KR20130118966A - 항체 및 이들의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 키메라 사람 항체, 제조합 항체, 합성 항체를 포함하는 항체, 및 이들을 엔코딩하는 핵산, 및 이러한 면역글로불린을 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 이러한 폴리펩티드 및/또는 항체의 재조합 및 합성 폴리펩티드와 핵산 구체예를 제공한다. 본 발명은 또한 컨센서스 사람 프레임워크 영역, 또는 "ICF(Independently Consensused Frameworks)"를 포함하거나, 이로 구성된 폴리펩티드, 이들을 엔코딩하는 핵산, 및, 개별적으로 또는 조합 라이브러리와 조합물로, 본 발명의 이러한 ICF 및/또는 항체를 포함하는 라이브러리와 키트를 제공한다.

Description

항체 및 이들의 제조 및 사용 방법{ANTIBODIES AND METHODS FOR MAKING AND USING THEM}
관련 출원
본원은 35 U.S.C. §119(e)에 의거하여, 2006년 12월 20일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호(USSN) 제60/871,069호에 대한 우선권을 주장한다. 앞서 언급된 출원은 이의 전체로서 또한 모든 목적을 위해 본 명세서에 의도적으로 통합된다.
EFS - WEB 을 통해 제출된 서열 목록에 대한 설명
본원은 MPEP §1730 II.B.2.(a)(A)에서 권한이 부여되고 설정된, USPTO EFS-WEB 서버를 통해 전자적으로 제출되었으며, 이 전자 파일은 전자적으로 제출된 서열목록(SEQ ID)을 포함한다; 이 서열 목록의 전체 내용은 모든 목적을 위한 참고문헌으로서 본 명세서에 통합된다. 이 서열 목록은 아래의 전자적으로 제출된 .txt 파일에서 확인된다:
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 유전 공학, 분자 면역학 및 의약과 관련이 있다. 일 양상에서, 본 발명은 항체, 예컨대, 키메라 사람 항체(사람 성분을 지니는 키메라 항체), 이들을 엔코딩하는 핵산, 및 이들 면역글로불린을 제조하는 방법과 이를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 재조합 및 합성 폴리펩티드 및 이들 폴리펩티드의 핵산 구체예를 제공한다. 본 발명은 또한 컨센서스 사람 프레임워크 영역, 또는 "ICF(Independently Consensused Framwork regions)"을 포함하거나, 이로 구성된 폴리펩티드, 이들을 엔코딩하는 핵산, 및 본 발명의 이들 ICF 및/또는 항체를, 개별적으로, 그리고 조합 라이브러리와 조합물(combinations)로, 포함하는 라이브러리와 키트를 제공한다.
배경
항체(또는 면역글로불린(Igs))는 체내에 외래 물질의 존재에 반응하여 면역 시스템에 의해 생산된 단백질이다. 면역글로불린은 또한 이 면역 시스템의 다른 기능들을 발휘하고 매개한다. 면역글로불린을 엔코딩하는 핵산 서열은 처음에 게놈(생식선(germline))내 몇몇 유전자들로부터 유래되는데, 이들은 후속하여 재배열되고 성숙이 진행되는 동안 돌연변이되어 이들의 최종, 성숙 형태로 면역글로불린의 다양성을 더 증가시킨다. 전형적인 면역글로불린인 IgG는 하기 4개의 쇄로 형성된 Y-형 구조를 갖는다: 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄, 각각은 가변 영역과 불변 영역을 지님. 가변 영역은 프레임워크(framework, FR) 및 상보성 결정 영역(complementarity-determining regions, CDRs)과 같은 다양한 하위영역(subregions)으로 더 세분될 수 있다.
면역글로불린은 다양한 질환 및 질병(conditions), 예를 들어, 알러지, 이식 거부, 암, 및 이식편대숙주 질환(host-versus-graft disease)을 치료하는데 사용되어 왔다. 그러나, 치료 항체 제조물을 사람 환자에게 투여할 때, 이 항체는 때때로 항체 그 자체에 대한 환자에 의한 비바람직하며 잠재적으로 해로운 면역 반응("면역원성")을 자극시키는데, 특히 반복된 투여후에 그러하다. 면역원성은 항체가 사람이 아닌 공급원, 예컨대, 동물에서 유래된 경우, 특별한 문제점으로 곤란을 야기시킬 수 있다. 항체가, 치료 모델로 흔히 사용되는, 마우스에서 유래되는 경우, 환자가 사람 항-뮤린 항체(HAMA) 반응을 발달시킬 수 있다. HAMA과 같은 요망되지 않는 면역원성을 감소시키기 위해, 동물 항체의 특정 영역이 사람 항체의 상응하는 영역으로 대체될 수 있는데, 이러한 항체는, 본질적으로, "사람화된" 항체이다. 변형된 항체, 예컨대, "키메라" 항체 및 CDR-이식 항체가 면역원성 반응을 감소시키기 위해 개발되었다. 그러나, 그러한 대체 전략은 충분히 면역원성을 최소화할 수 없고 면역글로불린의 치료 효능을 감소시킬 수 있다. 따라서, 치료 효능을 유지하거나 심지어 개선시키면서 면역원성을 감소시키거나 제거시키는 변형된 면역글로불린에 대한 요구가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 한 종(species)에서 유래된 프레임워크 및 또 다른 종에서 유래된 항원에 대한 결합에 관여하는 서열을 지니는 항체를 제공한다. 대안적인 양상에서, 이들 항체는 분리되거나, 재조합되거나 합성된 형태이다. 대안적인 구체예에서, 본 발명의 항체의 프레임워크 분절(segments)(또는 "프레임워크 영역", 또는 FR)의 하나 이상, 수개, 또는 모두가 생식선 서열에서 유래된 핵산 서열에 의해 엔코딩된다; 일 양상에서, 프레임워크 분절의 하나 이상, 수개, 또는 모두는, 본 명세서에 기재된, "컨센서스 서열"이다. 일 양상에서, 항체 프레임워크 분절은 본 발명의 항체가, 예를 들어, 생체내 면역치료 또는 면역진단 시약으로 투여되는, 동물, 예를 들어, 사람에서 유래된다. "상보성 결정 영역"(또는 CDRs)으로 지칭되는, 항원에 대한 결합에 관여하는 항체 서열 단편은 요망되는 항원 특이적 항체를 생성시키는데 사용되는 사람이 아닌 동물에서 유래된다; 대안적인 양상에서, 항원은 이 동물에게 인공적으로 투여될 수 있거나, 항원은 자연적이거나 우연적인 환경 노출, 예컨대, 독소 또는 독(poison) 노출의 결과이거나, 항원의 의도적인 투여에 의한 결과일 수 있다. 대안적인 구체예에서, FR은 사람 게놈 폴리뉴클레오티드에서 유래된 "컨센서스 서열"에 의해 엔코딩되며, CDR은 마우스와 같은, 뮤린 공급원에서 유래된다.
본 발명은 치료되어야 하는 환자 본래의(native) 항체와 특성에서 더 유사한, 예를 들어, 본 발명의 재조합 인간화 항체를 포함하는, 본 발명의 항체를 디자인하고 제공하기 위한 ("사람 프레임워크 재조립(Human Framework Reassembly)" 또는 HuFR) 방법을 제공한다. 이 방법은 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 가변 영역의 프레임워크 하위영역(예컨대, FR1, FR2, FR3, 및 FR4)에 대한 컨센서스 서열을 도출하는(deducing) 단계를 수반할 수 있는데, 여기서 각각의 하위영역에 관한 상기 컨센서스 서열은 다른 프레임워크 하위영역 중에서 획득되고 독립적으로 선택된다. 따라서, 핵산 또는 폴리펩티드의 다양한 콜렉션은 각각의 프레임워크 하위영역에 대하여 독립적으로 선택된 컨센서스 서열의 조합 라이브러리로부터 생성될 수 있고, 본 발명의 제조합 인간화 항체를 포함하는, 재조합 항체를 제조하기 위해 후속하여 사용될 수 있다. 이들 컨센서스 서열은 특정 개체, 예컨대, 사람, 사람이 아닌 영장류, 개, 고양이, 및 말의 성숙한 면역글로불린의 서열 또는 생식선 서열에서 유래될 수 있고, 따라서, 그러한 특정 개체, 동물 및/또는 사람에서 감소된 면역원성을 갖는 항체가 생성된다.
본 발명은 재조합 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 폴리펩티드, 및 이들을 엔코딩하는 핵산을 제공하는데, 여기서 상기 가변 영역은 적어도 하기 3가지 "ICF(Independently Consensused Framwork)" 도메인을 포함할 수 있다: ICF1, ICF2, 및 ICF3. 이 재조합 가변 영역 폴리펩티드는 ICF(Independently Consensused Framwork) 4 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
일 구체예에서, ICF 도메인 각각은, 생식선 핵산 서열에서 번역된, 복수의 아미노산 서열에서 결정된 아미노산 컨센서스 서열을 포함하는데, 상기 핵산 서열 각각은 상응하는 Kabat 프레임워크 영역(KF) 도메인, 예컨대, KF1, KF2, 또는 KF3의 적어도 일부분을 엔코딩한다. 일 구체예에서, 상기 ICF 도메인 각각은 성숙 KF 도메인 아미노산 서열에서 결정된 아미노산 컨센서스 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 예컨대, 컨센서스 서열을 획득하기 위한 방법("컨센서싱")은 하기 단계를 포함한다: 조사(inspection)에 의해 또는 당업계의 서열 정렬 프로그램을 사용하여 한 Kabat 프레임워크 하위영역(예컨대, KF1, KF2, KF3, 또는 KF4)의 적어도 일부분을 엔코딩하는 아미노산 또는 핵산 서열 세트를 정렬시키는 단계; 잔기(예컨대, 뉴클레오티드 또는 아미노산)가 상기 특이 하위영역에 관한 각각의 위치에서 나타나는 빈도를 결정하는 단계; 및 상기 하위영역에 관한 컨센서스 서열의 세트로 높은 빈도의 잔기를 합성하고, 그에 따라 ICF1, ICF2, ICF3, 또는 ICF4 컨센서스 서열을 생성시키는 단계. 대표적인 ICF는 중쇄 ICF(표 1과 2 참조) 및 경쇄 ICF(표 3과 4 참조)에 관해 제공되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 Ig 폴리펩티드, 예컨대, 전장 길이 항체, 단일 쇄 항체, 2가 항체, Fab 단편, 또는 단일 쇄 Fv를 제공한다. ICF1, 2, 및 3 도메인은 제 1 동물종에서 유래될 수 있고, 상기 CDR1, 2, 및 3 도메인은 제 2 동물종에서 유래될 수 있다. 대표적인 항체는 항원, 예컨대, CD20 또는 CD3에 결합하는 그러한 항체가 제공된다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드와 핵산 및 이들의 조합 라이브러리를 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드의 조합 라이브러리는 상이한 ICF1, ICF2, 및 ICF3를 상이한 조합으로 결합시킬 수 있다. 중쇄 및 경쇄 라이브러리의 개별 구성원들 쌍의 추가 연결(association)은 30,000개를 초과하는 항체의 라이브러리를 산출할 수 있다. 이 조합 라이브러리는 요망되는 특성, 예컨대, 요망되는 항원에 대한 결합 또는 감소된 면역원성에 관해 스크리닝될 수 있다.
본 발명은 하기 조합을 지니는 하나 이상의 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
(1) 경쇄 BD22084(서열번호 225) 및 중쇄 BD20332(서열번호 138);
(2) 경쇄 BD22085(서열번호 232) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(3) 경쇄 BD22086(서열번호 227) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(4) 경쇄 BD22088(서열번호 229) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(5) 경쇄 BD22087(서열번호 240) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(6) 경쇄 BD22089(서열번호 243) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(7) 경쇄 BD22090(서열번호 234) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(8) 경쇄 BD22095(서열번호 244) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(9) 경쇄 BD22091(서열번호 242) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(10) 경쇄 BD22108(서열번호 230) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(11) 경쇄 BD22092(서열번호 235) 및 중쇄 BD20338(서열번호 149);
(12) 경쇄 BD22094(서열번호 231) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(13) 경쇄 BD22096(서열번호 241) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(14) 경쇄 BD22092(서열번호 235) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(15) 경쇄 BD22102(서열번호 248) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(16) 경쇄 BD22097(서열번호 246) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(17) 경쇄 BD22104(서열번호 239) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(18) 경쇄 BD22085(서열번호 232) 및 중쇄 BD20339(서열번호 150);
(19) 경쇄 BD22107(서열번호 226) 및 중쇄 BD20339(서열번호 150);
(20) 경쇄 BD22100(서열번호 236) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(21) 경쇄 BD22103(서열번호 228) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(22) 경쇄 BD22105(서열번호 237) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(23) 경쇄 BD22101(서열번호 247) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(24) 경쇄 BD22106(서열번호 245) 및 중쇄 BD20333(서열번호 142);
(25) 경쇄 BD22108(서열번호 230) 및 중쇄 BD20338(서열번호 149);
(26) 경쇄 BD22109(서열번호 233) 및 중쇄 BD20341(서열번호 154); 또는
(27) 경쇄 BD22111(서열번호 238) 및 중쇄 BD20336(서열번호 144).
본 발명은, 중쇄 가변 영역의 적어도 일부분 및 경쇄 가변 영역의 적어도 일부분을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 상기 경쇄 부분 및 상기 중쇄 부분이 하기 조합들 중 하나 이상의 조합 중의 각각의 경쇄 및 중쇄에 대하여 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 서열 동일성이 있거나 완전한 서열 동일성이 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
(1) 경쇄 BD22084(서열번호 225) 및 중쇄 BD20332(서열번호 138);
(2) 경쇄 BD22085(서열번호 232) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(3) 경쇄 BD22086(서열번호 227) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(4) 경쇄 BD22088(서열번호 229) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(5) 경쇄 BD22087(서열번호 240) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(6) 경쇄 BD22089(서열번호 243) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(7) 경쇄 BD22090(서열번호 234) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(8) 경쇄 BD22095(서열번호 244) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(9) 경쇄 BD22091(서열번호 242) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(10) 경쇄 BD22108(서열번호 230) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(11) 경쇄 BD22092(서열번호 235) 및 중쇄 BD20338(서열번호 149);
(12) 경쇄 BD22094(서열번호 231) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(13) 경쇄 BD22096(서열번호 241) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(14) 경쇄 BD22092(서열번호 235) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(15) 경쇄 BD22102(서열번호 248) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(16) 경쇄 BD22097(서열번호 246) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143).
(17) 경쇄 BD22104(서열번호 239) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(18) 경쇄 BD22085(서열번호 232) 및 중쇄 BD20339(서열번호 150);
(19) 경쇄 BD22107(서열번호 226) 및 중쇄 BD20339(서열번호 150);
(20) 경쇄 BD22100(서열번호 236) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(21) 경쇄 BD22103(서열번호 228) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(22) 경쇄 BD22105(서열번호 237) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
(23) 경쇄 BD22101(서열번호 247) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
(24) 경쇄 BD22106(서열번호 245) 및 중쇄 BD20333(서열번호 142);
(25) 경쇄 BD22108(서열번호 230) 및 중쇄 BD20338(서열번호 149);
(26) 경쇄 BD22109(서열번호 233) 및 중쇄 BD20341(서열번호 154); 또는
(27) 경쇄 BD22111(서열번호 238) 및 중쇄 BD20336(서열번호 144),
여기서 상기 경쇄의 적어도 일부분, 상기 중쇄의 적어도 일부분, 또는 상기 둘 모두는 하기 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조된 서열에서 적어도 부분적으로 유래된다:
(1) 각각이 Kabat 프레임워크 영역 1(KF1) 도메인의 적어도 일부분에서 유래된 아미노산을 포함하는 복수의 아미노산 서열에서 유래된 아미노산 컨센서스 서열을 포함하는, ICF1(Independently Consensused Framework 1) 도메인을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 복수의 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 영역 유전자의 생식선 서열로부터 번역되거나 성숙 면역글로불린으로부터 획득되는, 단계;
(2) 1F5 항체의 가변 영역에서 유래된 상보성 결정 영역 1(CDR1)의 적어도 일부분을 제공하는 단계;
(3) 각각이 Kabat 프레임워크 영역 2(KF2) 도메인의 적어도 일부분에서 유래된 아미노산을 포함하는 복수의 아미노산 서열에서 유래된 아미노산 컨센서스 서열을 포함하는, ICF2(Independently Consensused Framework 2) 도메인을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 복수의 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 영역 유전자의 생식선 서열로부터 번역되거나 성숙 면역글로불린으로부터 획득되는, 단계;
(4) 1F5 항체의 가변 영역에서 유래된 상보성 결정 영역 2(CDR2)의 적어도 일부분을 제공하는 단계;
(5) 각각이 Kabat 프레임워크 영역 3(KF3) 도메인의 적어도 일부분에서 유래된 아미노산을 포함하는 복수의 아미노산 서열에서 유래된 아미노산 컨센서스 서열을 포함하는, ICF3(Independently Consensused Framework 3) 도메인을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 복수의 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 영역 유전자의 생식선 서열로부터 번역되거나 성숙 면역글로불린으로부터 획득되는, 단계;
(6) 1F5 항체의 가변 영역에서 유래된 상보성 결정 영역 3(CDR3)의 적어도 일부분을 제공하는 단계; 및
(7) 선택적으로 각각이 Kabat 프레임워크 영역 4(KF4) 도메인의 적어도 일부분에서 유래된 아미노산을 포함하는 복수의 아미노산 서열에서 유래된 아미노산 컨센서스 서열을 포함하는, ICF4(Independently Consensused Framework 4) 도메인을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 복수의 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 영역 유전자의 생식선 서열로부터 번역되거나 성숙 면역글로불린으로부터 획득되는, 단계;
(8) 5' 에서 3' 방향으로, ICF1-CDR1-ICF2-CDR2-ICF3-CDR3 및 선택적으로 ICF4 도메인을 엔코딩하는 핵산을 연결시키는 단계[여기서 하나 이상의 상기 ICF는 게놈 핵산 서열에서 유래됨].
본 발명은 본 발명의 항원 결합 항체 단편을 제공하는데, 여기서 상기 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 단일-쇄 항체, Fv 단편, scFv 단편, 항체 모방체(mimetic), Fd 단편, 또는 Fd' 단편이거나; 달리, 본 발명의 항원 결합 항체 단편은 Fc에 융합된 항체 단편이거나, 이를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 가변 영역 조합을 포함하는 구조를 갖는 재조합, 합성 또는 분리 항체를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 가변 영역 조합을 포함하는 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 키메라 항원 결합 항체 단편을 제공하는데, 여기서 상기 키메라 항체 단편은 키메라 Fab, 키메라 Fab', 키메라 F(ab')2, 키메라 단일-쇄 항체, 키메라 Fv, 키메라 scFv, 항체 모방체, 키메라 Fd, 또는 키메라 Fd'이다.
본 발명은 CD20 항원에 특이적으로 결합하고 하기한 것들을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다: (a) 서열번호 43-49의 아미노산 서열을 포함하는 ICF1; (b) 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (c) 서열번호 58-61의 아미노산 서열을 포함하는 ICF2; (d) 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; (e) 서열번호 67-71, 73, 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 ICF3; (f) 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는 (g) 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 ICF4.
본 발명은 CD20 항원에 특이적으로 결합하고 하기한 것들을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다: (a) 서열번호 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 ICF1; (b) 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (c) 서열번호 9, 10, 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 ICF2; (d) 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; (e) 서열번호 13, 17, 19, 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 ICF3; (f) 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는 (g) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 ICF4.
본 발명은 (a) 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 약제학적 조성물 또는 제형을 제공하며; 일 양상에서, 상기 약제학적 조성물 또는 제형은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 질환, 감염, 질병(condition) 또는 독 노출(toxic exposure)을 치료 또는 개선하기 위한 방법을 제공한다: (a) 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및 (b) 충분한 양의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이의 투여가 요망되는 개체에게 투여하는 단계.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 면역 반응을 억제 또는 폐기(abrogation)시키는 방법을 제공한다: (a) 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 단계; 및 (b) 충분한 양의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이의 투여가 요망되는 개체에게 투여하는 단계.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 B-세포 매개 면역 반응을 억제 또는 폐기시키는 방법을 제공한다: (a) 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 단계; 및 (b) 충분한 양의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이의 투여가 요망되는 개체에게 투여하는 단계.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는 B-세포 림프종을 치료하는 방법을 제공한다: (a) 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 단계; 및 (b) 충분한 양의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이의 투여가 요망되는 개체(예를 들어, 사람)에게 투여하는 단계.
본 발명은 B-세포 매개 질환 또는 조건을 지니는 피검체(예를 들어, 사람)에게 유효량의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 의해, 상기 B-세포 매개 질환 또는 조건을 지니는 피검체(예를 들어, 사람)를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공하며, 일 양상에서, 상기 질환은 B-세포 림프종이다.
본 발명의 하나 이상의 양상의 세부내용은 하기 첨부된 도면 및 상세한 설명에 설명되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 상세한 설명과 도면, 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다.
본 명세서에 인용된, 모든 간행물, 특허, 특허 출원, GenBank 서열 및 ATCC 기탁체(deposits)는 모든 목적을 위해 참고문헌으로써 의도적으로 여기에 통합된다.
도 1은 사람 프레임워크 재조립을 설명하는, 대표적인 중쇄 또는 경쇄(아미노산 서열 또는 이들을 엔코딩하는 핵산)의 구성성분들에 대한 개략도이다. 출발 뮤린 쇄가 도시되어 있으며, 3개의 CDR(밑줄)에 대한 서열들이 상기 쇄로부터 획득된다. 다양한 ICF(Independently Consensused Framework Domains)가 FR1, FR2, FR3, 및 선택적으로 FR4에 상응하는 각각의 위치들에 대해 제공된다. 바람직한 ICF가 각각의 위치에 대해 독립적으로 선택되고 뮤린 CDR, 선택적으로 불변 도메인(이중-밑줄)과 조립되어 재조합 HuFR 면역글로불린 쇄가 수득된다.
도 2는 사람 생식선 카파 경쇄 가변 영역에 대한 유전자에서 유래된 대표적인 아미노산 서열을 보여준다.
도 3은 사람 생식선 람다 경쇄 가변 영역에 대한 유전자에서 유래된 대표적인 아미노산 서열을 보여준다.
도 4는 하기, 실시예 3에 상세하게 논의된, 항-CD20 세포 ELISA에서 항-CD20 HuFR 클론의 특이 활성을 입증하는 항-CD20 ELISA 검정으로부터의 데이터에 관한 그래프를 도시한다.
도 5는 하기, 실시예 3에 상세하게 논의된, 항-CD20 세포 ELISA에서 탑(top) 항-CD20 HuFR 클론의 특이 활성을 비교하는 데이터에 관한 막대 그래프를 도시한다.
도 6은 하기, 실시예 3에 상세하게 논의된, 몇몇 탑 HuFR 히트(hits)가 대조 항체 및 DVSA-CD20과 동등하거나 이 보다 나은 활성을 지님을 입증하는, 아폽토시스 검정에 관한 막대 그래프를 도시한다.
도 7은 하기, 실시예 3에 상세하게 논의된, HuFR 항-CD20 히트가 시험관내에서 사람 PBMC에서 세포 증식을 유도하지 아니함을 보여주는 세포 주기 검정에 관한 도면이다.
도 8은 하기, 실시예 3에 상세하게 논의된, CDC 검정에 관한 막대 그래프이다.
도 9는 하기, 실시예 3에 상세하게 논의된, ADCC 검정에 관한 막대 그래프이다.
도 10은 하기, 실시예 4에 상세하게 논의된, DVSA-CD3의 경쇄(위) 및 중쇄(아래) 핵산 서열을 도시한다.
도 11은 하기, 실시예 4에 상세하게 논의된, DVSA-CD3의 경쇄(아래)뿐 아니라 DVSA-CD3의 중쇄(위) 및 경쇄(중간) 아미노산 서열을 도시한다.
도 12는 상위(top) 9개 항-CD3 히트(hits)에서의 중쇄 및 경쇄의 정렬을 제공한다.
다양한 도면에서 유사한 참조 기호는 유사한 엘리먼트를 지시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 항체, 예컨대, 키메라 사람 항체(사람 성분을 지니는 키메라 항체), 재조합 항체, 합성 항체, 이들을 엔코딩하는 핵산, 및 이들 면역글로불린을 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명은 키메라 항체 및/또는 재조합 또는 합성 항체를 포함하는, 항체를 디자인하기 위한 신규한 접근방법을 제공한다. 이 접근방법은 면역글로불린 가변 영역 프레임워크 하위영역에 대한 컨센서스 서열을 생성시키는 것에, 적어도 부분적으로, 기초하는데, 여기서 상기 각각의 하위영역에 대한 컨센서스 서열은 다른 하위영역과 독립적으로 수득된다.
일 양상에서, 컨센서스 서열은 생식선 서열에서 유래된다(생식선 서열과 비교됨); 따라서, 생식선에서 대부분 나타나는 서열은 항체 디자인을 위해 우선될 수 있다. 각각의 프레임워크 하위영역에 관해 독립적으로 선택된 컨센서스 서열의 라이브러리로, 항체의 조합 라이브러리가 생성될 수 있다. 예를 들어, (공지 항원에 특이적으로 결합하는) 공지 항체의 CDR 영역을 유지하면서, 상기 CDR 영역은 상이한 프레임워크 하위영역 조합으로 재조립될 수 있고, 그에 따라 동일한 CDR 영역을 지니지만, 상이한 프레임워크 서열을 지니는 거대한 항체 콜렉션(collection)이 생성된다. 이러한 항체 콜렉션은 이후 프레임워크 서열이 타깃 항원에 대한 충분한 결합 친화력(affinity) 및 결합력(avidity)을 유지하면서 최소의 면역원성을 제공하는지 여부를 측정하기 위해 시험될 수 있다.
본 발명은 키메라 및/또는 재조합, 중쇄 가변 영역 폴리펩티드와 더불어 이들을 엔코딩하는 핵산(예를 들어, 본 발명의 키메라 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산)을 포함하는, 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 라이브러리를 제공한다. 본 발명은 키메라 및/또는 재조합, 경쇄 가변 영역 폴리펩티드와 더불어 이들을 엔코딩하는 핵산(예를 들어, 본 발명의 키메라 경쇄가변 영역 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산)을 포함하는, 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 라이브러리를 제공한다. 키메라 및/또는 재조합 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 포함하는, 본 발명의 중쇄 가변 영역 폴리펩티드는 2가 면역글로불린(Ig)을 생성시키기 위해 경쇄 가변 영역 폴리펩티드(예를 들어, 본 발명의 경쇄 가변 영역 폴리펩티드)와 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 ICF를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터 생성된 항체 조성물을 제공한다. 대안적인 구체예에서, 임의의 공지 항체(예를 들어, 표 5-6에 제시된 그러한 대표적인 항체)로부터의 임의의 CDR은 ICF, 예컨대, 표 1-4의 ICF와 결합되거나 연결될 수 있다. 또한, 이들은 불변 도메인(CD)(예를 들어, 표 7-8에 제시된 그러한 것들)과 추가로 결합되거나 연결되어 전장 길이 중쇄 가변 영역 폴리펩티드 또는 전장 길이 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 면역글로불린을 생성시키기 위해 폴리펩티드들을 결합시킬 때, Ig는 하기 비제한적인 항체 일예에 대한 기능 단위로서 역할할 수 있다: 단일 쇄 항체, 2가 항체(예컨대, 이황화결합으로 연결된 항체), Fab 단편, 및 단일 쇄 Fv.
추가적으로, 본 발명은 ICF를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 핵산의 조합 라이브러리를 생성시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항원에 특이적이며 감소된 면역원성을 지니는 항체를 생성시키는 방법을 제공한다.
대안적인 구체예에서, 본 발명의 항체(예를 들어, 본 발명의 키메라 및/또는 재조합 항체)는, 이로만 국한됨이 없이, 모노클로날 항체, 다특이적(multispecific) 항체, 사람 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 단일-쇄 Fv(scFv), 단일 쇄 항체, 단일 도메인 항체, Fab 단편, F(ab) 단편, 이황화결합으로 연결된 Fv(sdFv), 항-이디오타입(anti-idiotypic)(항-Id) 항체, 및 상기한 것들 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함하며 포괄한다(참조한다). 대안적인 구체예에서, 본 발명의 항체(예를 들어, 본 발명의 키메라 및/또는 재조합 항체)는 면역글로불린 분자와 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성있는 단편, 즉, 항원 결합 부위를 함유한 분자를 포함한다. 항체 단편은 또한, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 중쇄 또는 경쇄로부터의 하나 이상의 CDR3, CDR3를 제공하지 않는 면역글로불린 쇄로부터의 하나 이상의 CDR1 또는 CDR2, 및 모 분자(모 항체)내 CDR의 결합에 근접시키는 이의 능력에 기초하여 중쇄 또는 경쇄에서 선택된 하나 이상의 프레임워크 영역으로 구성된 작은 "항체 모방체"를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY)의 부류(예를 들어, IgG1, IgG2 , IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위클래스일 수 있다.
대안적인 구체예에서, 본 발명의 항체(예를 들어, 본 발명의 키메라 및/또는 재조합 항체)는 예를 들어, 2개의 경쇄와 쌍을 이룬 2개의 중쇄를 포함하는, 천연 전장-길이 항체의 동등물(equivalent)을 포함할 수 있다. 대안적인 구체예에서, 본 발명의 항체(예를 들어, 본 발명의 키메라 및/또는 재조합 항체)는 약 50 kD(길이에서 대략 446개의 아미노산)의 전장 길이 중쇄를 포함할 수 있다; 일 양상에서, 중쇄 가변 영역 유전자(약 116개 아미노산)과 불변 영역 유전자에 의해 엔코딩될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 상이한 아이소형, 예컨대, 알파, 감마(IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론, 및 뮤 서열의 중쇄 불변 영역을 엔코딩하는 상이한 중쇄 불변 영역 유전자가 사용된다. 대안적인 구체예에서, 경쇄 가변 영역 유전자와 불변 영역 유전자에 의해 엔코딩되므로, 약 25 kD 크기(대략 214개 아미노산 길이)의 전장 길이 경쇄가 사용된다. 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 영역은 항원에 대한 결합에 참여하며, 불변 영역은 항체의 이펙터 기능에 일반적으로 관여한다.
대안적인 구체예에서, 본 발명의 항체(예를 들어, 본 발명의 키메라 및/또는 재조합 항체)는 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 "가변 영역"(항체 쇄의 N-말단 성숙 도메인임)을 포함할 수 있다. 모든 도메인, CDR, 및 잔기 번호(numbers)는 서열 정렬 및 구조적 지식에 기초하여 할당된다. 대안적인 구체예에서, 본 발명의 항체(예를 들어, 본 발명의 키메라 및/또는 재조합 항체)는 하기를 포함할 수 있다: VH(항체 중쇄의 가변 도메인임); 또는 VL(항체 경쇄의 가변 도메인임)[대안적으로 카파((κ) 또는 람다(λ) 아이소형일 수 있음].
대안적인 구체예에서, 본 발명의 항체(예를 들어, 본 발명의 키메라 및/또는재조합 항체)는 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다; 일 양상에서, 상보성 결정 영역, 또는 CDR로도 칭해지는, 3개 또는 4개의 별개의 초가변 영역과 접해있고 이들을 포함하는 프레임워크 영역(FR)을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 대안적인 구체예에서, 천연에서와 마찬가지로, FR과 CDR 사이의 경계선(borderlines)은 항상 규정될 수 없으며, 특정 항체 및 다른 유사 항체와 대비한 가변성(variability)의 정도 및 이의 위치에 의존할 수 있다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종들 내부에서 비교적 보존되어 있다. 항체의 프레임워크 영역 - 즉, 구성 경쇄 및 중쇄의 결합된 프레임워크 영역 - 은 CDR의 위치를 정하고 이를 정렬시키는 역할을 한다. CDR은 항원의 에피토프에 대한 결합에 주로 관여한다.
대안적인 구체예에서, Kabat 체계(널리 공지되어 있고 폭넓게 사용되는 지침)가 본 발명의 프레임워크 영역과 CDR을 식별하기 위해 사용된다 - 참조: Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1987) 및 (1991). Kabat 프레임워크 서열 식별 방법은 잘 알려져 있고, 그에 따라, 이것은 정규 프로토콜이다; 예를 들어, 미국 특허 제5,840,299호; 미국 공개 특허 제20050261480호 참조. 카바트와 동료들은 항체에 관한 다수의 아미노산 서열을 각각의 하위클래스에 관해 나열하고, 가장 흔히 발생하는 아미노산을 상기 하위클래스내 각각의 잔기 위치에 관해 나열한다. 카바트와 동료들은 나열된 서열내 각각의 아미노산에 대해 잔기 번호를 할당하는 방법을 사용하며, 잔기 번호를 할당하는 이 방법은 당해 기술분야에서 표준이 되었다. 카바트와 동료들의 체계(scheme)는 상기 카바트 등의 문헌 중의 컨센서스 서열 중 하나와 문제가 되는 항체를 정렬시킴으로써 일람표(compendium)내에 포함되지 않은 다른 항체로 확장될 수 있다. 카바트와 동료들의 번호매김 체계의 사용은 상이한 항체내 동등한 위치에서 아미노산을 용이하게 식별시킨다. 예를 들어, 사람 항체의 L50위치의 아미노산은 마우스 항체의 아미노산 위치 L50과 동등한 위치를 점유한다.
당해 기술분야에서 사용되는, 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내부의 상보성 결정 영역을 의미한다. 가변 영역 각각에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지정된, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에 3가지 CDR이 존재한다. CDR이 (유사 서열의 영역과 대비하여) 가변성이 증가된 영역을 나타내기 때문에, 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 체계에 따라 다르게 규정될 수 있다. 카바트에 의해 기술된 폭넓게 사용되는 체계(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) 및 (1991))가 항체의 임의 가변 영역에 적용가능한 잔기 넘버링 체계를 제공하며 상기 3가지 CDR을 규정하는 잔기 경계를 제공한다. 이들 CDR은 "카바트 CDR"로 지칭될 수 있다. 코티아와 동료들(Chothia et al., Nature (1989) 342:877-883; Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)은 Kabat CDR 내의 특정 하위-부분(sub-portions)이, 아미노산 서열 수준에서 매우 큰 다양성을 지님에도 불구하고, 거의 동일한 펩티드 백본 배좌(conformations)를 채택하고 있음을 발견하였다. 이러한 하위-부분은 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3로 지정되고, 여기서 "L"과 "H"는 경쇄 및 중쇄 영역을 나타낸다. 이들 영역은 코티아 CDR로 지칭될 수 있는데, 이들은 Kabat CDR과 중첩되는 경계를 갖는다.
용어 "프레임워크," "프레임워크 영역," 또는 "프레임워크 서열"은 가변 영역에서 CDR을 뺀 나머지 서열을 의미한다. CDR 서열의 정확한 정의가 상이한 체계에 의해 결정될 수 있기 때문에, 프레임워크 서열의 의미는 이에 상응하여 상이하게 해석되게 된다. 일 구체예에서, 프레임워크 영역 내부의 6개의 CDR(경쇄의 CDR1, 2, 및 3과 중쇄의 CDR1, 2, 및 3)의 점유위치(positioning)는 각각의 쇄의 프레임워크 영역을 FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 지정된, 4개의 하위영역으로 효과적으로 나눈다. CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치하며; CDR2는 FR2와 FR3 사이; CDR3는 FR3와 FR4 사이에 위치한다. 특정 하위영역을 FR1, FR2, FR3, 또는 FR4로 명기함이 없이, 다른 이들에 의해 지칭된, 프레임워크 영역은 단일의, 천연적으로 생성된 면역글로불린 쇄의 가변 영역 내부의, 조합된(combined) 하위영역 FR1, FR2, FR3, 및 FR4를 나타낸다. 대안적인 구체예에서, 본 발명의 프레임워크 영역(FR)은 4개의 하위영역 중 하나로 이루어진 서열을 포함하는, 전제 프레임워크 서열의 임의의 일부를 포함하거나 이로 이루어진다(나타낸다). 대안적인 구체예에서, 본 발명의 프레임워크 영역(FR)은 Kabat 프레임워크 영역(KF) 도메인에서 유래된 아미노산을 포함하거나 이로 이루어지며, 여기서 상기 아미노산 서열은 생식선 면역글로불린 서열에서 유래된다.
일 구체예에서, 면역글로불린 서열과 관련하여, 용어 "생식선 서열"은 특정 면역글로불린의 발현을 위한 유전자 재배열과 체세포 과돌연변이(somatic hypermutation)를 야기시키는 성숙 과정을 겪지 않는 게놈 서열(면역글로불린 코딩 서열을 포함함)을 의미한다. (예를 들어, 하기 문헌을 참조: Shapiro et al., (2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200; Marchalonis et al., (2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484: 13-30). "생식선"은 생식세포(gametes)를 생성시키며 수 세대를 걸쳐 지속되는 세포의 계통을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 성숙 면역글로불린, 성숙 (Ab) 서열 및/또는 성숙 (Ab) 형태 등과 관련하여, 용어 "성숙"은, 임의의 비-생식선 면역글로불린 서열을 포함할 수 있다; 예를 들어, 친화력-성숙 서열(예를 들어, 생체내 또는 시험관내 친화력 성숙 과정 후)을 포함하는, 임의의 V 영역과 재배열된 임의의 아이소형의 재배열되거나 변형된 임의의 생식선 서열.
일 구체예에서, 용어 "컨센서스 서열"은 관련 단백질(예를 들어, 임의의 특정 하위클래스의 면역글로불린, 예를 들어, 경쇄, 예컨대, 카파 또는 람다, 또는 아이소형) 또는 소단위체 구조) 세트내의 각각의 위치에 더 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(의미한다). 컨센서스 서열은 특정 종 또는 다수 종의 면역글로불린에 기초할 수 있다. 대안적인 구체예에서, "더 빈번하게"는 관련 단백질의 세트, 예를 들어, 임의의 특정 하위클래스(예를 들어, 경쇄, 예컨대, 카파 또는 람다, 또는 아이소형) 또는 소단위체 구조의 면역글로불린 서열내의 각각의 잔기 위치(지점)에서 약 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 51% 이상, 52% 이상, 53% 이상, 54% 이상, 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 더 빈번하게 생성되는 아미노산 잔기를 의미한다.
용어 "유도체"는 또 다른 분자로부터 형성될 수 있는 분자를 의미한다. 뉴클레오티드(예를 들어, 핵산서열) 또는 단백질성 물질(proteinaceous agent)(예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 등; 예를 들어, 항체)의 문맥에서, 유도체는 본래의 핵산 서열(예컨대, 생식선 서열), 또는 아미노산 서열을 포함하는 단백질성 물질(본래 공급원에서 획득되거나 아미노산 잔기 치환, 결실, 및/또는 부가의 도입에 의해 변형됨)을 포함하는 물질을 의미할 수 있다. 그러한 물질의 유도체는 이것이 유래된 물질과 유사하거나 동일한 서열을 소유한다.
본 명세서에 사용된, "위치지정자(placeholder)"는 Kabat 프레임워크 영역 1, 2, 및 3, 및 공지의 면역글로불린의 CDR 1, 2, 및 3을 포함하는 면역글로불린 가변 영역(예를 들어, 경쇄 가변 영역)을 엔코딩하는 핵산 서열이다. 위치지정자는 가공된, 성숙 항체의 서열(예를 들어, 성숙 항체의 핵산 서열과 가장 유사한 그러한 경쇄 가변 영역 생식선 서열)의 서열 동일성과 비교하여 생식선 가변 영역 핵산 서열 동일성에 기초하여 결정된다. 일단 확인된, 위치지정자는 이후 제 2의 쇄와 연결되어 중쇄의 기능적 특성을 평가하기 위하여, 예를 들어, 본 발명의 중쇄 가변 영역 분자와 결합된 일시적 단일 쇄 분자로서 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 위치지정자는 경쇄 가변 영역(예를 들어, 카파 쇄 또는 람다 쇄)이다.
본 명세서에 사용된, "Kabat 프레임워크 영역(KF)"은 면역글로불린의 아미노산 잔기를 넘버링하고 FR과 CDR에 관하여 위치를 할당하기 위해 표준 카바트 체계에 상응하는 가변 쇄 프레임워크 영역(하위영역)이다(Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91- 3242). 예를 들어, 이 체계에 따라서, 하기 Kabat 넘버는 가변 중쇄 프레임워크 하위영역을 구별하는데 사용될 수 있다: Kabat 프레임워크 영역 1(KF1, FR1에 상응할 수 있음)은 잔기 1 내지 대략 잔기 29를 포함한다; Kabat 프레임워크 영역 2(KF2, FR2에 상응할 수 있음)는 대략 잔기 36 내지 대략 잔기 49 포함한다; Kabat 프레임워크 영역 3(KF3, FR3에 상응할 수 있음)는 대략 잔기 66 내지 대략 잔기 94를 포함한다; Kabat 프레임워크 영역 4(KF4, FR4에 상응할 수 있음)는 대략 잔기 103 내지 대략 잔기 113을 포함한다.
또한, 이 체계에 따라, 대안적인 구체예에서, 하기 Kabat 넘버가 가변 경쇄 프레임워크 영역을 구별하는데 사용되 수 있다: Kabat 프레임워크 영역 1(KF1, FR1에 상응할 수 있음)은 잔기 1 내지 대략 잔기 23을 포함한다; Kabat 프레임워크 영역 2(KF2, FR2에 상응할 수 있음)는 대략 잔기 35 내지 대략 잔기 49를 포함한다; Kabat 프레임워크 영역 3은 대략 잔기 57 내지 대략 잔기 88(KF3, FR3에 상응할 수 있음)을 포함한다; Kabat 프레임워크 영역 4는 대략 잔기 96 내지 대략 잔기 109(KF4, FR4에 상응할 수 있음)를 포함한다.
본 명세서에 사용된, "ICF(Independently Consensed Framework)"는, 예를 들어, 하기에서 획득된 컨센서스 서열인 아미노산 또는 상기 서열을 코딩하는 핵산을 지니는 프레임워크 영역(예를 들어, FR1, FR2, FR3, FR4, 및 그에 따라 KF1, KF2, KF3, 또는 KF4에 상응할 수 있음)을 의미한다: 공지 면역글로불린의 (1) 생식선 V 또는 J 유전자, (2) 재배열된 VDJ 유전자, (3) 재배열된 VJ 유전자, 및 (4) 아미노산 서열(및/또는 동일 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 핵산 서열). 유전자 코드의 축퇴성 때문에, 많은 수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 폴리펩티드를 엔코딩한다. 예를 들어, 코돈 CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, 및 AGG 모두 아미노산 아르기닌을 엔코딩한다. 따라서, 아르기닌이 하나의 코돈에 의해 특정된 모든 위치에서, 상기 코돈은 엔코딩된 폴리펩티드를 변형시킴 없이 기재된 상응하는 코돈들 중 임의의 코돈으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이체(variations)는 "침묵 변이체(silent variations)"로 칭해진다. 당업계의 통상의 기술자는 핵산 서열내 코돈(AUG 제외; 보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈임)이 표준 기술에 의해 기능적으로 동일한 분자를 생산하도록 변형될 수 있음을 인지할 것이다.
일 구체예에서, 각각의 ICF는 가변 영역내 다른 ICF에서 독립적으로 선택된 컨센서스 서열을 포함한다. 즉, 일 양상에서, ICF 컨센서스 서열은 다른 프레임워크 하위영역과는 독립된 특정 프레임워크 하위영역의 분석으로부터 획득된다(별개의 프레임워크 하위영역을 독립적으로 분석함으로써가 아니라 전체 프레임워크 영역을 시험함으로써 프레임워크 컨센서스 서열을 분석하는 방법과 대조됨). 독립적인 선별은 가변 쇄 프레임워크 영역의 적어도 몇몇 일부분을 엔코딩하는 다수의 생식선 핵산 서열로부터 획득된 ICF 생식선 핵산서열의 풀을 정렬하는 단계 및 후속하여 서열 유사도에 따라 서열을 클러스터링(clustering)하는 단계를 포함할 수 있는데, 여기서, 각각의 프레임워크 클러스터로부터의 서열은 이후 컨센서스 서열을 형성하는데 사용된다. 번역시, 컨센서스 서열은 각각의 잔기 위치에서 발생하는 가장 빈번한 아미노산 서열을 입증한다. 도메인은 ICF1, ICF2, ICF3, 또는 ICF4일 수 있다. 가변 프레임워크 영역 아미노산 잔기는 표준 Kabat 넘버링 체계에 상응할 수 있다. ICF 서열은 ICF 도메인을 결정하기 위해 사용된 본래 생식선 서열과 일치할 수 있다. 컨센서스 서열은 또한 핵산 컨센서스 서열내 임의의 와블(wobble) 위치 변화를 포함하는데, 여기서 상기 뉴클레오티드 변화는 여전히 동일한 아미노산 서열을 엔코딩할 것이다. 예를 들어, 컨센서스 서열은 사람 생식선 서열에 기초하여 사람에 대해 결정될 수 있다. 컨센서스 서열은 또한, 적절한 생식선 서열을 이용하면서, 다음 비제한적인 일예들, 예컨대, 개과 동물, 고양이과 동물, 양, 말, 소, 돼지, 닭, 염소, 연어, 및 하이브리도마 세포주에 대해 결정될 수 있다.
면역글로불린 구조
면역글로불린(Igs)은 항원에 대한 반응으로(즉, 감염 또는 면역화로) 혈장 세포에 의해 생산된 항체로서 기능하는 분자이다. 면역글로불린은 하나 또는 수개의 밀접하게 관련된 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 면역글로불린의 주요 기능은 항원에 결합하는 것이며, 궁극적으로 동물내에서 보호를 야기시킬 수 있는 다양한 이펙터 기능을 매개한다. Ig는 중쇄의 불변 영역내의 아미노산 서열의 차이에 근거하여, 5개의 상이한 클래스(예를 들어, 감마(γ) 중쇄(IgG), 뮤(μ) 중쇄(IgM), 알파(α) 중쇄(IgA), 델타 중쇄(IgD), 및 엡실론(ε) 중쇄(IgE))로 나뉘어진다. 해당 클래스내의 모든 Ig는 유사한 중쇄 불변 영역을 가질 것이다. Ig 클래스는 중쇄의 불변 영역내 아미노산 서열내의 작은 차이에 기초하여 서브클래스로 더 세분될 수 있다. 서브클래스내의 Ig는 유사한 중쇄 불변 영역 아미노산 서열을 가질 수 있는데, 여기서 차이는 혈청학적 수단에 의해 검출된다. 예를 들어, IgG 서브클래스는 IgGl, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하며, 여기서 상기 중쇄는 아미노산 차이에 기해, 감마 1 중쇄, 감마 2 중쇄 등으로 분류된다. 또 다른 일예에서, IgA 서브클래스는 IgAl과 IgA2를 포함하며, 여기서 상기 중쇄는 아미노산 차이에 기해, 알파 1 중쇄 또는 알파 2 중쇄로 분류된다.
면역글로불린은 또한 경쇄, 예컨대, 카파 경쇄 또는 람다 경쇄를 포함한다. 경쇄 타입의 특이성(distinctions)은 경쇄의 불변 영역내의 아미노산 서열에서의 차이에 기초하며, 이 차이는 또한 혈청학적 수단에 의해 검출될 수 있다. 경쇄는 또한 경쇄의 불변 영역내 아미노산 서열내의 차이에 기초하여 서브타입으로 나뉘어 질 수 있다. 예를 들어, 람다 서브타입은 람다 1, 람다 2, 람다 3, 및 람다 4로 분류된다.
면역글로불린은 이종성(heterogeneous) 분자의 집단을 포함하는데, 이것은 이들이 상이한 클래스 및 서브클래스의 중쇄로 구성되기 때문이다. 각각의 중쇄는 후속하여 상이한 타입 및 서브타입의 경쇄와 결합될 수 있다. 그 결과로, 상이한 면역글로불린 분자들은 상이한 VH와 VL 영역으로 인해 상이한 항원 결합 특성을 가질 수 있다. 일반적으로, 면역글로불린은 이들의 기본 단위로서 4-쇄 구조를 포함한다. 전장-길이 Ig는 공유적으로 연결된 2개의 중쇄(~ 50-70 kD)와 2개의 경쇄(각각, ~ 23 kD, 예컨대, 람다 또는 카파 쇄)를 포함한다. 각각의 경쇄는 또한 상기 중쇄들 중 하나와 공유적으로 연결된다. 예를 들어, 상기 2개의 중쇄와 상기 중쇄 및 경쇄는 쇄간(inter-chain) 이황화결합에 의해 그리고 비공유 상호작용에 의해 결합된다. 쇄간 이황화결합의 개수는 상이한 면역글로불린 분자들 사이에서 다를 수 있다. 각각의 쇄는 N-말단 가변 도메인(VH 또는 VL, 여기서 각각은 ~ 110개의 아미노산 길이임)과 C-말단에 하나 이상의 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인(CL은 ~110개 아미노산 길이임)은 중쇄의 제 1 불변 도메인(CH는 -330-440개 아미노산 길이임)에 정렬되고 이에 이황화결합된다. 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. Ig 중쇄는 2개 이상의 추가 CH 도메인(예컨대, CH2, CH3 등)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 힌지 영역은 CH1와 CH2 불변 도메인 사이에서 확인될 수 있다. 상기 힌지 영역은 항체 분자의 팔(arms)이 Y-형태를 이루고 분자에 약간의 유연성(flexibility)을 부여하는 영역이다.
위에서 논의되고 정의된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 프레임워크 영역(FRs)과 상보성-결정 영역(CDRs)으로 칭해지는 초가변 영역, 및 쇄간 이황화결합을 포함한다. (예를 들어, 하기 문헌 참조: Chothia et al., (1985) J. Mol. Biol. 186:651-663; Novotny and Haber, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:45924596; Padlar et al., (1986) Mol. Immunol., 23(9): 951-960; 및 S. Miller, J. (1990) Mol. Biol, 216:965-973).
Ig 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 프레임워크 영역내의 이들의 유사성 및 차이에 기초하여 그룹 및 서브그룹으로 나뉘어질 수 있다. 가변성은 상이한 가변 영역 유전자(예컨대, V, D, 및 J 유전자) 산물의 결과이다.
VDJ 재조합, 생식선 서열, 및 면역글로불린 다양성
Ig 분자의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 V 분절(가변 유전자 분절) 및 J 분절(연결 유전자 분절)을 포함한다. V 유전자는 V-분절을 엔코딩하며 J-분절은 J 유전자에 의해 엔코딩된 영역을 의미한다. 또한, 중쇄 가변 영역은 D 분절(다양성 유전자 분절)을 포함하며, 이 분절은 D 유전자에 의해서 엔코딩된다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 V 분절은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, 및 소수의 CDR3의 아미노산으로 이루어져 있다. 경쇄 가변 영역의 J 분절은 CDR3의 나머지와 완전하게 FR4를 포함한다. 중쇄 가변 영역에서, J 분절은 CDR3의 일부분과 FR4의 전부를 포함하는데, 여기서 D 분절은 CDR3의 잔여 부분을 포함한다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역을 생성시키기 위해, B-세포 분화가 진행되는 동안 J 분절이 경쇄 가변 영역 유전자의 재배열의 결과로써 V 분절에 부가된다. 중쇄의 경우, J 분절 이외에 D 분절이 V 분절에 부가되어 중쇄 가변 영역을 생성시킨다.
면역글로불린 다양성은 다양한 과정, 예컨대, 조합 조립(예를 들어, V(D)J 재조합), 접합(junctional) 조립, 경쇄 커플링(예를 들어, κ와 λ 경쇄의 상이한 조합이 사용될 수 있으나, 모든 중쇄는 κ 및 λ와 동등하게 쌍을 잘 이룸), 및 체세포 과돌연변이의 결과이다.
다수의 생식선 유전자의 조합 조립은 가변 영역을 엔코딩하는 것과 다양한 체세포성 사건을 포함한다. V(D)J 재조합은 발달하는 B 세포내의 성분 V, D, 및 J 유전자 분절로부터 Ig 유전자를 조립한다. 체세포성 사건은 완전한 VH 영역(중쇄 가변 영역의 V(D)J 도메인)을 만들기 위하여 다양성(D) 및 연결(J) 유전자 분절과 가변 (V) 유전자 분절의 무작위 재조합을 포함한다. 요약하면, 제 1 재조합 사건은 발달하는 B 세포에서 중쇄 유전자좌(locus)의 한개의 D와 한개의 J 유전자 분절 사이에서 일어나며, 이 사건은 DJ 복합체를 형성시킨다. 이들 두 유전자 사이의 DNA는 결실된다. 이후 D-J 재조합 사건에 후속하여 새로이 형성된 DJ 복합체의 상류 영역으로부터의 한 V 유전자의 연결이 일어나며, 그 결과로 재배열된 VDJ 유전자의 형성이 야기된다. 새로운 VDJ 유전자의 V와 D 분절 사이의 다른 유전자는 이제 결실된다. 면역글로불린 경쇄 유전자좌의 카파(κ)와 람다(λ) 쇄는, 경쇄에 D 분절이 결여되어 있다는 것을 제외하고는, 유사하게 중쇄 가변 영역과 재조합되며, 여기서 이 사건은 또한 완전한 VL 영역(경쇄 가변 영역의 VJ 도메인)을 만들기 위해 가변(V) 및 연결(J) 유전자 분절의 무작위 재조합을 포함할 수 있다.
접합 다양성은 또한 재조합 과정이 진행되는 동안 달성되는 Ig 다양성에 기여한다. D 유전자 분절이 J 유전자 분절에 접합되고, V 유전자 분절이 후속하여 DJ 영역에 접합될 때, 이 과정 그 자체가 부정확하고, 그 결과 V(D)J 도메인의 접합부에서 다양한 아미노산을 엔코딩하는 뉴클레오티드의 손실 또는 부가를 초래할 수 있다. 다양성을 생성시키는데 관여하는 이러한 메카니즘은 항원 노출에 앞서 발달중인 B 세포에서 일어난다.
항원 자극후, B 세포내에서 발현된 Ig 유전자는, Ig 가변성에 추가로 기여하는, 체세포 돌연변이 또는 과돌연변이를 겪는다(하기 문헌 참조: Maizels (2005) Ann. Rev. Genet. 39:23-46). 항원과 조우한 후 활성화된 후, 성숙한 B 세포는 면역글로불린 유전자의 가변 영역내로 점 돌연변이를 도입시킬 가능성을 갖게 된다(이는 친화력 성숙으로 지칭됨); 이것은 전문화된 임파 구조(배심(germinal centers)에서 일어난다. 일부 돌연변이는 Ig가 항원에 대하여 더 높은 친화력을 갖도록 야기시킬 수 있다. 항원에 강하게 결합하는 항체는 증식을 위해 선별되는데, 이는 이들이 이의 항원에 약하게 결합하는 항체를 더 자주 자극받기 때문이다.
Ig 다양성을 생성시키는 상기한 메카니즘 이외에, 발현된 면역글로불린을 엔코딩하는 서열로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래된 유전자적으로 다양한 뉴클레오티드의 콜렉션이 사용될 수 있다. 예를 들어, 서열은 시험관내 자극에 의해 세포주에서 생성될 수 있는데, 상기 자극에 반응하여 재배열이 일어난다. 달리, 서열의 일부 또는 전부는, 예를 들어, 뉴클레오티드 합성, 무작위 돌연변이유발, 및 다른 방법, 예컨대, 미국 특허 제5,565,332호에 개시된 방법을 사용하여, D 및 J 분절과 재배열되지 않은 V 분절을 결합시킴으로써, 획득될 수 있다. 대략 1.6 x 107 개의 상이한 항체가 생식선 유전자 분절(예컨대, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 V, D, 및 J 분절)의 추정된 개수, 이들 분절의 무작위 재조합, 및 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH-VL)의 무작위 짝지음에 기초하여 생산될 수 있다(Fundamental Immunology (3rd ed), ed. Paul, Raven Press, New York, N. Y., 1993; Immunobiology: the immune system in health and disease, 4th ed., Janeway et al., Elsevier Science/Garland Publishing, York, N. Y., 1999). 항체 다양성에 기여하는 다른 과정(예컨대, 체세포 과돌연변이)를 고려할 때, 대략 1010개의 상이한 Ig가 생성될 수 있다(Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1995; Immunology, 3rd ed., Kuby, J., W.H. Freeman and Co., New York, NY., 1997).
폴리펩티드
본 발명은 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산과 더불어 재조합 중쇄 가변 영역 폴리펩티드의 조합물을 제공한다. 본 발명은 또한 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 뿐만 아니라 재조합 경쇄 가변 영역 폴리펩티드의 조합물을 제공한다. 재조합 중쇄 가변 영역 폴리펩티드는 면역글로불린을 생성시키기 위해 경쇄 가변 영역 폴리펩티드와 커플링될 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 핵산 서열과 더불어 핵산 조합물, 즉, 적어도 부분적으로 개개의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질을 엔코딩하는 그러한 핵산 서열 또는 핵산 조합물이 천연적으로 생성되거나, 합성되거나, 상기 둘의 조합일 수 있다. 이들은 mRNA, DNA 또는 cDNA일 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 핵산은 항체를 엔코딩한다. 추가 구체예에서, 핵산은 단일 쇄 항체, 2가 항체, Fab 단편, 또는 단일 쇄 Fv를 엔코딩한다.
일 구체예에서, ICF(Independently Consensused Frameworks)를 엔코딩하는 아미노산 서열이 재조합 중쇄 가변 영역을 생성시키기 위해 제공된다(참조: 표 1). 또 다른 구체예에서, ICF에 상응하는 아미노산 서열을 엔코딩하는 핵산이 재조합 중쇄 가변 영역 폴리펩티드를 생성시키기 위해 제공된다(표 2). 다른 구체예에서, ICF(Independently Consensused Frameworks)를 엔코딩하는 아미노산 서열이 재조합 경쇄 가변 영역을 생성시키기 위해 제공된다(참조: 표 3). 아직 추가의 구체예에서, ICF에 상응하는 아미노산 서열을 엔코딩하는 핵산은 재조합 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 생성시키기 위해 제공된다(표 4). ICF(예를 들어, ICF1, ICF2, ICF3, 또는 ICF4)는, 예를 들어, 하기로부터 획득된 컨센서스 서열인 아미노산 또는 핵산 코딩 서열을 포함하는 Kabat 프레임워크(KF) 영역(즉, KF1, KF2, KF3, 또는 KF4)일 수 있다: 공지의 Ig의 (1) 생식선 V 또는 J 유전자, (2) 재배열된 VDJ 유전자, (3) 재배열된 VJ 유전자, 또는 (4) 아미노산 서열(및/또는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 핵산 서열).
표 1. 가변 중쇄 ( V H ) ICF 에 관한 대표적인 아미노산 서열:
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표 2. 가변 중쇄 ( V H ) ICF 에 관한 대표적인 핵산 서열.
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표 3. 가변 경쇄 (Vκ 또는 Vλ) ICF 의 대표적인 아미노산 서열
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표 4. 가변 경쇄 ICF 에 관한 대표적인 핵산 서열
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표 1 내지 4에 나열된 서열 이외에, 본 발명에 사용될 수 있는 다른 ICF가 도 24, 32, 33, 34, 38, 39와, 실시예 3과 4에 개시된 조립된 HuFR 서열에 제공된다(채색되거나 밑줄 그어지지 않은 서브서열).
예를 들어, 각각의 ICF는 독립적으로 선택된 컨센서스 서열을 포함하는데, 여기서 독립적인 선택은 가변 쇄 Kabat 프레임워크 영역의 적어도 몇개의 일부분을 엔코딩하는 다수의 생식선 핵산 서열로부터 획득된 ICF 생식선 핵산 서열의 풀을 정렬시키고 후속하여 서열 유사도에 따라 서열을 클러스터링하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 각각의 프레임워크 클러스터로부터의 서열은 이후 중쇄 가변 영역에 대한 컨센서스 서열을 확립시키는데 사용된다. 비제한적인 일례에서, 모든 생식선 사람 VH 엑손의 서열이 컴파일링(compiling)될 수 있고, 엑소 서열 각각은 후속하여 카바트 등의 문헌(상기 참조)에 규정된 것과 같이 프레임워크 하위영역, FR1, 2, 3, 및 4로 나뉘어질 수 있다.
프레임워크 하위영역 1-4를 포함하는 전체 프레임워크의 서열 보다, FR 하위영역 서열의 세트(예컨대, Kabat FR1 서열의 풀)가 이후 정렬되고 서열 유사도에 의해 클러스터링된다. 각각의 FR 하위영역 클러스터(예를 들어, FR1, FR2, FR3, 또는 FR4)로부터의 서열은 이후, 각각의 서열 위치에서 가장 빈번하게 발생되는 아미노산을 포함하는, 전체 프레임워크 영역에서 독립적으로 유래된, 컨센서스 서열(예를 들어 ICF1, ICF2, ICF3, 및 ICF4)을 생성시키는데 사용될 수 있다(표 1 및 2 참조). 컨센서스 과정은 또한 각각의 프레임워크 하위영역 내부의 컨센서스 서열을 식별시키기 위해 VL 엑손에 대해 수행될 수 있다(표 3-4; 또한 실시예 1-2를 참조). 예를 들어, 중쇄 가변 영역을 조립하기 위해 사용된 ICF 서열은 결과적으로 총 336개의 중쇄 가변 영역 조합물(즉, 7개 IFC1 서열 x 6개 ICF2 서열 x 8개 ICF3 서열 x 1개 ICF4 서열). 경쇄 가변 영역(예를 들어, 카파 경쇄)을 조립하기 위해 ICF 서열을 사용하는 또 다른 일예에서, 총 224개 경쇄 가변 영역 조합물이 가능하다(즉, 7개 IFCl 서열 x 4개 ICF2 서열 x 8개 ICF3 서열 x 1개 ICF4 서열). 중쇄 및 경쇄 가변 영역 조합물 둘 모두가 또 다른 것과 연결되는 경우, 총 75,264개 중쇄-경쇄 복합체(예를 들어, 더 사람과 유사한 면역글로불린 분자)가 생성될 수 있다.
일 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF1 핵산 서열은 서열번호 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28 중 임의의 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF2 핵산 서열은 서열번호 29, 30, 31, 32, 또는 33를 포함한다. 추가 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF3 핵산 서열은 서열번호 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 또는 41을 포함한다. 본 발명의 아직 또 다른 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF4 핵산 서열은 서열번호 42이다.
또 다른 일예에서, 각각의 프레임워크 클러스터로부터의 서열은 또한 경쇄 가변 영역에 관한 컨센서스 서열을 확립시키는데 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF1 핵산 서열은 서열번호 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 또는 98을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF2 핵산 서열은 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107을 포함한다. 추가 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF3 핵산 서열은 서열번호 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 또는 123을 포함한다. 본 발명의 아직 또 다른 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF4 핵산 서열은 서열번호 125 또는 126이다.
각각의 프레임워크 클러스터로부터의 아미노산 서열은 또한 중쇄 가변 영역에 관한 컨센서스 서열을 확립시키는 데 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF1 아미노산 서열은 서열번호 1-7, 186, 187, 188, 189, 181, 199 중 임의의 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF2 아미노산 서열은 서열번호 8-12 또는 190-192 중 임의의 서열을 포함한다. 추가 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF3 아미노산 서열은 서열번호 13-20, 180, 182-185, 또는 193-198을 포함한다. 본 발명의 아직 또 다른 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF4 아미노산 서열은 서열번호 21, 206, 또는 207이다.
추가적으로, 각각의 프레임워크 클러스터로부터의 아미노산 서열은 또한 경쇄 가변 영역에 관한 컨센서스 서열을 확립시키는 데 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF1 아미노산 서열은 서열번호 43-57 또는 200-204 중 임의의 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF2 아미노산 서열은서열번호 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 또는 204를 포함한다. 추가 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF3 아미노산 서열은 서열번호 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 또는 82를 포함한다. 본 발명의 아직 또 다른 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF4 아미노산 서열는 서열번호 83 또는 84이다.
번역시, ICF1, ICF2, ICF3, 또는 ICF4 컨센서스 서열은 각각의 잔기 위치에서 발생하는 가장 빈번한 아미노산 서열의 증거가 된다. ICF 서열은 ICF 도메인을 결정하기 위해 사용된 본래 생식선 서열과 동일할 수 있다. 일 구체예에서, 중쇄 가변 영역을 포함하는 ICF 서열은 생식선 Kabat 프레임워크 영역(KFR)과 80% 이상 동일하다. 또 다른 구체예에서, ICF 서열은 생식선 KFR과 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일하다.
본 발명의 경쇄 가변 영역 폴리펩티드의 ICF 서열은 ICF 도메인을 결정하기 위해 사용된 본래 생식선 서열과 동일할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 경쇄 가변 영역을 포함하는 ICF 서열은 생식선 KFR과 70% 이상 동일하다. 또 다른 구체예에서, ICF 서열은 생식선 KFR과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일하다.
번역시, ICF1, ICF2, ICF3, 또는 ICF4 컨센서스 서열은 각각의 잔기 위치에서 발생된 가장 빈번한 아미노산 서열의 증거가 된다. 일 구체예에서, 중쇄 가변 영역을 포함하는 ICF 서열은 성숙한 항체 KFR과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일하다.
본 발명의 경쇄 가변 영역 폴리펩티드의 ICF 서열은 또한 ICF 도메인을 결정하기 위해 사용된 본래의 성숙한 항체 서열과 동일할 수 있다. 일 구체예에서, 경쇄 가변 영역을 포함하는 ICF 서열은 성숙한 항체 KFR과 50% 이상 동일하다. 다른 구체예에서, 경쇄 가변 영역을 포함하는 ICF 서열은 성숙한 항체 KFR과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100% 동일하다.
가변 프레임워크 영역 아미노산 잔기는 위에 기재된 것과 같이 표준 Kabat 넘버링 체계에 부합할 수 있다. Kabat 넘버링 체계는 본 발명의 ICF 아미노산 서열과 부합할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 영역의 ICF1은 Kabat 프레임워크(KF) 1의 약 25개 잔기를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 ICF1는 KF1의 20개 이상, 25개 이상, 또는 29개 이상의 연속된(contiguous) 잔기를 포함한다.
일 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 ICF2는 KF2의 약 14개 잔기를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 ICF2는 KF2의 10개 이상, 12개 이상, 또는 14개 이상의 연속된 잔기를 포함한다.
중쇄 가변 영역의 ICF3는 KF3의 약 32개 잔기를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 ICF3는 KF3의 25개 이상, 30개 이상, 또는 32개 이상의 연속된 잔기를 포함한다.
중쇄 가변 영역의 ICF4는 KF4의 약 12개 잔기를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 중쇄 가변 영역의 ICF4는 KF4의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상의 연속된 잔기를 포함한다.
Kabat 넘버링 체계는 또한 본 발명의 경쇄 가변 영역 폴리펩티드의 ICF 아미노산 서열과 부합할 수 있다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역(예를 들어, Vκ 또는 Vλ)의 ICF1은 Kabat 프레임워크(KF) 1의 약 22개 잔기를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 경쇄 가변 영역의 ICF1는 KF1의 15개 이상, 20개 이상, 또는 23개 이상의 연속된(contiguous) 잔기를 포함한다.
경쇄 가변 영역의 ICF2는 KF2의 약 15개 잔기를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 경쇄 가변 영역의 ICF2는 KF2의 10개 이상의 연속된 잔기를 포함한다. 또 다른 구체예에서, ICF2는 KF2의 12개 이상의 연속된 잔기를 포함한다. 추가 구체예에서, ICF2는 KF2의 14개 이상의 연속된 잔기를 포함한다.
경쇄 가변 영역의 ICF3는 KF3의 약 32개 잔기를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 경쇄 가변 영역의 ICF3는 KF3의 25개 이상, 30개 이상, 또는 32개 이상의 연속된 잔기를 포함한다.
경쇄 가변 영역의 ICF4는 KF4의 약 10개 잔기를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 경쇄 가변 영역의 ICF4는 KF4의 8개 이상, 10개 이상, 또는 13개 이상의 연속된 잔기를 포함한다.
ICF 핵산 컨센서스 서열은 핵산 컨센서스 서열내 임의의 와블(wobble) 부위 변화를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 뉴클레오티드 변화는 여전히 동일한 아미노산 서열을 엔코딩할 것이다. 유전자 코드의 축퇴성 때문에, 어마어마한 수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 폴리펩티드를 엔코딩한다. 예를 들어, 코돈 CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, 및 AGG는 모두 아미노산 아르기닌을 엔코딩한다. 따라서, 아르기닌이 한 코돈에 의해 특정된 모든 위치에서, 이 코돈은 엔코딩된 폴리펩티드를 변형시키지 않은 채 기재된 상응하는 코돈들 중 임의의 코돈으로 변경될 수 있다.
특정 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF1을 엔코딩하는 핵산 서열은 서열번호 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다. 다른 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF2를 엔코딩하는 핵산 서열은 서열번호 29, 30, 31, 32, 또는 33과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다. 몇몇 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF3를 엔코딩하는 핵산 서열은 서열번호 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 또는 41과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다. 아직 추가의 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF4를 엔코딩하는 핵산 서열은 서열번호 42와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다.
다른 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF1을 엔코딩하는 핵산 서열은 서열번호 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 또는 98과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다. 특정 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF2를 엔코딩하는 핵산 서열은 서열번호 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다. 몇몇 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF3를 엔코딩하는 핵산 서열은 서열번호 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 또는 123과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다. 아직 다른 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF4를 엔코딩하는 핵산 서열은 서열번호 125 또는 126과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다.
보존적 아미노산 변형은 유사한 측쇄 변형을 갖는 아미노산 잔기의 교환성(interchangeability)을 의미한다. 예를 들어, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 리신, 아르기닌, 및 히스티딘이고; 지방족(aliphatic) - 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린과 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴과 글루타민이고; 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 티로신, 페닐알라닌, 및 트립토판이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다.
특정 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF1을 엔코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다. 다른 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF2를 엔코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 8, 9, 10, 11, 또는 12와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다. 몇몇 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF3을 엔코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다. 아직 추가의 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF4를 엔코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 21과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다.
다른 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF1을 엔코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 또는 57과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다. 특정 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF2를 엔코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 또는 66과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다. 몇몇 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF3를 엔코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 또는 82와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다. 아직 다른 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF4를 엔코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 83 또는 84와 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 동일하다.
ICF 핵산 또는 아미노산 컨센서스 서열(예를 들어, ICF1, ICF2, ICF3, 또는 ICF4에 상응하는 서열)은 사람 생식선 서열 또는 성숙(즉, 재배열된) 항체 서열에 기초하여 사람에 대해 결정될 수 있다. ICF 핵산 또는 아미노산 컨센서스 서열은 또한, 적절한 생식선 서열을 이용하면서, 다음 비제한적인 일예들, 예컨대, 개과 동물, 고양이과 동물, 양, 말, 소, 돼지, 닭, 염소, 연어, 및 하이브리도마 세포주에 대해 결정될 수 있다.
본 발명은 위에 기재된 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터 생성된 항체 조합물을 제공한다. 본 발명에 따라서, 공지 항체로부터의 임의의 CDR(예를 들어, 표 5-6에 제시된 그러한 것들)이 표 1-4의 ICF와 같은 ICF와 결합될 수 있다. 또한, 이들은 추가로 불변 도메인(CD)(예를 들어, 표 7-8에 도시된 그러한 것들)과 결합되어 전장-길이 중쇄 가변 영역 폴리펩티드 또는 전장 길이 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 이들 폴리펩티드는 Ig를 생성시키기 위해 후속하여 결합될 수 있는데, 여기서 상기 Ig는 하기 비제한적 항체의 일예에 대한 기능 단위로서 역할할 수 있다: 단일 쇄 항체, 2가 항체(예컨대, 이황화결합으로 연결된 항체), Fab 단편, 및 단일 쇄 Fv.
면역글로불린 단편은 단백질가수 분해에 의해 생성될 수 있으며 면역글로불린에서 구조/기능 관계를 밝히는데 매우 유용한 것으로 입증되었다. Ig 단편은 항원 결합 부위를 형성하기 위해 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합물을 포함할 수 있다. 항체 단편은, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, 및 Fd' 단편을 포함한다.
예를 들어, Fab 단편은 파파인 분해로 생성될 수 있는데, 여기서 상기 효소는 H-H 쇄간 이황화결합 앞의 힌지 영역에서 면역글로불린 분자를 쪼갠다. 이것은 결과적으로 경쇄 및 중쇄의 VH와 CH1 도메인을 함유하고 추가적으로 항체의 항원 결합 부위를 포함하는 2개의 동일한 단편의 형성을 초래한다. 각각의 Fab 단편은 1가(monovalent)인 반면, 본래 분자는 2가(divalent)이다. Fc 단편은, 예를 들어, 파파잉 분해에 의해 생성될 수도 있다. 이 효소는 각각 CH2와 CH3 도메인을 함유하는 2개의 중쇄의 나머지를 함유한 단편을 생성시킬 수 있다.
펩신으로 면역글로불린의 처리는 결과적으로 두 항원 결합 부위를 함유하는 단편을 야기시키는 H-H 쇄간 이황화결합 뒤의 중쇄의 절단을 초래한다. 펩신 분해로 생성된 이 2가 단편은 F(ab')2로 지칭된다. 이 분자의 Fc 영역은 펩신에 의해 작은 펩티드로 분해된다. F(ab')2 단편은 이의 항원에 결합할 수 있으나 항체의 이펙터 기능을 일반적으로 매개하지 못한다.
조성물
본 발명의 화합물(예를 들어, 본 명세서에 기재된 화합물) 각각은 허용가능한 담체 또는 부형제와 조합될 때, 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)로 사용될 수 있다. 이러한 본 발명의 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)은 피검체를 치료하기 위하여 생체내에서(in vivo) 또는 생체외에서(ex vivo) 피검체에게 투여하거나 시험관내 또는 생체내 분석에 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 활성 성분(들)과 더불어, 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 버퍼, 안정화제 또는 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다. 일 양상에서, 이들 물질은 무독독성이고 활성 성분의 효능을 방해하지 않는다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 제형 및 투여 경로에 좌우될 수 있다.
본 발명의 약제학적 제형은 본 발명의 단백질, 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 확인된 것과 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편)은, 예를 들어, 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로, 예를 들어, 요망되는 순도를 지니는 단백질과 선택적인 생리학적으로 허용되는 임의의 담체, 부형제 또는 안정화제를 혼합함으로써 저장용으로 제조될 수 있다(예를 들어, 하기 문헌 참조: Remington's Pharmaceutical Sciences (최신판), 또는 제 16판, Osol, A. Ed. (1980)). 대안적인 구체예에서, 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 채택된 투여량(dosages)과 농도에서, 수령체(예를 들어, 사람 환자)에게 무독한 그러한 것들이며, 버퍼, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코브산과 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메쏘늄 클로라이드; 벤잘코니움 클로라이드, 벤제쏘니움 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 똔느 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로오스, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 무독성 계면활성제, 예컨대, TWEEN®, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.
대안적인 구체예에서, 허용가능한 담체는 투여받는 개체(예를 들어, 사람 환자)에게 생리학적으로 허용가능하며 이것과 함께/이것 중에 투여되는 화합물의 치료학적 특성을 유지시킨다. 허용가능한 담체 및 이들의 제형은 일반적으로, 예를 들어, 문헌[Remington' pharmaceutical Sciences(최신판)(또한 개정 제18판, A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990)을 참조]에 기재되어 있다. 일 양상에서, 대표적인 담체는 생리 식염수이다.
본 발명을 실시하기 위해 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"는 한 장기, 또는 신체 일부분의 투여 부위로부터 또 다른 장기, 또는 신체 일부로, 또는 생체외 또는 시험관내 검정 시스템내로 대상 화합물을 운반 또는 수송하는데 관여하는, 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대, 액체 또는 고체 충진제(filler), 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화(encapsulating) 물질을 포함할 수 있다. 대안적인 구체예에서, 각각의 담체는 제형의 다른 성분들과 양립가능하며 이것을 투여받는 피검체에 해롭지 않다는 의미로 허용가능하다. 대안적인 구체예에서, 허용가능한 담체는 대상 화합물의 특이 활성을 변형시키지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물 또는 약제학적 제형은 피검체에서 약제학적 사용에 적합한 조성물을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물과 제형은 소정 분량의 본 발명의 화합물과 약제학적으로 또는 생리적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물 또는 약제학적 제형)은 특정 투여 경로(즉, 전신 또는 경구)와 양립되도록 제형화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 조성물은, 필요한 경우, 조성물내의 화합물의 안정성을 개선시키고/거나 조성물의 방출 속도를 조절하기 위해서 허용가능한 첨가제(additive)를 추가로 포함할 수 있다. 허용가능한 첨가제는 대상 화합물의 특이 활성을 변형시키지 않는다. 대표적인 허용가능한 첨가제는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 당, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 글루코오스, 자일리톨, 트레할로오스, 소르보오스, 수크로오스, 갈락토오스, 덱스트란, 덱스트로오스, 프룩토오스, 락토오스 및 이들의 혼합물을 포함한다. 허용가능한 첨가제는 덱스트로오스와 같은 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 화합될 수 있다. 대안적으로, 대표적인 허용가능한 첨가제는펩티드의 안정성을 증가시키고 용액의 겔화(gelling)를 감소시키기 위해, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 계면활성제는 조성물에 용액의 0.01% 내지 5%의 분량으로 첨가될 수 있다. 그러한 허용가능한 첨가제의 첨가는 저장시 조성물의 안정성 및 반감기를 증가시킨다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 주사로 투여될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 주사용 조성물은 수성 용액(물에 용해될 수 있음) 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 대안적인 구체예에서, 정맥 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수(bacteriostatic water), CREMOPHOR EL™(BASF, Parsippany, NJ.) 또는 인산 완충 염수(PBS)를 포함한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적당한 혼합물을 함유하는, 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코딩의 사용에 의해, 분산액의 경우 요망되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
항박테리아 및 항진균제는, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코브산 및 티메로살(thimerosal)을 포함할 수 있다. 등장제, 예를 들어, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨이 조성물에 포함될 수 있다. 그 결과 얻어진 용액은 있는 그대로 또는 동결건조하여 사용하기 위해 패키지될 수 있다; 동결건조된 제조물은 투여에 앞서 멸균 용액과 나중에 화합될 수 있다.
정맥내 주사 또는 통증 부위에 주사의 경우, 활성 성분은 무-피로겐(pyrogen-free)이고 적당한 pH, 등장도(isotonicity) 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수성 용액의 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대, 염화나트륨 주사(Sodium Chloride Injection), 링거주사, 락테이트화된 링거주사를 사용하여 적당한 용액을 포함할 수 있다(당업계의 통상의 기술자는 잘 준비할 수 있다). 보존제, 안정화제, 버퍼, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 멸균 주사가능 용액은 적절한 용매 중에 필요한 양으로 활성 성분과 필요에 따라 위에 열거된 하나 이상의 성분들의 조합물과 통합시키고, 후속하여 여과 멸균킴으로써 제조될 수 있다. 일 양상에서, 분산액은 활성성분을 염기성 매질 및 위에 열거된 것들로부터의 요망되는 다른 성분들을 함유한 멸균 비히클로 통합시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 대안적인 제조 방법은 진공 건조와 동결 건조인데, 이는 활성 성분과 더불어 이의 사전 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 요망되는 추가 성분의 분말을 양산한다.
조성물은, 예를 들어, 단위 용량의 주사에 의해, 정맥내로 관용적으로 투여될 수 있다. 주사의 경우, 활성 성분은 실질적으로 무-피로겐이며 적당한 pH, 등장도 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수성 용액의 형태로 존재할 수 있다. 통상의 기술자는, 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대, 염화나트륨 주사, 링거 주사, 락테이트화된 링거 주사를 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 버퍼, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가, 필요에 따라, 포함될 수 있다. 추가적으로, 조성물은 에어로졸화(aerosolization)를 통해 투여될 수 있다. (Lahn et al., Aerosolized Anti-T-cell-Receptor Antibodies Are Effective against Airway Inflammation and Hyperreactivity, Int. Arch. Allegery Immune, 134: 49-55 (2004)).
한 구체예는 본 명세서에 기재된 질병, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위해 본 명세서에 기재된 조성물의 사용을 고려한다. 약제는 치료가 필요한 환자/피검체의 육체적 특성에 기초하여 제형화될 수 있고, 상기 병태, 질환 또는 장애의 단계에 기초하여 단일 또는 복수 제혀으로 제형화될 수 있다. 약제는 병원과 클리닉에 분배을 위한 적절한 라벨과 함께 적합한 패키지로 포장될 수 있는데, 여기서 상기 라벨은 본 명세서에 기재된 질환을 지니는 피검체의 치료에 관한 표시(indication)를 위한 것이다.
치료
일 양상에서, 본 발명의 폴리펩티드는, 결합후 내화(internalization)되지 않고 세포 표면으로부터 떨어져 나오지 않는, B-세포 전구체와 성숙 B-세포 상의 막관통 표면 항원, CD20에 특이적으로 결합할 수 있다. CD20은 또한 매우 다양한 질환에 관여하는 높은 비율의 B-세포에서 발현된다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 발암성(tumorigenic) 장애, 예를 들어, B 세포 림프종(예를 들어, NHL)을 포함하는 CD20을 발현하는 종양 세포의 존재에 의해 특징지워지는 장애를 지니는 피검체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
대안적인 양상에서, 본 밤령이 조성물, 본 발명의 방법은, 질환 또는 질병을 "억제,", "개선", "처치," 및/또는 "치료"하기 위해 사용되며, 이들 용어는 상호교환되어 사용될 수 있으며, 예를 들어, 증상의 정지, 생존의 연장, 증상의 부분적 또는 완전한 개선, 및 질병, 질환 또는 장애의 부분적 또는 완전한 근절을 지칭할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 B-세포 매개 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일 양상에서, 본 발명의 "치료"는 면역 반응의 억제 또는 폐기를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 B-세포 매개 면역 반응을 억제 또는 폐기시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 암성 세포, 성장, 또는 종양의 정체, 부분적 또는 완전한 제거를 포함하는, 암의 치료에 사용될 수 있다. 대안적인 양상에서, 치료 또는 부분적 제거는, 예를 들어, 세포, 성장 또는 암 크기 및/또는 부피에서의 배수(fold) 감소, 예컨대, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배, 약 50배, 또는 이들 사이의 임의의 배수 감소를 포함한다. 대안적인 양상에서, 치료 또는 부분적 제거는 세포, 성장 또는 암 크기 및/또는 부피에서의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%의 백분율 감소 또는 이들 사이의 임의의 백분율 감소를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 또는 방법을 사용하여 치료되고/거나 예방될 수 있는 종양성 질환의 일예는 전구체 B 세포 림프구성 백혈병/림프종 및 성숙 B 세포 신생물(neoplasms), 예컨대, B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소 림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종(lymphoplasmacytic lymphoma), 맨틀 세포 림프종(MCL), 여포성 림프종(FL)(저급, 중급 및 고급 FL을 포함함), 피부 여포 중심 림프종(cutaneous follicle center lymphoma), 변연부 B 세포 림프종(MALT형, 결절형 및 비장형), 모발상 세포 림프종, 확산성 거대 B 세포 림프종, 버킷(Burkitt) 림프종, 형질세포종, 혈장 세포 골수종, 이식후 림프구증식성 장애, 발덴스트롬(Waldenstrom) 매크로글로불린혈증(macroglobulinemia), 및 역행성 거대-세포 림프종(anaplastic large-cell lymphoma, ALCL)을 포함하는, B 세포 림프종(예를 들어, NHL)을 포함한다.
본 발명의 조성물 또는 방법을 사용하여 치료되고/거나 예방될 수 있는 B 세포 비-호치킨 림프종의 추가 일예는 림프종모양 육아종증(lymphomatoid granulomatosis), 원발성삼출성림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 종격동거대B세포림프종, 중쇄 질환(감마, 뮤, 및 알파 질환을 포함함), 면역억제제로의 치료법에 의해 유발된 림프종, 예컨대, 시클로스포린-유도성 림프종, 및 메토트렉세이트-유도성 림프종이다.
본 발명의 조성물 또는 방법을 사용하여 치료되고/거나 예방될 수 있는 CD20을 발현하는 B 세포가 관련된 면역 장애의 일예는 자가면역 장애, 예컨대, 건선, 건선성 관절염, 피부염, 전신성 경피증 및 경화증, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 호흡 곤란 증후군, 수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체신염, 습진, 천식, 죽상동맥경화증, 백혈구 부착 결핍증(leukocyte adhesion deficiency), 다발성 경화증, 레이노증후군(Raynaud's syndrome), 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome), 소아 발병형 당뇨병(juvenile onset diabetes), 라이터 증후군(Reiter's disease), 베체트 질환(Behcet's disease), 면역 복합체 신장염(immune complex nephritis), IgA 신병증(nephropathy), IgM 다발신경병증(polyneuropathies), 면역 매개 용혈빈혈(immune-mediated thrombocytopenias), 급성 특발성 혈소판 감소성 자반병(acute idiopathic thrombocytopenic purpura) 및 만성 특발성 혈소판 감소성 자반병, 용혈성 빈혈(hemolytic anemia), 중증근무력증(myasthenia gravis), 루푸스 신염(lupus nephritis), 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis, RA), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 천포창(pemphigus), 그레이브병(Graves' disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 오멘 증후군(Omenn's syndrome), 만성 신부전, 급성 감염성 단핵세포증(acute infectious mononucleosis), HIV, 및 헤르페스 바이러스 관련 질환을 포함한다. 추가 일예는 극심한 급성 호흡 곤란 증후군과 맹락망막염(choreoretinitis)이다.
대안적인 양상에서, 본 발명의 조성물 또는 방법을 사용하여 치료되고/거나 예방될 수 있는 다른 질환 및 장애는 바이러스, 예컨대, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV)에 의한 B-세포의 감염에 의해 초래되거나 이에 의해 매개되는 그러한 질환 및 장애이다.
표 5. 나열된 항체의 가변 중쇄 ( V H ) 및 가변 경쇄(Vκ 또는 Vλ)의 CDR 단편에 관한 대표적인 핵산 서열.
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표 6. 나열된 항체의 가변 중쇄 ( V H ) 및 가변 경쇄(Vκ 또는 Vλ)의 CDR 단편에 관한 대표적인 아미노산 서열.
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표 7. Ig 중쇄 및 κ 경쇄의 대표적인 불변 도메인( CD )의 아미노산 서열.
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Figure pat00029
표 8. Ig 중쇄 및 κ 경쇄의 대표적인 불변 도메인( CD )의 핵산 서열.
Figure pat00030
표 5 내지 8에 나열된 서열 이외에, 다른 CDR(밑줄) 및 불변 영역(이중 밑줄 또는 노란색으로 강조(yellow-highlighted))이 도 24, 32, 33, 34, 36, 38, 39, 42에, 또, 실시예 3 내지 6에 개시된 본래 및 조립된 HuFR 서열로 제공된다.
대표적인 항체
대안적인 구체예에서, 본 발명의 조성물, 예를 들어, 본 발명의 키메라 및/또는 재조합 항체는 CD20에 특이적으로 결합하며, CD20은 B 세포의 표면에 발현되는 비당화된(unglycosylated) 인단백질이고 B-세포 마커로 역할한다. CD20은 막관통 칼슘 전도(conductance)의 조절자로서 역할하며 B 세포 활성화와 증식에 소정 역할을 하는 것으로 일컬어진다. 본 발명의 일 양상에서, 진핵생물 세포(예를 들어, B 세포)의 표면 단백질에 유도되는, 사람과 더 유사한 가변 영역을 함유하는 항체가 생성될 수 있다. 일 구체예에서, 항-CD20 항체의 CDR을 함유하는 본 발명의 재조합 중쇄 가변 영역 폴리펩티드와 재조합 경쇄 가변 영역 폴리펩티드가 특성에 있어서 더 사람과 가까운 가변 영역을 지니는 항체를 형성시키는데 사용된다. 예를 들어, 항체는 CD20 항원에 결합한다. 일 구체예에서, 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 43, 44, 45, 46, 47, 38, 또는 49의 아미노산 서열을 포함하는 ICF1; 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 58, 59, 60, 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 ICF2; 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 서열번호 67-71, 73, 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 ICF3; 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 ICF4를 포함한다. 다른 구체예에서, 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 ICF1; 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 9, 10, 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 ICF2; 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 서열번호 13, 17, 19, 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 ICF3; 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 ICF4를 포함한다.
CD3는 T-세포 수용체 복합체의 구성원이다. 이것은 T 세포에 특이적인 표면 마커이고, 그에 따라, T 세포를 특이적으로 확인하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따라, 진핵생물 세포(예를 들어, T 세포)의 표면 단백질에 유도되는, 사람과 더 유사한 가변 영역을 함유하는 항체가 생성될 수 있다. 일 구체예에서, 항-CD3 항체의 CDR을 함유하는 본 발명의 재조합 중쇄 가변 영역 폴리펩티드와 재조합 경쇄 가변 영역 폴리펩티드가 특성에 있어서 사람과 더 가까운 가변 영역을 지니는 항체를 형성하는데 사용된다. 예를 들어, 항체는 CD3 항원에 결합한다. 일 구체예에서, 항체의 경쇄 가변 영역은 서열번호 43-46, 또는 49의 아미노산 서열을 포함하는 ICF1; 서열번호 169의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 58, 59, 또는 60의 아미노산 서열을 포함하는 ICF2; 서열번호 170의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 서열번호 68-69,72, 73, 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 ICF3; 서열번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 ICF4를 포함한다. 추가 구체예에서, 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 3, 7, 또는 181의 아미노산 서열을 포함하는 ICF1; 서열번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; 서열번호 9 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 ICF2; 서열번호 158의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 서열번호 15, 16, 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 ICF3; 서열번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 ICF4를 포함한다.
핵산
일 구체예에서, 독립적으로 컨센서스된 중쇄 가변 영역 도메인 ICF 1, 2, 및 3를 엔코딩하는 본 발명의 핵산 서열이 공지 면역글로불린 중쇄 가변 영역(예컨대, 항-CD20, 항-CD3의 중쇄 가변 영역)의 상보성 결정 영역 1, 2, 및 3 을 엔코딩하는 서열과 더불어 제공된다. 또 다른 구체예에서, 독립적으로 컨센서스된 경쇄 가변 영역 도메인 ICF 1, 2, 및 3을 엔코딩하는 본 발명의 핵산 서열이 공지 면역글로불린 경쇄 가변 영역(예컨대, 항-CD20, 항-CD3의 경쇄 가변 영역)의 상보성 결정 영역 1, 2, 및 3 을 엔코딩하는 서열과 더불어 제공된다. 추가 구체예에서, 독립적으로 컨센서스된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 도메인 ICF4를 엔코딩하는 핵산 서열이 추가적으로 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 중쇄 가변 영역 ICF 1, 2, 3, 및 4 도메인과 경쇄 가변 영역 ICF 1, 2, 3, 및 4 도메인은 표 2와 4에 나열된 서열번호를 지닌다. 공지 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 CDR 1, 2, 및 3에 상응하는 핵산 서열은 표 5에서 확인된다.
위에서 제공된 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 ICF 도메인과 CDR을 엔코딩하는 핵산은 5'에서 3'으로 융합되며, 단일 핵산 분자의 이종성 집단을 생성하는 핵산을 형성한다. 한 구체예에서, 중쇄 가변 영역 ICF 도메인 및 CDR을 엔코딩하는 핵산은 하기 순서로 5'에서 3' 방향으로 융합된다: ICF1을 엔코딩하는 핵산; CDR1을 엔코딩하는 핵산; ICF2를 엔코딩하는 핵산; CDR2를 엔코딩하는 핵산; ICF3를 엔코딩하는 핵산; CDR3를 엔코딩하는 핵산. 또 다른 구체예에서, 경쇄 가변 영역 ICF 도메인과 CDR을 엔코딩하는 핵산은 하기 순서로 5'에서 3' 방향으로 융합된다: ICF1을 엔코딩하는 핵산; CDR1을 엔코딩하는 핵산; ICF2를 엔코딩하는 핵산; CDR2를 엔코딩하는 핵산; ICF3를 엔코딩하는 핵산; CDR3를 엔코딩하는 핵산. 추가 구체예에서, 중쇄와 경쇄 가변 영역 도메인 ICF4를 엔코딩하는 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 중쇄 또는 경쇄 CDR3의 C-말단에 융합된다. 예를 들어, 본 발명의 중쇄 가변 영역 ICF 1, 2, 3, 및 4 도메인과 경쇄 가변 영역 ICF 1, 2, 3, 및 4 도메인은 표 2와 4에 나열된 서열번호를 갖는다. 공지 면역글로불린 중쇄 가변 영역의 CDR 1, 2, 및 3에 대응하는 핵산 서열은 표 5에서 확인된다.
HuFR에 의해 획득된 Ig 쇄는 미국 특허 제6,171,820호, 제6,537,776호, 제6,562,594호, 제6,605,449호, 및 제6,764,835호에 기재된 것과 같은, Gene Site Saturation Mutagenesis(GSSM™) 또는 Synthetic Ligation Reassembly(SLR 또는 GeneReassembly™) 혁신 방법을 사용하여 요망되는 특성을 위해 추가로 변형될 수 있다.
벡터
중쇄 또는 경쇄 가변 영역 분자가 일단 생성되면, 이후 이것은 플라스미드로 클로닝되고 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 발현시키기 위해 세포로 형질변환될 수 있다. 일 구체예에서, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 폴리펩티드 유전자를 운반하는 플라스미드는 E. coli에서 증폭되고 전장-길이 면역글로불린의 생산을 위한 포유동물 세포로 트랜스펙션되었다.
발현 벡터(작제물), 예컨대, 플라스미드가 도입된, 배양에 적합한 세포는 번식할 수 있다. 발현 벡터 작제물은 트랜스펙션, 리포펙션, 형질변환, 주입, 전자천공(electroporation), 또는 감염에 의해 도입될 수 있다. 발현 벡터는 배양 과정에서 발현 및 생산을 위한 단백질을 엔코딩하는, 코딩 서열, 또는 이의 일부분을 함유할 수 있다. 그러한 발현 벡터는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위한 요망되는 성분들을 포함할 수 있다. 생산되는 단백질과 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 비롯한 적절한 전사 및 번역 조절 엘리먼트를 함유한 발현 벡터는 널리 알려져 있고 당업계의 통상이 기술자에 의해 실행되는 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함하는데, 이러한 기술은 문헌[J. Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y. 및 F. M. Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y.]에 기재되어 있다. 활용될 수 있는 방법 및 도구의 유형에 대한 더 상세한 설명은 하기에 제공되어 있다.
표준 분자 생물학 프로토콜에 의해 획득된 클론은 요망되는 생성물의 발현을 위하여 적합한 숙주 세포, 예컨대, 포유동물 세포로 트랜스펙션될 수 있다. 트랜스펙션 기술은 활용되는 숙주 세포를 위해 적절한 당업계에 확립된 표준 기술을 사용하여 수행된다. 예를 들어, 포유동물 세포 트랜스펙션은 리포펙션, 원형질체 융합, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, CaPO4 동시-침전(co-precipitation), 전자천공, 직접 미세주입(direct microinjection)을 하기한 것들을 포함할 수 있는 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 수행될 수 있다: 스크레이핑(scraping), 직접 흡수(direct uptake), 삼투압 또는 수크로오스 충격, 리소자임 융합 또는 적혈구 융합, 간접 미세주입, 예컨대, 적혈구-매개 기술, 및/또는 숙주 세포가 전기 전류를 겪게함.
발현
다세포 유기체(예를 들어, 포유동물 기원)에서 유래된 진핵생물 숙주 세포에서의 관심있는 단백질을 엔코딩하는 DNA의 발현(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 폴리펩티드, 당단백질, 예컨대, Ig)은 본 발명의 정황에서 활용될 수 있다(Tissue Cultures, (1973) Academic Press, Cruz and Patterson, Eds.). 다세포 유기체에서 유래된 숙주 세포는 인트론을 스플라이스 아웃(splice out)시키는 능력을 가지며 이에 따라 직접적으로 게놈 DNA 단편을 발현시키는데 사용될 수 있다. 관심있는 단백질의 수용(harboring), 발현 및 분비시킬 수 있는 유용한 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 예컨대, CHO-K1(ATCC CCL-61), DG44(Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet, 12:555-556; Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909; 및 WO 01/92337 A2), 디히드로폴레이트 리덕타제 음성 CHO 세포(CHO/dhfr-, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 77:4216), 및 dp12.CHO 세포(미국 특허 제5,721,121호); SV40에 의해 형질변환된 원숭이 신장 CV1 세포(COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); 사람 태아 신장 세포(예를 들어, 293 세포, 또는 현탁 배지에서 성장을 위해 서브클론된 293 세포(Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL-IO); 원숭이 신장 세포(CV1, ATCC CCL-70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); 마우스 세로톨리(Sertoli) 세포(TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251); 사람 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL-2); 개의 신장 세포(MDCK, ATCC CCL-34); 사람 폐 세포(W138, ATCC CCL-75); 사람 간암 세포(HEP-G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562, ATCC CCL-51); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL-1442); TRI 세포(Mather, 1982, Annals NY Acad. ScL, 383:44-68); MCR 5 세포; FS4 세포를 포함한다.
포유동물 세포와 같은, 진핵생물 세포용 발현 벡터는 당업계에 잘 확립된 포유동물 세포와 호환가능한 프로모터와 조절 서열을 포함할 수 있다. 일부 조절 엘리먼트는, 예를 들어, 다양한 발현 벡터에서 발견된 CMV 프로모터 또는 조류 육종 바이러스(ASV) 프로모터일 수 있다. 일반적으로 사용되는 기타 초기 및 후기 프로모터는 시미안 바이러스 40(SV 40)에서 유래된 프로모터(Fiers, et al., (1973) Nature 273:113), 또는 다른 바이러스 프로모터, 예컨대, 우 유두종(bovine papilloma), 폴리오마(polyoma), 및 아데노바이러스 2 바이러스에서 유래된 프로모터를 포함한다. 당업계에 공지된 다른 것들 중에서, 조절 프로모터, hMTII(Karin, et al., 1982, Nature 299:797-802)가 또한 사용될 수 있다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, SF9 세포)에서의 재조합 단백질 발현을 위해, 몇몇 가용한 배큐올로바이러스(baculovirus) 벡터는 pVL 시리즈(Lucklow, V. A., and Summers, M. D., 1989, Virology 170:31-39)와 pAc 시리즈(Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165)를 포함한다. 당업계의 통상의 기술자는 또한 인헨서 영역(논코딩 DNA 영역내의 프로모터 영역의 상류 또는 하류에서 발견되는 그러한 서열)이 또한 발현을 개선시키는데 중요하다. 필요한 경우, 예를 들어, 플라스미드 DNA의 도입을 위해 원핵생물 숙주를 활용하는 경우, 복제 기점이 바이러스 공급원으로부터 채용될 수 있다.
숙주 세포
대안적인 구체예에서, 포유동물 숙주 세포 이외에, 다른 진핵생물 유기체가 또한 관심있는 단백질(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, Ig와 같은 당단백질을 포함하는, 본 발명의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 폴리펩티드)을 발현시키기 위해 숙주로서 사용될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 분열 효모 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은, 다른 효모 균주를 비롯한 출아 효모 사카로미세스 세래비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 실험실 균주(strains)가 사용될 수 있다. 관심있는 단백질(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드)를 엔코딩하는 DNA를 수용한 효모 벡터는 2μ 복제 기점(Broach et al., (1983) Meth. Enz. 101:307), 또는 효모와 호환가능한 다른 복제 기점(예를 들어, 하기 문헌 참조: Stinchcomb et al., 1979, Nature 282:39; Tschempe et al., 1980, Gene 10:157; 및 Clarke et al., 1983, Meth. Enz. 101:300)을 활용할 수 있다. 효모 벡터내에 포함된 조절 엘리먼트는 해당(glycolytic) 효소의 합성을 위한 프로모터일 수 있다(Hess et al., 1968, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland et al., 1978, Biochemistry 17:4900). 또한 당업계의 통상의 기술자는 다른 프로모터를 활용할 수 있는데, 여기서 성장 조건은 조절 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 포유동물 발현 시스템과 유사하게, 효모 발현 벡터내 터미네이터 서열이 코딩 서열의 3' 말단에 요망될 수 있고 효모-유래 유전자내의 개방해독틀 다음의 3' 비번역 영역에서 발견된다. 본 발명의 재조합 단백질, 예를 들어, 본 발명의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 폴리펩티드, 당단백질, 예컨대, Ig은 또한 곤충 세포에서 발현될 수 있다(예를 들어, 배큐올로바이러스 벡터를 사용).
다양한 배양 파라미터가 배양되는 숙주 세포와 관련하여 사용될 수 있다. 포유동물 세포에 관한 적절한 배양 조건은 당업계에 널리 알려져 있거나(Cleveland et al., (1983) J. Immunol. Methods, 56: 221-234) 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있고(예를 들어, Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., (1992) Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. (Oxford University Press: New York,) 참조), 선택된 특정 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다. 시중에서 구입할 수 있는 배지가 사용될 수 있으며, 예를 들어, 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium(MEM), Sigma, St. Louis, Mo.); 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagles Medium(DMEM), Sigma); 햅의 F10 배지(Ham's FlO Medium, Sigma); 하이클론(HyClone) 세포 배양 배지(HyClone, Logan, Utah); RPMI-1640 배지(Sigma); 및 특정 세포 유형에 대해 포뮬레이션되는, 화학적으로 규정된(chemically-defined, CD) 배지, 예를 들어, CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)를 포함한다. 이들 배지들 중 임의의 배지에는, 필요에 따라 또는 요망시에, 적절한 농도 또는 양으로, 앞서 정의된 보충 성분 또는 요소(ingredients)(임의 성분을 포함함)가 필요에 따라 보충될 수 있다.
당단백질, 면역글로불린을 포함하는, 관심있는 단백질(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드)은 다양한 세포 배양 조건하에서 요망되는 단백질 생성물을 발현하는 세포를 성장시킴으로써 생산될 수 있다. 당업계의 통상의 기술자는 단백질 생산을 위한 세포 배양과 배양 흐름(runs)이 다음 3가지 일반적인 유형을 포함할 수 있음을 이해할 것이다: 연속 배양, 회분 배양(batch culture), 및 유가 배양(fed-batch culture). 일 양상에서, 연속 배양 과정, 신선한 배양 배지 보충(예를 들어, 피딩(feeding) 배지)가 배양 기간 동안 세포에 공급되는 한편, 오래된 배양 배지는 제거된다. 연속 배양 동안 생산된 생성물은 또한, 예를 들어, 일단위로 또는 연속적으로, 수확될 수 있다. 세포가 살아 있고, 환경적 조건과 배양 조건이 유지되는한, 세포는 연속 배양 과정에서 원하는 만큼 긴 시간 동안 배양시 유지될 수 있다.
관심있는 단백질(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드)를 생산하는 배양의 세포는 특정 포유동물 숙주 세포와 고려된 특정 생산 계획에 가장 적합한 임의의 계획(scheme) 또는 일과(routine)에 따라 증식(propagation)될 수 있다. 세포 배양 조건은 팽창과 성장에 최적화된 시간의 기간 동안 세포 배양의 성장기로 포유동물 숙주 세포의 팽창 또는 성장을 증강시키기 위해 개발될 수 있다. 또한, 세포 배양 조건은 소정 시간의 기간 동안 세포 배양의 생산기 동안 단백질 생산을 향상시키기 위해 개발될 수 있다. 사용될 수 있는 배양 조건, 예컨대, 온도, pH, 용존 산소(DO2)는 당업계의 통상의 기술자에 의해 이해되는 포유동물 숙주 세포 배양시에 사용되는 배양 조건이다. 포유동물 숙주 세포, 예컨대, CHO 세포를 배양하기 위한 적절한 온도 범위는 30 내지 40℃이고, 일 구체예에서, 약 37℃이다. pH는 일반적으로 산 또는 염기를 사용하여 약 6.5와 7.5 사이의 수준으로 조정된다. 적합한 DO2는 5-90%의 공기 포화이다. 이러한 배양 조건은 관심있는 요망되는 단백질을 생산하는 포유동물 세포의 배양을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
항체 제조 방법
본 발명은 감소된 면역원성을 지니며 항원에 특이적인 항체를 제조하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 상기 항체는 ICF를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이 콜렉션을 제조하기 위한 방법은 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 폴리펩티드를 생산하는 세포내에서 발현된 (상기로부터의) 중쇄 및 경쇄 핵산의 조합 라이브러리를 제공하는 단계(여기서 상기 가변 영역은 ICF를 포함함), 및 감소된 면역원성을 지니며 항원에 결합하는 항체를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 핵산의 조합 라이브러리는 둘다 당업계에서 확립된 방법에 따라 세포내로 트랜스펙션될 수 있으며, 그에 따라 세포에 의해 발현된 두 콜렉션을 갖는다. 이것은 경쇄 및 중쇄가 세포 내부에서 재조합될 수 있도록 할 것이며, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결합 친화력 및/또는 감소된 면역원성에 대해 스크리닝될 수 있는 항체가 제조된다.
또 다른 구체예에서, 중쇄의 조합 라이브러리는 제 1 세포군내에 존재할 수 있고 경쇄의 조합 라이브러리는 제 2 세포군에 존재할 수 있다. 발현과 스크리닝을 분리시키는데 적합한 방법은 2006년 10월 4일에 출원된, 미국 특허 출원 제60/849,597호에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 통합된다.
*조합 라이브러리
본 발명은 ICF를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 핵산의 조합 라이브러르를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 이 콜렉션을 제조하기 위한 방법은 ICF를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 핵산을 제공하는 단계, 5'에서 3' 방향으로 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 엔코딩하는 핵산을 연결시키는 단계, 및 세포내에서 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 방법은 중쇄 가변 영역의 핵산(또는 이들에 의해 엔코딩된 아미노산 서열)의 조합 라이브러리를 제공한다. 표 G는 조합 라이브러리에서 사용될 수 있는, ICF1, 2, 3 및 4의 세트의 일예를 보여준다.
표 G. 조합 중쇄 라이브러리를 제조하기 위한 ICF 의 대표적인 세트
Figure pat00031
표 G의 ICF의 4개 세트를 사용하여 결과적으로 총 280개 중쇄 조합(7 ICF1 x 5 ICF2 x 8 ICF3 x 1 ICF4)이 얻어질 수 있다.
상응하는 경쇄 라이브러리의 경우, 표 H의 ICF 세트가 사용될 수 있는 ICF의 일예이다.
표 H. 조합 경쇄 라이브러리를 제조하기 위한 ICF 의 대표적인 세트
Figure pat00032
따라서, 224개 카파 쇄(7 x 4 x 8 x 1) 또는 320개(8 x 5 x 8 x 1) 람다 쇄의 조합 라이브러리가 이들 세트로부터 획득될 수 있다.
본 발명의 조합 라이브러리는 ICF의 다른 세트로부터 조립될 수 있다. 예를 들어, 감소된 라이브러리는, 예를 들어, 동일한 지정 번호(VK1_2 + VK1_2_3 + VKl + VK1 또는 VK6_VK4_5_6 + VK6 + VK1)를 갖는 ICF1, ICF2, 및 ICF3를 결합시키고, 그에 따라, 감소된, 그러나 대표적인 8개 카파 쇄의 세트를 획득함으로써 제조될 수 있다. 다른 라이브러리는 표 1 내지 4에 제공된 것과 같은, ICF를 또 다른 ICF로 대체함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 라이브러리에 관한 ICF1의 세트를 선택할 때, GL2가 (a) 생략되거나, (b) 표 1 또는 실시예에 나열된 GL2a, GL2b 또는 다른 ICF1에 의해 대체되거나 (c) 생식선 또는 성숙 항체의 상응하는 서열과 같은, GL2, GL2a, GL2b, 또는 다른 ICF1과 유사한 하나 이상의 서열에 의해 대체될 수 있다.
대안적인 대표적인 구체예
또 다른 구체예에서, HuFR은 하나 이상의 위치지정자 핵산을 포함하는 2 단계 재조립 과정을 포함할 수 있다. 상기 위치지정자는 감소된 경쇄 ICF 세트를 포함할 수 있다. 위치지정자는 또한 가공된, 성숙 항체의 서열(예를 들어, 성숙 항체의 핵산 서열과 가장 유사한 그러한 경쇄 가변 영역생식선 서열)의 핵산 서열 동일성과 대비한 공지 항체 또는 생식선 가변 영역 핵산 서열 동일성에 기초하여 결정될 수 있다. 일단 확인된 경우, 세포내로 트랜스펙션되고 발현된 후, 위치지정자 핵산 서열은 이후 본 발명의 중쇄 가변 영역분자와 커플링될 수 있는 일시적인 단일의 경쇄 분자로서 사용될 수 있다.
요망되는 특성, 예컨대, 항원에 대한 결합하는 특성을 지니는 중쇄 가변 영역 폴리펩티드가 최고의 중쇄이다. 일 구체예에서, 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열은 세포내에서 발현된 경쇄 가변 영역 핵산의 조합 라이브러리와 조합될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항체 클론은, 상기한 바와 같이, 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 항체 클론은 증강된 결합 친화력, 예를 들어, 아폽토시스를 유도하거나 세포 사멸을 매개하는 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
경쇄 유전자는 HC 스크리닝 목적을 위해 위치지정자로서 역할하도록 합성된다. 동일 패밀리(예를 들어, 동일한 본래 생식선 서열에서 유래된 패밀리)에 속하는 FR1, FR2, FR3, 및 FR4로부터의 경쇄 프레임워크의 대표적인 서열이 획득되었으며 위치지정자 경쇄 유전자로서 활용되었다. 8개의 카파 프레임워크 영역 패밀리와 8개의 람다 프레임워크 영역의 패밀리가 선택되었는데, 이 패밀리들은 스크리닝용으로 생성될 수 있는 8개의 잠재적인 카파 또는 람다 라이브러리를 나타낸다.
일단 상기 8개 패밀리 각각에 대해 중쇄 및 위치지정자 경쇄가 생성되면, 생성물 각각은 라이브러리(예를 들어, 총 8개 라이브러리를 가질때까지, 경쇄의 패밀리 1과 함께 생성된 245개의 중쇄; 경쇄의 패밀리 2와 함께 생성된 245개의 중쇄 등)로 연합될 수 있다. 8개 라이브러리 각각(각각은 1개의 생식선 패밀리를 나타냄)으로부터, 총 1960개 항체가 결합 검정(예컨대, ELISA)를 사용하여 스크리닝될 것이다. 따라서, 결국 8개의 라이브러리가 스크리닝된다. 총 15,680개 HC 후보자가 시험될 것이다. 이로부터, 상위(top) 10개의 결합 HC는 일단 위치지정자 경쇄가 제거되고 HuFR 가공의 제 2 단계(phase)에서 결정될 경쇄 가변 영역 핵산의 조합 라이브러리로 대체된 다음 추가로 평가될 것이다.
라이브러리 합성 및 클로닝에 후속하여, 항체 유전자를 운반하는 플라스미드는 E. coli에서 증폭될 수 있고 전장 길이 Ig의 생산을 위해 포유동물 세포내로 트랜스펙션될 수 있다. 그 결과 얻어진 항체 상청액은 이후 아폽토시스 검정에서 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, CD3 항체의 경우, 일차 스크리닝으로부터 선택된 326개 히트(hits)가 존재하였으며, 상위 10개의 중쇄 히트가 선택되었다(실시예 4 참조).
제 2 라운드에서, 아폽토시스 검정에 의해 확인된 상위 10개의 재조립된 중쇄 유전자는 후속하여 HuFR 조합 경쇄 라이브러리로 조합될 수 있다. 이 라이브러리는 대조 항체와 대비하여 동일하거나 개선된 특성을 지니는 변이체의 확인을 위해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, CD3 항체의 경우, 일차 스크리닝으로부터 268개 히트가 존재하였고, 37개의 확정된 히트가 존재하였으며, 상위 10개가 선택되었다. 9개는 성공적으로 리트랜스펙션되었고 확정 검정에서 검정되었다(실시예 4 참조).
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 기술될 것이다; 그러나, 본 발명이 그러한 실시예로 국한되는 것이 아님이 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1: 경쇄 라이브러리에 대한 프레임워크 재조립 단편
본 발명은, 키메라 항원-결합 폴리펩티드를 작제하기 위해 사용될 수 있는, 경쇄 및 중쇄 프레임워크 영역 "단편", 또는 작동 조각(working pieces)의 라이브러리를 제공한다. 하기 실시예는, 키메라 항원-결합 폴리펩티드를 작제하는데 사용될 수 있는, 경쇄 프레임워크 영역 "단편", 또는 작동 조각의 대표적인 라이브러리와 이들을 제조하기 위한 대표적인 방법을 기술한다.
일 양상에서, 프레임워크 단편은 사람 프레임워크 영역(FR), 예를 들어, 하위영역 FR1, FR2, 및 FR3의 서열 다양성을 나타내도록 디자인된다. 이 실시예에서, 단편 라이브러리를 사람 생식선 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL)에 기초하여 작제하였다.
재조립 라이브러리에 관한 프레임워크 영역 단편의 경쇄 람다(V λ )의 디자인
람다-쇄 프레임워크 영역에 관한 서열을 확인하기 위해, 항체 서열의 Kabat 데이터베이스를 사람 생식선 유전자가 성숙한, 기능성 항체로 사용되었는지를 확인하기 위해 참조하였다. 서열 비교 소프트웨어를 사용하여 각각의 성숙 VL에 관한 가장 유사한 생식선 유전자를 확인하였다. 따라서, 유전자는 이들로부터 생겨날 수 있는 성숙 항체의 백분율로 비교될 수 있다. 기능성 전장-길이 서열(도 2-3)에 기초하여, 탑 전장-길이 생식선 서열을 선택하여 개별 FR 영역을 획득하였다.
사람 FR을 대표하는 "컨센서스" 서열을 획득하기 위해, 모든 사람 Vκ 엑손의 서열을 컴파일링하고, 엑손 서열을 FR로 나누었다. FR 서열의 각 세트에 대해 하기 단계들을 수행하였다. FR 서열의 세트를 정렬시키고 서열 유사도에 의해 클러스터링하였다. 각각의 주 FR 클러스터로부터의 서열을 사용하여 컨센서스 서열을 생성시켰으며, 상기 서열은 각각의 서열 위치에서 가장 빈도높계 발생한 아미노산으로 구성되었다. 그 결과 얻어진 서열은 17개 컨센서스 FR1(ICF1으로도 지칭됨), 16개 컨센서스 FR2(ICF2로도 지칭됨), 및 15개 컨센서스 FR3(ICF3로도 지칭됨)이었다. 컨센서스 영역 각각은(예를 들어, ICF1, ICF2, ICF3) 생식선 라이브러리 FR 단편과 52% 이상, 성숙 FR 단편과 65% 이상 동일하였다. FR 컨센서스 서열(예를 들어, ICF1, ICF2, ICF3)을 DNA 서열로 전환시켰다.
이들 ICF의 서브세트는, 요망되는 적용범위(coverage)와 스크리닝 성능에 따라, 선별될 수 있다. 서브세트 단편을 제일 먼저 ICF VK 라이브러리로부터의 독특한 단편을 포함시키는 단계(해당 시간에 사용), 이후 성숙 항체에 의한 이들의 상대적 사용빈도에 일차적으로 기초하고 현재의 라이브러리에 의해 놓쳐진 임의의 서열 공간의 이들의 적용범위에 이차적으로 기초하여 컨센서스 단편을 이 리스트에 보충시키는 단계에 의해 선택하였다.
실시예 2: 중쇄 라이브러리에 관한 프레임워크 재조립 단편
본 발명은 두 경쇄 및 중쇄 ICF에 대한 별개의 라이브러리를 제공한다; 이들 라이브러리는 본 발명의 대표적인 방법을 사용하여 제조되었다. 하기 실시예는, 키메라 항원-결합 폴리펩티드를 작제하기 위해 사용될 수 있는, 중쇄 프레임워크 영역 "단편", 또는 작동 조각(working pieces)의 대표적인 라이브러리와 이들을 제조하기 위한 대표적인 방법을 기술한다.
중쇄 ICF에 관한 별개의 라이브러리를 사람 생식선 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH), 및 천연, 면역학적 성숙 과정을 거친 사람 VH에 기초하여 작제하였다. 임의의 VH는 상보성-결정 영역(CDR)과 FR로 나뉘어질 수 있다. 각각의 FR의 경우, 몇몇 단편을 천연 VH FRS 사이에서 보여지는 다양성을 나타내도록 디자인하였다.
모든 사람 Vκ 엑손의 서열을 컴파일링하고, 엑손 서열을 FR로 나누었다. FR 서열의 각 세트에 대해 하기 단계들을 수행하였다. FR 서열의 세트를 정렬시키고 서열 유사도에 의해 클러스터링하였다. 각각의 주 FR 클러스터로부터의 서열을 사용하여 컨센서스 서열을 생성시켰으며, 상기 서열은 각각의 서열 위치에서 가장 빈도높계 발생한 아미노산으로 구성되었다. 각각의 FR 패밀리 아미노산 컨센서스 서열(예를 들어, ICF1, ICF2, ICF3)을 비편중된 방식으로 코돈으로 역-번역시켰다. 이들 예비(preliminary) 뉴클레오티드 모델을 사람 VH 엑손과 정렬시켜 "천연" 코돈 사용빈도를 결정하였다. 일차 뉴클레오티드 모델과 정렬된 엑손 영역을 사용하여 2차 뉴클레오티드 모델을 생성하였다. 2차 뉴클레오티드 모델을 본래 컨센서스 일차 구조(예를 들어, ICF1, ICF2, ICF3)에 대한 비교를 위해 번역시켰다. 컨센서스 서열(예를 들어, ICF1, ICF2, ICF3)로부터의 돌연변이로 야기된, 2차 모델내 코돈을 컨센서스 서열에서 확인되는 잔기를 코딩하는 사람 코돈으로 대체하였다. FR3는 12개의 대표적인 단편 서열을 지녔다; 한 실험 라이브러리에서, 8개의 단편을 사용하였다. 이들은 상기 12개의 세트와 상기 8개의 세트 사이의 서열 다양성에서의 차이를 최소화하기 위해 선태되었다.
실시예 3: 항- CD20 항체
본 발명은 폴리펩티드 CD20, 예를 들어, 일 구체예에서, 사람 CD20에 특이적으로 결합하는 키메라 폴리펩티드를 제공한다.
사람 CD20에 특이적으로 결합하는 마우스 항체를 확인하였으며, 이들은 대조 항체와 유사한 생물학적 특성을 갖는다. 마우스 하이브리도마를 배양하였고, 사람 CD20+ B 세포주(Daudi)에 대한 마우스의 항체의 결합을 형광-활성화 세포 분류(Fluorescent-Activated Cell Sorting, FACS) 분석으로 확인하였다.
추가 특성결정 및 검정 개발에 앞서, 선택된 모 마우스 항체를 키메라 항-CD20 항체로 전환시켰다. 키메라 항체는 선택된 항체 대 대조 항체(마우스-사람 키메라)에 대한 대조 생물학 연구를 수행하는데 요구되었다. 더욱이, 키메라 항체를 변형에 사용된 스크리닝 검정을 위해 적절한 대조군으로서 역할하도록 제조하였다. 모 키메라를 제조하여 면역글로불린 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 유전자로부터의 가변 영역을 엔코딩하는 서열을 분리하고 사람 IgGl 불변 도메인을 함유하는 포유동물 발현 벡터내로 클로닝하였다. 그 결과 얻어진 키메라 항-CD20 항체는 DVSA-CD20로 지칭된다.
검정 개발
세포-기반 ELISA를 DVSA-CD20과 유사하거나 이보다 나은 CD20-결합 특성을 지니는 HuFR 변이체의 확인을 위해 단순하고, 빠르며, 일차적인 스크린으로써 확립하였다. 이 검정을 현탁액 중의 CD20+ B 세포주를 비롯한 사람 CD20 단백질을 발현하는 적당한, 부착 HEK-293 세포주와 함께 사용하여 개발하였다.
CDC ( Complement - Dependent Cytotoxicity ) 검정. 형광-기반, 96-웰 플레이트 검정을 CD20+ 림프종 세포에 결합하는 항-CD20 변이체의 활성을 평가하기 위해 개발하였다. 보체(Complement) 활성화를 세포 생존도의 측정에 의해 평가하였다. 이 검정의 경우, 대조 항체 및 DVSA-CD20는 양성 대조군으로 역할하였다. 음성 대조군은 비처리된 세포, 보체로만 처리된 세포, 비관련 사람 IgG와 보체로 처리된 세포, 및 벡터 대조 상청액 및 보체로 처리된 세포를 포함하였다.
ADCC ( antibody - dependent , cell - mediated cytotoxicity assay ). ADCC를 유도하는 항-CD20 항체의 활성을 검정하였다. 항-CD20 항체 변이체를 CD20 세포성 ELISA로 DVSA-CD20에 대한 유사하거나 개선된 결합에 대해 시험하였고 상기 변이체는 CDC 검정으로 DVSA-CD20과 비교하였을 때 유사하거나 개선된 활성을 지녔다. 항-CD20 변이체가 이 이펙터 기능을 보유하는지를 확인하기 위해, 96-웰 ADCC 검정을 확립하였다. 세포 사멸을 LDH 방출을 사용하여 측정하였다. 이 검정에 대한 양성 대조군은 대조 항체 및 DVSA-CD20 항체를 포함하였다.
아폽토시스 검정. 혈장 막 통합성의 손실을 측정한, FACS-기반 검정을 아폽토시스를 유발하는 항-CD20 변이체의 활성을 평가하기 위해 개발하였다. 이 검정의 경우, 사람 CD20 양성 B 세포 림프종 세포를 어넥신(Annexin) V와 프로디디움 아이오다이드로 염색한, 항-CD20로 처리하고, 후속하여 FACS 분석을 실행하였다.
세포 주기 검정. DVSA-CD20의 완전 뮤린, 모 항체가 교차 항체의 존재시 시험관내에서 사람 PBMC의 세포 증식을 유도하는 것으로 보고되었다. 대조 항체는 이러한 바람직하지 않을 수 있는 활성을 나타내지 않았다. 항-CD20 변이체가 사람 B 세포의 세포 증식을 유도하지 않았음을 확실하게 하기 위해, 항-CD3 세포 세포 검정을 이 스크리닝에 관해 개조하였다. 문헌에 보고된 뮤린 CD20(muCD20)은 교차 항체의 존재하에 인큐베이션될 때 적절한 수준의 세포 증식을 유도한다.
HuFR 라이브러리의 제작
사람 프레임워크 재조립을 2 라운드로 수행하였다. 제 1 라운드의 경우, 중쇄 라이브러리를 제조하였다. 하기 표는 도 1에 도식적으로 기재된, 마우스 CDR로의 CD20 중쇄 조립(ICF의 서열에 관해 표 1 및 2 참조)을 위해 사용된 ICF를 보여준다.
Figure pat00033
중쇄 가변 영역에 관한 완전한 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 하기와 같이 제공된다:
중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
Figure pat00034
Figure pat00035
Figure pat00036
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열:
Figure pat00037
중쇄와 연결된 신호 서열 및 불변 영역은 하기와 같다:
Figure pat00038
Figure pat00039
중쇄 라이브러리는 이후 8개의 위치지정자 경쇄와 연결된다. 각각의 경쇄는 고정된 세트의 사람 프레임워크와 마우스 CDR로 구성된다. 항체 유전자를 운반하는 플라스미드를 E. coli에서 증폭시키고 세포 ELISA로 스크리닝을 위해 전장-길이 IgG-함유 상청액의 생산을 위해 포유동물 세포로 트랜스펙션시켰다. 세포 ELISA에 의해 확인된 최상의 재조립 중쇄 유전자를 이후 하기와 같이 재조립 경쇄 라이브러리와 조합시켰다:
Figure pat00040
Figure pat00041
경쇄 가변 영역에 관한 완전한 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 하기와 같이 제공된다:
경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열:
Figure pat00042
Figure pat00043
Figure pat00044
Figure pat00045
Figure pat00046
Figure pat00047
Figure pat00048
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열:
Figure pat00049
Figure pat00050
Figure pat00051
Figure pat00052
Figure pat00053
경쇄와 연결된 신호 서열 및 불변 영역은 하기와 같다:
Figure pat00054
이들을 플라스미드 Ig 쇄 발현 벡터를 통해 HEK-293 현탁 세포로 트랜스펙션시켰고, 그 결과 얻어진 세포 배양 상청액을 스크리닝하였다.
HuFR 라이브러리 스크리닝 결과. 최종 HuFR 라이브러리에 관한 일차 고-효율 스크리닝 데이터는 도 26에 제시되어 있는데, 이 도면은, 부착 CD20+ HEK-293 세포를 사용하는, 항-CD20 세포 ELISA에서 항-CD20 HuFR 클론의 특이 활성을 입증하는 항-CD20 ELISA 검정으로부터의 데이터에 대한 그래프를 도시한다. DVSA-CD20의 특이 활성은 1.0으로 설정되었다. 1.0과 동일하거나 이를 초과하는 활성을 지니는 클론을 CDC 검정으로 시험하였다. 신호:잡음은 정량 ELISA의 경우 4.2(CV 8.8%)이었고 항-CD20 세포 ELISA의 경우 3.6(CV 5.7%)이었다. HuFR 클론의 특이 활성은 항체 발현 수준(정량 IgG ELISA에 의해 결정된 바와 같음)에 의해 항-CD20 세포 ELISA 결합 활성을 표준화함으로써 결정되었다. DVSA-CD20의 특이 활성을 1.0으로 설정하고 가장 높은 특이 활성에 의해 정렬시켰다. 최고의 추정 히트(> 80)을 추가 분석을 위해 선택하였다. 세포 ELISA로부터 확인된 상위(top) 추정 히트를 CDC 검정으로 프로파일링하였다. CD20 세포 ELISA와 CDC 검정으로 상기 상위 히트의 비교는 많은 세포 ELISA 히트가, 도 5에 도시된 것과 같이, DVSA-CD20과 유사한 세포독성 활성을 보유함을 도시하였다. 도 5는 항-CD20 ELISA에서 상위 항-CD20 HuFR 클론의 특이 활성(자주색, 왼쪽 바)과 CDC 검정에서 상위 클론 활성(옥색, 오른쪽 바)을 비교하는 막대 그래프이다. DVSA-CD20 양성 대조군(cDVSA) 및 음성 대조군(비처리된 사람 IgG)의 활성이 표시되어 있다.
세포 ELISA와 CDC 검정의 결과에 기초하여, 상위 HuFR 변이체를 2차 검정 패널에서의 확증 및 추가 분석을 위해 선택하였다. 이러한 변이체로 연결된 HuFR 중쇄 및 경쇄는 다음과 같다:
Figure pat00055
* LC & HC 조합 번호 23은 번호 10과 동일한 조합의 경쇄 및 중쇄(BD22108 및 BD20337)를 가짐을 주목하라. 번호 29는 번호 17과 동일한 중쇄/경쇄 조합(BD22104 및 BD20337)을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 조합 번호 23과 29는 하기 결과의 합치되는 제시를 위해 유지되었다.
상위 변이체를 HEK-293 현탁 세포로 트랜스펙션시키고 그 결과 얻어진(비정제된) 세포 배양물 상청액을 하기 이차 검정의 패널에서 시험하였다: 아폽토시스(도 6 참조); 세포 주기(도 7 참조); CDC(도 8 참조); 및 ADCC(도 9 참조). 도 6은 아폽토시스 검정에 관한 막대 그래프인데, 이 그래프는 상위 HuFR 히트의 일부가 대조 항체 및 DVSA-CD20와 동일하거나 더 나은 활성을 가짐을 입증한다. 양성 대조군은 스타우로스포린(staurosporine), 대조 항체, 및 DVSA-CD20이다. 음성 대조군은 비처리된 세포(배지 무염색), 비처리된 세포 교차 항체 단독(배지 GAH 단독), 및 비처리된 사람 IgG로 처리된 세포(사람)이다. 도 7은 세포 주기 검정에 관한 것인데, HuFR 항-CD20 히트가 시험관내 사람 PBMC에서 세포 증식을 유도하지 아니함을 보여준다. DVSA-CD3은 양성 대조군이었다(레인 1). 음성 대조군은 교차 항체로 비처리된 세포 및 비처리된 사람 IgG로 처리된 세포를 포함하였다. 도 8은 CDC 검정에 관한 막대 그래프이다. 몇몇 항-CD20 HuFR 히트는 CDC를 유도할 뿐만 아니라, 대조 항체와 DVSA-CD20(레인 3과 4)보다 더 나은 CDC를 유도한다. 이 검정에 대한 음성 대조군(100% 생존도)은 비처리된 세포 및 사람 IgG로 처리된 세포(레인 1과 2).
도 9는 하기 실시예 4에서 상세히 논의된, ADCC 검정에 관한 막대 그래프이다. 상위 항-CD20 HuFR 히트의 서브세트와 함께 예비 ADCC 데이터는 이들 이트의 일부가 1 μg/ml의 농도에서 대조 항체 및 DVSA-CD20와 유사한 활성을 갖는다는 것을 제시한다. 이 검정에 관한 음성 대조군은 관련없는 사람 IgG (사람) 항-CD3와 함께 인큐베이션된 CD20+ 타깃 세포였다.
검정 데이터의 요약은 표 A에 제시되어 있다. 변이체는, 세포 ELISA에서의 최고의 결합 활성으로 시작하여, 1에서 29까지의 순서로 순위가 매겨졌다. ++의 성과(performance)는 대조 항체와 등가였다. 전체적으로 상위 12개 변이체가 주역이 된다.
표 A. 2차 세포-기반 검정 패널에서 항- CD20 변이체의 요약
Figure pat00056
실시예 4: 항- CD3 항체
본 발명은 키메라 폴리펩티드 및 폴리펩티드 CD3, 예를 들어, 일 구체예에서, 사람 CD3에 특이적으로 결합하는 키메라 2가 항체를 제공한다. 일 양상에서, 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어, 본 발명의 키메라 폴리펩티드 또는 키메라 2가 항체는, 면역 반응을 억제 또는 폐기시키기 위해, 예를 들어, 신장 이식 환자에서 급성 동종이식 거부반응 및 심장과 간 이식 환자에서 스테로이드-내성 급성 동종이식 거부반응을 치료(완화)하기 위해, 자가면역질환, 심각한 이식편대숙주질환을 치료(완화)하기 위해, 건선 및 궤양성 대장염을 치료(완화)하기 위해, 예를 들어, 최근에 진단된 I-형 당뇨 환자를 포함하는, 당뇨 환자에서 인슐린 생산을 유지 또는 개선함으로써 I-형 당뇨병을 완화시키기 위해 사용된다.
대안적인 구체예에서, 본 발명의 항-CD3 항체는 신장이식 환자에서의 급성 동종이식 거부반응 및 심장 및 간 이식 환자에서 스테로이드-내성 급성 동종이식 거부반응을 치료하는데 유용하다. 대안적인 구체예에서, 이러한 본 발명의 항체는 또한 건선과 궤양성 대장염을 포함하는 자가면역질환과, 심각한 이식편대숙주질환을 치료하는데 유용하며, 최근에 진단된 I-형 당뇨 환자에서 인슐린 생산을 유지 또는 개선시키는데 유용하다. 변형된 항-CD3는 건선 및 궤양성 대장염에 관한 2상 연구에서 평가된다.
대조 마우스 항-CD3 항체를 키메라, 본 발명의 항-CD3 항체로 전환시켰다. 단일 아미노산 변형(T299V)을 상기 항체의 Fc 영역에 도입하여 대조 항체(이 T299V 돌연변이를 지니는 Fc 영역은 "Fc 눌(null)"로 지칭됨)와 연관된 바람직하지 않을 수 있는 사이토카인 부작용을 감소시켰다. Fc 눌은 추가적인 대조군으로써 역할하였다.
키메라 항체는 또한 변형에 사용된 스크리닝 검정을 확립하기 위한 적절한 대조군으로써 역할하도록 하기 위해 제조하였다. 모 키메라를 제조하여 가변 영역을 엔코딩하는 대조 서열을 사람 IgG1 불변 도메인을 함유하는 포유동물 발현 벡터로 클로닝하였다.
도 9는 하기 실시예 4에 논의된, ADCC 검정에 관한 막대 그래프이다. 상위 항-CD20 HuFR 히트의 서브세트를 이용한 예비 ADCC 데이터는 이러한 히트의 일부가 1 μg/ml의 농도에서 대조 항체와 DVSA-CD20과 유사한 활성을 갖는다는 것을 제시한다. 이 검정을 위한 음성 대조군은 관련이 없는 사람 IgG(사람) 항-CD3와 함께 인큐베이션된 CD20+ 타깃 세포였다.
그 결과 얻어진 키메라, 항-CD3 항체는, 도 10과 도 11에 제시된 DVSA-CD3로 지칭된다. 도 10은 DVSA-CD3의 경쇄(위) 및 중쇄(아래) 핵산 서열을 보여준다. 노란색으로 강조된 문자는 CDR을 나타낸다. 도 11은 DVSA-CD3의 중쇄(위)와 경쇄(가운데) 아미노산 서열을 비롯한, DVSA-CD3의 경쇄(아래)를 나타낸다. 노란색으로 강조된 문자는 불변 영역을 나타낸다.
아폽토시스 검정
세포 배지(RPMI- 1640(ATCC Cat. 30-2001)/10% FBS(Invitrogen Cat. 10082-147)/0.05 mM 2-머캅토에탄올(Sigma M-7522))에서 배양된, 저캇(Jurkat) T 세포(ATCC Cat. TIB-152)를 마지막 2차배양(subculturing) 2일 경과후 약 2.5 x 104 세포 밀도로 플레이팅하였다. 이후 세포를 실온에서 200g로 원심분리하였다. 소모된 세포 배양 배지를 후속하여 흡입기로 빨아들이고 세포를 부드럽게 신선한 배지 중에 재현탁시켰다. 세포를 계수한 후 신선한 세포 배양 배지로 세포수를 4.0 x 105 세포/ml로 조정하였다. 세포를 이후 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다(~ 50 μl/웰). 세포 배양 배지로 제조된 항체 용액(100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml 또는 12.5 ng/ml IgG)을 세포에 첨가하고 24시간 동안, 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 시험될 항체(20 ng/ml)는 스크리닝 과정에서 확인된 항체였다. 관련없는 사람 IgG1(EMD Biosciences Cat. 400120), DVSA-CD3, DVSA-CD3(Fc 눌)는 대조 항체로써 역할하였다.
APO-ONE APOPTOSIS ASSAY™(Promega Cat. G7791)를 사용하였다. 검정 판독(readout)은 96-웰 포맷으로 형광적으로 표지된 테트라펩티드 기질의 절단에 기초하였다(APO-ONE™ HOMOGENEOUS CASPASE-3/7 Assay, Promega Cat. G7790, G7791). 100 μl/웰의 APO-ONE™ 시약/기질(희석비 100:1)을 각각의 웰에 첨가하고 암실내 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 확립된 시험관내 아폽토시스 검정은 항-CD3 항체 처리후 사람 CD3+ T 세포에서 카스파제 활성의 유도를 측정한다. 이후 플레이트를 485 nm의 여기 파장 및 530 nm의 방출 파장에서 형광 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다.
HuFR 항- CDS 라이브러리의 제작
HuFR을 실시예 3에서와 같이 수행하였다. 제 1 라운드에서, 항체 상청액(카파 위치지정자 쇄와 연결된 중쇄 HuFR 라이브러리)을 T-세포 신호 변환(transduction) 및 연이은 아폽토시스를 유도할 수 있는 항체 변이체의 활성을 측정하는 고-효율 검정으로 스크리닝하였다. 1회 실험 실행시, 일차 스크리닝으로부터 선택된 326개 히트가 존재하였고, 52개 히트가 확정되었으며, 상위 10개 중쇄 히트가 선택되었다. 표 C와 D는 중쇄 및 경쇄 서열을 보여준다(표 1 내지 4 참조).
제 2 라운드에서, 아폽토시스 검정에 의해 확인된 상위 10개의 재조립된 중쇄 유전자를 이후 HuFR 경쇄 라이브러리와 조합하였다. 이 라이브러리를 대조 DVSA-CD3(Fc-눌)와 비교할 때 동일하거나 개선된 특성을 지니는 변이체의 확인을 위해 스크리닝하였다. 한 실험에서, 일차 스크리닝으로부터 268개의 히트가 존재하였고, 37개 히트가 확증되었으며, 상위 10개가 선택되었다. 9개 후보 클론을 성공적으로 리트랜스펙션시키고 확증 검정으로 검정하였다(표 B). 상위 중쇄 및 경쇄에서 드러난 ICF는 표 C과 D에 제시되어 있다.
표 B. 상위 항- CD3 HuFR 항체에서 중쇄 및 경쇄
Figure pat00057
표 C. 항- CD3 에 관한 상위 중쇄에 사용된 ICF
Figure pat00058
표 D. 항- CD3 에 관한 상위 카파 경쇄에 사용된 ICF
Figure pat00059
도 12는 상기 탑 9개 항-CD3 히트에서 중쇄 및 경쇄의 정렬을 제공한다.
HuFR 라이브러리 스크리닝 결과
상위 9개(9) CD3 항체 변이체 중쇄 및 경쇄 후보자를 HEK-293 현탁 세포로 트랜스펙션시키고 그 결과 얻어진 세포 배양물 상청액을 아폽토시스 활성과 열안정성에 관하여 시험하였다. 사람 프레임워크 재조립 반응을 통해 획득한 모두 9개의 변이체는 시험관내에서 DVSA-CD3(Fc-눌)과 동일하거나 이보다 나은 아폽토시스 활성을 나타내었다(표 E). 음성 대조군은 비처리된 세포(배지)와 관련없는 사람 IgG(hulgG)였다.
표 E. HuFR 항체의 아포 -원( Apo - One ) 아폽토시스 검정
Figure pat00060
열안정성
또한 9 HuFR 변이체를 이 항체의 구조적 통합성(integrity)이 아미노산 변형 중 임의의 변형에 의해 저하되지 아니하였음을 확실시 하기 위해 열안정성에 관해 검정하였다. 사람 프레임워크 재조립 반응을 통해 획득된 변이체는 DVSA-CD3 (Fc-눌) 항체보다 더 높은 해리 온도(melting temperatures)를 가졌다.
표 F. 변이체 9의 열안정성은 HuFR 에 의해 영향받지 않았다
본 발명은, 열안정 결합 활성을 지니는 항원에 결합할 수 있는, 하기 변이체 1 내지 변이체 9로 기재된, 키메라 폴리펩티드를 제공한다:
Figure pat00061
Figure pat00062
모든 특허, 특허 출원, 및 출원에 참조된 간행물의 전체 개시사항은 참고문헌으로써 본 명세서에 통합된다.
SEQUENCE LISTING <110> VERENIUM CORPORATION FREY, Gerhard KIMMEL, Bruce ANDERSON, Abraham <120> ANTIBODIES AND METHODS FOR MAKING AND USING THEM <130> 564462015840 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 60/871,069 <151> 2006-12-20 <160> 372 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser 20 25 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180 aatcagaagt tcaaaggcag agtcaccatc tcagctgaca agtccatcag cactgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagatcgcac 300 tacggtagta actacgtaga ctactttgac tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360 tcctcc 366 <210> 133 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 133 ggctacacct ttactaggta cacgatgcac 30 <210> 134 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 134 tacattaatc ctagccgtgg ttatactaat tacaatcaga agttcaagga c 51 <210> 135 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 135 tattatgatg atcattactg ccttgactac 30 <210> 136 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 136 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcttc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt gcgacaggct 120 cctggaaaag ggcttgagtg gatgggtgct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180 aatcagaagt tcaaaggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatcgcac 300 tacggtagta actacgtaga ctactttgac tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360 tcctcc 366 <210> 137 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 137 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcttc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggtgct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180 aatcagaagt tcaaaggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatcgcac 300 tacggtagta actacgtaga ctactttgac tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360 tcctcc 366 <210> 138 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 138 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 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cttctggggt cccatcaagg 180 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa 240 gattttgcaa cttactactg tcatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggccaaggt 300 accaaggtgg aaatcaaa 318 <210> 224 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 224 gaaatagtga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtatcagca gaaaccagga 120 cagcctccta agctgctcat ttatgccaca tccaacctgg cttctggggt cccatcaagg 180 ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa 240 gattttgcaa cttactactg tcatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggccaaggt 300 accaaggtgg aaatcaaa 318 <210> 225 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 225 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn 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Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 365 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 365 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 366 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 366 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 367 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 367 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 368 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 368 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 369 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 369 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 370 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 370 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 371 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 371 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 372 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 372 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (11)

  1. 중쇄 가변 영역의 적어도 일부분 및 경쇄 가변 영역의 적어도 일부분을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 상기 경쇄 부분 및 상기 중쇄 부분이 하기 조합들 중 하나 이상의 조합의 각각의 경쇄 및 중쇄에 대하여 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 서열 동일성을 가지거나 완전한 서열 동일성을 가지는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    (1) 경쇄 BD22084(서열번호 225) 및 중쇄 BD20332(서열번호 138);
    (2) 경쇄 BD22085(서열번호 232) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
    (3) 경쇄 BD22086(서열번호 227) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
    (4) 경쇄 BD22088(서열번호 229) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (5) 경쇄 BD22087(서열번호 240) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
    (6) 경쇄 BD22089(서열번호 243) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
    (7) 경쇄 BD22090(서열번호 234) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (8) 경쇄 BD22095(서열번호 244) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (9) 경쇄 BD22091(서열번호 242) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (10) 경쇄 BD22108(서열번호 230) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (11) 경쇄 BD22092(서열번호 235) 및 중쇄 BD20338(서열번호 149);
    (12) 경쇄 BD22094(서열번호 231) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (13) 경쇄 BD22096(서열번호 241) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (14) 경쇄 BD22092(서열번호 235) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (15) 경쇄 BD22102(서열번호 248) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (16) 경쇄 BD22097(서열번호 246) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143).
    (17) 경쇄 BD22104(서열번호 239) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (18) 경쇄 BD22085(서열번호 232) 및 중쇄 BD20339(서열번호 150);
    (19) 경쇄 BD22107(서열번호 226) 및 중쇄 BD20339(서열번호 150);
    (20) 경쇄 BD22100(서열번호 236) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
    (21) 경쇄 BD22103(서열번호 228) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (22) 경쇄 BD22105(서열번호 237) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (23) 경쇄 BD22101(서열번호 247) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
    (24) 경쇄 BD22106(서열번호 245) 및 중쇄 BD20333(서열번호 142);
    (25) 경쇄 BD22108(서열번호 230) 및 중쇄 BD20338(서열번호 149);
    (26) 경쇄 BD22109(서열번호 233) 및 중쇄 BD20341(서열번호 154); 또는
    (27) 경쇄 BD22111(서열번호 238) 및 중쇄 BD20336(서열번호 144).
  2. 중쇄 가변 영역의 적어도 일부분 및 경쇄 가변 영역의 적어도 일부분을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 상기 경쇄 부분 및 상기 중쇄 부분이
    (1) 경쇄 BD22084(서열번호 225) 및 중쇄 BD20332(서열번호 138);
    (2) 경쇄 BD22085(서열번호 232) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
    (3) 경쇄 BD22086(서열번호 227) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
    (4) 경쇄 BD22088(서열번호 229) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (5) 경쇄 BD22087(서열번호 240) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
    (6) 경쇄 BD22089(서열번호 243) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
    (7) 경쇄 BD22090(서열번호 234) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (8) 경쇄 BD22095(서열번호 244) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (9) 경쇄 BD22091(서열번호 242) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (10) 경쇄 BD22108(서열번호 230) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (11) 경쇄 BD22092(서열번호 235) 및 중쇄 BD20338(서열번호 149);
    (12) 경쇄 BD22094(서열번호 231) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (13) 경쇄 BD22096(서열번호 241) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (14) 경쇄 BD22092(서열번호 235) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (15) 경쇄 BD22102(서열번호 248) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (16) 경쇄 BD22097(서열번호 246) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143).
    (17) 경쇄 BD22104(서열번호 239) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (18) 경쇄 BD22085(서열번호 232) 및 중쇄 BD20339(서열번호 150);
    (19) 경쇄 BD22107(서열번호 226) 및 중쇄 BD20339(서열번호 150);
    (20) 경쇄 BD22100(서열번호 236) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
    (21) 경쇄 BD22103(서열번호 228) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (22) 경쇄 BD22105(서열번호 237) 및 중쇄 BD20337(서열번호 148);
    (23) 경쇄 BD22101(서열번호 247) 및 중쇄 BD20335(서열번호 143);
    (24) 경쇄 BD22106(서열번호 245) 및 중쇄 BD20333(서열번호 142);
    (25) 경쇄 BD22108(서열번호 230) 및 중쇄 BD20338(서열번호 149);
    (26) 경쇄 BD22109(서열번호 233) 및 중쇄 BD20341(서열번호 154); 또는
    (27) 경쇄 BD22111(서열번호 238) 및 중쇄 BD20336(서열번호 144)의 조합들 중 하나 이상의 조합의 각각의 경쇄 및 중쇄에 대하여 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 서열 동일성을 가지거나 완전한 서열 동일성을 가지며,
    여기서 상기 경쇄의 적어도 일부분, 상기 중쇄의 적어도 일부분, 또는 상기 둘 모두는
    (1) Kabat 프레임워크 영역 1(KF1) 도메인의 적어도 일부분에서 유래된 아미노산을 각각 포함하는 복수의 아미노산 서열에서 유래된 아미노산 컨센서스 서열을 포함하는, ICF1(Independently Consensused Framework 1) 도메인을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 복수의 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 영역 유전자의 생식선(germline) 서열로부터 번역되거나 성숙 면역글로불린으로부터 획득되는, 단계;
    (2) 1F5 항체의 가변 영역에서 유래된 상보성 결정 영역 1(CDR1)의 적어도 일부분을 제공하는 단계;
    (3) Kabat 프레임워크 영역 2(KF2) 도메인의 적어도 일부분에서 유래된 아미노산을 각각 포함하는 복수의 아미노산 서열에서 유래된 아미노산 컨센서스 서열을 포함하는, ICF2(Independently Consensused Framework 2) 도메인을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 복수의 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 영역 유전자의 생식선 서열로부터 번역되거나 성숙 면역글로불린으로부터 획득되는, 단계;
    (4) 1F5 항체의 가변 영역에서 유래된 상보성 결정 영역 2(CDR2)의 적어도 일부분을 제공하는 단계;
    (5) Kabat 프레임워크 영역 3(KF3) 도메인의 적어도 일부분에서 유래된 아미노산을 각각 포함하는 복수의 아미노산 서열에서 유래된 아미노산 컨센서스 서열을 포함하는, ICF3(Independently Consensused Framework 3) 도메인을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 복수의 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 영역 유전자의 생식선 서열로부터 번역되거나 성숙 면역글로불린으로부터 획득되는, 단계;
    (6) 1F5 항체의 가변 영역에서 유래된 상보성 결정 영역 3(CDR3)의 적어도 일부분을 제공하는 단계; 및
    (7) 선택적으로 Kabat 프레임워크 영역 4(KF4) 도메인의 적어도 일부분에서 유래된 아미노산을 각각 포함하는 복수의 아미노산 서열에서 유래된 아미노산 컨센서스 서열을 포함하는, ICF4(Independently Consensused Framework 4) 도메인을 제공하는 단계로서, 여기서 상기 복수의 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 영역 유전자의 생식선 서열로부터 번역되거나 성숙 면역글로불린으로부터 획득되는, 단계;
    (8) 5'-에서-3' 방향으로, ICF1-CDR1-ICF2-CDR2-ICF3-CDR3 및 선택적으로 ICF4 도메인을 엔코딩하는 핵산을 연결시키는 단계[여기서 하나 이상의 상기 ICF는 게놈 핵산 서열에서 유래됨]의 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조된 서열로부터 적어도 부분적으로 유래되는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제 2항에 있어서, 항체 단편이 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 단일-쇄 항체, Fv 단편, scFv 단편, 항체 모방체(mimetic), Fd 단편, 또는 Fd' 단편인, 항원 결합 항체 단편.
  4. 제 3항에 있어서, 항체 단편이 Fc에 융합된, 항원 결합 항체 단편.
  5. 제 2항의 하나 이상의 가변 영역 조합을 포함하는 구조를 갖는 재조합, 합성 또는 분리 항체.
  6. 제 2항의 하나 이상의 가변 영역 조합을 포함하는 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 키메라 항체 단편이 키메라 Fab, 키메라 Fab', 키메라 F(ab')2, 키메라 단일-쇄 항체, 키메라 Fv, 키메라 scFv, 항체 모방체, 키메라 Fd, 또는 키메라 Fd'인, 키메라 항원 결합 항체 단편.
  8. CD20 항원에 특이적으로 결합하고, (a) 서열번호 43-49의 아미노산 서열을 포함하는 ICF1; (b) 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (c) 서열번호 58-61의 아미노산 서열을 포함하는 ICF2; (d) 서열번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; (e) 서열번호 67-71, 73, 또는 74의 아미노산 서열을 포함하는 ICF3; (f) 서열번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는 (g) 서열번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 ICF4를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. CD20 항원에 특이적으로 결합하고, (a) 서열번호 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 ICF1; (b) 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; (c) 서열번호 9, 10, 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 ICF2; (d) 서열번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; (e) 서열번호 13, 17, 19, 또는 20의 아미노산 서열을 포함하는 ICF3; (f) 서열번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 및/또는 (g) 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 ICF4를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. (a) 제 2항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 B-세포 림프종을 치료하기 위한 약제학적 조성물 또는 제형.
  11. 제 10항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물 또는 제형.
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