-(vi):
본 공정은, 알케닐 옥심 A-(20)의 열적 분자내 사이클로부가에 의해 화합물 A-(21)을 수득하는 공정이다.
반응은 첨가제, 예로 하이드로퀴논의 존재 하에 수행된다.
이 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않는다. 적합한 반응 용매로는 고비점(high boiling) 용매, 예컨대 자일렌을 포함한다. 반응 온도는 특별히 한정되지 않으며, 통상 80 - 200℃ 또는 용매 환류 온도이다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 48시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다.
공정 C-(vii):
본 공정은, 화합물 A-(21)에 대해 N-O 결합의 환원 절단 반응을 수행함으로써 화합물 A-(22)를 수득하는 공정이다.
이 반응은 일반 제조 방법 A, 공정 A-(ii)에 언급된 조건 하에 수행될 수 있다.
공정 C-(viii):
본 공정은 화합물 A-(22)로부터 화합물 A-(23)를 수득하는 공정이다. 티오우레아 유도체 A-(23)은 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 화합물 A-(22)로부터 수득할 수 있다.
이 반응은 일반 제조 방법 A, 공정 A-(iii)에 언급된 조건 하에 수행될 수 있다.
공정 C-(ix):
본 공정은 화합물 A-(23)을 고리화함으로써 화합물 A-(24)를 수득하는 방법이다. 화합물 A-(24)는 R이 CH2F인 화합물 A-(7)의 유도체이다.
이 반응은 일반 제조 방법 A, 공정 A-(iv)에 언급된 조건 하에 수행될 수 있다.
D. 일반 제조 방법 D:
Figure pct00013
상기 식에서, X는 상기 정의와 같이 정의된다.
일반 제조 방법 D는 공정 D-(i)에서 공정 D-(iv)의 다단계 공정을 통해 원료로서 화합물 A-(25)로부터 PG가 Tr인 화합물 A-(2)를 제조하는 다른 방법이다. A-(2)는 본 발명에 따른 화합물 (I)의 중간산물이다.
화합물 A-(25)의 제조는 일반 제조 방법 F 및 G에 언급되어 있다.
공정 D-(i):
본 공정은, 알코올 A-(25)에 염기 및 알킬화제 (클로로아세틸)모르폴린을 처리하여 화합물 A-(26)을 수득함으로써, 화합물 A-(26)을 수득하는 공정이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 반응을 알코올 화합물의 O-알킬화 반응에 통상적으로 사용되는 조건과 동일한 조건에서 수행할 수 있음을 알 것이다 (예, Tetrahedron Lett. 2005, 46, 7751-7755에 언급된 조건). 이러한 반응에서, 화합물 A-(25)는, 예로, 수소화나트륨과 같은 염기를 THF 중의 중간산물 알코올 용액에 첨가하여 알콕사이드를 제조한 다음, 알콕사이드를 tert-부틸 브로모아세테이트와 반응시킴으로써, 수득할 수 있다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않고 출발 물질을 어느 정도 용해시킬 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 THF, DMF 및 디메틸 설폭사이드와 같은 용매를 포함한다. 본 반응은 그러한 용매의 존재 하에 적정 염기 1 내지 3 당량을 적용하여 수행할 수 있다. 사용되는 염기의 예로는 수소화나트륨, 수소화칼륨 및 t-부톡시포타슘을 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 12시간이다. 반응 온도는 통상 -20℃ 내지 50℃이다.
본 반응에 테트라부틸암모늄 요오드화물과 같은 염을 첨가함으로써, 수율 개선 등의 보다 바람직한 결과를 달성할 수 있다.
다른 예로, 화합물 A-(26)은 상 전이 조건에서 알킬화 반응을 수행함으로써 화합물 A-(25)로부터 수득할 수 있다. 본 반응의 용매는 반응을 방해하지 않고 물과 혼합되지 않는 한 특별힌 한정되지 않는다. 용매에 대한 적합한 예로는 디클로로메탄과 클로로포름이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 사용되는 염기는 수용성이며, 이러한 염기의 예로는 수산화나트륨 수용액과 수산화칼륨 수용액이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 또한, 반응에 상 전이 촉매의 첨가가 필요하다. 적합한 상 전이 촉매의 예로는 테트라부틸암모늄 염, 예컨대 테트라부틸암모늄 수소 설페이트가 있으나, 이로 한정되지 않는다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다. 반응 온도는 통상 빙랭 내지 40℃이다.
공정 D-(ii):
본 공정은 Synlett 1997, 12, 1414에 언급된 바와 같이 유기금속 (아릴리튬 시약 또는 그리냐드 시약) 시약을 화합물 A-(26)과 반응시킴으로써 화합물 A-(27)을 수득하는 공정이다.
본 공정에서 반응은 예컨대 Synlett 1997, 12, 1414에 기술된 조건과 동일한 조건에서 수행할 수 있다.
아릴리튬 시약 (헤테로사이클릭 포함) 또는 그리냐드 시약 (헤테로사이클릭 포함)은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 구체적으로, 해당 페닐 리튬 시약 또는 페닐 마그네슘 (그리냐드) 시약은 예로, n-, sec- 또는 tert-부틸리튬과 같은 알킬리튬 시약 또는 이소프로필마그네슘 브로마이드와 같은 그리냐드 시약 등의 시판 유기금속 시약, 또는 금속성 마그네슘과 아릴 할라이드 화합물 간의 할로겐-금속 교환을 통해, 제조할 수 있다. 이소프로필마그네슘 브로마이드 - 리튬 클로라이드 복합체를 이용함으로써 보다 우후적인 결과를 수득할 수 있다.
본 공정에 사용되는 용매는 출발 물질과 사용되는 시약에 따라 달라지며, 반응을 저해하지 않고 출발 물질이 일정 수준으로 용해되고 반응 중에 항상 불활성인 한, 특별히 한정되지 않는다. 용매의 바람직한 예로는 유기 용매, 예컨대 디에틸 에테르, 테트라하이드로푸란, 1,4-디옥산, 1,2-디메톡시에탄, 벤젠 및 톨루엔, 및 이들의 혼합 용매를 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.1 내지 48시간이며, 바람직하게는 0.1 내지 12시간이다. 반응 온도는 출발 물질, 사용 시약 등에 따라 달라지며, 예로 유기금속 시약이 그리냐드 시약인 경우, 2가지 성분들의 반응성에 따라, 최대 0℃, 10℃ 또는 심지어 실온이 적용될 수 있지만, 바람직하게는 낮게, 예로 -78 내지 -60℃로 유지된다.
공정 D-(iii):
본 공정은 화합물 A-(27)의 옥심화에 의해 화합물 A-(28)를 수득하는 공정이다.
본 공정에서 반응은 Org. Lett. 2007, 9, 753-756; Tetrahedron: Asymmetry 1994, 5, 1018-1028 및 Tetrahedron, 1998, 54, 5868-5882에 언급된 조건과 같이, 카르보닐 화합물의 옥심화 반응에 통상 사용되는 조건과 동일한 조건으로 수행할 수 있다.
구체적으로, 화합물 A-(28)은 예로, 화합물 A-(27)을 하이드록실아민 또는 하이드록실아민 염 (예, 하이드록실아민 하이드로클로라이드 또는 하이드록실아민 설페이트)와 염기의 존재 또는 부재하에 반응시켜 수득할 수 있다.
이 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 바람직한 예로는 유기 용매, 예컨대 에탄올, 메탄올, 테트라하이드로푸란, 1,4-디옥산, 1,2-디메톡시에탄 및 디클로로메탄, 및 이들 용매와 물의 혼합물을 포함한다. 사용되는 염기의 예로는 소듐 아세테이트, 피리딘, 수산화나트륨, 세슘 하이드록사이드, 바륨 하이드록사이드 및 2,6-루티딘을 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 5분 내지 24시간이며, 바람직하게는 5분 내지 12시간이다. 반응 온도는 통상 -20℃ 내지 용매 환류 온도이며, 더 바람직하게는 0℃ 내지 용매 환류 온도이다.
공정 D-(iv):
본 공정은 알케닐 옥심 A-(28)의 열적 분자내 사이클로부가에 의해 PG가 Tr인 화합물 A-(2)를 수득하는 공정이다.
이 반응은 일반 제조 방법 C, 공정 C-(vi)에 언급된 조건 하에 수행될 수 있다.
E. 일반 제조 방법 E:
Figure pct00014
상기 식에서, X는 상기 정의와 동일하게 정의된다.
일반 제조 방법 E는 공정 E-(i)에서 공정 E-(iii)의 다단계 공정을 통해 원료로서 화합물 A-(25)로부터, 본 발명에 따른, 화합물 (I)의 중간산물인, 화합물 A-(27)을 제조하는 다른 방법이다.
화합물 A-(25)의 제조에 대해서는 일반 제조 방법 F 및 G에 언급되어 있다.
공정 E-(i):
본 공정은, 알코올 A-(25)에 염기 및 알킬화제 tert-부틸브로모 아세테이트를 처리하여 화합물 A-(29)를 수득함으로써, 화합물 A-(25)를 알킬화하는 공정이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 반응을 알코올 화합물의 O-알킬화 반응에 통상적으로 사용되는 조건과 동일한 조건에서 수행할 수 있음을 알 것이다 (예, Tetrahedron Lett. 2005, 46, 7751-7755에 언급된 조건). 이러한 반응에서, 화합물 A-(25)는, 예로, 수소화나트륨과 같은 염기를 THF 중의 중간산물 알코올 용액에 첨가하여 알콕사이드를 제조한 다음, 알콕사이드를 tert-부틸 브로모아세테이트와 반응시킴으로써, 수득할 수 있다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않고 출발 물질을 어느 정도 용해시킬 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 THF, DMF 및 디메틸 설폭사이드와 같은 용매를 포함한다. 본 반응은 그러한 용매의 존재 하에 적정 염기 1 내지 3 당량을 적용하여 수행할 수 있다. 사용되는 염기의 예로는 수소화나트륨, 수소화칼륨 및 t-부톡시포타슘을 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 12시간이다. 반응 온도는 통상 -20℃ 내지 50℃이다.
본 반응에 테트라부틸암모늄 요오드화물과 같은 염을 첨가함으로써, 수율 개선 등의 보다 바람직한 결과를 달성할 수 있다.
다른 예로, 화합물 A-(29)는 상 전이 조건에서 알킬화 반응을 수행함으로써 화합물 A-(25)로부터 수득할 수 있다. 본 반응의 용매는 반응을 방해하지 않고 물과 혼합되지 않는 한 특별힌 한정되지 않는다. 용매에 대한 적합한 예로는 디클로로메탄과 클로로포름이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 사용되는 염기는 수용성이며, 이러한 염기의 예로는 수산화나트륨 수용액과 수산화칼륨 수용액이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 또한, 반응에 상 전이 촉매의 첨가가 요구된다. 적합한 상 전이 촉매의 예로는 테트라부틸암모늄 염, 예컨대 테트라부틸암모늄 수소 설페이트가 있으나, 이로 한정되지 않는다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다. 반응 온도는 통상 빙랭 내지 40℃이다.
공정 E-(ii):
본 공정은 에스테르기를 탈보호화하여 Weinreb 아미드를 형성함으로써 화합물 A-(29)로부터 화합물 A-(30)을 수득하는 2단계 연속 반응이다.
이 반응은 일반 제조 방법 C, 공정 C-(iii)에 언급된 조건 하에 수행될 수 있다.
공정 E-(iii):
본 공정은 Tetrahedron Lett. 1981, 22, 3815에 언급된 바와 같이 유기금속 (아릴리튬 시약 또는 그리냐드 시약) 시약을 화합물 A-(30)과 반응시킴으로써 화합물 A-(27)을 수득하는 공정이다.
이 반응은 일반 제조 방법 C, 공정 C-(iv)에 언급된 조건 하에 수행될 수 있다.
F. 일반 제조 방법 F:
Figure pct00015
일반 제조 방법 F는 공정 F-(i)를 통해 원료 화합물 A-(28)로부터, 본 발명에 따른, 화합물 (I)의 중간산물이 화합물 A-(25)를 제조하는 방법이다.
화합물 A-(28)은 상업적으로 구입가능하다.
본 공정은, 에폭사이드 A-(28)을 설포늄 일라이드로 개환하여, 알릴 알코올 A-(25)를 제조함으로써 화합물 A-(25)를 수득하는 공정이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 알릴 알코올 A-(25) 기의 분리없이 A-(26), A-(29) 또는 A-(30) 등의 화합물로 직접 변환시킬 수 있음을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이러한 변환은 하나의 포트에서 수행되거나 또는 2가지의 별개의 반응으로 수행할 수 있음을 알 것이다. 당해 기술 분야의 당업자는, 2가지의 별개의 반응을 수행하는 것에 비해 하나의 포트 반응의 이점과 문제점을 알 것이며, 요건에 따라 최상의 방법을 선택할 것이다.
구체적으로, 에폭사이드 A-(28)을 트리메틸설포늄 요오드화물의 음이온에 의해 개환하고 디메틸설파이드가 결과적으로 소실됨으로써, 대응되는 알릴 알콕사이드를 수득할 수 있다. 트리메틸설포늄 요오드화물은 적정 염기, 예컨대 부틸 리튬으로 탈보호화할 수 있다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 간섭하지 않는 한 특별히 한정되지 않는다. 적정 용매의 예로는 THF를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이 경우에, 용어 용매는 반응이 수행되고 시약이 용해되지 않을 수 있는 액체를 지칭한다. 바람직하게는, 반응은 실온 미만의 온도에서, 바람직하게는 -30 내지 20℃에서 수행되어야 한다. 첨가 후, 반응물을 실온으로 가온하여 반응을 촉진시킬 수 있다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 5분 내지 24시간이며, 바람직하게는 1 - 6시간이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 이러한 반응으로 제조되는 알콕사이드를 tert-부틸 브로모아세테이트와 같은 알킬화제와 직접 반응시켜 A-(29)를 수득하거나 또는 4-(클로로아세틸)-모르폴린과 반응시켜 A-(26)을 수득할 수 있으며, 이러한 반응이 부가적인 용매를 첨가하거나 첨가하지 않고 진행될 수 있다는 것을 알 것이다. 부가적인 용매가 반응 촉진을 위해 필요한 경우, 용매, 예컨대 DMF 또는 NMP가 적합하다. 반응 온도는 특별히 한정되지 않는다. 적정 반응 온도는 실온 내지 80℃, 바람직하게는 실온이다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 5분 내지 1주일, 바람직하게는 1 - 48시간이다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 중간산물 알콕사이드를 퀀칭, 분리 및 정제한 다음, 독립적인 알킬화 조건에 투입할 수 있음을 알 것이다. 이 반응은 알코올 화합물의 O-알킬화 반응에 통상적으로 사용되는 동일한 조건에서 수행할 수 있다 (예, Tetrahedron Lett. 2005, 46, 7751-7755에 기술된 조건). 이 반응에서, 화합물 A-(29)는, 예컨대 수소화나트륨와 같은 염기를 THF 중의 중간산물 알코올 용액에 첨가하여 알콕사이드를 제조한 다음, 알콕사이드를 tert-부틸 브로모아세테이트와 반응시킴으로써, 수득할 수 있다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않고 출발 물질을 어느 정도 용해시킬 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 THF, DMF 및 디메틸 설폭사이드와 같은 용매를 포함한다. 본 반응은 그러한 용매의 존재 하에 적정 염기 1 내지 3 당량을 적용하여 수행할 수 있다. 사용되는 염기의 예로는 수소화나트륨, 수소화칼륨 및 t-부톡시포타슘을 포함한다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 12시간이다. 반응 온도는 통상 -20℃ 내지 50℃이다.
본 반응에 테트라부틸암모늄 요오드화과 같은 염을 첨가함으로써, 수율 개선 등의 보다 바람직한 결과를 달성할 수 있다.
G. 일반 제조 방법 G:
Figure pct00016
일반 제조 방법 G는 공정 G-(i)를 통해 원료 화합물 A-(31)로부터 본 발명에 따른, 화합물 (I)의 중간산물인 화합물 A-(25)를 제조하는 대안적인 방법이다.
화합물 A-(31)은 라세믹 형태로 상업적으로 구입가능하다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 화합물 A-(31)을 라세믹 또는 거울상이성체적으로 순수한 형태로 사용할 수 있음을 알 것이다.
구체적으로, 본 공정은 화합물 A-(31)의 일차 알코올을 선택적으로 보호하는 공정으로서, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 범주의 보호기를 이용하여 달성할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 이러한 유형의 변형에는 거대 보호기가 선택된다는 것을 알 것이다.
이러한 보호기의 일 예로는 트리틸 (트리페닐메틸) 보호기가 있다.
당해 기술 분야의 당업자라면, 다양한 적정 알코올 보호기가 선택될 수 있으며, 보호기의 선택은 탈보호에 필요한 조건과 화학적 안정성에 의해 영향을 받는다는 것을 알 것이다. 적합한 보호기는 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Chemistry, Third Edition", John Wiley & Sons (1999)에 기술되어 있다.
보호기가 트리틸 (트리페닐메틸)인 경우, 탈보호에 적합한 조건은 T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Chemistry, Third Edition", John Wiley & Sons (1999), P. 102-104에서 확인할 수 있다.
예컨대, 화합물 A-(25)는 화합물 A-(31')에 트리틸 클로라이드 (트리페닐메틸 클로라이드)를 처리함으로써 화합물 A-(31)로부터 제조할 수 있다. 반응에 사용되는 용매는 반응을 저해하지 않고 출발 물질을 어느 정도 용해시킬 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 용매의 예로는 톨루엔 또는 디클로로메탄을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 염기의 사용이 반응을 촉진시키거나 반응 수율을 향상시킬 수 있다는 것을 알 것이다. 적합한 염기의 예로는 트리에틸아민과 디이소프로필에틸아민이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않으며, 통상 0.5 내지 72시간이며, 바람직하게는 0.5 내지 24시간이다. 반응 온도는 통상 빙랭 온도 내지 용매 환류 온도이며, 바람직하게는 빙랭 내지 40℃이다.
도 1은 화합물 4-(9)의 키랄 HPLC 분리로부터 수득한 전형적인 크로마토그램이다.
본 발명은 실시예, 제조예 및 실험예를 참조하여 하기에서 보다 구체적으로 기술될 것이다. 그러나, 본 발명은 이로 한정되지 않는다. 본 실시예들에서 사용되는 약어는 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 통상적인 약어이다. 일부 약어들은 하기에 나타낸다:
LCMS, LC/MS & LC-MS (액체 크로마토그래피/질량 분광측정기); MS (질량 분광측정기); MDAP (질량 지정된 자동 정제(mass directed auto purification)); NMR (핵 자기 공명); s, d, t, dd, m, br (싱글렛, 더블렛, 트리플렛, 더블렛의 더블렛, 멀티플렛, 광의); Ph, Me, Et, Pr, Bu, Bn (페닐, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 벤질); THF (테트라하이드로퓨란); DCM (디클로로메탄); DMF (N,N-디메틸포름아미드); h, hr, hrs (시간); EDC & EDAC (N-3-(디메틸아미노프로필)-N'에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드); DMAP (4-N,N-디메틸아미노피리딘); DMSO (디메틸설폭사이드); UV (자외선); RT & rt (실온); Rt (체류시간); min & mins (분); EtOAc (에틸 아세테이트); Et2O (디에틸 에테르); MeCN (아세토니트릴); EtOH (에탄올); MeOH (메탄올); PhCH3 & PhMe (톨루엔); tlc (박층 크로마토그래피); TFA (트리플루오로아세트산); NaOH (소듐 하이드록사이드); HCl (염산); NMP (N-메틸피롤리디논 또는 1-메틸-2-피롤리디논); HPLC (고성능 액체 크로마토그래피); TBAF (테트라부틸암모늄 플루오라이드); BuLi (n-부틸 리튬); PyBOP: 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트; Pd2dba3: 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐; Pd(t-Bu3P)2: 비스(트리-t-부틸포스핀)팔라듐; TFA: 트리플루오로아세트산; pTLC: 분취용 박막 크로마토그래피; HRMS (고해상도 질량 분광측정기); Tr 또는 Trt (트리틸 또는 트리페닐메틸).
1H NMR 스펙트럼은 (기록된) 주파수 400 MHz에서 작동하는 Bruker AM 시리즈 스펙트로미터에서 기록하였다. 양자 핵 자기 공명 스펙트럼에서의 화학적 시프트는 테트라메틸 실란에 상대적인 δ 단위(ppm)로 기록하였고, 커플링 상수 (J)는 헤르츠(Hz)로 기록하였다. 패턴은 s: 싱글렛, d: 더블렛, t; 트리플렛, br; broad로 표시한다.
아래 실시예 및 제조예에서 "실온"은 전형적으로 약 10℃ 내지 약 35℃이다. "%"는 다르게 명시되어 있지 않은 한 wt%이다.
화학적 명칭은 ChemBioDraw Ultra 11.0 및 12.0을 이용하여 화학적 구조로부터 구하였다.
실시예 1: N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4,5-디플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드 (실시예 1-(14))의 합성
Figure pct00017
1-(2) (3aR,4S,6aS)-6a-(2,3-디플루오로페닐)-4-((트리틸옥시)메틸)헥사하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸의 합성
n-부틸리튬의 헥산 용액 (2.50 M; 29.8 mL)에, N2 분위기 하 -78℃에서, 1-브로모-2,3-플루오로벤젠 (2.93 mL)의 THF/톨루엔 (15 mL/150 mL) 용액에 점적 첨가하였다. 반응 용액을 동일 온도에서 30분간 교반하였다. 보론 트리플루오라이드-디에틸 에테르 복합체 (9.2 mL)와 (3aR,4S)-4-((트리틸옥시)메틸)-3,3a,4,6-테트라하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸 (17.0 g)의 톨루엔 (50 mL) 영액을 상기 반응 용액에 동일 온도에서 순차적으로 점적 첨가하였다. 동일 온도에서 60분간 교반한 후, NH4Cl 수용액(포화, 50 mL)을 반응 용액에 조심스럽게 첨가한 다음, RT로 가온하였다. 그 후, 브린 (200 mL)을 반응 용액에 첨가하고, 이 혼합물을 EtOAc로 추출하였다 (3 x 200 mL). 유기층을 조합하여 무수 MgSO4 상에서 건조하고, 불용성 물질을 여과에 의해 분리하였다. 여과물을 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (농도구배: DCM: 헥산 1:3 중의 0% 내지 20% EtOAc), 표제 화합물을 수득하였다 (15.51 g). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 3.18 - 3.38 (m, 2 H), 3.44 - 3.54 (m., 1 H), 3.83 - 3.99 (m, 2 H), 4.04 - 4.38 (br. s., 2 H), 5.35 (s, 1 H), 7.03 - 7.51 (m, 18 H).
1-(3) ((2S,3R,4S)-4-아미노-4-(2,3-디플루오로페닐)-2-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)메탄올
아연 분말 (20.0 g)을, 제조예 1-(2)에서 수득한 (3aR,4S,6aS)-6a-(2,3-디플루오로페닐)-4-((트리틸옥시)메틸)헥사하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸 (15.51 g)의 아세트산 (120 mL) 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 용액을 RT로 가온하고, 18시간 교반하였다. 불용성 물질을 셀라이트®로 여과하여 분리하고, 아세트산 (100 mL) 및 AcOEt (300 mL)로 세척한 다음 여과물을 농축하였다. NaHCO3 포화 수용액을 조심스럽게 첨가하여 잔류물을 중화시키고, 혼합물을 EtOAc로 추출하였다 (3 x 200 mL). 유기층을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (15.42 g). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 2.60 - 2.68 (m, 1 H), 2.85 (br s, 3 H), 3.29 (d, J=4.8 Hz, 2 H), 3.66 (dd, J=12.1, 4.8 Hz, 1 H), 3.89 - 3.99 (m, 2 H), 4.31 (d, J=9.1 Hz, 1 H), 4.34 - 4.40 (m, 1 H), 7.04 - 7.19 (m, 2 H), 7.20 - 7.33 (m, 10 H), 7.39 - 7.50 (m, 6 H).
1-(4) N-(((3S,4R,5S)-3-(2,3-디플루오로페닐)-4-(하이드록시메틸)-5-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)카르바모티오일)벤즈아미드
벤조일 이소티오시아네이트 (6 g)을 제조예 1-(3)에서 수득한 ((2S,3R,4S)-4-아미노-4-(2,3-디플루오로페닐)-2-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)메탄올 (15.42 g)의 CH2Cl2 (80 mL) 용액에 점적 첨가하고, 혼합물을 RT에서 18시간 교반하였다. EtOAc를 첨가하고, 혼합물을 NaHCO3로 추출하고 (3 x 100 mL), MgSO4 상에 건조 및 증발시킨 후, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중 0% -> 30% EtOAc), 표제 화합물을 수득하였다 (19.06 g). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 3.00 (t, J=6.2 Hz, 1 H), 3.08 - 3.17 (m, 1 H), 3.26 (dd, J=10.2, 4.2 Hz, 1 H), 3.38 (dd, J=10.2, 3.9 Hz, 1 H), 3.73 - 3.95 (m, 2 H), 4.04 - 4.12 (m, 1 H), 4.54 (d, J=9.6 Hz, 1 H), 4.69 (d, J=9.9 Hz, 1 H), 7.05 - 7.68 (m, 21 H) 7.88 (d, J=7.1 Hz, 2 H), 8.88 (s, 1 H), 11.83 (s, 1 H)
1-(5) N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-((트리틸옥시)메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드
제조예 1-(4)에서 수득한 N-(((3S,4R,5S)-3-(2,3-디플루오로페닐)-4-(하이드록시메틸)-5-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)카르바모티오일)벤즈아미드 (19.06 g)를 DCM (75 mL)에 용해하였다. 피리딘 (8.6 mL)을 첨가하고, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 트리플루오로메탄설폰 무수물 (9.6 mL)을 점적 첨가하고, 반응물을 0℃에서 교반하였다. 90분 후, NaHCO3 (포화 수용액, 250 mL)를 조심스럽게 첨가하여 반응물을 퀀칭하고, EtOAc로 추출하였다 (3 x 250 mL). 조합한 유기 추출물을 MgSO4 상에 건조하고, 진공 농축한 다음, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (0% -> 30% EtOAc/hex), 표제 화합물을 수득하였다 (14.52 g). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.63 - 2.76 (m, 1 H), 3.07 - 3.24 (m, 2 H), 3.32 - 3.52 (m, 3 H), 3.99 - 4.11 (m, 1 H), 4.53 - 4.63 (m, 2 H), 7.09 - 7.56 (m, 21 H), 8.08 - 8.30 (m, 2 H)
1-(6) N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(하이드록시메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드의 합성
제조예 1-(5)에서 수득한 N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-((트리틸옥시)메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (8.42 g)를 메탄올 (100 mL)에 현탁하고, 물 (3 mL)과 진한 염산 (5 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 왕성하게 교반하고, 감압하 농축하여 부피 약 30 mL로 만들었다. 그 후, 혼합물을 NaHCO3 (포화 수용액, 100mL)로 조심스럽게 중화시킨 다음 EtOAc (3 x 100 mL)로 추출하였다. 유기층을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발하고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중의 0% -> 50% EtOAc), 표제 화합물을 수득하였다(4.20 g). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.94 (br. s., 1 H), 2.83 (d, J=10.6 Hz, 1 H), 3.14 - 3.49 (m, 2 H), 3.77 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 3.97 (dd, J=11.7, 2.7 Hz, 1 H), 4.08 (d, J=6.3 Hz, 1 H), 4.46 - 4.63 (m, 2 H), 7.07 - 7.25 (m, 3 H), 7.37 - 7.60 (m, 3 H), 8.00 - 8.26 (m, 2 H)
1-(7) N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-포르밀-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드의 합성
제조예 1-(6)에서 수득한 N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(하이드록시메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (4.20 g)를 DCM (60 mL)에 용해하고, 용액을 0℃로 냉각하였다. 1,1,1-트리스(아세틸옥시)-1,1-디하이드로-1,2-벤즈요오도솔-3(1H)-온 (5.50 g)을 10분에 걸쳐 나누어 첨가하고, 반응 혼합물을 RT로 가온하였다. 2시간 교반한 후, NaHCO3 (포화 수용액, 100 mL)을 첨가하고, 혼합물을 DCM로 추출하였다 (3 x 150 mL). 유기층을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발시켜, 표제 화합물을 수득하였다(3.04g, 순도 약 60%), 다음 단계에 정제없이 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.97 (dd, J=14.0, 4.2 Hz, 1 H), 3.23 (d, J=11.6 Hz, 1 H), 3.29 - 3.38 (m, 1 H), 4.08 - 4.18 (m, 1 H), 4.56 - 4.83 (m, 2 H), 7.11 - 7.24 (m, 3 H), 7.39 - 7.64 (m, 3 H), 7.98 - 8.18 (m, 2 H), 9.96 (d, J=1.0 Hz, 1 H).
1-(8) N-((4aS,5S,7aS)-5-(디플루오로메틸)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드의 합성
제조예 1-(7)에서 수득한 N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-포르밀-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (3.04 g, 순도 약 60%)를 DCM (50 mL)에 용해하고, 용액을 0℃로 냉각하였다. 그 후, 디에틸아미노설퍼 트리플루오라이드 (0.99 mL)를 점적 첨가하고, 반응 혼합물을 RT로 가온하여 교반하였다. 2시간 후, 반응물을 NaHCO3 (포화 수용액, 100 mL)을 첨가하여 퀀칭하고, DCM으로 추출하였다 (2 x 150 mL). 유기층을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발시킨 후, 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중의 5% -> 50% EtOAc), 표제 화합물을 수득하였다(757 mg). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.89 (dd, J=13.8, 3.7 Hz, 1 H), 3.22 (d, J=13.1 Hz, 1 H), 3.46 - 3.61 (m, 1 H), 4.02 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 4.56 (d, J=9.1 Hz, 1 H), 4.62 - 4.72 (m, 1 H), 5.86 - 6.18 (m, 1 H), 7.08 - 7.25 (m, 3 H), 7.40 - 7.63 (m, 3 H), 7.96 - 8.16 (br. s., 2 H).
1-(9) (4aS,5S,7aS)-5-(디플루오로메틸)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민의 합성
제조예 1-(8)에서 수득한 N-((4aS,5S,7aS)-5-(디플루오로메틸)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (891 mg)를 메탄올 (10 mL)에 용해하고, 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔 (1.02g)을 첨가한 다음, 용액을 환류 가열하였다 (히팅 블럭 온도 70℃). 16시간 후, 반응 혼합물을 냉각시키고, 감압하 농축한 다음, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (헥산에서의 0% -> 80% EtOAc), 표제 화합물을 수득하였다(565 mg). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.88 (dd, J=13.4, 4.0 Hz, 1 H), 3.13 (dd, J=13.6, 3.3 Hz, 1 H), 3.24 (dt, J=7.7, 3.7 Hz, 1 H), 3.89 (d, J=8.3 Hz, 1 H), 4.33 - 4.70 (m, 4 H), 5.94 (td, J=56.3, 3.8 Hz, 1 H), 7.05 - 7.25 (m, 3 H)
1-(10) (4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로-5-니트로페닐)-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민의 합성
제조예 1-(9)에서 수득한 (4aS,5S,7aS)-5-(디플루오로메틸)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (565 mg)을 TFA (3 mL)에 용해하고, 용액을 0℃로 냉각하였다. 황산 (진한 황산, 0.8 mL)을 첨가한 다음, 발연 질산 (0.08 mL)을 20분간 점적하였다. 이를 0℃에서 90분간 교반한 후, 반응 혼합물을 조심스럽게 NaHCO3 (포화 수용액, 50 mL)로 중화하고, EtOAc (3 x 100 mL)로 추출한 다음, 유기상을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산에서의 0% -> 80% EtOAc), 표제 화합물을 수득하였고 (700 mg, 순도 약 80%), 다음 단계에 정제없이 사용하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 3.04 (dd, J=14.0, 3.9 Hz, 1 H), 3.23 - 3.31 (m, 1 H), 3.59 (d, J=3.0 Hz, 1 H), 4.23 (d, J=9.9 Hz, 1 H), 4.44 - 4.60 (m, 2 H), 6.02 (t, J = 57.6 Hz, 1 H), 8.02 - 8.26 (m, 2 H)
1-(11) tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로-5-니트로페닐)-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트의 합성
제조예 1-(10)에서 수득한 (4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로-5-니트로페닐)-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (700 mg, 순도 약 80%)을 THF (10 mL)에 용해하고, 디-tert-부틸 디카보네이트 (450 mg)를 20분에 걸쳐 나누어 첨가한 다음, 반응 혼합물을 60℃로 가열하였다. 디-tert-부틸 디카보네이트 (250 mg)를 2번에 나누어 2시간 간격으로 첨가하였다. 6시간 후, 반응 혼합물을 냉각시키고, 중탄산나트륨 (포화 수용액, 20 mL)을 첨가하였다. 그 후, 혼합물을 EtOAc로 추출하고 (3 x 50 mL), 유기층을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발시켰다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중의 0% -> 50% EtOAc), 표제 화합물을 수득하였다(489 mg). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.53 (s, 9 H), 2.81 (dd, J=13.9, 4.0 Hz, 1 H), 2.98 (dd, J=13.9, 2.3 Hz, 1 H), 3.41 (dd, J=7.3, 3.5 Hz, 1 H), 3.86 (d, J=8.3 Hz, 1 H), 4.46 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 4.52 - 4.71 (m, 1 H), 6.00 (t, J= 54.6 Hz, 1 H), 7.36 (br. s., 1 H), 8.03 - 8.22 (m, 2 H)
1-(12) tert - 부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2,3-디플루오로페닐)-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트의 합성
제조예 1-(11)에서 수득한 tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로-5-니트로페닐)-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트 (489 mg)를 에탄올 (10 mL)에 용해하고, 주석 클로라이드 이수화물 (800 mg)을 첨가하였다. 16시간 교반한 후, NaOH (2N aq., 20 mL)를 첨가하고, 혼합물을 EtOAc로 추출하였다 (2 x 50 mL). 유기층을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발시켜, 표제 화합물을 수득하였다 (457 mg). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.52 (m, 9 H), 2.79 (dd, J=13.8, 3.9 Hz, 1 H), 3.08 (d, J=13.6 Hz, 1 H), 3.34 (d, J=3.5 Hz, 1 H), 3.70 (br. s., 2 H), 3.85 (d, J=8.3 Hz, 1 H), 4.40 - 4.62 (m, 2 H), 5.76 - 6.14 (dt, J=4.0, 56.6 Hz, 1 H), 6.28 - 6.38 (m, 1 H), 6.45 (ddd, J=11.1, 6.3, 2.8 Hz, 1 H)
1-(13) tert -부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로-5-(5-메톡시피라진-2-카르복스아미도)페닐)-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트의 합성
제조예 1-(13)에서 합성한 tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2,3-디플루오로페닐)-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트 (100 mg)를 DCM (2 mL)에 용해하고, 5-메톡시피라진-2-카르복실산(50 mg), N,N-디이소프로필에틸아민 (100 mg) 및 (1H-벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리딘-1-일)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (175 mg)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 RT에서 3일간 교반하고, 중탄산나트륨 (포화 수용액, 25 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고 (2 x 40 mL), 유기층을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발시킨 다음, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (EtOAc/헥산 농도구배), 표제 화합물을 백색 고형물로서 수득하였다(108 mg). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.54 (s, 9 H), 2.82 (dd, J=13.5, 3.4 Hz, 1 H), 3.08 (d, J=12.9 Hz, 1 H), 3.33 - 3.45 (m, 1 H), 3.84 - 3.93 (m, 1 H), 4.10 (s, 3 H), 4.46 - 4.65 (m, 2 H), 5.97 (dt, J = 3.8, 56.6 Hz, 1 H), 7.08 (br. s., 1 H), 7.27 - 7.36 (m, 1 H), 8.14 (ddd, J=11.6, 7.0, 2.7 Hz, 1 H), 8.20 (d, J=1.3 Hz, 1 H), 9.04 (d, J=1.3 Hz, 1 H), 9.55 (s, 1 H)
1-(14) N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4,5-디플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드의 합성
제조예 1-(13)에서 합성한 tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로-5-(5-메톡시피라진-2-카르복스아미도)페닐)-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트 (108 mg)를 DCM (2 mL)에 용해하고, TFA (1 mL)를 첨가하였다. RT에서 2시간 교반한 후, 반응 혼합물을 증발시킨 후, 중탄산나트륨 (포화 수용액, 25 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고 (3 x 25 mL), 유기상을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발시킨 후, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 표제 화합물을 백색 고형물로서 수득하였다 (45 mg). 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 2.87 - 2.99 (m, 1 H), 3.17 - 3.26 (m, 2 H), 3.89 (d, J=8.8 Hz, 1 H), 4.09 (s, 3 H), 4.39 - 4.59 (m, 2 H), 6.02 (dt, J = 3.8, 55.8 Hz, 1 H), 7.48 - 7.63 (m, 1 H), 7.98 (ddd, J=12.1, 7.0, 2.7 Hz, 1 H), 8.29 (d, J=1.3 Hz, 1 H), 8.92 (d, J=1.5 Hz, 1 H)
실시예 2: N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4-플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드의 합성
Figure pct00018
2-(2) (R)-1-클로로-3-플루오로프로판-2-올의 합성
피리딘 하이드로플루오라이드 (70% HF 및 30% 피리딘 복합체) (460 mL, 5.10 mol)를 테플론으로 코팅된 자기 교반 막대가 장착된 1L 폴리프로필렌 에를렌마이어 플라스크에 넣었다. 이 플라스크를 -30℃로 냉각시키고, 내부 온도를 반응하는 동안에 PTFE-코팅된 온도계를 이용하여 모니터링하였다. 피리딘 (60 mL, 741.83 mmol)을, 내부 온도가 0℃를 넘지 않도록 하면서 조금씩 주입하였다. 그런 후, 반응 용기를 얼음조로 옮기고, 내부 온도를 0℃로 만들었다. (R)-2-(클로로메틸)옥시란 (60 ml, 765.2 mmol)을 DCM (60 ml) 중의 용액으로서 시린지 펌프 또는 바늘이 부착된 점적 깔때기를 이용하여 점적 첨가하였다. 첨가는 140분간 행하였다. 바늘의 끝 (~2 cm)을 피리딘 혼합물에 담구는 것이 중요하다. 첨가하는 동안에 온도가 0℃에서 4℃로 상승하였다. 혼합물을 다시 30분간 교반하고, 얼음 (1100 g)-물 (600 mL)-NaCl (200 g)-DCM (500 mL)의 혼합물에 서서히 부었다. 유기층을 분리하고, 수층을 DCM (8 x 300 mL)으로 추출하였다. 조합한 유기 추출물을 NaHCO3 (120 mL)와 함께 교반하고, MgSO4 상에 건조하고 농축하였다. (수조의 온도는 증발 초기에 20℃ 미만으로, 그리고 말기에 약 10℃로 150 mbar의 압력 하에 유지시켰음). 조산물 (78.65 g)을 노란색 액체로 수득하였다.
상기 반응을 동일 스케일로 13회 반복하여, 조산물 1020 g을 수득하였다. 조산물을 감압 증류하여, 표제 화합물을 맑은 오일로서 40-50℃/8 mbar에서 수득하였다 (378.2 g). 1H NMR (400 MHz, CDCl3)) δ ppm 2.36 - 2.56 (m, 1 H) 3.61 - 3.73 (m, 2 H) 4.03 - 4.16 (m, 1 H) 4.47 (dd, J=4.80, 1.14 Hz, 1 H) 4.59 (dd, J=4.80, 1.01 Hz, 1 H)
2-(3) (S)-tert-부틸 2-((1-플루오로부트-3-엔-2-일)옥시)아세테이트의 합성
(R)-1-클로로-3-플루오로프로판-2-올 (50.0 g, 444.37 mmol)를 질소 하에 테트라하이드로푸란 (150 mL)에 용해하였다. 용액을 -20℃로 냉각시켰다. 포타슘 헥사메틸디실라자이드 (89.8 g, 450.16 mmol)를 40분에 걸쳐 조금씩 (각각 ~10g으로 9번) 첨가하여, 내부 온도를 -5℃ 내지 -10℃로 유지시켰다. 그 후, 반응물을 RT로 가온하고, 질소 하에 밤새 교반하였다.
다른 플라스크에서, 트리메틸설포늄 요오드화물 (181.35 g, 888.65 mmol)을 THF에 용해하였다. 용액을 -30℃로 냉각시켰다. 리튬 헥사메틸디실라자이드 (888.65 mL, THF 중의 1 M 용액, 888.65 mmol)를 25분에 걸쳐 첨가하였다. 첨가시 내부 온도는 -30℃ 내지 -26℃로 되었다. 반응물을 30분간 -30℃에서 교반하였다. 이 용액에, (앞의 플라스크에서 준비한) (S)-2-(플루오로메틸)옥시란 용액을 첨가하였다. 첨가는 -30℃에서 5분에 걸쳐 행하였다. 그런 후, 반응물을 최대 RT로 가온하고, 3시간 교반하였다. 얼음조를 이용하여 (내부 온도) 3℃로 냉각시킨 다음, 1-메틸-2-피롤리디논 (100 mL)을 첨가하였다. 내부 온도를 8℃로 높였다. tert-부틸 브로모아세테이트 (131.22 mL, 888.65 mmol)의 1-메틸-2-피롤리디논 용액 (100 mL)을 점적 깔때기를 이용하여 점적 첨가하고, 온도를 17-20℃로 유지시켰다. 반응물을 얼음조에서 온도가 5℃가 될 때까지 교반하였다. 얼음조를 제거하고, RT에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물에 물 (2L)을 부은 후 Et2O (1L)를 첨가하였다. 10분간 교반한 후, 2층으로 분리한 다음, 수층을 Et2O (4 x 500 mL)로 추출하였다. 조합한 유기 추출물을 MgSO4 상에 건조하고 농축하였다. 조상물을 초기에 헥산을 이용한 다음 헥산 중의 5% EtOAc를 이용하여 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여, 표제 화합물을 노란색 액체로서 수득하였다 (57 g, 63%).
상기 반응을 동일 스케일로 3회 반복하여, 표제 화합물 168 g을 수득하였다. 이를 감압 증류하여 점제함으로써, 0.3 mbar 및 80-95℃에서 산물을 투명 액체로서 수득하였다 (93.88 g). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.48 (s, 9 H) 4.01 (s, 1 H) 4.05 (s, 1H) 4.12 - 4.22 (m, 1 H) 4.36 - 4.44 (m, 1 H) 4.48 - 4.57 (m, 1 H) 5.33 - 5.51 (m, 2 H) 5.67 - 5.82 (m, 1 H)
2-(4) (S)-2-((1-플루오로부트-3-엔-2-일)옥시)-N-메톡시-N-메틸아세타미드의 합성
(S)-tert-부틸 2-((1-플루오로부트-3-엔-2-일)옥시)아세테이트 (96.26 g, 471.31 mmol)를 0℃로 냉각하였다. 포름산 (354 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 RT로 가온하여, 밤새 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 감압하 농축 (수조 온도 40℃)하였다. 잔류물을 톨루엔 (3 x 100 mL)과 공비 혼합하여, 진갈색 오일로서 카르복실산을 수득하였다. 잔류물을 DCM (720 mL)에 용해하고, 내부 온도가 3℃가 될 때까지 얼음조에서 냉각하였다. N,N'-카르보닐 디이미다졸 (87.88 g, 542.00 mmol)을 10분에 걸쳐 나누어 첨가하고, 내부 온도는 8℃ 이상으로 승온되지 않게 하였다. 이후, 얼음조를 제거하고, 혼합물을 RT에서 48분간 교반하였다. 그 후, 내부 온도가 3℃가 될 때까지 얼음조에서 냉각시켰다. N,O-디메틸 하이드록실아민 하이드로클로라이드 (55.17 g, 565.57 mmol)를 10분에 걸쳐 첨가하였다 (내부 온도는 8℃로 승온됨). 반응 혼합물을 RT로 가온하고, 밤새 교반하였다. 2N HCl (500 mL)을 첨가하고, 2개의 층을 분리하였다. 수층을 DCM (2 x 200 mL)로 추출하고, 유기층을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발시켰다. 조산물을 용리제로서 EtOAc를 이용한 NH 실리카 패드로 여과하여 정제함으로써, 옅은 노란색 액체로서 산물을 수득하였다 (70 g, 366.10 mmol). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 3.01 (s, 3 H) 3.50 (s, 3 H) 3.99 - 4.11 (m, 1 H) 4.11 - 4.20 (m, 2 H) 4.23 - 4.27 (m, 1 H) 4.35 - 4.39 (m, 1 H) 5.16 - 5.31 (m, 2 H) 5.60 (ddd, J=17.43, 10.29, 7.26 Hz, 1 H).
2-(5) ((S)-2-((1-플루오로부트-3-엔-2-일)옥시)-1-(2-플루오로페닐)에타논의 합성
n-부틸리튬의 헥산 (2.50 M; 176.52 mL, 441.29 mmol) 용액을 2-브로모플루오로벤젠 (49.00 mL, 451.88 mmol)의 THF (670 mL) 용액에 20분간 N2 분위기 하 -78℃에서 점적하였다. 반응물의 온도를 첨가하는 동안에 -60℃ 미만으로 유지시켰다. 노란색 용액을 30분간 -78℃에서 교반하였다. (S)-2-((1-플루오로부트-3-엔-2-일)옥시)-N-메톡시-N-메틸아세타미드 (67.50 g, 353.03 mmol)를 내부 온도를 -60℃로 유지시키면서 THF (100 mL)의 용액으로서 점적 첨가하였다. 반응물을 -78℃에서 45분간 교반하였다. NH4Cl 수용액 (200 mL)을 반응 용액에 첨가하고, 최대 RT로 가온한 다음, EtOAc (700 mL)를 첨가하였다. 2개의 층을 분리하였다. 수층을 EtOAc로 추출하였다 (300 mL). 유기층을 조합하여 물 (9300 mL)로 세척한 다음, MgSO4 (40 g) 상에 건조 및 농축하였다. 조산물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산에서의 1% -> 10% EtOAc), 표제 화합물을 노란색 액체로서 수득하였다 (63.78 g, 80%). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 4.16 - 4.31 (m, 1 H) 4.42 - 4.51 (m, 1 H) 4.54 - 4.61 (m, 1 H) 4.67 - 4.88 (m, 2 H) 5.35 - 5.52 (m, 2 H) 5.80 (ddd, J=17.43, 10.29, 7.26 Hz, 1 H) 7.11 - 7.19 (m, 1 H) 7.24 - 7.31 (m, 1 H) 7.49 - 7.60 (m, 1 H) 7.92 - 8.00 (m, 1 H).
2-(6) (S)-2-((1-플루오로부트-3-엔-2-일)옥시)-1-(2-플루오로페닐)에타논 옥심의 합성
(S)-2-((1-플루오로부트-3-엔-2-일)옥시)-1-(2-플루오로페닐)에타논 (63.25 g, 279.59 mmol)을 무수 메탄올 (620 mL)에 용해하고, 하이드록실아민 하이드로클로라이드 (25.26 g, 363.47 mmol)와 소듐 아세테이트 (34.40 g, 419.39 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 90분간 50℃로 가열한 다음 RT로 냉각시켰다. 그 후, 셀라이트로 여과하고, EtOAc (600 mL)로 세척한 다음, 진공 농축하였다. EtOAc (500 mL)를 조산물에 첨가한 후, 물 (600 mL)을 첨가하였다. 2개의 층을 분리하고, 수층을 EtOAc로 추출하였다 (2 x 500 mL). 조합한 유기 추출물을 MgSO4 상에 건조 및 농축하였다. 조산물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중의 10% -> 50% EtOAc), 표제 화합물을 투명 오일로서 수득하였다. 이는 기하이성체의 혼합물로서 존재한다 (67.76g, 100%). 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 3.91 - 4.06 (m, 1 H) 4.16 - 4.19 (m, 1 H) 4.29 (d, J=5.56 Hz, 1 H) 4.78 (d, J=0.76 Hz, 2 H) 5.24 - 5.43 (m, 2 H) 5.57 - 5.77 (m, 1 H) 7.06 - 7.14 (m, 1 H) 7.15 - 7.24 (m, 1 H) 7.35 - 7.41 (m, 1 H) 7.47 (td, J=7.45, 1.77 Hz, 1 H) 9.24 (br. s, 1 H).
2-(7) (3aR,4S,6aS)-4-(플루오로메틸)-6a-(2-플루오로페닐)헥사하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸의 합성
(S)-2-((1-플루오로부트-3-엔-2-일)옥시)-1-(2-플루오로페닐)에타논 옥심 (67.5 g, 279.81 mmol)을 자일렌 (560 mL)에 용해하고, 하이드로퀴논 (5.54 g, 50.36 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 5시간 동안 환류 가열하였다 (히팅 블럭 온도 145℃). 반응물을 RT로 냉각하고, 용매를 증발시켰다. 잔류물을 아미노 실리카 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중의 30% EtOAc), 표제 화합물을 노란색 오일로 수득하였다 (50.53 g, 75 %). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 3.32 - 3.42 (m, 1 H) 3.96 (dd, J=10.11, 1.52 Hz, 2 H) 4.16 - 4.43 (m, 2 H) 4.44 - 4.83 (m, 2 H) 5.38 (s, 1 H) 7.09 (dd, J=11.75, 8.72 Hz, 1 H) 7.18 (td, J=7.58, 1.26 Hz, 1 H) 7.28 - 7.34 (m, 1 H) 7.71 (br. s., 1 H).
2-(8) ((2S,3R,4S)-4-아미노-2-(플루오로메틸)-4-(2-플루오로페닐)테트라하이드로푸란-3-일)메탄올의 합성
(3aR,4S,6aS)-4-(플루오로메틸)-6a-(2-플루오로페닐)헥사하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸 (62.20 g, 257.14 mmol)을 아세트산 (540 mL)에 용해하고, 용액을 0℃로 냉각하였다. 아연 분말 (168.14 g, 2571.4 mmol)을 15분간 첨가하였다. 반응물 온도를 8℃ - 16℃로 승온시켰다. 얼음조를 첨가 후 제거하고, 반응 혼합물을 최대 RT로 승온시켰다. 내부 온도를 40℃로 높이고, 점차적으로 24℃로 냉각시켰다. 반응물을 16시간 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트로 여과하고, 1.5 L의 EtOAc로 세척하였다. 용매를 증발시킨 후, 조산물을 클로로포름 (600 mL)에 용해하고, 암모니아 (28% aq., 240 mL)를 점적 깔때기를 이용하여 서서히 첨가하였다. 내부 온도를 40℃로 높였다. 층 분리하고, 수층을 다시 클로로포름 (3 x 250 mL)으로 추출하였다. 조합한 유기 추출물을 무수 MgSO4 상에서 건조 및 증발시켜, 표제 화합물을 수득하였으며 (63.00 g, 100%), 다음 단계에 추가적인 정제없이 사용하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.39 - 2.86 (m, 4 H) 3.81 (dd, J=11.87, 4.55 Hz, 1 H) 3.94 (dd, J=9.09, 3.03 Hz, 1 H) 4.07 (dd, J=12.13, 4.04 Hz, 1 H) 4.25 (d, J=9.09 Hz, 1 H) 4.40 - 4.68 (m, 3 H) 7.09 (ddd, J=12.57, 8.15, 1.26 Hz, 1 H) 7.17 (td, J=7.58, 1.26 Hz, 1 H) 7.28 - 7.34 (m, 1 H) 7.49 (td, J=8.08, 1.77 Hz, 1 H)
2-(9) N-(((3S,4R,5S)-5-(플루오로메틸)-3-(2-플루오로페닐)-4-(하이드록시메틸)테트라하이드로푸란-3-일)카르바모티오일)벤즈아미드의 합성
((2S,3R,4S)-4-아미노-2-(플루오로메틸)-4-(2-플루오로페닐)테트라하이드로푸란-3-일)메탄올 (62.72 g, 257.84 mmol)을 무수 디클로로메탄 (500 mL)에 용해하였다. 용액을 0℃로 냉각하였다. 벤조일 이소티오시아네이트 (38.16 mL, 283.62 mmol)를 30분에 걸쳐 DCM (40 mL) 용액으로서 첨가하였다. 내부 온도를 5℃ - 7℃로 승온시켰다. 혼합물을 최대 RT로 승온시키고, 55분간 RT에서 교반하였다. 용매를 제거하여 오렌지 폼을 수득하였다. 잔류물을 1:9 MeOH:EtOAc (500 mL) 용액으로 트리투레이션하고, 고형물을 여과하여 제1 수득물 (10.50 g)을 수득하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 9:1 MeOH:EtOAc (300 mL) 용액으로 트리투레이션하여, 수득물 2를 수득하였다 (55.80 g). 모액을 증발시키고, 잔류물을 9:1 MeOH:EtOAc (100 mL)로 트리투레이션하여, 수득물 3 (4.32 g)을 수득하였다. 2회 이승의 트리투레이션으로 수득물 4 (3.88g)와 수득물 5 (4.10 g)를 수득하였다. 마지막으로, 잔류물을 헥산 중의 70%-80% EtOAc를 이용하여 아미노 실리카 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여, 0.35 g의 산물을 수득하였다. 백색 고형물로서의 표제 화합물 78.95g, 수율 75%. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 3.03 (br. s., 1 H) 3.10 (td, J=8.21, 4.29 Hz, 1 H) 3.92 - 4.26 (m, 3 H) 4.42 - 4.74 (m, 4 H) 7.04 (ddd, J=12.25, 8.21, 1.26 Hz, 1 H) 7.19 (td, J=7.71, 1.26 Hz, 1 H) 7.28 - 7.36 (m, 1 H) 7.50 - 7.58 (m, 2 H) 7.62 - 7.68 (m, 1 H) 7.73 (td, J=8.02, 1.64 Hz, 1 H) 7.87 (dd, J=8.46, 1.14 Hz, 2 H) 8.89 (s, 1 H) 11.82 (s, 1 H)
2-(10) N-((4aS,5S,7aS)-5-(플루오로메틸)-7a-(2-플루오로페닐)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드의 합성
N-(((3S,4R,5S)-5-(플루오로메틸)-3-(2-플루오로페닐)-4-(하이드록시메틸)테트라하이드로푸란-3-일)카르바모티오일)벤즈아미드 (78.70 g, 193.63 mmol)를 피리딘 (391 mL, 5190.48 mmol)에 용해하고, 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 트리플루오로메탄설폰 무수물 (43.98 mL, 261.40 mmol)을 40분간 점적 첨가하였다 (내부 온도를 4℃ - 18℃로 증가시킴). 반응물을 얼음조에서 1시간 25분간 교반하였다. 여기에 암모늄 클로라이드 (포화 수용액, 260 mL)를 서서히 첨가한 다음 물 (390 mL)을 첨가하여, 퀀칭하였다. 수층을 EtOAc로 추출하였다 (3 x 500 mL). 조합한 유기 추출물을 MgSO4 상에 건조하고, 진공 농축한 다음, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (20% -> 60% EtOAc/hex), 표제 화합물을 수득하였다 (70.86 g, 94%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.83 (dd, J=13.64, 3.79 Hz, 1 H) 3.30 (dd, J=13.89, 3.54 Hz, 1 H) 3.38 - 3.47 (m, 1 H) 4.07 (dd, J=9.22, 2.65 Hz, 1 H) 4.51 - 4.78 (m, 4 H) 7.15 (ddd, J=12.44, 8.15, 1.14 Hz, 1 H) 7.22 (td, J=7.58, 1.26 Hz, 1 H) 7.34 - 7.41 (m, 1 H) 7.41 - 7.48 (m, 3 H) 7.49 - 7.56 (m, 1 H) 8.10 - 8.18 (m, 2 H).
2-(11) (4aS,5S,7aS)-5-(플루오로메틸)-7a-(2-플루오로페닐)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민의 합성
N-((4aS,5S,7aS)-5-(플루오로메틸)-7a-(2-플루오로페닐)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (70.56 g, 181.65 mmol)를 메탄올 (420 mL)에 용해하고, 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔 (55.73 mL, 372.69)을 첨가한 다음, 용액을 5시간 동안 환류 가열하였다 (히팅 블럭 온도 80℃). 반응 혼합물을 감압하 농축, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (헥산 중의 10% -> 50% EtOAc), 표제 화합물을 수득하였다(46.05 g, 89%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.79 (dd, J=13.39, 4.04 Hz, 1 H) 2.98 - 3.05 (m, 1 H) 3.12 (dd, J=13.39, 3.54 Hz, 1 H) 3.87 (dd, J=8.46, 2.65 Hz, 1 H) 4.46 (br. s., 2 H) 4.48 - 4.67 (m, 4 H) 7.06 (ddd, J=12.57, 8.15, 1.26 Hz, 1 H) 7.15 (td, J=7.58, 1.26 Hz, 1 H) 7.24 - 7.31 (m, 1 H) 7.44 (td, J=8.08, 2.02 Hz, 1 H).
2-(12) (4aS,5S,7aS)-7a-(2-플루오로-5-니트로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민의 합성
(4aS,5S,7aS)-5-(플루오로메틸)-7a-(2-플루오로페닐)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (45.85 g, 161.26 mmol)를 TFA (192 mL)에 용해하고, 용액을 0℃로 냉각하였다. 황산 (진한 황산, 33.65 mL, 161.26 mmol)을 첨가한 다음, 발연 질산 (7.78 mL, 185.44 mmol)을 25분간 점적하였다. 0℃에서 30분간 교반한 후, 반응 혼합물을 얼음 (500 g)/CHCl3 (500 mL)에 붓고, 6N NaOH (aq.)를 사용하여 pH 12로 염기성화하였다. 2개의 층을 분리하고, 수층을 CHCl3 (2 x 500 mL)로 추출하였다. 조합한 유기 추출물을 MgSO4 상에 건조 및 농축하여, 밝은 오렌지 폼으로서 산물을 수득하였다 (52.11 g, 98 %). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.80 (dd, J=13.26, 3.92 Hz, 1 H) 3.03 (dt, J=7.77, 3.82 Hz, 1 H) 3.08 (dd, J=13.39, 3.28 Hz, 1 H) 3.85 (dd, J=8.84, 2.27 Hz, 1 H) 4.49 - 4.67 (m, 4 H) 7.22 (dd, J=10.99, 8.97 Hz, 1 H) 8.16 - 8.23 (m, 1 H) 8.43 (dd, J=6.82, 2.78 Hz, 1 H).
2-(13) tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(2-플루오로-5-니트로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트의 합성
(4aS,5S,7aS)-7a-(2-플루오로-5-니트로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (52.0 g, 157.90 mmol)을 THF (440mL)에 RT 및 질소 하에 용해하였다. 트리에틸아민 (37.41 mL, 268.43 mmol)을 시린지를 통해 RT에서 점적하였다. 용액을 0℃로 냉각하였다. 디-tert-부틸 디카보네이트 (51.69g, 236.85 mmol)의 THF (50 mL) 용액을 15분에 걸쳐 나누어 첨가하였다 (내부 온도는 4℃로 유지됨). 반응 혼합물을 15분간 얼음조에서 교반하고, 최대 RT로 승온시킨 후, 밤새 교반하였다. TLC를 통해 출발 물질이 남아있는 것으로 확인되었다. 반응물을 0℃로 냉각하였다. 여기에 트리에틸아민 (22 mL, 157.90 mmol)을 첨가한 다음 디-tert-부틸 디카보네이트 (17.23g, 78.95 mmol)의 THF (10 mL) 용액을 첨가하였다. 반응물을 최대 RT로 승온시키고, 질소 하에 밤새 교반하였다. ~300 mL이 될 때까지 THF를 증발시켰다. 여기에 EtOAc (1 L)를 첨가하고, 수득되는 침전물을 여과하여, 산물을 백색 고형물 25.34 g으로서 수득하였다. 여과물에 THF (100 mL)와 NH4Cl 포화 수용액 (0.5 L)을 첨가하였다. 2개의 층을 분리하고, 수층을 EtOAc로 추출하였다 (2 x 250 mL). 조합한 유기 추출물을 MgSO4 상에 건조 및 농축하였다. 잔류물에 EtOAc (500 mL)를 첨가하고, 침전물을 여과하여, 백색 고형물로서 산물을 수득하였다 (36.16 g). 전체 61.50 g이 수득되었다 수율 90.7 %. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.53 (s, 9 H) 2.73 (dd, J=13.64, 4.04 Hz, 1 H) 2.98 (d, J=13.14 Hz, 1 H) 3.18 (br. s., 1 H) 3.84 (d, J=8.08 Hz, 1 H) 4.45 - 4.74 (m, 4 H) 7.19 - 7.26 (m, 1 H) 7.35 (br. s., 1 H) 8.16 - 8.26 (m, 1 H) 8.27 - 8.36 (m, 1 H)
2-(14) tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트의 합성
tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(2-플루오로-5-니트로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트 (67.99 g, 158.32 mmol)를 에탄올 (500 mL)에 용해하였다. 주석 클로라이드 이수화물 (125.03 g, 554.13 mmol)을 RT에서 20분에 걸쳐 나누어 첨가하였다. 반응물의 내부 온도는 주석 클로라이드 첨가시 18℃ - 12℃가 되었다. 제조되는 노란색 현탁물을 RT에서 교반하였다. 이를 RT에서 40분간 교반한 후, 현탁물이 투명 용액으로 바뀌었으며, 내부 온도는 40℃로 증가하였다. 마지막으로, 교반 20분 후, 내부 온도는 23℃로 냉각되었다. 반응물을 RT에서 밤새 (16시간) 교반하였다. 반응 혼합물을 20분에 걸쳐 차가운 NaOH (2N aq., 1 L) 용액과 셀라이트® (~110 g)에 서서히 0℃에서 부었다. 제조되는 혼합물을 셀라이트®로 더욱 여과한 다음 EtOAc (2 L)로 추출하였다. 2개의 층으로 분리되었다. 조합한 유기 추출물을 물 (500 mL)과 브린 (500 mL)으로 세척하고, MgSO4 상에 건조 및 증발시켜, 표제 화합물을 노란색 고형물로서 수득하였다 (59.28 g, 94%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.51 (s, 9 H) 2.70 (dd, J=13.71, 3.60 Hz, 1 H) 3.11 (d, J=12.51 Hz, 1 H) 3.21 (br. s., 1 H) 3.64 (br. s., 2 H) 3.87 (d, J=7.45 Hz, 1 H) 4.48 - 4.69 (m, 4 H) 6.54 - 6.66 (m, 2 H) 6.87 (dd, J=11.94, 8.53 Hz, 1 H)
2-(15) tert -부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(2-플루오로-5-(5-메톡시피라진-2-카르복스아미도)페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트의 합성
DCM (60 mL) 중의 tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트 (4.70 g)와 5-메톡시피라진-2-카르복실산(2.65 g)의 교반한 용액에, N,N-디이소프로필에틸아민 (8.0 mL)과 (1H-벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리딘-1-일)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (9.0 g)를 10분에 나누어 분할하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 18시간 동안 RT에서 교반하고, 약 20 mL로 진공 농축한 다음, 중탄산나트륨 (포화 수용액, 100 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고 (2 x 150 mL), 유기층을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발 후, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (DCM에서의 0% -> 50% EtOAc 농도구배), 표제 화합물을 백색 고형물로서 수득하였다 (6.71 g, 순도 약 90%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.54 (m, 9 H), 2.71 - 2.83 (br. s., 1 H), 3.03 - 3.34 (br. s., 1 H), 3.81 - 4.01 (br. s., 1 H), 4.09 (m, 3 H), 4.48 - 4.75 (m, 4 H), 7.05 - 7.20 (m, 1 H), 7.36 - 7.58 (m, 1 H), 7.93 - 8.02 (m, 1 H), 8.20 (d, J=1.3 Hz, 1 H), 9.04 (d, J=1.3 Hz, 1 H), 9.53 (br. s., 1 H)
2-(16) N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4-플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드의 합성
제조예 2-(2)에서 합성한 tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(2-플루오로-5-(5-메톡시피라진-2-카르복스아미도)페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트 (6.71 g, 순도 약 90%)를 DCM (20 mL)에 용해하고, TFA (10 mL)를 첨가하였다. RT에서 2시간 교반한 후, 반응 혼합물을 증발시킨 후, 중탄산나트륨 (포화 수용액, 50 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고 (2 x 100 mL), 유기상을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발한 후, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (DCM에서 0% -> 50% EtOAc), 표제 화합물을 백색 고형물로서 수득하였다 (3.26 g). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.81 (dd, J=13.4, 3.8 Hz, 1 H), 3.08 (dt, J=7.7, 3.7 Hz, 1 H), 3.18 (dd, J=13.4, 3.3 Hz, 1 H), 3.88 (dd, J=8.6, 2.5 Hz, 1 H), 4.09 (s, 3 H), 4.43 - 4.73 (m, 6 H), 7.10 (dd, J=11.9, 8.8 Hz, 1 H), 7.55 (dd, J=7.1, 2.8 Hz, 1 H), 7.91 - 8.00 (m, 1 H), 8.17 (d, J=1.3 Hz, 1 H), 9.04 (d, J=1.0 Hz, 1 H), 9.51 (s, 1 H)
실시예 3: N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4-플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드의 합성
Figure pct00019
3-(2) tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-5-(디플루오로메틸)-7a-(2-플루오로-5-(5-메톡시피라진-2-카르복스아미도)페닐)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트의 합성
DCM (30 mL) 중의, tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2-플루오로페닐)-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트 (2.70 g)와 5-메톡시피라진-2-카르복실산(1.25 g, WO2009/091016)의 교반한 용액에, N,N-디이소프로필에틸아민 (3.5 mL) 및 (1H-벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리딘-1-일)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (4.2 g)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 18시간 RT에서 교반하고, 약 20 mL로 진공 농축한 다음, 중탄산나트륨 (포화 수용액, 100 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고 (2 x 150 mL), 유기층을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발 후, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (DCM에서 0% -> 25% 농도구배), 표제 화합물을 백색 고형물로서 수득하였다(1.74 g). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.54 (s, 9 H), 2.76 - 2.88 (m, 1 H), 2.95 - 3.28 (m, 1 H), 3.34 - 3.53 (m, 1 H), 3.83 - 3.93 (m, 1 H), 4.10 (s, 3 H), 4.46 - 4.68 (m, 2 H), 5.98 (dt, J = 3.6, 56.8 Hz, 1 H), 7.07 - 7.20 (m, 1 H), 7.36 - 7.48 (m, 1 H), 7.96 - 8.04 (d, J=7.8 Hz, 1 H), 8.20 (d, J=1.0 Hz, 1 H), 9.04 (d, J=1.3 Hz, 1 H), 9.53 (br. s., 1 H)
3-(3) N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4-플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드의 합성
제조예 3-(2)에서 합성한 tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-5-(디플루오로메틸)-7a-(2-플루오로-5-(5-메톡시피라진-2-카르복스아미도)페닐)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트 (1.74 g)를 DCM (20 mL)에 용해하고, TFA (10 mL)를 첨가하였다. RT에서 2시간 교반한 후, 반응 혼합물을 증발시키고, 중탄산나트륨 (포화 수용액, 50 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고 (2 x 100 mL), 유기상을 조합하여 MgSO4 상에 건조 및 증발시켜, 표제 화합물을 백색 고형물로서 수득하였다 (1.33 g). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.89 (dd, J=13.6, 3.8 Hz, 1H), 3.18 (dd, J=13.3, 2.9 Hz, 1H), 3.29 - 3.37 (m, 1H), 3.90 (d, J=7.3 Hz, 1H), 4.09 (s, 3H), 4.41 - 4.70 (m, 4H), 5.96 (dt, J= 4.5, 56.1 Hz, 1H), 7.12 (dd, J=11.9, 8.8 Hz, 1H), 7.50 - 7.62 (m, 1H), 7.97 (dt, J=8.7, 3.3 Hz, 1H), 8.17 (d, J=1.3 Hz, 1H), 9.04 (d, J=1.0 Hz, 1H), 9.52 (s, 1H)
실시예 4: N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4,5-디플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드
Figure pct00020
공정 4-(2): 1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-올
Figure pct00021
RT에서, 트리페닐메틸 클로라이드 (3.31 kg, 11.87 mol, 0.99 당량)의 톨루엔 (6.74 kg) 용액에, 부트-3-엔-1,2-디올 (1.06 kg, 12.02 mol, 1.0 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각하였다. 온도를 5℃ 미만으로 유지하면서 반응 혼합물에 트리에틸아민 (2.72 kg, 26.91 mol, 2.24 당량)을 서서히 첨가한 다음, 4-디메틸아미노피리딘 (8.38 g, 0.068 mol, 5.71 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 최대 10℃로 승온시킨 다음 40℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 밤새 40℃에서 교반하였다. 반응을 TLC (헵탄/EtOAc 20%에서 Rf 0.45)로 추적하였다. 반응 혼합물을 26.5℃로 냉각하고, 여과한 다음, 고형물을 톨루엔 (2.72 kg)으로 헹구었다. 여과물을 28% NH4Cl 수용액 (3.38 kg)과 NaCl 포화 수용액 (1.26 kg)으로 순차적으로 세척하였다. 유기상을 감압하 농축하여, 조산물 혼합물로서 오일을 수득하였다 (3.95 kg). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 7.42 (dd, J = 8.3, 1.0 Hz, 6H), 7.33 (dd, J = 10.5, 4.8 Hz, 6H), 7.30 - 7.19 (m, 3H), 5.94 - 5.83 (m, 1H), 5.25 (td, J = 17.3, 1.8 Hz, 1H), 5.08 (td, J = 10.9, 1.8 Hz, 1H), 2.99 (dd, J = 8.9, 6.3 Hz, 1H), 2.84 (dd, J = 8.9, 5.7 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ 144.35, 140.07, 128.78, 128.26, 127.39, 115.04, 86.25, 70.88, 68.27.
HRMS 계산치 C23H22O2 [M+Na]+ 353.1517; 실측치 353.1543.
4-(3): tert-부틸 2-((1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-일)옥시)아세테이트
Figure pct00022
질소 분위기에서, 톨루엔 (4.63 kg)에 용해된 테트라부틸암모늄 수소 설페이트 (367 g, 1.08 mol, 0.1 당량) 현탁물을 제조하여 0℃로 냉각하였다. 50% NaOH 수용액 (9.09 kg)을 온도를 50℃ 이하로 유지하면서 서서히 첨가하였다. 공정 4-(2) 유래의 조 혼합물(3.95 kg, 톨루엔 중의 1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-올, 총 양 6.34 kg)을 온도를 15℃ 이하로 유지하면서 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 15분간 교반하였다. tert-부틸 브로모아세테이트 (1.01 kg, 5.19 mol, 0.43 당량)를 첨가하여 슬러리 형성을 유도하였다. 여기에 물 (1 kg)을 첨가한 다음 tert-부틸 브로모아세테이트 (1.55 kg, 7.95 mol, 0.66 당량)를 첨가하였고, 이때 온도는 30℃ 미만으로 유지하였다. 반응물을 밤새 교반시켰다. 반응물을 TLC (헵탄/EtOAc 20% 중의 Rf 0.60)로 추적하였다. 여기에 물 (9.72 kg)과 2-메톡시-2-메틸프로판 (10.4 kg)을 첨가한 다음, 물 (3.90 kg)과 NaCl 포화 수용액 (0.63 kg)으로 세척하였다. 유기상을 감압하 농축하여, 조 혼합물을 수득하였다 (4.70 kg). 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 7.47 (dt, J = 7.9, 3.9 Hz, 6H), 7.27 - 7.19 (m, 6H), 7.14 (dd, J = 14.2, 6.9 Hz, 3H), 5.81 - 5.70 (m, 1H), 5.28 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 4.10 - 3.94 (m, 3H), 3.34 (dt, J = 17.7, 8.8 Hz, 1H), 3.18 (dd, J = 9.6, 5.3 Hz, 1H), 1.43 (s, 9H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 169.48, 143.95, 135.69, 128.69, 127.67, 126.86, 118.47, 86.62, 81.07, 80.74, 66.75, 66.41, 28.05.
HRMS 계산치 C29H22O4 [M+Na]+ 467.2193; 실측치 467.2198.
4-(4): 2-((1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-일)옥시)아세트알데하이드
Figure pct00023
공정 4-(3)의 조 혼합물 (tert-부틸 2-((1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-일)옥시)아세테이트 3.01 kg, 6.771 mol, 1.00 당량)을 CH2Cl2 (5.81 L)에 용해하였다. 반응 혼합물을 -78℃로 냉각하였다 DIBAL (톨루엔 중의 1.5 M, 4.14 L, 6.19 mol, 1.00 당량)을 온도를 -65℃ 미만으로 유지하면서 나누어 첨가하였다. 반응물을 다시 30분간 -78℃에서 교반하였다. 온도를 -60℃ 이하로 유지하면서, 반응 혼합물에 HCl 수용액 (4.00 L, 2.0 M)을 천천히 첨가하였다. 그 후, 반응물을 최대 16.8℃로 승온시켰다. 반응 혼합물에 HCl 수용액 (2.0 M, 3.50 L)을 천천히 첨가하였다. 유기상을 추출한 다음 HCl 수용액 (1M, 7.50 L)과 10% NaHCO3 수용액 (3.75 L)으로 순차적으로 세척하였다. 유기상을 다음 단계의 조 용액 (11.48 kg)으로서 취하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 9.62 (s, 1H), 7.43 (dd, J = 8.3, 0.9 Hz, 6H), 7.32 (dd, J = 13.5, 5.6 Hz, 6H), 7.25 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 5.81 - 5.70 (m, 1H), 5.30 (dd, J = 17.3, 1.0 Hz, 1H), 5.24 (dd, J = 10.4, 0.8 Hz, 1H), 4.19 (q, J = 18.2 Hz, 2H), 4.05 (dd, J = 11.4, 6.2 Hz, 1H), 3.16 (dd, J = 9.7, 6.3 Hz, 1H), 3.05 (dd, J = 9.7, 4.4 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 201.70, 144.14, 135.92, 128.75, 128.32, 127.48, 119.01, 86.55, 80.79, 74.60, 66.57.
4-(5): 2-((1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-일)옥시)아세트알데하이드 옥심
Figure pct00024
CH2Cl2 (7.76 kg)를 공정 4-(4) (11.48 kg 총양)의 조 용액에 첨가하였다. NaOAc (1.11 kg, 13.54 mol)를 첨가하고, 반응물을 18.7℃에서 30분간 교반하였다. 하이드록실아민 하이드로클로라이드 (706 g, 10.16 mol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 18.9℃에서 다시 18시간 교반하였다. 여기에 물 (10.1 L)을 첨가하였다. 2상 혼합물을 45분간 교반하였다. 유기상을 분리한 다음 10% NaHCO3 수용액(5.04 l)으로 세척하였다. 그 후, 유기상을 감압하 농축하여, 녹색 오일로서 조 혼합물 (2.67 kg)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 7.52 - 7.49 (m, 0.5H), 7.48 - 7.43 (m, 6H), 7.29 - 7.21 (m, 6H), 7.20 - 7.13 (m, 3H), 6.96 (t, J = 3.6 Hz, 0.5H), 5.73 - 5.64 (m, 1H), 5.24 (dd, J = 17.3, 1.1 Hz, 1H), 5.18 (dd, J = 10.5, 0.5 Hz, 1H), 4.43 (dd, J = 16.4, 3.5 Hz, 0.51H), 4.36 (dd, J = 16.4, 3.7 Hz, 0.5H), 4.17 (dd, J = 12.9, 5.3 Hz, 0.5H), 4.07 (dd, J = 12.9, 6.1 Hz, 0.5H), 3.93 - 3.81 (m, 1H), 3.32 - 3.25 (m, 1H), 3.15 - 3.08 (m, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm 151.59, 148.71, 143.92, 135.37, 135.18, 128.67, 127.71, 126.92, 126.90, 118.43, 118.34, 86.66, 86.63, 81.09, 80.25, 66.43, 66.40, 65.63, 63.14.
참조: 이 화합물은 이성체의 혼합물로서, 큰 탄소 피크들과 반정수 양성자 적분을 차지한다.
HRMS 계산치 C25H25NO3 [M+Na]+ 410.1732; 실측치 410.1748.
4-(6): (3aR*,4S*)-4-((트리틸옥시)메틸)-3,3a,4,6-테트라하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸
Figure pct00025
공정 4-(5)의 조 혼합물 (0.432 kg)을 2-메톡시-2-메틸프로판 (2.16 L)에 용해한 다음, 질소 분위기에서 0℃로 냉각하였다. 5% NaOCl 수용액 (4.66 kg)을 반응 혼합물에 첨가한 (12.5 mL/min) 다음, 반응물을 3시간 동안 0℃에서 교반하였다. 제조된 백색 현탁물을 최대 rt로 승온시켜, 밤새 교반하였다. 현탁물을 여과하고, 고형물을 차가운 2-메톡시-2-메틸프로판 (0.5 L)으로 헹구었다. 수집한 고형물을 진공 오븐에서 건조하여, 백색 고형물로서 표제 화합물 (195.1 g)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 7.43 - 7.38 (m, 6H), 7.33 - 7.27 (m, 6H), 7.27 - 7.21 (m, 3H), 4.60 - 4.41 (m, 3H), 4.08 - 3.89 (m, 3H), 3.38 (dd, J = 9.8, 4.4 Hz, 1H), 3.28 - 3.18 (m, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm 168.82, 143.58, 128.53, 127.93, 127.23, 86.91, 80.83, 73.00, 64.80, 61.52, 58.72
HRMS 계산치 C25H23NO3 [M+H]+ 386.1756; 실측치 386.1786.
4-(7): (3aR*,4S*,6aS*)-6a-(2,3-디플루오로페닐)-4-((트리틸옥시)메틸)헥사하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸
Figure pct00026
헥산 (197 mL, 0.493 mol, 1.90 당량) 중의 2.50 M n-부틸리튬 용액을, 질소 분위기 하 -75 내지 - 69℃에서, THF/톨루엔 (100 mL/1000 mL) 중의 1-브로모-2,3-디플루오로벤젠 (95.1 g, 0.493 mol, 1.90 당량) 함유 용액에 점적 첨가하였다. 10분 후, 보론 트리플루오라이드-디에틸 에테레이트 복합체 (62.5 mL, 0.493 mol)를 온도를 -71℃ 미만으로 유지하면서 점적 첨가하였다. 온도를 -70℃ 미만으로 유지하면서, THF (400 mL) 중의 미리 준비해 둔 (3aR*,4S*)-4-((트리틸옥시)메틸)-3,3a,4,6-테트라하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸 (100 g, 0.259 mol, 1.0 당량) 용액을 첨가하였다. 이를 -75℃에서 1.5시간 교반한 후, NH4Cl 포화 수용액 (300 mL)과 물 (100 mL)을 반응 용액에 (5분에 걸쳐) 서서히 첨가하였다. 여기에 2-메톡시-2-메틸프로판 (300 mL)을 첨가하고, 반응물을 최대 0℃로 승온시켰다. 유기상을 분리하여, 27% NaCl 수용액 (200 mL)으로 세척하였다. 유기층을 감압하 농축하고, THF (200 mL)/이소프로필 알코올 (700 mL)로부터 재결정화하였다. 표제 화합물 (87.5 g)이 분리되었다. 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 7.42 - 7.33 (m, 8H), 7.31 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 7.28 - 7.21 (m, 3H), 7.20 - 7.12 (m, 1H), 6.39 (s, 1H), 4.13 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.03 (s, 1H), 3.97 (s, 1H), 3.89 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 3.81 - 3.70 (m, 1H), 3.36 - 3.29 (m, 1H), 3.26 (dd, J = 10.1, 6.0 Hz, 1H), 3.15 (dd, J = 10.0, 3.5 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 150.74 (dd, J CF = 246.4, 14.4 Hz), 148.66 (dd, J CF = 248.3, 13.5 Hz), 144.09, 130.58, 128.67, 128.32, 127.48, 124.75, 124.45, 117.18 (d, J CF = 17.0 Hz), 86.57, 84.91, 78.16, 76.81, 64.82, 56.46.
HRMS 계산치 C31H27F2NO3 [M+Na]+ 522.1857; 실측치 522.1900.
4-(8): (2S*,3R*,4S*)-4-아미노-4-(2,3-디플루오로페닐)-2-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)메탄올
Figure pct00027
(3aR*,4S*,6aS*)-6a-(2,3-디플루오로페닐)-4-((트리틸옥시)메틸)헥사하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸 (87.5 g, 0.175 mol, 1.0 당량)에 아세트산 (385 mL)을 첨가하였다. 이 현탁물을 15℃로 냉각시키고, 아연 (88.4g, 1.35 mol, 7.71 당량)을 2-3분에 걸쳐 소량씩 첨가하였다. 반응물을 3-4시간에 걸쳐 최대 18℃로 승온시켜, 9시간 교반하였다. 반응물을 셀라이트 (40 g)로 여과하고, 톨루엔 (210 mL)으로 헹구었다. 여과물을 수집하여 조 온도 35℃ 이하에서 감압하 농축하고, 톨루엔 (3 x 130 mL)을 3번에 나누어 사용하여, 체이싱( chasing)하였다. 수득되는 오일을 CH2Cl2 (320 mL)에 용해하였다. 물 (195 mL)을 첨가한 다음, 28% NH4OH (43.4 mL)를 첨가하였다. 유기층을 분리하고, 나머지 수상을 CH2Cl2 (130 mL)로 추출하였다. 유기상을 조합하여 27% NaCl 수용액 (87.5 mL)으로 헹구었다. 용액을 감압하 농축하고, THF (270 mL)에 용해하여, 셀라이트로 여과하였다. 고형물을 THF (130 mL)로 헹구고, 여과물을 조합하여 진공 농축함으로써, 표제 화합물을 폼으로서 수득하였다 (69.1 g) as a foam. 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 7.47 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 7.5 Hz, 6H), 7.34 - 7.27 (m, 7H), 7.28 - 7.21 (m, 3H), 7.19 - 7.10 (m, 1H), 4.14 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.15 - 4.09 (m, 1H), 3.77 (dd, J = 8.6, 2.6 Hz, 1H), 3.59 (dd, J = 11.1, 6.4 Hz, 1H), 3.46 (dd, J = 11.1, 6.6 Hz, 1H), 3.18 (dd, J = 9.9, 3.0 Hz, 1H), 3.07 (dd, J = 9.9, 5.8 Hz, 1H), 2.62 (dd, J = 14.6, 6.6 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 150.68 (dd, J CF = 244.4, 13.9 Hz), 148.46 (dd, J CF = 246.7, 13.0 Hz), 144.36, 135.44 (d, J CF = 8.1 Hz), 128.76, 128.23, 127.37, 124.31, 124.23, 116.12 (d, J CF = 17.1 Hz), 86.29, 81.48, 78.92 (d, J CF = 4.3 Hz), 66.03, 63.93, 59.49, 51.27
HRMS 계산치 C31H29F2NO3 [M+Na]+ 524.2013; 실측치 524.2039.
4-(9): ((2S,3R,4S)-4-아미노-4-(2,3-디플루오로페닐)-2-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)메탄올 (-)디벤조일-L-타르타르산
Figure pct00028
키랄 분리 (Chiral resolution)
라세믹 혼합물 (2S*, 3R*,4S*)-6a-(2,3-디플루오로페닐)-4-((트리틸옥시)메틸)헥사하이드로퓨로 [3,4-c]이속사졸 (69.1 g, 0.138 mol, 1.0 당량)과 (-)-디벤조일-L-타르타르산 (49.4 g, 0.138 mol, 1.0 당량)를 아세톤 (346 mL)에 용해하였다. 그 후, 혼합물을 15분간 61.9℃로 가열하였다. 여기에 톨루엔 (415 mL)을 첨가하였다. 그 후, 용액을 RT로 냉각시켰다. 이후, 반응 혼합물을 -5℃로 냉각시켜, 다시 1시간 그 온도에서 교반하였다. 이 현탁물을 여과하고, 톨루엔/아세톤 (V/V 6/5, 138 mL, 0℃로 냉각) 용액으로 헹구었다. 고형물을 감압 건조하고, 표제 화합물 (44.5 g)을 분리하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 8.00 - 7.95 (m, 4H), 7.66 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.53 (t, J = 7.8 Hz, 4H), 7.47 - 7.39 (m, 2H), 7.40 - 7.35 (m, 6H), 7.35 - 7.28 (m, 6H), 7.28 - 7.23 (m, 3H), 7.23 - 7.15 (m, 1H), 5.75 (s, 1H), 4.19 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 4.02 (dd, J = 9.5, 2.1 Hz, 1H), 3.61 (dd, J = 11.4, 6.4 Hz, 1H), 3.52 (dd, J = 11.4, 6.2 Hz, 1H), 3.21 - 3.14 (m, 1H), 3.12 - 3.05 (m, 1H), 2.77 (dd, J = 14.3, 6.4 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 168.07, 165.23, 150.68 (dd, J CF = 245.2, 13.4 Hz), 148.27 (dd, J CF = 248.0, 13.6 Hz), 144.18, 134.09, 129.75, 129.60, 129.24, 128.70, 128.28, 127.45, 124.88, 124.20, 117.40 (d, J CF = 16.8 Hz), 86.40, 80.73, 76.73, 72.22, 65.42, 64.58, 58.63, 50.51.
HRMS 계산치 C31H29F2NO3 [M+Na]+ 524.2013; 실측치 524.2047.
키랄 HPLC 파라미터:
장치, 시약 및 이동상:
장치:
HPLC 컬럼: Chiralpak AD, 4.6 x 250 mm, 10 μm, Daicel Chemical Industries, Ltd., catalog no. 19025.
용매 전달 시스템: Agilent 1100 HPLC 터너리 펌프, 저압, 인-라인 탈기제와 믹싱, 또는 등가물.
오토샘플러: Agilent 1100 autosampler, 0.1 내지 100 ㎕ 범위 또는 등가물
검출기: Agilent 1100 가변성 파장 검출기 또는 등가물.
크로마토그래피 소프트웨어: Agilent ChemStation 소프트웨어 버전 A.09.03 또는 고급 HPLC, Waters Empower 2 Build 2154 또는 등가물.
부피 측정용 유리제품: Class A.
부피 측정용 파이펫: Class A.
파이페토르: 캘리브레이션된 에펜도르프 적정가능한 부피 또는 등가물.
밸런스: 분석 밸런스, ± 0.1 mg 칭량 가능함
시약:
헵탄: HPLC 등급, 비이커 (catalog no. 9177-03) 또는 등가물.
2-프로판올: HPLC 등급, 비이커 (catalog no. 9095-03) 또는 등가물.
트리에틸아민: ≥ 99%, Sigma-Aldrich (catalog no. T0886) 또는 등가물.
이동상:
100 mL 2-프로판올 및 900 mL 헵탄 (각각 100 mL 및 1000 mL 눈금의 실린더로 개별 측정됨)을 첨가하고, 0.5 mL 트리에틸아민 (부피 측정용 유리 파이펫으로 측정)을 적정 플라스크에 넣고, 혼합하였다. 사용하는 동안 인-라인 탈기하였다.
희석 용액: 2-프로판올
HPLC 파라미터:
HPLC 컬럼: Chiralpak AD, 4.6 x 250 mm, 10 ㎛, Daicel Chemical Industries, Ltd., catalog no. 19025.
온도: 35℃
유속*: 0.8 mL/min
농도구배: NA
주입 부피: 5 ㎕
검출: 260 nm UV
데이타 획득 시간: 40 min
총 운영 시간: 40 min
컬럼 최대압: 35 Bar
니들 세척: 2-프로판올
*유속은 명시된 체류 시간을 달성하기 위해 ± 0.2 ml/min으로 조정할 수 있음.
분석물과 불순물의 체류 시간:
화합물 피크 체류 시간
(상대적인 체류 시간, RRT)
Figure pct00029
 15.5 min ± 10%
(RRT 1.00)
Figure pct00030

(거울상이성체)		 21.5 min
(RRT 1.39)
화합물 4-(9)의 키랄 HPLC 분리로부터 수득한 전형적인 크로마토그램을 도 1에 나타낸다.
4-(10): N-(((3S,4R,5S)-3-(2,3-디플루오로페닐)-4-(하이드록시메틸)-5-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)카르바모티오일)벤즈아미드
Figure pct00031
((2S,3R,4S)-4-아미노-4-(2,3-디플루오로페닐)-2-((트리틸옥시)메틸) 테트라하이드로푸란-3-일)메탄올 (-)디벤조일-L-타르타르산 (44.21 g, 0.051 mol, 1.0 당량)의 EtOAc (133 mL) 현탁물을 1.7℃로 냉각시켰다. NaOH 수용액 (1.0 M, 121 mL, 0.12 mol, 2.4 당량)을 온도를 5℃ 이하로 유지하면서 첨가하였다. 반응물을 5분간 교반한 다음, 벤질 이소티오시아네이트 (9.43 g, 0.058 mol, 1.12 당량)를 5분에 걸쳐 첨가하였다. 1.5시간 후, EtOAc (133 mL)를 첨가하였다. 유기상을 분리하여, NaHCO3 포화 수용액 (130 mL)과 18% NaCl 수용액 (44 mL)으로 순차적으로 세척하였다. 수상을 조합하여 EtOAc (66 mL)와 CH2Cl2 (30 mL)로 추출하였다. 유기상을 모두 합하여, 여과 및 감압하 농축하였다. 잔류 용매를 CH2Cl2 (88 mL)로 체이싱하여, 표제 화합물 (34.2 g)을 폼으로서 분리하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 11.97 (br s, 1H), 11.20 (br s, 1 H), 7.94 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.63 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.51 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.38 - 7.21 (m, 17H), 7.13 (dd, J = 13.4, 7.9 Hz, 1H), 5.13 (t, J = 4.4 Hz, 1H), 5.07 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 4.47 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.24 - 4.16 (m, 1H), 3.68 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.19 (dd, J = 10.1, 2.9 Hz, 1H), 3.01 (dd, J = 10.1, 4.8 Hz, 1H), 2.63 - 2.52 (m, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 180.06, 168.14, 150.75 (dd, J CF = 244.6, 13.2 Hz), 147.93 (dd, J CF = 247.5, 13.5 Hz), 144.15, 133.46, 132.55. 131.90 (d, J CF = 6.4 Hz), 129.04, 128.86, 128.67, 128.28, 127.43, 124.41, 124.25, 116.12 (d, J CF = 17.0 Hz), 86.27, 79.75, 75.03, 68.04, 64.63, 58.16, 53.35.
HRMS 계산치 C39H34F2N2O4S [M+H]+ 663.2129; 실측치 663.2200.
4-(11): N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-((트리틸옥시)메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드
Figure pct00032
N-(((3S,4R,5S)-3-(2,3-디플루오로페닐)-4-(하이드록시메틸)-5-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)카르바모티오일)벤즈아미드 (34.0 g, 0.0511 mol, 1.0 당량)의 CH2Cl2 (204 mL) 용액에, -20℃에서, 피리딘 (10.3 ml, 0.128 mol, 2.50 당량)을 첨가하였다. 그런 후, 트리플루오로메탄설폰 무수물 (9.46 mL, 0.0563 mol, 1.10 당량)의 CH2Cl2 (34 mL) 용액을 12분에 걸쳐, 온도를 -17℃ 이하로 유지하면서, 첨가하였다. 반응물을 -20℃에서 30분간 교반한 다음, 5℃로 서서히 승온시켰다. NH4Cl 포화 수용액 (85 mL)과 물 (32 mL)을 첨가하였다. 그 후, 수층을 CH2Cl2 (68 mL)로 추출하였다. 유기상을 감압하 농축하여, 표제 화합물을 오렌지 폼 (33.6 g)으로서 수득하였다.
HRMS 계산치 C39H32F2N2O3S [M+H]+ 647.2180; 실측치 647.2123.
4-(12): N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(하이드록시메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드
Figure pct00033
포름산 (116 mL)을 N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-((트리틸옥시)메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (33.30 g, 0.051 mol, 1.0 당량)에 첨가하고, 혼합물을 RT에서 25분간 교반하였다. 반응물에 물 (17 mL)을 점적 첨가한 다음, 다시 30분간 교반하였다. 수득되는 현탁물을 여과하고, 여과물을 진공 하 톨루엔 (360 mL)을 이용한 공비 혼합 증류에 의해 건조하였다. 여기에 메탄올 (110 mL)을 첨가한 다음 트리에틸아민 (22 mL, 0.15 mol, 3.0 당량)을 첨가하고, 용액을 2시간 교반하였다. 용매를 진공 하에 제거하고, 톨루엔 (66 mL)으로 체이싱하였다. 잔류 오일을 CH2Cl2 (250 ml)에 용해하고, HCl 수용액 (1M, 100 mL), NaHCO3 포화 수용액 (67 mL) 및 18% NaCl 수용액 (67 mL)으로 순차적으로 세척하였다. 유기상을 감압 농축하였다. 그 후, 잔류물에 톨루엔 (66 mL)과 THF (67 mL)를 첨가하고, 용액을 셀라이트로 여과 및 감압하 농축하여, 표제 화합물을 수득하였다 (21 g). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 8.11 (dd, J = 16.4, 4.2 Hz, 2H), 7.70 - 7.58 (m, 1H), 7.57 - 7.44 (m, 3H), 7.43 - 7.34 (m, 1H), 7.34 - 7.26 (m, 1H), 4.43 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.25 - 4.16 (m, 1H), 4.10 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 3.59 (d, J = 4.5 Hz, 2H), 3.30 - 3.21 (m, 1H), 3.20 - 3.08 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 169.08, 150.95 (dd, J CF = 245.8, 13.1 Hz), 148.22, 148.09 (dd, J CF = 248.7, 13.2 Hz), 133.46, 129.11, 128.99, 128.62, 125.43, 124.70, 118.16 (d, J CF = 16.9 Hz), 81.36, 75.29, 66.76, 62.39, 40.77, 24.25.
HRMS 계산치 C20H18F2N2O3S [M+H]+ 405.1084; 실측치 405.1081.
4-(13): N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드
Figure pct00034
N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(하이드록시메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (21.0 g, 0.519 mol, 1.0 당량)를 드라이 THF (105 mL)에 질소 분위기 하에 용해하고, 용액을 0℃로 냉각하였다. 여기에, 온도를 5℃ 이하로 유지하면서, N,N-디이소프로필에틸아민 (40.7 mL, 0.234 mol, 4.50 당량), 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드 (14.0 mL, 0.0857 mol, 1.65 당량) 및 퍼플루오로부탄설포닐 플루오라이드 (22.4 mL, 0.125 mol, 2.40 당량)를 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 3시간 교반한 다음, RT로 서서히 승온시키고, 11시간 교반하였다. 반응 혼합물에 NH4Cl 포화 용액 (100 mL)과 2-메톡시-2-메틸프로판 (100 mL)을 순차적으로 첨가하였다. 유기상을 분리하여, HCl 수용액 (1.0 M, 100 ml)으로 세척하고, 농축한 다음, 다시 2-메톡시-2-메틸프로판 (301 ml)에 용해시켰다. 그 후, 유기상을 HCl 수용액 (1M, 63 mL), NaHCO3 포화 수용액(100 mL)으로 세척하였다. 마지막 수층을 2-메톡시-2-메틸프로판으로 추출하였다. 유기상을 조합하여 18% NaCl 수용액 (63 mL)으로 세척하고, 감압하 농축하여, 표제 화합물을 폼으로서 수득하였다 (19.40 g). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 8.02 (s, 2H), 7.61 - 7.51 (m, 1H), 7.51 - 7.38 (m, 3H), 7.39 - 7.18 (m, 2H), 4.72 - 4.49 (m, 2H), 4.48 - 4.37 (m, 1H), 4.41 (d, J = 9.1 Hz, 21H), 3.04 (s, 2H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 150.92 (dd, J CF = 245.5, 13.3 Hz), 148.11 (dd, J CF = 248.2, 13.4 Hz), 132.40, 128.99, 128.63, 125.16, 124.94, 117.61, 83.64 (d, J CF = 170.2 Hz), 79.51 (d, J CF = 18.4 Hz), 76.17, 66.27, 23.67.
HRMS 계산치 C20H17F3N2O2S [M+H]+ 407.1041; 실측치 407.1024.
4-(14): (4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민
Figure pct00035
N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (19.40 g, 0.048 mol, 1.0 당량)를 메탄올 (97 mL)에 질소 분위기 하에 용해하였다. 여기에 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔 (8.92 mL, 0.060 mol, 1.25 당량)을 첨가하고, 용액을 55-60℃로 가열하였다. 8시간 후, 반응 혼합물을 감압하 농축하고, 잔류물을 실리카 겔 플래시 컬럼 크로마토그래피 (헵탄에서의 5% -> 100% EtOAc)로 정제하여, 표제 화합물을 수득하였다(9.01 g). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 7.38 - 7.28 (m, 1H), 7.26 - 7.14 (m, 2H), 6.12 (s, 2H), 4.66 - 4.41 (m, 2H), 4.37 - 4.27 (m, 2H), 4.29 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 3.74 (dd, J = 8.2, 2.6 Hz, 1H), 3.30 (s, 1H), 3.06 - 2.90 (m, 2H), 2.79 - 2.71 (m, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 150.84 (dd, J = 244.8, 14.0 Hz), 149.71, 148.07 (dd, J CF = 247.8, 13.4 Hz), 133.08 (d, J CF = 7.7 Hz), 125.24, 124.55 (dd, J CF = 7.2, 4.3 Hz), 116.58 (d, J CF = 17.2 Hz), 83.91 (d, J CF = 170.0 Hz), 79.12 (d, J CF = 18.2 Hz), 77.96 (d, J CF = 4.9 Hz), 66.22, 36.41 (d, J CF = 3.3 Hz), 23.40.
HRMS 계산치 C13H13F3N2OS [M+H]+ 303.0779; 실측치 303.0767.
4-(15) : (4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로-5-니트로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민
Figure pct00036
(4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (9.10 g, 0.03 mol, 1.0 당량)을 트리플루오로아세트산 (36.4 mL)에 용해하고, 용액을 0℃로 냉각시켰다. 황산 (진한 황산, 12.0 mL)을 첨가한 다음, 발연 질산 (6.9 mL)을 온도를 5℃ 이하로 유지하면서 점적하였다. 이를 0-5℃에서 4시간 교반한 후, 온도를 20℃ 이하로 유지하면서, 왕성하게 교반한 NaOH 수용액 (43.3 g/물 273 mL)에 반응 혼합물을 서서히 첨가하였다. 혼합물을 CH2Cl2 (1 x 94 ml, 및 2 x 64 mL)로 추출하고, 유기상을 조합하여 NaCl 포화 수용액 (46 mL)으로 세척하였다. 유기상에 셀라이트 (15.0g)를 첨가하고, 혼합물을 여과하여 CH2Cl2 (40 mL)로 헹구었다. 용매를 증발시켜, 표제 화합물(8.3 g)을 수득하였고, 다음 단계에 정제없이 사용하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 8.41- 8.30 (m, 1H), 8.22 - 8.13 (m, 1H), 6.36 (s, 2H), 4.70 - 4.46 (m, 2H), 4.43 - 4.31 (m, 1H), 4.35 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 8.5, 1.6 Hz, 1H), 3.04 - 2.91 (m, 2H), 2.86 - 2.76 (m, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 152.36 (dd, J CF = 246.8, 12.3 Hz), 151.13, 150.32 (dd, J CF = 238.2, 12.2 Hz), 143.25 (dd, J CF = 7.9, 2.5 Hz), 134.70 (d, J CF = 9.5 Hz), 121.28, 113.02 (d, J CF = 22.3 Hz), 83.74 (d, J CF = 170.1 Hz), 79.44 (d, J CF = 18.3 Hz), 78.02 (d, J = 3.9 Hz), 36.96, 23.28.
HRMS 계산치 C13H12F3N3O3S [M+H]+ 348.0630; 실측치 348.0614.
4-(16): (4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2,3-디플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민
Figure pct00037
철 (8.03 g, 0.144 mol, 6.0 당량)에 에탄올 (66.56 mL)을 첨가한 다음, 진한 HCl (62%, 1.2 mL, 0.014 mol, 0.60 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 65℃로 가열한 다음, NH4Cl 포화 용액 (33%, 33.3 mL)을 첨가하고, 반응 온도를 55℃로 유지하였다. 이 철 현탁물에, 에탄올 (41.6 mL) 중의 (4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로-5-니트로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (8.32g, 0.024 mol, 1.0 당량)과 진한 HCl (1.93 mL, 0.024 mol, 1.0 당량) 용액을 첨가하였다. 반응물을 30분간 55℃에서 교반한 다음, 에탄올 (50 mL)을 첨가하고, 현탁물을 20℃로 냉각시킨 후, 셀라이트로 여과하고 (8.3 g), 에탄올 (125 mL)로 헹구었다. 여과물을 감압하 농축하고, 물 (66 mL)을 첨가한 다음, 3.0 M NaOH 수용액 (24 mL, 0.0179 mol, 3.0 당량)을 첨가하였다. 수득되는 혼합물을 CH2Cl2 (2 x 83 mL)로 추출하였다. 유기상을 조합하여 셀라이트로 여과하고, 감압 농축하여, 표제 화합물을 수득하였다 (7.60 g). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 6.42-6.35 (m, 2H), 6.02 (brs, 2H), 4.66-4.41 (m, 2H), 4.37-4.25 (m, 1H), 4.21 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.69 (dd, J = 7.8, 2.2 Hz, 1H), 2.97 (qd, J = 13.5, 3.4 Hz, 3H), 2.74-2.64 (m, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 151.08 (dd, J CF = 240.1, 14.8 Hz), 148.88, 145.40 (d, J CF = 10.7 Hz), 139,33 (dd, J CF = 233.5, 13.8 Hz), 132.53 (d, J CF = 8.1 Hz), 109.90, 100.70 (d, J CF = 20.0 Hz), 83.99 (d, J CF = 169.9 Hz), 78.79 (d, J CF = 18.3 Hz), 77.99 (d, J CF = 5.5 Hz), 66.22, 36.24, 23.14.
HRMS 계산치 C13H14F3N3OS [M+H]+ 318.0888; 실측치 318.0874.
4-(17): N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4,5-디플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드
Figure pct00038
5-메톡시피라진-2-카르복실산(4.01 g, 0.026 mol, 1.10 당량)의 N,N'-디메틸이미다졸린-2-온 (22.5 mL) 현탁물을 주위 온도에서 15분간 교반한 다음, 0℃로 냉각시켰다. 여기에, 온도를 10℃ 이하로 유지하면서 티오닐 클로라이드 (2.24 mL, 0.031 mol, 1.3 당량)를 첨가하였다. 수득되는 현탁물을 2시간 동안 0-10℃로 교반하였고, 이때 맑은 용액으로 전환되었다. 다른 용기에서, (4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2,3-디플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (7.60 g, 0.024 mol, 1.0 당량)을 N,N'-디메틸이미다졸린-2-온 (22.5 mL)에 용해하였다. 수득되는 용액을, 온도를 10℃ 이하로 유지하면서, 아실 클로라이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분간 교반하였다. 30℃ 이하로 온도를 유지하면서 물 (112 mL)을 첨가하였다. 수득되는 혼합물을 30분간 교반한 다음, EtOAc (112 mL)를 첨가하였다. 이 혼합물에, 50% NaOH 수용액 (10.0 g)을 수층의 pH가 11이 될 때까지 첨가하였다. 수층을 EtOAc (75 mL)로 추출하였다. 유기상을 조합하여, NaCl 포화 수용액 (38 mL)과 물 (38 mL)로 세척하였다. 유기상을 실리카 겔 패드 (15 g)로 여과하고, EtOAc (37.5 mL)로 헹구었다. 유기상을 진공 농축하여, 고형물을 수득하였다. 이 고형물에, 1-프로판올 (112 mL)을 첨가하고, 현탁물을 100℃로 가열하였다. 이 혼합물을 -10℃로 냉각시켜, 1시간 유지하였다. 고형물을 여과하여, 차가운 1-프로판올 (15 mL)로 헹군 다음, 무게가 일정해 질때까지 진공 건조 (35℃)하여, 표제 화합물을 수득하였다 (8.18 g). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 10.73 (s, 1H), 8.88 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 8.39 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 8.11 - 7.87 (m, 1H), 7.73 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 6.07 (s, 2H), 4.68 - 4.44 (m, 2H), 4.41 - 4.28 (m, 1H), 4.23 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.01 (s, 3H), 3.82 (dd, J = 8.1, 2.4 Hz, 1H), 3.18 (dd, J = 13.5, 3.5 Hz, 1H), 3.01 (dd, J = 13.5, 3.8 Hz, 1H), 2.77 - 2.69 (m, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 162.24, 162.20, 150.05 (dd, J CF = 242.1, 14.4 Hz), 149.37, 144.42 (dd, J CF = 245.5, 13.7 Hz), 142.18, 138.09, 134.73 (dd, J CF = 10.3, 2.7 Hz), 134.03, 133.22 (d, J CF = 9.1 Hz), 116.6, 108.42 (d, J CF = 22.4 Hz), 83.98 (d, J CF = 169.9 Hz), 79.21 (d, J CF = 18.2 Hz), 77.96 (d, J CF = 5.2 Hz), 66.26, 54.78, 36.23, 23.64.
HRMS 계산치 C19H18F3N5O3S [M+H]+ 454.1161; 실측치 454.1149.
특이 광학 회전 [α]D +115.3 (c 0.584, MeOH)
특이 광학 회전 파라미터들:
장치:
편광계: Perkin Elmer, model 341 또는 등가물.
셀: Microglass cell, 100 mm pathlength, 1.0 mL capacity,
Perkin-Elmer Cat. # B001-7047.
밸런스: ± 0.1 mg로 칭량 가능한 캘리브레이션된 분석 밸런스
수조: NESLAB RTE 1121 Chiller 또는 등가물.
부피 측정용 유리 제품: Class A.
석영 스탠다드: ID number 098799, 또는 등가물.
편광계: Perkin Elmer, model 341 또는 등가물.
시약:
메탄올: HPLC 등급, Baker (catalog no. 9093-03) 또는 등가물
장치 파라미터:
램프: Na/Hal, Perkin-Elmer Cat. # B000-8754.
셀: Microcell (100mm), Perkin-Elmer Cat. #B004-1693.
셀 경로: 100 mm (1 데시미터)
모드: OROT
파장: 589 nm
셀 온도: 20℃
노출 시간: 2초
조리개: MICRO
수조 온도: 20 ± 1℃
4-(6)의 4-(7) (3aR*,4S*,6aS*)-6a-(2,3-디플루오로페닐)-4-((트리틸옥시)메틸)헥사하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸에 대한 다른 합성법
Figure pct00039
4-(18): 1-모르폴리노-2-(1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-일옥시)에타논
Figure pct00040
1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-올 (41.6 g, 0.111 mol, 1.0 당량)이 담겨 있는 반응조에 톨루엔 (146 mL)을 첨가하였다. 수득되는 용액을 0-5℃로 냉각하고, 테트라-n-부틸암모늄 수소 설페이트 (7.52 g, 0.0222 mol, 0.20 당량)를 첨가하였다. 여기에 4-(클로로아세틸)모르폴린 (18.1g, 0.111 mol, 1.00 당량)을 0-5℃에서 첨가하였다. 수산화나트륨 (수중 50% wt.; 88.6g, 1.10 mol, 10 당량)을 15℃로 냉각시키고, T < 10℃를 유지하면서 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 T < 15℃에서 1시간 교반하고, 1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-올 (타겟 >99%)의 소비를 모니터링하였다. 반응 혼합물에 2-메톡시-2-메틸프로판 (146 mL)과 물 (146 mL)을 T < 20℃에서 첨가하였다. 유기상을 18% NaCl 수용액 (73 mL)과 NH4Cl 포화 수용액 (21 mL)으로 세척하였다. 유기상을 셀라이트(10.4 g)로 여과하여, 미립자를 제거하고, 2-메톡시-2-메틸프로판 (83 mL)으로 헹구었다. 용매를 T < 30℃에서 진공 증발시켜, 백색 고형물을 수득하였다 (55.0 g, 잔류 용매를 감안하여 수율 98.7%). 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 7.46 - 7.41 (m, 6H), 7.32 - 7.25 (m, 6H), 7.25 - 7.18 (m, 3H), 5.79 - 5.68 (m, 1H), 5.28 (d, J = 17.0 Hz, 1H), 5.26 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 4.20 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 4.10 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 3.97 - 3.88 (m, 1H), 3.69 - 3.47 (m, 8H), 3.25 (dd, J = 9.9, 6.5 Hz, 1H), 3.17 (dd, J = 9.9, 4.3 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm 167.84, 143.84, 134.84, 128.67, 127.78, 127.04, 119.06, 86.73, 81.07, 68.78, 66.78, 66.34, 45.94, 42.16.
4-(19): 1-(2,3-디플루오로페닐)-2-(1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-일옥시)에타논
Figure pct00041
이소프로필마그네슘클로라이드-LiCl 복합체 (THF 중의 1.30 M, 155.0 mL, 0.0715 mol)를 질소 분위기 하에 0-5℃로 냉각시킨 후, T < 10℃ 하에 2,3-디플루오로브로모벤젠 (13.8 g, 0.0715 mol, 1.50 당량)을 첨가하였다. 1시간동안 0-5℃에 둔 후, 1-모르폴리노-2-(1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-일옥시)에타논 (21.8 g, 0.048 mol, 1.0 당량)의 THF (2.0 vols) 용액을 T < 10℃로 유지하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 2.5시간 교반하고, 1-모르폴리노-2-(1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-일옥시)에타논 (타겟 >97%)의 소비를 모니터링하였다. 반응 혼합물에 T < 20℃를 유지하면서 차가운 NH4Cl (110 mL) 포화 수용액과 물 (33 mL)을 첨가함으로써 퀀칭하였다. 여기에 2-메톡시-2-메틸프로판 (218 mL)을 첨가하여, 층 분리하였다. 유기상을 NH4Cl 포화 수용액 (65 mL)과 18% NaCl 수용액 (44 mL)으로 세척하였다. 유기상을 진공 및 T < 25℃에서 농축시켜, 연노란색 오일을 수득하였다 (21.6 g). 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 7.70 - 7.64 (m, 1H), 7.47 - 7.42 (m, 6H), 7.37 - 7.30 (m, 1H), 7.30 - 7.25 (m, 6H), 7.24 - 7.19 (m, 3H), 7.19 - 7.13 (m, 1H), 5.84 - 5.71 (m, 1H), 5.30 (d, J = 17.3 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 4.78 (dd, J = 17.7, 3.1 Hz, 1H), 4.70 (dd, J = 17.7, 3.1 Hz, 1H), 4.03 (dd, J = 11.8, 6.5 Hz, 1H), 3.35 (dd, J = 9.8, 6.4 Hz, 1H), 3.18 (dd, J = 9.8, 4.6 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm 194.15 (dd, J CF = 4.9, 2.4 Hz), 150.77 (dd, J CF = 250.3, 14.1 Hz), 150.29 (dd, J CF = 256.4, 13.9 Hz), 143.98, 135.34, 128.75, 127.76, 126.95, 125.70 (d, J CF = 12.0 Hz), 125.16 (d, J CF = 3.5 Hz), 124.55 (dd, J CF = 6.4, 4.2 Hz), 121.62 (d, J CF = 17.6 Hz), 118.83, 86.78, 81.35, 74.98 (d, J CF = 9.5 Hz), 66.71.
4-(20): 1-(2,3-디플루오로페닐)-2-(1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-일옥시)에타논 옥심
Figure pct00042
1-(2,3-디플루오로페닐)-2-(1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-일옥시)에타논 (21.1 g, 0.0435 mol, 1.0 당량)의 MeOH (106 mL) 용액에 NaOAc (5.36 g, 0.0653 mol, 1.50 당량)를 주위 온도에서 첨가하였다. 5분 후, NH2OH HCl (3.33g, 0.048 mol, 1.10 당량)을 나누어 첨가하였다. 현탁물을 35℃로 가온하여, 1시간 교반하였다. 반응 혼합물을 17.8℃로 냉각시켜 15분간 교반한 다음, 여과하고 EtOAc (84 mL)로 세척하였다. 여과물을 진공 농축하였다 (T < 30℃). 수득되는 잔류물에 2-메톡시-2-메틸프로판 (169 mL)과 물 (21.1 mL)을 투입하였다. 유기상을 NaHCO3 포화 수용액 (53 mL)과 18% NaCl 수용액 (21 mL)으로 헹구었다. 유기상을 진공 농축하여, 표제 화합물을 오일로서 수득하였다 (21.0 g). 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ ppm 7.42 - 7.32 (m, 6H), 7.30 - 7.15 (m, 10H), 7.16 - 7.06 (m, 1H), 7.03 - 6.95 (m, 1H), 5.72 - 5.58 (m, 1H), 5.24 - 5.13 (m, 2H), 4.80 (d, J = 14.6 Hz, 1H), 4.73 (d, J = 14.6 Hz, 1H), 4.45 (d, J = 12.4 Hz, 0.3H), 4.35 (d, J = 12.4 Hz, 0.3H), 3.99 - 3.91 (m, 0.3H), 3.91 - 3.83 (m, 1H), 3.20 (dd, J = 9.9, 6.8 Hz, 0.3H), 3.09 (dd, J = 9.8, 6.6 Hz, 1H), 3.02 (dd, J = 9.9, 4.2 Hz, 0.3H), 2.95 (dd, J = 9.8, 4.0 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ ppm 155.40, 150.59 (dd, J CF = 248.1, 13.0 Hz), 148.86 (dd, J CF = 252.6, 13.5 Hz), 143.96, 135.10, 128.73, 128.69, 127.72, 127.68, 126.92, 126.85, 124.96, 124.56 (d, J CF = 10.6 Hz), 124.03 - 123.86 (m), 118.64 (d, J CF = 15.1 Hz), 117.92 (d, J CF = 17.2 Hz), 86.66, 86.50, 81.30, 80.32, 69.20, 66.54, 66.48, 62.57.
4-(7): (3aR*, 4S*, 6aS*)- 6a-(2,3-디플루오로페닐)-4-((트리틸옥시)메틸)헥사하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸
Figure pct00043
1-(2,3-디플루오로페닐)-2-(1-(트리틸옥시)부트-3-엔-2-일옥시)에타논 옥심 (20.0 g, 0.0400 mol, 1.0 당량)의 톨루엔 (140 mL) 용액에 하이드로퀴논 (0.0882 g, 0.008 mol, 0.2 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 가열 (110-115℃)하여, 13시간 유지하였다. 반응 혼합물을 20-25℃로 냉각시키고, 진공 농축하였다 (T < 45℃). 용매를 2-프로판올 (100 mL)로 체이싱하였다. 조 잔류물에 이소프로판올 (140 mL)을 첨가하고, 이 혼합물을 맑은 용액이 형성될 때까지 65-70℃로 가열하였다. 용액을 10℃/hr의 속도로 0℃로 냉각시킨 후, 1시간 유지시켰다. 수득되는 현탁물을 여과하고, 고형물을 차가운 2-프로판올 (40.0)로 헹구었다. 건조 후, 표제 화합물을 분말로서 수득하였다 (13.2 g). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 7.42 - 7.33 (m, 8H), 7.31 (t, J = 7.6 Hz, 6H), 7.28 - 7.21 (m, 3H), 7.20 - 7.12 (m, 1H), 6.39 (s, 1H), 4.13 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.03 (s, 1H), 3.97 (s, 1H), 3.89 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 3.81 - 3.70 (m, 1H), 3.36 - 3.29 (m, 1H), 3.26 (dd, J = 10.1, 6.0 Hz, 1H), 3.15 (dd, J = 10.0, 3.5 Hz, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 150.74 (dd, J CF = 246.4, 14.4 Hz), 148.66 (dd, J CF = 248.3, 13.5 Hz), 144.09, 130.58, 128.67, 128.32, 127.48, 124.75, 124.45, 117.18 (d, J CF = 17.0 Hz), 86.57, 84.91, 78.16, 76.81, 64.82, 56.46.
5-메톡시피라진-2-카르복실산의 합성
Figure pct00044
5-클로로피라진-2-카르복실산(5.0 g, 0.032 mol)을 온도계, 오버헤드 교잔기 및 환류 콘덴서가 장착된 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 여기에 메탄올 (37.5 mL, 0.926 mol)을 투입한 후, 진한 황산 (0.2 mL, 0.004 mol)을 투입하였다. 3구 플라스크를 히팅 멘틀에 장착한 다음, 반응 혼합물을 약 65.0℃ (T 내부온도)로 가열하였다. 반응 혼합물을 약 4시간 동안 약 65.0℃ (T 내부온도)에서 계속 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 약 25.8℃ (T 내부온도)로 냉각하였다. 여기에 메탄올 (12 mL, 0.31 mol; EMD; Lot 50197)을 첨가하고, 이 슬러리를 약 15분간 약 22.3℃ (T 내부온도)에서 계속 교반한 다음, 질소 분위기 하에 약 10.0℃ (T 내부온도)로 냉각하였다. 플라스크에 메탄올 중의 25% 소듐 메톡사이드 (1:3, 소듐 메톡사이드:메탄올, 7.7 mL)를 투입하면서, 온도를 30.0℃ (T 내부온도) 이하로 유지하였다. 반응 혼합물을 20.4℃ (T 내부온도)로 조정하였다. 30분 후, 수산화나트륨 (2.0 g, 0.04 mol)과 물 (37.5 mL, 2.08 mol)을 조합하여 용액을 제조한 다음, 용액을 반응 혼합물에 투입하였다. 물 (50.0 mL, 2.78 mol)을 투입하고, 반응 혼합물을 약 60분간 40.0℃ (T 내부온도)로 가열하였다. 히팅 멘틀을 제거하고, 반응 혼합물을 약 25.4℃ (T 내부온도)로 냉각시켰다. 38% HCl 수용액 (38:62, 수소 클로라이드:물, 4.0 mL)을, 온도가 30.0℃ (T 내부온도) 이하로 유지되는 속도 (약 5분)로 투입하였다. 끈적한 슬러리를 1시간 동안 약 21.4℃ (T 내부온도)에서 교반한 다음, 소결 깔때기를 통해 여과하였다. 고형물을 물 (10.0 mL, 0.555 mol)로 헹군 다음 밤새 진공 건조하여, 5-메톡시피라진-2-카르복실산 (3.59 g)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ ppm 13.24 (1H, br s), 8.79 (1H, d, J = 1.2 Hz), 8.37 (1H, d, J = 1.2 Hz), 3.98 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO) δ ppm 165.36, 161.88, 143.88, 136.82, 135.55, 54.69.
실시예 4. N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-((S)-플루오로메틸)-4a,5-디하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일]-4,5-디플루오로페닐}-5-메톡시피라진-2-카르바미드의 다른 합성법
Figure pct00045
4-(22) (3aR,4S,6aS)-6a-(2,3-디플루오로페닐)-4-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸 (1-(2)로도 지칭됨)
n-부틸리튬의 헥산 용액(2.76 M, 15 ml)을 톨루엔 (400 ml) 및 THF (40 ml) 중의 2-브로모플루오로벤젠 (5.07 ml) 용액에 -78℃ 및 질소 분위기 하에 서서히 첨가하였다. 수득되는 혼합물을 30분간 교반한 다음, 보론 트리플루오라이드 디에틸 에테르 복합체 (5.2 ml)와 THF (60 ml) 중의 (3aR,4S)-4-트리틸oxy메틸-3a,4-디하이드로-3H,6H-퓨로[3,4-c]이속사졸 (7.96 g) 용액을 내부 온도를 -60℃ 이하로 유지하면서 순차적으로 첨가하였다. 첨가 후, 수득되는 혼합물을 2.5시간 동안 동일 온도에서 교반한 다음, 과량의 암모늄 클로라이드 포화 수용액을 첨가하고, 이 혼합물을 RT로 가온하였다. 유기상을 EtOAc로 추출하고, 유기층을 브린으로 세척하였다. 수득되는 유기층을 MgSO4 상에 건조하고, 고형물을 여과 제거하였다. 여과물을 진공 농축하고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (농도구배: 헵탄에서 0% -> 40% EtOAc). 수득되는 조 화합물을 헵탄에 현탁하고, 고형물을 여과에 의해 수집하였다. 고형물은 진공 건조하여, 표제 화합물을 백색 고형물로 수득하였다 (7.76 g). 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 3.25-3.31 (m, 2H), 3.47 (bs, 1H), 3.87-4.22 (m, 4H), 5.34 (bs, 1H), 7.04-7.13 (m, 2H), 7.22-7.31 (m, 9H), 7.42-7.44 (m, 7H)
4-(23) ((2S,3R,4S)-4-아미노-4-(2,3-디플루오로페닐)-2-트리틸옥시메틸테트라하이드로푸란-3-일)메탄올 (1-(3)로도 지칭됨)
제조예 4-(22)에서 수득한 (3aR,4S,6aS)-6a-(2,3-디플루오로페닐)-4-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로퓨로[3,4-c]이속사졸 (7.76 g)의 아세트산 (75 ml) 현탁물에, RT에서, 아연 분말 (10.1 g)을 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 11.5시간 교반한 다음, 고형물을 셀라이트를 통해 여과 제거하였다. 여과물을 진공 농축하고, 잔류물을 EtOAc에 용해하였다. 28% 암모니아 수용액을 천천히 첨가하고, 유기층을 분리하여 염수로 세척한 다음 MgSO4 상에 건조하였다. 고형물을 여과 제거하고, 여과물을 감압하 농축하였다. 아연 분말 (10.1 g)을 아세트산 (75 ml)에 용해한 잔류물의 현탁물에 RT에서 첨가하였다. 혼합물을 동일 온도에서 11.5시간 동안 교반한 다음, 고형물을 셀라이트를 통해 여과 제거하였다. 여과물을 진공 농축하고, 잔류물을 EtOAc에 용해하였다. 28% 암모니아 수용액을 천천히 첨가하고, 유기층을 분리하여 브린으로 세척한 다음 MgSO4 상에 건조하였다. 고형물을 여과 제거하고, 여과물을 감압하 농축하였다. 조 혼합물을 아미노실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (농도구배: 헵탄에서 50% -> 100% EtOAc), 표제 화합물을 백색 고형물로서 수득하였다 (7.04g). 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 2.60-2.64 (m, 1H), 3.27 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.61-3.65 (m, 1H), 3.89-3.94 (m, 2H), 4.30 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.33-4.37 (m, 1H), 7.04-7.16 (m, 2H), 7.20-7.30 (m, 10H), 7.40-7.43 (m, 6H)
4-(24) N-(((3S,4R,5S)-3-(2,3-디플루오로페닐)-4-(하이드록시메틸)-5-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)카르바모티오일)벤즈아미드 (1-(4)로도 지칭됨)
제조예 4-(23)에서 수득한 [(2S,3R,4S)-4-아미노-4-(2,3-디플루오로페닐)-2-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일]메탄올 (7.04 g)의 DCM (26 ml) 용액에 벤조일 이소티오시아네이트 (2.1 ml)를 0℃에서 첨가하였다. 동일 온도에서 10시간 50분 동안 교반한 후, 혼합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 직접 정제하여 (농도구배: 헵탄에서 20% -> 50% EtOAc), 표제 화합물을 옅은 노란색 고형물로 수득하였다 (9.47 g).
4-(25) N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-((트리틸옥시)메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (1-(5) 및 4-(11)로도 지칭됨)
제조예 4-(24)에서 수득한 N-(((3S,4R,5S)-3-(2,3-디플루오로페닐)-4-(하이드록시메틸)-5-((트리틸옥시)메틸)테트라하이드로푸란-3-일)카르바모티오일)벤즈아미드 (9.47 g)의 피리딘 (35 ml) 용액에, 0℃, 질소 분위기에서, 트리플루오로메탄설폰 무수물 (3 ml)을 첨가하였다. 동일 온도에서 1시간 40분 동안 교반한 후, 혼합물을 중탄산나트륨 포화 수용액에 붓고, EtOAc를 첨가하였다. 유기층을 분리하여, 물과 브린으로 세척한 다음 MgSO4 상에 건조하였다. 고형물을 여과 제거하고, 여과물을 진공 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다 (농도구배: 헵탄에서 30% -> 70% EtOAc). 수득되는 조 화합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 다시 정제하여 (농도구배: 헵탄에서 10% -> 35% EtOAc), 표제 화합물을 옅은 노란색 고형물로서 수득하였다 (8.34 g). 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 2.68 (dd, J = 13.6, 3.2 Hz, 1H), 3.11-3.14 (m, 1H), 3.32-3.36 (m, 2H), 3.42-3.46 (m, 1H), 4.04 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.54-4.60 (m, 2H), 7.13-7.33 (m, 11H), 7.37-7.53 (m, 10H), 8.11-8.13 (m, 2H)
4-(26) N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(하이드록시메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (1-(6) 및 4-(12)로도 지칭됨)
제조예 4-(25)에서 수득한 N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-((트리틸옥시)메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (8.79 g)의 에테르 (35 ml) 용액에, RT에서 포름산 (35 ml)을 첨가하였다. 이를 RT에서 15.25시간 교반한 후, 혼합물을 오리지날 부피의 대략 절반으로 진공 농축하였다. 잔류물에 포름산 (15 ml)을 RT에서 첨가하였다. RT에서 4시간 교반한 후, 혼합물을 진공 농축하였다. 잔류물에 메탄올 (450 ml)과 TEA (9 ml)를 첨가하고, 혼합물을 1시간 환류 교반하였다. 추가로 TEA (9 ml)를 첨가하고, 혼합물을 3시간 환류 교반하였다. 수득되는 혼합물을 진공 농축하고, 암모늄 클로라이드 포화 수용액을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 추출하고, 암모늄 클로라이드 포화 수용액과 브린으로 세척하였다. 수득되는 유기층을 MgSO4 상에 건조하고, 고형물을 여과 제거하였다. 여과물을 진공 농축하고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (농도구배: 헵탄에서 50% -> 100% EtOAc), 표적 화합물을 옅은 노란색 고형물로 수득하였다 (5.5 g). 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 2.80-2.84 (m, 1H), 3.20-3.24 (m, 1H), 3.35-3.38 (m, 1H), 3.73-3.77 (m, 1H), 3.94-3.97 (m, 1H), 4.05-4.08 (m, 1H), 4.51-4.56 (m, 2H), 7.12-7.24 (m, 3H), 7.43-7.47 (m, 2H), 7.51-7.55 (m, 1H), 8.10-8.12 (m, 2H)
4-(27) N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (4-(13)으로도 지칭됨)
TEA (14.9 ml), 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드 복합체 (5.83 ml), 및 퍼플루오로부탄설포닐 플루오라이드 (6.17 ml)를, 제조예 4-(26)에서 수득한 N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(하이드록시메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (3.83 g)의 THF (60 ml) 용액에, 0℃에서 순차적으로 첨가하였다. 동일 온도에서 2시간 교반한 후, 혼합물을 RT로 가온한 다음 RT에서 1시간 20분간 교반하였다. 추가로 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드 복합체 (4.37 ml)를 첨가한 다음, 혼합물을 1시간 10분간 RT에서 교반하였다. 또한, TEA (7.49 ml)와 퍼플루오로부탄설포닐 플루오라이드 (3.09 ml)를 첨가하고, 혼합물을 1시간동안 RT에서 교반하였다. 수득되는 혼합물을 중탄산나트륨 포화 수용액에 붓고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 MgSO4 상에 건조하고, 고형물을 여과 제거하였다. 여과물을 진공 농축하고, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (농도구배: 헵탄에서 30% -> 100% EtOAc), 표제 화합물을 백색 고형물로서 수득하였다 (2.11 g). 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 2.83 (dd, J = 13.6, 3.6 Hz, 1H), 3.24 (d, J = 13.6 Hz, 1H) , 3.36 (bs, 1H), 4.03 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.45-4.75 (m, 4H), 7.12-7.24 (m, 3H), 7.46 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.54 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 8.08 (d, J = 4.8 Hz, 2H)
4-(28) (4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (4-(14)로도 지칭됨)
제조예 4-(27)에서 수득한 N-((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)벤즈아미드 (2.114 g)의 MeOH (20 ml) 용액에 DBU (1.47 ml)를 첨가하였다. 혼합물을 환류 가열하고, 4시간 15분간 교반한 다음 RT로 냉각하여, 진공 농축하였다. 잔류물을 아미노 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (농도구배: 헵탄에서 20% -> 80% EtOAc), 표제 화합물을 무색 검으로서 수득하였다. 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 2.78-2.82 (m, 1H), 2.98 (quin, J = 4.0 Hz, 1H) , 3.10-3.14 (m, 1H), 3.87 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 4.46-4.63 (m, 6H), 7.04-7.15 (m, 2H), 7.17-7.21 (m, 1H)
4-(29) tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로-5-니트로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트
제조예 4-(28)에서 수득한 (4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-아민 (1.45 g)의 TFA (12 ml) 및 황산 (917 ㎕) 용액에, 발연 질산 (475 ㎕)을 0℃에서 첨가하고, 혼합물을 동일 온도에서 90분간 교반하였다. 추가로 황산 (917 ㎕)과 발연 질산 (475 ㎕)을 순차적으로 첨가하여, 혼합물을 실온에서 150분간 교반한 다음, 반응 혼합물을 분쇄 얼음과 수산화나트륨 용액 (50%, 8.1 ml)에 붓고, 반응 용기를 클로로포름으로 헹구었다. 혼합물에 > pH 13이 될 때까지 수산화나트륨 용액 (50%)을 첨가한 다음, 클로로포름으로 추출(3회)하였다. 조합한 유기 추출물을 MgSO4 상에 건조하고, 고형물을 여과 제거하였다. 여과물을 진공 농축하였다. 잔류물을 THF (12 ml) 및 TEA (4.58 ml)에 용해하고, Boc2O (1.92 g)를 RT에서 첨가하였다. RT에서 19시간 교반한 후, 수득되는 혼합물을 암모늄 클로라이드 포화 수용액에 붓고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 암모늄 클로라이드 포화 수용액, 물 및 브린으로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 MgSO4 상에 건조하고, 고형물을 여과 제거하였다. 여과물을 진공 농축한 다음, 조 화합물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (농도구배: 헵탄에서 20% -> 50% EtOAc), 표제 화합물을 백색 고형물로서 수득하였다 (1.17 g). 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 1.53 (s, 9H), 2.71-2.76 (m, 1H), 2.96-3.00 (m, 1H), 3.13-3.20 (m, 1H), 3.84 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.47 (dd, J = 8.8, 1.2 Hz, 1H), 4.50-4.72 (m, 3H), 7.29-7.31 (m, 1H), 8.04-8.09 (m, 1H), 8.11-8.14 (m, 1H)
4-(30) tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2,3-디플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트
제조예 2-(29)에서 수득한 tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(2,3-디플루오로-5-니트로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트 (1.17 g)의 에탄올 (20 ml) 현탁물에 주석(II) 클로라이드 이수화물 (2.06 g)을 RT에서 첨가하였다. 혼합물을 동일 온도에서 16시간 교반하였다 (고형물이 점차적으로 용해되어, 반응물이 노란색이 됨). 수득되는 혼합물을 2N 수산화나트륨 용액에 붓고, 유기상을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 물과 브린으로 순차적으로 세척한 다음, MgSO4 상에 건조하였다. 고형물을 여과 제거하고, 여과물을 진공 농축하였다. 조 혼합물을 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 (농도구배: 헵탄에서 20% -> 60% EtOAc), 표제 화합물을 옅은 노란색 고형물로서 수득하였다 (1.09 g). 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 1.51 (s, 9H), 2.69-2.73 (m, 1H), 3.07-3.15 (m, 2H), 3.69 (bs, 2H), 3.84-3.85 (m, 1H), 4.49-4.67 (m, 4H), 6.34-6.36 (m, 1H), 6.44 (ddd, J = 11.2, 6.4, 2.8 Hz, 1H)
4-(31) N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4,5-디플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드 (4-(17)로도 지칭됨)
제조예 4-(30)에서 수득되는 tert-부틸 ((4aS,5S,7aS)-7a-(5-아미노-2,3-디플루오로페닐)-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-2-일)카바메이트 (359 mg)의 DCM (14 ml) 혼합물에, 메톡시피라진-2-카르복실산(159 mg), PyBOP (898 mg) 및 디이소프로필에틸아민 (754 ㎕)을 RT에서 첨가하였다. 혼합물을 동일 온도에서 3시간 교반하였다. 수득되는 혼합물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 직접 정제하였다 (농도구배: 헵탄에서 15% -> 70% EtOAc). 증발 후, TFA (7 ml)를 수득되는 화합물의 DCM (7 ml) 혼합물에 RT에서 첨가하였다. 동일 온도에서 75분간 교반한 후, 수득되는 혼합물을 진공 농축하였다. 클로로포름과 중탄산나트륨 포화 수용액을 잔류물에 첨가하고, 유기상을 클로로포름으로 (3회) 추출하였다. 유기층을 조합하여 MgSO4 상에 건조하고, 고형물을 여과 제거하였다. 조 혼합물을 아미노 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 (농도구배: 헵탄에서 30% -> 100% EtOAc), 표제 화합물을 백색 고형물로서 수득하였다 (320 mg). 1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 2.81 (dd, J = 13.6, 4.0 Hz, 1H), 3.02-3.06 (m, 1H), 3.15 (dd, J = 13.6, 3.6 Hz, 1H), 3.86 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 4.07 (s, 3H), 4.50-4.59 (m, 5H), 4.64-4.65 (m, 1H), 7.18-7.20 (m, 1H), 8.06 (ddd, J = 11.6, 6.8, 2.8 Hz, 1H), 8.16 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 9.01 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 9.52 (bs, 1H)
시험관내 세포 분석 :
랫 태아 뇌 유래의 뉴런 배양에 있어서의 Aβ 펩타이드의 정량
(1) 랫 초대 신경세포 배양
배아 발생 18일된 Wistar 랫 (Charles River, UK)의 대뇌피질로부터 초대 신경세포 배양물을 준비하였다. 구체적으로는, 에테르 마취 하에, 임신 중인 랫으로부터 무균적으로 태아를 적출하였다. 태아의 뇌를 분리하여, 10mM HEPES (Gibco #15630-056)가 포함된 HBSS (Sigma Aldrich #H9269)에 침지하였다. 상기 분리한 뇌로부터, 입체 현미경 하에서 대뇌피질을 채취하였다. 채취한 대뇌피질 단편을, 0.05% 트립신-EDTA 용액 (GIBCO, #25300)이 포함된 효소 용액에서, 37℃에서 20분간 효소적으로 처리하여, 세포를 분산시켰다. 그런 후, 세포를 2회 헹구고, 2% B27 첨가제(GIBCO #17504-044), 0.5 mM L-글루타민(GIBCO #25030), 1x N2 (GIBCO #17502-048), 100ug/ml Pen/Strep (GIBCO 15140-122) 및 5% 열에 의해 불활화된 FCS (PAA #A15-701)가 첨가된 Neurobasal 배지(GIBCO #21103)에 조심스럽게 재현탁하였다. 세포 분산물을 40-㎛ 나일론 메쉬 (BD Falcon #352340)를 통해 여과하여, 남아있는 세포 덩어리를 제거하고, 따라서 신경 세포 현탁물을 수득하였다. 신경 세포 현탁물을 상기 배지로 희석한 다음, 폴리-D-라이신으로 코팅된 96웰 배양 플레이트 (Greiner #655940)에 초기 세포 밀도 3.25 × 105 세포/ml로 100 ㎕/웰 접종하였다. 접종한 세포는, 5% CO2-95% 공기 하, 37℃에서, 24시간, 배양 플레이트에서 배양하였다. 배지 전량을 '분석 Neurobasal 배지' (상기에서 열에 의해 불활화한 FCS만 제외된 배지)로 교체한 다음, 다시 세포를 5일간 더 배양하였다.
(2) 화합물 첨가
배양 6일째에 약물을 하기와 같이 배양 플레이에 첨가하였다. 최종 분석 농도 (FAC)의 x1000 농도로, 8 포인트 화합물 연속 희석물을 DMSO 중에서 제작하였다. 그런 후, DMSO 화합물 스톡 1 ㎕에 (상기에서 기술된) '분석 Neurobasal 배지' 999 ㎕를 첨가하여, 화합물 용액을 제조하였다. 배지의 전량을 세포 플레이트 웰 각각에서 제거하고, '분석 Neurobasal 배지'를 140 ㎕/웰로 첨가한 다음, 화합물 용액 60 ㎕을 첨가하였다. 최종 DMSO 농도는 0.1%이다.
(3) 샘플링
각각 ABx-40 및 ABx-42 분석을 위해 화합물 첨가 후 1 또는 3일간 세포를 배양하였다. 샘플 배지 150 ㎕를 수집하여, ELISA 샘플로 사용하였다.
(4) 세포 생존성 평가
세포 생존성은 아래 절차에 Alamar 분석을 이용하여 평가하였다. ELISA 분석에 사용할 샘플을 수집한 후, 분석 Neurobasal 배지 중의 20% Alamar 블루 용액 (Invitrogen #DAL1100) 50 ㎕를, 각 웰에 남아있는 샘플 50 ㎕에 첨가하였다. 그 후, 세포를 1시간 동안 5% CO2-95% 공기 하, 37℃에서 배양하였다.
각 웰에 대한 형광 강도 측정은 Pherastar plus plate reader (BMG labtech)를 사용하여 540/590 nm에서 행하였다. 측정 시, 세포를 접종하지 않은 웰과 배지 및 Alamar 용액만 들어있는 웰을 백그라운드 (bkg)로 설정하였다.
(5) Aβ ELISA
Aβ ELISA에서는, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 사의, 인간/랫 β 아밀로이드(42) ELISA 키트 와코 (＃290-62601), 및 인간/랫 β 아밀로이드(40) ELISA 키트 와코 (#294-62501)를 사용하였다. Aβ ELISA는 키트에 첨부된 문서에 기술된 제조사가 권장하는 프로토콜에 따라 실시하였다. 결과는, 대조군에 대한 퍼센트로서 나타내었고, 각 화합물의 IC50 값을 XLFIT5 소프트웨어 패키지 (IDBS)를 이용한 4 파라미터 로지스틱 피트 모델로 결정하였다.
본 발명의 화합물은 Aβ42 생산 저하 효과를 가지고 있었다.
본 발명에 따른 일반식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 Aβ42 생산 저하 효과를 가진다. 따라서, 본 발명은 알츠하이머형 치매 또는 다운 증후군과 같이 Aβ에 기인한 신경퇴행성 질환에 대한 예방학적 제제 또는 치료학적 제제를 제공할 수 있다.
상기 시험관내 분석에서 측정된 바와 같이, 실시예 1 내지 14의 화합물들은 표 7의 IC50 값을 나타내었다.
표 7:
실시예 IC50 (μM)
1 0.007
2 0.004
3 0.004
4 0.012

Claims (15)

  1. 식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00046

    상기 식 (I)에서,
    X는 수소 또는 불소이고;
    R은 모노플루오로메틸 또는 디플루오로메틸이다.
  2. 제1항에 있어서, X가 수소인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R이 모노플루오로메틸인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 화합물이 아래 화합물들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염:
    N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4,5-디플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드;
    N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4-플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드;
    N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(디플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4-플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드;
    4-(17) : N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4,5-디플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드;
    또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  5. 제1항에 있어서, N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4-플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  6. 제1항에 있어서, N-(3-((4aS,5S,7aS)-2-아미노-5-(플루오로메틸)-4a,5,7,7a-테트라하이드로-4H-퓨로[3,4-d][1,3]티아진-7a-일)-4,5-디플루오로페닐)-5-메톡시피라진-2-카르복스아미드인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 치료 요법에 사용하기 위한 것인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 아밀로이드-β 단백질의 생산을 저해하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 베타-사이트 아밀로이드-β 전구체 단백질 절단 효소 1 (BACE1)을 저해하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 알츠하이머형 치매 (AD), 다운 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA), 가벼운 인지 장애 (MCI), 기억상실, 초로성 치매, 노인성 치매, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈, 및 혼성 혈관 및 퇴행성 기원의 치매, 핵상 마비성 치매, 피질 기저 퇴행성 치매, 파킨슨 질환 (PD)성 치매 및 AD의 미만성 루이소체 타입의 치매를 비롯한 기타 퇴행성 치매와 같은 신경퇴행성 질환을 치료하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  11. 알츠하이머형 치매 (AD), 다운 증후군, 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA), 가벼운 인지 장애 (MCI), 기억상실, 초로성 치매, 노인성 치매, 아밀로이드증성 유전성 뇌출혈, 및 혼성 혈관 및 퇴행성 기원의 치매, 핵상 마비성 치매, 피질 기저 퇴행성 치매, 파킨슨 질환 (PD)성 치매 및 AD의 미만성 루이소체 타입의 치매를 비롯한 기타 퇴행성 치매와 같은 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방용 약제를 제조하기 위한,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 2형 당뇨병을 치료하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염.
  13. 2형 당뇨병의 치료 또는 예방용 약제를 제조하기 위한,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도.
  14. 활성 성분으로서 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과, 약제학적으로 허용가능한 담체를 조합하여 포함하는, 약학 조성물.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 제1 활성 성분과,
    신경퇴행성 질환의 치료에 사용가능한 하나 이상의 추가적인 활성 성분을 조합하여 포함하는, 약제학적 제품.
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