TW201142034A - Microorganisms and methods for the biosynthesis of propylene - Google Patents

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201142034 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大體而言係關於生物合成方法，且更特定言之關 於具有丙烯生物合成能力之生物體。 本申請案主張2010年4月30曰申請之美國臨時申請案第 61/330,258號之優先權益，該案之全部内容以引用方式併 入本文中。 【先前技術】 丙烯主要以石油精煉及藉由烴原料蒸汽裂解製造乙稀的 副產物之形式製得。藉由自獲自裂解及其他精煉法之烴混 合物分餾來分離丙烯。典型烴原料來自非再生性化石燃 料，諸如來自石油、天然氣且在小得多的程度上來自煤。 每年製造750億磅以上丙烯，使其成為僅次於乙烯所製得 之第二大基於化石之化學物質。丙烯為基礎化學物質，可 轉化為各種聚合物、聚合物中間物及化學物質。化學級及 聚合物級丙烯之一些最常見衍生物為聚丙烯、丙烯酸、丁 醇、丁二醇、丙烯腈、環氧丙烷、異丙醇及異丙苯。丙烯 衍生物聚丙烯在製造塑膠（諸如射出成型塑膠）及纖維（諸如 地毯）中之使用佔美國對此衍生物之消耗的三分之一以 上。丙烯亦用於製造合成橡膠且用作氣溶膠中之推進劑或 組分。 自替代性及/或可再生原料製造丙烯之能力將代表探索 更多可持續化學製造方法中之主要進步。一種可再生地製 造丙稀之可能方式包括使糖或其他原料_以製得醇類2- 155953.doc 201142034 、 丙醇（異丙醇）或卜丙醇’其在包括基於金屬之催化的第二 步驟中經分離、純化’接著脫水得到丙烯。自可再生原料 直接醱酵製得丙烯將消除脫水需要。在醱酵製造期間，丙 烯氣體將自醱酵槽連續逸出’其可輕易收集及冷凝。開發 一種醱酵製造方法亦將消除對基於化石之丙烯的需要且將 使得成本、能量及有害廢料及排氣相對於石化來源丙稀有 實質節省。 自廉價可再生原料（諸如源自生物質來源之糖蜜、甘嚴 汁及糖’生物質來源包括農業廢料及廢材）以及c丨原料（諸 如合成氣及二氧化碳）有效產生丙稀之微生物體及方法係 描述於本文中且包括相關優勢。 【發明内容】 本發明提供含有丙烯路徑之非天然存在之微生物體，該 等丙烯路徑包含至少一種編碼足量表現以產生丙烯之丙烯 路徑酶的外源核酸《本發明另外提供使用此等微生物體、 藉由在產生丙烯之條件下且歷時足以產生丙烯之時間段培 養如本文所述的含有丙烯路徑之非天然存在之微生物體來 產生丙稀的方法。 【實施方式】 本發明係關於設計及製造具有丙烯生物合成產生能力之 細胞及生物體。特定言之，本發明係關於設計能夠藉由引 入一或多種編碼丙烯路徑酶之核酸來產生丙烯的微生物 體。 在一個實施例中，本發明利用大腸桿菌代謝 155953.doc 201142034 co" metabolism)之電腦模擬化學計量模型“乃 smco stoichiometric model)，其鑑別丙烯生物合成製造之 代謝設計。本文所述之結果表明可設計及重組工程改造代 謝路徑以達成在大腸桿菌及其他細胞或生物體中之丙稀生 物合成。例如供電腦模擬設計之丙烯生物合成製造可藉由 構造具有經設計的代謝基因型之細胞株來證實。此等代謝 方面經工程改造之細胞或生物體亦可經受適應性進化以進 一步加強丙烯生物合成，包括在接近理論最大生長之條件 下。 在某些實施例中，經設計細胞株之丙烯生物合成特徵使 其遺傳學上穩定且尤其適用於連續生物過程。如下鑑別個 別細胞株設計策略：將不同非原生或異源反應能力併入大 腸桿菌或其他宿主生物體中，從而自2_酮戊二酸或丙綱酸 產生製造丙烯之代謝路徑。鑑別電腦模擬代謝設計，使得 在微生物中自此等受質或代謝中間物中每—者生物合成丙 烯。 可藉由遺傳學上工程改造任何預測之代謝改變將經由平 台之計算組件鑑別的細胞株投人實際生產中使得生物合 成製造丙烯或其他中間物及/或下游產品。在又一實施例 中’顯示生物合成製造此等化合物之細胞株可進一步經受 適應性進化以進一步加強產物& >刀5$座物生物合成。適應性進化後之 產物生物合成產率的量亦可葬士多^ — J J藉由系統之計算組件預測。

葡萄糖之最大理論丙烯產率A w 厘午马 133 mol/mol(0.311 g/g): 3 C6H12〇6=4 C3H6+6 c〇2+6 H20 155953.doc 201142034 假°又可自葡萄糖形成2個丙酮酸分子或1個(^酮戊二酸分 子’圖2及3中呈現之路徑達成每莫耳所用葡萄糖1莫耳丙 烯之產率。若細胞能夠經由碳固定機制（諸如還原性（或逆 向）TCA循環或Wood_Ljungdahl路徑，其補充有丙酮酸··鐵 氧化還原蛋白氧化還原酶）固定一些自所描繪路徑或自產 生酮戊二酸釋放之c〇2，則將產物產率提高至133 mol/mol為可能的。 如本文所用，術語「非天然存在」當參考本發明之微生 物體或微生物使用時意欲意謂微生物體具有至少一種並不 常見於參考物種之天然存在之細胞株(包括參考物種之野 生型：胞株)中的基因改變。基因改變包括例如引入編碼 代謝^肽之可表現核酸的修飾、其他核酸添加、核酸缺失 及/或微生物體遺傳物質之其他功能性破壞。此等修飾包 括例如參考物種之異源、同源或異源與同源多狀之編碼區 力月b片·^又。其他修飾包括例如非編碼調節區，其中修 飾改變基因或操縱子之表現。例示性代謝多狀在丙稀生物 合成路徑内包括酶或蛋白質。 代謝修飾係指使得自其天然存在之狀態改變的生化反 應因此’非天然存在之微生物可具有對編碼代謝多肽或 其功牝片奴之核酸的基因修飾。本文揭示例示性代謝修 飾。 文所用，術語具有分子式C3H0及分子質量42 g/m〇l之「丙烯（pr〇pylene)」（參看圖2及3)_Ac名稱丙 (Pr〇pene))可始終與1·丙烯u-pr〇pene)、丨·丙 155953.doc 201142034 (1 propylene)、甲基乙烯（咖化咖加叫及曱基乙烯 (methylethylene)互換使用。在室溫下，丙稀為具有微弱但 令人討厭的氣味之無色氣體。丙稀由於其較大尺寸而具有 同於乙稀之後度及彿點，然而其海點稍低於丙烧，外加更 具揮發性。丙烯無強極性鍵，然而該分子因其減小之對稱 陡而具有小偶極矩。丙烯亦為環丙院之結構異構體。 如本文所用’術語「分離」當參考微生物體使用時意欲 意谓生物體實質上不含如參考微生物體在自然界中所見之 至少一種組分。該術語包括自如天然環境中所見之一些或 所有組分移出微生物體。該術語亦包括自如非天然存在之 環境中所見之-些或所有組分移出微生物體。因此，因為 見於自然界中或如生長、健存或存在於非天然存在之環境 中’所以分離之微生物體係與其他物質部分或完全分離。 分離之微生物體的特定實例包括部分純微生物、實質上純 微生物及於非天然存在之培養基中培養之微生物。 如本文所用，術語「微生物的」、「微生物體」或「微生 物」意欲意謂以包括於古細g(arehaea)、細菌或真核之域 内的微觀細胞形式存在之任何生物體。因此，該術語意欲 ' ㉟蓋具有微觀尺寸之原核或真核細胞或生物體且包括所有 ； ⑯種之細菌、古細菌及真細菌’以及真核微生物，諸如酵 母及真i。該術語亦包括任何物種之細胞培養#勿，其可經 培養來產生生化物質。 如本文所用，術語具有分子式及分子質量 398.44咖〇1之「S_腺普甲硫胺酸」或「sam」（iupAc名 155953.doc 201142034 稱：（2S)-2-胺基-4-[[(2S，3S，4R，5R)-5-(6-胺基嘌呤-9-基）_3,4-二經基氧雜環戊_2_基]甲基-甲基二氫硫基]丁酸酯） 為涉及甲基轉移之共受質。轉甲基、轉硫基及胺基丙基化 為使用SAM之一些代謝路徑。連接至saM_之曱硫胺酸硫 原子之甲基（CH3)具有化學反應性。此使得此基團供給轉 甲基反應中之受者受質。 如本文所用，術語「C〇A」或「輔酶A」意欲意謂有機 輔因子或輔基（酶之非蛋白質部分），其存在為形成活性酶 系統之許多酶（去辅基酶）之活性所需。某些縮合酶中之輔 酶A功旎係在乙醯基或其他醯基轉移中及在脂肪酸合成及 氧化、丙酮酸氧化中及在其他乙醯化中起作用。 如本文所用，術語「實質上缺氧（anaer〇bic)」當參考培 養或生長條件使用時意欲意謂氧量小於液體培養基中溶解 氧飽和度之約10% ^該術語亦意欲包括維持具有小於約1% 氧氣之氛圍的液體或固體培養基密封腔室。 外源」¥在本文中使用時意欲意謂將參考分子或參考 活性引入宿主微生物體中 分子可如下引入：例如將編碼 核酸引入宿主遺傳物質巾，諸如整合於宿主染色體中或作 為非染色體遺傳物質’諸如質體H該術語#參考編 碼核酸之表現使用時係指將編碼核酸以可表現形式引入微 生物體中。當參考生物合成活性使用日寺，該術語：指引入 宿主參考生物體中之活性。來源可為例如在引入宿主微生 物體中之後表現參考活性之同源或異源蝙碼核酸。因此， 術語「内源」係、指存在於宿主中之參考分子或活性。類似 155953.doc 201142034 地’該術語當參考編碼核酸之表現使用日寺係指微生物體内 所含之編碼核酸的表現。術語「異源」係指源自除參考物 種以外之來源的分子或活性，而「同源」係指源自宿主微 生物體之^子或活性。因此’本發明之編碼核酸的外源表 現可利用異源或同源編碼核酸中任一者或兩者。 應瞭解，虽種以上外源核酸包括於微生物體中時，該 一種以上外源核酸係指如以上討論之參考編碼核酸或生物 合成活性。應進一步瞭解’如本文所揭示，可將此一種以 上外源核酸引入宿主微生物體中於個別核酸分子、多順反 子核駄刀子或其組合上，且仍視為一種以上外源核酸。舉 幻而CT如本文所揭示，微生物體可經工程改造以表現兩 種或兩種以上編碼所需路徑酶或蛋白質之外源核酸。在將 兩種編碼所需活性之外源核酸引入宿主微生物體中之情況 :’應瞭解該兩種外源核酸可以單一核酸形式引入例如於 單質體、個別質體上，可整合至宿主染色體中於單一位 點或多個位點處，且仍視為兩種外源核酸。類似地，應瞭 。將兩種以上外源核酸以任何所需組合引入宿主生物體 中例如於單一質體上、於個別質體上，可整合至宿主染 色體中於單一位點或多個位點處，且仍視為兩種或兩種以 卜源核I ’例如三種外源核酸。因此，參考外源核酸或 物η成活性之數目係指編碼核酸數目或生物合成活性數 目 5 Τ- . 非引入宿主生物體中之個別核酸數目。 本I明之非天然存在之微生物體可含有穩定基因改變， _甘.j争才t -.p 其 9 培養大於五代而不損失改變之微生物。一般而 155953.doc 201142034 言’穩定基因改變包括存留大於10代之修飾，特定言之穩 定修飾將存留大於約25代，且更特定言之穩定基因修飾將 大於50代，包括無限。 熟習此項技術者將瞭解，包括本文例示之代謝修飾的基 因改變係參考適合宿主生物體（諸如大腸桿菌）及其相應代 謝反應或所需遺傳物質（諸如所需代謝路徑之基因）之適合 來源生物體來描述。然而，考慮到多種生物體之完整基因 組定序及基因組學領域中之高技術程度，熟習此項技術者 將輕易能夠將本文提供之教示及指導應用於基本上所有其 他生物體。舉例而言’本文例示之大腸桿菌代謝改變可藉 由併有來自除參考物種以外之物種的相同或相似編碼核酸 輕易應用於其他物種。此等基因改變大體上包括例如物種 同系物之基因改變，及尤其直系同源物、旁系同源物或非 直系同源基因置換。 直系同源物為藉由垂直譜系傳遞（vertical descent)相關 之基因，且在不同生物體中負責實質上相同或一致功能。 舉例而言，可將小鼠環氧化物水解酶與人類環氧化物水解 酶視作環氧化物水解之生物功能的直系同源物。基因當例 如共享足量序列相似性以表明同源時藉由垂直譜系傳遞相 關’或藉由自共同祖先進化而相關。基因若共享三維結構 但未必共享足量序列相似性以表明其已由共同祖先進化至 不可鑑別一級序列相似性之程度，則亦可視作直系同源 物。直系同源基因可編碼具有約25%至1 〇〇〇/。胺基酸序列一 致性之序列相似性的蛋白質。編碼共享小於25%之胺基酸 155953.doc 201142034 相似性之蛋白質的基因若其三維結構亦顯示相似性，則亦 可視為已藉由垂直譜系傳遞出現。酶之絲胺酸蛋白酶家族 之成員（包括組織血纖維蛋白溶酶原活化劑及彈性蛋白酶） 被視為已藉由垂直譜系傳遞自共同祖先出現。 直系同源物包括基因或其經編碼基因產物，其經由例如 進化已在結構或總體活性方面趨異。舉例而言，當一個物 種編碼顯示兩種功能之基因產物時且#此等功能已在第二 物種中分離至不同基因中時，將該三種基因及其相應產物 視為直系同源物。為產生生化產物’ $習此項技術者將瞭 解應選擇具有代謝活性待引入或經破壞之直系同源基因 以便構造非天然存在之微生#。顯示可分離活性之直系同 源物之實例為不同活性已在兩種或兩種以上物種之間或在 早-物種内分離至不同基因產物中之情形。特定實例為將 彈性蛋白酶蛋白分解與金纖維蛋白溶酶原蛋白分解，即兩 種類型之絲胺酸蛋白酶活性㈣至作為血纖維蛋白溶酶原 活化劑及彈性蛋白酶之不时子中。第三實例為分離徽聚 菌5 -3外切核酸酶與果蠅⑷dna聚合酶⑴活 性。可將來自第-物種之舰聚合酶視作來自第二物種之 外切核酸酶或聚合酶中任一者或兩者的直系同源物，且反 之亦然。 相反’旁系同源物為藉由例如複製，接著進化趨異而相 關之同系物且具有相似或共同而非一致之功能。旁系同源 物可起源或來源於例如相同物種或不同物種。舉例而言， 微粒體環氧化物水解酶(環氧化物水解酶I)與可溶環氧化物 155953.doc -11- 201142034 水解酶（環氧化物水解酶π)因為代表兩種不同酶、由共同 祖先共進化而來、在相同物種中催化不同反應且具有不同 功能’所以可視作旁系同源物。旁系同源物為來自相同物 種之蛋白質，彼此具有顯著序列相似性從而表明其同源， 或為經由自共同袓先共進化而相關的蛋白質。旁系同源蛋 白質豕族之群包括HipA同系物、勞光素酶基因、肽酶及其 他蛋白。 非直系同源基因置換為來自一個物種之非直系同源基因 可取代不同物财之參考I因功能。取代包括例如能夠在 起源物種中執行與不同物種中的參考功能相比實質上相同 或相似之功能。儘管一般而言，非直系同源基因置換將可 鑑別為與編碼參考功能之已知基因結構上相關，然而結構 上相關性較小但功能上相似之基因及其相應基因產物仍屬 於該術5吾如本文中所用之含義内，功能相似性需要例如與 編碼尋求取代之功能的基因相比在非直系同源基因產物之 活性位點或結合區中之至少一些結構相似性。因此，非直 系同源基因包括例如旁系同源物或無關基因。 因此’在鑑別及構築本發明之具有丙烯生物合成能力的 非天然存在之微生物體中，熟習此項技術者將瞭解，將本 文提供之教示及指導應用於特定物種，代謝修飾之鐘別可 包括直系同源物之鑑別及包涵或失活。至旁系同源物及/ 或非直系同源基因置換存在於編碼催化相似或實質上相似 代謝反應之酶的參考微生物中之程度，熟習此項技術者亦 可利用此等進化上相關基因。 155953.doc •12· 201142034 直系同源物、旁系同源物及非直系同源基因置換可藉由 熟習此項技術者熟知之方法測定。舉例而言，兩種多肽之 核酸或胺基酸序列的檢驗將揭示比較序狀間的序列一致 性及相似性。基於此等相似性，$習此項技術者可確定相 似性是否高至足以表明蛋白質經由自共同祖先進化而相 關。熟習此項技術者熟知之演算法（諸如AUgn、blast、 Clustal W及其他）比較及測定原始序列相似性或一致性， 以及測定可射權重或評分之序列中之間隙的存在或顯著 性。此等演算法亦為此項技術中已知且同樣可適用於測定 核苷酸序列相似性或一致性^基於計算統計學相似性之熟 知方法計算足以測定相關性之相似性之參數，或測定在隨 機多肽中發現相似匹配之機率，及匹配顯著性。兩個或兩 個以上序列之電腦比較必要時亦可由熟習此項技術者視覺 上最佳化。可預期相關基因產物或蛋白質具有高相似性， 例如25%至100%序列一致性。若掃描足夠尺寸之資料庫 (約5。/。），則無關蛋白質可具有基本上與所預期㈣發生相 同之-致性。5%與24%之間的序列可能代表或可能不代表 足以推斷比較序列相關之同源性。可進行其他統計分析以 測定已知資料組尺寸時此等匹配之顯著性，從而測定此等 序列之相關性。 使用BLAST凟异法測定兩個或兩個以上序列之相關性之 例示性參數例如可闡述如不。簡言之，胺基酸序列比對^ 使用2.0.8版BLASTP(1999年i月05日）及以下參數來進行： 矩陣：0 BLOSUM62 ;間隙開放：u ;間隙延伸. 155953.doc -13- 201142034 x_dn>poff : 5〇 ;預期：1〇 〇 ;字長：3 ;濾波器：開。核 酸序列比對可使用2.0.6版BLASTN(1998年9月16日）及以下 參數來進行：匹配：1 ;錯配：-2 ;間隙開放：5 ;間隙延 伸：2 ; x_drop〇ff : 5〇 ;預期：1〇 〇 ;字長：n ;濾波 器：關。熟習此項技術者將知曉可對上述參數進行何種修 改以例如提高或降低比較嚴格性及測定兩個或兩個以上序 列之相關性。 在一些實施例中’本發明提供一種非天然存在之微生物 體’其包括具有擁有至少一種外源核酸之丙烯路徑的微生 物體’該至少一種外源核酸編碼足量表現以產生丙烯之丙 稀路徑酶’該丙烯路徑包括2_酮戊二酸甲基轉移酶或丙烯 形成酶（參看圖2，步驟1_2)。在一個態樣中，非天然存在 之微生物體包括具有擁有至少一種外源核酸之丙烯路徑的 微生物體，該至少一種外源核酸編碼足量表現以產生丙烯 之丙烯路徑酶，該丙烯路徑包括2_酮戊二酸甲基轉移酶及 丙稀形成§#(參看圖2，步驟1及2)。 在一些實施例中，本發明提供一種非天然存在之微生物 體，其包括具有擁有至少一種外源核酸之丙烯路徑的微生 物體，該至少一種外源核酸編碼足量表現以產生丙烯之丙 烯路徑酶，該丙烯路徑包括4_羥基_4_甲基_2_酮戊二酸醛 縮酶、4-羥基-4-甲基·2-酮戊二酸脫水、4_羥基_4_甲 基-2-酮戊一酸脫水酶〖、4_亞曱基_2_酮戊二酸還原酶、‘ 甲基-2-酮戊烯二酸還原酶或丙烯形成酶（參看圖3，步驟 A-F)。在-個態樣中，非天然存在之微生物體包括具有擁 155953.doc •14· 201142034 有至少一種外源核酸之丙烯路徑的微生物體，該至少一種 外源核酸編碼足量表現以產生丙烯之丙烯路徑酶，該丙烯 路控包括4-羥基_4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶、4-羥基-4-甲 基-2-酮戊二酸脫水酶π、4_亞甲基_2_酮戊二酸還原酶及丙 烯形成酶（參看圖3，步驟A、Β、C及F)。在一個態樣中， 非天然存在之微生物體包括具有擁有至少一種外源核酸之 丙稀路徑的微生物體’該至少一種外源核酸編碼足量表現 以產生丙烯之丙烯路徑酶，該丙烯路徑包括4羥基·4_甲 基-2-蜗戊二酸醛縮酶、4_羥基_4_曱基_2_酮戊二酸脫水酶 I、4-曱基-2-酮戊烯二酸還原酶及丙烯形成酶（參看圖3 ’ 步驟A、D、E及F)。 在一些實施例中’本發明提供一種非天然存在之微生物 體’其包括具有擁有至少一種外源核酸之丙烯路徑的微生 物體，該至少一種外源核酸編碼足量表現以產生丙烯之丙 烯路徑酶’該丙烯路徑包括白胺酸胺基轉移酶、去氫酶 (去胺基）或氧化酶；4-甲基-2-側氧基戊酸去氫酶；異戊醯 CoA去氫酶；3-甲基巴豆醯c〇A羧基酶；3-甲基戊烯二醯 CoA水解酶、轉移酶或合成酶；3_甲基戊烯二酸水合酶； 3-甲基-2-羥基戊二酸去氫酶；3_羥基·3_甲基戊二醯c〇a脫 水酶；或3-羥基-3-甲基戊二醯CoA解離酶（參看圖4，步驟 A-Ι)。在一個態樣中，非天然存在之微生物體包括具有擁 有至少一種外源核酸之丙烯路徑的微生物體，該至少一種 外源核酸編碼足量表現以產生丙烯之丙烯路徑酶，該丙烯 路徑包括白胺酸胺基轉移酶、去氫酶（去胺基）或氧化酶； 155953.doc -15- 201142034 4-甲基-2-側氧基戊酸去氫酶；異戊醯c〇A去氫酶；3_甲基 巴且醯CoA羧基酶；3_曱基戊烯二醯c〇A水解酶、轉移酶 或合成酶；3-甲基戊烯二酸水合酶；3_甲基_2羥基戊二酸 去氫酶及丙烯形成酶（參看圖4,步驟A_G及圖2 ,步驟2)。 在一個態樣中，非天然存在之微生物體包括具有擁有至少 一種外源核酸之丙烯路徑的微生物體，該至少一種外源核 酸編碼足量表現以產生丙烯之丙烯路徑酶，該丙烯路徑包 括3-甲基戊烯二醯c〇A水解酶、轉移酶或合成酶；3_甲基 戊烯二酸水合酶；3_甲基羥基戊二酸去氫酶；3_羥基_3_ 曱基戊二醯CoA脫水酶；3_羥基_3_甲基戊二醯c〇A解離酶 及丙烯形成酶（參看圖4,步驟E_G及圖2，步驟2)。 上述丙烯路徑酶或蛋白質之編碼核酸之來源為此項技術中 熟知且可獲自多種物種，包括（但不限於）本文例示者。 在一些實施例中，本發明提供一種非天然存在之微生物 體，其包括具有擁有至少一種外源核酸之丙烯路徑的微生 物體，該至少一種外源核酸編碼足量表現以產生丙烯之丙 烯路徑酶，該丙烯路徑包括離胺酸6_胺基轉移酶、6_去氫 酶（去胺基）或6-氧化酶；2_胺基己二酸去氫酶；2_胺基己 一酸歧化酶，4-曱基-2-胺基戊二酸胺基轉移酶、去氫酶 (去胺基）或氧化酶；2-胺基己二酸胺基轉移酶、去氫酶（去 胺基）或氧化酶；或2_側氧基己二酸歧化酶（參看圖5，步驟 A-F)。在一個態樣中，非天然存在之微生物體包括具有擁 有至少一種外源核酸之丙烯路徑的微生物體該至少—種 外源核酸編碼足量表現以產生丙烯之丙稀路徑酶，該丙烯 155953.doc • 16 · 201142034 、6_去氫酶（去胺基）或6-氧 2-胺基己二酸歧化酶；4_甲 去氫酶（去胺基）或氧化酶； 路徑包括離胺酸6-胺基轉移酶 化酶；2-胺基己二酸去氫酶、 基-2-胺基戊二酸胺基轉移酶、 及丙烯形成酶（參看圖5，步驟A_D，圖3，步驟在一個 態樣中，非天然存在之微生物體包括具有擁有至少一種外 源核酸之丙烯路徑的微生物體，該至少一種外源核酸編碼 足量表現以產生丙烯之丙烯路徑酶，該丙烯路徑 酸6-胺基轉移酶、6_去氫酶（去胺基）或6_氧化酶；2•胺基己 二酸去氫酶；2-胺基己二酸胺基轉移酶、去氫酶（去胺基） 或氧化酶；2·側氧基己二酸歧化酶；及丙烯形成酶（參看圖 5，步驟A、B、E及F，圖3，步驟F)。上述丙烯路徑酶或 蛋白質之編碼核酸之來源為此項技術中熟知且可獲自多種 物種’包括（但不限於）本文例示者。 在另一實施例中，本發明提供一種非天然存在之具有丙 烯路徑之微生物體，其中該非天然存在之微生物體包含至 少一種編碼將受質轉化為產物之酶或蛋白質的外源核酸， 該轉化係選自由以下組成之群：2_酮戊二酸轉化為3_甲 基-2-酮戊二酸、3-曱基-2-酮戊二酸轉化為丙烯、丙酮酸 轉化為4-羥基-4-曱基-2-酮戊二酸、4-羥基_4-甲基_2-酮戍 二酸轉化為4-亞曱基-2-酮戊二酸、4-亞甲基-2-_戊二酸轉 化為4-甲基-2-酮戊二酸、4-經基-4-曱基-2-酮戊二酸轉化 為4-甲基-2-酮戊稀二酸、4-甲基-2-酮戊稀二酸轉化為4_曱 基-2-酮戊二酸或4-甲基-2-酮戊二酸轉化為丙烯。熟習此 項技術者將瞭解其僅為例示性的且適於產生所需產物且適 155953.doc •17· 201142034 當活性可用於將受質轉化為產物的本文揭示之任何 產物對均可由熟習此項技術者基於本文教轉易確定。因 此，本發明提供-種非天然存在之微生物體，其含有至卜 -種編瑪酶或蛋白f之外源㈣，其中酶或蛋白質轉化= 烯路徑之受質及產物，諸如圖2_5中所示者。 儘管本文-般描述為含有丙烯路徑之微生物體，但應瞭 解’本發明另外提供一種非天然存在之微生物體，其包含 至少-種編碼；I量表現以產生丙烯路徑之中間物的丙婦路 徑酶之外源核酸。舉例而言，如本文所揭示，丙烯路徑例 示於圖2-5中。因,匕’除含有產生丙烯之丙烯路徑之微生 物體外，本發明另外提供一種非天然存在之微生物體，其 包含至少一種編碼丙烯路徑酶之外源核酸，其中該微生物 體產生丙浠路徑中間物，例如3_甲基_酮戊二酸、羥 基-4-甲基-2·酮戊二酸、4·亞甲基_2•酮戊二酸、4_甲基_2· 酮戊稀二酸或4-甲基-2-酮戊二酸。 應瞭解，本文所揭示，如實例中所述及圖中例示之任何 路徑（包括圖2 - 5之路徑）必要時可用於產生製得任何路徑中 間物或產物之非天然存在之微生物體。如本文所揭示，產 生中間物之此類微生物體可與表現下游路徑酶之另—微生 物體組合使用以產生所需產物。然而，應瞭解，產生丙稀 路徑中間物之非天然存在之微生物體可用於產生作為所需 產物之中間物。 本文一般參考代謝反應、其反應物或產物或特定參考— 或多種編碼以下之核酸或基因來描述本發明：與參考代謝 155953.doc -18- 201142034 反應、反應物或產物相關或催化參考代謝反應、反應物或 產物之酶，或與參考代謝反應、反應物或產物相關之蛋白 質。除非在本文中另外明確規定，否則熟習此項技術者將 瞭解參考反應亦構成對反應之反應物及產物的參考。類似 地，除非在本文中另外明確規定，否則參考反應物或產物 亦參考反應’且參考任何此等代謝組分亦參考編碼催化參 考反應、反應物或產物之酶或涉及參考反應、反應物或產 物之蛋白質的基因。同樣，考慮到代謝生物化學、酶學及 基因組學之熟知領域，在本文中參考基因或編碼核酸亦構 成對相應編碼酶及其所催化之反應或與反應以及反應之反 應物及產物相關之蛋白質的參考。 如本文所揭示，中間物3_甲基_2•酮戊二酸、4•羥基·4甲 基-2-酮戊二酸、4-曱基-2-酮戊烯二酸、4_亞甲基-2_酮戊 二酸、4-甲基-2-酮戊二酸、4-甲基-2-側氧基戊酸、3_甲基 戊烯二酸、3-甲基-2-羥基戊二酸、2_胺基己二酸半醛、2_ 胺基己二酸、2_側氧基己二酸及4_甲基_2_胺基戊二酸以及 其他中間物為羧酸，其可以各種離子化形式，包括完全質 子化、部分質子化及完全去質子化形式出現。因此，字尾 「酸（-ate)」或酸形式可互換使用以描述游離酸形式以及 任何去質子化形式，此係尤其因為已知離子化形式係視化 合物所見之pH值而定之故。應瞭解羧酸產物或中間物包括 竣酸產物或路徑中間物之酯形式，諸如〇_羧酸酯及s_羧酸 醋。〇_及S-羧酸可包括低碳烷基，亦即(：1至(：6分支鏈或直 鏈羧酸。一些此等〇_或S-羧酸包括（不限於）甲基、乙基、 155953.doc -19- 201142034 正丙基、正丁基、異丙基、第二丁基及第三丁基、戊基、 己基〇-或s-羧酸，其中任一者可進一步具有不飽和度，從 而提供例如丙烯基、丁烯基、戊基及己烯基〇_或；5_羧酸。 0-羧酸可為生物合成路徑之產物。經由生物合成路徑獲取 之例示性0-羧酸可包括（不限於）曱基_3_曱基_2_酮戊二酸、 曱基-4-羥基-4·•甲基-2-酮戊二酸、曱基-4-曱基-2-酮戊烯二 酸、曱基-4-亞甲基-2-酮戊二酸、甲基-4-曱基-2-酮戊二 酸、曱基-4-曱基-2-侧氧基戊酸、甲基-3-曱基戊烯二酸、 甲基-3 -甲基-2-羥基戊二酸、曱基-2-胺基己二酸半醛、甲 基-2-胺基己二酸、甲基_2_側氧基己二酸、甲基_4_甲基_2_ 胺基戊一酸、乙基-3-甲基-2-酮戊二酸、乙基_4-經基_4_甲 基-2-酮戊二酸、乙基_4•甲基_2_酮戊烯二酸、乙基_4_亞甲 基-2-酮戊二酸、乙基_4_曱基-2-酮戊二酸、乙基_4_甲基-2-側氧基戊酸、乙基-3 -甲基戊烯二酸、乙基·3·甲基_2_經基 戊~酸、乙基-2-胺基己二酸半酸、乙基-2-胺基己二酸、 乙基-2-側氧基己二酸及乙基·4 -甲基-2-胺基戊二酸、正丙 基-3-曱基_2-_戊二酸、正丙基_4_經基-4-甲基-2-嗣戍二 酸、正丙基-4-甲基-2-鲷戊烯二酸、正丙基-4-亞甲基_2_酮 戊二酸、正丙基-4-甲基-2-酮戊二酸、正丙基·4·曱基·二—側 氧基戊酸、正丙基-3 -甲基戊烯二酸、正丙基-3_甲基_2-經 基戍一酸、正丙基-2·胺基己二酸半酸、正丙基_2_胺基己 一醆、正丙基-2-側氧基己二酸及正丙基-4-甲基_2-胺基戍 二酸。其他生物合成可獲取之0-羧酸可包括中長鍵基團， 亦即C7-C22 0_羧酸酯，其衍生自脂肪醇，諸如庚醇、辛 155953.doc •20- 201142034 醇、壬醇、參酿 六知、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四 醇、十不 疋^、十六烷醇、軟脂醯醇、十七烷醇、十八 醇、十六、龄 几醇、二十燒醇 '二_j--烧醇及二十二烧醇， X、中任—者可視情況為分支鏈及/或含有不飽和度》〇_幾 曰亦可絰由諸如以下之生化或化學方法獲取：游離羧酸 物之酗化或〇_或s•羧酸之酯基轉移。s_羧酸之實例為 酉曰半胱胺醯基S-酯、烷基硫酯及各種芳基及雜芳 基硫酯。 本發明之非天然存在之微生物體可藉由引人編碼參與一 或多種丙稀生物合成路徑之酶或蛋白質中一或多者的可表 :核酸來產生。視選擇用於生物合成之宿主微生物體而 定，可表現一些或所有特定丙稀生物合成路徑之核酸。舉 例而言，若所選宿主缺乏一或多種用於所需生物合成路徑 $酶或蛋白質，則將缺乏之酶或蛋白質之可表現核酸引入 伯主中以便隨後外源表現。或者，若所選宿主顯示一些路 徑基因之内源表現，但缺乏其他基因，則對於缺乏之酶或 蛋白質需要編碼核酸以達成丙稀生物合成。因此，本發明 之非天然存在之微生物體可如下產生：引入外源酶或蛋白 質活性以獲得所需生物合成路徑’或所需生物合成路徑可 藉由引入連同-或多種内源酶或蛋白質一起產生諸如丙稀 之所需產物的一或多種外源酶或蛋白質活性來與得 宿主微生物體可選自在例如細菌、酵母、真二用於 撥酵方法之多種其他微生物中任-者中產生的非天然存在 之微生物體。例示性細菌包括選自以 卜之物種：大腸桿 155953.doc •21 · 201142034 菌、產酸克雷伯菌oxyiocra)、厭氧產丁二酸螺 菌（Anaerobiospifillum succiniciproducens)、~Γ 二駿放線菌 jwcc/wogewe·?)、產丁 二酸曼氏桿菌 swccz’mWp/Oc/Mce”·?)、艾特利根瘤菌 (Rhizobium etli)、枯萆桿菌（Bacillus subtilis)、谷胺駿棒 狀桿菌（Cor_y«e6acierz’ww gVwiamicMm)、氧化葡糖酸菌 (G/“ccmoZ>acier ojcyc/awi)、運動酿酵單胞菌（Zymo/wowa·? 、雷特氏乳球菌（jLaciococcw5 /ac"5)、植物乳酸桿 菌、天藍色鍵徽菌（SVrepiomycei coelicolor)、丙 酮丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutylicum) ^ ^ ^ {Pseudomonas fluorescens) 及惡臭假單胞菌。例示性酵母或真菌 包括選自以下之物種：酿酒酵母（<S^cc/z(3rc>w>>ce5 cerevisiae) ' # ϋ {Schizosaccharomyces pombe) ' % 酸刻魯維酵母（AVi^yveromyce·? /aciis)、馬克西安克魯維酵 母（尺/Myvero/nycei warxz’awMi)、土 生麵徽 C^iperg/Z/w·? ierrew·?)、黑麯黴（Aper客z7/w·? w/ger)、甲醇酵母（P/c/π’α 無根根徽（Λ/π·ζ67?μ·5 arr/n’zw5)、米根黴 o/^zize)、解脂耶氏酵母菌（FarroiWa /z'po/yiicr·?)及其類似 物。大腸桿菌由於為適用於基因工程改造之良好表徵微生 物體而為尤其適用之宿主生物體。其他尤其適用之宿主生 物體包括酵母，諸如釀酒酵母。應瞭解，任何適合之微生 物宿主生物體均可用以引入代謝及/或基因修飾以產生所 需產物。 155953.doc -22- 201142034 視所選宿主微生物體之丙烯生物合成路徑組分而定，本 發明之非天然存在之微生物體將包括至少一種外源表現之 丙烯路徑編碼核酸及用於一或多種丙烯生物合成路徑之至 多所有編碼核酸。舉例而言，丙烯生物合成可經由相應編 碼核酸之外源表現在缺乏路徑酶或蛋白質之宿主中建立。 在缺乏所有丙烯路徑酶或蛋白質之宿主中，可包括路徑中 所有酶或蛋白質之外源表現，但應瞭解即使宿主含有至少 一種路徑酶或蛋白質，所有路徑酶或蛋白質仍可表現。舉 例而言，可包括產生丙烯之路徑中所有酶或蛋白質之外源 表現，諸如2-酮戊二酸甲基轉移酶及丙烯形成酶，或者4_ 羥基-4-甲基-2_酮戊二酸醛縮酶、4_羥基·4_甲基酮戊二 酸脫水酶Π、4-亞甲基_2,戊二酸還原酶及丙豨形成酶Τ 或者4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶、4_羥基甲基- 酮戊二酸脫水酶I、4-曱基-2-酮戊烯二酸還原酶及丙烯形 成酶。 考慮到本文提供之教示及指導，熟習此項技術者將瞭 解，以可表現形式引入之編碼核酸數目將至少對應於 (parallel)所選宿主微生物體之丙烯路徑缺乏。因此，本發 明之非天然存在之微生物體可具有一、二、三或四個、至 多所有編碼構成本文揭示之丙烯生物合成路徑之酶或蛋白 質的核酸H實施例中，非天时在之微生物體亦可 包括有助於或最佳化⑽生物合成或賦予宿主微生物體其 他適用功能之其他基因修飾。_種此類其他功能可包括例 如增強-或多種丙稀路徑前驅體（諸如2•嗣戊二酸或丙綱 155953.doc -23- 201142034 酸）之合成。 一般而言，選擇宿主微生物體使得其產生丙烯路徑前驅 體’作為天然產生之分子或作為工程改造之產物，其使得 所需前驅體重新產生或提高宿主微生物體天然產生之前驅 體的產量。舉例而言’丙酮酸及2-酮戊二酸係在諸如大腸 桿菌之宿主生物體中天然產生。如本文所揭示，宿主生物 體可經工程改造以提高前驅體產量。另外，已經工程改造 以產生所需前驅體之微生物體可用作宿主生物體且經進一 步工程改造以表現丙烯路徑酶或蛋白質。 在一些實施例中，本發明之非天然存在之微生物體係自 3有合成丙稀之扭促能力的宿主產生。在此特定實施例 中，其可適用於提高丙烯路徑產物之合成或累積以例如促 使丙烯路徑反應朝著丙烯產生的方向發生。提高之合成或 累積可藉由例如編碼一或多種上述丙烯路徑酶或蛋白質之 核酸的過表現來實現。丙烯路徑酶及/或蛋白質之過表現 可例如經由内源基因之外源表現或經由異源基因之外源表 現來發生。因此，天然存在之生物體可輕易產生作為本發 明之非天然存在之微生物體，其例如經由一、二、三或四 種亦即至多所有編碼丙烯生物合成路徑酶或蛋白質之核 酸的過表現來產生丙烯。另外，非天然存在之生物體可藉 由内源基因突變誘發從而使得丙烯生物合成路徑中之酶活 性提高來產生。 ' 在尤其適用之實施例中，採用編碼核酸之外源表現。外 源表現賦予宿主及應用定製表現及/或調節元件之能力以 155953.doc -24· 201142034 達成由使用者控制之所需表現量。然而，諸如藉由移除負 調節效應物或誘導基因之啟動子（當連接至誘導性啟動子 或其他調節元件時）’内源表現亦可用於其他實施例。因 此，具有天然存在之誘導性啟動子的内源基因可藉由提供 適當誘導劑而經上調，或可工程改造内源基因之調節區以 使其併有誘導性調節元件，藉此使得内源基因提高之表現 調節所需倍數。類似地，可包括誘導性啟動子作為引入非 天然存在之微生物體中的外源基因之調節元件。 應瞭解’在本發明之方法中’任何一或多種外源核酸均 可引入微生物體中以產生本發明之非天然存在之微生物 體。可引入核酸以便賦予微生物體例如丙烯生物合成路 徑。或者，可引入編碼核酸以產生具有催化—些所需反應 之生物合成能力以賦予丙烯生物合成能力的中間微生物 體。舉例而言，具有丙烯生物合成路徑之非天然存在之微 生物體可包含至少兩種編碼諸如以下組合之所需酶或蛋白 質的外源核酸：2-酮戊二酸曱基轉移酶與丙烯形成酶，或 者4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸脫水酶^與4_亞甲基·2_酮戊二 酸還原酶，或者4_羥基_4_曱基·2_酮戊二酸醛縮酶與丙烯 形成酶，及其類似組合。因此，應瞭解生物合成路徑之兩 種或兩種以上酶或蛋白質之任何組合均可包括於本發明之 非天然存在之微生物體中。類似地，應瞭解生物合成路徑 之一種或二種以上酶或蛋白質之任何組合均可包括於本發 明之非天然存在之微生物體中，例如4•羥基·4_甲基·2_酮 戊二酸醛縮酶、4_羥基_4_甲基_2_酮戊二酸脫水酶1](及4_亞 155953.doc •25· 201142034 甲基-2-酮戊二酸還原酶’或者4-羥基_4_甲基_2_酮戊二酸 脫水酶II、4-亞甲基-2-酮戊二酸還原酶及丙烯形成酶或 者4-經基-4-甲基-2-酮戊二酸路縮酶、4-經基甲基2綱 戊二酸脫水酶I及4-曱基-2-酮戊烯二酸還原酶，或者心經 基-4-曱基-2-_戊二酸脫水酶I、4-甲基·2-_戊稀二酸還原 酶及丙稀形成酶等（必要時）’前提為所需生物合成路彳&之 酶及/或蛋白質之組合使得產生相應所需產物。類似地， 如下四者，4-羥基-4-曱基-2-酮戊二酸醛縮酶、4_經基-4一 甲基-2-酮戊二酸脫水酶Π、‘亞甲基_2_酮戊二酸還原酶及 丙烯形成酶，或者4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶、‘羥 基-4-甲基-2-酮戊二酸脫水酶卜4-甲基·2·酮戊烯二酸還原 酶及丙烯形成酶，或如本文揭示之生物合成路徑之更多酶 或蛋白質的任何組合必要時均可包括於本發明之非天然存 在之微生物體中，前提為所需生物合成路徑之酶及/或= 白質之組合使得產生相應所需產物。 除如本文所述之丙烯生物合成外，本發明之非天然存在 之微生物體及方法亦可以彼此及與此項技術中熟知之其他 微生物體及方法的各種組合利用以藉由其他途徑達成產物 生物合成。舉例而t ’除使用丙稀產生物外的—種產生丙 烯之替代方案為添加能夠轉化丙烯路徑中間物為丙烯之另 -微生物體…種此程序包括例如使微生物體輯，從而 產生丙婦路徑中間物。接著可將丙烯路徑中間物用作第二 微生物體之受質，使得丙烯路徑中間物轉化為丙稀。可將 丙烯路徑中間物直接添加至第二生物體之另—培養物中， 155953.doc * 26 - 201142034 或丙烯路徑中間物產生物之原始培養物可藉由例如細胞分 離來消除此等微生物體，接著將第二生物體隨後添加至醱 酵培養液中可用以產生最終產物而無中間物純化步驟。 在其他實施例中，本發明之非天然存在之微生物體及方 法可以多種子路徑組裝以達成例如丙烯之生物合成。在此 等實施例中，本發明之所需產物的生物合成路徑可分離至 不同微生物體中，且可共同培養不同微生物體以產生最終 產物在此類生物合成方案中，一種微生物體之產物為第 二微生物體之受質直至合成最終產物為止。舉例而言，丙 烯生物合成可藉由構築含有將一種路徑中間物轉化為另一 路徑中間物或產#之生物合成路徑的微生物體來實現。或 者，丙烯亦可自微生物體經由在同一容器中使用兩種生物 體共同培養或共同醱酵而以生物合成方式產生，其中第一 微生物體產生丙中間物且第二微生物體轉化該中間物為 丙埽。 考慮到本文提供之教示及指導，熟習此項技術者將瞭 解’在共同培養具有子路徑之其他非天然存在之微生物體 的情況下及在此項技術中熟知產±丙烯之其他化學及/或 生化程序之組合的情況下，對於本發明之非天然存在之微 生物體及方法以及其他微生物體存在多種組合及排列。 丙稀路徑酶或蛋白質之編碼核酸的來源可包括例如編碼 基因產物能夠催化參考反應之任何物種。此等物種包括原 核與真核生物體’包括(但不限於)細菌(包括古細菌及真細 菌）’及真核生物（包括酵母、植物、昆蟲、動物及哺乳動 155953.doc -27· 201142034 物，包括人類）。此等來源之例示性物種包括例如 dwaeroirwTicwi DSM 17241、多毛擬桿菌 {Bacteroides 29799 、空腸曲桿菌 {Campylobacter jejuni) ' 肉毒梭菌 d·? str{Clostridium sir)、科氏梭菌（C/〇5irz’i/z’wm 灸/wyverz*)、赂丁 酸梭菌（C/osirz·山‘wm 〇/roZ?M〇/rz'CMm)、睾丸酮叢毛單胞菌 (Comamonas testosteroni)、麵胺酸棒狀桿菌 {Corynebacterium glutamicum) ' 夠蟲ί 食鋼 M (Cupriavidus weaior)、大腸桿菌、大腸桿菌C、大腸桿菌W、真桿菌 {Eubacterium 6ar 灸 eri)、肺炎克雷伯氏桿菌 pneumoniae)、詹氏曱烧球菌（Mei/7a«oca/<i〇i；occMi jannaschii)、熱 Ζλ 後儀（Moorella 、喜溫酿 酵菌（户e/oiomacM/ww 、諸色假單胞菌 NGJlCPsewi/omoTiai oc/zraeeae NGJ1)、惡臭假單胞菌、 雷氏假單胞菌 M77)、假單胞菌 大豆致病變種（Psewi/owowa^ /?v. G/_ychea)、丁香 假單抱菌菜豆致病變種syringae pv. phaseolicola尸尺2)、婉豆細菌性疫病菌 •syrz’/igae pv. PzW)、富養羅爾斯通氏菌 eutropha JMP134)、青枯菌（Ralstonia solanacearum)、褐 家鼠（ΛίϊίίΜί «orveg/cwi)、不透明紅球菌（及/zoi/ococcw·? opacw·?)、酿酒酵母、腸道沙門氏菌（5Wwi〇«e//<a enterica) ' 躺胺醇單胞菌屬 SYK6(Sphingomonas sp. 155953.doc -28 - 201142034 SYK6)、天藍色鏈黴菌、弗氏鏈黴菌（57^广〇叩^以 fradiae)、玫取抱鏠黴菌 NRRL U379(Streiyt〇myces roseosporus NRRL "3 79)、極端嗜熱菌（以以卿友

Mermo;?；n7Wls)，以及本文所揭示或以相應基因之來源生物 體形式可得之其他例示性物種。然而，因為目前超過55〇 個物種可得完整基因組序列（其中一半以上係於諸如NCB】 之公共資料庫可得），包括395個微生物基因組及多種酵 母、真菌、植物及哺乳動物基因組，所以鑑別編碼相關或 遠緣物種十一或多種基因之必要丙烯生物合成活性的基因 (包括例如已知基因之同系物、直系同源物、旁系同源物 及非直系同源基因置換，及生物體之間的基因改變之互 換）在此項技術中為常規及熟知的。因此，參考諸如大腸 杯菌之特定生物冑使得生物合成本文所述之丙#的代謝改 變可同樣輕易適用於其他微生物，包括原核及真核生物 體。考慮到本文提供之教示及指導，熟習此項技術者將知 曉在一種生物體中例示之代謝改變可同等適用於其他生物 體。 在一些情況下，諸如當替代性丙烯生物合成路徑存在於 無關物種中時，可藉由例如外源表現來自催化相似但不同 之代謝反應以替代參考反應之無關物種的旁系同源物而將 丙稀生物合成賦予宿主物種。因為不同生物體之間存在代 謝、周路之某些差異，所以熟習此項技術者將瞭解不同生物 體之間的實際基因利用率可不同。然而，考慮到本文提供 之教示及彳a導’熟習此項技術者亦將瞭解，在使用與本文 155953.doc •29- 201142034 例示同源之代謝改變以在將合成丙烯之相關物種中構築微 生物體的情況下，本發明之教示及方法可適用於所有微生 物體。 構築及測試非天然存在之丙烯產生宿主之表現量的方法 可例如藉由此項技術中熟知之重組及偵測方法來進行。此 等方法可見描述於例如Sambrook等人，Mo/ecw/ar Cloning: A Laboratory Manual ，第 3 版，Cold Spring

Harbor Laboratory, New York (2001);及 Ausubel 等人，

Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons，Baltimore，MD (1999)中 〇

可使用此項技術中熟知之技術將涉及產生丙烯之路徑的 外源核酸序列穩定或暫時引入宿主細胞中，該等技術包括 (但不限於）接合、電穿孔、化學轉型、轉導、轉染及超音 波轉型。為在大腸桿菌或其他原核細胞中外源表現，真核 核酸之基因或cDNA中之一些核酸序列可編碼靶向信號， 諸如N端粒線體或其他乾向信號，必要時其可在轉型至原 核宿主細胞中之前經移除。舉例而言，移除粒線體前導序 列使得大腸桿菌中之表現提高（H〇ffmeister等人，乂仍W CT^m. 280:4329-4338 (2005))。為在酵母或其他真核細胞 中外源表現’基因可在未添加前導序列之情況下表現於細 胞溶質中，或可把向粒線體或其他細胞器，或絲向以便 分泌，藉由添加諸如適用於宿主細胞之粒線體乾向或分泌 信號之適合乾向序列來達成，，應瞭解移除或包括乾 向序列之對核酸序列之適當修飾可併人外源核酸序列中以 155953.doc •30- 201142034 賦予所需特性。此外，可用此項技術中熟知之技術對基因 進行密碼子最佳化以達成最佳化蛋白質表現。 可構築表現載體以使其包括一或多種編碼如本文例示之 可操作地連接於宿主生物體中之功能性表現控制序列的核 i之丙烯生物合成路徑。適用於本發明之微生物宿主生物 體中的表現載體包括例如質體、噬菌體載體、病毒載體、 游離基因體及人工染色體，包括載體及選擇序列或標記， 其對於穩定整合至宿主染色體中為可操作的。另外，表現 載體可包括一或多種可選標記基因及適當表現控制序列。 亦可包括如下可選標記基因，其例如提供對抗生素或毒 素、補體營養缺陷型缺乏之抗性，或供應不在培養基中之 關鍵營養素。表現控制序列可包括此項技術中熟知之構成 性及誘導性啟動子、轉錄強化子、轉錄終止子及其類似 物。當兩種或兩種以上外源編碼核酸共同表現時，兩種核 酸可嵌_入例如單一表現載體或個別表現載體中。對於單一 載體表現’編碼核酸可操作地連接至一個共同表現控制序 列或連接至不同表現控制序列，諸如一個誘導性啟動子及 一個構成性啟動子。涉及代謝或合成路徑之外源核酸序列 的轉型可使用此項技術中熟知之方法證實。此等方法包括 例如核酸分析，諸如mRNA之北方墨點法（Northern blot)或 聚合酶鏈反應（PCR)擴增’或基因產物表現之免疫墨點 法，或測試所引入核酸序列或其相應基因產物之表現的其 他適合分析法。熟習此項技術者應瞭解，足量表現外源核 酸以產生所需產物’且應進一步瞭解，可使用此項技術中 155953.doc -31 · 201142034 熟知及如本文揭示之方法最佳化表現量以獲得足量表現。 在一些實施例中，本發明提供一種產生丙烯之方法，其 匕括培養非天然存在之微生物體，包括具有丙烯路徑之微 生物體，該丙烯路徑包括至少一種編碼足量表現以產生丙 烯之丙烯路徑酶的外源核酸，該丙烯路徑包括2_酮戊二酸 曱基轉移酶或丙烯形成酶（參看圖2，步驟1-2)。在一個態 樣中’該方法包括具有丙烯路徑之微生物體，該丙烯路徑 包括2_酮戊二酸曱基轉移酶及丙烯形成酶（圖2，步驟1及 2)。 在—些實施例中，本發明提供一種產生丙烯之方法，其 包括培養非天然存在之微生物體，包括具有丙烯路徑之微 生物體，該丙烯路徑包括至少一種編碼足量表現以產生丙 稀之丙稀路徑酶的外源核酸，該丙浠路徑包括4·經基曱 基-2-酮戊二酸醛縮酶、4_羥基_4_甲基·2_酮戊二酸脫水酶 Π、4-羥基-4-曱基-2-酮戊二酸脫水酶丨、4-亞甲基_2-酮戊 二酸還原酶、4·曱基_2_酮戊烯二酸還原酶或丙烯形成酶 (參看圖3，步驟A-F)。在一個態樣中，該方法包括具有丙 烯路徑之微生物體，該丙烯路徑包括4_羥基_4_甲基_2_酮 戊二酸醛縮酶、4-羥基-4-甲基酮戊二酸脫水酶π、4_亞 曱基-2-酮戊二酸還原酶及丙烯形成酶（參看圖3，步驟a、 C及F)在個態樣中，該方法包括具有丙烯路徑之微 生物體，該丙烯路徑包括4·羥基_4_曱基_2-酮戊二酸醛縮 酶、4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸脫水酶1、4_曱基·2_酮戊烯 一酸還原及丙稀形成酶（圖3，步驟A、d、E及F)。 155953.doc •32· 201142034 在一些實施例中，本發明摇批_接立l 赞a杈供種產生丙烯之方法，其 包括培養非天㈣在之微生物體，包括具有㈣路徑之微 生物體，該丙烯路徑包括至少—種編収量表現以產生丙 烯之丙稀路徑酶的外源核酸，該丙稀路徑包括白胺酸胺基 轉移酶、去氫酶(去胺基)或氧化酶；4_甲基_2•側氧基戊酸 去氫酶；異戊醯CoA去氫酶；3_甲基巴豆醯—緩基酶； 3-曱基戊烯二醯CoA水解酶、轉移酶或合成酶；3•甲基戊 稀二酸水合酶；3.甲基_2_經基戊二酸去氫酶；㈣基二甲 基戊二醯CoA脫水酶；或3_羥基_3_甲基戊二醯c〇a解離酶 (參看圖4,步驟A-D。在一個態樣中，該方法包括具有丙 烯路徑之微生物體，該丙烯路徑包括白胺酸胺基轉移酶、 去氫酶（去胺基）或氧化酶；4-甲基_2_側氧基戊酸去氣酶； 異戊醯CoA去氫酶；3-甲基巴豆醯c〇A羧基酶；夂甲基戊 稀二醯CoA水解酶 '轉移酶或合成酶；3_甲基戊稀二酸水 合酶；3-甲基-2-經基戊二酸去氫酶及丙稀形成酶（參看圖 4，步驟A-G及圖2，步驟2)。在一個態樣中，該方法包括 具有丙烯路徑之微生物體，該丙烯路徑包括3_曱基戊烯二 醯CoA水解酶、轉移酶或合成酶；3_甲基戊烯二酸水合 酶；3-甲基-2-羥基戊二酸去氫酶；3_羥基_3_甲基戊二酿 CoA脫水酶；3-羥基-3-甲基戊二醯C〇A解離酶及丙烯形成 酶（參看圖4，步驟I、h、E_G及圖2，步驟2)。上述丙烯路 徑酶或蛋白質之編碼核酸之來源為此項技術中熟知且可獲 自多種物種’包括（但不限於）本文例示者。 在一些實施例中，本發明提供一種產生丙烯之方法，其 155953.doc -33- 201142034 包括培養非天然存在之微生物體，包括具有丙稀路徑之微 生物體，該丙稀路徑包括至少一種編碼足量表現以產生丙 稀之丙稀路徑酶的外源核酸，該丙稀路徑包括離胺酸卜胺 基轉移酶、6_去氫酶（去胺基）或卜氧化酶；h胺基己二酸 去氫酶；2-胺基己二酸歧化酶；4_甲基胺基戊二酸胺基 轉移酶、去氫酶（去胺基）或氧化酶；2_胺基己二酸胺基轉 移酶、去氫酶(去胺基)或氧化酶；或2_側氧基己二酸歧化 酶(參看圖5 ’步驟A_F)e在一個態樣十，該方法包括具有 丙烯路徑之微生物體，該丙稀路徑包括離胺酸卜胺基轉移 酶、6-去氫酶（去胺基）或6_氧化酶；2_胺基己二酸去氫 酶、2-胺基己二酸歧化酶；4_甲基|胺基戊二酸胺基轉移 酶、去氫酶（去胺基）或氧化酶；及丙稀形成酶（參看圖5, 步驟A-D，圖3，步驟F)。在一個態樣中，該方法包括具有 丙烯路徑之微生物體，該丙烯路徑包括離胺酸6_胺基轉移 酶、6·去氩酶（去胺基）或6_氧化酶；2_胺基己二酸去氫 酶；2-胺基己二酸胺基轉移酶、去氫酶（去胺基）或氧化 酶，2-側氧基己二酸歧化酶；及丙烯形成酶（參看圖5，步 驟A、B、E及F，圖3，步驟F)。上述丙烯路徑酶或蛋白質 之編碼核酸之來源為此項技術中熟知且可獲自多種物種， 包括（但不限於）本文例示者。 測試丙烯產生之適合純化及/或檢定可使用熟知方法進 行。對於欲測試之各工程改造之細胞株，可使諸如三個重 複培養物之適合複製物生長。舉例而言，可監測經工程改 造產生宿主中之產物及副產物形成。最終產物及令間物及 155953.doc -34- 201142034 其他有機化合物可藉由諸如HPLC(高效液相層析）、 GC-MS(氣相層析-質譜分析）及LC_MS(液相層析_質谱分析） 或使用此項技術中熟知之常規程序之其他適合分析法的方 法分析。礙酵培養液中之產物釋放亦可用培養物上清液測 試。副產物及殘餘葡萄糖可藉由HPLC，使用例如葡萄糖 及醇之折射率偵測器’及有機酸之UV偵測器（Lin等人， 加/mo/仍90:775-779 (2005))或此項技術中熟知 之其他適合檢定及偵測方法來定量。亦可使用此項技術中 熟知之方法檢定來自外源DNA序列之個別酶或蛋白質活 性。對於典型檢定法，參看烴分析手冊（Manual Hydrocarbon Analysis)(ASTM Manula Series, A.W. Drews 編’第 6版 ’ 1998，American Society f〇r Testing and Materials, Baltimore, Maryland)。 可使用此項技術中熟知之多種方法將丙烯與培養物中之 其他組分分離。此等分離方法包括例如萃取程序以及包括 以下之方法.連續液-液萃取、滲透蒸發、膜過濾、膜分 離、逆滲透、電透析、蒸餾、結晶、離心、萃取過濾、離 子父換層析、尺寸排阻層析、吸附層析及超濾。所有上述 方法均為此項技術中熟知。 本文所述之任何非天然存在之微生物體均可經培養以產 生及/或分泌本發明之生物合成產物。舉例而言，可培養 丙烯產生物以便生物合成產生丙烯。 為產生丙烯，在含碳源及其他必需營養素之培養基中培 養重組細胞株。有時需要且可能高度需要維持醱酵槽中之 155953.doc •35- 201142034 缺氧條件以降低總體方法之成本。此等條件可例如藉由首 先以氮氣喷射培養基，接著以膈膜及螺旋蓋密封燒瓶來獲 得。對於未在缺氧下觀察到生長之細胞株，彳藉由以小孔 將膈膜穿孔以便有限充氣來應用微有氧或實質上缺氧條 件。先前已描述例示性缺氧條件且其為此項技術中熟知。 例不性有氧及缺氧條件描述於例如2〇〇7年8月1〇日申♦奮之 美國公開案2009_47719中。如本文所㈣，酸酵^分 批、分批進料或連續方式進行。 必要時’培養基之pH值可藉由添加如將培養基維持在所 需pH值下所冑之驗（諸如Na〇H或其他驗）或酸而維持在所 需pH值’尤其中性pH值，諸如約7之阳值下。生長速率可 藉由使用分光光度計（_ nm)量測光學密度來測定，且葡 萄糖攝取速率藉由隨時間監_源損耗來測定。 長培養基可包括例如可向非天然存在之微生物供應, 源的任何碳水化合物源。此等來源包括例如糖，諸如^ 糖、，糖、阿拉伯糖（arabin〇se)、半乳糖、甘露糖、^ 糖、蔬糖及殿粉。其他碳水化合物源包括例如可再生原制 及生物質。可在本發明之方法中用作原料的生物質之例示 性類型包括纖維素生物質、本纏 明負牛纖維素生物質及木質素原料 或原料之部分。此等生物暂疮輕人士， 物質原枓含有例如適用作碳源之碳 水化合物受質，諸如諂苗她 邊如匍萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、 甘露糖、果糖及澱粉。者磨丨士 考慮到本文提供之教示及指導，孰 習此項技術者將瞭解，除卜令私μ _ , 、 除上文所例不以外之可再生原料及 生物質亦可用於培養本發 脣不發明之微生物體以便產生丙烯。 155953.doc -36 - 201142034 除諸如上文所例^之可再生原料外，本發明之㈣微生 物體亦可㈣質以便在作為其碳源之合成氣上生長。在此 特疋實施例中，使-或多種蛋白質或酶在丙稀產生生物體 t表現以提供代謝路徑以便利用合成氣或其他氣體碳源。 亦稱為合成氣或發生氣（producer gas)之合成氣體為煤及 含碳材料（諸如生物質材料’包括農作物及殘餘物）氣化之 主產物。合成氣為主要1^與(：：0之混合物且可獲自任何有 機原料之氣化，有機原料包括（但不限於）煤、煤油、天然 氣、生物質及有機廢物。一般在高燃料與氧氣比率下進行 氣化。合成氣儘管主要包括Ha及c〇，但亦可包括較少量 C〇2及其他氣體。因此，合成氣體提供成本有效之氣體碳 源’諸如CO及另外co2。

Wood-Ljungdahl路徑催化C0與Ha轉化為乙醯c〇A及其他 產物’諸如乙酸酯。能夠利用CO及合成氣之生物體一般 亦具有經由Wood-Ljungdahl路徑涵蓋之同一組基礎酶及轉 化來利用C〇2及C〇2/H2混合物之能力。在揭示c〇亦可由相 同生物體使用且涉及相同路徑之前很早便認識到微生物依 賴於H2將C〇2轉化為乙酸酯。許多產乙酸菌（acet〇gen)已顯 示在C〇2存在下生長且產生諸如乙酸酯之化合物，前提為 存在氫氣以供應必需之還原相等物（參看例如Drake，

AeiogeweA，第 3-60 頁 Chapman 及 Hall，New York， (1994))。此可由以下方程式概括： 2 C02+4 H2+n ADP+n Pi-^CH3COOH+2 H20+n ATP 因此，具有Wood-Ljungdahl路徑之非天然存在之微生物 155953.doc •37· 201142034 亦可利用C〇2及Η2混合物以便產生乙醯coA及其他所需產 物。

Wood-Ljungdahl路徑為此項技術中熟知且由可分離至 兩個分支中之12個反應組成：（丨）甲基分支及（2)隸基分 支。甲基分支將合成氣轉化為曱基-四氫葉酸（甲基_ THF)，而羰基分支將曱基-THF轉化為乙醯c〇A。甲基分 支中之反應係由以下S#或蛋白質依次催化：鐵氧化還原 蛋白氧化還原酶、曱酸去氫酶、甲醯四氫葉酸合成酶、 甲酿四氫葉酸環脫水酶、亞甲基四氫葉酸去氫酶及亞甲 基四氫葉酸還原酶。羰基分支中之反應係由以下酶或蛋 白質依次催化：曱基四氫葉酸：類咕啉蛋白甲基轉移酶 (methyltetrahydrof〇late:.corrinoid protein methyltransferase) (例如AcsE)、類咕啉鐵硫蛋白、鎳蛋白組裝蛋白（例如 AcsF)、鐵氧化還原蛋白、乙醯c〇A合成酶、一氧化碳去 氫酶及鎳蛋白組裝蛋白（例如CooC)。按照本文提供之關於 引入足夠數目之編碼核酸以產生丙稀路徑之教示及指導， 熟習此項技術者將瞭解，關於引入至少編碼宿主生物體中 不存在之Wood-Ljungdahl酶或蛋白質之核酸，亦可進行相 同工程設計。因此，將一或多種編碼核酸引入本發明之微 生物體中使得經改質生物體含有完整Wood-Ljungdahl路 徑’將賦予合成氣利用能力。 另外’還原性（逆向）三羧酸循環伴隨一氧化碳去氫酶及/ 或氣化酶活性亦可用於將CO、C02及/或112轉化為乙醯CoA 及其他產物’諸如乙酸酯。能夠經由還原性TC A路徑固定 155953.doc -38 - 201142034 奴之生物體可利用-或多種以下酶：ATP檸檬酸解離酶、 檸檬酸解離酶、烏頭酸酶、異檸檬酸去氫酶、戊二 I .鐵氧化還原蛋白氧化還原酶、丁二醯c〇A合成酶、丁 一醯CoA轉移酶、反丁烯二酸還原酶、反丁烯二酸酶 (fumarase)、蘋果酸去氫酶、NAD(p)H:鐵氧化還原蛋白氧 化還原酶、一氧化碳去氫酶及氫化酶。特定言之，利用藉 由一氧化碳去氫酶及氫化酶自c〇及/或Hz提取之還原相等 物經由還原性TCA循環將C〇2固定為乙醯c〇A或乙酸酯。 乙酸酯可藉由諸如乙醯c〇A轉移酶、乙酸激酶/磷酸轉乙醯 酶及乙醯CoA合成酶之酶轉化為乙醯c〇A。乙醯c〇A可藉 由丙酮酸：鐵氧化還原蛋白氧化還原酶及葡糖新生酶轉化 為對曱苯甲酸、對苯二甲酸或（2_羥基_3_曱基_4_側氧基丁 氧基）膦酸前驅體、甘油醛_3_磷酸、磷酸烯醇丙酮酸及丙 嗣S文。按照本文提供之關於引入足夠數目之編碼核酸以產 生對曱苯曱酸、對笨二曱酸或（2_羥基_3_曱基_4_側氧基丁 氧基）膦酸路徑之教示及指導，熟習此項技術者將瞭解， 關於引入至少編碼宿主生物體中不存在之還原性TCA路徑 酶或蛋白質之核酸，亦可進行相同工程設計。因此，將一 或多種編碼核酸引入本發明之微生物體中使得經改質生物 體含有完整還原性TCA路徑，將賦予合成氣利用能力》 因此’由本文提供之教示及指導，熟習此項技術者將瞭 解可產生非天然存在之微生物體，其在諸如碳水化合物之 碳源上生長時分泌本發明之生物合成化合物。此等化合物 包括例如丙烯及丙烯路徑中之任何中間代謝物。僅需要工 155953.doc -39- 201142034 程改造-或多種所需酶或蛋白質活性以達成生物合成所需 化合物或中間物，例如包括一些或所有丙烯生物合成路 仅。因此’本發明提供一種非天然存在之微生物體，其在 碳水化合物或其他碳源上生長時產生及/或分泌丙烯，、且 在碳水化合物或其他碳源上生長時產生及/或分泌丙稀路 徑中所示之任何中間代謝物。本發明之製造丙稀之微生物 體可自中間物例如3_甲基，戊二酸、4_羥基_4_甲基·2_酮 戊二酸、4-亞甲基戊三酸、4•甲基洞戍稀二酸或4· 甲基-2-酮戊二酸起始合成。 本發明之非天然存在之微生物體係使用如本文例示之此 項技術中熟知之方法構築，以外源表現至少-種編碼丙烯 路徑酶或蛋白質之核酸，以足量產生丙稀。應瞭解本發明 之微生物體係在足以產生丙烯之條件下培養。按照本文提 供之教不及指導，本發明之非天然存在之微生物體可達成 物。成丙烯，得到約〇 〇〇1·2〇〇〇 mM之間或更高的細胞 内濃度。一般而言，細胞内丙烯濃度係在約3_l5〇〇 mM之 尤其在約5-125〇111]\4之間，更特別在約8_1〇〇〇111]^之 匕括、，勺 100 mM、200 mM、500 mM、800 mM 或 800 mM以上。在各此等例示性範圍之間及以上之細胞内濃度 亦可由本發明之非天然存在之微生物體達成。 »_ /么一些實施例中，培養條件包括缺氧或實質上缺氧生長 ，隹持條件。例示性缺氧條件先前已描述且為此項技術中 熟知。醱缺·士、丄 哪酵方法之例示性缺氧條件描述於本文中且描述於 7年8月1〇日申請之美國公開案2〇〇9/〇〇47719中。 155953.doc 201142034 任何此等條件以及此項技術中熟知之其他缺氧條件均可用 於非天然存在之微生物體。在此等缺氧或實質上缺氧條件 下，丙烯生產者可以5-1〇 mM或更高的細胞内濃度以及本 文例示之所有其他濃度合成丙烯。應瞭解，儘管上文描述 係指細胞内濃度，但製造丙烯之微生物體可在細胞内產生 丙烯及/或將產物分泌至培養基中。 除本文揭示之培養及醱酵條件外，達成生物合成丙烯之 生長條件亦可包括將滲透保護劑添加至培養條件中。在某 些貫細•例中，本發明之非天然存在之微生物體可如本文所 述在滲透保護劑存在下保持、培養或醱酵。簡言之，滲透 保護劑係指充當滲透劑（OSm〇lyte)且有助於如本文所述之 微生物體經受得住滲透應力之化合物。滲透保護劑包括 (但不限於）甜菜鹼、胺基酸及糖海藻糖。其非限制性實例 為甘胺酸甜菜鹼、堅果糖甜菜鹼、二曱基噻亭 (dimethylthetin)、二曱基二氫硫基丙酸酯、3-二甲基二氫 硫基-2-甲基丙酸醋、2-〇底σ定曱酸（pipec〇ijc acid)、二曱基 二氫硫基乙酸酯、膽鹼、L-肉鹼及四氫嘧啶（ectoine) »在 一個態樣中，滲透保護劑為甘胺酸甜菜鹼。一般技術者應 瞭解’適用於保護本文所述之微生物體不受滲透應力影響 之滲透保護劑的量及類型將視所用微生物體而定。培養條 件中滲透保護劑之量可為例如不超過約〇· 1 mM、不超過約 0.5 mM、不超過約1.〇 mM、不超過約l_5 mM、不超過約 2.0 mM、不超過約2.5 mM、不超過約3.0 mM、不超過約 5.0 mM、不超過約7.0 mM、不超過約10 mM、不超過約50 155953.doc • 41 · 201142034 mM、不超過約1〇()111]^或不超過約5〇〇mM。 *培養條件可包括例如液體培養程序以及醱酵及其他大規 模培養程序。如本文所述，本發明之生物合成產物的尤其 適用產率可在缺氧或實質上缺氧培養條件下獲得。 、 如本文所述，達成生物合成丙烯之一個例示性生長條件 包括缺氧培養或醱酵條件。在某些實施例中，本發明之非 天然存在之微生物體可在缺氧或實質上缺氧條件下保持、 培養或礙酵。簡言之，缺氧條件係指缺乏氧氣之環境。實 質上缺氧條#包括例如料、分批醋酵或連續_，使得 培養基中之溶解氧濃度保持在〇與1〇%飽和度之間。實質 上缺氧條件亦包括使細胞在液體培養基中或在固體瓊脂上 在維持具有小於10/。氧氣之氛圍的密封腔室内生長或靜 止。 氧氣百分比可藉由例如以N2/C02混合物或其他適合之非 氧氣體噴射培養物來維持。 本文所述之培養條件可按比例放大且連續生長以便製造 丙烯。例示性生長程序包括例如分批進料輯及分批分 離；分批進料醱酵及連續分離，或連續醱酵及連續分離。 所有此等方法均為此項技術中熟知。礙酵程序尤其適用於 生物合成產生商業量之丙烯。一般而言，且如非連續培養 程序，連續及/或接近連續產生丙稀將包括在足夠營養素 及培養基中培養本發明之非天然存在之製造丙稀之生物體 以保持及/或幾乎保持指數期生長。在此等條件下之連續 培養可包括例如生長i日、2日、3日、4日、5日、6日或7 155953.doc -42· 201142034 日或7日以上。另外，連續培養可包括1週、2週、3週、4 週或5週或5週以上及至多數月之較長時段。或者，若適用 於特定應用，則可培養本發明之生物體數小時。應瞭解連 續及/或接近連續培養條件亦可包括此等例示性時期之間 的所有時間間隔。應進一步瞭解，培養本發明之微生物體 的時間為足以產生用於所需目的之足量產物的時間段。 此項技術中熟知醱酵程序。簡言之，用於生物合成產生 丙烯之醱酵可用於例如分批進料醱酵及分批分離；分批進 料醱酵及連續分離，或連續醱酵及連續分離。此項技術中 熟知分批及連續醱酵程序之實例。 除使用本發明之丙烯產生物連續產生大量丙烯的上述醱 酵程序外，必要時，丙烯產生物亦可例如同時經受化學合 成程序以將產物轉化為其他化合物，或產物可與醱酵培養 物分離且繼而經受化學或酶促轉化以將產物轉化為其他化 合物。 為產生較佳產生物，可利用代謝模型化最佳化生長條 件。模型化亦可用以設計另外最佳化路徑利用率之基因剔 除（參看例如美國專利公開案US 2002/0012939、US 2003/0224363 、 US 2004/0029149 、 US 2004/0072723 、 US 2003/0059792、US 2002/0168654及 US 2004/0009466及美 國專利第7，127,379號）。模型化分析使得可靠地預測使代 謝朝著更有效產生丙烯的方面偏移對細胞生長之影響。 一種鑑別及設計有利於生物合成所需產物之代謝改變的 計算法為OptKnock計算構架（Burgard等人， 155953.doc -43· 201142034 5z_oe«容.84:647-657 (2003))。OptKnock為代謝模型化及模 擬程式，其提出導致產生過度產生目標產物之基因穩定微 生物的基因缺失或破壞策略。特定言之，該構架檢驗微生 物之完整代謝及/或生化網路以提出迫使所需生化物質變 成細胞生長之專性副產物（obligatory byproduct)的基因操 作。藉由策略性置放之基因缺失或其他功能基因破壞將生 化物質產生與細胞生長聯繫起來，在生物反應器中長時間 段之後，施加於經工程改造細胞株之生長選擇壓力使得效 能因強迫性生長聯合生化物質產生而改良。最後，當構築 基因缺失時’存在以下可忽略之可能性：因為藉由 OptKnock選擇之基因自基因組完全移除，所以所設計之細 胞株恢復至其野生型狀態。因此，此計算法可用以鑑別引 起生物合成所需產物之替代性路徑或與非天然存在之微生 物體關聯用於進一步最佳化生物合成所需產物。 簡言之，OptKnock為在本文中用以指用於模型化細胞代 謝之計算法及系統的術語^ 〇ptKn〇ck程式係關於將特定約 束併入流平衡分析（flux balance analysis ; FBA)模型中之 模型及方法的構架。此等約束包括例如定性動力學資訊、 定性調節資訊及/或DNA微陣列實驗資料。〇ptKn〇ck亦藉 由例如收緊經由流平衡模型產生之流邊界及隨後探測在^ 因添加或缺失存在下代謝網路之效能限度來計算各種代謝 問題之解。optKn〇ck計算構架使得構造模型制定(m〇dei ―)，其使得有效查詢代謝網路之效能限度且提供 解決所得混合整數線性規劃問題之方法。在本文中稱作 155953.doc -44 - 201142034

OptKnock之代謝模型化及模擬方法係描述於例如2002年1 月10曰申請之美國公開案2002/0168654、2002年1月1〇日 申請之國際專利第PCT/US02/00660號及2007年8月10日申 請之美國公開案2009/0047719中。 鑑別及設計有利於生物合成產生產物之代謝改變的另— 計算法為稱為SimPheny®之代謝模型化及模擬系統。此計 算法及系統係描述於例如2 0 0 2年6月14曰申請之美國公開 案2003/023321 8及2003年6月13日申請之國際專利申請案 第PCT/US03/18838號中。SimPheny®為計算系統，其可用 以產生電腦模擬網路模型且經由生物系統之化學反應模擬 質里、能量或電荷流以界定含有系統中化學反應之任何及 所有可能功能之解空間，藉此確定生物系統之允許活性的 範圍。因為解空間係由諸如所包括反應之已知化學計量以 及與通過反應之最大流相關的反應熱力學及能力約束之約 束界定’所以此方法係稱作基於約束之模型化。可查詢由 此等約束界定之空間以確定生物系統或其生化組分之表型 能力及行為。 因為生物系統為靈活的且可以許多不同方式達成相同結 果’所以此等計算法係與生物現實一致β經由已受所有生 物系統均必須面對之基本約束限制的進化機制來設計生物 系統。因此，基於約束之模型化策略涵蓋此等一般現實。 此外’經由收緊約束對網路模型連續施加其他限制之能力 使得解空間尺寸減小，藉此提高可預測生理學效能或表型 之精度》 155953.doc •45· 201142034 考慮到本文提供之教示及指導，熟習此項技術者將能夠 應用代謝模型化及模擬之各種計算構架以設計及實施宿主 微生物體中所需化合物之生物合成。此等代謝模型化及模 擬方法包括例如上文例示為SimPheny⑧及〇ptKn〇ck之計算 系統。為說明本發明，本文參考用於模型化及模擬之 OptKn.ock計算構架來描述一些方法。熟習此項技術者將知 曉如何使用OptKnock將代謝改變之鑑別、設計及實施應用 於此項技術中熟知之任何此等其他代謝模型化及模擬計算 構架及方法。 上述方法將提供一組代謝反應來破壞。消除該組内之各 反應或代謝修飾可在生物體生長期期間產生所需產物作為 專性產物。因為反應為已知的，所以雙層〇ptKn〇ck問題 (bilevel OptKnock problem)之解決方法亦將提供編碼一或 多種在反應組内催化各反應之酶的相關基因。鑑別反應組 及其編碼參與各反應之酶的相應基因一般為自動化方法， 其經由反應與具有酶與編碼基因之間關係的反應資料庫之 關聯來實現。 一旦得到鑑別，欲經破壞以達成產生所需產物之反應組 即在目標細胞或生物體中藉由功能性破壞至少—種編碼該 組内各代謝反應之基因來實施。一種達成功能性破壞反應 組之尤其適用方法為缺失各編碼基因。然而，在一些情況 下，宜藉由調節區（諸如啟動子，或調節因子之順式結合 位點）之其他基因失常（genetic aberration)(包括例如突變、 缺失）或藉由在許多位置中任一處截短編碼序列來破壞反 I55953.doc • 46 · 201142034 應。例如當需要快速評估產物偶合時或當不太可能發生基 因回復（genetic reversion)時，引起小於基因組全部缺失之 此等後述失常可能適用。 為鑑別引起其他反應組實現破壞或代謝修飾（其可引起 生物合成，包括生長聯合生物合成所需產物）之上述雙層 〇PtKn〇Ck問題之其他產生性解決方法（productive solution)，可實施稱為整數切割（imeger euts)之最佳化方 法。此方法藉由在各重複下合併稱作整數切割之其他約束 重複解決上文例示之0ptKnock問題來進行。整數切割約束 有效防止解決過程選擇在強制聯合產物生物合成與生長之 任何先前重複中鑑別的精確相同之反應組。舉例而言若 先前鑑別之生長聯合代謝修飾指定針對破壞之反應丨、2及 3，則以下約束防止在隨後解決方法中同時考慮相同反 應。整數切割法為此項技術中熟知且可見描述於例如 Burgard等人，於17:791 797 (2〇〇1)中如 對於本文中參考用途組合用於代謝模型化及模擬之 OptKnock計算構架描述之所有方法，在重複計算分析中減 少冗餘之整數切割法亦可與此項技術中熟知之其他計算構 架（包括例如SimPheny®)—起應用。 本文例示之方法使得構造以生物合成方式產生所需產物 之細胞及生物體，包括強制聯合目標生化產物之產生與經 工程改造以具有經鑑別基因改變之細胞或生物體之生長。 因此，本文所述之計算法使得鑑別及實施代謝修飾，其由 選自OptKnock或SimPheny®之電腦模擬法鑑別。代謝修飾 155953.doc -47- 201142034 組可包括例如添加一或多種生物合成路徑酶及/或功能性 破壞一或多種代謝反應，包括例如藉由基因缺失來破壞。 如上文所討論，OptKnock方法係在突變型微生物網路當 經受長期生長選擇時可向其計算預測之最大生長表型進化 之前提下開發。換言之，該方法影響生物體在選擇壓力下 自我最佳化之能力。OptKnock構架允許詳盡列舉迫使在生 化物質產生與細胞生長之間基於網路化學計量聯合之基因 缺失組合。鑑別最佳基因/反應剔除需要解決雙層最佳化 問題，其選擇活性反應組，使得所得網路之最佳生長解決 方法過度產生相關生化物質（Burgard等人，价oiec/mo/ 84:647-657 (2003))。 大腸桿菌代謝之電腦模擬化學計量模型可用以鑑別如先 前例示及以下專利中所述之代謝路徑的必需基因：例如美 國專利公開案 US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149 ' US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654 及 US 2004/0009466 ，及美國專利第 7，127,379號。如本文所揭示，OptKnock數學構架可適用於 針尖基因缺失，其引起所需產物之生長聯合產生。此外， 雙層OptKnock問題之解決方法僅提供一 i缺失。為列舉所 有有意義之求解，亦即所有引起生長聯合之產生形成之剔 除組，可實施稱為整數切割之最佳化技術。此要求如上文 所討論在各重複下合併稱作整數切割之其他約束來重複解 決OptKnock問題。 如本文所揭示，可將編碼丙烯路徑之所需活性的核酸引 155953.doc • 48· 201142034 入佰主生物體中。在一些情況下，可能需要修改丙烯路徑 酶或蛋白質之活性以提高丙烯產量。舉例而言，可將提高 蛋白質或酶活性之已知突變引入編碼核酸分子中。另外， 可應用最佳化方法以提高酶或蛋白質活性及/或降低抑制 活性，例如降低負調節劑活性。 種此最佳化方法為定向進化（directed evolution)。定 向進化為—種包括引入靶向特定基因之突變以改良及/或 改良酶特性之強大方法。經改良及/或改變之酶可經由開 發及實施允許自動篩選許多酶變異體（例如>104)之敏感性 门產量篩選檢定來鑑別。通常進行數輪重複之突變誘發及 篩選以得到具有最佳化特性之酶。可有助於鑑別突變誘發 基因區域之計算演算法亦已經開發且可顯著減少需要產生 及篩選之酶變異體的數目。已開發出有效產生不同變異體 庫之眾多定向進化技術（關於回顧，參看Hibbert等人， 〇/·五《尽 22.11-19 (2005) ; Huisman 及 Lalonde，

Biocatalysis m the pharmaceutical and biotechnology industries 第717_742 頁（2〇〇7)，(編），cRC p觀；

Otten及 Quax.价刪/ jEwg22:19 (2〇〇5);及—等人柳/ 出143:212_223 (2〇〇7))，且此等方法已成 功應用於涵蓋許多酶類別之廣泛範圍特性之改良。已藉由 定向進化技術改良及/或改變之酶特徵包括例如：選擇性/ 特異性，針對轉化非天然受質；溫度穩定十生，針對穩固高 溫處理；ΡΗ穩定性’針對在較低或較高阳條件下之生物 處理；受質或產物容限，使得可達成高產物力價；結合 155953.doc •49· 201142034 (Km)，包括加寬受質結合以包 以移除產物、受質或關鍵中間物之抑：又質，抑制⑹’ 1J嗯之抑制；活性（k彳 =酶：反應速率以達成所需流：表現量，以提高蛋白質 及t路役流，氧氣穩定性，針對在有氧條件下操作空 氣敏感性酶；及缺氧活性，針對 卜 対在無氧氣存在下操作好氧 。

下文較詳細地描述已開發用於I 叫％暴因突變誘發及多樣化 乾向特異性酶之所需特性的例示性 』不注方去。此等方法為熟 此項技術者所熟知。任何此等方沐的飞 此寻万去均可用以改變及/或 佳化丙烯路徑酶或蛋白質之活性。 EPPCR(Pritchard 等人’ j rw爲/ 234 497 5〇9 (2005))藉由降低PCR反應中DNA聚合酶之保真度藉由添加 Mn2+離子、藉由偏倚dNTp濃度或藉由其他條件性變化來 引入隨機點突變。將突變誘發限於相關目標基因之五步選 殖法包括：1)易錯PCR擴增相關基因；2)限制酶消化；3) 凝膠純化所需DNA片段；4)接合至載體中；5)將基因變異 體轉型至適合宿主中且針對改良效能篩選庫。此方法可在 單一基因中同時產生多個突變，其可適用於篩選較大數目 之具有所需活性之可能變異體。可藉由EpPCR產生高數目 之突變體，因此例如使用機器人之高產量篩選檢定或選擇 方法適用於鑑別具有所需特徵者。 易錯滾環式擴增（Error-prone Rolling Circle Amplification ; epRCA)(Fujii 等人，办 Λα. 32:el45 (2004);及 Fujii 等人，iWoc. 1:2493-2497 155953.doc -50- 201142034 (2006))具有許多與epPCR相同之元件，但使用整個環狀質 體作為模板且使用在最後2個核苷酸上具有外切核酸酶抗 性硫代磷酸酯鍵之隨機6-聚體來擴增質體，接著將其轉型 至細胞中’其中質體在串聯重複序列處再環化。調節Mn2+ 濃度可稍微改變突變率。此技術使用一種簡單易錯單步法 以產生具有3-4個突變/kbp之質體的完整複本。不需要限制 酶消化或特異性引子。另外，此方法通常以市售套組形式 可得。 DNA或家族改組（Family Shuffling)(Stemmer，/V〇c λ^/ Ad C/M 91:10747-10751 (1994);及 Stemmer， 370:389-391 (1994))通常包括消化兩種或兩種以上具有核 酸酶（諸如Dnase I或EndoV)之變異型基因以產生隨機片段 池其藉由在DNA聚合存在下之黏接及延伸循環來重組 裝以產生嵌合基因庫。片段彼此預致敏（prime)且當一個複 本預致敏另一複本（模板切換）時發生重組。此方法可用於 >1 kbp DNA序列》除片段重組裝產生之突變重組體外，此 方法亦在延伸步驟中以類似於易錯PCR之速率引入點突 變。δ玄方法可用以移除有害、隨機及中性突變。 交錯延伸（Staggered Extension ; StEP)(Zhao等人， 价oiec/mo/ 16:258-261 (1998))要求模板預致敏，接著為2 步PCR(變性）及極短黏接/延伸持續時間（短至5秒）之重複循 環。生長片段黏接於不同模板且進一步延伸，其經重複直 至產生全長序列為止。模板切換意謂大多數所得片段具有 夕個親本。低保真度聚合酶（丁叫與MutaZyme)之組合因相 155953.doc •51· 201142034 反突變譜而減小易錯偏倚。 在隨機預致敏重組（Random Priming Recombination ; RPR)中，使用隨機序列引子來產生與模板之不同區段互補 的許多短DNA片段（Shao等人，iVMc/eic dcz’c/·? Λα 26:681-683 (1998))。經由epPCR實現之鹼基錯併及錯印（Base misincorporation and mispriming)得到點突變。短DNA片段 基於同源性彼此預致敏且藉由重複熱循環重組及重組裝成 全長。在此步驟之前移除模板可確保低親本重組體》此方 法如大多數其他方法可歷經多個重複來進行以進化獨特特 性。此技術避免序列偏倚、與基因長度無關且需要極少親 本DNA以便應用。 在異雙螺旋重組中，使用線性化質體DNA來形成異雙螺 旋，其藉由錯配修復來修復（Volkov等人，iVwc/ek Res. 27:el8 (1999);及 Volkov 等人， 328:456-463 (2000))。錯配修復步驟至少稍微誘突變。異 雙螺旋比線性同雙螺旋（homoduplex)轉型更有效。此方法 適用於大基因及全部操縱子。 過渡模板隨機嵌合發生（Random Chimeragenesis on Transient Template; RACHITT)(Coco等人，iVai. 19:354-359 (2001))採用單股DNA(ssDNA)之Dnase I斷裂及 尺寸分級分離。同源片段在無聚合酶存在下與互補SSDNA 骨架雜交。任何重疊之未雜交片段末端均藉由外切核酸酶 裁減。填充片段之間的間隙，接著接合得到與骨架雜交之 全長不同股之池’其含有U以排除擴增。接著破壞骨架且 155953.doc •52- 201142034 藉由PCR擴增以與不同股互補之新股替代。該方法包括來 自僅一個親本之一股（骨架），而預致敏片段來源於其他基 因；再次選擇親本骨架。因此，不發生親本片段再黏接。 以外切核酸酶修剪重疊片段。另外，此在概念上類似於 DNA改組及StEP。因此，應不存在同輩份物（sibling)、存 在極少非活性物且不存在未改組親本。此技術之優勢在於 產生極少親本基因且相對於標準DNA改組可得到多得多之 交換（crossover) 〇 截短模板重組延伸（Recombined Extension on Truncated template ; RETT)要求在用作模板池之單向ssDNA片段存在 下來自引子之單向生長股的模板切換（Lee等人，J. Mo/ec. (Γαία/γζ··? 26:119-129 (2003))。不使用 DNA核酸内切酶。 單向ssDNA係藉由DNA聚合酶使用隨機引子產生，或藉由 連續缺失使用外切核酸酶產生。單向ssDNA僅為模板且不 為引子。隨機預致敏及外切核酸酶不引入序列偏倚，此適 用於DNA改組/RACHITT之酶促裂解。RETT因為使用正常 PCR條件而非極短延伸，所以可比StEP更輕易最佳化。重 組係作為PCR步驟之分項出現，亦即無直接改組。此方法 亦可因不存在暫停而比StEP更隨機。 在簡併寡核苦酸基因改組（Degenerate Oligonucleotide Gene Shuffling ; DOGS)中，使用簡併引子來控制分子之間 的重組；（Bergquist及 Gibbs, Μο/·5ζ·ο/ 352:191-204 (2007) ; Bergquist 等人，Biomol.Eng 22:63-72 (2005); Gibbs等人，Ge«e 271:13-20 (2001))此可用以控制諸如 155953.doc -53 - 201142034 DNA改組之其他方法使親本基因再生之趨勢。此方法可與 所選基因區段之隨機突變誘發（epPCR)組合。此可為阻斷 親本序列重組之良好方法。不需要核酸内切酶。藉由調節 所產生區段之輸入濃度，可向所需主鏈偏倚。此方法允許 在無限制酶消化物之情況下自無關親本進行DNA改組且允 許選擇隨機突變誘發方法。 用於產生雜交酶之增量截短（Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzyme ; ITCHY)產生具有相關基 因片段之1個驗基對缺失之組合庫（Ostermeier等人，iVoc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562-3567 (1999) ； ^Ostermeier# 尺，Nat. Biotechnol· 17:1205-1209 (1999))。在 2種不同基 因之片上在相反方向中引入截短。將其接合在一起且選殖 該等融合物。此技術不需要2種親本基因之間的同源性。 當ITCHY與DNA改組組合時，將系統稱作SCRATCHY(參 看下文）。兩者之主要優勢在於無需親本基因之間的同源 性；例如經由ITCHY產生大腸桿菌與人類基因之間的功能 融合物。當產生ITCHY庫時，捕捉所有可能之交換。 用於產生雜交酶之硫基增量截短（Thio-Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes ； THIO-ITCHY)類似於ITCHY，但使用硫代磷酸dNTP來產生截短 (Lutz等人，/V'wc/ez’c Λα 29:E16 (2001))。相對於 ITCHY，THIO-ITCHY可更輕易地最佳化，提供更多再現 性及可調性》 SCRATCHY組合用於重組基因、ITCHY及DNA改組之兩 155953.doc -54- 201142034 種方法（Lutz等人，iVoc. iVai/. &ί·. 98:11248- 11253 (2001))。SCRATCHY 組合 ITCHY 與 DNA 改組之最佳 特徵。第一，使用ITCHY在基因片段之間以DNA同源性無 關方式產生廣泛融合物組。接著使此人造家族經DNA改組 步驟以增大交換數目。可將計算預測值用於最佳化中。當 序列一致性在80°/。以下時，SCRATCHY比DNA改組更有 效。 在隨機漂移突變誘發（Random Drift Mutagenesis ; RNDM)中，經由epPCR產生突變，然後篩選/選擇保留可 用活性者（Bergquist等人，•五《g. 22:63-72 (2005))。 接著，將該等突變用於DOGS以在多種活性突變體之間或 在活性突變體與一些其他所需親本之間產生融合物重組 體。經設計以促進中性突變分離；其目的在於針對保留之 催化活性進行篩選而無論此活性高於或低於原始基因中之 活性。當篩選能夠偵測到在背景以上之活性時，RNDM可 用於高產量檢定中。RNDM已在產生多樣性中用作DOGS 前端。該技術強加在改組或其他後續步驟之前之活性要 求；表明中性漂移庫自較小庫產生活性之較高/較快改 良。儘管公開使用epPCR，但此技術亦可應用於其他大規 模突變誘發方法。 序列飽和突變誘發（Sequence Saturation Mutagenesis ; SeSaM)為一種隨機突變誘發方法，其：1)使用隨機併入硫 代磷酸核苷酸及裂解來產生隨機長度片段之池；將此池用 作模板以2)在「通用」驗基（諸如肌苷（inosine))存在下延 155953.doc •55· 201142034 伸；3)複製含肌苷之補體得到隨機鹼基併入且因此得到突 變誘發（Wong等人，/. 3:74-82 (2008); Wong 等人，Jcz’A Λα. 32:e26 (2004);及 Wong等人， 」似/·价oc/zem. 341:187-189 (2005))。使用此技術，可能在 2至3日内使用簡單方法產生大的突變體庫。此技術與dnA 聚合酶之突變偏倚相比為非定向的。此方法之差異使得此 技術與epPCR互補（或為其替代方法）。 在合成改組中，將重疊寡榨苷酸設計為編碼「目標中之 所有基因多樣性」且允許經改組子代具有極高多樣性 (Ness等人，Bz’oiec/mo/· 20:1251-1255 (2002))。在此 技術中，可設計待改組片段。此有助於提高子代之所得多 樣性。可設計序列/密碼子偏倚以使得較遠相關之序列以 接近對於較緊密相關序列所觀察到之速率的速率重組。另 外’該技術不需要實體上具有模板基因。 核苷酸交換及切除技術NexT利用dUTP併入，接著依次 以尿嘧啶DNA醣苷酶及哌啶處理之組合以進行終點DNA斷 裂（Muller等人，iiei· 33:ell7 (2005))。基因 係使用内部PCR引子延伸與校對聚合酶（proofreading polymerase)進行重組裝。改組尺寸可使用不同dUPT:dTTP 比率直接控制。此為使用尿嘧啶併入及裂解之簡單方法的 終點反應。諸如8-側氧基-鳥嘌呤之其他核苷酸類似物可用 於此方法。另外，該技術係以極短片段（86 bp)良好工作且 具有低錯誤率。用於此技術之DNA的化學裂解產生極少未 改組純系。 155953.doc -56· 201142034 在序列同源性無關蛋白質重組（Sequence Homology-independent Protein Recombination ; SHIPREC) 中， 使用連 接子以有助於兩種遠緣或無關基因之間的融合。使用核酸 酶處理來產生兩種基因之間的嵌合體範圍。此等融合物產 生單一交換雜交物庫（Sieber等人，iVai， 19:456-460 (2001))。此技術產生有限類型之改組且需要一 種突變誘發之個別方法。另外，因為無需同源性，所以此 技術可產生具有不同分數之兩種無.關親本基因中每一者的 嵌合體庫。以細菌CP450之血色素結合域融合至哺乳動物 CP450之N端區，藉此測試SHIPREC ;此技術在溶解性較 高之酶中產生哺乳動物活性。 在基因位點飽和突變誘發TM(Gene Site Saturation Mutagenesis™ ; GSSMTM)中，起始物質為含有插入及兩個 引子（其在所需突變位點處簡併）之緊密螺旋dsDNA質體 (Kretz等人，Mei/zoA Ewzywo/. 388:3-11 (2004))。攜帶相 關突變之引子黏接至dna之相反股上之相同序列。該突變 通常在引子中間且每一側側接正確序列之約20個核苷酸。 引子中之序列為NNN或NNK(編碼）及MNN(非編碼）(N=均 為4，K=G、T，M=A、C)。延伸之後，使用Dpnl消化dam-曱基化DNA以消除野生型模板。此技術探索在既定基因座 (亦即一個密碼子）處之所有可能之胺基酸取代。該技術有 助於在沒有無義密碼子之單一位點處產生所有可能之置換 且以相等至接近相等之程度呈現最有可能之對偶基因。此 技術不需要目標酶之結構、機制或域的先前知識。若接著 155953.doc -57· 201142034 進行改組或基因重組裝，則此技術產生含有單一位點向上 突變（single-site up-mutation)之所有可能組合之重組體的 不同庫。已顯示此技術組合適用於50種以上不同酶之成功 進化，以及既定酶中之一種以上特性。 組合性卡S式突變誘發（Combinatorial Cassette Mutagenesis ; CCM)包括使用短寡核苦酸卡匣以用大量可 能之胺基酸序列改變替代有限區域（Reidhaar-Olson等人’ Methods Enzymol. 208:564-586 (1991);及 Reidhaar-Olson 等人，241:53-57 (1988))。使用此技術可能在二或 三個位點處同時取代。另外，該方法測試在有限範圍之位 點處可能序列變化的較大多重性。此技術已用以探索λ抑 制因子DNA結合域之資訊含量。 組合性多重卡S式突變誘發（Combinatorial Multiple Cassette Mutagenesis ; CMCM)基本上類似於CCM，但其用 作較大程式之一部分：1)在高突變率下使用epPCR至2)鑑 別熱點及熱區，接著3)藉由CMCM延伸以涵蓋蛋白質序列 空間之規定區域（Reetz等人，dngew. C/zew. /«i. 40:3 589-3 591 (2001))。如用CCM，此方法可測試目標區域 上事實上所有可能之改變。若連同產生隨機突變及改組基 因之方法一起使用，則其提供產生不同改組蛋白質之優良 方法。此方法將酶之對映選擇性（enantioselectivity)成功提 高51倍。 在增變株技術（Mutator Strains technique)中，條件性h 增變質體在選擇期間允許隨機及自然突變頻率提高20至 155953.doc -58- 201142034 4000倍，且當不需要選擇時阻斷有害突變累積（Selifonova 等人，yip/?/. 67:3645-3649 (2001)) ° it匕 技術係基於質體來源之mMiZ)5基因，其編碼DNA聚合酶III 之突變次單元。此次單元結合於内源DNA聚合酶III，且在 具有該質體之任何株中損害聚合酶III之校對能力。發生廣 泛鹼基取代及框移突變。為有效使用，一旦達成所需表型 即應移除增變質體；此可經由允許質體在41°C消除 (curing)之溫度敏感（ts)複製起點實現。應注意，已探索增 變株很長時間（參看Low等人，乂 Mo/·沿〇/. 260:359-3680 (1996))。在此技術中，觀察到極高自發突變速率。條件特 性將非所需背景突變減到最少。此技術可與適應性進化組 合以提高突變誘發速率且較快速達成所需表型。 劉覽突變誘發（Look-Through Mutagenesis ; LTM)為一種 多維突變誘發方法，其評估及最佳化所選胺基酸之組合突 ^(Rajpal^A » Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:8466-8471 (2005))。不以所有可能之胺基酸變化使各位點飽和，而是 選擇一組九個以涵蓋胺基酸R基團化學之範圍。每個位點 較少變化允許多個位點經此類型突變誘發。經由此方法， 已達成對低奈莫耳濃度至皮莫耳濃度抗體之結合親和力提 高800倍以上。此方法為最小化隨機組合數目之合理方 法，且可藉由極大減少欲篩選純系之數目提高發現改良特 性之能力。此方法已應用於抗體工程改造，特別應用於提 高結合親和力及/或降低解離。該技術可與篩選或選擇組 合0 155953.doc -59- 201142034 基因重組裝為一種DNA改組方法，其可一次應用於多基 因或應用於產生單基因之嵌合體（多突變）之大庫（由

Verenium Corporation 提供之 Tunable GeneReassemblyTM (TGR™)Technology)。通常此技術係與超高產量篩選組合 使用以查詢所欲改良之呈現序列空間。此技術允許與同源 性無關之多基因重組。交換事件之正確數目及位置可使用 經由生物資訊分析設計之片段預定。此技術產生極高程度 之多樣性與事實上無親本基因重組及低量非活性基因。與 GSSM™組合’可測試大突變範圍之改良活性。該方法允 許摻合」及「微調」DNA改組，例如可最佳化密碼子使 用。 電腦模擬蛋白質設計自動化$出c〇 Pr〇tein Design Automation ; PDA)為一種錨定具有特定摺疊之結構上界定 的蛋白質主鏈且搜尋可穩定化摺疊及總體蛋白質能量學之 胺基酸取代之序列空間的最佳化演算法（Hayes等人尸 #如/· 士99:15926_15931 (2〇〇2))。此技術使用 基於電lb模擬結構之烟預測以朝著蛋白質胺基酸變化方面 搜尋結構容限。應用統計力學以計算在各位置處之偶合相 互作用。朝著胺基酸取代方面之結構容限為偶合之度量。 最終，將此技#f設計為產生蛋白質特性之所需修改，同時 維持結構特徵完整性。該方法藉由計算評估大量可能之序 列變異體（1〇且允許過滤該等變異體。選擇待測試序列 變異體係關於基於最有利熱力學之預測。表面上僅穩定性 或與穩定性有關之特性可用此技術有效解決。該方法已成 155953.doc •60- 201142034 功用於一些治療蛋白中，尤其用於工程改造免疫球蛋白。 電腦模擬預測可避免測試相當多可能之變異體。基於現存 三維結構之預測比基於假想結構之預測更可能成功。此技 術可輕易預測及允許多種同時突變之靶向篩選，此篩選因 數目指數增大而不可能用純粹實驗技術實現。 重複飽和突變誘發（Iterative Saturation Mutagenesis ; ISM)包括：1)使用結構/功能之知識來選擇酶改良之可能 位點；2)使用諸如 Stratagene QuikChange(S'tratagene; San Diego CA)之突變誘發方法在所選位點處進行飽和突變誘 發；3)針對所需特性進行篩選/選擇；及4)使用改良之純 系，在另一位點處重新開始且繼續重複直至達成所需活性 為止（Reetz 等人，A/W· Proioc. 2:891-903 (2007);及 Reetz 等人，Jngew. C/zem. /«Λ 五45:7745-7751 (2006))。 此方法為經證明之方法，其確保產生在既定位置處之所有 可能置換以便篩選/選擇。 任何上述突變誘發方法均可單獨使用或以任何組合使 用。另外，定向進化方法中任一者或其組合可與如本文所 述之適應性進化技術聯合使用。 應瞭解，亦在本文提供的本發明之定義内提供不會實質 上影響本發明之各種實施例之活性的修改。因此，以下實 例意欲說明而非限制本發明。

實例I 自2-酮戊二酸或丙酮酸產生丙烯之路徑 本文揭示使用具有將常見代謝物轉化為三碳烯烴（即丙 155953.doc -61· 201142034 稀）所必需之酶的經工程改造非天然微生物來直接產生丙 烯之新穎方法。直接產生丙烯要求使用熟知之乙烯形成酶 (EFE)，其已自例如植物病原體丁香假單胞菌 (he«办之致病變種分離及表徵且顯示將2_ 酮戊二酸轉化為乙稀及二氧化碳（圖1)。使用EFE酶或efe 變異體以類似於轉化2 -酮戊二酸之方式將3 _甲基_ 2 _酮戊二 酸或4-甲基-2-酮戊二酸轉化為丙烯及二氧化碳（圖2之步驟 2及圖3之步驟F) »因此，吾人在本文中將此酶稱作丙烯形 成酶（PFE)。中間物3-甲基-2-酮戊二酸可自2-酮戊二酸經 由S-腺苷甲硫胺酸依賴性甲基轉移酶（諸如由例如弗氏鍵 黴菌/rWke)及其他生物體中之基因^所尸編 碼者）直接形成（圖2之步驟1)。或者，其可如圖4中所描綠 自白胺酸或乙酿乙酸及乙醯Co A形成。中間物4-甲基-2-側 氧基-戊二酸可如下形成：將丙酮酸經醛縮酶催化轉化為4_ 經基-4-曱基-2-酮戊二酸’接著用頻果酸脫水酶之酶或變 異體脫水’隨後用烯酸還原酶或用反丁烯二酸還原酶之酶 或變異體還原（圖3之步驟A-E)。或者，其可如圖5中所描 繪自離胺酸形成。下文提供圖2之步驟1及2及圖3之步驟A-F的酶候選物。 圖2之步驟1描緣2-酮戊二酸甲基轉移酶，其催化2__戊 二酸之曱基化以形成3 -曱基-2-¾戊二酸。此活性可使用由 天藍色鏈黴菌之ywT、玫瑰孢鏈黴菌（加epiomyces 之办ί/及弗氏鏈黴菌之/〆/編碼的酶獲得 (Mahlert等人 ’ J. Am. Chem. Soc，2007，129(39)，12011- 155953.doc ·62· 201142034 12018)。 基因 GenBank寄存編號 GI編號 生物體 glmT NP_627429.1 21221650 天藍色键黴菌A3 (2) dptl ZP_04706744.1 239986080 玫瑰孢鏈黴菌NRRL11379 lptl AAZ23087.1 71068232 弗氏鏈黴菌 若干候選基因可能對3-曱基-2-酮戊二酸（步驟2，圖2)或 4-曱基-2-酮戊二酸（步驟F，圖3)天然顯示PFE活性。若未 顯示，則其可經工程改造以顯示對此等受質之PFE活性。 候選基因包括來自丁香假單胞菌（Pseudomonas syHngae)及 青枯菌之各種細胞株的EFE(Fukuda等人’ Biochem Biophys Res Comm, 1992，188 (2)，826-832 ; Tao等人’ Appl Microbiol Biotechnol，2008，80(4):573-8 ’ Chen 等 人，Int J of Biol Sci，2010，6(1):96-106 ; Weingart等人， Phytopathology，1999，89:360-365)。 基因 GenBank寄存編號 GI編號 生物體 Efe BAA02477.1 216878 丁香假單孢菌菜豆致病變槿PK2 Efe AAD 16443.1 4323603 婉豆細菌性疫病菌 Efe Q7BS32.1 50897474 丁香假單胞菌大豆致病變槿 Efe CAD 18680.1 17432003 青枯菌 圖3之步驟A描繪4-經基-4-甲基-2-酮戊二酸搭縮酶，其 催化兩個丙酮酸分子縮合形成4-羥基-4·甲基-2-酮戊二 酸。以下生物體之基因編碼催化以下之酶：4_羥基_4_甲 基-2-酮戊二酸酸縮酶：赭色假單胞菌NGJUMaruyama等 人，Biosci Biotechnol Biochem，2001, 65(12):2701- 2709)、惡臭假單胞菌（Dagley，Methods Enzymo1，1982, 155953.doc -63- 201142034 90:272-276) 及睾丸酮假單胞菌 ieWwiemWX或睾丸嗣叢毛單胞菌）(providenti等人， Microbiology, 2001 147 (Pt 8)，2157-2167)，及落花生 (Arachis hypogaea)。 基因 GenBank寄存編號 GI編號 生物體 proA BAB21456.3 13094205 赭色假單胞菌NGJ1 Pput一 1361 ABQ77519.1 148510659 惡臭假單胞菌F1 Pput_3204 ABQ79330.1 148512470 惡臭假單胞菌F1 CtCNBl_2744 YP_003278786.1 264678879 睾丸酮叢毛單胞菌 圖3之步驟D描繪4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸脫水酶I，其 使4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸脫水形成4-曱基-2-酮戊烯二 酸。圖3之步驟B描繪4·羥基-4-曱基-2-酮戊二酸脫水酶Π， 其使4-羥基-4-曱基-2-酮戊二酸脫水形成4-亞甲基-2-酮戊 二酸。可應用各種類別之脫水酶以催化此等轉化。下文提 供特定實例且或者可利用EC 4.2.1中之若干其他脫水酶。 舉例而言，一種催化類似轉化之酶為擰蘋酸水解酶 (citramalate hydrolyase)(EC 4.2.1.34)，即一種將2-曱基蘋 果酸天然脫水為中康酸之酶。此酶已在詹氏曱烷球菌中、 在至2-側氧基丁酸之丙酮酸路徑的情形中得到研究，其中 其已顯示具有寬受質特異性（Dreviand等人，J· Bacteri〇1· 189:4391-4400 (2007))。亦在破傷風形梭菌 tetanomorphum)、庳氏庳根蛰（Morganella morganii)、無丙 二酸檸檬酸桿菌中偵測到此酶 活性，其中認為該酶參與麩胺酸降解（Kato及Asano Arch· 155953.doc ·64· 201142034

Microbiol. 168:457-463 (1997))。詹氏甲烷球菌蛋白質序 列不帶有與此等生物體中基因之顯著同源性。下文概括關 於此基因之Genbank資訊。 基因 GenBank寄存編號 GI編號 生物體 leuD 3122345 Q58673.1 廣氏甲烷球菌 另一適用酶為反丁烯二酸水合酶（EC 4.2.1.2)，亦稱為反 丁烯二酸酶，其催化反丁烯二酸可逆性水合至蘋果酸。在 不同氧氣可用性條件下調節由fumA、fumB及fumC編碼之 大腸桿菌之三種反丁烯二酸酶。FumB具有氧氣敏感性且 在缺氧條件下具有活性。FumA在微缺氧條件下具有活 性，且FumC在有氧生長條件下具有活性（Tseng等人，J. Bacteriol. 183:461-467 (2001) ; Woods #A，Biochim· Biophys. Acta 954:14-26 (1988) ; Guest 等人，J. Gen. Microbiol. 131:2971-2984 (1985))。釀酒酵母含有反丁烯 二酸酶編碼基因FUM1之一個複本，其產物定位於細胞溶 質及粒線體中（Sass等人，J. Biol. Chem· 278:45109-45116 (2003))。其他反丁烯二酸酶見於空腸曲桿菌（Smith等人， Int. J. Biochem. Cell. Biol. 31:961-975 (1999))' 極端嗜熱 菌（Thermus thermophilus)(Mizobata 等人，Arch. Biochem. Biophys. 355:49-55 (1998))及褐家鼠（Kobayashi 等人，J. Biochem· 89:1923-1931 (1981))中。具有高序列同源性之 類似酶包括來自擬南芥細胞（Arabidopsis thaliana)之fuml及 來自麩胺酸棒狀桿菌之fumC。來自喜溫醱酵菌之MmcBC 反丁烯二酸酶為另一類別之具有兩個次單元之反丁烯二酸 155953.doc -65- 201142034 酶（Shimoyama 等人，FEMS Microbio1. Lett. 270:207-213 (2007))。下文概括關於此等基因之Genbank資訊。 基因 ___—-- GenBank寄存编號 GI編號 生物體 fumA NP 416129.1 16129570 大腸桿菌 fiunB NP_418546.1 16131948 大腸桿菌 fumC NP_416128.1 16129569 大腸桿菌 FUMl NP_015061 6324993 讓酒酵母 fiimC Q8NRN8.1 39931596 缝胺酸棒狀桿菌 fumC 069294.1 9789756 空腸曲桿菌 fumC P84127 75427690 極端嗜熱菌 fumH P14408.1 120605 MmcB YP_001211906 147677691 喜溫醱酵菌 MmcC YP_001211907 147677692 喜溫醱酵菌 酶OHED水合酶參與4-羥苯基乙酸降解，其中其使用鎮 作為輔因子將2-側氧基-庚-4-烯-1,7-二酸（OHED)轉化為2_ 側氧基-4-羥基-庚-1，7-二酸（HODH)(Burks 等人，j. Am. Chem. Soc. 120 (1998))。已在大腸桿菌 C(Izumi等人，j.

Mol. Biol. 370:899-911 (2007) ; Roper等人，Gene 156:47-51 (1995))及大腸桿菌 w(Prieto 等人，J. Bacterid. 178:111-120 (1996))中鑑別及表徵〇HED水合酶。序列比較 揭示在細菌 '植物及動物範圍内之同系物。尤其在肺炎克 雷伯氏朴菌（91 % —致性’ e值=2e-138)及腸道沙門氏菌 (91%—致性，e值=4e-138)中含有具有高度相似序列之 酶。下文概括關於此等基因之Genbank資訊。 155953.doc -66 - 201142034 基因 GenBank寄存編號 GI編號 生物艘 hpcG CAA57202.1 556840 大腸桿菌C hpaH CAA86044.1 757830 大腸桿菌w hpaH ABR80130.1 150958100 肺炎克雷伯氏桿菌 Sari一01896 ABX21779.1 160865156 腸道沙門氏菌 類似於圖3之步驟D催化脫水之又一酶為真桿菌之2-(羥 曱基）戊二酸脫水酶。此酶已在菸鹼酸分解代謝之情形中 得到研究且由 /zmc?編碼（Alhapel 等人，Proc· iVai/. Jcaif. Sci. C/SJ 103:12341-12346 (2006))。具有高序列同源性之 類似酶見於多毛擬桿菌及jwaeroirwwcw·? co/i/iomz'm··?中。此 等酶亦與含[4Fe-4S]之細菌絲胺酸脫水酶（例如由McG、 以/ιβ及scia儿編碼之大腸桿菌酶）之α-及β-次單元同源。下文 概括關於此等基因之Genbank資訊。 基因 GenBank寄存編號 GI編號 生物體 hmd ABC88407.1 86278275 真桿菌 BACCAPJ2294 ZP_02036683.1 154498305 多毛凝择磨ATCC 29799 ANACOLJ2527 ZP_02443222.1 167771169 Anaerotruncus colihominis DSM 17241 能夠編碼來自圖3之步驟B或步驟D之脫水酶的另一基因 為4-酸草醯基中康酸水合酶（或4-羧基-4-羥基-2-酮己二酸 脫水酶）。例示性酶可見於睾丸酮叢毛單胞菌（Providenti等 人，Microbiology，2001, 147(Pt 8); 2157-67)、鞘胺醇單胞 菌屬 SYK6(Hara等人，J Bacteriol，2000, 182(24);6950-7)， 及豬色假單胞菌 NGJl(Maruyama等人，Biosci Biotechnol Biochem，2001 65(12); 2701-9 ; Maruyama 等人，Biosci 155953.doc -67- 201142034

Biotechnol Biochem，2004，68(7); 1434-41)中 ----

圖3之步驟C描繪4-亞甲基-2-酮戊二酸還原酶，其還原4_ 亞曱基-2-酮戊二酸還原酶以形成4-曱基-2-綱戊二酸。圖3 之步驟E描繪4-曱基-2-酮戊烯二酸還原酶，其還原4_甲基_ 2-酮戊烯二酸以形成4-曱基-2-酮戊二酸。可應用各種類別 之烯酸還原酶以催化此等轉化。下文提供特定實例且或者 可利用EC 1.3.1中之若干其他烯酸還原酶。 已知2-烯酸氧化還原酶催化多種α，β不飽和缓酸及搭之 NAD(P)H依賴性還原及氧化（Rohdich等人，j. Bi〇i. Chem. 276:5779-5787 (2〇01))。在最近公開之科氏梭菌基因組序 列中，報導烯酸還原酶之9種編碼序列，其中一種已經表 徵（Seedorf等人’？1*〇<:.]^3比入〇318<^.1；.8.入.105:2128-2133 (2008))。來自酪丁酸梭菌（C. 與熱乙酸 菌（M i/zermoaceiicwm)之enr基因均已得到選殖及定序且顯 示彼此59% —致性。亦發現前一基因與科氏梭菌中之經表 徵基因具有約 75%相似性（Giesel及 Simon，Arch· Microbiol. 135:51-57 (1983))。基於此等序列結果，已報導e«r極類似 於大腸桿菌中之二稀醯C〇A還原酶(/<a<ii〇(Rohdich等人，J. Biol. Chem. 276:5779-5787 (2001))。熱乙酸梭菌（C. 基因亦已以催化活性形式表現於大腸 155953.doc -68 · 201142034 桿菌中（Rohdich等人，同上文）。下文概括關於此等基因之 Genbank資訊0 基因 GenBank寄存編號 GI編號 生物體 enr AC A54153.1 169405742 肉毒梭菌A3 str enr CAA71086.1 2765041 路丁酸梭菌 enr CAA76083.1 3402834 科氏梭菌 enr YP_430895.1 83590886 熱乙酸菌 fadH NP_417552.1 16130976 大腸桿菌 MAR為催化2-馬來醢乙酸（2-maleylacetate)(順-4-側氧基 己-2-烯二酸）可逆性還原為3-側氧基己二酸之2-烯酸氧化 還原酶（圖2，步驟0)。MAR酶天然參與芳族降解路徑 (Camara等人，J· Bacteriol· 191:4905-4915 (2009) ; Huang 等人 ，Appl· Environ. Microbiol. 72:723 8-7245 (2006); Kaschabek及 Reineke，J. Bacteriol. 177:320-325 (1995); Kaschabek 及 Reineke， J. Bacteriol. 175:6075-6081 (1993))。在假單胞菌屬細胞株B13中鑑別及表徵酶活性 (Kaschabek 及 Reineke，（1995)同上文；Kaschabek 及 Reineke，（1993)同上文），且將編碼基因選殖及定序 (Kasberg等人，J. Bacteriol. 179:3801-3803 (1997))。其他 MAR基因包括來自假單胞菌屬細胞株B13之c/c五基因 (Kasberg等人，同上文）、來自不透明紅球菌之所加」基因 (Seibert等人，J. Bacteriol. 175:6745-6754 (1993))、來自 富養羅爾斯通氏菌（亦稱為鉤蟲貪銅菌）之wacJ基因 (Seibert等人，Microbiology 150:463-472 (2004))、來自富 155953.doc •69- 201142034 養羅爾斯通氏菌之//«^"(Seibert等人’（1993)同上文）及 來自麩胺酸棒狀桿菌之WCgHnAHuang等人’八口口1· Environ Microbiol. 72:7238·7245 (2006))。由 ccfljD編碼之 雷氏假單胞菌M77中之MAR最近得到鑑別且核苷酸序列係 以 DBJ/EMBL GenBank 寄存編號 EF159980 可得（Camara 等 人，J. Bacteriol· 191:4905-4915 (2009))。下文概括關於 此等基因之Genbank資訊0 基因 GenBank寄存編號 GI編號 生物體 clcE 030847.1 3913241 假單胞菌屬細胞株B13 macA 084992.1 7387876 不透明紅球菌 macA AAD55886 5916089 釣蟲貪鋼菌 tfdFII AC44727.1 1747424 富養羅爾斯通氏菌JMP134 NCgllll2 NP_600385 19552383 麵胺酸棒狀桿菌 ccaD EF159980.1 134133935 雷氏假單胞菌ΜΓ1 反丁烯二酸還原酶催化反丁烯二酸還原為丁二酸。由 /rcL45CX>編碼之四個次單元構成的大腸桿菌之反丁烯二酸 還原酶為膜結合的且在缺氧條件下具有活性。此反應之電 子供體為甲基萘醌且此反應中產生之兩個質子不會有助於 質子梯度（Iverson 等人，284:1961-1966 (1999)) 〇 酵母基因組編碼由FRDSl(Enomoto等人，_〇见4 Λα. 3:2(53-257 (1996))及 FRDS2(Muratsubaki 卓人， 352:175-181 (1998))編碼之兩種可溶性反丁烯二 酸還原酶同功酶，FRDS1及FRDS2分別定位於細胞溶質及 前粒線體中且用於葡萄糖上之缺氧生長（Arikawa等人， FEMSMicrobiol. Lett. 165:111-116 (1998)) 〇 155953.doc -70- 201142034 蛋白質 GenBank寄存編號 GI編號 生物體 FRDS1 P326I4 418423 釀酒酵母 FRDS2 NP_012585 6322511 讓酒酵母 frdA NP_418578.1 16131979 大腸桿菌 frdB NP_418577.1 16131978 大腸桿菌 frdC NP—418576.1 16131977 大腸桿菌 frdD NP_418475.1 16131877 大腸桿菌 在整個本申請案中，已參考各種公開案。包括GenBank 及GI編號公開案之此等公開案之全文揭示内容係以引用的 方式併入本申請案中以更完整地描述本發明所屬之目前先 進技術。儘管已參考上文提供之實例描述了本發明，但應 瞭解，可在不脫離本發明精神之情況下進行各種修改。 【圖式簡單說明】 圖1展示2-酮戊二酸藉由乙烯形成酶轉化為乙烯及二氧 化碳。 圖2展示藉由2-酮戊二酸甲基轉移酶及丙烯形成酶自2-酮戊二酸產生丙烯之例示性路徑。 圖3展示自丙酮酸產生丙烯之例示性路徑。用於將經鑑 別受質轉化為產物之酶包括：A)4-羥基-4-曱基-2-酮戊二 酸醛縮酶、B)4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸脫水酶II、C)4-羥 基-4-甲基-2-酮戊二酸脫水酶I、D)4-亞曱基-2-酮戊二酸還 原酶、E)4-甲基-2-酮戊烯二酸還原酶，及F)丙烯形成酶。 圖4展示自白胺酸及乙醯乙酸至3-曱基-2-酮戊二酸之路 徑。用於將經鑑別受質轉化為產物之酶包括：A.白胺酸胺 基轉移酶、去氫酶（去胺基）或氧化酶、B. 4-甲基-2-側氧基 155953.doc -71 · 201142034 戊酸去氫酶、C.異戊醯CoA去氫酶、D. 3-曱基巴豆醯C〇A 羧基酶、E. 3 -曱基戊烯二醯基CoA水解酶、轉移酶或合成 酶、F. 3-甲基戊烯二酸水合酶、G. 3_曱基_2_羥基戊二酸去 氫酶、H. 3-經基-3 -甲基戊二酿Co A脫水酶及I. 3-經基-3 -甲 基戍C ο A解離酶。 圖5展示自離胺酸至4_甲基·2_側氧基戊二酸之路徑。用 於將經鑑別受質轉化為產物之酶包括：Α·離胺酸6胺基轉 移酶、6-去氫酶（去胺基）或6_氧化酶、& 2_胺基己二酸去 氫_、C. 2-胺基己二酸歧化酶、D. 4-甲基胺基戊二酸 胺基轉移酶、去氫酶（去胺基）或氧化酶、Ε. 2_胺基己二酸 胺基轉移酶、去氫酶（去胺基）或氧化酶，及F. 2-側氧基己 二酸歧化酶。 155953.doc -72-

Claims (1)

1. 201142034 七、申請專利範圍： 1. 一種非天然存在之微生物體，其包含具有丙烯路徑的微 生物體，其包含至少一種外源核酸編碼丙烯路徑酶，以 足量表現以產生丙烯，該丙烯路徑包含丙烯形成酶或2· 酮戊二酸曱基轉移酶。 2·如請求項1之非天然存在之微生物體，其中該微生物體 包含兩種外源核酸各編碼丙烯路徑酶。 3. 如請求項1之非天然存在之微生物體，其中該丙烯路徑 包含2-酮戊二酸曱基轉移酶及丙烯形成酶。 4. 如請求項1之非天然存在之微生物體，其中該至少一種 外源核酸為異源核酸。 5 ·如睛求項1之非天然存在之微生物體’其中該非天然存 在之微生物體係於實質上缺氧（anaer〇bic)培養基中。 6_ —種非天然存在之微生物體，其包含具有丙烯路徑的微 生物體’其包含至少一種外源核酸編碼丙烯路徑酶，以 足量表現以產生丙烯’該丙烯路徑包含丙烯形成酶、4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸醛縮酶（aldolase)、4-羥基-4-曱 基-2-酮戊二酸脫水酶η、4-羥基-4-甲基-2-酮戊二酸脫水 酶I、4-亞曱基-2-酮戊二酸還原酶或4-甲基-2-酮戊烯二 酸（ketoglutaconate)還原酶。 7. 如請求項6之非天然存在之微生物體，其中該微生物體 包含兩種外源核酸各編碼丙烯路徑酶。 8. 如請求項6之非天然存在之微生物體，其中該微生物體 包含三種外源核酸各編碼丙烯路徑酶。 155953.doc 201142034 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 如凊求項6之非天然存在之微生物體，其中該微生物體 包3四種外源核酸各編碼丙烯路徑酶。 勹 項6之非天然存在之微生物體，其中該丙烤路徑 匕3 4-羥基_4_曱基_2_酮戊二酸醛縮酶、4-羥基曱 酮戊一酸脫水酶Π、4-亞曱基-2- _戊二酸還原酶及 丙烯形成酶。 ::求項6之非天然存在之微生物體，其中該丙烯路徑 包a 4·羥基_4_曱基_2•酮戊二酸醛縮酶、4_羥基·4_曱 基戊二酸脫水酶〗、4_曱基_2_酮戊烯二酸還原酶及 丙烯形成酶》 如請求項6之非天然存在之微生物體，其中該至少一種 外源核酸為異源核酸。 如請求項6之非天然存在之微生物體，其中該非天然存 在之微生物體係於實質上缺氧培養基中。 種產生丙烯之方法，其包含如請求項1至13中任一項 之非天然存在之微生物體在產生丙烯之條件下培養足以 產生丙烯之時間。 如吻求項Μ之方法，其中該非天然存在之微生物體係於 實質上缺氧培養基中。 155953.doc