KR20130096641A - 프로필렌을 생합성하기 위한 미생물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로필렌 경로를 구비한 비천연 미생물 유기체를 제공한다. 본 발명은 또한 프로필렌을 생산하기 위한 상기 유기체의 이용 방법을 제공한다.

Description

프로필렌을 생합성하기 위한 미생물 및 방법 {MICROORGANISMS AND METHODS FOR THE BIOSYNTHESIS OF PROPYLENE}

본 출원은 2010년 4월 30일자 미국 가출원번호 61/330,258에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 일반적으로 생합성 공정, 보다 상세하게는 프로필렌 생합성 능력을 가진 유기체에 관한 것이다.

프로필렌은 주로 석유 정제 공정과 탄화수소 공급원료의 증기 분해 반응에 의한 에틸렌 제조 공정의 부산물로서 생산된다. 프로펜은 분해 반응과 기타 정제 과정으로부터 발생되는 탄화수소 혼합물을 분별 증류함으로써 분리된다. 전형적인 탄화수소 공급원료는 석유, 천연 가스와 같은 재생할 수 없는 화석 연료로부터 기원하며, 그 수준은 훨씬 낮지만 석탄으로부터도 기원한다. 프로필렌은 연간 750억 파운드 이상 생산되고 있어, 에틸렌 다음으로 2번째로 가장 많이 생산되는 화석 유래 화합물이다. 프로필렌은 매우 다양한 폴리머, 폴리머 중간체 및 화합물들로 변환되는 기본 화합물이다. 화합물 및 폴리머 등급의 프로필렌 중에서 가장 보편적인 유도체는 플로프로필렌, 아크릴산, 부탄올, 부탄디올, 아크릴로니트릴, 프로필렌 옥사이드, 이소프로판올 및 큐멘이다. 프로필렌 유도체인 폴리프로필렌이 사출 몰딩과 같은 플라스틱 및 카페트와 같은 섬유의 제조에 사용되는 비중은 미국에서의 이들 유도체 소비량의 1/3을 웃돈다. 또한, 프로필렌은 합성 고무와 에어로졸의 추진체 또는 성분의 제조에도 사용되고 있다.

대체성 및/또는 재생가능한 공급원료로부터 프로필렌을 제조하는 역량은 보다 지속가능한 화학적 생산 공정을 탐색하는데 큰 장점이 될 것이다. 프로필렌을 재생가능한 방식으로 생산할 수 있는 가능한 방법은 당 또는 기타 공급원료를 발효시켜, 알코올 2-프로판올 (이소프로판올) 또는 1-프로판올을 제조하고, 이를 분리, 정제한 다음 금속계 촉매를 사용하는 2차 단계에서 프로필렌으로 탈수시키는 것이다. 재생가능한 공급원료로부터 직접 발효를 통해 프로필렌을 제조하는 방법은 탈수시킬 필요가 없을 것이다. 발효 생산 공정에서, 프로필렌 기체가 계속적으로 발효기에서 방출되므로, 이를 용이하게 수집하여 응축시킬 수 있다. 또한, 발효 생산 공정의 개발로 프로필렌을 화석으로부터 제조할 필요가 없어지게 되며, 석유화학적으로 유래되는 프로필렌에 비해 비용, 에너지 및 유해 폐기물과 배기물을 상당히 절감할 수 있을 것이다.

당밀, 사탕수수 쥬스 및 농업 폐기물과 목재 폐기물을 비롯한 바이오메스 소스 유래의 당과 같은 저렴한 재생가능한 공급원료 뿐만 아니라 합성가스와 이산화탄소와 같은 C1 공급원료로부터 프로필렌을 효율적으로 생산하기 위한 미생물 유기체와 방법들이 본원에 기술되어 있으며, 관련된 이점을 가진다.

본 발명은 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 가진 비천연성 미생물 유기체를 제공한다. 본 발명은, 또한, 본원에 기술된 프로필렌 경로를 가진 비천연성 미생물 유기체를 프로필렌을 생산하기 위한 조건 하에 충분한 시간 동안 배양함으로써, 상기한 미생물 유기체를 이용한 프로필렌의 생산 방법을 제공한다.

도 1은 에틸렌 생성 효소에 의한, 2-케토글루타레이트에서 에틸렌과 이산화탄소로의 변환을 나타낸 것이다.
도 2는 2-케토글루타레이트 메틸트랜스퍼라제 및 프로필렌 생성 효소에 의한, 2-케토글루타레이트로부터 프로필렌을 제조하는 경로의 예를 도시한 것이다.
도 3은 피루베이트로부터 프로필렌을 제조하는 경로의 예를 도시한 것이다. 지정된 기질을 산물로 변환시키기 위한 효소로는, A) 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제, B) 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II, C) 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 I, D) 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제, E) 4-메틸-2-케토글루타코네이트 리덕타제, 및 F) 프로필렌 생성 효소를 포함한다.
도 4는 루신과 아세토아세테이트로부터 3-메틸-2-케토글루타레이트를 제조하는 경로를 도시한 것이다. 지정된 기질을 산물로 변환시키기 위한 효소로는, A. 루신 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제, B. 4-메틸-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제, C. 이소발레릴-CoA 데하이드로게나제, D. 3-메틸크로토닐-CoA 카르복실라제, E. 3-메틸글루타코닐-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제, F. 3-메틸글루타코네이트 하이드라타제, G. 3-메틸-2-하이드록시글루타레이트 데하이드로게나제, H. 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 데하이드라타제, 및 I. 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리아제를 포함한다.
도 5는 라이신으로부터 4-메틸-2-옥소글루타레이트를 제조하는 경로를 도시한 것이다. 지정된 기질을 산물로 변환시키기 위한 효소로는, A. 라이신 6-아미노트랜스퍼라제, 6-데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 6-옥시다제, B. 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제, C. 2-아미노아디페이트 뮤타제, D. 4-메틸-2-아미노글루타레이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제, E. 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제, 및 F. 2-옥소아디페이트 뮤타제를 포함한다.

본 발명은 프로필렌 생합성 능력을 지닌 세포 및 유기체의 설계와 생산에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 도입함으로써 프로필렌을 생산할 수 있는 미생물 유기체를 설계하는 것에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명은 프로필렌을 생합성하기 위한 대사적 설계를 확인하는 에스케리치아 콜라이 (E. coli) 대사의 인 실리코(in silico) 화학량론적 모델을 이용한다. 본원에 기술된 결과들은, 대사 경로가 에스케리치아 콜라이와 기타 세포 또는 유기체에서 프로필렌의 생합성을 달성하도록 설계 및 재조합적으로 조작될 수 있음을 보여준다. 예컨대, 인 실리코 설계에서, 프로필렌의 생합성에 의한 생산은, 설계된 대사관련 유전자형을 가진 균주를 구축함으로써, 검증할 수 있다. 또한, 대사적으로 조작된 세포 또는 유기체는, 이론적 최대 성장을 달성하는 조건 등의, 프로필렌 생합성을 더욱 증대시키기 위한 적응 진화(adaptive evolution)를 거칠 수 있다.

특정 구현예에서, 설계된 균주의 프로필렌 생합성 특징들은 균주를 유전학적으로 안정하게 만들며, 계속적인 응용 생물학적 제조에 특히 유용하다. 에스케리치아 콜라이 또는 다른 숙주 유기체에 여러가지 비-천연적인 또는 이종적인 반응 능력을 병합하여, 2-케토글루타레이트 또는 피루베이트로부터 프로필렌을 생산하는 대사 경로를 구축하는, 각각의 균주 설계 전략들이 확인되었다. 미생물에서 이들 기질 또는 대사 중간체 각각으로부터 프로필렌을 생합성하는 인 실리코 대사 설계가 동정되었다.

플랫폼의 계산 요소(computational component)를 통해 동정된 균주들은 예상되는 대사적 변이들 중 임의의 변이를 유전학적으로 조작함으로써 실제 생산에 투입시킬 수 있으며, 프로필렌 또는 기타 중간체 및/또는 하위 산물의 생합성 생산을 유도할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이들 화합물들을 생합성에 의해 생산하는 균주는, 추가적으로 산물의 생합성을 증대시키기 위해 적응 진화를 추가로 수행할 수 있다. 또한, 적응 진화를 거친 후 산물의 생합성 수율 수준은 시스템의 계산 요소를 통해 예측할 수 있다.

글리콜로부터 프로필렌을 생산하는 이론적인 최대 수율은 하기 등식에 따라 1.33 mol/mol (0.311 g/g)이다:

3 C₆H₁₂O₆ = 4 C₃H₆ + 6 CO₂ + 6 H₂O

도 2 및 3에 나타낸 경로에서는, 이용되는 글루코스 1 몰 당 프로필렌 1 몰이 만들어지므로, 글루코스로부터 피루베이트 2 분자 또는 알파-케토글루타레이트 1 분자가 생성될 것으로 추정된다. 만일 세포가 도시된 경로나 또는 환원성 (또는 역) TCA 사이클 또는 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제가 보충된 Wood-Ljungdahl 경로 등의 탄소-고정 기전을 통해 알파-케토글루타레이트의 생산시 방출되는 CO₂를 일부 고정할 수 있다면, 산물의 수율을 1.33 mol/mol로 증가시킬 수 있다.

본원에서, 용어 "비천연(non-naturally occurring)"은, 본 발명의 미생물 유기체 또는 미생물에 대해 사용되는 경우, 언급된 종의 야생형 균주를 비롯하여, 언급된 종의 천연 균주에서는 통상적으로 발견되지 않는 하나 이상의 유전자 변형을 포함한다는 의미이다. 유전자 변형은, 예를 들어, 대사 폴리펩타이드를 코딩하는 발현 가능한 핵산의 도입, 다른 핵산의 부가, 핵산의 결손 및/또는 미생물 유기체의 유전 물질의 기타 기능적 파괴를 포함한다. 이러한 변형은, 예컨대, 언급된 종에 대해 이종, 동종, 또는 이종 및 동종의 폴리펩타이드에 대한 코딩 영역 및 이의 기능성 단편을 포함한다. 다른 변형으로는, 예컨대 상기 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변형시키는 비-코딩 조절 영역을 포함한다. 예시적인 대사 폴리펩타이드는 프로필렌 생합성 경로의 효소 또는 단백질을 포함한다.

대사 변형은 이의 본래의 상태에서 변형된 생화학적 반응을 지칭한다. 따라서, 비천연 미생물은 대사 폴리펩타이드 또는 이의 기능성 단편을 코딩하는 핵산에 대한 유전자 변형을 포함할 수 있다. 대사 변형의 예는 본원에 기술되어 있다.

본원에서, 용어 "프로필렌"은 분자식 C₃H₆의 분자량이 42.08 g/mol (도 2 및 3 참조) (IUPAC 명칭 프로펜)인 물질로서, 1-프로펜, 1-프로필렌, 메틸에텐 및 메틸에틸렌과 도처에서 호환적으로 사용된다. 프로필렌은 실온에서 무색 기체이며, 약하지만 불쾌한 냄새를 풍긴다. 프로필렌은 에틸렌 보다 크기가 커 에틸렌 보다 밀도와 끓는점이 높지만, 프로판 보다는 끓는점이 약간 낮고 휘발성이 더 강하다. 프로필렌에는 강한 극성 결합이 없으며, 대칭성 감소로 인해 쌍극자 모멘트가 낮다. 또한, 프로필렌은 사이클로프로판의 구조 이성질체이다.

본원에서, 용어 "분리된"은 미생물 유기체에 대해 사용되는 경우, 이는 언급된 미생물 유기체가 자연 상태에서 발견될 때의 성분들 중 하나 이상이 실질적으로 결여된 유기체를 의미한다. 이 용어는 자연 환경에서 발견될 때의 성분들 일부 또는 전체가 제거된 미생물 유기체를 포함한다. 또한, 이 용어는 미생물 유기체가 비천연 환경에서 발견될 때의 성분들이 부분적으로 또는 전체가 제거된 미생물 유기체를 포함한다. 즉, 분리된 미생물 유기체는 유기체가 자연에서 발견되거나 또는 비천연 환경에서 증식, 보관 또는 유지될 때의 기타 성분들로부터 일부 또는 완전히 분리된다. 분리된 미생물 유기체의 구체적인 예로는 부분적으로 순수한 미생물, 실질적으로 순수한 미생물 및 비천연성 배지에서 배양된 미생물을 포함한다.

본원에서, 용어 "미생물(microbial)", "미생물 유기체" 또는 "미생물(microorganism)"은 고세균, 박테리아 또는 진핵생물류에 속하는 미시 세포로서 존재하는 모든 유기체를 의미한다. 즉, 이 용어는 미시적인 크기의 원핵 또는 진핵 세포 또는 유기체를 포괄하며, 모든 종의 박테리아, 고세균류 및 유박테리아(eubacteria) 뿐만 아니라 효모 및 진균과 같은 진핵 미생물을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 이 용어는 생화학적으로 생산하기 위해 배양할 수 있는 임의 종의 세포 배양물을 포함한다.

본원에서, 용어 "S-아데노실 메티오닌" 또는 "SAM"은, 분자식 C₁₅H₂₂N₆O₅S⁺, 분자량 398.44 g/mol (IUPAC 명칭: (2S)-2-아미노-4-[[(2S,3S,4R,5R)-5-(6-아미노퓨린-9-일)-3,4-di하이드록시옥솔란-2-일]메틸-메틸설포니오]부타노에이트)인 물질로서, 메틸기 전이에 관여하는 공-기질이다. SAM을 이용하는 대사 경로들 중 일부는 메틸전이, 황전이 및 아미노프로필화이다. SAM에서 메티오닌 황 원자에 결합된 메틸기(CH₃)는 화학적인 반응성을 가진다. 그래서, 이 기를 메틸전이 반응에서 억셉터 기질로 전이시킬 수 있다.

본원에서, 용어 "CoA" 또는 "코엔자임 A"는, 활성 효소 시스템을 만들기 위해 다수 효소(주효소(apoenzyme))의 활성에 필요한 유기 조인자 또는 보결기(효소의 비단백질 영역)를 의미한다. 코엔자임 A는 특정 축합 효소에 작용하며, 아세틸 또는 기타 아실기를 전달시키는 작용을 하며, 지방산 합성 및 산화, 피루베이트 산화 및 기타 아세틸화에 관여한다.

본원에서, 용어 "실질적으로 혐기성"은 배양 또는 생장 조건에 대해 사용되는 경우, 산소의 양이 액체 매질내 용해 산소 포화도 약 10% 미만임을 의미한다. 또한, 이 용어는 약 1% 미만의 산소 분위기로 유지되는 액체 또는 고체 배지가 들어있는 밀폐된 챔버를 포괄하는 의미이다.

본원에서 "외인성"은 언급된 분자 또는 활성이 숙주 미생물 유기체로 도입되는 것을 의미한다. 분자는, 예컨대, 플라스미드와 같은 숙주 염색체 또는 비-염색체성 유전 물질내로의 삽입에 의해서와 같이, 코딩 핵산을 숙주 유전 물질에 도입함으로써, 도입될 수 있다. 따라서, 이 용어는, 코딩 핵산의 발현에 대해 사용되는 바와 같이, 발현가능한 형태로 코딩 핵산을 미생물 유기체에 도입하는 것을 의미한다. 생합성 활성에 대해 사용되는 경우, 이 용어는 숙주 참조 유기체에 도입되는 활성에 대해서 사용된다. 그 소스는, 예컨대 숙주 미생물 유기체로 도입되어 언급된 활성을 발현하는 동종의 또는 이종의 코딩 핵산일 수 있다. 따라서, 용어 "내인성"은 숙주에 존재하는 언급된 분자 또는 활성에 대해 사용된다. 마찬가지로, 이 용어는, 코딩 핵산의 발현에 대해 사용되는 경우, 미생물 유기체내에 포함된 코딩 핵산의 발현에 대해 사용된다. 용어 "이종"은 언급된 종 이외의 소스로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭하며, "동종"은 숙주 미생물 유기체로부터 유래된 분자 또는 활성을 지칭한다. 즉, 본 발명의 코딩 핵산의 외인성 발현시 이종 또는 동종의 코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘다를 이용할 수 있다.

2 이상의 외인성 핵산이 미생물 유기체에 포함되는 경우, 2 이상의 외인성 핵산은 전술한 바와 같이 언급된 코딩 핵산 또는 생합성 활성을 지칭하는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 기술된 바와 같이, 이러한 2 이상의 외인성 핵산은 숙주 미생물 유기체에 별개의 핵산 분자로, 폴리시스트론 핵산 분자로 또는 이의 조합으로 도입될 수 있으며, 여전히 2 이상의 외인성 핵산으로서 간주될 수 있는 것으로 또한 이해된다. 예컨대, 본원에 기술된 바와 같이, 미생물 유기체는 원하는 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는 2 이상의 외인성 핵산을 발현하도록 조작될 수 있다. 원하는 활성을 코딩하는 2개의 외인성 핵산이 숙주 미생물 유기체로 도입되는 경우, 상기 2개의 외인성 핵산은 단일 핵산으로서, 예컨대 단일 플라스미드 형태로 또는 분리된 플라스미드 형태로 도입될 수 있으며, 숙주 염색체에서 단일 부위 또는 복수의 부위에 통합될 수 있으며, 여전히 2개의 외인성 핵산으로 간주되는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 3개 이상의 외인성 핵산을, 숙주 유기체에 임의의 바람직한 조합으로, 예컨대 단일 플라스미드로, 각각의 개별 플라스미드로 도입할 수 있으며, 숙주 염색체에서 단일 위치 또는 복수 위치로 삽입할 수 있으며, 여전히 2 이상의 외인성 핵산, 예컨대 3개의 외인성 핵산으로 간주되는 것으로 이해된다. 따라서, 언급되는 외인성 핵산 또는 생합성 활성의 수는 숙주 유기체로 도입되는 개개 핵산의 수를 지칭하는 것이 아니라, 코딩 핵산의 수 또는 생합성 활성의 수를 지칭한다.

본 발명의 비천연 미생물 유기체는 안정적인 유전자 변형을 포함할 수 있는데, 이는 상기한 변형을 유지하면서 5 세대 이상 배양할 수 있는 미생물을 지칭한다. 일반적으로, 안정적인 유전자 변형은 10 세대 이상 유지되는 변형을 포함하며, 특히 안정적인 변형은 약 25 세대 이상 유지될 것이며, 보다 구체적으로는 안정적인 유전자 변형은 무한정을 비롯하여 50 세대 이상 유지될 것이다.

당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 예시된 대사적 변이를 포함하여 유전자 변형이, 에스케리치아 콜라이와 같은 적정 숙주 유기체와 이의 해당 대사 반응 또는 원하는 대사 경로에 관여하는 유전자 등의 바람직한 유전 물질에 대해 적합한 소스 유기체와 관련하여 기술됨을 알 것이다. 그러나, 매우 다양한 유기체의 전체 게놈 서열 분석과 게놈학 분야의 높은 기술 수준을 감안하면, 당해 기술 분야의 당업자는 본원에 기술된 내용 및 설명을 다른 유기체들 모두에도 적용할 수 있음을 쉽게 알 것이다. 예를 들어, 본원에 예시된 에스케리치아 콜라이의 대사 변형은 언급된 종이 아닌 다른 종 유래의 동일 또는 유사 코딩 핵산을 병합함으로써, 다른 종에도 쉽게 적용할 수 있다. 이러한 유전자 변형으로는, 예컨대 일반적으로 종 상동체의 유전자 변형이 있으며, 구체적으로 오르소로그(ortholog), 파라로그(paralog) 또는 비-오르소로그형 유전자 치환(non-orthologous gene displacement)을 포함한다.

오르소로그는 수직 직계(vertical descent) 관계이며, 상이한 유기체들에서 실질적으로 동일하거나 상동한 기능을 담당하는 유전자 또는 유전자들이다. 예를 들어, 마우스 에폭사이드 하이드롤라제와 인간 에폭사이드 하이드롤라제는 에폭사이드의 가수분해라는 생물학적 기능상 오르소로그로 간주할 수 있다. 유전자들은, 예컨대 유전자들이 상동적이거나 또는 공통 조상으로부터 진화적으로 관련있는 것으로 표현되기에 충분한 서열 유사성을 공유하는 경우, 수직 직계 관계이다. 또한, 유전자는, 3차 구조를 공유하지만, 1차 서열 유사성이 확인불가한 수준으로 공통 조상으로부터 진화된 것임을 의미하는 충분한 수준의 서열 유사성을 반드시 가지고 있지 않은 경우에도, 오르소로그로 간주할 수 있다. 오르소로그인 유전자들은 아미노산 서열 유사성이 약 25% 내지 100%인 단백질을 코딩할 수 있다. 25% 미만의 아미노산 유사성을 공유하는 단백질을 코딩하는 유전자들 역시, 이들의 3차원 구조에 유사성이 있다면, 수직 직계에 의해 생겨난 것으로 간주할 수 있다. 조직 플라스미노겐 활성자 및 엘라스타제 등의 세린 프로테아제 패밀리 효소의 구성원들은 공통 조상의 수직 직계에서 생겨난 것으로 간주된다.

오르소로그는, 예를 들어, 진화를 통해 구조적으로 또는 전체 활성 측면에서 분화된 유전자, 또는 이로 코딩되는 유전자 산물을 포함한다. 예를 들어, 어떤 종이 2가지 기능을 나타내는 유전자 산물을 코딩하고 있으며 이 기능들이 제2의 종에서는 별개의 유전자로 분리되어 있는 경우, 이들 3종의 유전자와 이의 대응 산물들은 오르소로그로 간주된다. 생화학적 산물의 제조시, 당해 기술 분야의 당업자들은, 비천연 미생물을 구축하기 위해, 도입 또는 파괴할 대사 활성을 가지고 있는 오르소로그형 유전자를 선택해야 함을 알 것이다. 분리가능한 활성을 나타내는 오르소로그의 예는, 개개 활성이 2종 이상의 종들에서 또는 하나의 종에서 개별 유전자 산물로 분리되어 있는 경우이다. 구체적인 예는, 세린 프로테아제의 2가지 활성인 엘라스타제 단백질 분해 활성과 플라스미노겐 단백질 분해 활성이, 플라스미노겐 활성자 및 엘라스타제로서 개별 분자로 분리되는 경우이다. 두 번째 예는, 마이코플라스마 5'-3' 엑소뉴클레아제와 드로소필라 DNA 폴리머라제 III 활성이 분리되는 경우이다. 상기 첫 번째 종 유래의 DNA 폴리머라제는, 2번째 종 유래의 엑소뉴클레아제 또는 폴리머라제 중 어느 하나 또는 이들 둘다에 대해 오르소로그인 것으로 간주할 수 있으며, 그 역도 성립된다.

이와는 반대로, 파라로그는 예를 들어 복제와 이후 진화적 분화 관계에 있는 상동체이며, 유사하거나 공통되지만, 기능이 동일하진 않은 것이다. 파라로그는, 예컨대, 동일 종 또는 다른 종으로부터 기원하거나 유래될 수 있다. 예를 들어, 마이크로솜 에폭사이드 하이드롤라제(에폭사이드 하이드롤라제 I)와 가용성 에폭사이드 하이드롤라제(에폭사이드 하이드롤라제 II)는, 이들이 별개의 반응을 촉매하고, 동일 종에서 다른 기능을 가지고 있는, 공통 조상으로부터 함께 진화된 2개 별개의 효소이기 때문에, 파라로그로 간주될 수 있다. 파라로그는 서로 유의한 서열 유사성을 보이는 동일한 종으로부터 유래된 단백질들이므로, 이들은 상동적이거나 또는 공통 조상으로부터 함께 진화된 관계임을 시사한다. 파라로그 패밀리 그룹으로는 HipA 상동체, 루시퍼라제 유전자, 펩티다제 등이 있다.

비-오르소로그 유전자 치환(nonorthologous gene displacement)은 다른 종에서 언급된 유전자의 기능을 치환할 수 있는 어떤 종 유래의 비-오르소로그 유전자이다. 치환은, 예를 들어 다른 종들에서 언급된 기능과 비교하여, 기원 종에서 실질적으로 동일하거나 유사한 작용을 수행할 수 있음을 포함한다. 일반적으로, 비-오르소로그 유전자 치환은 언급된 기능을 코딩하는 공지된 유전자와 구조적으로 관련있는 것으로 구분할 수 있지만, 구조적으로는 관련성이 낮지만 기능적으로는 유사한 유전자 및 이의 유전자 산물도 그럼에도 불구하고 여전히 본 발명에서 사용되는 용어의 의미에 포함될 것이다. 기능 유사성에는, 예를 들어 치환하고자 하는 기능을 코딩하는 유전자에 대해, 비-오르소로그 유전자 산물의 활성부 또는 결합부에서의 어느 정도 이상의 구조 유사성이 요구된다. 따라서, 비-오르소로그 유전자는 예를 들어 파라로그 또는 비관련 유전자를 포함한다.

따라서, 프로필렌 생합성 능력을 갖춘 본 발명의 비천연 미생물 유기체를 동정하고 구축함에 있어, 당해 기술 분야의 당업자들은, 본 발명에 제공된 교시 및 지침을 특정 종들에 적용하여, 대사 변형 확인에 오르소로그의 동정 및 이의 함유 또는 불활성화가 포함될 수 있음을 인지할 것이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 또한, 파라로그 및/또는 비-오르소로그 유전자 치환이, 유사하거나 또는 실질적으로 유사한 대사 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 참조된 미생물에 존재하는 한, 진화적으로 관련성 있는 유전자들을 사용할 수 있다.

오르소로그, 파라로그 및 비-오르소로그 유전자 치환은 당해 기술 분야의 당업자에게 널리 공지된 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 2개의 폴리펩타이드에 대해 핵산 또는 아미노산 서열을 검사하여, 상기 비교되는 서열들 간의 서열 동일성과 유사성을 확인한다. 이러한 유사성을 토대로, 당해 기술 분야의 당업자는 상기 유사성이 상기 단백질들이 공통 조상으로부터 진화된 관계임을 의미할 만큼 충분히 높은지를 결정할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자들에게 널리 공지된 알고리즘, 예컨대 Align, BLAST, Clustal W 등으로 원(raw) 서열의 유사성 또는 동일성을 비교 및 확인하며, 또한, 웨이트 또는 스코어를 할당할 수 있는 서열내 갭의 존재나 유의 수준을 정할 수 있다. 이러한 알고리즘들은 또한 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 뉴클레오타이드 서열 유사성 또는 동일성 결정에 마찬가지로 적용가능하다. 관계(relatedness)를 정할 만큼 충분한 유사성에 대한 매개변수들은, 널리 공지된 통계학적 유사성 계산법, 또는 랜덤 폴리펩타이드내에서 유사한 매칭을 발견할 확률, 그리고 확인된 매칭의 유의 수준을 근거로 산정된다. 2개 이상 서열들의 컴퓨터 비교는, 또한, 필요한 경우, 당해 기술 분야의 당업자에 의해 가시적으로 최적화할 수 있다. 관련 유전자 산물 또는 단백질은 높은 유사성, 예를 들어 25% 내지 100%의 서열 동일성을 가지는 것으로 볼 수 있다. 비관련 단백질은, 충분한 크기의 데이터베이스 검색시 우연히 발생할 수 있는 수준과 기본적으로 동일한 동일성(약 5%)을 가질 수 있다. 5% 내지 24%의 서열이, 비교 서열들과 관련성 있다고 판단할 만큼 충분한 상동성을 보이거나 그렇지 않을 수 있다. 데이터 세트의 크기를 제시하는 이러한 매칭 유의 수준을 결정하기 위한 추가적인 통계학적 분석을 수행하여, 이들 서열들의 관련성을 결정할 수 있다.

BLAST 알고리즘을 이용하여 2종 이상의 서열의 관계를 측정하기 위한 매개변수의 예로, 다음과 같을 수 있다. 간략하게는, 아미노산 서열 정렬은 BLASTP 버전 2.0.8(1999년 1월 5일) 및 하기의 매개변수들을 사용하여 수행할 수 있다: 매트릭스: 0 BLOSUM62; 갭 오픈(gap open): 11; 갭 연장(gap extension): 1; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 워드크기: 3; 필터: 온(on). 핵산 서열 정렬은 BLASTN 버전 2.0.6(1998년 9월 16일) 및 하기의 매개변수들을 사용하여 수행할 수 있다: 매치: 1; 미스매치: -2; 갭 오픈: 5; 갭 연장: 2; x_드롭오프: 50; 예상: 10.0; 워드크기: 11; 필터: 오프. 당해 기술 분야의 당업자는, 상기 매개변수들에 대해 예를 들어 상기 비교의 엄격성을 높이거나 낮추고, 2종 이상 서열의 관계를 정하기 위한 변형을 가할 수 있음을 알 것이다.

일부 구현예들에서, 본 발명은, 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 비롯한, 비천연 미생물 유기체를 제공하며, 상기 프로필렌 경로는 2-케토글루타레이트 메틸트랜스퍼라제 또는 프로필렌 생성 효소를 포함한다 (도 2의 1-2 단계들을 참조함). 일 측면에서, 상기 비천연 미생물 유기체는, 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체로서, 상기 프로필렌 경로가 2-케토글루타레이트 메틸트랜스퍼라제 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 것인, 미생물 유기체를 포함한다 (도 2의 단계 1 및 2를 참조함).

일부 구현예들에서, 본 발명은, 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 비롯한, 비천연 미생물 유기체를 제공하며, 상기 프로필렌 경로는 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 I, 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제, 4-메틸-2-케토글루타코네이트 리덕타제 또는 프로필렌 생성 효소를 포함한다 (참조: 도 3, 단계 A-F). 일 측면에서, 상기 비천연 미생물 유기체는, 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체로서, 상기 프로필렌 경로가 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II, 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 것인, 미생물 유기체를 포함한다 (참조: 도 3, 단계 A, B, C 및 F). 일 측면에서, 상기 비천연 미생물 유기체는, 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체로서, 상기 프로필렌 경로가 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 I, 4-메틸-2-케토글루타코네이트 리덕타제 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 것인, 미생물 유기체를 포함한다 (참조: 도 3, 단계 A, D, E 및 F).

일부 구현예들에서, 본 발명은, 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 비롯한, 비천연 미생물 유기체를 제공하며, 상기 프로필렌 경로는 루신 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제; 4-메틸-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제; 이소발레릴-CoA 데하이드로게나제; 3-메틸크로토닐-CoA 카르복실라제; 3-메틸글루타코닐-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제; 3-메틸글루타코네이트 하이드라타제; 3-메틸-2-하이드록시글루타레이트 데하이드로게나제; 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 데하이드라타제; 또는 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리아제를 포함한다 (참조: 도 4, 단계 A-I). 일 측면에서, 상기 비천연 미생물 유기체는, 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체로서, 상기 프로필렌 경로가 루신 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제; 4-메틸-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제; 이소발레릴-CoA 데하이드로게나제; 3-메틸크로토닐-CoA 카르복실라제; 3-메틸글루타코닐-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제; 3-메틸글루타코네이트 하이드라타제; 3-메틸-2-하이드록시글루타레이트 데하이드로게나제 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 것인, 미생물 유기체를 포함한다 (참조: 도 4, 단계 A-G 및 도 2, 단계 2). 일 측면에서, 상기 비천연 미생물 유기체는, 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체로서, 상기 프로필렌 경로가 3-메틸글루타코닐-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제; 3-메틸글루타코네이트 하이드라타제; 3-메틸-2-하이드록시글루타레이트 데하이드로게나제; 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 데하이드라타제; 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리아제 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 것인, 미생물 유기체를 포함한다 (참조: 도 4, 단계 I, H, E-G 및 도 2, 단계 2). 전술한 프로필렌 경로 효소 또는 단백질에 대한 코딩 핵산의 소스는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 본원에 예시된 다양한 종으로부터 수득할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

일부 구현예들에서, 본 발명은, 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 비롯한, 비천연 미생물 유기체를 제공하며, 상기 프로필렌 경로는 라이신 6-아미노트랜스퍼라제, 6-데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 6-옥시다제; 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제; 2-아미노아디페이트 뮤타제; 4-메틸-2-아미노글루타레이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제; 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제; 또는 2-옥소아디페이트 뮤타제를 포함한다 (참조: 도 5, 단계 A-F). 일 측면에서, 상기 비천연 미생물 유기체는, 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체로서, 상기 프로필렌 경로가 라이신 6-아미노트랜스퍼라제, 6-데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 6-옥시다제; 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제, 2-아미노아디페이트 뮤타제; 4-메틸-2-아미노글루타레이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제; 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 것인, 미생물 유기체를 포함한다 (참조: 도 5, 단계 A-D, 도 3, 단계 F). 일 측면에서, 상기 비천연 미생물 유기체는, 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체로서, 상기 프로필렌 경로가 라이신 6-아미노트랜스퍼라제, 6-데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 6-옥시다제; 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제; 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제; 2-옥소아디페이트 뮤타제; 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 것인, 미생물 유기체를 포함한다 (참조: 도 5, 단계 A, B, E 및 F, 도 3, 단계 F). 전술한 프로필렌 경로 효소 또는 단백질에 대한 코딩 핵산의 소스는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 본원에 예시된 다양한 종으로부터 수득할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

부가적인 구현예에서, 본 발명은 프로필렌 경로를 구비한 비천연 미생물 유기체를 제공하며, 여기서 상기 비천연 미생물 유기체는 2-케토글루타레이트 → 3-메틸-2-케토글루타레이트, 3-메틸-2-케토글루타레이트 → 프로필렌, 피루베이트 → 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 → 4-메틸렌-2-케토글루타레이트, 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 → 4-메틸-2-케토글루타레이트, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 → 4-메틸-2-케토글루타코네이트, 4-메틸-2-케토글루타코네이트 → 4-메틸-2-케토글루타레이트 또는 4-메틸-2-케토글루타레이트 → 프로필렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 기질 → 산물로 변환시키는, 효소 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자는, 이는 예에 불과하며, 바람직한 산물을 생산하는데 적합하며 적정 활성을 기질을 산물로 변환하는데 이용가능한, 본원에 기술된 기질-산물의 임의 쌍을, 본원에 기술된 내용을 기초로 당해 기술 분야의 당업자라면 쉽게 결정할 수 있을 것으로 이해될 것이다. 즉, 본 발명은, 효소 또는 단백질이 도 2-5에 나타낸 바와 같이, 기질과 프로필렌 경로의 산물을 변환시키는, 상기 효소 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 비천연 미생물 유기체를 제공한다.

본원에 일반적으로 프로필렌 경로를 포함하는 미생물 유기체로서 기술되지만, 본 발명은, 부가적으로, 프로필렌 경로의 중간 산물을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는, 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는, 비천연 미생물 유기체를 제공하는 것으로 이해된다. 예컨대, 본원에 기술된 바와 같이, 프로필렌 경로는 도 2-5로 예시된다. 따라서, 프로필렌을 생산하는 프로필렌 경로를 포함하는 미생물 유기체와 더불어, 본 발명은 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 비천연 미생물 유기체를 제공하며, 이때 상기 미생물 유기체는 프로필렌 경로 중간 산물, 예컨대, 3-메틸-케토글루타레이트, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트, 4-메틸렌-2-케토글루타레이트, 4-메틸-2-케토글루타코네이트, 또는 4-메틸-2-케토글루타레이트를 생산한다.

실시예에 기술되고, 도 2-5의 경로 등의 도에서 예시된 바와 같이, 본원에 기술된 임의의 경로를 활용하여, 원하는 임의의 경로 중간 산물 또는 산물을 생산하는 비천연 미생물 유기체를 제조할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 중간 산물을 생산하는 상기한 미생물 유기체는 원하는 산물을 생산하기 위해 하류 경로 효소를 발현하는 다른 미생물 유기체와 조합하여 사용할 수 있다. 그러나, 프로필렌 경로 중간 산물을 생산하는 비천연 미생물 유기체를 이용하여, 원하는 산물로서 상기 중간 산물을 생산할 수 있는 것으로 이해된다.

본 발명은, 대사 반응, 반응체 또는 그 산물에 대한 일반적인 참조로, 또는 언급된 대사 반응, 반응체 또는 산물과 연관된 효소, 촉매하는 효소, 또는 연관된 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 유전자에 대한 구체적인 참조로 기술된다. 본원에 명확하게 언급되어 있지 않은 한, 당해 기술 분야의 당업자는 반응에 대한 언급이 반응체 및 반응의 산물에 대한 언급으로 구성됨을 이해할 것이다. 마찬가지로, 본원에서 명확하게 언급되지 않은 한, 반응체 또는 산물에 대한 언급은 또한 반응을 지칭하며, 이들 대사적 구성 요소들 중 임의의 것에 대한 언급 역시 언급된 반응, 반응체 또는 산물을 촉매하는 효소 또는 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자들을 지칭한다. 이와 같이, 잘 알려진 대사적 생화학, 효소학 및 게놈학 분야에서 본다면, 유전자 또는 코딩 핵산에 대한 본원의 언급은 대응되는 코딩된 효소와 이를 촉매하는 반응 또는 반응과 관련된 단백질 뿐만 아니라 반응의 반응체 및 산물에 대한 언급을 포함한다.

본원에 기술된 바와 같이, 중간체 3-메틸-2-케토글루타레이트, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트, 4-메틸-2-케토글루타코네이트, 4-메틸렌-2-케토글루타레이트, 4-메틸-2-케토글루타레이트, 4-메틸-2-옥소펜타노에이트, 3-메틸글루타코네이트, 3-메틸-2-하이드록시글루타레이트, 2-아미노아디페이트 세미알데하이드, 2-아미노아디페이트, 2-옥소아디페이트, 및 4-메틸-2-아미노글루타레이트, 뿐만 아니라 기타 중간체, 즉 카르복시산은, 완전히 양성자화된 형태, 부분 양성자화된 형태 및 완전히 탈양성자화된 형태 등의 다양한 이온화된 형태로 생산될 수 있다. 이에, 접미사 "-에이트" 또는 산 형태는 상호 호환적으로 사용되며, 이온화된 형태는 화합물이 발견되는 pH에 따라 결정되는 것으로 알려져 있어, 유리 산 형태와 특히 임의의 탈양성자화된 형태 둘다를 나타낼 수 있다. 카르복실레이트 산물 또는 중간체는 O-카르복실레이트 및 S-카르복실레이트 에스테르와 같은 카르복실레이트 산물의 에스테르 형태 또는 경로 중간체를 포함하는 것으로 이해된다. O-카르복실레이트 및 S-카르복실레이트는, C1 - C6의 분지쇄 또는 직쇄 카르복실레이트인 저급 알킬을 포함할 수 있다. 이러한 O-카르복실레이트 또는 S-카르복실레이트의 일부로는, 비제한적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, i-프로필, sec-부틸 및 tert-부틸, 펜틸, 헥실 O- 또는 S-카르복실레이트를 포함하며, 이들 모두 추가로 불포화될 수 있으며, 예로, 프로페닐, 부테닐, 펜틸 및 헥세닐 O- 또는 S-카르복실레이트를 포함한다. O-카르복실레이트는 생합성 경로의 산물일 수 있다. 생합성 경로를 통해 입수되는 O-카르복실레이트로는, 비제한적인 예로, 메틸-3-메틸-2-케토글루타레이트, 메틸-4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트, 메틸-4-메틸-2-케토글루타코네이트, 메틸-4-메틸렌-2-케토글루타레이트, 메틸-4-메틸-2-케토글루타레이트, 메틸-4-메틸-2-옥소펜타노에이트, 메틸-3-메틸글루타코네이트, 메틸-3-메틸-2-하이드록시글루타레이트, 메틸-2-아미노아디페이트 세미알데하이드, 메틸-2-아미노아디페이트, 메틸-2-옥소아디페이트, 메틸-4-메틸-2-아미노글루타레이트, 에틸-3-메틸-2-케토글루타레이트, 에틸-4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트, 에틸-4-메틸-2-케토글루타코네이트, 에틸-4-메틸렌-2-케토글루타레이트, 에틸-4-메틸-2-케토글루타레이트, 에틸-4-메틸-2-옥소펜타노에이트, 에틸-3-메틸글루타코네이트, 에틸-3-메틸-2-하이드록시글루타레이트, 에틸-2-아미노아디페이트 세미알데하이드, 에틸-2-아미노아디페이트, 에틸-2-옥소아디페이트, 에틸-4-메틸-2-아미노글루타레이트, n-프로필-3-메틸-2-케토글루타레이트, n-프로필-4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트, n-프로필-4-메틸-2-케토글루타코네이트, n-프로필-4-메틸렌-2-케토글루타레이트, n-프로필-4-메틸-2-케토글루타레이트, n-프로필-4-메틸-2-옥소펜타노에이트, n-프로필-3-메틸글루타코네이트, n-프로필-3-메틸-2-하이드록시글루타레이트, n-프로필-2-아미노아디페이트 세미알데하이드, n-프로필-2-아미노아디페이트, n-프로필-2-옥소아디페이트, 및 n-프로필-4-메틸-2-아미노글루타레이트를 포함할 수 있다. 그외 생합성에 의해 입수가능한 O-카르복실레이트로는, C7-C22인 중쇄 - 장쇄기, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 라우릴, 트리데실, 미리스틸, 펜타데실, 세틸, 팔미톨릴, 헵타데실, 스테아릴, 노나데실, 아라키딜, 헤네이코실 및 베헤닐 알코올과 같은 지방 알코올로부터 유래된 O-카르복실레이트 에스테르를 포함할 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 선택적으로 분지화되거나 및/또는 불포화를 포함할 수 있다. O-카르복실레이트 에스테르는, 또한, 유리 카르복시산 산물의 에스테르화 또는 O- 또는 S-카르복실레이트의 트랜스에스테르화 등의, 생화학적 과정 또는 화학적 과정을 통해 입수할 수 있다. S-카르복실레이트는 CoA S-에스테르, 시스테이닐 S-에스테르, 알킬티오에스테르 및 다양한 아릴 및 헤테로아릴 티오에스테르로 예시된다.

본 발명의 비천연 미생물 유기체는, 하나 이상의 프로필렌 생합성 경로에 참여하는 하나 이상의 효소 또는 단백질을 코딩하는 발현가능한 핵산을 도입함으로써, 제조할 수 있다. 생합성용으로 선택된 숙주 미생물 유기체에 따라, 특정 프로필렌 생합성 경로의 일부 또는 전부를 위한 핵산들을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 선택한 숙주에 원하는 생합성 경로에 대한 하나 이상의 효소 또는 단백질이 결핍된 경우, 결핍된 효소(들) 또는 단백질(들)에 대한 발현가능한 핵산을 이후 외인성 발현을 위해 숙주에 도입한다. 다른 예에 있어서, 선택한 숙주가 일부 경로 유전자들을 내인성 발현하지만 다른 유전자들은 결핍된 경우, 프로필렌 생합성을 달성하기 위해서는 결핍된 효소(들) 또는 단백질(들)에 대한 코딩 핵산이 필요하다. 따라서, 본 발명의 비천연 미생물 유기체는 원하는 생합성 경로를 획득하기 위해 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입함으로써 제조하거나, 또는 원하는 생합성 경로는, 하나 이상의 내인성 효소 또는 단백질과 함께, 프로필렌과 같은 원하는 산물을 생산하는, 하나 이상의 외인성 효소 또는 단백질 활성을 도입함으로써, 획득할 수 있다.

숙주 미생물 유기체는, 예컨대 박테리아, 효모, 진균 또는 발효 공정이 적용가능한 기타 다양한 미생물들 중 임의의 미생물로부터 선택할 수 있으며, 비천연 미생물 유기체는 이들로부터 제조될 수 있다. 예시적인 박테리아로는, 에스케리치아 콜라이, 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 안에어로비오스피릴룸 숙시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 액티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 만하이미아 숙시니시프로두센스(Mannheimia succiniciproducens), 리조븀 에틀리(Rhizobium etli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 플라타룸(Lactobacillus plantarum), 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor), 클로스트리듐 아세토부틸리컴(Clostridium acetobutylicum), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 슈도모나스 푸티타(Pseudomonas putida)로부터 선택되는 종을 포함한다. 효모 또는 진균의 예로는, 사카로마이세스 세레비지애, 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 피키아 패스토리스(Pichia pastoris), 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus), 리조부스 오리제(Rhizobus oryzae), 야오이와 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 등으로부터 선택되는 종을 포함한다. 에스케리치아 콜라이는 유전자 조작에 적합한 잘 특정화된 미생물이기 때문에, 특히 유용한 숙주 미생물이다. 그외 특히 유용한 숙주 유기체는 사카로마이세스 세레비지애와 같은 효모이다. 임의의 적합한 미생물 숙주 유기체를 사용하여, 원하는 산물을 생산하도록 대사성 및/또는 유전자 변형을 도입할 수 있다는 것으로 이해된다.

선택된 숙주 미생물 유기체의 프로필렌 생합성 경로의 구성 요소들에 따라, 본 발명의 비천연 미생물 유기체는, 하나 이상의 외인성으로 발현되는 프로필렌 경로를 코딩하는 핵산, 최대로는 하나 이상의 프로필렌 생합성 경로를 코딩하는 모든 핵산을 포함할 것이다. 예컨대, 프로필렌 생합성은, 대응되는 코딩 핵산의 외인성 발현을 통해 경로 효소 또는 단백질이 결핍된 숙주에서 확립할 수 있다. 프로필렌 경로의 효소 또는 단백질들이 모두 결핍된 숙주인 경우, 상기 경로의 모든 효소 또는 단백질의 외인성 발현을 포함할 수 있지만, 경로의 모든 효소 또는 단백질은 숙주가 하나 이상의 경로 효소 또는 단백질을 포함하더라도 발현시킬 수 있는 것으로 이해된다. 예컨대, 프로필렌을 생산하는 경로의 모든 효소 또는 단백질, 예로, 2-케토글루타레이트 메틸트랜스퍼라제 및 프로필렌 생성 효소, 또는 다른 예로서, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II, 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제 및 프로필렌 생성 효소, 또는 다른 예로서 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 I, 4-메틸-2-케토글루타코네이트 리덕타제 및 프로필렌 생성 효소의 외인성 발현도 포함될 수 있다.

본원에 제공되는 교시 및 지침 하에, 당해 기술 분야의 당업자라면, 발현가능한 형태로 도입되는 코딩 핵산의 수가, 적어도, 선택된 숙주 미생물 유기체의 프로필렌 경로 결함성에 대응됨을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 비천연 미생물 유기체는, 본원에 기술된 프로필렌 생합성 경로를 구성하는 효소 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 1, 2, 3 또는 4종, 최대 모든 핵산을 구비할 수 있다. 일부 구현예에서, 또한, 비천연 미생물 유기체는 프로필렌 생합성을 촉진시키거나 최적화하는, 또는 숙주 미생물 유기체에 다른 유용한 기능을 부여하는, 다른 유전적 변형을 포함할 수도 있다. 이러한 다른 기능성으로, 예컨대, 프로필렌 경로의 하나 이상의 전구체, 예컨대 2-케토글루타레이트 또는 피루베이트의 합성 증대를 포함할 수 있다.

일반적으로, 숙주 미생물 유기체는, 프로필렌 경로의 전구체를, 자연적으로 생산되는 분자로서 또는 숙주 미생물 유기체에 의해 자연적으로 생산되는 전구체의 생산 증가 또는 원하는 전구체의 데 노보 생산을 제공하는 조작된 산물로서 생산하도록, 선택된다. 예를 들어, 피루베이트 및 2-케토글루타레이트는 에스케리치아 콜라이와 같은 숙주 유기체에서 천연적으로 생산된다. 숙주 유기체는, 본원에 기술된 바와 같이, 전구체의 생산을 증가시키도록 조작될 수 있다. 또한, 원하는 전구체를 생산하도록 조작된 미생물 유기체를 숙주 유기체로 사용할 수 있으며, 또한 프로필렌 경로의 효소 또는 단백질을 발현하도록 추가로 조작될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 비천연 미생물 유기체는, 프로필렌을 합성하기 위한 효소적 역량을 포함하는 숙주로부터 제조된다. 이러한 구체적인 구현예에서, 이 유기체는, 예컨대 프로필렌을 생산하는 방향으로 프로필렌 경로 반응을 진행시키도록, 프로필렌 경로 산물의 합성 또는 축적을 높이는데 사용가능할 수 있다. 합성 또는 축적의 증가는, 예컨대, 전술한 프로필렌 경로의 효소 또는 단백질들 중 하나 이상을 코딩하는 핵산의 과다발현에 의해 달성될 수 있다. 프로필렌 경로의 효소 또는 효소들 및/또는 단백질 또는 단백질들의 과다 발현은, 예컨대 내인성 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해, 또는 이종의 유전자 또는 유전자들의 외인성 발현을 통해, 이루어질 수 있다. 따라서, 천연 유기체는, 프로필렌 생합성 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는, 1, 2, 3 또는 4종, 즉 최대 모든 수의 핵산의 과다 발현을 통해, 예컨대 프로필렌을 생산하는 비천연 미생물 유기체로, 쉽게 제조할 수 있다. 또한, 비천연 유기체는, 프로필렌 생합성 경로에서 효소의 활성을 증가시키게 되는, 내인성 유전자의 돌연변이 유발에 의해, 제조할 수 있다.

특히 유용한 구현예에서, 상기 코딩 핵산의 외인성 발현을 이용한다. 외인성 발현은 숙주 및 용도에 맞게, 사용자에 의해 조절되는 바람직한 발현 수준을 달성하도록 발현 및/또는 조절 인자를 맞춤식으로 조절하는 능력을 부여한다. 그러나, 또한, 내인성 발현은, 다른 구현예에서, 유도성 프로모터나 다른 조절 인자에 연결되었을 때, 부정적인 조절 작동자의 제거 또는 유전자의 프로모터 도입에 의해서와 같이, 활용될 수 있다. 따라서, 천연적인 유도성 프로모터를 가진 내인성 유전자는, 적정 유도제를 제공함으로써, 상향-조절시킬 수 있거나, 또는 내인성 유전자의 조절 부위를 유도성 조절 인자가 병합되도록 조작하여, 원하는 시기에 내인성 유전자의 발현 증가를 조절할 수 있다. 마찬가지로, 유도성 프로모터를 비천연 미생물 유기체에 도입되는 외인성 유전자에 대한 조절 요소로서 포함시킬 수 있다.

본 발명의 방법에서, 하나 이상의 외인성 핵산들 중 임의의 핵산을 미생물 유기체에 도입하여 본 발명의 비천연 미생물 유기체를 제조할 수 있는 것으로 이해된다. 핵산을, 미생물 유기체에 예컨대 프로필렌 생합성 경로를 부여하도록 도입시킬 수 있다. 다른 예에 있어서, 코딩 핵산을 도입하여, 프로필렌 생합성 능력을 부여하는데 필요한 반응들 중 일부를 촉매하는 생합성 능력을 가진 중간 미생물 유기체를 제조할 수 있다. 예컨대, 프로필렌 생합성 경로를 구비한 비천연 미생물 유기체는, 바람직한 효소 또는 단백질을 코딩하는 2 이상의 외인성 핵산을 포함할 수 있으며, 그 예로, 2-케토글루타레이트 메틸트랜스퍼라제와 프로필렌 생성 효소, 또는 다른 예로서 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II와 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제, 또는 다른 예로서 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제와 프로필렌 생성 효소의 조합 등을 포함할 수 있다. 따라서, 생합성 경로의 2 이상의 효소 또는 단백질의 임의 조합이 본 발명의 비천연 미생물 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 유사하게, 생합성 경로의 3개 이상의 효소 또는 단백질의 임의 조합이, 원하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 대응되는 원하는 산물의 생산으로 귀결되는 한, 예컨대, 필요에 따라, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제 + 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II + 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제, 또는 다른 예로서 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II + 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제 + 프로필렌 생성 효소, 또는 다른 예로서 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제 + 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 I + 4-메틸-2-케토글루타코네이트 리덕타제, 또는 다른 예로서 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 I + 4-메틸-2-케토글루타코네이트 리덕타제 + 프로필렌 생성 효소 등이, 본 발명의 비천연 미생물 유기체에 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 임의의 4개로 구성된 조합, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제 + 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II + 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제 + 프로필렌 생성 효소, 또는 다른 예로서 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제 + 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 I + 4-메틸-2-케토글루타코네이트 리덕타제 + 프로필렌 생성 효소, 또는 본원에 기술된 생합성 경로의 더 많은 효소 또는 단백질들이, 원하는 생합성 경로의 효소 및/또는 단백질의 조합이 대응되는 원하는 산물의 생산으로 귀결되는 한, 필요에 따라, 본 발명의 비천연 미생물 유기체에 포함될 수 있다.

본원에 기술된 프로필렌의 생합성 외에도, 본 발명의 비천연 미생물 유기체 및 방법은, 또한, 다른 경로에 의해 산물의 생합성을 달성하기 위해, 서로간의 다양한 조합으로, 그리고 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 다른 미생물 유기체 및 방법들과의 다양한 조합으로 이용할 수 있다. 예를 들어, 프로필렌 생산체를 이용하는 것 이외의 프로필렌을 생산하는 다른 방법은, 프로필렌 경로 중간 산물을 프로필렌로 변환시킬 수 있는 다른 미생물 유기체를 추가하는 것이다. 이러한 방법으로는, 예컨대 프로필렌 경로 중간 산물을 생산하는 미생물 유기체의 발효를 포함한다. 프로필렌 경로의 중간 산물은 그런 후 프로필렌 경로의 중간 산물을 프로필렌로 변환하는 2번째 미생물에 대한 기질로서 사용할 수 있다. 프로필렌 경로의 중간 산물은, 제2 유기체의 다른 배양물에 직접 첨가할 수 있거나, 또는 프로필렌 경로 중간 산물 생산체의 오리지날 배양물을 예컨대 세포 분리에 의해 이들 미생물 유기체를 고갈시킨 다음, 발효 브로스에 제2 유기체를 첨가하여, 중간 정제 단계 없이 최종 산물을 생산할 수 있다.

다른 구현예에서, 본 발명의 비천연 미생물 유기체 및 방법은, 예컨대, 프로필렌의 생합성을 달성하기 위해, 매우 다양한 서브경로로 조합될 수 있다. 이들 구현예에서, 본 발명의 바람직한 산물의 생합성 경로를 여러가지 미생물 유기체들로 분산시키고, 이 여러가지 미생물 유기체를 공-배양하여 최종 산물을 생산할 수 있다. 이러한 생합성 공정에서, 한가지 미생물 유기체의 산물은 최종 산물이 합성될 때 까지 2번째 유기체의 기질이다. 예컨대, 프로필렌의 생합성은, 하나의 경로의 중간 산물을 다른 경로의 중간 산물 또는 산물로의 변환시키기 위한 생합성 경로를 구비한 미생물 유기체를 구축함으로써 달성할 수 있다. 다른 예에 있어서, 프로필렌은, 또한, 동일 용기에서 2가지 유기체, 프로필렌 중간 산물을 생산하는 1번째 미생물 유기체와 상기 중간 산물을 프로필렌로 변환시키는 2번째 미생물 유기체를 이용하여 공-배양 또는 공-발효시킴으로써, 미생물 유기체로부터 생합성 방법으로 생산할 수 있다.

본원에 제시된 교시 및 지침을 감안하여, 당해 기술 분야의 당업자라면, 다른 미생물 유기체, 서브경로를 구비한 다른 비천연 미생물 유기체들의 공-배양, 및 프로필렌을 생산하기 위한 당해 기술 분야에 잘 공지된 다른 화학 공정 및/또는 생화학 공정의 조합과 더불어, 본 발명의 비천연 미생물 유기체 및 방법에 대해, 매우 다양한 조합 및 변경이 존재함을 이해할 것이다.

프로필렌 경로 효소 또는 단백질의 코딩 핵산의 소스는, 예컨대, 상기 코딩된 유전자 산물이 언급된 반응을 촉매할 수 있는 임의의 종을 포함할 수 있다. 이러한 종으로는, 비제한적으로, 고세균 및 유박테리아를 비롯한 박테리아, 및 효모, 식물, 곤충, 동물 및 인간을 포함한 포유류를 비롯한 진핵생물 등의, 원핵 생물 및 진핵 생물 둘다를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 이러한 소스의 예시적인 종으로는, 예컨대, 안에어로트룬쿠스 콜리호미니스(Anaerotruncus colihominis) DSM 17241, 박테로이데스 카필로수스(Bacteroides capillosus) ATCC 29799, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum) A3 str, 클로스트리듐 클루이베리(Clostridium kluyveri), 클로스트리듐 티로부티리컴(Clostridium tyrobutyricum), 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni), 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum), 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator), 에스케리치아 콜라이, 에스케리치아 콜라이 C, 에스케리치아 콜라이 W, 유박테리움 바케리(Eubacterium barkeri), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 메타노칼도코커스 야나치이(Methanocaldococcus jannaschii), 모렐라 서모아세티카(Moorella thermoacetica), 펠로토마쿨럼 서모프로피오니컴(Pelotomaculum thermopropionicum), 슈도모나스 오크레이시이(Pseudomonas ochraceae) NGJ1, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) F1, 슈도모나스 레이네케이(Pseudomonas reinekei) MT1, 슈도모나스(Pseudomonas) sp. strain B13, 슈도모나스 시링가이 pv. 글리시니아(Pseudomonas syringae pv. Glycinea), 슈도모나스 시링가이 pv. 파세올리콜라 PK2(Pseudomonas syringae pv. phaseolicola PK2), 슈도모나스 시링가이 pv. 피시(Pseudomonas syringae pv. Pisi), 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) JMP134, 랄스토니아 솔라나시이룸(Ralstonia solanacearum), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 로도코커스 오파쿠스(Rhodococcus opacus), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 스핑고모나스(Sphingomonas) sp. SYK6, 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor) A3(2), 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae), 스트렙토마이세스 로세오스포루스(Streptomyces roseosporus) NRRL 11379, 서무스 서모필러스(Thermus thermophilus) 뿐만 아니라 본원에 기술되거나 또는 해당 유전자들에 대한 소스 유기체로서 이용가능한 다른 예시적인 종들을 포함한다. 그러나, 395종의 미생물 게놈 및 다양한 효모, 진균, 식물 및 포유류 게놈을 포함하여, 현재 550종 이상에 대한 이용가능한 완전한 게놈 서열을 이용하여(NCBI 등의 공공 데이타베이스에 이용가능한 것의 절반 이상), 예컨대 공지 유전자의 상동체, 오르소로그, 파라로그 및 비-오르소로그 유전자 치환, 및 유기체들 간의 유전자 변형의 교환을 비롯하여, 관련 또는 비관련 종들에서의 하나 이상의 유전자에 대한 필수적인 프로필렌 생합성 활성을 코딩하는 유전자의 동정은, 일상적이며, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 즉, 에스케리치아 콜라이 등의 특정 유기체에 대해, 본원에 기술된 프로필렌의 생합성이 가능한 대사적 변이는, 원핵 및 진핵 유기체를 막론하고 다른 미생물들에도 쉽게 적용할 수 있다. 본원에 제시된 교시 및 지침을 감안하여, 당해 기술 분야의 당업자라면, 한가지 유기체에서 예시된 대사적 변이는 다른 유기체에도 동등하게 적용될 수 있는 것음을 알 것이다.

비관련 종들에 대안적인 프로필렌 생합성 경로가 존재하는 경우 등의 일부 경우들에서, 프로필렌 생합성은, 예컨대 언급된 반응을 대체하기 위해 유사하지만 동일하진 않은 대사 반응을 촉매하는 비관련 종들로부터 파라로그 또는 파라로그들을 외인적으로 발현시킴으로써, 숙주 종에 부여할 수 있다. 여러가지 유기체들 간에 대사 네트워크에 대한 일정한 차이가 존재하기 때문에, 당해 기술 분야의 당업자라면, 상이한 유기체들간의 실제 유전자 용법은 상이할 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 본원에 제시된 교시 및 지침 하에, 당해 기술 분야의 당업자라면, 프로필렌을 합성할 대상 종에서 미생물 유기체를 구축하기 위해, 본 발명의 내용과 방법들을 본원에 예시된 내용에 동족의 대사 변이를 이용하여 모든 미생물 유기체에 적용할 수 있음을 이해할 것이다.

비천연성 프로필렌 생산 숙주의 구축 방법 및 발현 수준을 테스트하는 방법은 예컨대 당해 기술 분야에 공지된 재조합 및 검출 방법에 의해 수행할 수 있다. 이러한 방법은, 예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)에 언급된 내용에서 볼 수 있다.

프로필렌의 생산 경로에 참여하는 외인성 핵산 서열은, 비제한적인 예로서, 접합, 전기충격, 화학적 형질전환, 형질전이, 형질감염 및 초음파 형질전환 등의 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법을 이용하여 숙주 세포로 안정적으로 또는 일시적으로 도입할 수 있다. 에스케리치아 콜라이 또는 다른 원핵 생물 세포에서의 외인성 발현을 위해, 진핵 생물의 핵산의 유전자 또는 cDNA내 일부 핵산 서열은 N-말단 미토콘드리아 신호 또는 다른 타겟팅 신호와 같은 타겟팅 신호를 코딩할 수 있으며, 상기 신호는 필요에 따라 원핵 생물 숙주 세포에 형질전환시키기 전에 제거될 수 있다. 예컨대, 미토콘드리아 리더 서열을 제거하면, 에스케리치아 콜라이에서의 발현 증가로 이어진다 (Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005)). 효모 또는 다른 진핵 생물 세포에서의 외인성 발현을 위해, 유전자를 리더 서열을 첨가하지 않고, 세포질에서 발현시키거나, 또는 숙주 세포에 적합한 미토콘드리아 표적 또는 분비 신호 등의 적합한 표적 신호를 부가함으로써, 미토콘드리아 또는 다른 기관으로 타겟팅하거나 또는 분비되도록 타겟화할 수 있다. 즉, 타겟팅 서열을 제거하거나 포함시키기 위한 핵산 서열에서의 적절한 변형이 바람직한 특성을 부여하기 위해 외인성 핵산 서열에 통합시킬 수 있는 것으로 이해된다. 아울러, 유전자는 단백질의 발현 최적화를 달성하기 위해, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법으로 코돈 최적화를 수행할 수 있다.

발현 벡터 또는 벡터들은, 숙주 유기체에서 기능하는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 예시된 바와 같은 하나 이상의 프로필렌 생합성 경로를 코딩하는 핵산을 포함하도록 구축할 수 있다. 본 발명의 미생물 숙주 유기체에서 이용하기 위한 적용가능한 발현 벡터는, 예컨대, 플라스미드, 파지 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 숙주 염색체내로의 안정적인 삽입을 위해 작동가능한 벡터 및 선택 서열 또는 마커를 포함하는 인공 염색체를 포함한다. 또한, 발현 벡터는 하나 이상의 선택성 마커 유전자와 적합한 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항생제 또는 독소에 대한 내성, 보완적인 영양요구성 결핍, 또는 배양 배지에 없는 주요 영양원의 공급을 제공하는, 선택성 마커 유전자도 포함시킬 수 있다. 발현 조절 서열은 당해 기술 분야에 널리 공지된 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 전사 인핸서, 전사 종결자 등을 포함할 수 있다. 2 이상의 외인성 코딩 핵산을 공동으로 발현시켜야 하는 경우, 이들 두가지 핵산을 예를 들어 하나의 발현 벡터 또는 분리된 발현 벡터에 삽입시킬 수 있다. 하나의 벡터에서 발현시키는 경우, 코딩 핵산을 하나의 공통 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결시키거나 또는 하나의 유도성 프로모터 및 하나의 구성적 프로모터와 같은 여러가지 발현 조절 서열에 연결시킬 수 있다. 대사 또는 합성 경로에 관여하는 외인성 핵산 서열의 형질전환은 당해 기술 분야에 널리 공지된 방법으로 검증할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 핵산 분석, 예를 들어 mRNA의 노던 블럿 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 유전자 산물의 발현에 대한 면역블럿팅, 또는 도입된 핵산 서열 또는 이의 상응하는 유전자 산물의 발현을 테스트하기 위한 기타 적합한 분석 방법을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 외인성 핵산이 바람직한 산물을 생산하는데 충분한 양으로 발현됨을 알 것이며, 발현 수준을 당해 기술 분야에 널리 공지되고 본원에 개시된 방법을 이용하여 충분한 발현이 이루어지도록 최적화할 수 있음을 또한 알 것이다.

일부 구현예들에서, 본 발명은, 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 비롯한 비천연 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는 프로필렌 생산 방법으로서, 상기 프로필렌 경로가 2-케토글루타레이트 메틸트랜스퍼라제 또는 프로필렌 생성 효소를 포함하는 것인, 프로필렌 생산 방법을 제공한다 (참조: 도 2, 단계 1-2). 일 측면에서, 상기 방법은 2-케토글루타레이트 메틸트랜스퍼라제 및 프로필렌 생성 효소 (도 2, 단계 1 및 2)를 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함한다.

일부 구현예들에서, 본 발명은, 프로필렌을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 비롯한 비천연 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는 프로필렌 생산 방법으로서, 상기 프로필렌 경로가 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 I, 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제, 4-메틸-2-케토글루타코네이트 리덕타제 또는 프로필렌 생성 효소를 포함하는 것인, 프로필렌 생산 방법을 제공한다 (참조: 도 3, 단계 A-F). 일 측면에서, 상기 방법은, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II, 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 (참조: 도 3, 단계 A, B, C 및 F) 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함한다. 일 측면에서, 상기 방법은, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 I, 4-메틸-2-케토글루타코네이트 리덕타제 및 프로필렌 생성 효소 (도 3, 단계 A, D, E 및 F)를 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함한다.

일부 구현예들에서, 본 발명은 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체 등의 비천연 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는 프로필렌 생산 방법으로서, 상기 프로필렌 경로가 루신 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제; 4-메틸-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제; 이소발레릴-CoA 데하이드로게나제; 3-메틸크로토닐-CoA 카르복실라제; 3-메틸글루타코닐-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제; 3-메틸글루타코네이트 하이드라타제; 3-메틸-2-하이드록시글루타레이트 데하이드로게나제; 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 데하이드라타제; 또는 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리아제를 포함하는 것인, 프로필렌 생산 방법을 제공한다 (참조: 도 4, 단계 A-I). 일 측면에서, 상기 방법은, 루신 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제; 4-메틸-2-옥소펜타노에이트 데하이드로게나제; 이소발레릴-CoA 데하이드로게나제; 3-메틸크로토닐-CoA 카르복실라제; 3-메틸글루타코닐-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제; 3-메틸글루타코네이트 하이드라타제; 3-메틸-2-하이드록시글루타레이트 데하이드로게나제 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 (참조: 도 4, 단계 A-G 및 도 2, 단계 2), 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함한다. 일 측면에서, 상기 방법은, 3-메틸글루타코닐-CoA 하이드롤라제, 트랜스퍼라제 또는 신테타제; 3-메틸글루타코네이트 하이드라타제; 3-메틸-2-하이드록시글루타레이트 데하이드로게나제; 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 데하이드라타제; 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리아제 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 (참조: 도 4, 단계 I, H, E-G 및 도 2, 단계 2), 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함한다. 전술한 프로필렌 경로 효소 또는 단백질에 대한 코딩 핵산의 소스는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 본원에 예시된 다양한 종으로부터 수득할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

일부 구현예들에서, 본 발명은 프로필렌을 생산하기 위해 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체 등의 비천연 미생물 유기체를 배양하는 단계를 포함하는 프로필렌 생산 방법으로서, 상기 프로필렌 경로가 라이신 6-아미노트랜스퍼라제, 6-데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 6-옥시다제; 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제; 2-아미노아디페이트 뮤타제; 4-메틸-2-아미노글루타레이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제; 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제; 또는 2-옥소아디페이트 뮤타제를 포함하는 것인, 프로필렌 생산 방법을 제공한다 (참조: 도 5, 단계 A-F). 일 측면에서, 상기 방법은, 라이신 6-아미노트랜스퍼라제, 6-데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 6-옥시다제; 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제, 2-아미노아디페이트 뮤타제; 4-메틸-2-아미노글루타레이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제; 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 (참조: 도 5, 단계 A-D, 도 3, 단계 F), 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함한다. 일 측면에서, 상기 방법은, 라이신 6-아미노트랜스퍼라제, 6-데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 6-옥시다제; 2-아미노아디페이트 데하이드로게나제; 2-아미노아디페이트 아미노트랜스퍼라제, 데하이드로게나제 (탈아민화) 또는 옥시다제; 2-옥소아디페이트 뮤타제; 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 (참조: 도 5, 단계 A, B, E 및 F, 도 3, 단계 F), 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함한다. 전술한 프로필렌 경로 효소 또는 단백질에 대한 코딩 핵산의 소스는 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 본원에 예시된 다양한 종으로부터 수득할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.

프로필렌의 생산을 테스트하기 위한 적합한 정제 및/또는 분석은 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 테스트할 조작된 각 균주에 대해 3세트 배양물 등의 적정 레플리케이트로 증식시킬 수 있다. 예를 들어, 조작된 생산 숙주에서의 산물 및 부산물의 생성을 모니터링할 수 있다. 최종 산물 및 중간산물, 및 기타 유기 화합물은 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), GC-MS(기체 크로마토그래피-질량 분광학) 및 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광학) 또는 당해 기술 분야에 널리 공지된 통상적인 절차를 이용하는 그외 적정 분석 방법으로 분석할 수 있다. 발효 브로스에서 산물의 분비는, 또한, 배양 상층액을 이용하여 테스트할 수 있다. 부산물 및 잔류 글루코스는, 예컨대 글루코스 및 알코올의 경우 굴절률 검출기, 유기산의 경우 UV 검출기(Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005))를 이용하여 HPLC로, 또는 당해 기술 분야에 널리 공지된 그외 적합한 분석 및 검출 방법으로 정량할 수 있다. 또한, 외인성 DNA 서열로부터 각 효소 또는 단백질의 활성은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 분석할 수 있다. 전형적인 분석 방법에 대해서는 Manual on Hydrocarbon Analysis (ASTM Manula Series, A.W. Drews, ed., 6^th edition, 1998, American Society for Testing and Materials, Baltimore, Maryland을 참조한다.

프로필렌은 당해 기술 분야에 잘 알려진 다양한 방법을 이용하여 배양물내 다른 성분들로부터 분리할 수 있다. 이러한 분리 방법으로는, 예컨대 추출 방법 뿐만 아니라, 연속적인 액체-액체 추출, 투석증발(pervaporation), 막 여과, 막 분리, 역삼투압, 전기투석, 증류, 결정화, 원심분리, 추출 여과(extractive filtration), 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 및 한외여과를 비롯한 방법들을 포함한다. 상기 방법들 모두 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.

본원에 기술된 임의의 비천연 미생물 유기체는 배양하여, 본 발명의 생합성 산물을 생산 및/또는 분리할 수 있다. 예컨대, 프로필렌 생산체를 프로필렌의 생합성 생산을 위해 배양할 수 있다.

프로필렌을 생산하기 위해, 재조합 균주는 탄소원과 기타 필수 영양원이 첨가된 배지에서 배양한다. 전체 공정의 비용을 줄이기 위해, 발효기를 혐기성 조건으로 유지하는 것이 때로는 바람직하며, 매우 바람직할 수 있다. 이러한 조건은, 예컨대, 배지에 질소를 일차 분사한 다음, 격막(septum)과 크림프-캡으로 플라스크를 밀봉함으로써 달성할 수 있다. 혐기 조건에서는 증식이 관찰되지 않는 균주의 경우, 제한된 호기를 위해 격막에 작은 구멍을 뚫어 미세호기 조건 또는 실질적으로 혐기 조건을 적용할 수 있다. 혐기 조건의 예들은 종래에 개시되어 있으며, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 호기 조건 및 혐기 조건의 예들은 2007년 8월 10일자 미국 공개 공보 2009/0047719에 기술되어 있다. 발효는 본원에 개시된 바와 같이 배치, 피드-배치 또는 연속적인 방식으로 수행할 수 있다.

적절한 경우, 배지의 pH는, 배양 배지를 원하는 pH로 유지하기 위해, 필요에 따라, NaOH 또는 기타 염기, 또는 산을 첨가함으로써, 바람직한 pH, 특히 pH 약 7과 같은 중성 pH로 유지시킬 수 있다. 증식율은 분광광도계(600 nm)를 이용하여 광학 밀도를 측정함으로써 결정할 수 있으며, 글루코스 흡수율(uptake rate)은 시간에 따른 탄소원 고갈을 모니터링함으로써 결정할 수 있다.

배양 배지는, 예컨대 비천연 미생물에 탄소원을 공급할 수 있는 임의의 탄수화물원을 포함할 수 있다. 이러한 탄수화물원으로는, 예컨대 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스, 슈크로스 및 스타치와 같은 당을 포함한다. 기타 탄수화물원으로는, 예컨대 재생가능한 공급 원료 및 바이오매스를 포함한다. 본 발명의 방법에 공급 원료로서 이용될 수 있는 타입의 바이오매스의 예로는, 셀룰로직 바이오매스, 헤미셀룰로직 바이오매스 및 리그닌 공급원료 또는 공급원료의 일부를 포함한다. 이러한 바이오매스 공급원료로는, 예컨대 글루코스, 자일로스, 아라비노스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스 및 스타치와 같이 탄소원으로서 이용가능한 탄수화물 기질을 포함한다. 본원에 제시된 교시 및 지침을 고려하여, 당해 기술 분야의 당업자라면, 상기에 예시된 것 이외의 재생가능한 공급원료 및 바이오매스가 또한 프로필렌을 생산하기 위한 발명의 미생물 유기체 배양에 사용될 수 있음을 이해할 것이다.

상기 예시된 바와 같은 재생가능한 공급원료 외에도, 본 발명의 프로필렌 미생물 유기체는 또한 탄소원으로서 합성가스(syngas)에서도 생장하도록 변형될 수 있다. 이러한 구체적인 구현예에서, 합성 가스 또는 기타 가스상 탄소원을 이용하는 대사 경로를 제공하기 위해, 하나 이상의 단백질 또는 효소를 프로필렌 생산 유기체에서 발현시킨다.

합성 가스(syngas) 또는 발생로 가스(producer gas)라고도 하는 합성 가스(synthesis gas)는, 석탄의 기체화와, 농업 작물 및 잔류물 등의 바이오매스 물질과 같은 탄소질 물질의 주요 산물이다. 합성 가스는 주로 H₂ 및 CO로 구성된 혼합물이며, 비제한적인 예로, 석탄, 석탄 오일, 천연 가스, 바이오매스 및 폐기 유기 물질 등의 임의의 유기 공급원의 기체화로부터 수득할 수 있다. 기체화는 일반적으로 높은 연료 대 산소 비율 하에 수행된다. 주로 H₂ 및 CO이지만, 합성 가스는 CO₂ 및 다른 기체를 소량으로 포함할 수 있다. 따라서, 합성 가스는 CO, 추가적으로 CO₂ 등의 가스상 탄소에 대한 비용 효율적인 소스로 제공된다.

Wood-Ljungdahl 경로는 CO와 H₂의 아세틸-CoA와 아세테이트 등의 기타 산물로의 변환을 촉매한다. 또한, CO 및 합성가스를 이용할 수 있는 유기체는, 일반적으로, Wood-Ljungdahl 경로에 포함된 효소 및 변환(transformation)의 동일한 기본적인 세트를 통해, CO₂ 및 CO₂/H₂ 혼합물을 이용하는 능력을 가진다. 또한, 동일 유기체에 의해 CO가 이용될 수 있으며 동일한 경로가 관여된다는 것이 밝혀지기 전까지, 오랜동안 미생물이 이산화탄소를 H₂-의존적인 방식으로 아세테이트로 변환시키는 것으로 인지되었다. 수소가 필수적인 환원 당량(reducing equivalent)의 공급원으로서 제공되는 한, 다수의 초산 생성균들을 이산화탄소의 존재 하에 증식시킬 수 있으며 아세테이트와 같은 화합물을 생산한다는 것이 확인되었다 (예, Drake, Acetogenesis, pp. 3-60 Chapman and Hall, New York, (1994)). 이를 아래 등식으로 정리할 수 있다:

2 CO₂ + 4 H₂ + n ADP + n Pi → CH₃COOH + 2 H₂O + n ATP

이때, Wood-Ljungdah 경로를 가지고 있는 비천연 미생물은 CO₂ 및 H₂ 혼합물을 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 아세틸-CoA와 기타 원하는 산물을 만들 수 있다.

Wood-Ljungdahl 경로는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 2가지의 분지로 분리될 수 있는 12가지의 반응으로 구성되어 있다: (1) 메틸 분지와 (2) 카르보닐 분지. 메틸 분지는 합성 가스를 메틸-테트라하이드로폴레이트 (메틸-THF)로 변환시키고, 카르보닐 분지는 메틸-THF를 아세틸-CoA로 변환시킨다. 메틸 분지에서의 반응들은 다음과 같은 효소 또는 단백질에 의해 순차적으로 촉매된다: 페레독신 옥시도리덕타제, 포르메이트 데하이드로게나제, 포르밀테트라하이드로폴레이트 신테타제, 메테닐테트라하이드로폴레이트 사이클로데하이트라타제(cyclodehydratase), 메틸렌테트라하이드로폴레이트 데하이드로게나제 및 메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제. 카르보닐 분지에서의 반응들은 다음과 같은 효소 또는 단백질에 의해 순차적으로 촉매된다: 메틸테트라하이드로폴레이트:코리노이드 단백질 메틸트랜스퍼라제 (예, AcsE), 코리노이드 철-황 단백질, 니켈-단백질 어셈블리 단백질 (예, AcsF), 페레독신, 아세틸-CoA 신타제, 카본 모노옥사이드 데하이드로게나제 및 니켈-단백질 어셈블리 단백질 (예, CooC). 프로필렌 경로를 구현하기 위해 충분한 수의 코딩 핵산을 도입하는 것에 대한 본원에 제공된 내용 및 지침에 따라, 당해 기술 분야의 당업자는, 숙주 유기체에 존재하지 않는 Wood-Ljungdahl 효소 또는 단백질을 코딩하는 핵산을 적어도 도입하는 측면에 대해, 동일한 조작 설계를 수행할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 변형된 유기체에 Wood-Ljungdah의 전체 경로가 포함되도록, 하나 이상의 코딩 핵산을 본 발명의 미생물에 도입함으로써, 합성 가스의 이용 능력이 부여될 것이다.

또한, 카본 모노옥사이드 데하이드로게나제 활성 및/또는 하이드로게나제 활성과 커플링된 환원성(역) 트리카르복시산 사이클은, CO, CO₂ 및/또는 H₂를 아세틸-CoA과 아세테이트와 같은 기타 산물로 변환시키기 위해 사용될 수 있다. 환원성 TCA 경로를 통해 탄소를 고정할 수 있는 유기체는 하나 이상의 다음과 같은 효소를 이용할 수 있다: ATP 사이트레이트-리아제, 사이트레이트 리아제, 아코니타제(aconitase), 이소시트레이트 데하이드로게나제, 알파-케토글루타레이트:페레독신 옥시도리덕타제, 숙시닐-CoA 신테타제, 숙시닐-CoA 트랜스퍼라제, 푸마레이트 리덕타제, 푸마라제(fumarase), 말레이트 데하이드로게나제, NAD(P)H:페레독신 옥시도리덕타제, 카본 모노옥시드 데하이드로게나제, 및 하이드로게나제. 구체적으로, 카본 모노옥사이드 데하이드로게나제 및 하이드로게나제에 의해 CO 및/또는 H₂로부터 추출된 환원 당량을 이용하여, 환원성 TCA 사이클을 통해 CO₂를 아세틸-CoA 또는 아세테이트에 고정한다. 아세테이트는 아세틸-CoA 트랜스퍼라제, 아세테이트 키나제/포스포트랜스아세틸라제, 및 아세틸-CoA 신테타제와 같은 효소에 의해 아세틸-CoA로 변환시킬 수 있다. 아세틸-CoA는, 피루베이트:페레독신 옥시도리덕타제 및 당신생 관련 효소에 의해, p-톨루에이트, 테레프탈레이트 또는 (2-하이드록시-3-메틸-4-옥소부톡시)포스포네이트 전구체, 글리세르알데하이드-3-포스페이트, 포스포에놀피루베이트 및 피루베이트로 변환될 수 있다. p-톨루에이트, 테레프탈레이트 또는 (2-하이드록시-3-메틸-4-옥소부톡시)포스포네이트 경로 구현을 위한 충분한 수의 코딩 핵산의 도입에 대해 본원에 제시된 교시 및 지침에 따라, 당해 기술 분야의 당업자라면, 숙주 유기체에 존재하지 않는 환원성 TCA 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는 핵산을 적어도 도입하는 것에 대하여 동일한 조작 설계를 수행할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 변형된 유기체가 환원성 TCA 전체 경로를 포함하도록, 하나 이상의 코딩 핵산을 본 발명의 미생물에 도입함으로써, 합성 가스의 이용 능력이 부여될 것이다.

즉, 본원에 제시된 교시 및 지침을 감안하여, 당해 기술 분야의 당업자라면, 탄수화물과 같은 탄소원에서 생육시켰을 때, 본 발명의 생합성된 화합물을 분비하는 비천연 미생물 유기체를 생산할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 화합물로는, 예컨대, 프로필렌과 프로필렌 경로에서의 임의의 중간 대사산물을 포함한다. 모든 필요한 것은, 예컨대 프로필렌 생합성 경로의 일부 또는 전체 포함 등의, 바람직한 화합물 또는 중간 산물의 생합성을 달성하도록 필수 효소 또는 단백질 활성 중 한가지 이상을 조작하는 것이다. 이에, 본 발명은, 탄수화물 또는 기타 탄소원에서 생장시켰을 때 프로필렌을 생산 및/또는 분비하며, 탄수화물 또는 기타 탄소원에서 생장시켰을 때 프로필렌 경로에 확인되는 임의의 중간 대사산물을 생산 및/또는 분비하는, 비천연 미생물 유기체를 제공한다. 프로필렌을 생산하는 본 발명의 미생물 유기체는 중산 산물들, 예를 들어 3-메틸-케토글루타레이트, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트, 4-메틸렌-2-케토글루타레이트, 4-메틸-2-케토글루타코네이트, 또는 4-메틸-2-케토글루타레이트로부터 합성을 개시할 수 있다.

본 발명의 비천연 미생물 유기체는, 프로필렌을 생산하기에 충분한 양으로 프로필렌의 경로 효소 또는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 외인성으로 발현하도록, 본원에 예시된 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 구축한다. 본 발명의 미생물 유기체는 프로필렌을 생산하기에 충분한 조건 하에서 배양되는 것으로 이해된다. 본원에 제시된 교시 및 지침에 따라, 본 발명의 비천연 미생물 유기체는 프로필렌의 생합성을 달성하여, 세포내 농도 약 0.001-2000 mM 이상을 형성시킬 수 있다. 일반적으로, 프로필렌의 세포내 농도는 약 3-1500 mM, 특히 약 5-1250 mM, 보다 구체적으로 약 8-1000 mM이며, 예로, 약 100 mM, 200 mM, 500 mM, 800 mM 또는 그 이상을 포함한다. 이들 예시적인 범위 사이, 그리고 그 이상의 세포내 농도는 또한 본 발명의 비천연 미생물 유기체로부터 달성할 수 있다.

일부 구현예에서, 배양 조건은 혐기적 또는 실질적으로 혐기적 배양 또는 유지 조건을 포함한다. 예시적인 혐기 조건은 종래에 개시되어 있으며, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 발효 공정에 대한 예시적인 혐기 조건은 본원에 기술되어 있으며, 예컨대 2007년 8월 10일자 미국 공개공보 2009/0047719에 기술되어 있다. 이러한 조건들 중 임의의 조건을 비천연 미생물 유기체로 이용할 수 있으며, 뿐만 아니라 당해 기술 분야에 잘 알려진 다른 혐기 조건을 이용할 수 있다. 프로필렌의 생산체들은, 상기한 혐기 또는 실질적인 혐기 조건 하에서, 프로필렌을 세포내 농도 5-10 mM 이상으로, 뿐만 아니라 본원에 예시된 다른 모든 농도들로 합성할 수 있다. 전술한 내용이 세포내 농도를 언급하더라도, 프로필렌을 생산하는 미생물 유기체가 프로필렌을 세포내에서 생산할 수 있으며, 및/또는 배양 배지로 산물을 분비할 수 있는 것으로 이해된다.

본원에 기술된 배양 및 발효 조건 외에도, 프로필렌의 생합성을 달성하기 위한 생육 조건은, 배양 조건에 내삼투압제(osmoprotectant)의 추가를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 비천연 미생물 유기체는 내삼투압제가 존재하는 조건에서 유지, 증식 및 발효될 수 있다. 간략하게는, 내삼투압제는 삼투 물질(osmolyte)로서 작용하며 본원에 기술된 미생물 유기체를 삼투 스트레스로부터 생존하도록 보조하는 화합물을 지칭한다. 내삼투압제로는, 베타인, 아미노산 및 당 트레할로스를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이러한 것에 대한 비제한적인 예로는 글리신 베타인, 프랄린 베타인, 디메틸테틴, 디메틸설포니오프로피오네이트, 3-디메틸설포니오-2-메틸프로피오네이트, 피페콜산, 디메틸설포니오아세테이트, 콜린, L-카르니틴 및 엑토인이 있다. 일 측면에서, 상기 내삼투압제는 글리신 베타인이다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 기술된 미생물 유기체를 삼투 스트레스로부터 보호하기에 적합한 내삼투압제의 양과 타입이 사용되는 미생물 유기체에 따라 결정된다는 것을 알 것이다. 배양 조건에서의 내삼투압제의 양은, 예컨대 약 0.1 mM 이하, 약 0.5 mM 이하, 약 1.0 mM 이하, 약 1.5 mM 이하, 약 2.0 mM 이하, 약 2.5 mM 이하, 약 3.0 mM 이하, 약 5.0 mM 이하, 약 7.0 mM 이하, 약 10 mM 이하, 약 50 mM 이하, 약 100 mM 이하, 또는 약 500 mM 이하일 수 있다.

배양 조건은, 예컨대 액체 배양 과정 뿐만 아니라 발효 및 그외 대규모 배양 과정을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 생합성 산물에 대해 특히 유용한 수율은 혐기 또는 실질적으로 혐기적 배양 조건에서 달성될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 프로필렌의 생합성을 달성하기 위한 배양 조건의 일 예는 혐기성 배양 또는 발효 조건을 포함한다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 비천연 미생물 유기체는 혐기 또는 실질적인 혐기 조건에서 유지, 배양 또는 발효시킬 수 있다. 간략하게는, 혐기 조건은 산소가 없는 환경을 지칭한다. 실질적인 혐기 조건은, 예를 들어, 배지내 용해된 산소 농도가 0 내지 10%의 포화율로 존재하는, 배양, 배치 발효 또는 연속 발효를 포함한다. 실질적인 혐기 조건은 또한 산소 1% 미만의 분위기로 유지되는 밀폐된 챔버 안에서 액체 배지내에서 또는 고체 한천 배지 상에서의 세포의 증식 또는 휴지를 포함한다. 상기 산소 비율은, 예컨대 상기 배양물에 N₂/CO₂ 혼합물 또는 그외 적절한 산소 이외의 기체 또는 기체들을 살포함으로써 유지시킬 수 있다.

본원에 기술된 배양 조건은 프로필렌을 생산하기 위한 규모 확대 및 연속 배양일 수 있다. 배양 공정의 예는, 피드-배치 발효(fed-batch fermentation) 및 배치 분리(batch separation); 피드-배치 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리를 들 수 있다. 이러한 공정들 모두 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 프로필렌을 상업적인 양으로 생합성에 의해 생산하는데에는 발효 공정이 특히 유용하다. 일반적으로, 그리고 비-연속식 배양 공정을 이용하는 경우와 같이, 프로필렌의 연속 및/또는 거의 연속적인 생산은, 본 발명의 프로필렌의 비천연 생산 유기체를 지수기(exponential phase)로의 증식을 유지 및/또는 거의 유지시키기 위한 충분한 영양분 및 배지에서 배양하는 단계를 포함할 것이다. 이러한 조건에서의 연속 배양은, 예컨대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 이상의 기간동안의 배양을 포함할 수 있다. 추가적으로, 연속 배양은 1주일, 2주일, 3주일, 4주일 또는 5주일 이상에서 최대 수 개월까지의 장기간을 포함할 수 있다. 다른 예에 있어서, 본 발명의 유기체는 특정 용도에 적합하다면, 수시간 배양할 수 있다. 상기 연속 및/또는 거의 연속 배양 조건은 이러한 예시적인 기간에 포함된 모든 시간 간격을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 아울러, 본 발명의 미생물 유기체의 배양 시간은 원하는 목적을 위해 산물을 충분한 양으로 생산하기에 충분한 기간인 것으로 이해된다.

발효 공정은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 간략하게, 프로필렌을 생합성 생산하기 위한 발효는, 예컨대 피드-배치 발효 및 배치 분리; 피드-배치 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리로 실시할 수 있다. 배치 및 연속 발효 공정의 예는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다.

상당량의 프로필렌을 연속 생산하기 위해, 본 발명의 프로필렌 생산체를 이용한 전술한 발효 공정 외에도, 프로필렌 생산체는, 또한, 예컨대, 산물을 다른 화합물로 변환시키는 화학적 합성 공정에 동시에 투입하거나, 또는 산물을 발효 배양물로부터 분리한 다음 순차적으로 이를 필요에 따라 산물을 다른 화합물로 변환시키는 화학적 또는 효소적 변환 공정을 진행할 수 있다.

보다 우수한 생산체를 제조하기 위해, 대사 모델 연구를 이용하여 생장 조건을 최적화할 수 있다. 모델 연구를 통해 또한 경로의 이용성을 추가적으로 최적화하는 유전자 낫아웃을 설계할 수 있다 (예, 미국 특허 공개번호 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466, 미국 특허 7,127,379). 모델 분석을 통해 프로필렌을 보다 효율적으로 생산하는 방향으로 대사를 이동시키는 세포 생육에 대한 효과들을 신뢰성있게 예견할 수 있다.

원하는 산물의 생합성에 유익한 대사 변이를 동정 및 설계하기 위한 한가지 컴퓨터 작업 방식은 OptKnock 전산 프래임워크이다 (Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)). OptKnock는 표적 산물을 과생산하는 유전적으로 안정한 미생물을 만드는, 유전자 결손 또는 파괴 전략을 제시하는 대사 모델링 및 시뮬레이션 프로그램이다. 구체적으로, 상기 프래임워크에서 원하는 생화학물질이 세포 생육의 필수 부산물이 되도록 강제하는 유전자 조작을 제안하기 위해, 미생물의 전체 대사 및/또는 생화학적 네트워크를 조사한다. 전략적으로 배치시킨 유전자 결손 또는 그외 기능성 유전자의 파괴를 통해, 생화학적 생산을 세포 생육과 커플링시킴으로써, 생물반응기에서의 장시간 경과 후 상기 조작된 균주에 부과되는 생육 선택압은 강제적인 생육과 커플링된 생화학적 생산의 결과로서 성능을 개선시킨다. 마지막으로, 유전자 결손의 구축시, OptKnock에서 선택된 유전자들은 게놈에서 완전히 제거되기 때문에, 설계된 균주는 야생형 형태로 되돌아갈 가능성이 거의 없다. 따라서, 상기 컴퓨터를 통한 계산 방법을 이용하여, 원하는 산물의 생합성을 도출하는 대안적인 경로를 동정하거나, 또는 원하는 산물의 생합성을 추가로 최적화하기 위해 비천연 미생물 유기체와 조합하여 사용할 수 있다.

간략하게 설명하면, OptKnock는 본원에서 세포 대사를 모델링하기 위한 계산 방법 및 시스템을 지칭하는 용어이다. OptKnock 프로그램은 특정 제한(particular constraint)을 플럭스 밸런스 분석(FBA) 모델과 통합시킨 방법 및 모델 프래임워크와 관련있다. 이러한 제한으로는, 예컨대 정성적인 동역학 정보(qualitative kinetic information), 정성적인 조절 정보, 및/또는 DNA 마이크로어레이 실험 데이터를 포함한다. 또한, OptKnock는, 예를 들어, 플럭스 밸런스 모델로부터 나오는 플럭스 바운더리를 엄격하게 하고 후속적으로 유전자 추가 또는 결손시의 대사 네트워크의 성능 한계를 탐지함으로써, 다양한 대사 문제들에 대한 해법을 도출한다. OptKnock 전산 프래임워크는 대사 네트워크의 성능 한계의 유효 쿼리를 허용하는 모델 포뮬레이션을 구축할 수 있으며, 구해지는 혼성-정수 선형 프로그래밍 문제점을 해결하는 방법을 제공할 수 있다. 본원에서 OptKnock로 지칭되는 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법들은, 예를 들어 2002년 1월 10일자로 출원된 미국 공개공보 2002/016854, 2002년 1월 10일자로 출원된 국제 특허 제 PCT/US02/00660, 및 2007년 8월 10일자로 출원된 미국 공개공보 2009/0047719에 개시되어 있다.

산물의 생합성 생산에 유리한 대사 변이를 동정 및 설계하기 위한 또 다른 계산법은, SimPheny^®로 칭하는 대사 모델링 및 시뮬레이션 시스템이다. 이 계산법 및 시스템은 예컨대 2002년 6월 14일자로 출원된 미국 공개공보 2003/0233218 및 2003년 6월 13일자로 출원된 국제 특허 출원 PCT/US03/18838에 개시되어 있다. SimPheny^®는 인 실리코(in silico) 네트워크 모델을 만들고, 생물 시스템의 화학 반응들을 통해 매스, 에너지 또는 전하의 흐름을 시뮬레이션하여 상기 시스템에서의 화학 반응의 임의의 및 모든 가능한 작용기를 포괄하는 해결 영역을 규정함으로써, 상기 생물 시스템에서 허용되는 다양한 활성들을 결정하기 위해 사용될 수 있는 전산 시스템이다. 이러한 방식은, 상기 해결 영역이 포함된 반응들의 공지된 화학량론 뿐만 아니라 반응을 통한 최대 플럭스와 조합된 반응 열역학적 한계 및 용량 한계 등의 한계로 규정되기 때문에, 제한 조건 기반의 모델링(constraints-based modeling)으로 지칭된다. 이러한 제한에 의해 규정되는 영역을 조사하여, 상기 생물 시스템 또는 그것의 생화학적 성분들의 표현형적 역량 및 행태를 결정할 수 있다.

이러한 계산법은, 생물 시스템들이 유연하고 다수의 다른 방식으로도 동일한 결과에 도달할 수 있기 때문에, 생물학적 현실에 부합된다. 생물 시스템은 모든 살아있는 시스템들이 직면해야 하는 기본적인 제약들에 의해 제한되는 진화 기전을 통해 설계된다. 따라서, 제한 조건 기반의 모델링 전략은 이러한 일반적인 현실을 포괄한다. 더욱이, 제한 조건의 엄격화를 통해 네트워크 모델에 추가적인 제한을 계속적으로 부과하는 능력은 상기 해결 영역의 크기를 줄이게 되고, 그래서 생리학적 성능 또는 표현형을 예견할 수 있는 정확도가 향상된다.

본 발명의 교시 및 지침을 감안하여, 당해 기술 분야의 당업자는 숙주 미생물 유기체에서 원하는 화합물의 생합성을 설계 및 구현하기 위해 대사 모델링 및 시뮬레이션에 다양한 계산 프래임워크를 적용할 수 있을 것이다. 이러한 대사 모델링 및 시뮬레이션 방법은, 예를 들어 SimPheny^® 및 OptKnock로 상기에 예시된 전산 시스템을 포함한다. 본 발명을 예시하기 위해, 모델링 및 시뮬레이션을 위한 OptKnock 계산 프래임워크 체계와 관련하여 일부 방법들을 본원에서 기술한다. 당해 기술 분야의 당업자들은, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 임의의 이러한 다른 대사 모델링 및 시뮬레이션 계산 프래임워크 및 방법에, OptKnock를 이용한 대사 변이의 동정, 설계 및 구현을 적용하는 방법을 알 것이다.

전술한 방법들은 파괴할 한가지 이상의 대사 반응 세트를 제공할 것이다. 상기 세트 또는 대사 변이에서 각 반응의 제거시, 원하는 산물은 유기체의 증식기 동안에 필수 산물로서 생산될 수 있다. 반응들은 공지되어 있으므로, bilevel OptKnock 문제에 대한 해법은, 또한, 반응 세트의 각 반응을 촉매하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 관련 유전자 또는 유전자들을 제공해 줄 것이다. 반응 세트와, 각 반응에 참여하는 효소를 코딩하는 해당 유전자를 동정하는 것은, 일반적으로 효소와 코딩 유전자 간의 관련성이 포함된 반응 데이타베이스를 이용한 반응들의 상관 관계를 통해 달성되는 자동화된 과정이다.

일단 동정되면, 원하는 산물의 생산을 달성하기 위해 파괴시켜야 하는 반응 세트는, 세트에 포함된 각 대사 반응을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 기능적 파괴에 의해, 타겟 세포 또는 유기체에서 수행된다. 상기 반응의 기능적 파괴를 달성하는데 특히 유용한 한가지 수단은, 각 코딩 유전자의 결손이다. 그러나, 일부 경우에, 예컨대 프로모터 또는 조절 인자에 대한 cis 결합 부위와 같은 조절 영역의 돌연변이, 결손 등의 기타 유전적 이상에 의해, 또는 다수 위치들 중 임의 위치에서의 코딩 서열의 절단(truncation)에 의해, 상기 반응을 파괴하는 것이 유익할 수 있다. 유전자 세트의 전체 결손까지는 아닌 그 미만의 수준의 결손을 발생시키는 상기한 이상은, 예컨대 산물의 커플링의 신속한 평가가 필요할 때 또는 유전자 복원이 이루어질 가능성이 거의 없을 경우에, 유용할 수 있다.

추가적인 반응 세트의 파괴 또는 생육과 커플링된 원하는 산물의 생합성 등의 생합성을 달성할 수 있는 대사 변이를 유도하는, 전술한 bilevel OptKnock 문제에 대한 추가적인 생산적인 해법을 동정하기 위해, 정수 컷(integer cut)으로 칭해지는 최적화 방법을 실행할 수 있다. 상기 방법은, 상기 예시된 OptKnock 문제를, 각 반복시 정수 컷으로 지칭되는 추가적인 제한을 통합하여, 반복적으로 해결함으로써, 진행된다. 정수 컷 제한은, 상기 해결 과정이, 산물 생합성과 생육을 필수적으로 조합시킨 임의의 이전 반복에서 동정된 반응의 실제 동일한 세트가 선택되지 않게 방지한다. 예컨대, 앞서 동정된 생육과 결합된 대사 변이에서 파괴시킬 반응들 1, 2 및 3가지가 확인된다면, 하기 제한으로 동일 반응이 후속 해법에서 동시에 고려되지 않도록 한다. 정수 컷 방법은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 Burgard et al., Biotechnol. Prog. 17:791-797 (2001)에서 찾아 볼 수 있다. 대사 모델링 및 시뮬레이션을 위해 OptKnock 계산 프래임워크와의 조합 사용에 대한 본원에 기술된 모든 방법들에서와 같이, 반복적인 계산 분석에서 쓸데없는 반복을 줄이는 정수 컷 방법을, 또한, 예컨대, SimPheny^® 등의 당해 기술 분야에 널리 공지된 그외 계산 프래임워크와 함께 적용할 수 있다.

타겟 생화학 산물의 생산을 동정된 유전자 변이를 가지도록 조작된 세포 또는 유기체의 생육과 필연적으로 커플링시키는 방법을 비롯하여, 본원에 예시된 방법들로, 원하는 산물을 생합성으로 생산하는 세포 및 유기체를 구축할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 계산법으로 OptKnock 및 SimPheny^® 중에서 선택되는 인 실리코(in silico) 방법으로 확인되는 대사 변이를 동정 및 구현할 수 있다. 대사 변이 세트는, 예컨대 하나 이상의 생합성 경로 효소들의 부가 및/또는 유전자 결손에 의한 파괴 등의 한가지 이상의 대사 반응의 기능적 파괴를 포함할 수 있다.

전술한 바와 같이, OptKnock 방법은 오랜 기간의 생육 선택을 거쳤을 때 미생물 돌연변이 네트워크가 계산적으로 예측되는 최대-증식 표현형을 나타내는 방향으로 진화할 수 있다는 전제에서 개발되었다. 즉, 이러한 방법은 선택압 하에서 유기체의 자기 최적화 능력을 활용한다. OptKnock 프래임워크는 네트워크 화학량론에 근거하여 생화학적 생산과 세포 증식을 강제로 커플링시키는 유전자 결손의 조합을 철저하게 조사할 수 있다. 최적 유전자/반응 낫아웃을 확인하는데에는, 형성되는 네트워크에 대한 최적 증식 해법이 대상 생화학적 산물을 과생산하도록, 활성 반응 세트를 선택하는 2단식 최적화 문제의 해법이 요구된다(Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)).

에스케리치아 콜라이 대사의 인 실리코 화학량론 모델을 채택하여, 기존에 예시되고, 예를 들어 미국 특허 공개공보 US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 및 US 2004/0009466, 및 미국 특허 7,127,379에 기술된 바와 같이, 대사 경로의 필수 유전자들을 동정할 수 있다. 본 발명에 개시된 바와 같이, OptKnock의 수리적 프래임워크를 적용하여, 원하는 산물을 증식과 조합하여 생산가능하게 하는, 유전자 결손을 정확하게 파악할 수 있다. 나아가, 상기 이단식 OptKnock 문제 해법은 오직 하나의 결손 세트만을 제공한다. 모든 의미 있는 해법들, 즉 증식과 조합되어 생산되게 하는 낫아웃 세트들을 모두 열거하기 위해, 정수 컷으로 지칭되는 최적화 기법을 구현할 수 있다. 이는, 전술한 바와 같이, 각 반복에서 정수 컷으로 지칭되는 추가적인 제한을 추가하면서 OptKonck 문제를 반복적으로 해결하는 과정을 수반한다.

본원에 기술된 바와 같이, 프로필렌 경로의 원하는 활성을 코딩하는 핵산을 숙주 유기체에 도입할 수 있다. 일부 경우에, 프로필렌 경로 효소 또는 단백질의 활성을 프로필렌 생산을 증가시키도록 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예컨대, 단백질 또는 효소의 활성을 증가시키는 공지된 돌연변이는 코딩 핵산 분자에 도입시킬 수 있다. 아울러, 효소 또는 단백질의 활성을 높이거나 및/또는 저해 활성을 낮추기 위해, 예컨대 네거티브 조절자의 활성을 낮추기 위해, 최적화 방법을 적용할 수 있다.

이러한 최적화 방법의 한가지가 방향성 진화(directed evolution)이다. 방향성 진화는, 효소의 특성을 개선 및/또는 변이시키기 위해, 특정 유전자로 표적화된 돌연변이를 도입하는 과정을 포함하는, 강력한 방법이다. 향상된 및/또는 변이된 효소는 다수의(예, >10⁴) 효소 변이체를 자동으로 스크리닝할 수 있는 민감성 고성능 스크리닝 분석을 개발 및 구현하여 동정할 수 있다. 돌연변이 유발 및 스크리닝의 반복 라운드를 전형적으로 수행하여 효소에 최적화된 특성을 부여할 수 있다. 돌연변이를 유발하기 위한 유전자의 영역들을 동정하는데 도움이 될 수 있는 수리적 알고리즘들도 또한 개발되었고, 제조 및 스크리닝할 필요가 있는 효소 변이체들의 수를 현저하게 줄일 수 있다. 다양한 변이체 라이브러리 제조에 유효한 다수의 방향성 진화 기법들이 개발되었고 (Hibbert et al., Biomol.Eng 22:11-19 (2005); Huisman and Lalonde, In Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries pgs. 717-742 (2007), Patel (ed.), CRC Press; Otten and Quax. Biomol.Eng 22:1-9 (2005); 및 Sen et al., Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223 (2007)), 많은 효소 클래스들에서의 매우 다양한 특성을 개선시키기 위해, 이러한 방법들이 성공적으로 적용되었다. 방향적 진화 기법에 의해 향상 및/또는 변이시킨 효소 특징들로는, 예컨대 비천연 기질의 변환을 위한, 선택성/특이성; 확실한 고온 처리를 위한 온도 안정성; 높거나 낮은 pH 조건에서의 생물학적 처리를 위한 pH 안정성; 기질 또는 산물 관용성, 이로써 높은 생산 역가를 달성할 수 있음; 비천연 기질들을 포괄하기 위한 광범위한 기질 결합성 등의, 결합성 (K_m); 산물, 기질 또는 주요 중간산물에 의한 저해를 없애기 위한, 저해성 (K_i); 원하는 플럭스를 달성하기 위해 효소적 반응 속도를 높이기 위한, 활성 (kcat); 단백질 수율 및 전체 경로 플럭스를 높이기 위한, 발현 수준; 호기 조건에서 공기 민감성 효소 작동을 위한, 산소 안정성; 및 산소가 존재하지 않는 조건에서 호기성 효소의 작동을 위한, 혐기 활성을 포함한다.

특정 효소의 원하는 특징을 표적하기 위한 유전자의 돌연변이 유발 및 다양화하기 위해 개발된 예시적인 방법들은 아래에서 보다 상세하게 기술한다. 이러한 방법들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법들 중 임의 방법을 이용하여 프로필렌 경로 효소 또는 단백질의 활성을 변형 및/또는 최적화시킬 수 있다.

EpPCR (Pritchard et al., J Theor.Biol. 234:497-509 (2005))은 PCR 반응에 Mn²⁺ 이온을 첨가하여 DNA 중합효소의 피델리티(fidelity)를 낮춤으로써, dNTP 농도를 편향시킴으로써, 또는 다른 조건에 변화를 가함으로써, 랜덤 포인트 돌연변이를 도입한다. 대상 타겟 유전자로의 돌연변이 유발을 제한하는 5단계 클로닝 공정은, 1) 대상 유전자의 에러 유발성 PCR 증폭; 2) 제한 효소 절단; 3) 원하는 DNA 단편의 정제; 4) 벡터로의 삽입; 5) 적정 숙주의 유전자 변이체로의 형질전환 및 성능 개선에 대한 라이브러리 검색을 포함한다. 이러한 방법은 하나의 유전자에 동시에 복수의 돌연변이를 만들 수 있어, 바람직한 활성을 가진 다수의 잠재적인 변이체를 스크리닝하는데 유용하다. EpPCR을 통해 다수의 돌연변이를 제작할 수 있어, 고성능 스크리닝 분석 또는 선별 방법, 예컨대 로봇 공학을 이용한 방법을 활용하여 바람직한 특징을 가진 변이체를 동정할 수 있다.

에러-유발 롤링 서클 증폭(Error-prone Rolling Circle Amplification) (epRCA) (Fujii et al., Nucleic Acids Res. 32:e145 (2004); 및 Fujii et al., Nat. Protoc. 1:2493-2497 (2006))은, 완전한 환형 플라스미드를 주형으로 사용하고, 마지막 뉴클레오티드 2개에 엑소뉴클레아제 내성 티오포스페이트 결합을 구비한 랜덤 6 mer를 이용하여 플라스미드를 증폭시킨 다음, 세포로 형질전환시키고, 세포내에서 플라스미드는 탠덤 리피트로 다시 환형화되는 것을 제외하고는, epPCR과는 동일한 다수의 요소들을 가지고 있다. Mn²⁺ 농도를 조정하여 돌연변이 비율을 어느 정도 바꿀 수 있다. 이 기법은 간단한 에러-유발성 한단계 방법을 이용하여, 3-4개의 돌연변이/kbp의 풀 카피 플라스미드를 제조한다. 제한 효소에 의한 절단이나 특이적인 프라이머는 필요하지 않는다. 부가적으로, 이 방법은 전형적으로 상업적으로 이용가능한 키트로 이용할 수 있다.

DNA 또는 패밀리 셔플링 (Stemmer, Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751 (1994)); 및 Stemmer, Nature 370:389-391 (1994))은, 전형적으로 Dnase I 또는 Endo V와 같은 뉴클레아제로 2개 이상의 변이체 유전자를 절단하여, DNA 중합효소의 존재 중에서 어닐링 및 연장 사이클에 의해 재조립되는 랜덤 단편 풀을 제조함으로써, 키메라 유전자 라이브러리를 구축하는 과정을 포함한다. 단편들은 서로 촉발하여, 하나의 카피가 다른 카피를 촉발시키는 경우 (주형 스위치) 재조립이 이루어진다. 이러한 방법은 >1 kbp DNA 서열을 이용할 수 있다. 단편 재조립에 의해 만들어지는 돌연변이 재조합 외에도, 이 방법은 에러-유발 PCR와 비슷한 비율로 연장 과정에 점 돌연변이를 도입한다. 이 방법을 이용하여, 유해하고, 랜덤이며, 중성인 돌연변이를 제거할 수 있다.

스테거드 연장(Staggered Extension) (StEP) (Zhao et al., Nat. Biotechnol. 16:258-261 (1998))은, 주형을 프라이밍한 후 변성과 매우 짧은 시간 동안(약 5초)의 어닐링/연장으로 이루어진 2단계 PCR 사이클을 반복하는 과정을 수반한다. 자라나는 단편들은 여러가지 주형에 어닐링하여, 더욱 연장시키고, 전장 서열이 제조될 때까지 반복한다. 주형 스위칭은 대부분 제조되는 단편들이 복수의 모 서열을 가진다는 의미이다. 피델러티가 낮은 중합효소들의 조합 (Taq 및 Mutazyme)은 반대되는 돌연변이 스펙트럼으로 인해 에러-유발 편향성을 낮춘다.

랜덤 프라이밍 재조합 (Random Priming Recombination, RPR)은, 랜덤 서열 프라이머를 사용하여 주형의 여러가지 세그먼트에 대해 상보적인 다수의 짧은 DNA 단편을 제조한다 (Shao et al., Nucleic Acids Res 26:681-683 (1998)). epPCR을 통한 베이스의 잘못된 병합과 잘못된 프라이밍으로 점 돌연변이가 만들어진다. 짧은 DNA 단편들은 상동성을 기반으로 다른 것을 촉발시키며, 재조합하여, 반복적인 써모사이클링에 의해 전장으로 재조립된다. 이 단계 전에 주형이 제거되면 낮은 수준의 모체형 재조합체가 만들어진다. 이 방법은 대부분의 다른 방법들과 같이 개별 특징을 진화시키기 위해 여러번 반복 수행할 수 있다. 이러한 기술은 서열의 편향성을 회피하며, 유전자 길이와는 독립적이며, 적용시 모 DNA가 거의 필요하지 않는다.

헤테로두플렉스 재조합(Heteroduplex Recombination)은, 선형화된 플라스미드 DNA를 사용하여 미스매치 복원에 의해 복원되는 헤테로두플렉스를 형성한다 (Volkov et al, Nucleic Acids Res. 27:e18 (1999); 및 Volkov et al., Methods Enzymol. 328:456-463 (2000)). 미스매치 복원 단계는 어느 수준 이상의 돌연변이를 유발한다. 헤테로두플렉스는 선형 호모두플렉스 보다 훨씬 효율적으로 형질전환된다. 이 방법은 큰 유전자와 전체 오페론에 적합하다.

RACHITT (Random Chimeragenesis on Transient Templates) (Coco et al., Nat. Biotechnol. 19:354-359 (2001))는 Dnase I 단편화와 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 크기 분획화를 이용한다. 상동적인 단편들은 중합효소 부재시 상보적인 ssDNA 스캐폴드와 혼성화한다. 임의의 중복되는 혼성화되지 않은 단편의 말단을 엑소뉴클레아제로 잘라낸다. 단편들 간의 갭을 메우고, 연결하여, 증폭을 방지하기 위해 U를 포함하는 스캐폴드에 혼성화되는 전장의 다양한 가닥들로 구성된 풀을 제조한다. 그런 후, 스캐폴드를 파괴하고, PCR 증폭을 통해 다양한 가닥에 상보적인 새로운 가닥으로 치환한다. 이 방법은 한쪽 모체로부터 유래되는 하나의 가닥 (스캐폴드)을 사용하나 프라이밍 단편은 다른 유전자로부터 유래되며; 이에 반하여 모체 스캐폴드가 선별된다. 따라서, 모체 단편과의 리어닐링은 발생되지 않는다. 중복성 단편은 엑소뉴클레아제로 트리밍한다. 그렇지 않다면, 개념상 DNA 셔플링 및 StEP와 유사하다. 따라서, 자매(sibling)가 없고, 거의 무활성이며, 언셔플링된 모체(unshuffled parental)가 없어야 한다. 이 기법은, 모 유전자가 거의 또는 전형 생성되지 않으며, 표준 DNA 셔플링에 비해 크로스오버가 더 많이 발생한다 점에서 이점을 가진다.

RETT (Recombined Extension on Truncated templates)는 주형의 풀로서 사용되는 단방향성 ssDNA 단편의 존재 중에서 프라이머로부터 한쪽 방향으로 자라는 가닥들의 주형 스위칭을 수반한다 (Lee et al., J. Molec. Catalysis 26:119-129 (2003)). DNA 엔도뉴클레아제는 사용하지 않는다. 단방향성 ssDNA는 랜덤 프라이머를 이용하여 DNA 중합효소에 의해 또는 엑소뉴클레아제를 이용하여 연속 제거에 의해 제조된다. 단방향성 ssDNA는 주형일 뿐이며, 프라이머가 아니다. 랜덤 프라이밍과 엑소뉴클레아제는 DNA 셔플링/RACHITT의 효소적 절단에서 그러한 서열 편향성을 도입하지 않는다. RETT는 연장이 매우 짧은 대신 정상적인 PCR 조건을 이용하기 때문에 StEP 보다 최적화하기 용이할 수 있다. 재조합은 PCR 단계의 요소로서, 즉, 직접적인 셔플링 없이 이루어진다. 이러한 방법은 또한 중단이 없기 때문에 StEP 보다 더 무작위적일 수 있다.

DOGS (Degenerate Oligonucleotide Gene Shuffling)에서는, 축중(degenerate) 프라이머를 사용하여 분자들 간의 재조합을 제어하며 (Bergquist and Gibbs, Methods Mol.Biol 352:191-204 (2007); Bergquist et al., Biomol.Eng 22:63-72 (2005); Gibbs et al., 유전자 271:13-20 (2001)), 이를 이용하여 모 유전자를 재생하는 DNA 셔플링과 같은 다른 방법들의 경향을 제어할 수 있다. 이 방법은 선별된 유전자 세그먼트의 랜덤 돌연변이 유발 (epPCR)과 조합할 수 있다. 이는 모 서열의 재형성(reformation)을 차단하기 위한 좋은 방법일 수 있다. 제조된 세그먼트의 투입 농도를 조정함으로써, 바람직한 벡본으로 편향시킬 수 있다. 이 방법은 제한 효소 절단 없이도 무관련 모체로부터 DNA 셔플링을 허용하며, 랜덤 돌연변이 유발 방법의 한가지 선택이 될 수 있다.

ITCHY(Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes)는 대상 유전자 또는 유전자 단편에서 1 bp가 결손된 조합 라이브러리(combinatorial library)를 만든다 (Ostermeier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562-3567 (1999); 및 Ostermeier et al., Nat. Biotechnol. 17:1205-1209 (1999)). 2종의 유전자들의 조각에서 반대 방향으로 절단을 도입한다. 이를 연결하고, 융합체를 클로닝한다. 이 기법에서는 2종의 모 유전자들 간에 상동성이 필요한 것은 아니다. ITCHY를 DNA 셔플링과 조합하는 경우, 이러한 시스템을 SCRATCHY라고 칭한다 (하기 참조). 이들 2가지 방법의 주된 이점은 모 유전자들 간에 상동성이 필요없다는 것이며; 예로, E. coli와 인간 유전자 간의 기능적 융합체가 ITCHY에 의해 제조되었다. ITCHY 라이브리 제조시, 모든 가능한 크로스오버들이 포착된다.

THIO-ITCHY(Thio-Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzyme)는 포스포티오에이트 dNTA를 이용하여 절단체(truncation)를 제조하는 것을 제외하고는 ITCHY와 유사하다 (Lutz et al., Nucleic Acids Res 29:E16 (2001)). ITCHY와 동류인 THIO-ITCHY는 최적화하기 용이하여, 우수한 재현성 및 조절 가능성을 제공할 수 있다.

SCRATCHY는 재조합 유전자에 대한 ITCHY와 DNA 셔플링 방법 2가지를 조합한 것이다 (Lutz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11248-11253 (2001)). SCRATCHY는 ITCHY와 DNA 셔플링의 최고 특징을 조합한다. 첫째로, ITCHY를 이용하여 DNA-상동성-의존적인 양상으로 유전자 단편들 간의 포괄적인 융합체 단편을 구축한다. 이러한 인위적인 패밀리를 DNA-셔플링 공정으로 수행하여, 크로스오버의 수를 증가시킨다. 최적화에는 컴퓨터를 이용한 예측을 사용할 수 있다. SCRATCHY는 서열 동일성이 80% 미만일 경우 DNA 셔플링 보다 더 효과적이다.

RNDM (Random Drift Mutagenesis)에서는, epPCR로 제작한 후, 유용한 활성을 보유한 것을 스크리닝/선별한다 (Bergquist et al., Biomol. Eng. 22:63-72 (2005)). 그런 후, 이를 DOGS로 수행하여, 복수의 활성 돌연변이들 또는 활성의 돌연변이와 일부 다른 적합한 모체들 간에 융합체와 재조합체를 제조한다. 중성인 돌연변이를 분리하는 것을 높이기 위해 고안되었다: 목적은 유지된 촉매 활성에서 활성이 오리지날 유전자 보다 높은지 낮은지를 스크리닝하기 위함이다. 스크리닝으로 백그라운드에 비해 높은 활성을 검출할 수 있을 경우, 고성능 분석으로 사용가능하다. RNDM은 다양성 구축에 DOGS에 프런트 엔드로서 사용되고 있다. 기법은 셔플링 전에 또는 다른 후속적인 공정 전에 활성에 필요한 요건을 부가하며; 중성 드리프트(neutral drift) 라이브러리는 소규모의 라이브러리에 비해 활성을 높이고/신속하게 개선시키는 것으로 확인된다. epPCR을 이용하는 것으로 공개되어 있지만, 다른 대규모 돌연변이 유발 방법에도 적용할 수 있다.

SeSaM (Sequence Saturation Mutagenesis)은, 1) 포스포티오에이트 뉴클레오티드의 랜덤 병합 및 절단을 이용하여 랜덤 길이의 단편들의 풀을 제조하고, 이러한 풀을 주형으로 사용하여 2) 이노신 등의 "유니버셜" 염기들의 존재 하에 연장시키고, 3) 이노신-함유 상보체의 복제로 랜덤 염기 병합이 이루어지고, 결과적으로 돌연변이가 유발되는, 랜덤 돌연변이 유발 방법이다 (Wong et al., Biotechnol. J. 3:74-82 (2008); Wong et al., Nucleic Acids Res. 32:e26 (2004); 및 Wong et al., Anal. Biochem. 341:187-189 (2005)). 이러한 기법을 이용하여, 2-3일 이내에 대규모의 돌연변이 라이브러리를 간단한 방법으로 제작할 수 있다. 이 기법은 DNA 중합효소의 돌연변이 편향성과 비교하여 방향성이 없다. 이러한 방법의 차이로 인해 이러한 기법이 epPCR을 보완한다 (또는 대체한다).

합성 셔플링(Synthetic Shuffling)에서는, "타겟에서 모든 유전자 다양성"을 코딩하고 셔플링된 후대(shuffled progeny)에 대해 매우 다양한 다양성을 허용할 수 있도록 중첩되는 올리고뉴클레오티드를 설계한다 (Ness et al., Nat. Biotechnol. 20:1251-1255 (2002)). 이 기법에서는, 셔플링할 단편을 설계할 수 있다. 이는 후대에서 이루어질 다양성 증가에 일조한다. 매우 관련성이 높은 서열에서 관찰되는 비율에 가까운 비율로 훨씬 관련성이 먼 서열들을 재조합하기 위한 서열/코돈 편향성을 설계할 수 있다. 부가적으로, 이 기법은 물리적으로 주형 유전자를 보유할 필요가 없다.

뉴클레오티드 교환 및 절개 기법(Nucleotide Exchange and Excision Technology) NexT은, dUTP 병합, 우라실 DNA 글리코실라제 처리 후 피페리딘 처리, 및 엔드포인트 DNA 단편화 수행으로 이루어진 조합을 이용한다 (Muller et al., Nucleic Acids Res. 33:e117 (2005)). 유전자는 프로프리딩(proofreading) 중합효소를 이용하여 내부 PCR 프라이머를 연장시켜 재조립된다. 셔플링 크기는 dUPT::dTTP 비율을 변화시켜 직접 조절가능하다. 이는 우라실의 병합과 절단을 위한 단순한 방법을 이용하는 엔드포인트 반응이다. 8-옥소-구아닌과 같은 다른 뉴클레오티드 유사체를 이 방법으로 사용할 수 있다. 부가적으로, 이 기법은 매우 짧은 단편 (86bp)에서도 잘 작동하며, 에러 발생율이 낮다. 본 기법에 사용되는 DNA의 화학적 절단으로 매우 적은 수의 셔플링되지 않은 클론들이 제조된다.

서열 상동성-독립적인 단백질 재조합(SHIPREC)에서는, 링커를 사용하여 2개의 관련성이 멀거나 관련성이 없는 유전자들이 융합되게 촉진시킨다. 뉴클레아제 처리를 이용하여, 2종의 유전자들 간에 다양한 키메라를 제조함으로써 단일-교차 하이브리드 라이브러리를 제조한다. 이들 융합체는 단일-크로스오버 하이브리드로 구성된 라이브러리를 구축한다 (Sieber et al., Nat. Biotechnol. 19:456-460 (2001)). 이는 제한된 유형의 셔플링을 만들어내며, 돌연변이 유발을 위해서는 개별 공정이 요구된다. 또한, 상동성이 필요하지 않기 때문에, 이러한 기법은 2개의 관련성이 없는 유전자들 각각의 다양한 분획들을 이용하여 키메라 라이브러리를 구축할 수 있다. SHIPREC는 포유류 CP450의 N-말단부에 융합된 박테리아 CP450의 헴-결합 도메인으로 테스트하였으며; 이로써 용해성이 높은 효소에서 포유류 활성이 발휘되었다.

유전자 부위 포화 돌연변이 유발(Gene Site Saturation Mutagenesis, GSSM™)에서, 출발 물질은 삽입체를 포함하는 슈퍼코일형의 dsDNA 플라스미드와 원하는 돌연변이 부위에 대해 축중인 2개의 프라이머를 포함한다 (Kretz et al., Methods Enzymol. 388:3-11 (2004)). 대상 돌연변이를 함유한 프라이머는 DNA 반대 가닥에 있는 동일한 서열에 어닐링한다. 돌연변이는 전형적으로 프라이머의 중간에, 각 말단에서 올바른 뉴클레오티드 서열 약 20개가 떨어진 측면에 위치된다. 프라이머의 서열은 NNN 또는 NNK (코딩) 및 MNN (비코딩) (N = 모두 4, K = G, T, M = A, C)이다. 연장 후, DpnI을 사용하여 dam-메틸화된 DNA를 잘라 야생형 주형을 제거한다. 이 기법은 정해진 위치 (즉, 코돈)에서 모든 가능한 아미노산 치환을 조사한다. 이 기법은 한 부위에 넌센스 코돈이 아닌 모든 가능한 치환이 구축되게 하며, 대부분 가능한 대립유전자들을 거의-동일 내지 동일하게 제공한다. 이러한 기법은 타겟 효소의 구조, 기전 또는 도메인에 대한 기존 지식이 필요없다. 이후 셔플링 또는 유전자 재조립한 후, 이 기법으로 단일 부위 상향-돌연변이들의 모든 가능한 조합을 포함하는 다양한 재조합 라이브러리를 제작한다. 이러한 조합 기법의 유용성은 50개 이상의 여러가지 효소들의 성공적인 진화로 입증되었고, 또한 해당 효소에서 2가지 이상의 특성들로 입증되었다.

조합 카세트 돌연변이 유발(Combinatorial Cassette Mutagenesis, CCM)은 제한된 영역을 다수의 가능한 아미노산 서열 변이로 치환시키는 짧은 올리고뉴클레오티드 카세트를 사용한다 (Reidhaar-Olson et al. Methods Enzymol. 208:564-586 (1991); 및 Reidhaar-Olson et al. Science 241:53-57 (1988)). 2 또는 3곳에서의 동시적인 치환이 이 기법으로 가능하다. 부가적으로, 본 방법은 제한된 범위의 부위에서 대규모의 다수의 가능한 서열 변화를 테스트한다. 이 기법은 람다 억제자 DNA-결합 도메인의 정보 내용을 연구하는데 사용되고 있다.

조합형 다중 카세트 돌연변이 유발(Combinatorial Multiple Cassette Mutagenesis, CMCM)은 기본적으로 CCM과 비슷하지만, 1) 높은 돌연변이 유발율로 epPCR을 이용하여 2) 핫 스팟과 핫 영역을 동정한 다음 3) CMCM으로 연장하여 단백질 서열 스페이스의 한정된 영역을 포괄(cover)하는, 큰 규모의 프로그램의 일부분으로서 사용된다 (Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:3589-3591 (2001)). CCM에서와 같이, 본 방법은 타겟 영역에서 사실상 모든 가능한 변이들을 테스트할 수 있다. 랜덤 돌연변이와 셔플링된 유전자를 구축하기 위한 방법들과 함께 사용하는 경우, 다양한 셔플링된 단백질을 제작하는 탁월한 수단이 된다. 이러한 방식은 효소의 거울상이성질체 선택성을 51배 높이는데 성공하였다.

돌연변이 유발 균주 기법(Mutator Strains technique)의 경우, 조건부 ts 돌연변이 유발 플라스미드는 선택 과정 중에 랜덤 및 천연 돌연변이 빈도를 20에서 4000 X로 증가시키며, 선택 과정이 필요없을 때에는 유해한 돌연변이가 축적되는 것을 차단할 수 있다 (Selifonova et al., Appl. Environ. Microbiol. 67:3645-3649 (2001)). 이 기법은 DNA 중합효소 III의 돌연변이 서브유닛을 코딩하는 플라스미드-유래의 mutD5 유전자를 이용한다. 이 서브유닛은 내인성 DNA 중합효소 III에 결합하며, 플라스미드를 보유한 임의의 균주에서 중합효소 III의 교정력을 약화시킨다. 광범위한 스펙트럼의 염기 치환과 프레임쉬프트 돌연변이가 이루어진다. 효율적으로 사용하기 위해서는, 돌연변이 유발 플라스미드는 바람직한 표현형이 달성되면 제거되어야 하며; 이는 복제 오리진의 온도 민감성 (ts)을 통해 달성되며, 이는 플라스미드를 41℃에서 큐어링(curing)한다. 돌연변이 유발 균주는 꽤 오래 연구되었음에 유념하여야 한다 (참조: Low et al., J. Mol. Biol. 260:359-3680 (1996)). 이러한 기법에서, 자발적인 돌연변이율은 매우 높게 관찰된다. 조건부 특성은 바람직하지 않은 백그라운드 돌연변이를 최소화한다. 이 기법은 돌연변이 유발율을 높이며, 매우 신속하게 바람직한 표현형을 달성하기 위해 후천적인 진화와 결부시킬 수 있다.

LTM (Look-Through Mutagenesis)은 선택된 아미노산의 조합 돌연변이(combinatorial mutation)를 분석 및 최적화하는 다향성 돌연변이를 유발하는 방법이다 (Rajpal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:8466-8471 (2005)). 모든 가능한 아미노산 변화로 각 부위를 포화시키기 보다는, 아미노산 R-기 화합물 범위를 포괄하도록 9개로 이루어진 세트를 선별한다. 부위 당 보다 변화가 적을 수록 복수의 부위에 이러한 타입의 돌연변이 유발이 일어나게 할 수 있다. 낮은 나노몰에서 피코몰의 항체에 대한 결합 친화성 > 800배 증가가 이러한 방법을 통해 달성되었다. 이는 랜덤 조합의 수를 최소화할 수 있는 합리적인 방식이며, 스크리닝할 클론의 수를 크게 낮춤으로써 개선된 형질을 발굴하는 능력을 개선시킬 수 있다. 이는 결합 친화성을 증가시키거나 및/또는 해리를 감소시키기 위해, 항체 조작에 특이적으로 적용되고 있다. 이 기법은 스크리닝 또는 선별과 조합할 수 있다.

유전자 어셈블리는, 한번에 복수의 유전자에 적용할 수 있거나, 또는 단일 유전자의 대규모 키메라(복수의 돌연변이) 라이브러리를 제조할 수 있는 DNA 셔플링 방법이다 (Tunable GeneReassembly™ (TGR™) Technology supplied by Verenium Corporation). 전형적으로, 이 기법에서는 바람직한 개선을 나타내는 대표적인 서열 스페이스를 검색하기 위해 울트라-고처리 스크리닝과 조합하여 사용한다. 이 기법으로 상동성과 무관하게 복수의 유전자를 재조합할 수 있다. 크로스오버의 실제 수와 위치는 생물정보 분석을 통해 설계된 단편을 이용하여 사전-결정할 수 있다. 이 기법은, 사실상 모 유전자의 재형성이 이루어지지 않으며 불활성 유전자의 비율이 낮은, 고도의 다양성을 발생시킨다. GSSM™과 조합시, 매우 다양한 돌연변이들을 대상으로 활성 개선을 테스트할 수 있다. 본 발명은 DNA 셔플링의 "혼성(blending) 및 "미세 조정(fine tuning)"을 허용하며, 예컨대 코돈 용법 (codon usage)을 최적화할 수 있다.

PDA (in Silico Protein Design Automation)는, 특정 폴드를 가지고 있는 구조적으로 정의된 단백질 백본을 고정하고, 폴드와 전체 단백질 에너제틱스를 안정화시킬 수 있는 아미노산 치환에 대해 서열 스페이스를 검색하는 최적화 알고리즘이다 (Hayes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:15926-15931 (2002)). 이 기법에서는 단백질 아미노산 변형에 대한 구조적 허용성을 검색하기 위해 인 실리코 구조-기반의 엔트로피 예측을 이용한다. 통계 역학을 적용하여 각 위치에서 커플링 상호작용을 계산한다. 아미노산 치환에 대한 구조 허용은 커플링 측정치이다. 궁극적으로, 이 기법은 구조적 특징의 보전성을 유지하면서 단백질 특성을 바람직하게 변형시키도록 설계된다. 본 방법은 전산적으로 조사하며, 가능한 최대 수 (10⁵⁰)의 서열 변이체들을 필터링할 수 있다. 테스트할 서열 변이체의 선택은 가장 우호적인 열역학을 기반으로 한 예측과 관련있다. 원칙적으로, 안정성 또는 안정성과 연계되는 특성들만 이러한 기법으로 효과적으로 해결할 수 있다. 이 방법은 특히 면역글로불린 조작에 일부 치료 단백질에 성공적으로 사용되고 있다. 인 실리코 예측은 다수의 잠재적인 변이체를 테스트하는 과정을 상당히 회피한다. 기존의 3차 구조를 기반으로 한 예측은 가정된 구조를 기반으로 한 예측 보다 성공할 가능성이 높다. 이 기법은 쉽게 예측할 수 있으며, 기하급수적인 수 증가로 인해 전적으로 실험 기법으로 불가능한 복수의 동시적인 돌연변이를 타겟화된 방식으로 스크리닝할 수 있다.

ISM (Iterative Saturation Mutagenesis)은, 1) 구조/기능에 대한 지식을 이용하여 효소 개선이 가능한 부위를 선택하는 단계, 2) Stratagene QuikChange (Stratagene; San Diego CA)와 같은 돌연변이 유발 방법을 이용하여 선택한 부위에서의 포화 돌연변이 유발(saturation mutagenesis)을 수행하는 단계, 3) 원하는 특징을 스크리닝/선별하는 단계, 및 4) 개선된 클론(들)을 이용하여 다른 부위에 대해서도 다시 시작하여 원하는 활성이 달성될 때까지 계속 반복하는 단계를 포함한다 (Reetz et al., Nat. Protoc. 2:891-903 (2007); 및 Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 45:7745-7751 (2006)). 이는 입증된 방법이며, 스크리닝/선별을 위해 해당 위치에서 모든 가능한 치환이 이루어지게 한다.

돌연변이 유발을 위한 임의의 전술한 방법들은 단독으로 또는 임의 조합하여 사용할 수 있다. 아울러, 방향성 진화 방법들 중 임의의 한가지 방법 또는 조합을 본원에 기술된 후천적인 진화 기법과 더불어 사용할 수 있다.

본 발명의 다양한 구현예들의 작용에 실질적으로 영향을 미치지 않는 변형들은 본원에 기술된 본 발명의 정의내에 제공되는 것으로 이해된다. 따라서, 아래 실시예들은 예시하기 위한 의도일 뿐 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 I

2-케토글루타레이트 또는 피루베이트로부터 프로필렌을 생산하는 경로

본 실시예에서는 공통 대사산물을 3탄소 알켄, 프로필렌으로 변환하는데 필요한 효소를 가지고 있는 조작된 비천연 미생물을 이용하여 프로필렌을 직접 생산하기 위한 새로운 과정을 기술한다. 프로필렌의 직접 생산은 잘 알려진 에틸렌 생성 효소 (EFE)의 사용을 수반하며, 이 효소는 예를 들면 식물 병원체 슈도모나스 시링가이의 병원형으로부터 분리 및 특정화되었으며, 2-케토글루타레이트를 에틸렌과 이산화탄소로 변환시키는 것으로 확인되었다 (도 1). EFE 효소 또는 EFE의 변이체는 2-케토글루타레이트의 변환과 유사한 방식으로 3-메티-2-케토글루타레이트 또는 4-메틸-2-케토글루타레이트를 프로필렌과 이산화탄소로 변환하는데 사용된다 (도 2의 단계 2, 및 도 3의 단계 F). 따라서, 본 발명자들은 본원에서 이 효소를 프로필렌 생성 효소 (EFE)로 언급한다. 중간산물 3-메틸-2-케토글루타레이트는, 예를 들어 스트렙토마이세스 프루디아(Streptomyces frudiae) 및 기타 유기체에서 유전자 glmT에 의해 코딩되는 효소와 같이 S-아데노실메티오닌-의존적인 메틸트랜스퍼라제 효소를 통해 2-케토글루타레이트로부터 직접 만들 수 있다 (도 2의 단계 1). 다른 예에 있어서, 도 4에 도시된 바와 같이 루신 또는 아세토아세테이트 및 아세틸-CoA로부터 만들 수 있다. 중간산물 4-메틸-2-옥소-글루타레이트는, 피루베이트를 알돌라제-촉매에 의해 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트로 변환시킨 후, 말레이트 데하이드라타제 효소 또는 변이체에 의해 탈수시킨 다음, 에노에이트 리덕타제를 이용하거나 또는 퓨마레이트 리덕타제 효소나 변이체를 이용하여 환원하여, 합성할 수 있다 (도 3의 단계 A-E). 다른 예에 있어서, 도 5에 도시된 라이신으로부터 합성할 수 있다. 도 2의 단계 1과 2, 그리고 도 3의 단계 A-F의 후보 효소를 아래에 제시한다.

도 2의 단계 1에는 2-케토글루타레이트의 메틸화를 촉매하여 3-메틸-2-케토글루타레이트를 합성하는 2-케토글루타레이트 메틸트랜스퍼라제를 표시한다. 이러한 활성은 스트렙토마이세스 코엘리콜러(Streptomyces coelicolor)의 glmT, 스트렙토마이세스 로세오스포루스(Streptomyces roseosporus)의 dptI, 그리고 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae)의 lptI에 의해 코딩되는 효소를 이용하여 수득할 수 있다 (Mahlert et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (39), 12011-12018).

유전자	유전자은행 등재번호	GI 번호	유기체
glmT	NP_627429.1	21221650	스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2)
dptI	ZP_04706744.1	239986080	스트렙토마이세스 로세오스포루스 NRRL 11379
lptI	AAZ23087.1	71068232	스트렙토마이세스 프라디애

몇가지 후보 유전자들은 3-메틸-2-케토글루타레이트 (단계 2, 도 2) 또는 4-메틸-2-케토글루타레이트 (단계 F, 도 3)에 대해 PFE 활성을 천연적으로 나타낼 것으로 생각된다. 그렇지 않다면, 이를 조작하여 기질에 대해 PFE 활성을 나타내게 할 수 있다. 후보 유전자로는 슈도모나스 시링가이와 랄스토니아 솔라나세이룸의 다양한 균주들 유래의 EFE를 포함한다 (Fukuda et al., Biochem Biophys Res Comm, 1992, 188 (2), 826-832; Tao et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 80(4):573-8; Chen et al., Int J of Biol Sci, 2010, 6(1):96-106; Weingart et al., Phytopathology, 1999, 89:360-365).

유전자	유전자은행 등재 번호	GI 번호	유기체
Efe	BAA02477.1	216878	슈도모나스 시링가이 pv. 파세올리콜러 PK2
Efe	AAD16443.1	4323603	슈도모나스 시링가이 pv. 피시
Efe	Q7BS32.1	50897474	슈도모나스 시링가이 pv. 글리시아
Efe	CAD18680.1	17432003	랄스토니아 솔라나세이룸

도 3의 단계 A에는, 피루베이트 2 분자를 축합하여 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트를 제조하는 과정을 촉매하는, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제를 표시한다. 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제를 촉매하는 효소를 코딩하는 하기 유기체 유래 유전자: 슈도모나스 오크라시아(Pseudomonas ochraceae) NGJ1 (Maruyama et al., Biosci Biotechnol Biochem, 2001, 65(12):2701-2709), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) (Dagley, Methods Enzymol, 1982, 90:272-276), 및 슈도모나스 테스토스테로니(Pseudomonas testosteroni)(또는 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni))(Providenti et al., Microbiology, 2001 147 (Pt 8), 2157-2167), 및 아라키스 히포게이(Arachis hypogaea).

유전자	유전자은행 등재번호	GI 번호	유기체
proA	BAB21456.	13094205	슈도모나스 오크라시아 NGJ1
Pput_1361	ABQ77519.1	148510659	슈도모나스 푸티다 F1
Pput_3204	ABQ79330.1	148512470	슈도모나스 푸티다 F1
CtCNB1_2744	YP_003278786.1	264678879	코마모나스 테스토스테로니

도 3의 단계 D에는, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트를 탈수하여 4-메틸-2-케토글루타코네이트를 제조하는 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 I을 표시한다. 도 3의 단계 B에는 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트를 탈수하여 4-메틸렌-2-케토글루타레이트를 제조하는 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II를 표시한다. 다양한 유형의 데하이드라타제를 이용하여 이러한 변환을 촉매할 수 있다. 구체적인 예는 아래에 나타내며, EC 4.2.1에 속하는 몇가지 추가적인 데하이드라타제 효소를 대안적으로 이용할 수 있다.

예를 들어, 유사 변환을 촉매하는 효소는 시트라말레이트 하이드로리아제 (EC 4.2.1.34)이며, 이 효소는 2-메틸말레이트를 메사코네이트로 본래 탈수시키는 효소이다. 이 효소는 2-옥소부타노에이트로의 피루베이트 경로 측면에서 메타노칼도코커스 야나키이(Methanocaldococcus jannaschii)에서 연구되었으며, 기질 특이성이 넓은 것으로 확인되었다 (Drevland et al., J. Bacteriol. 189:4391-4400 (2007)). 이 효소 활성은 또한 클로스트리듐 테타노모라품(Clostridium tetanomorphum,), 모르가넬라 모르가니이(Morganella morganii), 시트로박터 아말로나티쿠스(Citrobacter amalonaticus)에서 검출되었으며, 글루타메이트 분해에 참여하는 것으로 생각된다 (Kato and Asano Arch. Microbiol. 168:457-463 (1997)). 메타노칼도코커스 야나키이(M. jannaschii) 단백질 서열은 이들 유기체들의 유전자에 대해 유의한 수준의 상동성을 가지고 있지 않는다. 이 유전자와 관련된 유전자은행 정보를 아래에 요약한다.

유전자	유전자은행 등재번호	GI 번호	유기체
leuD	3122345	Q58673.1	메타노칼도코커스 야나키이

다른 유용한 효소는 퓨마라제하고도 하는 퓨마레이트 하이드라타제 (EC 4.2.1.2)이며, 이 효소는 퓨마레이트에서 말레이트로의 가역적인 수화를 촉매한다. E. coli의 3종의 퓨마라제, fumA, fumB 및 fumC는 여러가지 산소 이용 조건에서 조절된다. FumB는 산소에 민감하며, 혐기 조건에서 활성을 나타낸다. FumA는 미세혐기 조건에서 활성을 나타내며, FumC는 혐기 증식 조건에서 활성을 나타낸다 (Tseng et al., J. Bacteriol. 183:461-467 (2001); Woods et al., Biochim. Biophys. Acta 954:14-26 (1988); Guest et al., J. Gen. Microbiol. 131:2971-2984 (1985)). 사카로마이세스 세레비지애는 퓨마라제 코딩 유전자인 FUM1 한 카피를 포함하고 있으며, 이의 산물은 세포질과 미토콘드리아 양쪽에 위치한다 (Sass et al., J. Biol. Chem. 278:45109-45116 (2003)). 추가적인 퓨마라제 효소는 캄필로박터 제주니 (Smith et al., Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31:961-975 (1999)), 서무스 서모필러스 (Mizobata et al., Arch. Biochem. Biophys. 355:49-55 (1998)) 및 라투스 노르베기쿠스 (Kobayashi et al., J. Biochem. 89:1923-1931 (1981))에서도 발견되었다. 서열 상동성이 높은 유사 효소로는 아라비돕시스 탈리아나의 fum1와 코리네박테리움 글루타미컴의 fumC를 포함한다. 펠로토마쿨럼 서모프로피오늄(Pelotomaculum thermopropionicum) 유래의 MmcBC 퓨마라제는 2개의 서브유닛을 가진 다른 유형의 퓨마라제이다 (Shimoyama et al., FEMS Microbiol. Lett. 270:207-213 (2007)). 이들 유전자와 관련된 유전자은행 정보를 하기 표에 요약 개시한다.

유전자	유전자은행 등재번호	GI 번호	유기체
fumA	NP_416129.1	16129570	에스케리티아 콜라이
fumB	NP_418546.1	16131948	에스케리티아 콜라이
fumC	NP_416128.1	16129569	에스케리티아 콜라이
FUM1	NP_015061	6324993	사카로마이세스 세레비지애
fumC	Q8NRN8.1	39931596	코리네박테리움 글루타미컴
fumC	O69294.1	9789756	캄필로박터 제주니
fumC	P84127	75427690	서무스 서모필러스
fumH	P14408.1	120605	라투스 노르베기쿠스
MmcB	YP_001211906	147677691	펠로토마쿨럼 서모프로피오늄
MmcC	YP_001211907	147677692	펠로토마쿨럼 서모프로피오늄

효소 OHED 하이드라타제는 4-하이드록시페닐아세트산 분해에 참여하며, 조인자로서 마그네슘을 이용하여 2-옥소-헵트-4-엔-1,7-디오에이트 (OHED)를 2-옥소-4-하이드록시-헵타-1,7-디오에이트 (HODH)로 변환한다 (Burks et al., J. Am. Chem. Soc.120 (1998). OHED 하이드라타제 효소는 E. coli C (Izumi et la., J. Mol. Biol. 370:899-911 (2007); Roper et al., Gene 156:47-51 (1995))와 E. coli W (Prieto et al., J. Bacteriol. 178:111-120 (1996))에서 동정 및 특정화되었다. 서열 비교를 통해 박테리아, 식물 및 동물 범주에서의 상동성이 확인되었다. 그중에서도 클렙시엘라 뉴모니아(91% 상동성, 값 = 2e-138) 및 살모넬라 엔테리카 (91% 상동성, 값 = 4e-138)에 서열 유사성이 높은 효소가 함유되어 있다. 이들 유전자와 관련된 유전자은행 정보를 하기 표에 요약 개시한다.

유전자	유전자은행 등재번호	GI 번호	유기체
hpcG	CAA57202.1	556840	에스케리치아 콜라이 C
hpaH	CAA86044.1	757830	에스케리치아 콜라이 W
hpaH	ABR80130.1	150958100	클렙시엘라 뉴모니아
Sari_01896	ABX21779.1	160865156	살모넬라 엔테리카

도 3의 단계 D와 유사한 탈수를 촉매하는 또 다른 효소는 유박테리움 바케리(Eubacterium barkeri)의 2-(하이드록시메틸)글루타레이트 데하이드라타제이다. 이 효소는 니코티네이트 이화작용에 대해 연구되었고, hmd3에 코딩되어 있다 (Alhapel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:12341-12346 (2006)). 서열 상동성이 높은 유사 효소들은 박테리오데스 카필로수스(Bacteroides capillosus)와 안에어로트룬쿠스 콜리호미니스(Anaerotruncus colihominis)에서 발견되었다. 이들 효소는 또한 [4Fe-4S]-함유 박테리아 세린 데하이드라타제, 예로 tdcG, sdhB 및 sdaA에 의해 코딩되는 E. coli 효소의 알파- 및 베타-서브유닛과 상동하다. 이들 유전자와 관련된 유전자은행 정보를 하기 표에 요약 개시한다.

유전자	유전자은행 등재번호	GI 번호	유기체
hmd	ABC88407.1	86278275	유박테리움 바케리
BACCAP_02294	ZP_02036683.1	154498305	박테리오데스 카필로수스 ATCC 29799
ANACOL_02527	ZP_02443222.1	167771169	안에어로트룬쿠스 콜리호미니스 DSM 17241

도 3의 단계 B 또는 단계 D의 데하이드라타제 효소를 코딩할 수 있는 다른 유전자는 4-옥살로메사코네이트 하이드라타제 (또는 4-카르복시-4-하이드록시-2-케토아디페이트 데하이드라타제)이다. 효소의 예는 코마모나스 테스토스테로니(Comamonas testosteroni) (Providenti et al., Microbiology, 2001, 147(Pt 8);2157-67), 스핑고모나스(Sphingomonas) sp. SYK6 (Hara, et al., J Bacteriol, 2000, 182(24);6950-7), 및 슈도모나스 오크라시이(Pseudomonas ochraceae) NGJ1 (Maruyama et al., Biosci Biotechnol Biochem, 2001 65(12);2701-9; Maruyama et al., Biosci Biotechnol Biochem, 2004, 68(7);1434-41)에서 발견할 수 있다.

유전자	유전자은행 등재번호	GI 번호	유기체
pmdE	YP_003278787.1	264678880	코마모나스 테스토스테로니
ligJ	BAA97116.1	8777583	스핑고모나스 sp. SYK6
proH	BAB21455.1	12539404	슈도모나스 오크라시이 NGJ1

도 3의 단계 C에서는 　4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제를 환원하여 4-메틸-2-케토글루타레이트를 제조하는 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제를 표시한다. 도 3의 단계 E는 4-메틸-2-케토글루타코네이트를 환원하여 4-메틸-2-케토글루타레이트를 제조하는 4-메틸-2-케토글루타코네이트 리덕타제를 표시한다. 다양한 유형의 에노에이트 리덕타제를 이용하여 이의 변환을 촉매할 수 있다. 구체적인 예는 아래에 제공되며, 몇가지 추가적인 에노네이트 리덕타제 EC 1.3.1 효소를 대안적으로 이용할 수 있다.

2-에노에이트 옥시도리덕타제 효소는 NAD(P)H-의존적인 환원과 매우 다양한 α,β-불포화 카르복시산과 알데하이드의 산화를 촉매하는 것으로 알려져 있다 (Rohdich et al., J. Biol. Chem. 276:5779-5787 (2001)). 최근, 클로스트리듐 블루베리(C. kluyveri)에 대한 공개된 게놈 서열에서, 에노에이트 리덕타제 코딩 서열 9개가 보고되었고, 이들 중 하나가 특정화되었다 (참조: dorf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105:2128-2133 (2008)). C. 티로부티리컴(C. tyrobutyricum)과 M. 서모아세티컴(M. thermoaceticum) 유래의 enr 유전자들이 클로닝 및 서열 분석되었으며, 서로 간의 동일성은 59%이다. 또한, 전자 유전자는 C. 클루이베리에서 특정화된 유전자와 약 75%의 유사성을 가지는 것으로 알려져 있다 (Giesel and Simon, Arch. Microbiol. 135:51-57 (1983)). 이들 서열을 기반으로 enr이 E. coli (fadH)에서의 디에노일 CoA 리덕타제와 매우 유사하다는 결과가 보고된 바 있다 (Rohdich et al., J. Biol. Chem. 276:5779-5787 (2001)). C. 서모아세티컴 enr 유전자 역시 E. coli에서 촉매적으로 활성인 형태로 발현된 바 있다 (Rohdich et al., 상기 참조). 이들 유전자와 관련된 유전자은행 정보를 하기 표에 요약 개시한다.

유전자	유전자은행 등재번호	GI 번호	유기체
enr	ACA54153.1	169405742	클로스트리듐 보툴리눔 A3 str
enr	CAA71086.1	2765041	클로스트리듐 티로부티리컴
enr	CAA76083.1	3402834	클로스트리듐 클루이베리
enr	YP_430895.1	83590886	모렐라 서모아세티카
fadH	NP_417552.1	16130976	에스케리치아 콜라이

MAR은 2-말레일아세테이트 (cis-4-옥소헥스-2-에네디오에이트)를 3-옥소아디페이트로 가역적으로 환원시키는 과정을 촉매하는 2-에노에이트 옥시도리덕타제이다 (도 2, 단계 O). MAR 효소는 본래 방향족 분해 경로에 참여한다 (Camara et al., J. Bacteriol. 191:4905-4915 (2009); Huang et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:7238-7245 (2006); Kaschabek and Reineke, J. Bacteriol. 177:320-325 (1995); Kaschabek and Reineke, J. Bacteriol. 175:6075-6081 (1993)). 효소의 활성은 확인되었고, 슈도모나스 sp. B13 균주에서 특정화되었으며 (Kaschabek and Reineke, (1995) supra; Kaschabek and Reineke, (1993) supra), 코딩 유전자이 클로닝 및 서열분석되었다 (Kasberg et al., J. Bacteriol. 179:3801-3803 (1997)). 추가적인 MAR 유전자로는 슈도모나스 sp. 균주 B13의 clcE 유전자 (Kasberg et al., supra), 로도코커스 오팍쿠스의 macA 유전자 (Seibert et al., J. Bacteriol.175:6745-6754 (1993)), 랄스토니아 유트로파(또한 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator)라고도 함)의 macA 유전자 (Seibert et al., Microbiology 150:463-472 (2004)), 랄스토니아 유트로파의 tfdFII (Seibert et al., (1993) supra) 및 코리네박테리움 글루타미컴의 NCgl1112 (Huang et al., Appl. Environ Microbiol. 72:7238-7245 (2006))가 있다. 슈도모나스 라이네카이 MT1의 ccaD에 의해 코딩되는 MAR이 최근 동정되었으며, 이의 뉴클레오티드 서열은 DBJ/EMBL 유전자은행 등재번호 EF159980 (Camara et al., J. Bacteriol. 191:4905-4915 (2009)로 입수가능하다. 이들 유전자와 관련된 유전자은행 정보를 하기 표에 요약 개시한다.

유전자	유전자은행 등재번호	GI 번호	유기체
clcE	O30847.1	3913241	슈도모나스 sp. strain B13
macA	O84992.1	7387876	로도코커스 오팍쿠스
macA	AAD55886	5916089	쿠프리아비두스 네카터
tfdFII	AC44727.1	1747424	랄스토니아 유트로파 JMP134
NCgl1112	NP_600385	19552383	코리네박테리움 글루타미컴
ccaD	EF159980.1	134133935	슈도모나스 라이네카이 MT1

퓨마레이트 리덕타제는 퓨마레이트의 숙시네이트로의 환원을 촉매한다. E. coli의 퓨마레이트 리덕타제는 frdABCD에 의해 코딩되는 4개의 서브유닛으로 구성되며, 막 결합형이며 혐기 조건에서 활성을 나타낸다. 이들 반응의 전자 공여체는 메나퀴논이며, 이 반응에서 발생되는 2개의 양성자는 양성자 농도 구배에 관여하지 않는다 (Iverson et al., Science 284:1961-1966 (1999)). 효모 게놈은 FRDS1에 의해 코딩되는 2개의 용해성 퓨마레이트 리덕타제 이소자임 FRDS1 (Enomoto et al., DNA Res. 3:263-267 (1996)) 및 FRDS2 (Muratsubaki et al., Arch. Biochem. Biophys. 352:175-181 (1998))을 코딩하고 있는데, 이는 각각 세포질과 프로미토콘드리아에 위치하며, 글루코스에서의 혐기 증식시 이용된다 (Arikawa et al., FEMS Microbiol. Lett. 165:111-116 (1998)).

단백질	유전자은행 등재번호	GI 번호	유기체
FRDS1	P32614	418423	사카로마이세스 세레비지애
FRDS2	NP_012585	6322511	사카로마이세스 세레비지애
frdA	NP_418578.1	16131979	에스케리치아 콜라이
frdB	NP_418577.1	16131978	에스케리치아 콜라이
frdC	NP_418576.1	16131977	에스케리치아 콜라이
frdD	NP_418475.1	16131877	에스케리치아 콜라이

본 명세서에서는 전체에 걸쳐 다양한 문헌들을 참조한다. 유전자은행 및 GI 번호 공개물을 비롯하여, 이들 공개 문헌의 내용은 그 전체가 본 발명이 속하는 기술 분야의 상황을 보다 충분히 설명하기 위해 본 명세서에 원용에 의해 포함된다. 본 발명은 전술한 실시예를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 사상으로부터 이탈되지 않는 범위내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (15)

1. 프로필렌을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함하는 비천연 미생물 유기체로서,
   상기 프로필렌 경로가 프로필렌 생성 효소(propylene forming enzyme) 또는 2-케토글루타레이트 메틸트랜스퍼라제(2-ketoglutarate methyltransferase)를 포함하는, 비천연 미생물 유기체.
2. 제1항에 있어서, 상기 미생물 유기체는 프로필렌 경로 효소를 각각 코딩하는 2개의 외인성 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 비천연 미생물 유기체.
3. 제1항에 있어서, 상기 프로필렌 경로는 2-케토글루타레이트 메틸트랜스퍼라제와 프로필렌 생성 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 비천연 미생물 유기체.
4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 핵산이 이종 핵산인 것을 특징으로 하는 비천연 미생물 유기체.
5. 제1항에 있어서, 상기 비천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지에 존재하는 것을 특징으로 하는 비천연 미생물 유기체.
6. 프로필렌을 생산하기에 충분한 양으로 발현되는 프로필렌 경로 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 핵산을 포함하는 프로필렌 경로를 구비한 미생물 유기체를 포함하는 비천연 미생물 유기체로서,
   상기 프로필렌 경로가 프로필렌 생성 효소, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제(4-hydroxy-4-methyl-2-ketoglutarate aldolase), 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II(4-hydroxy-4-methyl-2-ketoglutarate dehydratase II), 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 I(4-hydroxy-4-methyl-2-ketoglutarate dehydratase I), 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제(4-methylene-2-ketoglutarate reductase), 또는 4-메틸-2-케토글루타코네이트 리덕타제(4-methyl-2-ketoglutaconate reductase)를 포함하는, 비천연 미생물 유기체.
7. 제6항에 있어서, 상기 미생물 유기체는 프로필렌 경로 효소를 각각 코딩하는 2개의 외인성 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 비천연 미생물 유기체.
8. 제6항에 있어서, 상기 미생물 유기체는 프로필렌 경로 효소를 각각 코딩하는 3개의 외인성 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 비천연 미생물 유기체.
9. 제6항에 있어서, 상기 미생물 유기체는 프로필렌 경로 효소를 각각 코딩하는 4개의 외인성 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 비천연 미생물 유기체.
10. 제6항에 있어서, 상기 프로필렌 경로는 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 II, 4-메틸렌-2-케토글루타레이트 리덕타제 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 비천연 미생물 유기체.
11. 제6항에 있어서, 상기 프로필렌 경로는 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 알돌라제, 4-하이드록시-4-메틸-2-케토글루타레이트 데하이드라타제 I, 4-메틸-2-케토글루타코네이트 리덕타제 및 프로필렌 생성 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 비천연 미생물 유기체.
12. 제6항에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 핵산이 이종 핵산인 것을 특징으로 하는 비천연 미생물 유기체.
13. 제6항에 있어서, 상기 비천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지에 존재하는 것을 특징으로 하는 비천연 미생물 유기체.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한항에 따른 비천연 미생물 유기체를 프로필렌을 생산하기 위한 조건과 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 프로필렌의 생산 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 비천연 미생물 유기체가 실질적으로 혐기성인 배양 배지에 존재하는 것을 특징으로 하는 생산 방법.

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