KR20130065165A - 만삼 추출물을 포함하는 발모용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 만삼 추출물을 함유하는 탈모 방지 또는 발모용 조성물과 이를 유효성분으로 하는 건강보조식품 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 만삼을 포함한 탈모 치료를 위한 약학적 조성물, 식품 조성물 및 만삼을 열수 추출 또는 유기용매 추출하는 것을 특징으로 하는 탈모 치료제 제조방법에 관한 것이다.

Description

만삼 추출물을 포함하는 발모용 조성물{Composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising the extract of Codonopsis pilosula}

본 발명의 목적은, 만삼 추출물을 이용한 발모 또는 탈모방지 약학적 조성물, 건강보조식품 및 그 조제방법을 제공하고자 함에 있다.

탈모에 대한 명확한 원인은 규명되고 있지 않으며 최근 들어 오히려 탈모증으로 고민하는 사람이 점점 늘고 있으며 그 연령층도 낮아지고 있는 실정이다.

종래의 탈모증 치료방법으로는, 호르몬설과 관련하여 여성 호르몬을 주재로 한 제제가 있으나 효과뿐 아니라 피부 염증 발생, 호르몬 투여에 의한 부작용 발생 등의 보고가 있어 현재는 사용이 중단되고 있다. 발모제로서 미국 업존사의 미녹시딜(minoxidil), 이태리 크리노스(Crinos, Co.)사의 트리코사카라이드 (trichosaccharide)등을 주성분으로 하는 제제가 사용되고 있으나 뚜렷한 효과의 부재 및 부작용 문제가 대두되고 있다. 또한 머크사에서 개발한 피나스테라이드(finasteride)는 전립선 비대증 치료제인 프로스카와 동일 성분으로 모낭에서 남성호르몬 테스토스테론 대사에 작용하는 효소인 5-α-리덕테이즈(5-α-reductase)의 활성을 억제하여 DHT합성을 억제하여 탈모를 방지시키는 물질로 알려져 있으나 우울증을 유발할 수 있으며 이 또한 장기간의 치료가 필요하다는 문제점을 안고 있다. 피나스테라이드를 1mg으로 2년 동안 복용한 환자의 80%가 모발 성장을 했다. 탈모 방지 효과를 위해서는 일생동안 복용해야 하고 그 외에 4.4%정도 부작용이 발생했는데 성기능 감소,정액 감소, 기형아 출산 ,남성의 여성형 유방 의 부작용 보고 되었다.

미녹시딜은 항고혈압약 경구약제로 사용되었으나 복용환자에서 다모증 나타나 탈모증 치료제로 개발되었다. 가장먼저 사용된 무치의 탈모증 치료 도포제 이다. 혈관확장을 통한 영양공급을 촉진시키고 포타슘 채널의 열리게 하는 효과 등이 모발성장을 유도하는 것으로 생각되고 있다. 6-12개월 후에 효과가 나타나기 시작하며 도포를 중단하게 되면 치료이전의 상태로 돌아간다. 부작용으로 두피건조,가려움, 홍반 ,다모증이 있다.

이 외에도 여성 경구 피임제, 시메티딘(cimetidine), 크레시나와 로게인이 있지만, 탈모 질환이 완전히 진행되기 전인 정상 두피에 모근이 살아있는 경우에만 사용된다. 이처럼 종래의 여러 종류의 발모제는 일반적으로 두피의 혈행 촉진과 모근의 영양공급을 목적으로 하여 모발의 성장에 도움을 주도록 하는 방법이 시도되었으나 이 역시 독성과 부작용이 심하고 그 효과 또한 미흡한 것이 현재 실정이다.약물이외에 모발이식수술, 두피관리 프로그램, 식이요법 ,자연요법, 가발등 다양한 방법이 시도되고 있으나 획기적인 탈모치료방법은 아직 발견하지 못하고 있다.

모발 건강의 중요 인자들은 첫째 모유두의 건강, 둘째 남성 호르몬 작용의 억제, 셋째 두피의 혈행개선 등을 들을 수 있다. 이러한 세 가지 작용들은 세포대사 단계에서 증가여부를 표식인자들로 확인할 수 있는데 예를 들면 IGF-1, VEGF, 넥신(NEXIN), TGF-β1, 안드로겐 수용체 등이 있다.

모유두의 건강에 관여하는 표식인자들은 IGF-1,NEXIN,TGF-β1, 남성호르몬 작용은 안드로겐 수용체 두피의 혈행에 관여하는 인자는 VEGF 등으로 정리할 수 있다.

IGF-1 (insulin-like growth factor) 성장호르몬의일종으로성장기모발을유지하는데관여 한다. 성장호르몬의 일종으로 간및 연골조직등의 말초조직에서 분비되어 연골의 성장을 자극한다. 소마토메딘즉 인슐린 성장인자 (IGF) 에는 IGF-1과 IGF-2가있는데, IGF-1이 훨씬 더 성장호르몬에 의존적이다. 그외에 노화방지,치매와 우울증개선,당뇨병이나 고혈압 등의 생활습관병 예방, 면연력증가 및 골밀도의 상승,피부노화방지에 도움이 된다.이 호르몬의 기능은 성장이 완료된 성인에서 근육섬유보다는 결체조직(인대,콜라겐(교원질)) 등을 증가시키고 근력의 증가와 함께 지방분해를 촉진시킨다. IGF-1은 체지방을 감소시켜 군살없는 몸을 만들고 뼈,근육,신경조직 들을 형성하며 손상된 세포를 재생시키는 역할을 한다. 특히 IGF-I을 직접적으로 공급해 줌으로써 GH와 다른 호르몬들을 분비하고 조절하는 뇌하수체의 노화를 지연시키고 정상적인 작용을 도와준다.탈모의 주원인인 모발의 휴지기상태에서 성장기 상태로 변환을 유도하여 탈모 치료에 사용된다.

VEGF (Vascular endothelial growth factor) 세포발생 및 분화촉진, 모낭과 모발의 크기를 증가시킨다. 모세혈관에서 혈장 단백질 투과를 증가시키는 사이토카인으로 세포의 분열과 이동을 촉진시킨다. 세포의 재구성을 일으키는 단백질 분해효소를 유도하는 기능이 있다. 세포의 소멸의 억제를 통해 새로 형성된 혈관의 생존을 유지시키며 신경 세포의 항원 제공을 억제하여 면역 조절을 담당하여 세포의 생장 및 분열을 유도한다. 혈관 세포의 이동을 촉진시켜 새로운 세포의 발생 및 분활를 촉진시켜 피부의 구성을 증가시킨다.

넥신은 모유두 세포에서만 발견되는 모유두 세포 표식의 유전자이다.

TGF-β1 (Transforming growth factor -β1)는 인체모낭에서 세포고사와 관련된 대표인자이다. 세포 고사는 모낭 주기과정에서 모발이 성장을 멈추고 퇴행기로 들어가는 과정에서 핵심요소이다. 실제로 생쥐모델에게 TGF-β1 을 투여했을때 모낭증식이 감소되고 세포고사가 증가되어 조기에 퇴행기가 발생하였다. 또한 탈모부인 두정부에서 안드로겐 호르몬에 의해 모유두 세포로부터 TGF-β1의 분비가 유도되고 분비된 TGF-β1에 의해 모낭상피세포의 세포고사가 일어남을 보고한 바 있으며 비 탈모부위에서 IGF-1의 분비가 증가함에 따라 모낭상피세포의 증식이 일어나는 것이 보고 되었다.

안드로겐 수용체(Androgen receptor)는 탈모의 원인인 안드로겐을 측정하기 위하여 수용체 단백질 확인하는데 남성호르몬인 테스토스테론은 모근 세포내에 존재하는 5a-환원효소에 의하여 DHT(dyhydrotestosterone)으로 전환되는데 DHT는 호르몬 활성도가 테스토스테론보다 10배가 강하며 이 물질은 모낭의 안드로겐 수용체와 결합하여 단백질 합성을 지연시켜 모낭의 성장기가 단축되어 빨리 휴지기로 들어가게 되어 모주기가 짧아지게 되게 된다. 이러한 과정으로 모발은 점차 가늘게 되고 탈락되게 한다.

특허출원번호 10-2010-0027688호에서는 인삼 사포닌 대사체 중의 하나인 D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물에 대해 개시하고 있다.

특허출원번호 10-2011-0125722호에서는 녹나무 추출물을 이용한 발모 촉진 조성물에 대해서 기재하고 있다.

특허출원번호 10-2011-0109288호에서는 대나무잎, 솔잎, 회잎나무잎, 측백잎 및 엉컹귀를 포함하는 추출물을 고구마를 발효하여 얻은 에탄올을 이용한 발모 촉진제에 대해 개시하고 있다. 이 이외에도 복령(특허출원번호 10-2011-0072636호), 녹차, 솔잎, 장뇌, 반묘, 용뇌, 감초 추출물(특허출원번호 10-2011-0087361호), 섬오갈피나무 추출물(특허출원 10.2010-0118365호), 더덕 추출물(10-2010-0116882호) 등 다양한 식물에서 발모 촉진용 조성물에 대해 알려져 있다.

특허출원 10-2006-0116483호에서는 만삼추출물을 이용한 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 대하여 개시하고 있다. 그러나, 만삼이 발모촉진에 효과적이라는 기재는 어디에도 발견되고 있지 않다. 본 발명자는 만삼의 추출물이 발모 촉진 또는 탈모방지에 효과적인 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 만삼 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

일반적으로 본 발명에 따른 탈모 치료용 조성물은 임상투여시에 경구 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 발모 또는 탈모 치료용 조성물은 실제 임상투여시에 경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명에 따른 항염증 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제,보존제 등이 포함될 수 있다.

만삼은 대한민국의 강원도, 경상남도에서 자생 한다. 만삼은 적혈구를 증가시키고 백혈구를 감소시키며, 면역력증강, 강장작용, 위산과다로 인한 소화성궤양등의 치료제로 민간에서 사용되어 왔다. 또한, 만삼은 인삼의 부작용이 있는 사람에게 인삼대용으로 사용되어온 약재이다 (박종희, 이정규, 상용 약용 식물도감, p115, 도서출판 신일상사(2000)). 만삼은 (Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf.) 도라지科(Campanulaceae )의 여러해살이 풀이며, 그 뿌리를 특히, 만삼(蔓蔘)이라고 한다. 중국에서는 코도높시스, 필로술라 (C. pilosula (Franch.) Nannf.) 및 코도높시스. 탕셈 (C. tangshem Oliv)의 뿌리를 건조한 것을 만삼(蔓蔘)이라고 하지 않고, 당삼이라고 하며, 전자를 서당, 후자를 천당이라고 한다.

한편, 본 명세서에서 용어 "만삼 추출물"은 만삼의 다양한 기관 (예: 잎, 꽃, 줄기 및 뿌리 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 만삼의 뿌리로부터 얻은 추출물을 의미한다.

본 발명에서의 만삼 추출물은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 얻어질 수 있고, 바람직하게는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 아세톤, (d) 에틸 아세테이트, (e) 클로로포름 또는 (f) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 만삼으로부터 얻은 것이다. 상기 추출 용매의 적합한 양은 만삼 건조 중량의 1-20 배이다.

한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출용매 뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 만삼 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.

또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 만삼 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명의 만삼 추출물은 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 제 2의 태양은 만삼을 포함한 발모 또는 탈모 치료를 위한 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 발모 또는 탈모 치료용 조성물을 식품으로 사용할 경우, 본 발명에 따른 발모 또는 탈모 치료용 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 발모 또는 탈모 치료용 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 각종 음료수, 차, 드링크제, 비타민 복합제, 아이스크림 및 소세지 등이 있고, 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 제 3의 태양은 만삼으로부터 발모 또는 탈모 치료용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 보다 상세하게는 만삼을 열수 추출 또는 유기용매 추출하는 것을 특징으로 하는 발모 또는 탈모 치료제 제조방법을 제공한다. 보다 바람직하게는 만삼을 알코올에 담구어 용출하는 단계; 상기 용출된 용출물을 여과하는 단계; 및 상기 여과물을 감압농축하는 단계를 포함하는 탈모 방지 또는 발모촉진용 조성물 생산방법를 제공한다. 상기 알코올은 이에 제한되는 것은 아니나 저급 알코올일 수 있으며, 가장 바람직하게는 에탄올이다. 상기 에탄올의 농도는 이에 제한되는 것은 아니나 30 내지 50%의 에탄올일 수 있다.

본 발명에 따른 만삼 추출물은 탈모 방지 및 발모 촉진에 효과적이다. 본 발명에 따른 만삼 추출물은 항산화에 효과적이다.

도 1은 만삼(Codonopsis pilosuala)를 처리 한 쥐에서 17일 후에 털이 자라는 것을 보이는 것을 보인다. CP; 3mg; Codonopsis pilosuala, CP 6 mg: Codonopsis pilosuala, PC; finasteriide 1㎍/ml 음성대조구(NC); 물
도 2는 Codonopsis pilosuala가 VEGF의 mRNA 발현에 미치는 효과를 보인다. DP 세포를 Codonopsis pilosuala 50㎍/ml, Codonopsis pilosuala 100㎍/ml, PC (finasteride 1㎍/ml) 및 NC(배지만 처리)로 처리하였다. 24시간 후에, 전체 RNA를 추출하였고 상대적인 mRNA 양을 RT-PCR를 이용해서 측정하였다.
도 3는 Codonopsis pilosuala가 넥신의 mRNA 발현에 미치는 효과를 보인다. DP 세포를 Codonopsis pilosuala 50㎍/ml, Codonopsis pilosuala 100㎍/ml, PC (finasteride 1㎍/ml) 및 NC(배지만 처리)로 처리하였다. 24시간 후에, 전체 RNA를 추출하였고 상대적인 mRNA 양을 RT-PCR를 이용해서 측정하였다.
도 4는 Codonopsis pilosuala가 IGF-1의 발현에 미치는 효과를 보인다. DP 세포를 Codonopsis pilosuala 50㎍/ml, Codonopsis pilosuala 100㎍/ml, PC (finasteride 1㎍/ml) 및 NC(배지만 처리)로 처리하였다. 24시간 후에, 전체 RNA를 추출하였고 상대적인 mRNA 양을 RT-PCR를 이용해서 측정하였다.
도 5는 Codonopsis pilosuala가 TGF-β1의 발현에 미치는 효과를 보인다. DP 세포를 Codonopsis pilosuala 50㎍/ml, Codonopsis pilosuala 100㎍/ml, PC (finasteride 1㎍/ml) 및 NC(배지만 처리)로 처리하였다. 24시간 후에, 전체 RNA를 추출하였고 상대적인 mRNA 양을 RT-PCR를 이용해서 측정하였다.
도 6은 21째 되는 날에 C58BL/6 숫놈 쥐의 털이 제거된 표피에 NC(배지),Codonopsis pilosuala(CP) 3mg 및6 mg를 급이한 후 넥신의 발현을 비교한 것이다.
도 7은 Codonopsis pilosuala가 안드로겐 수용체의단백질 발현에 대한 효과를 보인다. DP 세포를 Codonopsis pilosuala 50㎍/ml, Codonopsis pilosuala 100㎍/ml, PC (finasteride 1㎍/ml) 및 NC(배지만 처리)로 처리하였다. 24시간 후에, 단백질을 추출하고, 단백질 수준을 웨스턴 블랏을 이용하여 측정하였다.
도 8은 Codonopsis pilosuala가 IGF-1 단백질 발현에 대한 효과를 보인다. DP 세포를 Codonopsis pilosuala 50㎍/ml, Codonopsis pilosuala 100㎍/ml, PC (finasteride 1㎍/ml) 및 NC(배지만 처리)로 처리하였다. 24시간 후에, 단백질을 추출하고, 단백질 수준을 웨스턴 블랏을 이용하여 측정하였다.
도 9는 C58BL/6 쥐 Codonopsis pilosuala 모델에서 안드로겐 수용체 단백질의 발현효과를 보인다.
도 10은 C58BL/6 쥐 Codonopsis pilosuala 모델에서 IGF-1 단백질의 발현효과를 보인다.
도 11은 C58BL/6 쥐 Codonopsis pilosuala 모델에서 VEGF 단백질의 발현효과를 보인다.
도 12는 DPPH 분석을 이용하여 Codonopsis pilosuala 추출물의 스캐밴징(Scavenging) 효과를 보인다.

실시예 1 만삼에 의한 발모 효과 확인

재료 및 방법

1. 실험동물

6주령의 C57BL/6 수컷 쥐를 (주)샘타코(오산, 한국)에서 구입하여 한 케이지에 여섯 마리씩을 넣어 1주일간의 적응기간을 두었다. 온도는 23±3℃, 상대습도 50±10%, 12시간 조명 주기 하에 식이와 식수를 자유로이 섭취할 수 있게 하였다.

2. 시료의 준비

본 실험에서는 천연물을 추출 건조하여 식수에 혼합하여 급수하였다. 사용한 만삼 및 다른 천연물들은 경동시장에서 구입하여 사용 하였으며 양성 대조구(positive control)로 사용된 피나스테리드는 시그마에서 구입하여 사용하였다. 천연물은 중량의 각 열배가 되는 40% 에탄올에 담궈 48시간 동안 용출 하였다. 용출 된 천연물은 여과과정을 거친 후 감압농축기를 사용하여 농축 하였다. 농축된 시료는 동결건조기를 이용하여 72시간 동안 건조 시켰으며 건조된 분말을 -70℃에 보관하여 실험시 사용 하였다.

3. 시료의 투여

Zoletil 50(버박코리아, 한국)을 5mg/kg을 근육주사(1cc/kg)한 후에 소형동물용 클리퍼를 이용하여 피부에 손상이 가지 않게 주의하며 등부위의 털을 1차적으로 제거하였다. 미세한 털을 제거하기 위하여 제모제(비트, 옥시제킷벤키저)를 피부에 도포한 후 3분 뒤 닦아내어 털을 완전히 제거 한 후 흐르는 물을 이용하여 남은 제모제를 수세 하였다. 이 후 하루동안의 적응기를 거친 후 각 군당 6마리를 배치하여 대조군(NC), 양성 대조군(PC), 실험군 1, (CP 3mg), 실험군 2(CP 6mg)의 4군으로 나누었다.대조군은 100% 물을 급수하였으며 양성 대조군에는 2ug/ml의 피나스테리드를, 실험군 1에는 0.6mg/ml의 만삼추출물, 실험군 2에는 1.2mg/ml의 만삼 추출물을 식수에 혼합하여 급수하였다. 고형사료는 시중에 판매하는 쥐용 정상고형사료(샘타코, 한국)을 급이하였다. 실험 기간 동안 매일 일정한 시간에 식수 섭취량을 측정하였다.

4. 육안적 발모 관찰

제모제를 사용하여 털을 완전히 제거한 날을 실험 1일째로 정하여 발모 정도와 상태를 관찰하기 위하여 1주일 간격으로 디지털 카메라(소니, 일본)을 사용하여 촬영하였다. 1주일 간격 외에 각 그룹의 발모 차이가 확연히 드러나는 17일차에 촬영을 하였다.

5. 조직 적출

시료를 급수한 후 25일째에 쥐를 경추탈골법을 이용하여 희생시켰다. 이 후 발모된 털을 제거 한 뒤에 등의 일정한 부위에서 각 개체별로 피부 조직을 적출 한 후 액체질소로 급냉하여 보관하였다.

6. 모유두세포의 분리 및 만삼 처리

본 실험에서 사용된 모유두세포는 생후 1일된 랫드의 등 피부 조직을 해부칼로 잘라 낸 후 잘게 분해하였다. 분해된 피부 조직은 200unit/ml의 collagease I용액을 첨가하여 4시간 동안 37℃ 배양기에서 회전시키면서 반응 하였다. 반응이 끝난 조직 용액으로부터 세포가 분리 될 수 있도록 1분간 송풍 시킨 후 20분간 실온에서 정치 하였다. 이 후 상층액을 histopaque 1083(Sigma, 미국)위에 조심스럽게 올려 준 후 원심분리하였다. 원심분리 후 중간 세포 층을 취하여 10% fetal bovine serum, 100unit/ml penicillin, 100ug/ml streptomysin이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's 배지(Hyclone, 미국)을 사용하여 5% CO₂, 37℃ 조건하에 배양하였다. 배양한 DP cell을 100mm dish에 5X10⁴/ml의 농도로 분주 하여 24시간 동안 배양한 후 피나스테리드 1ug/ml, 만삼 50ug/ml, 만삼 100ug/ml의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양한 후 다음 실험에 이용하였다.

7. 세포에서 유전자 발현 변화 탐색

mRNA 수준에서의 유전자 발현을 탐색하기 위하여 RNA를 분리하기 위한 작업은 RNase의 오염이 없는 환경에서 진행하였다. 배양한 세포는 PBS를 이용하여 3회 세척 한 후 RNAqueous(Ambion, 미국)을 이용하여 제공된 방법에 준하여 RNA를 분리하였다. RNA는 230nm, 260nm, 280nm에서 O.D를 측정하여 유기용매의 오염과 단백질 오염 정도를 확인 하였으며 RNA의 양을 확인하였다. 농도 계산이 끝난 RNA는 1% agarose gel을 이용하여 100v에서 30분간 전기영동을 하여 RNA를 확인 하였으며 다음 실험 전까지 -70에서 보관하였다. RNA는 다시 cDNA로 합성 하였다. RNA 2ug과 oligo dT 1ug을 넣고 총 양이 11ul가 되게 D.W로 맞춘다. 70℃에서 5분 반응 시킨 후 얼음에서 5분을 두면서 식힌다. AMV Reverse Transcriptase 5X reaction buffer(promega. USA) 5ul, 10mM dNTP 2.5ul, AMV RT(promega. USA) 3ul를 넣고 D.W로 총 양을 25ul로 맞춘 후 42℃에서 60분 반응시키며 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 다음 실험 전까지 -20℃에서 보관하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 reverse trascription PCR을 수행 하였다.

8. 조직에서 유전자 발현 변화 탐색

-70℃에 보관된 피부 조직을 막자사발과 막자를 이용하여 액체질소로 냉동상태를 유지시킨 후 갈아주었다. 가루 상태가 된 조직에 RNAqueous에 포함된 lysis buffer를 넣어 준 후 다음 과정은 제공된 방법에 따라 RNA를 분리 하였다. RNA는 230nm, 260nm, 280nm에서 O.D를 측정하여 유기용매의 오염과 단백질 오염 정도를 확인 하였으며 RNA의 양을 확인하였다. 농도 계산이 끝난 RNA는 1% agarose gel을 이용하여 100v에서 30분간 전기영동을 하여 RNA를 확인 하였으며 다음 실험 전까지 -70℃에서 보관하였다. RNA는 다시 cDNA로 합성 하였다. RNA 2ug과 oligo dT 1ug을 넣고 총 양이 11ul가 되게 D.W로 맞춘다. 70℃에서 5분 반응 시킨 후 얼음에서 5분을 두면서 식힌다. AMV Reverse Transcriptase 5X reaction buffer(promega. USA) 5ul, 10mM dNTP 2.5ul, AMV RT(promega. USA) 3ul를 넣고 D.W로 총 양을 25ul로 맞춘 후 42에서 60분 반응시키며 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 다음 실험 전까지 -20℃에서 보관하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 reverse trascription PCR을 수행 하였다.사용되어진 마우스 유전자를 위한 프라이머의 올리고뉴클레오타이드의 서열을 표 1에 나타내었다.

Gene symbol	Primer sequence	Annealing temperature ( 0 C)	Product length ( bp )
GAPDH	F; 5-CAACTCCCTCAAGATTGTAGC-3 (서열번호 1) R; 5-GGGAGTTGCTGTTGAAGTCACA-3 (서열번호 2)	56	499
VEGF	F; 5-TCTTCAAGCCATCCTGTGTC-3 (서열번호 3) R; 5-GCGAGTCTGTGTTTTTGCAG-3 (서열번호 4)	58	297
NEXIN	F; 5-CCACGCAAAGCCAAGACGAC-3 (서열번호 5) R; 5-GAAACCGGCCTGCTCATCCT-3 (서열번호 6)	58	205
IGF-1	F; 5-AGAGACCCTTTGCGGGGCTGA-3 (서열번호 7) R; 5-CTTCTGAGTCTTGGGCATCT-3 (서열번호 8)	58	255
TGF -β1	F; 5-TGGACCGCAACAACGCCATCTATGAGAAAACC-3 (서열번호 9) R; 5-TGGAGCTGAAGCAATAGTTGGTATCCAGGGCT-3 (서열번호 10)	61	258

9. 세포에서 단백질 발현 변화 탐색

세포에서 단백질을 분리하기 위해 배양된 세포에 PRO-PREP protein extraction solution(Intron biotechnology, 한국)을 이용하였으며 제조사에서 제공된 방법을 따랐다. 분리된 단백질은 Brad ford assay를 이용하여 정량 하였으며 정량한 단백질을 이후 실험에 사용하였다. 20ug의 단백질을 4-12% gradient SDS-PAGE gel에 전기영동하고 PVDF paper로 이동 시킨 다음 5% skim milk로 1시간동안 blocking하고 primary antibody(β-actin, VEGE, Androgen receptor, IGF-1, Abcam, 미국)는 5% skim milk에 희석하여 4에서 8시간동안 반응하였다. 이 후 1X PBST로 세척 후 secondary antibody를 1시간동안 반응 시킨 후 암실에서 현상하였다.

10. 조직에서 단백질 발현 변화 탐색

-70℃에 보관된 피부 조직을 막자사발과 막자를 이용하여 액체질소로 얼리면서 갈았다. 가루 상태가 된 조직에 PRO-PREP protein extraction solution(Intron biotechnology, 한국)을 이용하였으며 제조사에서 제공된 방법을 따랐다.

분리된 단백질은 Brad ford assay를 이용하여 정량 하였으며 정량한 단백질을 이후 실험에 사용하였다. 20㎍의 단백질을 4-12% gradient SDS-PAGE gel에 전기영동하고 PVDF paper로 이동 시킨 다음 5% skim milk로 1시간동안 blocking하고 primary antibody(β-actin, VEGE, Androgen receptor, IGF-1, abcam, 미국)는 5% skim milk에 희석하여 4에서 8시간동안 반응하였다. 이 후 1X PBST로 세척 후 secondary antibody를 1시간동안 반응 시킨 후 암실에서 현상하였다.

11. DPPH 라디칼 소거효과

DPPH(1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 150μM이 되게 각각 넣은 후 만삼 추출물을 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, 600, 800, 1000㎍/ml씩 혼합하였다. 그 후 30분 실온에서 차광한 후 방치하였다. 96well plate에 200㎕씩 넣어 517nm에서 측정하여 흡광도를 측정하였다.

12. 통계 처리

모든 자료는 평균±표준편차 이며, 통계학적 유의성 검정은 student t test에 의하여 검정하였다. P값은 P<0.05에하에서 유의성이 있는 것으로 인정하였다.

13. 만삼이 육안적인 모발 성장에 미치는 영향

제모 한 후 7일째 까지는 각 군의 차이는 발견되지 않았다. 제모 후 10일 정도에는 피부색이 푸른색, 검은색등으로 변화가 되기 시작하여 생장기로 전환됨을 알 수 있었다. 제모 후 14일경부터 발모가 시작 되었으며 17일경에 발모속도의 뚜렷한 차이를 확인 할 수 있었다. 17일경에 NC는 6마리 중 5마리에서 뚜렷한 피부의 변화가 관찰되었으나 나머지 한 마리에서는 변화가 미미 하였다. 그에 반해 PC에서는 6마리 중 6마리 전부에서 발모가 관찰되었다. 만삼을 투여한 군인 CP 3mg과 CP 6mg에서는 한 그룹의 6마리 중 6마리 모두에서 발모가 왕성하게 일어남을 육안으로 관찰 할 수 있었다(도 1 참조)

14. 만삼이 세포에서 유전자 발현에 미치는 영향

만삼의 처리가 모유두세포에서 발모와 관련 있는 유전자에 미치는 영향을 알아 보기 위해 RT-PCR을 수행 한 결과는 다음과 같다. Vascular endothelial growth factor(VEGF)는 혈관 생성에 관여하는 대표적인 성장인자로서 모발의 생장기에 강하게 발현되며 발모 개선에 긍정적인 효과를 준다. (Lachgar S, Charveron M, Cernti I et al.,1996 Distribution of VEGF mRNA in different hair follicle stage by fliorecence in situ hybridization combined with confocal laser microscopy, 20, 40-412) 본 실험에서 만삼을 세포에 처리 한 후 VEGF의 발현 정도를 보았을 때 NC에 비교해서 만삼 100㎍/ml의 농도로 처리 했을 때 발현양이 111%로 약 11%가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.(P=0.2) (도 2 참조).

Nexin은 모유두세포에서 특이적으로 발현되며 생장기를 유지 시켜 준다(Michadl Rendl, Lisa Lewis, Elain Fuchs, 2005. Molecular dissection of mesenchymal-epithelial interactions in the hair follicle, 3, 910-1924). 따라서 nexin이 발현되면 모유두 세포임을 확인 할 수 있다. 본 실험에서 nexin은 발현이 되었으므로 모유두세포임을 확인 할 수 있었다.(도 3 참조).

IGF는 대표적인 성장인자로 모유두세포에서는 insulin-like growth factor binding protein-3와 결합하여 모발 성장을 촉진 시킨다(Joan R. Hembree, Charles S.Harmon, Thomoas D. Nevins and Richard L. Eckert, 1996, Regulation of human dermal papilla cell production of insulin-like factor binding protein-3 by retinoic acid, glucocorticoides, and insulin-like growth factor-1, 167, 556-561). 본 실험에서 만삼을 모유두세포에 처리하여 IGF-1의 발현양을 보았을 때 피나스테리드를 처리한 PC와 만삼을 처리한 세포에서 모두 발현이 증가 하였다. PC에서는 NC에 비해 155%가 증가 하였으며 만삼 50㎍/ml에서는 121%가 증가 하였고 만삼 100㎍/ml에서는 131%가 증가 하였다. (도 4 참조).

세포사멸(Apoptosis)를 촉진하는 cytokine인 transforming growth factor β1(TGF-β1)은 모발의 퇴화기에 발현이 된다. TGF-β1은 NC에 비해 PC 및 만삼 처리군에서 각각 75%, 70%, 54%로 감소하는 경향을 보였다. 특히 만삼 100㎍/ml에서 NC보다 통계적으로 유의한 감소결과를 나타내었다.(P<0.05) (도 5 참조)

15. 만삼이 피부조직에서 유전자 발현에 미치는 영향

만삼의 투여가 쥐의 피부 조직에서 발모에 영향을 미치는 유전자의 발현 변화를 살펴보고자 하였다. 피부 조직에서는 nexin 유전자의 발현을 확인 할 수 있었다. NC와 만삼 3mg 투여군, 만삼 6mg 투여군에서 nexin이 발현 되었으며 이는 피부 조직의 모유두 세포가 정상적인 활동을 함을 보여 주었다.(도 6 참조).

16. 만삼이 세포의 단백질 발현에 미치는 영향

만삼을 처리한 모유두 세포에서 단백질 발현을 확인하기 위해서 western blot 방법을 이용하여 측정하였다. 탈모의 한 원인으로 지목 받고 있는 androgen을 측정하기 위하여 androgen receptor 단백질을 확인하였다. 피나스테리드를 처리한 PC에서는 androgen receptor의 발현이 0.9로 감소 됨을 확인 할 수 있었으며 만삼 50㎍/ml을 처리한 모유두세포에서는 발현이 1.0으로 NC와 발현양이 비슷함을 확인 할 수 있었다. 만삼 100㎍/ml을 처리한 세포에서는 androgen receptor의 발현양이 1.09로 증가함을 확인 할 수 있었다. (도 7 참조).

모유두세포에서 발현되는 IGF-1 단백질을 확인하였다. IGF-1은 만삼을 처리한 모유두 세포에서 농도에 따라 증가하는 경향을 확인 할 수 있었다. 만삼 50㎍/ml에서는 1.06배, 만삼 100㎍/ml에서는 1.5배가 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. (도 8 참조).

17. 만삼이 조직의 단백질 변화에 미치는 영향

만삼의 급이가 피부 조직의 단백질 변화에 미치는 영향을 확인 하였다. 세포에서와 마찬가지로 androgen receptor와 IGF-1, 그리고 VEGF를 추가로 확인 하였다. 단백질의 발현은 β-actin의 발현에 비교하여 결정하였고 각 단백질의 NC에 비교하여 상대적인 강도로 표시 하였다.

Androgen receptor의 발현을 비교해 보았을 때 NC에 비해 만삼을 투여한 군에서 발현이 증가하였다. 만삼 3mg 투여군이 NC에 비해 1.2배 발현되었으며, 만삼 6mg 투여군에서 1.09배 발현되었다(P<0.05). (도 9 참조)

IGF-1의 발현 정도를 비교 해 보았을 때 NC에 비해 만삼 3mg을 투여한 군에서 유의성있게 증가하였다(P=0.03). NC에 비해 약 1.8배 정도의 높은 발현량을 보여 만삼이 IGF-1의 발현에 영향을 끼치는 것으로 생각된다. 그에 반해 만삼 6mg 투여군에서는 IGF-1의 발현량이 NC와 비슷한 정도를 보였다.(도 10 참조).

VEGF는 만삼을 투여한 쥐의 등 피부 조직에서 발현양을 살펴 보았을 때 아무것도 투여하지 않은 대조군인 NC와 거의 비슷한 발현양상을 보였다. 이는 만삼이 VEGF 단백질 발현에는 크게 영향을 끼치지 못하는 것으로 생각 되어진다. (도 11 참조).

본 발명에 따른 만삼 추출물을 급이한 군에서 발모의 효과가 17일 이후에 뚜렷하게 관찰하였다. 만삼 추출물을 모유두세포주에 처리시, 100 ug/ml 농도에서 혈관생성에 관련하는 VEGF의 발현정도는 대조군에 비해 11% 증가하는 것을 관찰하였다. 모발의 성장을 촉진하는 IGF-I의 발현정도는 대조군에 비해 50ug/ml에서 21% 그리고 100ug/ml에서 31% 증가하는 것을 관찰하였다. 또한 아폽토시스를 촉진하는 TGF-β1은 대조군에 비해 70%, 54% 각각 감소하였다. 본 발명에 따른 만삼 추출물은 모유두세포에서 웨스턴블럿팅 방법을 통하여 단백질을 확인시 앤드로젠수용체의 변화는 10% 정도의 변화가 있었으나 유의성은 관찰되지 않았으며, IGF-I 단백질을 확인시 100ug/ml 농도에서 50% 증가됨을 관찰할 수 있었다. 본 발명에 따른 만삼을 생쥐에 급이한 후 피부조직에서 앤드로젠수용체와 IGF-I, 그리고 VEGF를 확인하였다. 3mg, 6mg 투여군에서 앤드로젠수용체는 20%, 9%씩 각각 증가하였고, IGF-I은 80%, 19%씩 각각 증가하였다. VEGF는 유의성있는 변화가 관찰되지 않았다.

실시예 2 만삼의 라디칼 소거효과

만삼 추출물의 항산화 효과를 DPPH 라디칼에 소거 효과를 통하여 알아보았다. 만삼 추출물을 각각 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, 600, 800, 1000㎍/ml씩 30분 반응하여 결과를 보았다. 농도에 따라 각 97.9%, 95.7%, 94.7%, 93.9%, 93.3%, 92.2%, 91.2%, 89.3%, 86.8%, 86.4%, 80.9%, 79.3%, 76.0%, 72.0%을 나타냈다. 즉 농도에 따라 계속적으로 소거효과가 높아짐을 보여주었다. (도 12 참조). 본 발명에 따른 만삼추출물은 항산화 효과를 측정하였을 때, 만삼의 농도가 증가함에 따라 항산화(DPPH 라디칼제거)효과는 비례하여 증가하였다.

<110> SUNWUNBIOPHYSIC Co. LTD <120> Composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising the extract of Codonopsis pilosula <130> PN110056 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward primer <400> 1 caactccctc aagattgtag c 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Backward primer <400> 2 gggagttgct gttgaagtca ca 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF Forward primer <400> 3 tcttcaagcc atcctgtgtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VEGF Backward primer <400> 4 gcgagtctgt gtttttgcag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEXIN Forward primer <400> 5 ccacgcaaag ccaagacgac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NEXIN Backward primer <400> 6 gaaaccggcc tgctcatcct 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 Forward primer <400> 7 agagaccctt tgcggggctg a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF-1 Backward primer <400> 8 cttctgagtc ttgggcatct 20 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta1 forward primer <400> 9 tggaccgcaa caacgccatc tatgagaaaa cc 32 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta1 backward primer <400> 10 tggagctgaa gcaatagttg gtatccaggg ct 32

Claims (10)

1. 만삼 추출물을 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 만삼 추출물은 알콜에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 만삼 추출물은 C1-C4의 저급 알콜에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 약학적 조성물.
4. 만삼 추출물을 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 식품 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 만삼 추출물은 알콜에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 식품 조성물.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 만삼 추출물은 C1-C4의 저급 알콜에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 식품 조성물.
7. 만삼을 알코올에 담구어 용출하는 단계
   상기 용출된 용출물을 여과하는 단계; 및
   상기 여과물을 감압농축하는 단계를 포함하는 탈모 방지 또는 발모촉진용 조성물 생산방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 알코올은 저급 알코올인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모촉진용 조성물 생산방법.
9. 제 8 항에 있어서 상기 알코올은 에탄올인 것은 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모촉진용 조성물 생산방법.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 에탄올의 농도는 30 내지 50%의 에탄올인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모촉진용 조성물 생산방법.
    

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