KR20130116954A

KR20130116954A - 나노 입자형 약제학적 조성물용으로 유용한, 생혼화성이고 비생분해성이며 비독성인 중합체

Info

Publication number: KR20130116954A
Application number: KR1020137025487A
Authority: KR
Inventors: 아난드 씨. 벌만; 라마 무케르지; 드히라즈 카타르; 산조이 물릭; 마누 자기; 마노즈 쿠마르 싱흐; 무케쉬 쿠마르; 디팍 푸루스티; 파완 쿠마르 굽타; 라젠드란 프라빈; 쇼브히트 싱흐
Original assignee: 프레세니어스 카비 온콜로지 리미티드
Priority date: 2005-12-28
Filing date: 2006-12-26
Publication date: 2013-10-24
Also published as: EA200801563A1; US20090318661A1; EA017682B1; AR058866A1; ES2425075T3; ES2375740T3; ZA200806548B; CA2635469A1; CN101336256B; KR20080091158A; EP2172497B1; AU2006329554C1; IL192423A0; HK1123814A1; JP2009522251A; US20130274211A1; NZ569372A; CN101336256A; ATE529454T1; AU2006329554B2

Abstract

본 발명은 이작용성 비닐 유도체에 의해 가교결합되는 것으로서, 1-비닐피롤리돈(VP), N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM) 및 말레산 무수물과 폴리에틸렌 글리콜의 에스테르(MPEG)로부터 선택된 3개의 단량체 단위를 포함하며 각각의 독성 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않고 고순도이며 생혼화성이고 비생분해성이며 비독성인 화학식 1의 중합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 환자에게 머리맡에서 투여하기에 편리하고 저독성이며 안전한, 본 발명의 중합체를 포함하는 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물에 관한 것이기도 하다. 또한, 본 발명은 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물을 고도로 선택적으로 제조하는 방법에 관한 것이기도 하다.

Description

나노 입자형 약제학적 조성물용으로 유용한, 생혼화성이고 비생분해성이며 비독성인 중합체{A biocompatible, non-biodegradable, non-toxic polymer useful for nanoparticle pharmaceutical compositions}

본 발명은 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는, 생혼화성이고 비생분해성인 고순도 중합체 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 상기한 본 발명의 중합체를 사용하는 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물을 고도로 선택적으로 제조하는 방법 및 상기한 약제학적 조성물을 필요로 하는 환자에게 이를 투여하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 중합체는 비독성이고 안전하며 따라서 당해 중합체를 포함하는 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물로 하여금 또한 투여용으로 저독성이고 더욱 안전하도록 한다.

최근 수년에 걸쳐 생체의 생물학적 환경과 접촉하도록 고안된 의료 장치이건 인공 보철이건 간에 의학적 및 약제학적 분야에서 신규한 재료의 적용에 대한 관심이 증가세에 있어왔다. 이들 재료 중에서 중합체, 주로 합성 중합체가 지금까지로서는 환자의 건강 보호에 상당한 이점을 제공하는 것으로 밝혀진 가장 광범위한 종류이다.

의학적 및 약제학적 분야에 있어서 중합체의 용도는 광범위하다. 의학 분야에 있어서, 중합체는 임플란트 또는 인공 기관, 인공 혈관, 안내 렌즈, 인공 관절, 인공 보철, 봉합 재료, 체외 요법재 등과 같은 지지 재료 또는 혈액 관류, 혈액 산소 공급기, 카테터(catheter), 혈액 튜빙(tubing), 창상 및 화상 커버링 재료, 부목, 콘택트 렌즈 등에 사용되는 것과 같은 기타 지지 재료로서 사용된다. 약제학적 분야에 있어서, 중합체는 나노 입자 전달 시스템 및 방출 조절 전달 시스템의 개발시 특히 사용되어왔다. 약물을 전달 시스템을 사용하여 목적하는 위치에 표적화 하는데 또한 심도 깊은 연구가 이루어져 왔다. 또한, 중합체는 더욱이 경피 약물 전달 패치(patch), 미소구, 효소 및 세포 고정 등과 같은 응용 생물학적 요법과 같은 기타 적용시에도 대단한 유용성을 제공하는 것으로 밝혀졌다.

이러한 용도 중에서 나노 입자형 약물 전달 시스템이 더욱 심도 깊게 연구되어왔고 친수성 표면을 지닌 나노미터 크기의 약물 담체, 특히 소수성 약물 또는 화합물을 함입시키는 성능을 지니는 소수성 재료로 이루어진 치밀하게 팩킹된 코어와 친수성 재료로 제조된 외부 쉘로 이루어진 중합체성 마이셀(micell)의 2개의 구형 공동 중심 영역을 포함하는 것이 심도 깊게 연구되어왔다. 이러한 시스템은 세망내피계(reticulo-endothelial systems; RES)에 의한 인식 및 이해를 헛되게 하는 것으로 밝혀졌고 따라서 장기간동안 혈액 내에서 순환될 수 있다. 또한, 이들의 극소 크기(중합체성 마이셀은 통상적으로 수 백개의 블록 공중합체로 이루어져 있고 약 20nm 내지 50nm의 직경을 지닌다)로 인하여 입자는 고형암과 같은 병리학적 부위에서 수동적인 표적화 메카니즘(passive targeting mechanism)을 통해 침출된다.

중합체는 이의 화학적 및 구조적 특징에 기여할 수 있는 특성의 범위를 유도한다. 중합체 쇄는 필수적으로 인접한 쇄에 대해 선형이거나 분지되거나 가교결합될 수 있다. 또한, 이들 쇄는 정렬되지 않거나 정렬되거나 단일 방향으로 배향될 수 있다. 화학적 조성과 결합된 위와 같은 구조적인 특징은 중합체에 다양한 특성을 부여함으로써 결과적으로 다양한 최종 용도를 제공한다. 또한, 화학적 조성과 결합된 위와 같은 구조적인 특징은 생성된 중합체에 숙주 조직 환경에 의한 생분해에 대한 내성 및 생혼화성을 부여하거나 박탈할 수 있다. 이들 인자는 또한 용해도, 및 가공 및 성형 방법과 같은 기타 특성에도 영향을 미친다.

더욱이 중합체를 포유동물에 주입하는 경우 이는 통상적으로 투여 부위로부터 서서히 사라지나 이러한 사라짐은 통상적으로 생변형 과정의 일부인 가수분해와 같은 화학반응에 대한 반응시 발생하며 이러한 중합체는 신체로부터 대사되고 제거된다. 그러나 이는 종종 다양한 생물학적 계에 부적절한 효과를 야기시키는 불필요한 대사 산물을 제공하기도 한다. 따라서 사용 환경 내에서 또는 사용 환경에 불활성이고 투여 부위로부터 그대로 제거되거나 추출될 뿐만 아니라 중합체로부터 약물을 방출하고 전달하기 위한 속도 제한 장벽으로서 필수적으로 제공되는 중합체가 목적하는 기능을 기준으로 하였을 때 가장 중요한 것일 수 있다. 다시 말해서 중합체의 생분해성은 중합체의 기계적 및 화학적 특성에 의존한다. 다양한 천연, 합성 및 생합성 중합체는 생분해성이고 환경적으로 분해가능하다. C-C 주쇄를 기본으로 하는 중합체는 비생분해성이기 쉬운 반면 헤테로 원자 함유 중합체 주쇄는 생분해성을 제공한다. 따라서 비생분해성/생분해성은 다른 것들 중에서도 무수물, 에스테르 또는 아미드 결합과 같은 화학적 결합을 적절히 제거/부가함으로써 중합체내로 가공 처리할 수 있다. 통상적인 비생분해성 중합체 재료의 예에는 폴리에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리디메틸 실록산, 폴리에테르 우레탄, 에틸 셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 폴리에틸렌 및 폴리비닐 클로라이드가 포함된다.

중합체를 사용하는 매우 다양한 약물용 나노 입자형 전달 시스템의 개발에 지난 수십년 이상에 걸쳐 이루어져 왔던 수많은 보고서들이 있다. 몇 가지 예를 들어본다면 다음과 같은 문헌들이 포함되어 있다:

i) Sakurai 등의 미국 특허공보 제5,412,072호의 문헌; 여기서 친수성 분획과 소수성 분획으로 이루어진 중합체에 공유결합된 약물을 포함하는 복합물은 수용성 및 이로써 투여에 적합한 성질을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 여기서 사용된 약물은 일반적으로 수 난용성 또는 수 불용성 화합물이고 약물-중합체 복합물은 수용액 중에서 중합체성 마이셀을 형성하며 투여에 유용하고 적합한 수용성 고분자 중합화된 약물로 되는 것으로 보고되어 있다.

ii) Yokoyama 등의 미국 특허공보 제5,449,513호; 여기서 발명자들은 Sakurai 등의 미국 특허공보 제5,412,072호에 기재되어 있는 것과는 달리 약물이 중합체에 공유 결합되어 있는 복합물이 아니며 오히려 약물이 중합체 내에 함입되어 있는 중합체성 마이셀을 보고하고 있다. 함입용으로 사용되는 약물은 근본적으로 소수성이다. 중합체성 마이셀은 다시 소수성 약물을 초음파와 같은 통상의 방법을 통해 중합체성 쉘 내에 함입시킨 후 이렇게 수득한 마이셀을 투석을 통해 정제함으로써 제조한다.

iii) Desai 등의 미국 특허공보 제5,439,686호, 제5,362,478호, 제5,916,596호, 제6,096,331호, 제6,537,579호 및 제6,749,868호; 여기서는 실질적으로 수 불용성 화합물로 이루어진 중합체성 마이셀이 제조된다. 당해 수 불용성 화합물은 중합체성 쉘 내부로 상당한 정도 함입되고 이를 필요로 하는 환자에 가용성 형태 또는 현탁 형태로 투여하기에 적합한 것으로 보고되고 있다.

Sakurai 등의 미국 특허공보 제5,412,072호에서 사용된 중합체는 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜, 폴리사카라이드, 폴리아크릴아미드 등으로부터 선택된 친수성 분획과 폴리아스파르트산, 폴리글루탐산, 폴리리신 등으로부터 선택된 소수성 분획을 포함하는 중합체이다.

Yokoyama 등의 미국 특허공보 제5,449,513호에서 사용된 중합체는 일반적으로 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리말산, 폴리아스파르트산, 폴리글루탐산, 폴리리신, 폴리사카라이드 등으로부터 선택된 친수성 분획과 폴리(β-벤질 L-아스파르테이트), 폴리(γ-벤질 L-글루타메이트), 폴리(β-치환된 아스파르테이트), 폴리(γ-치환된 글루타메이트), 폴리(L-로이신), 폴리(L-발린), 폴리(L-페닐알라닌), 소수성 폴리아미노산, 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트 아미드, 폴리아크릴레이트 아미드, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리알킬렌 옥사이드 및 소수성 폴리올레핀으로부터 선택된 소수성 분획을 포함하는 것이다.

Desai 등의 미국 특허공보 제5,439,686호; 제5,362,478호; 제5,916,596호; 제6,096,331호; 제6,537,579호 및 제6,749,868호에서 사용된 중합체는 일반적으로 그 구조 내에 설프하이드릴 그룹 또는 설프하이드릴 결합, 예를 들면 알부민(35개의 시스테인 잔기를 함유하는), 인슐린(6개의 시스테인 잔기를 함유하는), 헤모글로빈(α₂β₂ 단위당 6개의 시스테인 잔기를 함유하는), 리소자임(8개의 시스테인 잔기를 함유하는), 이뮤노글로불린, α-2-매크로글로불린, 비트로넥틴, 피브리노겐 등을 필수적으로 포함하는 것이다. 이러한 중합체는 실질적으로 디설파이드 결합을 형성함으로써 가교결합된다. 이러한 중합체는 상기한 바와 같이 설프하이드릴 그룹 또는 디설파이드 결합을 그 구조 내에 함유하는 합성 및 천연 중합체를 둘 다 포함한다. 설프하이드릴 그룹 또는 디설파이드 결합은 미리 존재하거나 적합한 화학 변화를 통해 수득할 수 있는 것으로 보고되어 있다. 천연 중합체가 바람직한 것으로 보고되어 있고 이의 예에는 알부민 단백질, 올리고펩타이드, 폴리핵산 등이 포함된다.

그러나, Sakurai 등, Yokoyama 등 및 Desai 등에 의해 기재된 중합체성 마이셀을 사용하는 경우의 단점은 이들이 생분해성인 합성 중합체 및 천연 중합체를 둘 다 사용한다는 점이다. 생분해성 중합체는 약물 방출 패턴 및 부하된 약물의 방출 역학에 영향을 미칠 수 있으나 이는,

a) 단핵 탐식세포 시스템(MPS)에 의한 신속한 포획으로 인해 낮은 플라스마 수명을 지니며,

b) 생리학적 변화에 대한 반응이 부족하고,

c) 일정한 약물 방출 역학이 부족하여 경제적으로 및 치료학적으로 약물의 낭비 및 기타 역효과를 야기할 수 있으며,

d) 단백질 약물의 캡슐화가 유기 용매를 포함하기 때문에 독성 또는 면역원성을 증가시킬 수 있어 단백질의 변성을 야기할 수 있으므로,

약물 전달 시스템에서 특히 바람직하지 못하다는 사실을 언급할 수 있다.

비생분해성 중합체가 사용된 전달 시스템은 다음과 같은 문헌에 기재되어 있다:

i) Maitra 등의 미국 특허공보 제5,874, 111호; 여기서 약물은 중합체 내에 함입되어 결과적으로 고도로 단분산된 중합체성 친수성 나노 입자를 형성한다. 사용된 중합체는 비닐피롤리돈(VP) 또는 비닐피롤리돈과 폴리에틸렌글리콜푸마레이트(PEGF)의 혼합물 등과 같은 단량체를 포함하는 중합체이다.

ii) Maitra 등의 미국 특허공보 제6,322,817호; 여기서 사용된 중합체는 비닐피롤리돈, 아크릴산, C₃-C₆ 알킬 아크릴레이트, 분자량 2000 내지 6000의 작용화 폴리에틸렌 글리콜, C₃-C₆ N-알킬아크릴아미드 및 C₃-C₆ 알킬시아노아크릴레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유형의 양쪽성 단량체를 포함한다. 중합체성 마이셀에 함입된 약물은 탁산 유도체, 특히 파클리탁셀이다.

iii) Lowe 등의 미국 특허원 제2005/0169882호; 여기서 사용된 중합체는 스마트(smart) 분획(비생분해성인)과 생분해성 분획을 포함한다. 보다 상세하게는 비생분해성인 스마트 분획은 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(N-알킬아크릴아미드), 폴리(N-n-프로필아크릴아미드), 폴리(N-이소프로필메타크릴아미드), 폴리(에틸렌 옥사이드)-폴리(프로필렌 옥사이드)-폴리(에틸렌 옥사이드), 엘라스틴형 폴리펩타이드 또는 이들의 유도체를 포함하고 생분해성 분획은 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리에스테르, 폴리락타이드, 폴리(L-락트산), 폴리(D,L-락트산), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 비오티닐화 폴리(에틸렌 글리콜-블록-락트산) 등을 포함한다.

미국 특허공보 제5,874,111호에 기재되어 있는 중합체들의 경우 이러한 중합체들은 각각의 단량체들을 중합시킴으로써 제조되고 이렇게 수득된 중합체성 재료는 이를 함유하는 수성 매질로부터 투석 방법을 통해 정제되고 분리된다는 점을 주시할 수 있다.

미국 특허공보 제6,322,817호의 경우에도 중합체들은 각각의 단량체들을 중합시킴으로써 제조되고 수성 매질로부터 투석 방법을 통해 정제되고 분리된다.

이와 유사하게 Lowe 등의 미국 특허원 제2005/0169882호에 기재되어 있는 중합체들도 또한 이를 함유하는 수성 매질로부터 투석 방법을 통해 정제되고 분리된다.

Maitra 등의 미국 특허공보 제5,874,111호에 기재되어 있는 중합체에 함입시키기 위한 상기한 특허 문헌에 기재되어 있는 화합물 또는 약물과 관련하여 이들은 기본적으로 항원, 소 혈청 등이다. 미국 특허공보 제6,322,817호의 경우 당해 특허 문헌에 기재되어 있는 중합체에 함입시키기 위한 약물은 기본적으로 수 불용성 탁산 유도체, 특히 파클리탁셀인 반면 미국 특허원 제2005/0169882호에서 Lowe 등은 당해 특허 문헌에 기재되어 있는 중합체성 쉘에 함입시킬 수 있는 광범위한 다수의 약물을 기재하고 있다.

그밖에 미국 특허공보 제6,365,191호에서 Burman 등은 미국 특허공보 제6,322,817호에 기재되어 있는 중합체를 포함하는 약제학적 조성물, 보다 특히 탁산 유도체, 특히 파클리탁셀로 이루어진 약제학적 조성물을 교시하고 있다. 여기서 상기한 약제학적 조성물은 에탄올 중의 파클리탁셀의 용액을 음이온성 계면활성제와 완충제를 함유하는 중합체 수용액을 첨가한 덱스트로즈 용액을 포함하는 주입 비히클에 가함으로써 제조한다. Burman 등은 당해 약제학적 조성물이 관류액으로부터 약물이 침전됨이 없이 12시간 이상동안 안정하며 약물의 90% 이상(HPLC로 분석된)이 관류액을 제조하고 24시간 후에도 중합체성 마이셀 내에 함입되어 있음을 추가로 주장하고 있다.

미국 특허공보 제6,365,191호에서 Burman 등이 당해 특허 문헌에 기재되어 있는 약제학적 조성물이 나노 입자 형태로 존재한다고 주장하고 있다고 하더라도 해당하는 명세서 내에서는 청구된 나노 입자 형태의 크기에 대해서는 언급한바 없다. 파클리탁셀을 함유하는 중합체성 마이셀의 입자 크기에 대한 언급은 Maitra 등의 미국 특허공보 제6,322,817호에서 유일하게 발견된다. 여기서 파클리탁셀을 함유하는 나노 입자는 30 내지 150 nm 범위의 직경을 지니는 것으로 보고되었다. 유사하게 Lowe 등의 미국 특허원 제2005/0169882호에 기재되어 있는 조성물의 중합체성 마이셀의 입자 크기에 대해서도 언급된 바 없다.

미국 특허공보 제5,874,111호, 제6,322,817호 및 제6,365,191호, 및 미국 특허원 제2005/0169882호에 기재되어 있는 중합체는 비닐피롤리돈과 N-이소프로필아크릴아미드를 포함하는 하나 이상의 단량체로부터 제조된다는 사실을 주지하는 것이 중요하다. 추가로 비닐피롤리돈 및 N-이소프로필아크릴아미드는 독성 화합물로서 사람/동물에 의한 소비를 의미하는 약제학적 조성물 내에서의 이들의 존재에 대해서는 전세계 보건 기구가 이의를 제기할 뿐만 아니라 전세계 약물 포럼에서 확정된 엄중한 제한을 이용하는 강제 품질 제한에 해당한다는 사실을 주지하는 것도 중요하다. 예를 들면 미국 및 유럽 약전에 규정된 중합체 중의 단량체성 비닐피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 및 단량체로서 비닐피롤리돈을 함유하는 기타 중합체의 양은 0.001%의 한도를 초과해서는 안된다(즉, < 10 ppm).

단량체 중의 하나로서 비닐피롤리돈을 사용하는 중합체의 제조 및 분리방법에 관한 미국 특허공보 제5,874,111호, 제6,322,817호 및 제6,365,191호, 및 미국 특허원 제2005/0169882호에 기재되어 있는 방법에서 상기한 단량체, 즉 비닐피롤리돈은 0.001%를 초과하는 한도(즉, > 10 ppm)로 존재할 수 있다는 점에 심각한 위험이 있다.

단량체 중의 하나로서 비닐피롤리돈을 사용하는 중합체를 함유하는 약제학적 조성물도 또한 단량체성 불순물로서 비닐피롤리돈을 함유할 수 있고 당해 단량체, 즉 비닐피롤리돈도 또한 0.001%를 초과하는 한도(즉, > 10 ppm)로 존재할 수 있다는 점에 동일하게 심각한 위험이 있다.

이는 미국 특허공보 제6,322,817호 및 제6,365,191호, 및 미국 특허원 제2005/0169882호에 기재되어 있는 약제학적 조성물에 관해 특히 적용될 수 있는 사실이다.

중합체를 제조하기 위한 반응을 포함하는 모든 화학반응이 항상 하나 이상의 반응물이 생성물 내에 잔류한다는 측면에서 결코 완전한 것이 아니라는 사실은 아무리 강조해도 지나치지 않다. 이는 단량체로서 비닐피롤리돈을 포함하고 사용된 비닐피롤리돈의 몰비 또는 중량비에 의존하는 중합반응에 적용될 수 있으며 소정량의 비닐피롤리돈이 항상 제조된 중합체성 생성물에 불순물로서 잔류할 수 있다.

이와 관련하여 3개의 단량체, 즉 비닐피롤리돈(VP), N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM) 및 말레산 무수물과 폴리에틸렌 글리콜의 에스테르(MPEG)를 중합시켜 제조한 중합체를 미국 특허공보 제6,322,817호의 실시예 I, II 및 III에 기재되어 있는 바와 동일하게 실시한 분석 결과가 표 1에 요약되어 있는 바와 같은 양의 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM) 및 비닐피롤리돈(VP)을 함유하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명의 발명자들이 걱정한 것은 사실이다.

미국 특허공보 제6,322,817호의 실시예 I, II 및 III 에 기재되어 있는 방법에 따라 제조한 중합체에 잔류하는 단량체의 양
단량체	중합체 내에서 검출된 %w/w
NIPAM	0.066-0.076(660-760 ppm)
VP	0.008-0.011(80-110 ppm)

중합체 내에서 발견된 비닐피롤리돈의 양이 0.001%(즉, 10 ppm)의 독성 한계의 적어도 8배 이상이라는 사실은 확실히 명백하다. 여기서 이러한 중합체를 함유하는 약제학적 조성물은 사람 또는 동물에 투여하기에 매우 안전하지 못하고 독성이 크다.

불가피한 것은 아닐지라도 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM) 및 비닐피롤리돈(VP)과 같은 독성 단량체가 실질적으로 존재하지 않는 중합체 뿐만 아니라 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM) 및 비닐피롤리돈(VP)과 같은 독성 단량체성 불순물이 실질적으로 존재하지 않는 중합체를 포함하는 약제학적 조성물에 대한 필요성이 존재한다.

Burman 등의 미국 특허공보 제6,365,191호에 기재되어 있는 약제학적 조성물은 약 12시간 이상의 경우에만 안정성을 지니며 중합체성 마이셀 내에 함입된 약물의 90% 이상은 24시간까지만 안정성을 지니는 것으로 보고되어 있다는 사실도 또한 주지해야 할 것이다. 또한 Lowe 등의 미국 특허원 제2005/0169882호에 기재되어 있는 약제학적 조성물은 생물학적 활성 물질이 수시간 내지 수일에 걸쳐 방출되면서 약 40%만의 생물학적 활성 물질이 부하되는 것으로 보고되어 있다.

추가로 보다 장기간의 안정성과 보다 다량의 약물이 부하되면서 안전하고 저독성인 약제학적 조성물에 대한 필요성이 존재한다.

본 발명은 사람/동물 투여에 안전하고 보다 장기간의 안정성을 지니는, 독성 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 중합체를 제공할 뿐만 아니라, 이러한 바람직한 중합체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다는 측면에서 진일보한 단계이다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 생혼화성이고 비생분해성인 고순도 중합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 생혼화성이고 비생분해성인 고순도 중합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 생혼화성이고 비생분해성인 고순도 중합체를 포함하는 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 생혼화성이고 비생분해성인 고순도 중합체를 사용하여 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 안전하고 저독성인 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는, 생혼화성이고 비생분해성인 고순도 중합체를 포함하는 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단량체성 불순물을 함유하지 않는, 생혼화성이고 비생분해성인 고순도 중합체와 수 난용성 약물 또는 화합물을 포함하는 나노 입자형 약제학적 조성물을 고도로 선택적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는, 생혼화성이고 비생분해성인 고순도 중합체를 포함하는 나노 입자형 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 보다 장기간동안 안정한 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는, 생혼화성이고 비생분해성인 고순도 중합체를 포함하는 나노 입자형 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 상기 목적은 사람/동물 투여에 안전하고 보다 장기간의 안정성을 지니는, 독성 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 중합체를 제공할 뿐만 아니라, 이러한 바람직한 중합체를 포함하는 나노 입자형 약제학적 조성물을 제공함으로써 달성된다.

본 발명은 사람/동물 투여에 안전하고 보다 장기간의 안정성을 지니는, 독성 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 생혼화성이고 비생분해성인 고순도 중합체와 이러한 바람직한 중합체를 포함하는 나노 입자형 약제학적 조성물을 제공하는 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명의 중합체의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 중합체의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 중합체의 푸리에 변형 적외선(Fourier Transform Infrared; FT-IR) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 중합체의 TGA 열 분석도를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 중합체의 DSC 열 분석도를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의[C]-표지된 중합체의 약동학적 혈액 프로파일을 도시한 것이다.
도 7은 10% 덱스트로즈 용액(대조용)을 피하내 투여하고 48시간 후에 S&E 착색된 토끼의 귓볼 부위의 사진을 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 중합체의 수용액을 피하내 투여하고 48시간 후에 S&E 착색된 토끼의 귓볼 부위의 사진을 도시한 것이다.
도 9는 10% 덱스트로즈 용액(대조용)을 정맥내 투여하고 24시간 후에 S&E 착색된 토끼의 변연 귀정맥 부위의 사진을 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 중합체의 수용액을 정맥내 투여하고 24시간 후에 S&E 착색된 토끼의 변연 귀정맥 부위의 사진을 도시한 것이다.
도 11은 본 발명의 나노 입자형 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에 투여하기 위한 통상의 제조방법 및 투여방법을 도시한 것이다.

본 발명의 발명자들은 그들의 전력을 다하여 상기한 모든 목적들이 달성될 수 있으며 더욱이 모두는 아니지만 대체로 선행 기술의 한계를 극복할 수 있다는 사실을 밝혀냈다.

먼저, 본 발명의 발명자들은 NIPAM 단량체 단위 및 VP 단량체 단위를 둘 다 포함하는 중합체를 수득할 수 있으며 여기서 이렇게 수득된 각각의 개별적인 단량체성 불순물의 양이 소정의 독성 한계보다 적다는 사실을 밝혀내었다.

특히, 본 발명의 발명자들은 독성 NIPAM 및 VP의 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 NIPAM, VP 및 MPEG를 단량체 단위로서 포함하는 중합체가 수득될 수 있다는 사실을 밝혀냈다. 특히 본 발명의 발명자들은 상기한 NIPAM 및 VP 불순물을 0.001%w/w보다 훨씬 적은 양으로 함유하는 중합체를 고순도로 수득할 수 있다는 사실을 밝혀냈다.

목적하는 특성을 지니는 중합체는 NIPAM, VP 및 MPEG를 중합시켜 수득한 중합체를 함유하는 수용액을 선행 기술에서 교시한 바와 같은 투석 방법과는 달리 정용 여과(diafiltration) 또는 초미세여과 단계에 적용시킴을 포함하는 고도로 선택적인 방법을 통해 수득할 수 있었다.

본 발명의 방법으로 수득한 중합체가 선행 기술의 방법, 특히 미국 특허공보 제6,322,817호에 기재되어 있는 투석 단계를 포함하는 방법으로 수득한 중합체에 비해 탁월하다는 사실은 다음의 표 2에 요약되어 있는 바와 같은 각각의 중합체에 함유된 잔류 단량체를 비교하는 것으로부터 가장 잘 이해할 수 있었다:

미국 특허공보 제6,322,817호에 기재되어 있는 투석을 이용하는 방법에 따라 수득한 중합체에 함유된 단량체성 불순물과 정용 여과를 이용하여 본 발명에 따라 수득한 중합체에 함유된 단량체성 불순물의 비교
인자	미국 특허공보 제6,322,817호의 방법에 따라 수득한 중합체	본 발명의 방법에 따라 수득한 중합체
잔류 NIPAM	0.066-0.076%w/w (660-760 ppm)	〈 0.001%w/w(〈 10ppm)
잔류 VP	0.008-0.011%w/w (80-110 ppm)	〈 0.001%w/w(〈 10ppm)

투석은 반투과성 막을 통한 선택적인 확산에 의해 보다 큰 분자로부터 보다 작은 분자를 서서히 분리하거나 용액 중의 콜로이드성 입자로부터 용해된 물질을 서서히 분리하는 것을 포함하는 방법임을 주지해야 한다. 통상의 투석 방법에 있어서, 정제용 중합체 용액은 반투과성 막 내에 함유되어 있고 저분자량 용질(단량체)은 막 외부에 순수한 용매, 일반적으로는 물을 정치시킴으로써 분리해낸다. 당해 용매는 중합체를 함유하는 용액 중의 확산 가능한 용질(NIPAM 및 VP 같은 단량체)의 농도가 감소될 때까지 주기적으로 또는 연속적으로 변화시킨다.

투석 방법과는 달리 정용 여과 기술은 막을 가로지르는 펌프(pump)에 의해 유액을 기계적으로 유동시킴을 포함함으로써 유액이 막의 표면을 따라 접선형으로 펌핑된다[이러한 이유로 인해 정용 여과는 또한 접선형 유동 여과(Tangential Flow Filtration)로도 공지되어 있다]. 막을 통해 여과액 측으로 선택적으로 확산시키기 위해 유액의 일부에 압력을 가한다. 잔류하는 중합체성 성분이 반투과성 막 표면에 축적되지 않는다.

한편, 정용 여과 방법에서는 투석 방법과는 달리 중합체의 수용액이 접선형 유동에 의해 일소되어 상기 중합체를 함유하는 용액을 농축시킴으로써 결과적으로 보다 농축된 중합체의 용액을 제공하기 때문에 정제에 관여한 중합체의 수용액의 초기량 또는 초기 용적은 작업 종료시 또는 완료시 그대로를 유지하거나 동일하거나 희석되어진다. 예를 들면 물 5.0L 중의 중합체 100g을 함유하는 용액을 각각 투석 및 정용 여과시키는 경우, 투석 방법의 종료시에는 물 4.5 내지 5.5L 중의 중합체 100g을 함유하는 용액이 수득되는 반면, 정용 여과 방법의 종료시에는 초기 용적의 감소 또는 농축화가 일반적으로 초기 용적의 1/4 내지 1/6에 이르도록 하는 결과가 초래되고 종료시에는 물 약 0.8 내지 1.3L 중의 중합체 100g의 용액이 수득된다.

추가로 상기한 바와 같이 투석 방법에 있어서는, 중합체 용액을 함유하는 막의 외부에서 유지되는 용매가 주기적으로 또는 연속적으로 조작하여 변화시켜야 할 필요가 있는 반면 정용 여과 방법에 있어서는, 어떠한 용매도 주기적으로 또는 연속적으로 조작하여 변화시키는 작업을 필요로 하지 않는다. 이는, 투석 방법이 작업이 진행되는 동안 지지부진한 조작 관리를 필요로 하는 반면, 정용 여과 방법은 완전히 자동화되고 통제됨으로써 작업이 진행되는 동안 조작 관리를 필요로 하지 않고 보다 덜 지루하고 편리하다.

또한, 공개된 환경하에서 작업하는 투석 방법과 대비하여 밀폐된 환경하에서 작업하는 정용 여과 방법의 특성상, 정용 여과 방법에 있어서는 미생물 오염의 모든 가능성이 최소화되거나 존재하지 않고 따라서 의약품 제조 품질 관리 기준(Good Manufacturing Practices) 뿐만 아니라 전세계 규제 지침(Regulatory Guidelines worldover)을 준수하는 무균 조건하에서의 공정으로서의 자격이 있다.

또한, 조작 공정 뿐만 아니라 투석 방법이 실시되는 고유 원리의 특성상, 단위 공정의 주기가 길고 일반적으로 약 24 내지 36시간 소요된다. 이와 대조적으로 정용 여과 방법이 실시되는 고유 원리의 특성상, 정용 여과 방법은 매우 짧은 시간 주기가 필요할 뿐이며 통상적으로 공정 완료에 1시간 미만이 소요된다. 다시 말해서 정용 여과 방법은 투석 방법보다 25배 이상 신속하며 따라서 산업적으로 더욱 적합하다.

투석 방법이 작업 및 완료에 보다 긴 시간 주기를 필요로 하나 투석 방법의 또 다른 특유의 단점은 정제될 중합체의 용액의 용적/용량을 소량으로만 허용할 뿐이라는 데 있다. 이러한 한계는 정용 여과 방법에는 해당 되지 않으며 일반적으로 이는 보다 대용적/대량, 즉 정제될 용액의 4 내지 5배 이상 정도를 허용한다. 예를 들어 투석 방법이 1주기에 물 5.0L 중의 중합체 100g의 용액을 정제하는 성능을 지니는 경우, 정용 여과 방법에 의해서는 1주기에, 물 20.0 내지 25.0L 중의 중합체 400 내지 500g이 정제될 수 있다. 두말할 필요도 없이 정용 여과 방법의 대용량 작업 성능은 이미 상기한 바와 같은 다른 이점, 즉 신속한 작업 시간, 자동화되고 통제된 작업, 편리하고 보다 덜 지루하고 초기 용액의 농축화와 동시에 초기 용액의 용적의 감소, 의약품 제조 품질 관리 기준 및 전세계 규제 지침의 준수, 최소로 존재하거나 부재 하는 미생물 오염 등의 이점 이외에 제공되는 또 다른 이점이다.

그러나 상기에서 언급하고 논의한 바와 같이, 투석 방법 이상으로 정용 여과 방법이 지니는 가장 중요한 이점은 각각의 방법으로 수득한 중합체의 순도에 있다. 즉, 정용 여과 방법은 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않고 따라서 사람/동물 소비용으로 비독성이고 안전한 중합체를 생성한다[참조:표 2].

최소한의 것을 의미하지는 않으나 마지막으로 정용 여과 방법의 또 다른 고유 이점은 중합체가 용매의 증발을 통해, 즉 동결 건조를 통해 용액으로부터 고체 형태로 분리되어야 할 필요가 있는 경우, 중합체 용액의 초기 용적을 일반적으로 중합체 용액의 초기 용적의 약 1/4 내지 약 1/6로 감소시키거나 농축시키는 당해 방법의 특성상, 증발/동결 건조 시간 주기도 또한 크게 감소시키는 데 있다. 투석 방법에서는 초기 용적이 감소되거나 농축되지 않기 때문에 중합체를 용액으로부터 고체 형태로 분리해야 할 필요가 있는 경우, 증발/동결 건조 시간 주기는 훨씬 길다.

간단히 말해서 투석 방법에 비해 정용 여과 방법은 대량으로 생산하고 의약품 제조 품질 관리 기준을 준수하며 따라서 산업적으로 더욱 실용적이고 친근하게 용이하게 확장시킬 수 있다.

정용 여과 방법과 투석 방법 간의 필수적인 차이점은 신속한 참조를 위해 표 3에 요약해두었다.

어느 정도까지는 정용 여과 기술 또는 초미세 여과 기술이 각종 정제에 적용되나 중합체 분야에서의 적용은 지금까지 보고된 바 없고 이는 본 발명의 신규하고 발명성 있는 측면을 형성한다.

또한, 본 발명의 발명자들은 이렇게 하여 수득한 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도 중합체를 ¹H-NMR, ¹³C-NMR 및 푸리에 변형 적외선(FT-IR)과 같은 각종 분광법을 이용하여 특성화하였고 당해 중합체는 후술되는 화학식 1의 구조를 갖는 것을 밝혀내었다.

또한, 명세서의 후반부에 상세하게 기재되어 있는 바로부터 명백한 바와 같이, 수컷 스위스 알비노 마우스(Swiss albino mice)에 대해 방사성 표지된 중합체를 사용한 연구[참조: 표 4 및 표 7, 및 도 6]를 근거로 하였을 때, 본 발명의 중합체는 비생분해성이고 바이탈 기관(vital organ)에 침적되고 분해되지 않으면서 신체로부터 신속하게 제거되므로 사람/동물에 사용하기 위한 중합체의 안전성 및 유용성을 보장한다는 사실이 밝혀졌다.

본 발명의 중합체의 수용액의 정제와 관련하여 투석 방법과 정용 여과 방법의 비교
인자	투석 방법	정용 여과 방법
배치 크기	제한되고, 따라서, 제약이 있음(예:물 5.0L 중의 중합체 100g)	용적/용량의 4 내지 5배를 가공처리할 수 있음 (물 20.0 내지 25.0L 중의 중합체 400 내지 500g)
공정 조건	개방 환경	밀폐 환경
공정 시간	장시간(24 내지 36시간)	단시간(〈1시간)
작업 및 편이성	수동식; 지루함; 보다 덜 편리함	자동화되고 통제됨; 보다 덜 지루함; 매우 편리함
미생물 오염	가능성이 큼	최소 존재 또는 부재
용액의 초기 용적의 감소/농축화	없음	약 1/4 내지 1/6
용액의 동결 건조 시간 주기	장시간(동결건조되는 초기 용적의 90 내지 110%)	단시간(동결건조되는 초기 용적의 15 내지 25%만)
단량체성 오염	매우 높음	약전 및 독성 한계 미만
확장성 및 산업 수행능	어려움; 보다 덜 실용적임	용이하게 확장 가능함; 의약품 제조 품질 관리 기준 준수; 매우 실용적임

또한, 본 명세서의 후반부에 상세히 설명되어 있는 부분으로부터 명백한 바와 같이(참조: 도 7 내지 도 10), 편재화된 독성(Localized Toxicity)(피하내 및 정맥내), 800mg/kg(동물 체중) 이하의 표적 기관 투여 독성, 6개월 주기 투여량 독성 등과 같은 심도 깊은 독성 연구를 근거로 하였을 때, 본 발명의 중합체는 사람/동물에 사용 및 투여하기 위한 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용하기에 비독성이고 생혼화성이며 생물학적으로 안전한 것으로 밝혀졌다.

또한, 고도로 순수하고 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않으며 추가로 생혼화성이고 비생분해성이며 안전하고 비독성인 본 발명의 중합체는 특히 당해 중합체를 사람/동물에 사용 및/또는 투여하기에 안전하고 저독성인 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 나노 입자형 약제학적 조성물을 제조하는 데 유용하다는 사실이 밝혀졌다.

특히, 본 발명의 생혼화성이고 비생분해성이며 안전하고 비독성인 중합체는 30 내지 150nm 사이의 입자 크기로 나노 입자 형태로 이용가능한 다양한 수 난용성 약물 또는 화합물을 위의 중합체성 쉘 내에 완전히 또는 거의 완전히 함입시키는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 중합체의 구조

특히, 본 발명의 중합체는 다양한 수 난용성 약물 또는 화합물을 위의 중합체성 쉘 내에 완전히 또는 거의 완전히 함입시킨 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 나노 입자형 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 수 난용성 약물 또는 화합물은 용해도가 10mg/ml 미만인 것이다. 이러한 수 난용성 약물 또는 화합물의 예에는, 이로써 제한되는 것은 아니나 항암제, 소염제, 항진균제, 진토제, 고혈압 치료제, 성 호르몬, 스테로이드, 항생제, 면역조절제, 마취제 등이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 항암제의 통상적인 예에는 파클리탁셀, 도세탁셀 및 기타 관련된 탁산 유도체; 이리노테칸, 토포테칸 및 기타 관련된 캄프토테신 유도체; 독소루비신, 다우노마이신 및 기타 관련된 안트라사이클린 유도체; 시스플라틴; 옥살리플라틴; 5-플루오로우라실; 미토마이신; 메토트렉세이트; 에토포사이드; 베튤린산 및 이의 유도체; 및 웨델로락톤 및 이의 유도체가 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 소염제의 통상적인 예에는 인도메타신, 이부프로펜, 케토프로펜, 플루비프로펜, 피록시캄, 테녹시캄 및 나프록센이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 항진균제의 통상적인 예에는 케토코나졸 및 암포테리신 B가 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 성 호르몬의 통상적인 예에는 테스토스테론, 에스로겐, 프로게스테론 및 에스트라디올이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 스테로이드의 통상적인 예에는 덱사메타손, 프레드니솔론 및 트리암시놀론이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 고혈압 치료제의 통상적인 예에는 캅토프릴, 라미프릴, 테라조신, 미녹시딜 및 파라조신이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 진토제의 통상적인 예에는 온단세트론 및 그라니세트론이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 항생제의 통상적인 예에는 메트로니다졸 및 푸시드산이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 면역조절제의 통상적인 예에는 사이클로스포린 및 비페닐 디메틸 디카복실산이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 마취제의 통상적인 예에는 프로폴올, 알팍살론 및 헥소바르비탈이 포함된다.

특히 항암제와 관련하여 본 발명의 중합체는 미국 특허공보 제6,403,816호 및 본 발명의 발명자들에 의해 계류중인 인도 특허원 제265/DEL/2005호(2005년 2월 9일 출원)에 기재되어 있는 각각 다음 화학식 2의 MJ-1098, 화학식 3의 DRF-4012 및 화학식 4의 DRF-4015로 표시되는 것과 같은 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포사이드 및 각종 베튤린산 유도체와 같은 수 난용성 약물 또는 화합물을 그 중합체성 쉘에 완전히 함입시킬 수 있다는 사실이 밝혀졌다.

*MJ-1098, 미국 특허공보 제6,403,816호에 기재되어 있음.

DRF-4012, 인도 특허원 제265/DEL.2005호에 기재되어 있음.

DRF-4015, 인도 특허원 제265/DEL.2005호에 기재되어 있음.

상기한 바와 같은 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물, 특히 파클리탁셀, 도세탁셀 및 에토포사이드와 같은 수 난용성 약물 또는 화합물 및 상기한 바와 같은 MJ-1098, DRF-4012 및 DRF-4015와 같은 중요한 항암성 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물은 Burman 등의 미국 특허공보 제6,365,191호에 기재되어 있는 방법에 따라 제조된 것으로서 당해 특허 문헌에 겨우 12시간의 안정성을 지니는 것으로 청구되어 있는 파클리탁셀의 나노 입자형 약제학적 조성물에 비해 24 시간을 초과하는 보다 장시간의 안정성을 지니는 것으로 밝혀졌다. "안정성"이라는 용어와 관련하여 수 난용성 약물 또는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 내에서 상기한 수 난용성 약물 또는 화합물이 어떠한 침전도 발생시키지 않으면서 용액 상태로 잔류하는 기간을 시간으로 계측한 것을 의미하는 것으로 간주한다.

또한, 상기한 바와 같은 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물, 특히 파클리탁셀, 도세탁셀 및 에토포사이드와 같은 수 난용성 약물 또는 화합물 및 상기한 바와 같은 MJ-1098, DRF-4012 및 DRF-4015와 같은 중요한 항암성 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물에 있어서, 상기한 수 난용성 약물 또는 화합물은 중합체성 마이셀 내에서 24시간 후에도 95%를 초과하는 정도로 함입되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이와는 대조적으로 Burman 등의 미국 특허공보 제6,365,191호에 기재되어 있는 방법에 따라 제조된 파클리탁셀의 나노 입자형 약제학적 조성물에 있어서는 중합체성 마이셀 내에서 24시간 후에 겨우 90% 정도로만 함입되어 있는 것으로 밝혀졌다.

단량체성 불순물을 실질적으로 포함하지 않는 고순도의 본 발명의 중합체를 포함하는 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물과 미국 특허공보 제6,365,191호에 기재되어 있는 파클리탁셀의 나노 입자형 약제학적 조성물과의 대조는 표 4에 요약되어 있는 대조 결과로부터 명백해질 것이다.

본 발명의 수 난용성 약물 또는 화합물의 약제학적 조성물과 미국 특허공보 제6,365,191호에 기재되어 있는 약제학적 조성물의 대조
순번	세부사항	미국 특허공보 제6,365,191호에 포함되어 있는 기재사항	본 발명
1	수 난용성 약물 또는 화합물	탁산 유도체, 특히 파클리탁셀	다양한 약물 및 화합물
2	약제학적 조성물 내에서 사용된 중합체	NIPAM, VP 및 MPEG 단량체 단위를 포함함	NIPAM, VP 및 MPEG 단량체 단위를 포함함
3	중합체 내에 존재하는 단량체성 불순물	NIPAM:0.066-0.076 %w/w VP:0.008-0.011 %w/w	NIPAM:〈0.001%w/w VP:〈0.001%w/w
4	약제학적 조성물 중의 나노 입자의 크기	명시되지 않음	30-150nm
5	안정성	약 12시간	＞24 시간
6	24시간 후에 중합체성 마이셀 내에 함입되어 있는 약물	90%	＞95%

본 발명의 방법에 따라 수득한 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도의 본 발명의 중합체의 이점뿐만 아니라, 상기한 본 발명의 중합체를 포함하는 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물의 이점이, 상기에서 상세히 논의한 바와 같이, 선행 기술의 중합체 및 약제학적 조성물의 이점을 초월하는 것 이외에 본 발명의 발명자들은 추가로 본원에서 사용된 중합체의 중합체성 쉘 내에 함입된 수 난용성 약물 또는 화합물이 일정한 크기의 나노 입자 형태로 생성되는 수 난용성 약물 또는 화합물의 약제학적 조성물을 고도로 선택적으로 제조하는 방법을 밝혀냈다. 이와 같은 고도로 선택적인 방법은 본 발명의 또 다른 발명성이 있는 측면이다.

우선, Burman 등의 미국 특허공보 제6,365,191에서 실시예 1 내지 40에 포함된 기재사항과 "바람직한 조성물" 및 "주입용 제형"이라는 표제하에 주어진 기재사항으로부터 파클리탁셀의 약제학적 조성물은 먼저 소정량의 중합체를 소정량의 희석액에 용해시킨 후(일반적으로, 5% 또는 10% 덱스트로즈 용액), 음이온성 계면활성제를 가하여 투명액을 수득하고 pH를 임의로 완충제를 사용하여 조절함으로써 확실히 제조한다는 사실을 주지해야 한다. 이어서 이렇게 하여 생성된 희석액 중의 중합체 및 음이온성 계면활성제의 투명액에 파클리탁셀의 알콜성 용액을 가하여 약물 농도를 필수적으로 투여용으로 유용한 나노 입자형 약제학적 조성물이 되도록 청구된, 0.1 내지 10 mg/ml 범위로 조절한다.

상기한 바와 같이, 미국 특허공보 제6,365,191호는 위와 같이 하여 수득된 나노 입자의 크기에 대해서는 언급하지 않고 있으나 본 발명의 발명자들이 Burman 등의 미국 특허공보 제6,365,191에서 실시예 1 내지 40에 기재되어 있는 방법과 "바람직한 조성물" 및 "주입용 제형"이라는 표제하에 주어진 방법에 따라 파클리탁셀의 약제학적 조성물을 제조했을 때, 일정치 않은 크기의 나노 입자가 생성되거나 발생하는 것으로 밝혀졌다.

이러한 배경하에서 본 발명의 발명자들은 일정한 크기의 나노 입자가 생성된다는 것은 대단히 선택적이며 다음과 같은 사항에 크게 의존한다는 사실을 밝혀냈다:

i) 파클리탁셀의 알콜성 용액을 희석액 중의 중합체 및 기타 부형제의 용액에 가하는 속도;

ii) 파클리탁셀의 알콜성 용액의 용적 및 파클리탁셀의 알콜성 용액이 첨가될 희석액의 용적;

iii) 파클리탁셀의 알콜성 용액을 희석액 중의 중합체 및 약제학적으로 허용되는 부형제의 용액에 가하는 데 사용되는 니들의 내부 직경 또는 구멍 크기 ; 및

v) 파클리탁셀의 알콜성 용액의 첨가시 희석액, 중합체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 용기의 위치.

특히, 본 발명의 발명자들은 다음과 같은 경우를 통해서만, 중합체성 쉘 내에서, 크기 변화가 최소이거나 무시할 정도이고 약물의 부하가 일정하며 입자 크기가 일정한 나노 입자를 수득할 수 있음을 밝혀냈다.

a) 파클리탁셀의 알콜성 용액을 시린지를 통해 특정 시간 내에 희석액 중의 중합체 및 기타 부형제의 용액에 첨가;

b) 보다 소용적의 파클리탁셀의 알콜성 용액을 희석액 중의 중합체 및 약제학적으로 허용되는 부형제의 용액에 첨가하기 위한, 내부 직경이 0.305 mm 내지 0.356 mm인 니들의 사용; 또는

c) 보다 대용적의 파클리탁셀의 알콜성 용액을 희석액 중의 중합체 및 약제학적으로 허용되는 부형제의 용액에 첨가하기 위한, 내부 직경이 0.559 mm 내지 0.711 mm인 니들의 사용;

d) 파클리탁셀의 알콜성 용액을 희석액 중의 중합체 및 기타 부형제의 용액에 주입(여기서, 파클리탁셀의 알콜성 용액이 첨가되는 시린지의 니들은 희석 유액에 침지된 상태로 잔류해야 한다); 및

e) 임의로, 파클리탁셀의 알콜성 용액을 희석액 중의 중합체 및 기타 부형제의 용액에 주입하는 동안 상기한 희석액을 함유하는 용기를 반대 위치로 유지.

추가로, 위와 같은 선택적인 방법을 통해서만 보다 장기간의 안정성을 지니는 약제학적 조성물이 수득될 수 있다는 사실이 밝혀졌다.

또한, 상기한 바와 같은 고도로 선택적인 방법은 파클리탁셀의 나노 입자를 제조하는 데로만 제한되지 않으며 기타 수 난용성 약물 또는 화합물, 특히 상기한 바와 같은 화학식 2의 MJ-1098, 화학식 3의 DRF-4012 및 화학식 4의 DRF-4015와 같은 도세탁셀, 에토포사이드, 베튤린산, 중요한 항암성 베튤린산 유도체의, 입자 크기가 일정한 나노 입자의 제조시에도 동일하게 효과적인 것으로 밝혀졌다.

특히, 보다 소용적, 즉 1 내지 5ml의 수 난용성 약물 또는 화합물의 용액을 희석액 중의 중합체 및 기타 부형제의 용액(주입되는 용적의 약 35배)에 첨가하는 시간이 4초를 초과하는 경우 또는 니들(수 난용성 약물 또는 화합물의 용액이 주입되는)의 내부 직경이 0.305 mm 내지 0.356 mm의 범위를 벗어나는 경우, 이러한 첨가는 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자의 입자 크기를 일정치 못하게 생성하는 결과를 초래할 뿐만 아니라 안정성이 불량한 약제학적 조성물을 제공하는 결과를 초래함으로써 당해 용액은 장시간 동안 투명한 상태로 잔류하지 못하며 단시간 내에 유백색을 띄게 되는 것으로 밝혀졌다.

이와 유사하게 특히, 보다 대용적, 즉 5 내지 15ml의 수 난용성 약물 또는 화합물의 용액을 희석액 중의 중합체 및 기타 부형제의 용액(주입되는 용적의 약 35배)에 첨가하는 시간이 10초를 초과하는 경우 또는 니들(수 난용성 약물 또는 화합물의 용액이 주입되는)의 내부 직경이 0.559 mm 내지 0.711 mm의 범위를 벗어나는 경우, 이러한 첨가는 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자의 입자 크기를 일정치 못하게 생성하는 결과를 초래할 뿐만 아니라 안정성이 불량한 약제학적 조성물을 제공하는 결과를 초래함으로써 당해 용액은 장시간 동안 투명한 상태로 잔류하지 못하며 단시간 내에 유백색을 띄게 되는 것으로 밝혀졌다.

이는 2개의 수 난용성 항암제 또는 항암성 화합물, 즉 파클리탁셀 및 베튤린산 유도체, 즉 화학식 3의 DRF-4012의 약제학적 조성물에 대해 예시할 수 있었다. 여기서 상기한 약물의 용액을 가하는 시간 및 이러한 용액을 희석액 중의 중합체 및 기타 부형제의 용액에 첨가하는 니들의 내부 직경의 효과는 다음의 표 5a 및 5b에 요약해두었다:

본 발명의 약제학적 조성물은 다음과 같은 2개의 바이알 키트로서 편리하게 제공된다:

a) 수 혼화성 용매 또는 이러한 용매들의 혼합물 중의 수 난용성 약물 또는 화합물의 용액을 적당한 약물 농도로 포함하는 하나의 바이알 키트; 및

b) 수성 용매, 일반적으로 주사용 수 중의 약제학적으로 허용되는 부형제와, 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도의 본 발명의 중합체의 용액을 포함하는 다른 바이알 키트(여기서, 2개의 바이알은 모두 살균되었으며 무균 조건하에서 제조되고 팩킹된다).

이어서, 2개의 바이알의 내용물을 사람/동물에 투여하기 전에 희석액에 가한다.

임의로 상기한 키트는 추가로 희석액과 보다 소용적, 즉 1 내지 5ml의 바이알 a)의 내용물을 이의 용적의 약 35배에 해당하는 양의 바이알 b)의 내용물에 첨가하는 경우, 내부 직경이 0.305 내지 0.356 mm의 범위인 니들 및 시린지 또는 보다 대용적, 즉 10 내지 15ml의 바이알 a)의 내용물을 이의 용적의 약 35배에 해당하는 양의 바이알 b)의 내용물에 첨가하는 경우, 내부 직경이 0.559 내지 0.711 mm의 범위인 니들 및 시린지를 포함할 수 있다.

특히 유방암 치료를 위해 환자에 투여하기 위한 파클리탁셀을 포함하는 키트의 경우, 다음과 같은 2개의 바이알 키트가 제공될 것이다:

a) 에탄올 20ml 중의 파클리탁셀 400mg의 용액을 함유하는 하나의 바이알; 및

b) 물 20ml중의 약제학적으로 허용되는 부형제와, 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도의 본 발명의 중합체 200mg을 함유하는 용액을 함유하는 다른 바이알.

임의로 당해 키트는 추가로 크기 변화가 최소이거나 무시할 정도이고 중합체 쉘 내에서의 약물의 부하가 일정하며 보다 장기간동안 안정성을 보장하는 입자 크기가 일정한 나노 입자 형태로 투여하기에 적합한 약제학적 조성물을 생성하기 위해 10% 덱스트로즈 용액 500 ml 보틀(bottle)과, 바이알 a)의 용액을 10초를 초과하지 않는 시간, 바람직하게는 6초의 시간 내에 바이알 b)의 용액을 첨가한 10% 덱스트로즈 용액 500 ml 보틀에 주입하기 위한 내부 직경이 0.711 mm인 니들 및 시린지를 포함할 수 있다.

요약하자면 본 발명은 상기한 바와 같이 나노 입자 기술 분야의 선행 기술 방법의 대부분의, 아니면 모든 한계에 대한 해결책을 제공하는 데 있어서 진일보한 단계로서 다음을 제공한다:

i) 특히, 사람/동물용으로 사용하기에 생혼화성이고 비생분해성이며 안전하고 비독성이도록 설정된 것으로서 NIPAM, VP 및 MPEG로부터 선택된 3개의 단량체 단위를 포함하고 중합체 중의 독성 NIPAM 및 VP의 양이 < 0.001%이며 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도 중합체;

ii) 이렇게 제조된 중합체의 수용액을 정용 여과시킴을 포함하여 NIPAM, VP 및 MPEG로부터 선택된 3개의 단량체 단위를 포함하고 중합체 중의 독성 NIPAM 및 VP의 양이 < 0.001%이며 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도 중합체를 고도로 선택적으로 제조하는 방법;

iii) 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도 중합체를 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 사람/동물에 사용하거나 투여하기에 안전하고 비독성이며 따라서 매우 적합한 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물;

iv) 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도 중합체를 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 나노 입자의 입자 크기가 일정하고 약물 부하가 일정한 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물을 고도로 선택적으로 제조하는 방법; 및

v) 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도 중합체를 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 나노 입자의 입자 크기가 일정하고 약물 부하가 일정하며 보다 장기간 동안 안정한 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물.

발명의 상세한 설명

A. 본 발명의 중합체의 제조방법

본 발명의 중합체는 NIPAM, VP 및 MPEG로부터 선택된 3개의 단량체 단위를 포함하며 여기서 중합체 쇄는 어떠한 설프하이드릴 그룹 또는 디설파이드 결합도 함유하지 않는 가교결합제로 가교결합시킨다.

가교결합제는 선형 중합체 쇄에 가교결합을 제공함으로써 중합반응이 진행되는 동안 중요한 역할을 하며 사용되는 경우, 일반적으로 이작용성 비닐 유도체이다. 가교결합제는 이작용성보다 클 수도 있는데 이를 테면 2개 이상의 반응성 부위를 가질 수도 있다. 유리하게 사용되어질 수 있는 이작용성 비닐 유도체는 바람직하게는 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드(MBA)이다.

본 발명의 중합체는 중합반응용으로 통상적으로 적용되는 일반적인 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

특정 양태에 있어서 본 발명의 중합체는 단량체인, N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM), 1-비닐-2-피롤리돈(VP) 및 말레산 무수물의 폴리에틸렌 글리콜(분자량:6000) 에스테르(MPEG)을 활성화제, 중합반응 개시제 및 가교결합제의 존재하에 수성 매질 속에서 자유 래디칼 중합반응시킴으로써 제조할 수 있다.

단량체인 N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM)와 비닐피롤리돈(VP)의 배합물은 55:22 내지 65:35의 중량비 범위로 사용할 수 있고 사용가능한 (NIPAM + VP) : MPEG의 공단량체성 조성물은 80:20 내지 95:5의 범위로 존재한다. 보다 특히 바람직하게는 단량체인, N-이소프로필 아크릴아미드(NIPAM)와 비닐피롤리돈(VP)의 배합물은 58:32 내지 62:28의 중량비로 사용되며 (NIPAM + VP) : MPEG의 공단량체성 조성물은 90:10 또는 95:5의 범위로 사용되고 이러한 특정 비는 말레산 무수물-폴리에틸렌 글리콜(MPEG)의 디에스테르 부가 생성물(주 생성물) 및 모노에스테르 부가 생성물(부 생성물)에 의한 수소 결합으로부터 형성된 외부 쉘 피복물에 의해 안정화되는 랜덤하게 다분지된 NIPAM 및 VP의 공중합체 단위를 형성시키는 이유로 인하여 위와 같은 특정 비는 중합체에 바람직하게 생혼화성이고 비생분해성이며 생물학적으로 안전한 특성을 부여하는 것으로 밝혀졌다.

중합반응 개시제는 자유 래디칼 형성 개시시 중요한 역할을 한다. 사용 가능한 개시제는 단독으로 또는 배합하여 사용되는 퍼옥사이드 화합물(예: 디아실 퍼옥사이드, 벤조일 퍼옥사이드, 디아세틸 퍼옥사이드, 디알킬 퍼옥사이드, 3급 부틸 퍼옥사이드 및 3급 아밀 퍼옥사이드) 또는 니트릴계 중합반응 개시제(예: 2,2'-아조비스 이소부티로니트릴(AIBN)) 또는 무기염계 중합반응 개시제(예: 과이황산암모늄 또는 과황산암모늄(APS))일 수 있다.

상기한 중합반응 개시제 중에서, 과황산암모늄(APS)가 바람직한 것이다.

중합반응 개시제가 중합반응을 개시하기는 하나, 중합반응은 중합반응 개시제로부터 유리 래디칼의 형성을 촉매화하는 활성화제의 존재에 의해 촉진되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 활성화제는 테트라메틸에틸렌 디아민(TMED) 및 황산제일철암모늄(FAS)으로부터 선택될 수 있고 TMED와 FAS의 배합물이 바람직하다. 중합반응 개시제와 활성화제의 모든 배합물을 당해 중합반응에 이용할 수 있다. 2개 이상의 개시제를 사용할 수도 있다. 이와 유사하게 2개 이상의 활성화제를 사용할 수도 있다.

상기한 바와 같이 가교결합제는 선형 중합체 쇄에 가교결합을 제공함으로써 중합반응이 진행되는 동안 중요한 역할을 하며, 사용되는 경우, 일반적으로 이작용성 비닐 유도체이다. 가교결합제는 이작용성 이상의 작용성을 지닐 수도 있는데 이를 테면 2개 이상의 반응성 부위를 가질 수도 있다. 사용 가능한 이작용성 비닐 유도체는 바람직하게는 N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드(MBA)이다.

중합반응은 질소 또는 아르곤일 수 있는 불활성 기체의 존재하에서 수행할 수 있다.

일반적으로 중합반응은 우선 적당량의 각각의 단량체, 즉 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM), 1-비닐-2-피롤리돈(VP) 및 말레산 무수물의 폴리에틸렌 글리콜(분자량: 6000) 에스테르(MPEG)를 수성 용매, 일반적으로 물에 용해시킴으로써 수행한다. 이렇게 수득된 각각의 단량체의 수용액에 가교결합제 및 활성화제의 수용액을 연속적으로 가한다. 당해 용액은 불활성 기체를 약 30 내지 60분 동안 버블링(bubbling)시킴으로써 탈기시킨다. 이렇게 탈기된 용액에 중합반응 개시제의 수용액을 가하고 당해 용액을 25 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 35℃의 온도에서 중합반응이 완료되는 시점까지 연속적으로 불활성 기체를 버블링시키면서 중합반응시킨다.

가교결합제는 단량체의 총량의 1.3 내지 1.5 %w/w의 범위, 보다 바람직하게는 단량체의 총량의 1.35 내지 1.4 %w/w의 범위에 해당하는 양으로 사용할 수 있다.

활성화제는 단량체의 총량의 15 내지 18 %w/w의 범위, 보다 바람직하게는 단량체의 총량의 15 내지 16 %w/w의 범위에 해당하는 양으로 사용할 수 있다.

중합반응 개시제는 단량체의 총량의 20 내지 30 %w/w의 범위, 보다 바람직하게는 단량체의 총량의 23 내지 25 %w/w의 범위에 해당하는 양으로 사용할 수 있다.

중합반응의 진행은 HPLC로 모니터링(monitoring)할 수 있으며 통상적으로 약 3 내지 6시간 이내에 종료된다.

중합반응 종료 후에, 용액을 예비 살균시킨 1회용 0.2μm 폴리에테르설폰 막 1" 캡슐 여과기[0.8 및 0.2μm 직경 크기; 타입 DPS-5101AA-201(제조원: M/S Advanced Microdevices Pvt. Ltd, India)]를 통해 여과시킨다. 반응 용기로부터의 여과물을 Proflux M12(Millipore)를 이용하는 정용 여과 장치를 사용하여 정용 여과시켜 단량체성 불순물과 기타 저분자량 불순물을 제거한다.

정용 여과는 일반적으로 1시간 이내에 종료되고 통상적으로 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않을 뿐만 아니라 통상적으로 정용 여과시키는 용액의 초기 용적의 1/4 내지 1/6의 농축된 형태의 용액을 제공한다. 경우에 따라 이렇게 해서 수득한 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 농축액을 또 다른 정용 여과 주기에 적용시킨다. 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도의 본 발명의 중합체의 농축액을 동결 건조 단계에 적용시켜 약제학적 조성물에 사용하기 위한 고형 동결 건조 형태의 중합체를 수득하거나 농축액 그대로를 약제학적 조성물의 제형에 직접 사용할 수 있다.

통상의 양태에 있어서, 중합반응은 적당량의 각각의 단량체, 즉 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM), 1-비닐-2-피롤리돈(VP) 및 말레산 무수물의 폴리에틸렌 글리콜(분자량 6000) 에스테르(MPEG)를 물에 용해시킴으로써 수행한다. 이렇게 수득한 각각의 단량체의 수용액에 적당량의 가교결합제의 수용액(약 5% w/v), N,N'-메틸렌 비스아크릴아미드(단량체의 총량의 약 1.37 %w/w) 및 적당량의 테트라메틸에틸렌 디아민(TMED, 단량체의 총량의 약 15.4%w/w)과 황산제일철암모늄(단량체의 총량의 약 0.1 %w/w)의 수용액(0.5% w/v)을 포함하는 활성화제의 배합물을 가한다. 우선, 하나의 활성화제를 가하고 다른 활성화제를 중합반응 개시제와 함께 나중에 가하는 것이 바람직하다. 당해 용액은 질소를 약 30분 동안 버블링시킴으로써 탈기시킨다. 이어서 이렇게 탈기시킨 용액에 중합반응 개시제인, 과황산암모늄(단량체의 총량의 약 24 %w/w)의 수용액을 적당한 용적(약 80 % w/v) 가하고 당해 용액을 중합반응이 종료될 때까지 연속적으로 질소를 버블링시키면서 바람직하게는 25 내지 35℃의 온도에서 중합반응시킨다. 통상적으로 중합반응은 3 내지 5시간 이내에 종료된다.

중합반응이 종료된 후, 용액을 예비 살균시킨 1회용 0.2μm 폴리에테르설폰 막 1" 캡슐 필터(0.8 + 0.2μm 기공 크기)를 통해 여과시킨다. 반응 용기의 여과물을 정용 여과시켜 단량체성 불순물 및 기타 저분자량 불순물을 제거한다.

통상의 양태에서 물 50ml 중의 중합체 50ml의 농도로 물 중의 중합체의 용액을 정용 여과시킬 수 있으며 이때 정용 여과 후에 NIPAM 및 VP를 둘다 0.001%w/w 미만의 양으로 함유하는 초기 용적의 약 1/4 내지 1/6에 해당하는 중합체의 농축액, 즉 물 약 12 내지 13ml 중의 중합체 1g의 농축액이 수득된다.

중합체 내에 잔류하는 단량체, 특히 중합체 내에 잔류하는 VP 및 NIPAM의 검출과 정량화는 HPLC로 수행했다. 단량체의 검출에 사용할 수 있는 HPLC 시스템은 역상 RP-18(C-18) 컬럼[Lichrospher RP-18e, 5μ, 250 mm x 4 mm]을 사용하는 Agilent 1100 시리즈 또는 이의 등가 수준에 해당하는 시스템이다. 사용된 이동상은 1 ml/분 유속으로 물과 아세토니트릴을 80:20의 비율로 포함하는 혼합물이며 샘플 주입 용적은 50 μl이다.

작업 시간은 10분이고, 컬럼 온도는 30℃이며 검출기의 파장은 226 nm이다.

상기한 조건하에서 NIPAM의 체류 시간은 약 3분인 반면, VP의 체류 시간은 약 5분이다.

이렇게 수득된 중합체의 농축액은 고순도이고 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않으며 이를 동결 건조 단계에 적용시켜 중합체를 약제학적 조성물 내에서 사용하기 위한 고형 동결 건조 형태로 수득할 수 있거나 농축액을 그대로 약제학적 조성물의 제형화에 직접 사용할 수 있다. 그러나 농축액을 그대로 약제학적 조성물의 제형화에 직접 사용하는 것이 바람직하다.

B. 본 발명의 중합체의 특성화

상기한 바와 같은 방법으로 수득한 본 발명의 중합체를 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, 푸리에 변형 적외선(Fourier Transform Infrared)(FT-IR) 등과 같은 광범위 분광 분석 및, 시차 주사 열량계(DSC) 및 열 중량 분석(TGA) 등과 같은 열분석에 적용시켜 상기와 같이 수득한 중합체의 구조를 밝혔다.

CDCl₃ 중의 본 발명의 중합체의 ¹H NMR 스펙트럼은 다음과 같은 위치에서 피이크를 나타낸다:δ(ppm) 1.14(br, -CH(CH₃)₂); 1.45(br, -CH₂-CH-N(VP-링); 1.63(br,-CH₂-CHC(=O)NH); 1.99(br, -CHC(=O)NH-), CH₂(VP 링), 2.36(CH₂, VP 링), 3.0(-0-CH₂-CH₂-), 3.23(CH₂-N-); 3.62-3.66(Br, CH₂, MPEG); 3.72(NH-CH(CH₃)₂); 3.97(Br, CH). 본 발명의 중합체의 ¹H-NMR 스펙트럼은 도 1에 요약하였다.

본 발명의 중합체의 ¹³C NMR 스펙트럼은 다음과 같은 위치에서 피이크를 나타낸다:δ(ppm) 174(C=O); 76.6-77.6(CDCl₃에 대해 다중선 및 중합체 주쇄의 CH); 70.6(CH₂'s MPEG); 41.6(이소프로필 단위의 CH); 31,8(CH₂'s, 중합체 주쇄); 22.6(CH₃'s, 이소프로필). 본 발명의 중합체의 ¹³C NMR 스펙트럼은 도 2에 요약하였다.

본 발명의 중합체의 푸리에 변형 적외선(FT-IR) 스펙트럼은 다음과 같은 주파수(cm^-1)에서 피이크를 나타내었다: 3500(s, OH); 3296(s, NH, 2급-아미드); 2972-2933(s, CH, CH₂, CH₃); 1651(br, 강한, 분열된 피이크, 에스테르 C=O 및 아미드 I의 C=O); 1546(s, 아미드 II의 NH 밴드 및, 가능하게는 유리산의 C=O, 소량); 1387, 1367(이소프로필 그룹의 이중선, CH₃, 변형), 1172-1129(m, 0-C-O). 본 발명의 중합체의 푸리에 변형 적외선(FT-IR) 스펙트럼은 도 3에 요약하였다.

위와 같은 특성화 연구는 본 발명의 중합체가 아래의 화학식 1로 표시되는 구조를 지닌다는 사실을 뒷받침한다:

화학식 1

또한 중합체의 물리화학적 특성을 상세하게 특성화하기 위해 중합체의 열적 특성, 임계 마이셀 농도(CMC), 용해도, pH 및 저장 안정성과 같은 각종 특성을 측정하였다.

열 중량 분석(TGA) 결과는 51 내지 260℃에서 다소의 중량 손실이 있음을 입증하는데 이는 약 310℃에서 발생하는 분해가 개시되기 전에 중합체의 MPEG 단위에서 특히 발생할 수 있는 몇몇 매크로분자 반응물과 용매의 손실을 나타낸다. 이는 중합체가 대체로 MPEG 단위에 의해 제공될 수 있는 높은 열 안정성을 지님을 나타낸다. 본 발명의 중합체의 TGA 열 분석도는 도 4에 요약하였다.

추가로, 도 5에 나타낸 중합체의 시차 주사 열량계(DSC) 특성은 어떠한 유리 전이 온도(Tg)도 나타내지 않았고 58 ℃의 융점(Tm) 및 38.4 ℃의 재결정화점(Tc) 만이 관찰되었다. 분명한 Tg가 존재하지 않는다는 사실은 MPEG에 의한 광범위한 수소 결합이 기여할 수도 있는 매우 강한 고분지화된 구조임을 나타낸다.

본 발명의 중합체의 구조

중합체의 하한 임계 용액 온도(LCST)는 50 내지 60℃의 영역에서 값을 갖는다. 다시 말해서 이는 소위 LCST라고 칭명되는 특정 온도에서 열 반응성 상 전이시 명백하게 나타나는 수성 상 중의 양쪽성 중합체의 중요한 인자이다. LCST 미만의 온도에서 중합체는 가용성 연장 쇄 형태, 즉 친수성 거동을 나타낸다. LCST를 초과하는 온도에서 중합체는 상전이를 일으켜 불용성 소수성 응집체를 형성한다. 이러한 성질은 적합한 용매 속에서 마이셀을 형성하고 약제학적 적용시 약물용 전달 시스템에서 작용하는 성능을 측정하는 데 유용하다.

임계 마이셀 농도(CMC)는 나노 담체의 캡슐화능을 한정하고 안정성을 측정하는 또 다른 중요한 인자이다. 이는 약물을 이의 소수성 코어에 캡슐화시킬 수 있는 마이셀 구조를 형성하는 양쪽성 중합체 또는 유니머(unimer)의 최소 농도이다. 본 발명의 중합체의 CMC 값은 약 0.2mg/ml이다. 또한 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM) 및 1-비닐 피롤리딘-2-온(VP)과 같은 열 감응성 및 pH 감응성 단량체로 이루어진 중합체는 단백질 및 혈구와 생혼화성인 것으로 익히 공지되어 있다. 또한, 폴리(NIPAM)의 생의학적 적용은 이의 가역적인 온도 전이, 즉 LCST, 탁월한 수소 결합, 및 마이셀 및 하이드로겔 형성능으로 인하여 상당히 보급되어 있는 실정이다. 이와 유사하게 폴리비닐피롤리돈(포비돈(Povidone)으로서도 공지되어 있는) 중합체는 또한 수용성이 크고 물과 강력한 수소 결합을 형성한다. 이러한 중합체의 목적하는 용도는 수 난용성 약물을 안정화시키는 친수성 그룹 및 소수성 그룹을 함유하는 열 감응성이고 pH 감응성이며 안정한 중합체성 나노 입자의 형성을 유도하는 농도의 소정의 다양한 단량체를 혼입한 신규한 혼입 시스템을 고안해 내는 데 있다.

매우 놀랍게도 (NIPAM + VP) : MPEG의 공단량체성 조성물을 80:20 내지 95:5의 범위로 포함하고 NIPAM : VP 단위를 55:22 내지 65:35의 범위로 포함하는 말레산 무수물-폴리에틸렌 글리콜(MPEG)의 디에스테르 부가 생성물(주 생성물) 및 모노에스테르 부가 생성물(부 생성물)에 의한 수소 결합으로부터 형성된 외부 쉘 피복물에 의해 안정화된 NIPAM 및 VP로 이루어진 랜덤하게 고분지화된 공중합체 단위의 형성이 중합체에 목적하는 생혼화성, 비생분해성 및 생물학적으로 안전한 특성을 부여하는 것으로 밝혀졌다. 특히, (NIPAM + VP) : MPEG의 조성물이 90:10 또는 95:5의 범위로 존재하고 NIPAM : VP 단위가 58:32 내지 62:28의 범위로 사용되는 경우, 우수한 결과(고 LCST, 고 수율, 파클리탁셀 나노 입자로부터의 방출 백분율)가 수득되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 사용된 단량체의 비는 최종 생성물에서 일정하며 이는 ¹H-NMR, ¹³C-NMR 및 푸리에 변형 적외선(FT-IR) 분광학 연구와 같은 각종 연구에 의해 확인된다.

C. 본 발명의 중합체의 생혼화성 및 비생분해성

[¹⁴C]-표지된 중합체의 약동학, 생체 분포 및 제거는 스위스 알비노 마우스를 사용하여 측정하였고, 0.448 ± 0.157 시(26.88 분)의 짧은 제거 반감기 T1/2(β)와 54.7 ml/시의 신속한 제거율을 포함하는 방사능 혈액 농도 특성은 2-상 곡선(도 6)을 나타냈다. 이러한 연구 결과를 표 6 및 표 7에 요약하였다.

본 발명의 중합체의 약동학적 인자
인자	산정치± SE
T₁ _/2(K10)	0.152±0.018시
T₁ _/2(α)	0.065±0.014시
T₁ _/2(β)	0.448±0.157시
C_max	82.96±5.11μg/ml
AUC	18.29±1.62hr ×μg/ml
CL	54.67±4.86ml/시
MRT	0.465±0.13시
V_ss	25.43±5.2ml

주요 제거 경로는 소변(48시간에 소변 66.91% : 대변 17.39%)인 것으로 밝혀졌고 48시간까지 수집된 회수 데이터는 주입된 방사능의 84.87%로 측정되었다. 조직 분포는 무시할 정도이다. 신장, 간, 피부 및 장이 표적 조직인 것으로 밝혀졌다. 그러나 조직 내에서의 중합체의 양은 소변 및 대변을 통해 신속하게 제거되었다.

본 발명의 방사능 표지된 중합체의 회수
시간	투여량의 %
시간	0-10분	0-1시간	0-24시간	0-48시간
소변	27.14	61.64	64.56	66.91
대변	0.10	0.65	12.29	17.39
조직	15.50	3.22	0.78	0.57
린스	5.04	2.27	0.84	0.00
총량	47.16	67.78	78.47	84.87

따라서, 결론적으로 중합체는 바이탈 기관 내에서 축적 및 분해되지 않고 신체로부터 신속하게 제거되는 것으로 밝혀졌으며 이는 인체에 사용하기 위한 중합체의 안전성과 유용성을 암시한다.

D. 본 발명의 중합체에 대한 독성 연구

다음 사항을 평가하기 위하여, 화학식 1의 중합체의 독성 연구를 실시하였다:

(i) 편재화된 독성(피하내 및 정맥내);

(ii) 800mg/kg(동물 체중) 이하의 표적 기관 투여량 독성 및

(iii) 6개월 주기 투여량 독성

D(i) 편재화된 독성( 피하내 및 정맥내 )

중합체의 독성은 토끼의 귀에 중합체 75mg/ml 중의 100 μl를 단일 피하내 투여하여 주사 부위에서 완만한 감염을 야기시킨 후에 측정하였는데 주사하고 48시간 후에 시험하는 경우, 본 발명의 중합체는 피하내 투여를 실시한 투여 부위에서 어떠한 편재화된 독성도 야기시키지 않는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 중합체의 독성은 본 발명의 중합체를 토끼의 귀 정맥에 125 mg/kg의 투여량으로 5일 동안 연속적으로 정맥내 투여하여 측정하여 유사한 결과를 수득함으로써 본 발명의 중합체가 투여 부위에서 어떠한 편재화된 독성도 야기하지 않는다는 사실을 추가로 확인하였다.

10% 덱스트로즈 용액으로 피하내 주사하고 48시간 후에 S&E 착색된 토끼 귓볼 부위의 대표적인 사진을 도 7에 도시하였고 중합체의 수용액으로 피하 내 주사하고 48시간 후에 S&E 착색된 토끼 귓볼 부위의 사진을 도 8에 도시하였다.

10% 덱스트로즈 용액으로 정맥내 주사하고 24시간 후에 S&E 착색된 토끼의 변연 귀정맥 부위의 대표적인 사진을 도 9에 도시하였고 중합체의 수용액으로 정맥내 주사하고 24시간 후에 S&E 착색된 토끼의 변연 귀정맥 부위의 사진을 도 10에 도시하였다.

D( ii ) 표적 기관 투여량 독성(800 mg / kg (동물 체중) 이하)

또한, 독성은 특별히 미세 맥관 구조를 참고로 하여 가능한 표적 기관에서 평가하고 비스타르 래트에 단일 정맥 주사로 투여함으로써 측정하였다. 중합체를 두가지 상이한 투여량, 즉 400 mg/kg 및 800 mg/kg으로 투여하였다. 연구 조건하에서 본 발명의 중합체의 단일 정맥 주사 투여는 어떠한 투여량에서도 래트에서 어떠한 치명적이거나 관찰할 만한 독성의 신호나 증상을 제공하지 않는다. 래트의 개별 체중 및 평균 체중은 중합체 처치 그룹과 대조 그룹 모두에서 꾸준히 증가했다. 대조 그룹의 체중과 대비해서 양 투여량 모두에서 처치된 동물의 체중 상의 차이는 크게 없는 것으로 주시된다.

중합체를 사용하여 처치한 래트에서 혈액학적 인자는 전 연구를 통해서 정상 범위 내에 있다. 또한, 생화학적 인자도 양 투여량 모두로 처치된 동물의 정상 범위 내에 있었다. 광 회전 운동 감지기(photoactometer) 시험 결과는 각각 제7일 및 제21일에 대조 그룹과 처치 그룹 사이의 운동 활성 간의 차이는 크게 없는 것으로 밝혀졌으며 이는 중합체가 어떠한 신경 독성도 지니지 않는다는 사실을 암시한다.

처치 그룹 표본과 대조 그룹 표본은 유사한 조직학적 특징을 나타냈다. 조직학적 연구는 간, 심장, 폐, 신장, 비장, 위, 결장, 대퇴근 및 눈과 같은 바이탈 기관에 대해 수행하였다. 연구된 모든 기관은 현미경 사진에서 정상 구조를 나타내었다. 각각의 기관 내에서의 미세 맥관 구조를 조심스럽게 시험하였고 어떠한 기관에서도 병리학적 특징을 발견할 수 없었다. 또한 중합체 처치된 동물의 미세 맥관 구조의 변화도 없었다.

상기한 관찰로부터 400 mg/kg(체중) 또는 800 mg/kg(체중)의 투여량으로 5일 동안 연속적으로 투여된 본 발명의 중합체는 어떠한 일반적인 독성이나 어떠한 유의한 혈액학적 독성을 야기하지 않았다는 사실은 확실히 명백하고 이는 본 발명의 중합체가 생물학적으로 안전하고 비독성인 특성을 지님을 나타낸다.

D( iii ) 6개월 주기 투여량 독성

추가로 나노 입자 제형에 사용된 중합체를 정맥내 주사하여 6개월 주기 투여량 독성을 래트에 대해 연구하였다. 수컷/암컷 비스타르 래트를 본 연구에 사용하였고 180일(약 26주) 동안 매 3주마다 주기적으로 후방 꼬리 정맥에 정맥내 주사하여 투여하였다. 처치된 동물과 대조 그룹 동물은 연구가 진행되는 동안 일반적으로 활기가 있었고 건강했다. 약물 10 mg/kg에 상당하는 중합체 농도는 연구하에 있는 동물에서 안전한 것으로 밝혀졌다. 주목되는 혈액학적 인자의 최소 변경은 비스타르 래트에 대해 정상 범위 내에 있고 관련된 치료가 없었던 것으로 밝혀졌다.

상기한 연구는 합성 중합체가 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용하기에 비독성이고 생물학적으로 안전한 것임을 암시한다.

E. 본 발명의 중합체를 포함하는 약제학적 조성물

상기에서 논의한 바와 같이, 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않고 특히 잔류하는 단량체성 NIPAM 및 VP가 <0.001%인 고순도의 본 발명의 화학식 1의 중합체는 사람/동물 투여 또는 사용에 대해 안전하고 비독성인, 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물의 제조시의 이점을 위해 사용할 수 있다.

특히, 본 발명의 중합체는 다양한 수 난용성 약물 또는 화합물을 이의 중합체 쉘 내에서 완전히 또는 거의 완전히 함입시킨 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 나노 입자형 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용할 수 있다.

또한, 상기한 바와 같이 본 발명의 약제학적 조성물에 사용할 수 있는 수 난용성 약물 또는 화합물은 일반적으로 10 mg/ml 미만의 수 용해도를 지니는 것이다.

이러한 수 난용성 약물 또는 화합물의 예에는, 이로써 제한되지는 않으나 항암제, 소염제, 항진균제, 진토제, 고혈압 치료제, 성 호르몬, 스테로이드, 항생제, 면역조절제, 마취제 등이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입시킬 수 있는 항암제의 통상적인 예에는 파클리탁셀, 도세탁셀 및 기타 관련 탁산 유도체; 이리노테칸, 토포테칸 및 기타 관련 캄프토테신; 독소루비신, 다우노마이신 및 관련된 안트라사이클린 유도체; 시스플라틴; 옥살리플라틴; 5-플루오로우라실; 미토마이신; 메토트렉세이트; 에토포사이드; 베튤린산 및 이의 유도체; 및 웨델로락톤 및 이의 유도체가 있다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 소염제의 통상적인 예에는 인도메타신, 이부프로펜, 케토프로펜, 플루비프로펜, 피록시캄, 테녹시캄 및 나프록센이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 항진균제의 통상적인 예에는 케토코나졸 및 암포테리신 B가 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 성 호르몬의 통상적인 예에는 테스토스테론, 에스로겐, 프로게스테론 및 에스트라디올이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 스테로이드의 통상적인 예에는 덱사메타손, 프레드니솔론 및 트리암시놀론이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 고혈압 치료제의 통상적인 예에는 캅토프릴, 라미프릴, 테라조신, 미녹시딜 및 파라조신이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 진토제의 통상적인 예에는 온단세트론 및 그라니세트론이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 항생제의 통상적인 예에는 메트로니다졸 및 푸시드산이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 면역조절제의 통상적인 예에는 사이클로스포린 및 비페닐 디메틸 디카복실산이 포함된다. 중합체성 쉘 내에 함입될 수 있는 마취제의 통상적인 예에는 프로포폴(propofol), 알팍살론 및 헥소바르비탈이 포함된다.

수 난용성 약물 또는 화합물의 약제학적 조성물은 한편으로 수 혼화성 용매 또는 이들의 혼합물 중의 수 난용성 약물의 용액을 수 난용성 약물 또는 화합물의 적당한 농도로 함유하는 바이알과, 다른 한편으로 수성 용매, 일반적으로 주사용 수 중의, 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 고순도의 본 발명의 중합체와 약제학적으로 허용되는 부형제의 용액을 함유하는 바이알을 포함하는 2개의 키트-바이알(여기서, 2개의 키트 바이알은 모두 살균되고 무균 조건하에서 제조되고 팩킹된다)을 통상적으로 포함한다. 이어서, 2개의 바이알의 내용물을 사람/동물 투여용 희석액에 연속적으로 가한다. 상기한 바와 같이 그리고 후술되는 바와 같이, 수 난용성 약물 또는 화합물은 본원에서 사용된 중합체의 쉘 내에 함입되고 크기가 일정한 나노 입자 형태로 생성된다는 사실을 주지해야 한다. 2개의 바이알에 함유된, 수 혼화성 용매 또는 이들의 혼합물 중의 수 난용성 약물의 용액에 대한 수 혼화성 용매 또는 이들의 혼합물 중의 수 난용성 약물의 용액의 비는 일반적으로 1:1 내지 1:10의 용적비, 바람직하게는 1 :1의 용적비이다.

임의로 2개의 키트-바이알은 희석액과, 내부 직경이 0.305 내지 0.356mm 또는 0.559 내지 0.711 mm(여기서, 내부 직경은 이를 필요로 하는 사람/동물에 투여하기 위해 혼합될 중합체 및 부형제를 함유하는 희석액의 용적과 약물 용액의 용적에 의존한다)인 니들 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.

수 난용성 약물 또는 화합물을 용해시키는 데 사용할 수 있는 적합한 수 혼화성 용매의 예에는 지방족 알콜, 특히 에탄올; 디알킬 아미드, 특히 디메틸 포름아미드 및 디메틸 아세트아미드; 디알킬릴 설폭사이드, 특히 디메틸 설폭사이드 및 디에틸 설폭사이드; 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜; 다양한 분자량의 폴리프로필렌 글리콜; 계면활성제, 특히 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴리옥시에틸화 식물유 및 폴리에톡시화 캐스터유; 글리세린 등이 포함된다.

유리하게 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 부형제에는 데옥시콜산나트륨; 다양한 담즙산염; 각종 등급의 폴리소르베이트, 특히 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴리옥시에틸화 식물유 및 폴리에톡시화 캐스터유; 덱스트로즈, 수크로즈, 락토즈, 만니톨 등과 같은 폴리사카라이드; 각종 등급의 소르비탄 에스테르 또는 스팬(spans); 각종 등급의 myrj; 각종 등급의 폴록사머; 및 pH 조절을 위한완충제가 포함된다. 선행 기술 분야에서 공지된 임의의 완충제를 용액의 pH를 조절하기 위해 사용할 수 있으며 바람직한 양태에서 완충제로서 시트르산나트륨을 사용하는 것이 유리하다.

약제학적으로 허용되는 부형제 중에서 데옥시콜산나트륨이 약제학적 조성물의 안정화에 효과를 나타내기 때문에 바람직한 반면, 완충제는 관류액의 pH를 6.0 내지 8.5의 범위로 조절하기 위해 사용하는 것이며 이 또한 약제학적 조성물의 안정화에 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다.

약제학적 조성물은 적당한 부하량 또는 투여량의 수 난용성 약물 또는 화합물을 포함할 수 있으며 이러한 약물 또는 화합물의 최적의 부하량 또는 투여량의 선택은 당해 약물 또는 화합물의 특성, 이의 용해도 및 이것이 투여되는 치료 대상 질환에 크게 의존한다. 이와 유사하게 약제학적으로 허용되는 부형제의 경우, 약제학적 조성물 내에서 사용될 수 있는 비율 또는 양은 당해 조성물 내에 함유된 수 난용성 약물 또는 화합물의 특성 및 부하량에 다시 의존한다.

본 발명의 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자형 약제학적 조성물은 수 난용성 약물 또는 화합물을 중합체성 쉘 내에 완전히 또는 거의 완전히 함입시키고 입자 크기가 30 내지 150 nm인 수 난용성 약물 또는 화합물의 나노 입자를 생성할 수 있도록 다음과 같은 방식으로 제조할 수 있다:

i) 수 난용성 약물 또는 화합물을 적당한 수 혼화성 용매 또는 이들의 혼합물에 용해시킴을 포함하는 약물 농축액의 제조;

ii) a) 우선, 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 특히 독성 NIPAM 및 VP의 양이 <0.001 %인, 고순도의 화학식 1의 중합체의 필요량을 적당량의 주사용수에 가하여 용액을 수득하는 단계 및 b) 약제학적으로 허용되는 부형제 및 완충제를 중합체 수용액에 가하는 단계를 포함하는, 중합체와 약제학적으로 허용되는 부형제의 수성 농축액의 제조;

iii) 단계 ii) b)의 용액을 희석액과 혼합하여 투명액을 수득;

iv) 소용적의 단계 i)의 용액을 단계 iii)의 용액에 첨가하기 위한, 내부 직경이 0.305 내지 0.356 mm인 니들의 사용 또는

v) 대용적의 단계 i)의 용액을 단계 iii)의 용액에 첨가하기 위한, 내부 직경이 0.559 내지 0.711 mm인 니들의 사용;

vi) 단계 iii)의 용액에 단계 i)의 용액의 주입(여기서, 단계 i)의 용액이 첨가되는 시린지의 니들은 단계 iii)의 용액에 침지된 상태로 잔류해야 한다); 및

vii) 임의로, 단계 i)의 용액이 주입되는 동안 단계 iii)의 용액을 함유하는 컨테이너를 반대 위치로 유지.

위와 같은 관류액은 중합체성 마이셀 내에 부하된 95% 이상의 약물 잔류와 함께 24시간 이상 동안 안정한 상태를 유지한다.

본원에서는 희석액의 선택이 사용된 수 난용성 약물 또는 화합물의 특성 및 약제학적 조성물이 투여되는 질환에 크게 의존한다는 사실을 주지해야 한다. 적당한 희석액은 이로써 제한되는 것은 아니나, 물, 염수, 덱스트로즈 5% 및 10% 용액, 덱스트로즈 및 염화나트륨 용액, 락트산나트륨 용액, 락테이트화 링거액(Ringer's solution), 만니톨 용액, 덱스트로즈 또는 염화나트륨 용액 함유 만니톨, 링거액, 염화나트륨 용액, 주사용 살균수 및, 다양한 전해질, 덱스트로즈, 프럭토즈 및 환원당의 배합물을 포함하는 다양한 전해질 용액으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 희석액은 덱스트로즈와 물을 포함하는 유액 및, 더욱 바람직하게는 덱스트로즈 5% 및 10% 용액이다.

본 발명의 나노 입자형 약제학적 조성물의 바람직한 제조방법 및 이를 필요로 하는 환자에 투여하는 방법에 대해서는 도 11에 도시하였다.

본 발명은 다음과 같은 비제한적인 실시예를 통해 추가로 설명하고자 하나, 이로써 본 발명의 범주를 제한하려는 것으로 간주해서는 안된다.

후술되는 실시예에서 중합체의 정제를 위해 사용되는 정용 여과 장치는 Proflux M12 정용 여과 장치(제조원: Millipore)였고 중합체의 정제를 위해 사용된 투석 장치는 셀룰로즈 막-D-9402(제조원: Sigma)였다.

[실시예]

참조실시예-1

투석 방법을 이용한 중합체의 제조방법

중합반응은 2L 유리 용기에서 수행했다. N-이소프로필 아크릴아미드 24 g, 증류된 1-비닐-2-피롤리돈 12 ml 및 말레산 무수물의 폴리에틸렌 글리콜(분자량 6000) 에스테르(MPEG) 4 g을 물 약 2L에 가했다. 여기에, 수성 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(MBA) 용액 11.2 ml[49 mg/ml] 및 테트라메틸에틸렌디아민(d= 0.77g/ml) 8 ml를 가했다. 당해 용액을 질소 기체를 30분 동안 버블링시킴으로써 탈기시켰다. 이어서 수성 황산제일철암모늄(0.5% w/v) 8 ml 및 수성 과황산암모늄(80% w/v) 12 ml를 가하고 연속적으로 질소를 버블링시키면서 3시간 동안 반응을 지속시켰다. 중합반응은 34℃하에 수욕 속에서 80 rpm으로 진탕시키면서 수행했다.

용액을 투석 백에 충전시키고 물(투석 매질) 속으로 강하시켰다. 투석은 물을 1회 교체하면서 24시간 동안 수행했다. 24시간 후에 용액을 투석 백으로부터 분리하고 둥근 바닥 플라스크 내에서 동결 건조시켰다.

중합체 중의 잔류 단량체, 특히 잔류 VP 및 NIPAM의 검출 및 정량화는 역상 RP-18(C-18) 컬럼[Lichrospher RP-18e, 5μ,250 mm x 4 mm]을 사용하여 Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템에 의해 수행했다. 사용된 이동상은 1 ml/분의 유속으로 유동하는 80:20 비율의 물과 아세토니트릴의 혼합물이고 샘플 주입 용적은 50 μl였다. 작업 시간은 10분이고 컬럼 온도는 30℃이며 검출기 파장은 226 nm였다. 위와 같은 조건하에서 NIPAM의 체류시간은 약 3분인 반면, VP의 체류시간은 약 5분이었다.

분석 데이터: % 잔류 단량체 i) NIPAM = 0.066%(660 ppm) 및 ii) VP = 0.011%(110 ppm).

실시예-1

정용 여과 방법을 이용한 중합체의 제조방법

중합반응은 중합체 160 g(4L x 2)의 배치 크기에 대해 2개의 5L 유리 용기 속에서 수행한다. 각각의 용기에 N-이소프로필아크릴아미드 48 g, 증류된 1-비닐-2-피롤리돈 23 ml 및 말레산 무수물의 폴리에틸렌 글리콜(분자량 6000) 에스테르(MPEG) 8 g을 물 약 4L에 가했다. 여기에 수성 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(MBA) 용액 22.4 ml[49 mg/ml] 및 테트라메틸에틸렌디아민 16 ml를 가했다. 당해 용액을 질소 기체를 30분 동안 버블링시킴으로써 탈기시켰다. 이어서, 수성 황산제일철암모늄(0.5% w/v) 16 ml 및 수성 과황산암모늄(80% w/v) 24 ml를 가하고 계속해서 질소로 버블링시키면서 3시간 동안 반응을 지속시켰다. 중합반응은 34℃하에 수욕 속에서 80 rpm으로 진탕시키면서 수행했다. 중합반응이 진행되는 동안 반응 모니터링을 위하여 샘플을 적당한 시점(0분, 15분, 60분 및 180분)에서 회수했다.

중합반응을 완료한 후에 용액을 기공 크기가 0.8 및 0.2μm인 예비 살균시킨 1회용 0.2μm 폴리에테르설폰 막 1" 캡슐 필터; 타입 DPS-5101AA-201(제조원: Advanced Microdevices Pvt. Ltd, India)을 통해 여과시켰다. 양 반응 용기의 여과물을 모아서 Proflux M12(Millipore) 정용 여과 장치를 사용하여 접선형 유동 여과시켜 잔류하는 단량체 및 기타 저분자량 불순물을 제거하였다. 반응 혼합물 8L를 합한 분획을 우선 정용 여과를 통해 약 2.2L로 농축시킨 후, 생성된 농축액을 초정제수 약 30L를 사용하여 정용 여과시킨다. 정용 여과를 진행시키는 동안 반응 혼합물을 약 1L로 농축시킨다. 16Og(8L)의 배치 크기에 대한 정용 여과용 총 공정 시간은 약 4 내지 6시간이다. 이어서, 정용 여과된 용액을 동결 건조시킨다.

분석 데이터: % 잔류 단량체 i) NIPAM = < 0.001%(<10 ppm) 및 ii) VP = < 0.001%(<10 ppm).

당해 중합체는 다음과 같은 분광학적 특성을 지녔다:

¹H NMR(300 MHz, Bruker 분광계, CDCl₃, δ ppm): 1.15(br,-CH(CH₃)₂); 1.45(br, - CH2-CH-N(VP-링); 1.63(br,-CH₂-CHC(=O)NH); 1.99(br,-CH C(=O)NH-), CH₂(VP 링),2.36(CH₂, VP 링), 3.0(-0-CH₂-CH₂-), 3.23(CH₂-N-); 3.62-3.66(Br, CH₂, MPEG); 3.72(NH- CH(CHs)₂); 3.97(Br, CH).

¹³C NMR(300 MHz, Bruker 분광계, CDCl₃, δ ppm): 174(C=O); 76.6-77.6(CDCl₃에 대해 다중선 및 중합체 주쇄의 CH); 70.6(CH₂'s MPEG); 41.6(이소프로필 단위의 CH); 31,8(CH₂'s, 중합체 주쇄); 22.6(CH₃'s, 이소프로필).

FTIR(KBr 펠릿, cm^-1): 3500(s, OH); 3296(s, NH, 2급-아미드); 2972-2933(s, CH, CH₂, CH₃); 1651(br, 강한, 분열된 피이크, 에스테르 C=O 및 아미드 I의 C=O); 1546(s, 아미드 II의 NH 밴드 및, 가능하게는, 유리산의 C=O, 소량); 1387, 1367(이소프로필 그룹의 이중선, CH₃, 변형), 1172-1129(m, 0-C-O).

실시예-2

파클리탁셀 나노 입자형 약제학적 조성물의 제조방법( 소용적의 재구성, 40 ml 이하)

A] 파클리탁셀(20 mg/ml)의 알콜성 용액의 제조: 파클리탁셀 200 mg을 에탄올 10.0 ml에 용해시켰다.

B] 중합체와 부형제의 수성 농축액의 제조: 실시예-1에 의해 수득된 중합체 100 mg, 데옥시콜산나트륨 66.7 mg 및 시트르산나트륨 100 mg을 물 10 ml에 용해시켜 투명액을 수득하였다.

C] 파클리탁셀 나노 입자(0.6 mg/ml)의 제조: 단계 B]의 중합체와 부형제의 수성 농축액 1.0 ml를 10% 덱스트로즈 용액 31.3 ml에 용해시켜 투명액을 수득하였다. 단계 A]의 파클리탁셀의 알콜성 용액 1.0 ml를 내부 직경이 0.330 mm인 니들을 통해 상기한 용액에 4초 이내에 가하여 파클리탁셀의 나노 입자를 0.6 mg/ml의 농도로 수득하였다.

이렇게 제조된 약제학적 조성물은 다음과 같은 특성을 지녔다:

희석액	중합체 농도 (mg/ml)	데옥시콜산나트륨 농도 (mg/ml)	시트르산 나트륨 농도 (mg/ml)	파클리탁셀 농도 (mg/ml)	입자 크기 (nm)	안정성
10% 덱스트로즈	0.3	0.2	0.3	0.6	∼80	＞24시간

실시예-3

파클리탁셀 나노 입자형 약제학적 조성물의 제조방법(대용적의 재구성, 500 ml 이하)

A] 파클리탁셀(20 mg/ml)의 알콜성 용액의 제조: 파클리탁셀 400 mg을 에탄올 20.0 ml에 용해시켰다.

B] 중합체와 부형제의 수성 농축액의 제조: 실시예-1에 의해 수득된 중합체 200 mg, 데옥시콜산나트륨 133.4 mg 및 시트르산나트륨 200 mg을 물 20 ml에 용해시켜 투명액을 수득하였다.

C] 파클리탁셀 나노 입자(0.6 mg/ml)의 제조: 단계 B]의 중합체와 부형제의 수성 농축액 15.0 ml를 10% 덱스트로즈 용액 500 ml에 용해시켜 투명액을 수득하였다. 단계 A]의 파클리탁셀의 알콜성 용액 15.0 ml를 내부 직경이 0.771 mm인 니들을 통해 상기한 용액에 8초 이내에 가하여 파클리탁셀의 나노 입자를 0.6 mg/ml의 농도로 수득했다.

희석액	중합체 농도 (mg/ml)	데옥시콜산나트륨 농도 (mg/ml)	시트르산 나트륨 농도 (mg/ml)	파클리탁셀 농도 (mg/ml)	입자 크기 (nm)	안정성
10% 덱스트로즈	0.3	0.2	0.3	0.6	∼85	＞24시간

실시예-4

베튤린산 유도체[화학식 2의 MJ -1098]의 나노 입자형 약제학적 조성물의 제조방법

A] MJ-1098(15 mg/ml)의 용액의 제조: MJ-1098(15 mg)을, N,N-디메틸아세트아미드 0.15 ml, 폴리소르베이트 80 0.01 ml 및 에탄올 0.84 ml의 혼합물에 초음파를 이용하여 용해시켰다.

B] 중합체와 부형제의 수성 농축액의 제조: 실시예-1에 의해 수득된 중합체 10 mg, 데옥시콜산나트륨 6.67 mg 및 시트르산나트륨 10 mg을 물 1 ml에 용해시켜 투명액을 수득하였다.

C] MJ-1098 나노 입자(0.75 mg/ml)의 제조: 단계 B]의 중합체와 부형제의 수성 농축액 0.3 ml를 5% 덱스트로즈 용액 9.2 ml에 용해시켜 투명액을 수득하였다. 단계 A]의 MJ-1098의 용액 0.5 ml를 내부 직경이 0.330 mm인 니들을 통해 상기한 용액에 3초 이내에 가하여 MJ-1098의 나노 입자를 0.75 mg/ml의 농도로 수득하였다.

희석액	중합체 농도 (mg/ml)	데옥시콜산나트륨 농도 (mg/ml)	시트르산 나트륨 농도 (mg/ml)	MJ-1098 농도 (mg/ml)	입자 크기 (nm)	안정성
5% 덱스트로즈	0.3	0.2	0.3	0.75	∼62	＞24시간

실시예-5

베튤린산 유도체[화학식 3의 DRF -4012]의 나노 입자형 약제학적 조성물의 제조방법

A] DRF-4012(20 mg/ml)의 용액의 제조: MJ-DRF-4012(20 mg)을 폴리소르베이트 80 0.01 ml 및 에탄올 0.99 ml의 혼합물에 초음파를 이용하여 용해시켰다.

C] DRF-4012 나노 입자(0.6 mg/ml)의 제조: 단계 B]의 중합체와 부형제의 수성 농축액 0.33 ml를 5% 덱스트로즈 용액 10.44 ml에 용해시켜 투명액을 수득하였다. 단계 A]의 DRF-4012의 용액 0.33 ml를 내부 직경이 0.305 mm인 니들을 통해 상기한 용액에 3초 이내에 가하여 DRF-4012의 나노 입자를 0.6 mg/ml의 농도로 수득하였다.

희석액	중합체 농도 (mg/ml)	데옥시콜산나트륨 농도 (mg/ml)	시트르산나트륨 농도 (mg/ml)	DRF-4012 농도 (mg/ml)	입자 크기(nm)	안정성
5% 덱스트로즈	0.3	0.2	0.3	0.6	∼70	＞24시간

실시예-6

베튤린산 유도체[화학식 4의 DRF -4015]의 나노 입자형 약제학적 조성물의 제조방법

A] DRF-4015(20 mg/ml)의 용액의 제조: MJ-DRF-4015(20 mg)을 폴리소르베이트 80 0.01 ml 및 에탄올 0.99 ml의 혼합물에 용해시키고 초음파를 이용하여 용해시켰다.

C] DRF-4015 나노 입자(0.60 mg/ml)의 제조: 단계 B]의 중합체와 부형제의 수성 농축액 0.33 ml를 5% 덱스트로즈 용액 10.44 ml에 용해시켜 투명액을 수득하였다. 단계 A]의 DRF-4015의 용액 0.33 ml를 내부 직경이 0.330 mm인 니들을 통해 상기한 용액에 4초 이내에 가하여 DRF-4015의 나노 입자를 0.6 mg/ml의 농도로 수득하였다.

희석액	중합체 농도 (mg/ml)	데옥시콜산나트륨 농도 (mg/ml)	시트르산 나트륨 농도 (mg/ml)	DRF-4015 농도 (mg/ml)	입자 크기 (nm)	안정성
5% 덱스트로즈	0.3	0.2	0.3	0.6	∼46	＞24시간

실시예-7

도세탁셀 나노 입자형 약제학적 조성물의 제조방법

A] 도세탁셀(40 mg/ml)의 용액의 제조: 도세탁셀 200 mg을 에탄올 5.0 ml에 용해시켰다.

B] 중합체와 부형제의 수성 농축액의 제조: 실시예-1에 의해 수득된 중합체 400 mg, 데옥시콜산나트륨 400 mg 및 시트르산나트륨 400 mg을 물 10 ml에 용해시켜 투명액을 수득하였다.

C] 도세탁셀 나노 입자(0.5 mg/ml)의 제조: 단계 B]의 중합체와 부형제의 수성 농축액 4.0 ml를 10% 덱스트로즈 용액 35.5 ml에 용해시켜 투명액을 수득하였다. 단계 A]의 도세탁셀의 알콜성 용액 0.5 ml를 내부 직경이 0.330 mm인 니들을 통해 상기한 용액에 3초 이내에 가하여 도세탁셀의 나노 입자를 0.5 mg/ml의 농도로 수득하였다.

희석액	중합체 농도 (mg/ml)	데옥시콜산나트륨 농도 (mg/ml)	시트르산 나트륨 농도 (mg/ml)	도세탁셀 농도 (mg/ml)	입자 크기 (nm)	안정성
10% 덱스트로즈	4.0	4.0	4.0	0.5	∼125	＞24시간

실시예-8

에토포사이드 나노 입자형 약제학적 조성물의 제조방법

A] 에토포사이드(20 mg/ml)의 용액의 제조: 에토포사이드 20 mg을 초음파하에 N,N-디메틸아세트아미드 0.10 ml와 에탄올 0.90 ml의 혼합물에 용해시켰다.

B] 중합체와 부형제의 수성 농축액의 제조: 실시예-1에 의해 수득된 중합체 10 mg, 데옥시콜산나트륨 6.67 mg 및 시트르산나트륨 10 mg을 물 10 ml에 용해시켜 투명액을 수득하였다.

C] 에토포사이드 나노 입자(0.6 mg/ml)의 제조: 단계 B]의 중합체와 부형제의 수성 농축액 0.3 ml를 5% 덱스트로즈 용액 9.4 ml에 용해시켜 투명액을 수득하였다. 단계 A]의 에토포사이드의 알콜성 용액 0.3 ml를 내부 직경이 0.330 mm인 니들을 통해 상기한 용액에 3초 이내에 가하여 에토포사이드의 나노 입자를 0.6 mg/ml의 농도로 수득하였다.

희석액	중합체 농도 (mg/ml)	데옥시콜산나트륨 농도 (mg/ml)	시트르산 나트륨 농도 (mg/ml)	에토포사이드 농도 (mg/ml)	입자 크기 (nm)	안정성
5% 덱스트로즈	0.3	0.2	0.3	0.6	∼50	＞24시간

실시예-9

마우스에서 [ ¹⁴ C]- 표지된 중합체의 약동학, 생체 분포 및 제거의 측정

체중이 약 25 내지 30g인 6 내지 8주된 30 마리의 수컷 스위스 알비노 마우스(Swiss albino mice)를 각각 6마리로 이루어진 5개의 그룹으로 랜덤하게 분리하였다. [¹⁴C]-표지된 중합체를 탈이온수에서 중합체의 비방사능(specific activity)을 기준으로 하여 5 mg/ml로 희석시켰다. 모든 동물들은 [¹⁴C] 중합체 40 mg/kg을 정맥내 주사로 단일 투여받았다.

약동학 연구에서 EDTA 함유 튜브로 투여하고 3분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 16시간 및 24시간이 되는 시점에서 마취하에 후안와 출혈(retro-orbital bleeding)에 의해 동물로부터 혈액 100μl를 수거했다. 분비물의 연구를 위하여 소변 및 대변을 대사 상자(metabolic cage)로부터 수거하거나 강제로(10분) 수거하였다. 종료시(10분, 60분, 24시간 및 48시간), 부신, 뇌, 폐, 간, 심장, 신장, 비장, 위, 소장, 대장, 대변, 소변, 방광, 눈, 피부, 대퇴근, 테스팅(testing) 및 부고환을 수거하고, 헹구고, 절개하고 칭량했다.

혈액 및 소변 중의 [¹⁴C] 중합체의 농도는 혈액/소변 50 μl를 신틸레이션 혼합액 5 ml와 배합함으로써 측정했다. 대변 및 조직(0.5 g 이하)을 탈이온수 속에서 균질화하여 20 % 균질 현탁액을 수득한 후, 500 μl를 신틸레이션 혼합액 5 ml와 배합하였다. 샘플을 액체 신틸레이션 분석기로 분석하였다. 분당 계수(counts per minute; CPM)를, 선형성 및 소광 곡선을 근거로 하여, [¹⁴C] 중합체의 양(μg/ml)으로 전환시켰다.

방사능 혈액 농도 특성은 0.448 ± 0.157 시간(26.88 분)의 짧은 제거 반감기 T₁ _/2(β) 및 54.7 ml/시의 신속한 제거율을 갖는 2-상 곡선을 나타내었다.

주요 제거 경로는 소변(48시간 후에, 소변 66.91% : 대변 17.39%)인 것으로 밝혀졌으며 48시간까지 수거된 회수 데이터는 주입된 방사능의 84.87%에 해당함을 나타낸다. 조직 분포는 무시할 만하다. 신장, 간, 피부 및 장이 표적 기관인 것으로 밝혀졌다. 그러나 조직 내에서의 중합체의 양은 소변 및 대변을 통해 신속하게 제거되었다.

최고 방사능을 제공하는 신장, 간, 피부 및 장에서의 조직 분포는 무시할 만하다. 그러나 조직 내에서의 중합체의 양은 소변 및 대변을 통해 신속하게 제거되었다.

결론적으로 본 연구 결과는 중합체가 바이탈 기관 내에서 축적되지 않고 신체로부터 신속하게 제거됨을 입증한다. 중합체는 비생분해성인 것으로 공지되어 있으나 우선적으로 소변을 통해 신속하고 효율적으로 제거된다는 사실은 당해 중합체가 사람이 사용하기에 안전하고 유용하다는 사실을 암시한다.

실시예-10

토끼에서 중합체 125 mg / kg 을 정맥 주사로 투여하고 제5일에 투여 부위에서, 존재하는 경우, 가능한 편재화된 독성의 측정

덱스트로즈 10%에 75 mg/ml의 농도로 용해된 시험 물질을 5 ml의 1회용 시린지 및 23 G 니들을 사용하여 각각의 토끼의 우측 귀의 변연 정맥에 5일 동안 매일 125 mg/kg으로 정맥내 투여했다. 대조용으로 좌측 귀를 제공하고 동일한 경로로 10 % 덱스트로즈를 제공했다. 투여 용적을 3.5 ml/kg(동물의 체중) 이하로 조절하였다. 편재화된 독성은 1 내지 5일 동안 매일 5분, 10분, 30분, 60분 및 24시간 시점에서 주기적으로 관찰했다. 주사 부위에서의 조직 생검(punch biopsies)을 제7일에 6마리의 토끼 모두로부터 채취했다.

중합체 75 mg/ml를 125 mg/kg의 투여량으로 토끼의 귀 정맥에 5일 동안 연속 정맥내 투여하면 10% 덱스트로즈를 주사한 토끼의 주사 부위에 완만하거나 적당한 혈전성 정맥염이 야기된다. 소정의 중합체의 투여량은 투여 부위에서 어떠한 편재화된 독성도 야기하지 않는 것으로 결론지을 수 있다.

실시예-11

비스타르 래트에서 중합체 400 mg / kg 을 정맥 주사로 투여하고 제5일에 특히 미세 맥관 구조에 대해 가능한 표적 기관(들) 독성의 측정

시험 물질을 덱스트로즈 10%에 용해시키고 5 ml의 1회용 시린지 및 23 G 니들을 사용하여 각각의 래트의 꼬리 정맥에 400 mg/kg으로 정맥내 투여했다. 대조용 동물에게는 동일한 경로로 5 % 덱스트로즈만을 제공했다. 투여 용적을 5 ml/kg(동물의 체중)으로 조절하였다. 부작용(일반적인 시험 및 실험 인자) 및 치사율에 대한 주기적인 관찰 결과(처리 후 제7일, 제14일 및 제21일)를 기록했다. 모든 동물을 치사하고 부검하였다.

연구 조건하에서 중합체 400 mg/kg(체중)의 투여량으로 5일 동안 정맥 주사로 투여하면 처치된 래트에서 어떠한 치사 또는 생리학적 독성 신호나 증상도 발생하지 않는다.

래트의 개별적인 체중 및 평균 체중은 중합체 처치 그룹과 대조 그룹 모두에 대해 한결같이 증가하는 것으로 입증되었다. 대조용 동물의 체중과 대비하여 처치된 동물의 체중 상에 유의한 차이는 없는 것으로 확인되었다.

중합체로 처치한 래트에 있어서, 혈액학적 인자가 본 연구를 통해 정상 범위 내에 있었다. 상당한 차이라면 대조용 동물과 대비하여 중간 그룹에 대한 총 빌리루빈(p=0.0471) 및 우르산(p=0.0157)에 대한 기준선 및 종결 그룹에 대한 총 단백질(p=0.0005) 및 우르산(p=0.0404)에 대한 기준선에서 검출되었다. 그러나 모든 값이 정상 범위 내에 있다.

광 회전 운동 감지기 시험 결과는 각각 제7일 및 제21일에 운동 활동 면에서 대조 그룹과 처치 그룹 간에 유의한 차이가 없음을 입증하며 이는 중합체가 어떠한 신경 독성도 나타내지 않는다는 사실을 입증한다.

처치 그룹 표본과 대조 그룹 표본은 유사한 조직학적 특징을 나타냈다. 연구된 모든 기관은 현미경 사진에서 정상 구조를 나타내었다. 각각의 기관 내에서의 미세 맥관 구조를 조심스럽게 시험하였고 어떠한 기관에서도 병리학적 특징을 발견할 수 없었다. 또한, 중합체 처치된 동물의 미세 맥관 구조의 변화도 없었다.

상기한 관찰로부터 400 mg/kg(체중)의 투여량으로 5일 동안 연속적으로 투여된 중합체가 어떠한 일반적인 독성이나 어떠한 유의한 혈액학적 독성을 야기하지 않았다는 사실이 밝혀졌다. 그러나 총 빌리루빈은 제21일에 대조 그룹에 비해 종결 그룹에 대해 훨씬 높은 것으로 밝혀졌다.

실시예-12

비스타르 래트에서 중합체 800 mg / kg 을 단일 정맥 주사로 투여하고 특히 미세 맥관 구조에 대해 가능한 표적 기관(들)의 독성 측정

시험 물질을 덱스트로즈 10%에 용해시키고 1 ml의 1회용 시린지 및 26 G 니들을 사용하여 각각의 래트의 꼬리 정맥에 800 mg/kg으로 정맥내 투여했다. 대조용 동물에게는 동일한 경로로 10% 덱스트로즈 만을 제공했다. 투여 용적을 5 ml/kg(동물의 체중)으로 조절하였다. 부작용(일반적인 시험 및 실험 인자) 및 치사율에 대한 주기적인 관찰 결과(처리 후 제1일, 제3일 및 제7일)를 기록했다. 모든 동물을 치사하고 부검하였다.

연구 조건하에서 중합체 800 mg/kg(체중)의 투여량으로 단일 정맥 주사로 투여하면 래트에서 어떠한 치사 또는 어떠한 관찰 가능한 독성 신호나 증상도 발생하지 않는다.

래트의 개별적인 체중 및 평균 체중은 중합체 처치 그룹과 대조 그룹 모두에 대해 한결같게 증가하는 것으로 입증되었다. 당해 중합체로 처치한 래트에 있어서 혈액학적 인자가 본 연구를 통해 정상 범위 내에 있었다. 중합체로 처치한 래트에 있어서, 생화학적 인자가 연구를 통해 정상 범위 내에 있었다. 조직병리학적 연구 결과는 래트의 대조 그룹과 처치 그룹 간에는 유의한 차이가 없다는 사실을 입증한다. 주사 후 제3일 및 제7일에 치사된 중합체 처치 래트의 현미경 사진은 시험된 4개의 모든 기관(뇌, 눈, 신장 및 피부)에서 뚜렷한 미세 맥관 구조의 변화가 없다는 사실을 입증한다.

상기한 관찰로부터, 800 mg/kg(체중)의 투여량으로 투여된 중합체가 어떠한 일반적인 독성이나 어떠한 유의한 혈액학적 독성 및 생화학적 독성이나 미세 맥관 구조의 변화를 야기하지 않으며, 래트에 정맥내 투여하는 경우 안전한 것으로 간주할 수 있다는 사실이 밝혀졌다.

실시예 -13

토끼에서 중합체의 투여( 피하내 ) 부위에서, 존재하는 경우, 가능한 편재화된 독성의 측정

덱스트로즈 10%에 75 mg/ml의 농도로 용해된 시험 물질 0.1ml를 1 ml의 1회용 시린지 및 23 G 니들을 사용하여 6마리의 토끼의 각각의 우측 귓볼에 단일 주사에 의해 투여했다. 대조용으로 6마리의 토끼의 각각의 좌측 귓볼에 동일한 경로로 10 % 덱스트로즈 0.1ml를 제공했다. 편재화된 독성은 주사 부위에서 5분, 10분, 30분, 60분 및 24시간 시점에 주기적으로 관찰했다.

중합체 75 mg/ml의 100 μl 또는 덱스트로즈 100 μl를 토끼의 귀에 단일 피하내 투여하면 주사하고 48시간 후에 시험하는 경우 주사 부위에서 약간의 감염이 유발된다. 소정의 중합체가 피하내 투여후 투여 부위에서 어떠한 편재화된 독성도 야기하지 않는 것으로 결론지을 수 있다.

실시예-14

래트에서 중합체의 정맥내 투여에 의한 6개월 투여 독성 연구 결과의 측정

나노 입자 제형에 사용된 중합체를 약물 10 mg/kg에 상당하는 투여량으로 투여하였다. 대조용으로는 덱스트로즈(10 %)를 180일(약 26주)의 주기 동안 매 3주마다 후방 꼬리 정맥에 주기적으로 정맥내 투여하였다. 관찰 결과는 치사, 임상적 신호, 체중, 탈진, 탈수, 임상적 실험실 조사, 기관 칭량 및 조직 병리학적 결과를 포함하였다.

처치된 동물과 대조 그룹 동물은 연구가 진행되는 동안 일반적으로 활기가 있었고 건강했다. 처치 그룹과 대조 그룹 모두에서 감염으로 인해 발생한 극소수의 우발적 치사 이외에는 처치와 관련된 치사가 없었다. 수컷 동물과 암컷 동물 모두의 체중이 점진적으로 증가했고 연구가 진행되는 동안 사료 또는 물의 소모량의 변화는 없었다. 수컷 동물과 암컷 동물 모두에서 혈액학적 인자는 비스타르 래트에 대해 보고된 바와 같이 정상 범위 내에 있었다. 그러나 처치 그룹 중에서 수컷은 WBC 및 호중구 수치에서 그리고 암컷은 호중구 수치에서 여전히 정상 범위 내에 있기는 하지만 약간 감소했다. 처치 그룹과 대조 그룹 모두에서 망상 적혈구 수가 약간 증가한 것이 주목된다.

수컷과 암컷 모두에서의 혈액 생화학 인자는 비스타르 래트에 대해 보고한 바와 같은 정상 범위 내에 있다. 처치 그룹과 대조 그룹의 암컷과 수컷 모두에서 글루코즈, ALP 및 크레아틴이 정상치보다 약간 높게 측정되는 약간의 변화가 포함되었다. 처치 그룹의 수컷에서 트리글리세라이드가 완만히 증가한 것이 제6개월 후에 확인되었다. 수컷과 암컷 모두에서 소변 인자는 정상 범위 내에 있다. .

[색인어]

독성 단량체성 불순물, 1-비닐피롤리돈(VP), N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM), 말레산 무수물과 폴리에틸렌 글리콜의 에스테르(MPEG), 이작용성 비닐 유도체, 가교결합, 수 난용성 약물 또는 화합물, 나노 입자형 약제학적 조성물, 고순도, 생혼화성, 비생분해성, 비독성, T1/2(KlO) 값, T1/2(α) 값, T1/2(β) 값, 편재화된 독성, 정맥 주사, 피하내 투여.

발명에 사용된 약어

VP = 비닐피롤리돈 또는 1-비닐피롤리딘-2-온

NIPAM = N-이소프로필아크릴아미드

MPEG = 말레산 무수물과 폴리에틸렌 글리콜의 에스테르

MBA = N,N'-메틸렌비스아크릴아미드

TMED = 테트라메틸에틸렌디아민

APS = 과황산암모늄

LCST = 하한 임계 용액 온도

DSC = 시차 주사 열량계

TGA = 열중량 분석

CMC = 임계 마이셀 농도

Claims

수 난용성 약물 또는 화합물; 수 혼화성 용매; 중합체 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 모두 희석액에 함유된 상태로 포함하는, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하기에 적합한 나노 입자형 약제학적 조성물이며,
여기서 상기 중합체가 이작용성 비닐 유도체에 의해 가교결합되는 것으로서, 1-비닐피롤리돈(VP), N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM) 및 말레산 무수물과 폴리에틸렌 글리콜의 에스테르(MPEG)로부터 선택된 3개의 단량체 단위를 포함하며 각각의 독성 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 것인 나노입자형 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 중합체가 이작용성 비닐 유도체에 의해 가교결합되는 것으로서, 1-비닐피롤리돈(VP), N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM) 및 말레산 무수물과 폴리에틸렌 글리콜의 에스테르(MPEG)로부터 선택된 3개의 단량체 단위를 포함하며, 각각의 독성 단량체성 불순물을 0.001% 미만의 양으로 함유하는 것인 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 수 난용성 약물 또는 화합물이 항암제, 소염제, 항진균제, 진토제, 고혈압 치료제, 성 호르몬, 스테로이드, 항생제, 마취제 및 면역조절제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 항암제가 파클리탁셀, 도세탁셀 및 기타 관련된 탁산 유도체; 이리노테칸, 토포테칸 및 기타 관련된 캄프토테신 유도체; 독소루비신, 다우노마이신 및 기타 관련된 안트라사이클린 유도체; 시스플라틴; 옥살리플라틴; 5-플루오로우라실; 미토마이신; 메토트렉세이트; 에토포사이드; 베튤린산 및 이의 유도체; 및 웨델로락톤 및 이의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 소염제가 인도메타신, 이부프로펜, 케토프로펜, 플루비프로펜, 피록시캄, 테녹시캄 및 나프록센으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 항진균제가 케토코나졸 및 암포테리신 B로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 성 호르몬이 테스토스테론, 에스로겐, 프로게스테론 및 에스트라디올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 스테로이드가 덱사메타손, 프레드니솔론 및 트리암시놀론으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 고혈압 치료제가 캅토프릴, 라미프릴, 테라조신, 미녹시딜 및 파라조신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 진토제가 온단세트론 및 그라니세트론으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 항생제가 메트로니다졸 및 푸시드산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 면역조절제가 사이클로스포린 및 비페닐 디메틸 디카복실산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 마취제가 프로포폴, 알팍살론 및 헥소바르비탈로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 3항에 있어서, 베튤린산 유도체가 화학식 2의 MJ-1098, 화학식 3의 DRF-4012 및 화학식 4의 DRF-4015로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
화학식 2

화학식 3

화학식 4
제 1항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제가 데옥시콜산나트륨; 담즙산염; 폴리소르베이트 80; 폴리소르베이트 20; 폴리옥시에틸화 식물유; 폴리에톡시화 캐스터유; 덱스트로즈, 수크로즈, 락토즈 및 만니톨 같은 폴리사카라이드; 각종 등급의 소르비탄 에스테르 또는 스팬(spans); 각종 등급의 myrj; 각종 등급의 폴록사머 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 15항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제가 완충제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제 16항에 있어서, 완충제가 시트르산나트륨인 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 수 혼화성 용매가 에탄올; 디메틸 포름아미드; 디메틸 아세트아미드; 디메틸 설폭사이드; 디에틸 설폭사이드; 각종 분자량의 폴리에틸렌 글리콜; 각종 분자량의 폴리프로필렌 글리콜; 폴리소르베이트 80; 폴리소르베이트 20; 폴리옥시에틸화 식물유; 폴리에톡시화 캐스터유; 글리세린 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 희석액이 물, 염수, 덱스트로즈 5% 및 10% 용액, 덱스트로즈 및 염화나트륨 용액, 락트산나트륨 용액, 락테이트화 링거액, 만니톨 용액, 덱스트로즈 또는 염화나트륨 용액 함유 만니톨, 링거액, 염화나트륨 용액, 주사용 살균수 및, 전해질, 덱스트로즈, 프럭토즈 및 환원당의 다양한 배합물을 포함하는 다양한 전해질 용액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 수 난용성 약물 또는 화합물이 중합체성 쉘 내에 나노 입자 형태로 함입되어 있는, 약제학적 조성물.
제 20항에 있어서, 나노 입자 형태의 입자 크기가 30 내지 150 nm 범위인, 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 사용된 중합체가, 단량체성 VP 및 NIPAM를 0.001% 미만의 양으로 함유하고;¹³C NMR 스펙트럼에서 174, 76.6-77.6, 70.6, 41.6, 31.8 및 22.6에서 δ 피이크를 가지며; ¹H NMR 스펙트럼에서 1.14, 1.45, 1.63, 1.99, 2.36, 3.0, 3.23, 3.62-3.66, 3.72 및 3.97에서 δ 피이크를 가지고; FT-IR 스펙트럼에서 3500, 3296, 2972-2933, 1546, 1387, 1367 및 1172-1129에서 주파수(cm^-1)를 가지는 화학식 1의 구조를 지니는 고순도 중합체인, 약제학적 조성물.
화학식 1
제 1항에 있어서, 사용된 중합체가, 단량체성 VP 및 NIPAM를 0.001% 미만의 양으로 함유하고; T₁ _/2(KlO) 값이 0.152 ± 0.018 시간이고; T₁ _/2(α) 값이 0.065 ± 0.014 시간이며; T₁ _/2(β) 값이 0.448 ± 0.0157 시간이고; C_max 값이 82.96 ± 5.11 μg/ml이며; 곡선하에서의 면적(AUC)이 18.29 ± 1.62 시간 x μg/ml이고; 제거 시간(CL) 값이 54.67 ± 4.86 ml/시이며; 평균 체류 시간(MRT) 값이 0.465 ± 0.13 시간이고; 정상 상태하에서의 용적 분포(Vss) 값이 25.43 ± 5.2 ml/시인, 화학식 1의 구조를 지니는 고순도 중합체인, 약제학적 조성물.
화학식 1
제 1항에 있어서, pH가 6.0 내지 8.5인, 약제학적 조성물.
수 난용성 약물 또는 화합물을 적당한 수 혼화성 용매 또는 이러한 용매들의 혼합물에 용해시킴을 포함하여 약물/화합물 농축액을 제조하는 단계(i);
우선, 단량체성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 특히 독성 NIPAM 및 VP의 양이 <0.001 %인, 고순도의 화학식 1의 중합체의 필요량을 적당량의 주사용수에 가하여 용액을 수득하는 단계(a) 및 약제학적으로 허용되는 부형제 및 완충제를 중합체 수용액에 가하는 단계(b)를 포함하여 중합체와 약제학적으로 허용되는 부형제의 수성 농축액을 제조하는 단계(ii);
단계(ii)(b)의 용액을 희석액과 혼합하여 투명액을 수득하는 단계(iii);
소용적의 단계(i)의 용액을 단계(iii)의 용액에 4초 이내에 첨가하기 위한, 내부 직경이 0.305 내지 0.356 mm인 니들을 사용하는 단계(iv) 또는
대용적의 단계(i)의 용액을 단계(iii)의 용액에 10초 이내에 첨가하기 위한, 내부 직경이 0.559 내지 0.711 mm인 니들을 사용하는 단계(v);
단계(iii)의 용액에 단계(i)의 용액을 주입하는 단계(여기서, 단계 (i)의 용액이 첨가되는 시린지의 니들은 단계 (iii)의 용액에 침지된 상태로 잔류해야 한다)(vi); 및
임의로, 단계(i)의 용액이 주입되는 동안 단계(iii)의 용액을 함유하는 컨테이너를 반대 위치로 유지시키는 단계(vii)를 포함함을 특징으로 하는, 수 난용성 약물 또는 화합물을 포함하는, 제1항에 따르는 나노 입자형 약제학적 조성물의 제조방법.
화학식 1
제 25항에 있어서, 사용된 수 난용성 약물이 제3항 내지 제14항 중의 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 것인 방법.
제 25항에 있어서, 사용된 약제학적으로 허용되는 부형제가 제15항 내지 제17항 중의 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 것인 방법.
제 25항에 있어서, 수 혼화성 용매가 제18항에서 정의한 바와 같은 것인 방법.
제 25항에 있어서, 사용된 희석액이 제19항에서 정의한 바와 같은 것인 방법.
제 25항에 있어서, 단계(iv)에 따르는 용액의 소용적이 제25항의 단계(i)의 용액의 1 내지 5 ml의 용적에 해당하는 방법.
제 25항에 있어서, 단계(v)에 따르는 용액의 대용적이 제25항의 단계(i)의 용액의 10 내지 15 ml의 용적에 해당하는 방법.
제 25항에 있어서, 수득된 약제학적 조성물에서 중합체성 쉘 내에 함입된 수 난용성 약물 또는 화합물의 입자 크기가 30 내지 150 nm의 범위인 방법.
이를 필요로 하는 환자에게 정맥내, 근육내 또는 피하내로 투여되는, 제 25항에 따르는 방법으로 수득한 약제학적 조성물.
제 25항에 있어서, 사용된 중합체가 단량체성 VP 및 NIPAM를 0.001% 미만의 양으로 함유하고, 사람/동물 투여용으로 안전하고 비독성인, 화학식 1의 구조를 지니는 고순도 중합체인, 약제학적 조성물.
화학식 1
제 3항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따르는 수 난용성 약물 또는 화합물이 치료할 수 있는 병리학적 질환을 치료하는데 유용한, 제 15항에 따르는 방법으로 수득한 약제학적 조성물.
제 1항에 따르는 수 난용성 약물 또는 화합물을 함유하는 나노 입자형 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 제 3항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따르는 수 난용성 약물 또는 화합물이 치료할 수 있는 사람/동물의 병리학적 질환을 치료하는 방법.
제 36항에 있어서, 정맥내, 근육내 또는 피하내로 주사함을 포함하는 방법.