KR20130024325A - 브라질린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 주름의 예방 및 개선용 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Brazilin은 UV의해 증가된 LDH의 유리, 니트라이트, MMP-1, c-fos, c-jun, iNOS 의 유전자 발현을 감소, UV에 의해 생성이 감소한 TIMP-1, 프로콜라겐, Bcl-2 유전자 발현을 증가시켜 콜라겐의 생성 및 분해에 관련된 인자들을 조절하여 주름살 억제 및 UV 유발 피부손상 억제를 확인함으로써 피부 주름의 치료 및 예방에 유용한 조성물을 제공할 수 있다.

Description

브라질린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 주름의 예방 및 개선용 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물 {Topical Pharmaceutical Composition and cosmetic composition comprising brazilin or the pharmaceutically acceptable salt thereof for preventing and improving skin wrinkle}

본 발명은 브라질린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 주름의 예방 및 개선용 피부외용 약학 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M., Connective tissue alterations in skin exposed to natural and therapeutic UV-radiation. Photodermatol . 2(1), pp.15-26, Review, 1985.

[문헌 2] Hirobe T., Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Res . 18(1), pp.2-12. Review, 2005.

[문헌 3] McKay IA, Leigh IM., Epidermal cytokines and their roles in cutaneous wound healing. Br J Dermatol . 124(6), pp.513-8, Review, 1991.

[문헌 4] Kim HH, Cho S, Lee S, Kim KH, Cho KH, Eun HC, Chung JH., Photoprotective and anti-skin-aging effects of eicosapentaenoic acid in human skin in vivo. J Lipid Res . 47(5),pp.921-30, 2006.

[문헌 5] Medina A, Ghaffari A, Kilani RT, Ghahary A., The role of stratifin in fibroblast-keratinocyte interaction. Mol Cell Biochem . 305(1-2), pp.255-64, Review, 2007.

[문헌 6] Wang XJ, Han G, Owens P, Siddiqui Y, Li AG., Role of TGF beta-mediated inflammation in cutaneous wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc . 11(1), pp.112-7, Review, 2006.

[문헌 7] Traidl-Hoffmann C, MI, Ring J, Behrendt H., Impact of desloratadine and loratadine on the crosstalk between human keratinocytes and leukocytes: Implications for anti-inflammatory activity of antihistamines. Int Arch Allergy Immunol . 140(4), pp.315-20, 2006.

[문헌 8] Cannon JG, Tatro JB, Reichlin S, Dinarello CA., Alpha melanocyte stimulating hormone inhibits immunostimulatory and inflammatory actions of interleukin 1. J Immunol . 137(7), pp.2232-6, 1986.

[문헌 9] Yamamoto T, Eckes B, Mauch C, Hartmann K, Krieg T., Monocyte chemoattractant protein-1 enhances gene expression and synthesis of matrix metalloproteinase-1 in human fibroblasts by an autocrine IL-1 alpha loop. J Immunol . 164(12), pp.6174-9, 2000.

[문헌 10] Dai G, Freudenberger T, Zipper P, Melchior A, Grether-Beck S, Rabausch B, de Groot J, Twarock S, Hanenberg H, Homey B, Krutmann J, Reifenberger J, Fischer JW., Chronic ultraviolet B irradiation causes loss of hyaluronic acid from mouse dermis because of down-regulation of hyaluronic acid synthases. Am J Pathol . 171(5), pp.1451-61, 2007.

[문헌 11] Sung Won Kwon, Sang Beom Han, Il Ho Park, Jong Moon Kim, Man Ki Park, Jeong Hill Park. Liquid chromatographic determination of less polar ginsenosides in processed ginseng. Journal of Chromatography , 921, pp.335-339, 2001.

[문헌 12] Yong-Sam Keum, Kwang-Kyun Park, Jong-Min Lee, Kyung-soo Chun. Antioxidant and anti-tumor promoting activities of the methanol extract of heat-processed ginseng. J. Cancer Letters . 150, pp.41-48, 2000.

[문헌 13] Young C. Kim, So R. Kim, George J. Markelonis, Tae H. Oh, Ginsenosides Rb1 and Rg3 Protect Cultured Rat Cortical Cells From Glutamate-Induced Neurodegeneration. J. Neuroscience Re . 53, pp.426-432, 1998.

[문헌 14] Keun Young Jung, Dong seon Kim, Platelet Activating Factor Antagonist Activity of Ginsenosides. Biol . Pharm . Bull . 21. pp.79-80, 1998.

[문헌 15] Kenji Ohguchia,Yoshiko Bannob, Yukihiro Akaoa and Yoshinori Nozawaa, Involvement of phospholipase D1 in collagen type I production of human dermal fibroblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications, 348, 1398-1402, 2006

[문헌 16] Mohan R. K. Dasu, , Robert E. Barrow, Marcus Spies and David N. Herndon, Matrix metalloproteinase expression in cytokine stimulated human dermal fibroblasts, Burns 29, 527-531, 2003

[문헌 17] 대한민국 특허 10-0192678 약효가 증강된 가공인삼제품, 1999

[문헌 18] Kim, S. G. et al., Arch. Pharm. Res. 21(2), pp140-146, 1998

[문헌 19] Moon, C. K. et al., Drug Chem. Toxicol. 15(1), pp81, 1992

[문헌 20] Hwang, G. S. et al., Arch. Pharm. Res. 21(6), pp774-778, 1998

[문헌 21] 정보섭 외, 도해향약대사전, 영림당, pp666, 1989

현대인들은 자외선, 스트레스 등의 여러 가지 내외적인 요인에 의해 각종 피부 트러블 유발로 기미, 주근깨, 피부 색소 침착 등의 피부 손상 현상을 촉진한다(Voegeli, R. 1996. Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, 51-58). 피부의 색소 침착은 멜라닌 색소이 생합성에서 tyrosinase 효소를 비롯하여 DHICA oxidase(TRP-1)등의 L-tyrosine을 DOPA(3,4-dihydroxyphenyla-lanine)으로 DOPA에서 DOPA quinone으로 초기반응을 조절하는 것으로 알려져 있다(2.Aroca, P., et al. 1993. Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, 25650-25655). 이를 바탕으로 티로시나제(tyrosinase) 효소의 활성을 저해하여 멜라닌 생합성의 억제에 영향을 미칠 수 있는 천연물 탐색에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 결과 어성초 추출물을 이용하여 티로시나제(tyrosinase) 유전자 발현 억제 효과( Chin, J. E., et al. 2005. Effects of Houttuynia cordata extracts on tyrosinse gene expression. J. Korean Soc Food Sci Nutr 34, 1284-1288) 등 천연물을 활용한 연구가 활발히 이뤄지고 있다. 그 외 현재 알려져 있는 항산화 및 미백원료는 아르부틴(Arbutin), 코지산(Kojic acid), 아스코르브산(Ascorbic acid) 등의 물질이 대표적이고 상백피, 닥나무, 감초 등의 식물 추출물이 널리 알려져 있다.

환경의 파괴로 인한 자외선 증가 및 각종 산화성 물질의 증가는 피부 손상과 단백질의 합성능 저하를 유발할 수 있다. 이러한 피부 세포의 손상이나 기능 저하는 피부 탄력의 감소, 피부 주름살의 증가, 기미와 주근깨 생성 등 피부 미용에 치명적인 현상들을 유발한다. 피부 탄력성은 진피조직의 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 히알루론산(hyaluronic acid) 등에 의해 유지되며, 콜라겐(collagen)을 합성하는 섬유아세포(fibroblast)는 핵심적인 역할을 한다. 섬유아세포 기능은 각종 성장인자(growth factor) 뿐만 아니라 케라티노사이트(keratinocyte)나 멜라노사이트(melanocyte)와 같은 피부 세포들에서 분비되는 싸이토카인(cytokine)에 의해서도 조절된다. 정상적인 상태에서 유리되는 케라티노사이트의 TGF-β, TβRII, SGad3는 피부 섬유아세포(dermal fibroblast)로 부터 프로콜라겐(procollagen), 피브릴린(fibrillin-1), tropoelastin의 발현을 증가시켜 콜라겐 생성을 증가시키며, MMPs의 발현을 억제하여 콜라겐 분해를 억제하는 것으로 보고되었다.

UV에 의해 케라티노사이트가 손상되면 TGF-β(transforming growth factor) 외에도 TNF-α(tumor necrosis factor), PGE₂(prostaglandin E₂), α-MSH(melanocyte stimulating hormone), GSF(granulocyte stimulating factor), IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-8, IL-10 등의 유리가 유발한다. 이중 α-MSH와 PGE₂는 멜라노사이트를 자극하여 멜라닌 생성을 촉진하여, 이 멜라닌은 피부 세포의 항산화 작용을 증강시켜 피부세포가 자외선으로 인해 손상되는 것을 방어하게 한다. IL-1, TNF-α(tumor necrosis factor) 등은 fibroblast에 작용하여 procollagen 발현을 억제하며, MMP-1(martrix metalloproteinase-1), MMP-2, MMP-3, 히알루로니다아제(hyaluronidase)등의 활성을 증가시켜 콜라겐 분해를 촉진하게 된다. 또한, UV에 의해 직접적으로 섬유아세포(fibroblast)가 상해를 받는 경우에도 콜라겐 관련 유전자는 억제되고 분해에 관련되는 MMPs류 발현은 촉진되어 주름살은 증가하게 된다. 따라서, 진피 섬유아세포(dermal fibroblast)의 증식과 콜라겐 합성을 증가시키거나, MMPs을 억제하는 것은 주름살을 생성을 억제하는 수단이 될 수 있다.

플라보노이드 구조의 브라질린은 공기 중에 산화되어 브라질레인이 된다. 브라질린은 공기 중에 산화되어 브라질레인이 된다. 소목의 주성분인 브라질린이 고혈압에 효과가 있다(Moon, C. K. et al., Drug Chem. Toxicol. 15(1), pp81, 1992)는 보고가 있고, 브라질린이 혈소판에서 칼슘농도를 조절한다(Hwang, G. S. et al., Arch. Pharm. Res. 21(6), pp774-778, 1998)는 연구결과가 보고되었으며, 혈액에서 브라질린의 혈당 저하 작용(Kim, S. G. et al., Arch. Pharm. Res. 21(2), pp140-146, 1998)이 보고되었다.

이에 본 발명자들은 브라질린을 이용하여 UV에 의한 피부진피세포 보호작용을 평가하고, 콜라겐(collagen) 합성과 파괴에 관여하는 인자들에 대한 성능에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 이를 위하여 사람의 진피세포에 자외선 처리하여 MTT assay와 NO 유리에 미치는 영향을 평가하였으며, UV에 의해 감소하는 procollagen 유전자 및 MMP-1, iNOS-2, Bcl-2, Bax, c-jun, c-fos의 유전자 발현에 미치는 영향을 평가함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 구조식 1의 브라질린(Brazilin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 주름의 예방 및 치료용 피부외용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 브라질린(Brazilin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 주름의 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 Brazilin은 피부외용 약학조성물, 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%으로 포함함을 특징으로 한다.

상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형을 포함한다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩의 제형을 포함한다.

발명의 브라질린(Brazilin) 화합물들은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가 염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

상기의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 구조를 갖는 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 브라질린(Brazilin) 화합물은 당업계에 공지된 합성방법으로 제조가능하거나 상용으로 구입가능하다.

또한, 본 발명의 브라질린(brazilin)은 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 피부 첩포 시험에서 무자극 시료임이 입증되었으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 Brazilin을 함유하는 피부외용 약학조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 Brazilin의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 Brazilin은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 Brazilin은 UV에 의한 iNOS, c-jun 및 c-fos 유전자 발현을 감소시켜 세포 손상 억제를 확인하여 피부 주름의 치료 및 예방에 유용함을 확인하였다.

또한, 본 발명의 Brazilin은 주름 개선 효과를 갖는 화장품 및 세안제 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 에센스, 팩 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E(d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산 dl-알파 토코페롤비타민 E, dl-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE(폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP(폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01-5 중량%, 보다 바람직하게는 0.01-3 중량%로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 Brazilin 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명, Brazilin은 UV의해 증가된 LDH의 유리, 니트라이트, MMP-1, c-fos, c-jun, iNOS 의 유전자 발현을 감소, UV에 의해 생성이 감소한 TIMP-1, 프로콜라겐, Bcl-2 유전자 발현을 증가시켜 콜라겐의 생성 및 분해에 관련된 인자들을 조절하여 주름살 억제 및 UV 유발 피부손상 억제를 확인함으로써 피부 주름의 치료 및 예방에 유용한 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 브라질린(Brazilin)의 UVB 조사에 의한 피부 진피세포 상해에 미치는 영향을 나타낸 도이며; A : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(50 ㎍/㎖); B : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(10 ㎍/㎖); C : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(2 ㎍/㎖); ## p<0.01 vs Normal; **: P<0.01 vs Control,
도 2는 브라질린(Brazilin)의 UVB 조사에 의한 Nitrite 생성능에 미치는 영향을 나타낸 도이며; A : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(50 ㎍/㎖); B : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(10 ㎍/㎖); C : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(2 ㎍/㎖); ## p<0.01 vs Normal; **: P<0.01 vs Control,
도 3은 브라질린(Brazilin)의 UVB 조사에 의한 MMP-1 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; A : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(50 ㎍/㎖); B : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(10 ㎍/㎖); C : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(2 ㎍/㎖); ## p<0.01 vs Normal; **: P<0.01 vs Control,
도 4는 브라질린(Brazilin)의 UVB 조사에 의한 Procollagen 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; A : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(50 ㎍/㎖); B : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(10 ㎍/㎖); C : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(2 ㎍/㎖); ## p<0.01 vs Normal; **: P<0.01 vs Control,
도 5는 브라질린(Brazilin)의 UVB 조사에 의한 c-fos 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; A : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(50 ㎍/㎖); B : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(10 ㎍/㎖); C : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(2 ㎍/㎖); ## p<0.01 vs Normal; **: P<0.01 vs Control,
도 6은 Brazilin 추출물의 UVB 조사에 의한 c-jun 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; A : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(50 ㎍/㎖); B : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(10 ㎍/㎖); C : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(2 ㎍/㎖); ## p<0.01 vs Normal; **: P<0.01 vs Control,
도 7은 브라질린(Brazilin)의 UVB 조사에 의한 iNOS 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; A : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(50 ㎍/㎖); B : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(10 ㎍/㎖); C : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(2 ㎍/㎖); ## p<0.01 vs Normal; **: P<0.01 vs Control,
도 8은 브라질린(Brazilin)의 UVB 조사에 의한 TIMP-1 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; A : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(50 ㎍/㎖); B : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(10 ㎍/㎖); C : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(2 ㎍/㎖); ## p<0.01 vs Normal; **: P<0.01 vs Control,
도 9는 브라질린(Brazilin)의 UVB 조사에 의한 Bcl-2 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; A : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(50 ㎍/㎖); B : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(10 ㎍/㎖); C : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(2 ㎍/㎖); ## p<0.01 vs Normal; **: P<0.01 vs Control,
도 10은 브라질린(Brazilin)의 UVB 조사에 의한 Bcl-xL 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며; A : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(50 ㎍/㎖); B : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(10 ㎍/㎖); C : UVB(30 mJ/㎠) + brazilin(2 ㎍/㎖); ## p<0.01 vs Normal; **: P<0.01 vs Control.
도 11은 브라질린(Brazilin)의 ¹H-NMR spectra (DMSO-d₆,δ 0 ~ 12 ppm)을 나타낸 도이며;
도 12는 브라질린(Brazilin)의 ¹H-NMR spectra (DMSO-d₆,δ 6.1 ~ 7.2 ppm)을 나타낸 도이며;
도 13은 브라질린(Brazilin)의 ¹H-NMR spectra (DMSO-d₆,δ 2.4 ~ 4.0 ppm)을 나타낸 도이며;
도 14는 브라질린(Brazilin)의 ¹³C-NMR spectra (DMSO-d₆,δ 0 ~ 220 ppm)을 나타낸 도이며;
도 15는 브라질린(Brazilin)의 Low-resolution FAB-MS spectra 를 나타낸 도이며;
도 16은 high-resolution FAB-MS로 측정한 브라질린(Brazilin)의 분자량을 나타낸 도이며;
도 17은 브라질린(Brazilin)의 화학구조를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 소목추출물로부터 브라질린(brazilin)의 분리

하기 실험예에 개시된 물성치를 나타내는 브라질린(brazilin)을 DMSO를 이용하여 배지에 녹인 후, pore size 0.45 ㎛의 여과지를 통과시킨 후에 하기 실험예에 사용하였다.

참고예 1. 재료 및 방법

1. 재료

(1) 세포주

본 실험에 사용된 인간 피부 각질 세포주는 NIH3T3 진피 섬유아세포(dermal Fibroblast)로 ATCC(제품번호: CRL-1658)에서 구입하여 10% FBS와 penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco BRL Co. USA) 배지를 사용하여 5일간 세포를 배양하였으며 1일 1회 배지를 교환하였다. FBS(GIBCO 사14-501F)는 잔존하는 보체성분을 불활성화시키기 위해 실온에서 녹인 후에 가열 불활성화(heat inactivation; 56℃ 수욕조에서 30분간 가열)하여 사용하였으며 배지는 0.2 ㎛ 구멍크기 여과지로 여과 후 사용하였다. 세포에 각 조건 별로 96 well plate에는 well 당 100 ㎕, 24 well plate에는 well 당 500 ㎕로 배지를 넣어주었다. 세포를 회수할 때는 trypsin-EDTA(GIBCO사 25200) 1 ㎖을 가하여 37℃에서 1분간 반응시킴으로써 부착된 세포를 분리하고, 배지 4 ㎖을 넣고 1,000 rpm에서 3분 동안 원심분리를 하여 세척한 후에 실험에 사용하거나 필요시 액체질소에서 냉동 보관하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂를 사용한 CO₂ 배양기에서 배양하였다.

(2) 시약 및 기기

1) 시약

본 실험에 사용된 시약으로 NaNO₂(Sigma, S2252), Griess reagent solution(Sigma, G4410), TRIzol reagent(Invitrogen. Cat. No. 15596018),클로로포름 (Sigma Co., U.S.A), LDH kit(Sigma S500), isoamylalcohol(Sigma, USA), 에탄올(Sigma, USA), SybrGreen Mix(Sigma, USA), RNAase free water(Sigma, USA), Oligo dT(Promega, USA), RNAase 제거수(Promega, USA), dNTP(Promega, USA), RNAase inhibitor(Promega, USA), Taq polymerase(Promega, USA), primer((주)바이오니아, KOREA), DTT(Promega, USA)를 사용하였다.

2) 기기

본 실험에 사용된 기기는 자외선 조사기 UVATEC(Sherman Oaks, CA, USA), 광량 기기(IL 1700 radiometer, International Light Inc., MA, USA), ELISA Reader(Molecular Device, Emax), Microplate spectrophotometer(Molecular Devices,U.S.A), ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(Bioystems, USA), CO₂ 배양기(incubator;FormascientificCo.,U.S.A), waterbath(VisionscientificCo.,Korea), PCR(Perkin Elmer, USA), centrifuge (Sigma, U.S.A)등을 사용하였다.

실험예 1. UV 에 의한 상해에 미치는 영향 실험

상기 실시예에서 수득한 Brazilin이 UV에 의한 상해에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기에 개시된 방법을 이용하여 실험을 실시하였다.

1-1. LDH 유리능 측정

세포를 96 웰 플레이트를 이용하여 24시간 동안 미리 배양한 후, 1시간 동안 약물을 함유한 배지로 전처리 하였다. 세포는 웰당 1x10⁴개씩 넣었다. 배양액을 제거한 다음 각 well에 50 ㎕의 PBS(phosphate buffered saline)를 넣은 다음, 세포에 UVB를 30 mJ/cm² 를 조사한 후 PBS를 제거하고 웰당 약물이 포함된 200 ㎕의 DMEM 배지를 첨가하였다. 24시간이 경과한 다음 배양액을 취하여 세포 손상의 지표로 LDH(lactate dehydrogenase) 활성을 측정하였다. LDH 활성은 Sigma사의 LDH kit(Sigma S500)을 이용하여 정량하였으며, ELISA Reader(Molecular Device, Emax)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. UV에 의한 피부진피 세포 상해를 측정하기 위하여, 진피 섬유아세포(dermal fibroblast)에 UV를 조사한 후에 유리되는 LDH를 측정하였다.

실험 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, UV 조사시에 세포로부터 LDH 의 유리가 증가하였다. 반면 Brazilin을 처리한 경우, UV로 조사한 대조군에 비해 LDH의 유리를 억제하여, UV에 의한 진피 세포 상해를 억제하는 작용을 나타내었다.

1-2. 니트라이트( Nitrite ) 생성능 측정

세포를 96 웰 플레이트를 이용하여 24시간 동안 미리 배양한 후, 1시간 동안 약물을 함유한 배지로 전처리 하였다. 세포는 웰당 1x10⁴개씩 넣었다. 배양액을 제거한 다음 각 well에 50 ㎕의 PBS(phosphate buffered saline)를 넣은 다음, 세포에 UVB를 30 mJ/cm² 를 조사한 후 PBS를 제거하고 웰당 약물이 포함된 200 ㎕의 DMEM 배지를 첨가하였다.배양한 다음에 실험군에서 배지 상층액을 취하였다. NaNO₂ 용액(Sigma사 S2252)의 연속적인 희석액을 만들어 최종농도가 0.05 μM가 되도록 조절하였다. 먼저 얻은 세포 배양액과 NaNO₂ 희석액에 동량의 시약(Griess reagent solution, Sigma, G4410)을 넣고, 15분간 상온에 방치한 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. UV에 의한 피부 진피 세포의 산화적 스트레스를 측정하기 위하여, 피부진피세포에 UV를 조사한 후 생성되는 니트라이트(nitrite)를 측정하였다.

실험 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, UV 조사시에 세포에서 생성되는 니트라이트량이 증가하였다. 반면 Brazilin을 처리한 경우, UV로 조사한 대조군에 비해 니트라이트 생성을 억제하여, UV에 의한 산화적 스트레스를 억제하는 작용을 나타내었다.

실험예 2. 유전자 발현에 대한 영향 실험

상기 실시예의 Brazilin이 유전자 발현에 대한 영향을 확인하기 위하여 하기에 개시된 방법을 이용하여 실험을 실시하였다.

2-1. 총 RNA 분리

배양하고 있는 섬유아세포(Fibroblast)에 1 ml TRIzol reagent(Invitrogen, Cat.No. 15596018)를 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA 용액에 200 ㎕의 클로로포름(Sigma-Aldrich, Cat.No. 288306) : isoamylalcohol(Sigma-Aldrich, Cat.No. 320021) (24:1)을 넣고 강하게 섞은 후 14000 rpm으로 원심 분리하여 상층액 500 ul를 분리하였다. 0.5 ml 이소프로필 알코올을 여기에 가하여 영하 20도에서 하루밤 RNA를 침전시킨 후에 1400 rpm으로 20분간 원심 분리하였다. 상등액을 버린 후, 70% 에탄올 (Sigma-Aldrich, Cat.No. 459844) 로 세척하고 자연 건조시켰다. RNAase 제거수(RNAase free water, Sigma-Aldrich, Cat. No. 95289) 에서 RNA를 녹인 후에 RNase-free DNase(Promega, Cat.No. M6101) 를 첨가하고 -70℃에서 저장하였다.

2-2. cDNA 제조

대조군 및 시험군에서 각각 분리한 total RNA액 1 ul에 (1ug RNA 함유)에 oligo dT (Promega, Cat.No. C1101) (농도 100 pmol) 1 ㎕ 및 RNAase 제거수 (Promega, Cat.No. M6101) 3 ul을 넣은 후 조심스럽게 혼합한 다음, 65℃에서 10분간 배양하였다. 프라이머(primer)가 아닐링(annealing)하도록 4℃ 에서 약 5분간 방치한 다음, 역전사효소 완충액(Reverse transcriptase buffer), dNTP (Promega, Cat.No. U1515) (각 2.5 mM), RNase inhibitor (Promega, Cat.No. N2611), DTT (100nM) 및 역잔사효소(Reverse transcriptase, M-MLV 200 U/ul) (Promega, Cat.No. M5301)을 첨가한 후에, 아주 조심스럽게 혼합하였다. 이 후, 42℃에서 90분간 배양하고 95℃에서 5분간 처리한 후에 사용하였다.

2-3. RT - PCR

oligo (dT) primer (Promega, Cat.No. C1101), 반응 완충액(reaction buffer), 50mM Tris-HCl, 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 10mM DTT, pH8.3) (Promega, Cat.No. M1705), 1mM dNTP (Promega, Cat.No. U1515) 및 200unit M-MLV-RT (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase) (Promega, Cat.No. M1705)를 분리한 RNA에 처리하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. PCR은 total volume 25㎕에 10X PCR buffer, 0.2mM dNTPs, 2pmole의 sense 및 antisense primer를 넣은 혼합액에 cDNA와 1.25unit의 Taq polymerase (Promega, Cat.No. M8295)을 넣어 PCR을 시행하였다. 사용된 primer는 (주) 바이오니아(한국)에서 주문 생산하여 사용하였다. Procollagen 1α2 (PCol 1α2)의 sense primer는 “GTG GTT ACT ACT GGA TTG ACC”이었으며, antisense는 “TTG CCA GTC TCC TCA TCC AT”를 사용하였다. MMP-1 의 sense primer는 “CGA CTC TAG AAA CAC AAG AGC AAG A”, antisense는 “AAG GT T AGC TTA CTG TCA CAC GCT T”을 사용하였으며, TIMP-1의 sense primer는 “ATC CTG TTG CTG TGG CTG ATA G”, antisense는 “TGC TGG GTG GTA ACT CTT ATT TCA” 이었다. COX-2의 sense primer는 “TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT”, antisense는 “AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT”을 사용하였으며, iNOS의 sense primer는 “CGG TGC TGT ATT TCC TTA CGA GGC GAA GAA GG”, antisense는 “GGT GCT GTC TGT TAG GAG GTC CAA GTA AAG GGC”를 사용하였다. TNFα의 sense primer는 “TGC ACC ACA GTT TAA ACC CA”이었으며, antisense는 “GAC TCC TTC AGG TGC TCA GG”이었다. NF-κB2의 sense primer는 “TCC ACC TTT AGG TTG CCC TG”, antisense는 “TCT GCT CTC GTC ATG TCA CC”를 사용하였으며, c-Jun의 sense primer는 “GGA TCA AGG CGG AGA GGA AG”, antisense는 “GCG TTA GCA TGA GTT GGC AC”을 사용하였으며, c-Fos의 sense primer는 “GGA GAA TCC GAA GGA AAG G”, antisense는 “GCT TGG GCT CAG GGT CAT TG”를 사용하였다. Bcl-2의 sense primer는 “ACT CTG CTC AGT TTC GCC CT”, antisense는 “TTG TGG CTC AGA TAG GCA C”를 사용하였으며, Bcl-xL의 sense primer는 “ATG TCT CAG AGC AAC CGG”, antisense는 “TCT TTC CGA CTG AAG AGT G”를 사용하였다. Control로는 GAPDH를 사용하였으며 sense primer는 “CAG CCT CGT CCC GTA GAC AAA”이었으며, antisense는 “CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC” 이었다.

PCR 조건은 94℃ 4분, 30cycles의 [94℃ (20초), 54℃ (20초), 72℃ (30초)], 72℃ 10분이었다(Perkin Elmer, USA) 증폭된 PCR 산물을 2% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하였다. 전기영동 결과 나온 밴드(band)를 밀도(density) 분석 프로그램인 Gel-Pro analyzer 3.1(Media Cybernetics. USA)을 이용하여 구했다.

2-4. Real time RT - PCR

각각의 optical tube(MicroAmpOptical 96-Well Reaction Plate with Barcode and Optical Adhesive Films, Applied Biosystems, Cat.No. 4314320)에 3배의 SybrGreen Mix 2.5㎕(Sigma-Aldrich, Cat.No. S9430), 위에서 합성한 cDNA 1㎕, 10 pmol/㎕ primer pair mix 1㎕, 각각 2.5mM의 dNTP 2ul, 10 x Tag polymerase buffer 2.5ul, Tag Polymerase 0.3ul 와 14.7㎕ H₂O를 넣고, 95℃ 5min 1cycle, 95℃ 30sec, 45℃ 30sec, 72℃ 60sec 40cycles, 95℃ 20min 1cycle로 증폭시켰다. PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5ul를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity를 측정하고, ABI PRISM7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Cat.No. 4349157)를 사용하여 real time PCR 결과를 분석하였다.

실험결과, 도 3 내지 도 10에 나타난 바와 같이 브라질린은 UV에 의해 증가된 MMP-1, c-fos, c-jun, iNOS 의 유전자 발현 감소시켰다.

반면에 UV에 의해 생성이 감소한 TIMP-1, 프로콜라겐, Bcl-2 유전자 발현을 증가 및 Bcl-xL 유전자 발현에는 영향을 주지 못했다. 이를 바탕으로 Brazilin 추출물은 콜라겐의 생성 및 분해에 관련된 인자들을 조절하여 주름살 억제 및 UV 유발 피부손상 억제에 탁월한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

재조합 단백질		프라이머 서열 (Primer sequence)
Prcollagen 1α2	센스: 서열번호1	5'-GTG GTT ACT ACT GGA TTG ACC-3'
	안티센스: 서열번호2	5'-TTG CCA GTC TCC TCA TCC AT-3'
MMP-1	센스: 서열번호3	5'-CGA CTC TAG AAA CAC AAG AGC AAG A-3'
	안티센스: 서열번호4	5'-AAG GT T AGC TTA CTG TCA CAC GCT T-3'
TIMP-1	센스: 서열번호5	5'-ATC CTG TTG CTG TGG CTG ATA G-3'
	안티센스: 서열번호6	5'-TGC TGG GTG GTA ACT CTT ATT TCA-3'
COX-2	센스: 서열번호7	5'-TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT-3
	안티센스: 서열번호8	5'-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT-3'
iNOS	센스: 서열번호9	5'-CGG TGC TGT ATT TCC TTA CGA GGC GAA GAA GG-3'
	안티센스: 서열번호10	5'-GGT GCT GTC TGT TAG GAG GTC CAA GTA AAG GGC-3'
TNF-α	센스: 서열번호11	5'-TGC ACC ACA GTT TAA ACC CA-3'
	안티센스: 서열번호12	5'-GAC TCC TTC AGG TGC TCA GG-3'
c-Jun	센스: 서열번호15	5'-GGA TCA AGG CGG AGA GGA AG-3'
	안티센스: 서열번호16	5'-GCG TTA GCA TGA GTT GGC AC-3'
c-Fos	센스: 서열번호17	5'-GGA GAA TCC GAA GGA AAG G-3'
	안티센스: 서열번호18	5'-GCT TGG GCT CAG GGT CAT TG-3'
Bcl-2	센스: 서열번호19	5'-ACT CTG CTC AGT TTC GCC CT-3'
	안티센스: 서열번호20	5'-TTG TGG CTC AGA TAG GCA C-3'
Bcl-xL	센스: 서열번호21	5'-ATG TCT CAG AGC AAC CGG-3'
	안티센스: 서열번호22	5'-TCT TTC CGA CTG AAG AGT G-3'
GAPDH	센스: 서열번호23	5'-CAG CCT CGT CCC GTA GAC AAA-3'
	안티센스: 서열번호24	5'-CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC-3'

실험예 3. 핵자기공명분광법 ( NMR ) 및 질량분광법(MS)에 의한 브라질린 구조의 분석 실험

상기 실시예의 Brazilin을 핵자기공명분광법(nuclear magnetic resonance, 이하 NMR) 및 질량분광법(MS)으로 물질의 구조를 하기와 같이 실험을 실시하여 확인하였다.

핵자기공명분광법(nuclear magnetic resonance, 이하 NMR)에 따라 분리된 물질을 ¹H- 및 ¹³C-NMR(500 MHz)을 측정하여 다음의 결과를 얻었다. ¹H-NMR스펙트럼으로부터 6.19, 6.39, 6.53, 6.62 및 7.12 ppm 근처에서 방향성수소원자에 의한 신호(aromatic signal)가 나타났으며, 스핀결합상수(coupling constant, J)의 계산으로부터 6.39 ppm에 해당하는 doublet-doublet signal(J=8.3Hz)은 7.11 ppm과 ortho-coupling하는 수소이며, 6.19 ppm(J=2.35 Hz)의 doublet signal은 6.4 ppm의 수소와 meta-coupling을 하고 있음을 확인하였다. 또한, 6.53 ppm 및 6.62 ppm의 singlet signal은 주변에 인접한 수소가 없음을 시사하였다. 3.82 ppm(dd, J=11.3Hz)와 3.55 ppm에 나타난 신호는 cycle ring의 sp2의 혼성오비탈을 갖는 CH₂로 하나의 탄소에 붙어 있는 수소임을 확인하였으며, 2.85 ppm(d, J=15. 65Hz)과 2.67 ppm의 신호 역시 germinal proton에 기인함을 알 수 있었다(도 11, 12, 13, 표 2 참조)

한편, ¹³C-NMR측정 결과, 4개의 산화된 olefinic quaternary carbons(δ 154.0, δ 156.4, δ 144.2, δ 143.9)이 있어 aromatic ring에 산화된 탄소들이 존재함을 확인하였으며, 3개의 olefinic quaternary(δ 114.3, δ 130.8, δ 135.5)와 하나의 산화된 quaternary(δ 76.3) 탄소공명(carbon resonance)을 나타내었다(도 14 및 표 2 참조). 아울러 분리된 물질의 질량분석을 통하여 분자량이 286 m/z임을 확인하였으므로(도 15 및 16 참조), 이상의 데이터를 종합한 결과 물질의 구조는 brazilin으로 확인되었다(도 17 참조).

Position	δH ( ppm )	δC ( ppm )
1	7.11, 1H, d,J=8.3	130.8
1a	-	114.3
2	6.39, 1H, dd ,J=8.3,2.35	108.6
3	-	154.0
4	6.19, 1H, d,J=2.35	102.7
4a	-	156.4
6	3.55, 1H, d,J=11.3 3.82, 1H, d,J=11.3	69.6
6a	-	76.3
7	2.67, 1H, d,J=15.65 2.85, 1H, d,J=15.65	41.9
7a	-	129.7
8	6.52, 1H, s	112.0
9	-	144.2
10	-	143.9
11	6.62, 1H, s	111.6
11a	-	135.5
12	3.83, 1H, s	49.5

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

이하, 본 발명의 제형예로서 크림, 맛사지크림, 로션, 스킨로션, 에센스, 팩, 클렌징폼의 제형을 예시하고 있으나, 본 발명의 화장품 조성물을 포함하는 제형은 이에 한정되는 것은 아니다.

제형예 1. 크림조성물

유상과 수상을 각각 75℃로 가열 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

세토스테아릴 알코올 1.0 %

자기유화형 모노스테아린산 글리세린 1.0 %

친유형 모노스테아린산 글리세린 2.5 %

마이크로 스탈린 납 2.0 %

파라옥시안식향산메틸 0.2 %

파라옥시안식향산프로필 0.1 %

밀납 2.0 %

모노스테아린산 폴리에틸렌글리콜 2.0 %

모노스테아린산 소르비탄 1.0 %

트리 (카프릴, 카프린산) 글리세린 5.0 %

액상 리놀린 5.0 %

미리스틴산 옥틸도데실 8.0 %

스쿠알란 8.0 %

농글리세린 5.0 %

1,3-부틸렌글리콜 5.0 %

알란토인 0.1 %

브라질린(brazilin) 10.0 %

향료 미량

황색4호 미량

정제수 잔량

제형예 2. 맛사지크림 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 용해 혼합한 후 실온으로 냉각한다.

세토스테아릴 알코올 2.0 %

친유형 모노스테아린산 글리세린 2.5 %

자기유화형 모노스테아린산 글리세린 1.5 %

파라옥시안식향산메틸 0.2 %

파라옥시안식향산프로필 0.1 %

바셀린 3.5 %

모노스테아린산 폴리에틸렌글리콜 3.5 %

세스퀴올레인산 소르비탄 1.8 %

유동 파라핀 35.0 %

트리 (카프릴, 카프린산) 글리세린 3.0 %

옥틸도데칸올 5.0 %

스쿠알렌 2.0 %

농글리세린 5.0 %

브라질린(brazilin) 5.0 %

히아루로닉애씨드추출물 1.0 %

향료 미량

정제수 잔량

제형예 3. 로션 조성물

유상과 수상을 각각 75 ℃로 가열 혼합 유화한 후 실온으로 냉각한다.

세토스테아릴 알코올 2.0 %

스테아린산 1.0 %

친유형 모노스테아린산 글리세린 1.0 %

자기유화형 모노스테아린산 글리세린 2.0 %

바셀린 1.0 %

모노스테아린산 폴리에틸렌글리콜 1.5 %

세스퀴올레인산 소르비탄 1.0 %

유동 파라핀 5.0 %

스쿠알렌 5.0 %

파라옥시안식향산프로필 0.2 %

파라옥시안식향산메틸 0.2 %

농글리세린 5.0 %

브라질린(brazilin) 15.0 %

트리에탄올아민 0.5 %

카르복시비닐폴리머 0.2 %

향료 미량

정제수 잔량

제형예 4. 스킨로션 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

글리세린 2.0 %

1,3-부틸렌글리콜 2.0 %

구연산 0.01 %

에탄올 15.0 %

폴리옥시에틸렌경화피마자유 1.0 %

브라질린(brazilin) 25.0 %

향료 미량

위치하젤추출물 1.0 %

정제수 잔량

제형예 5. 에센스 조성물

수상과 에탄올상을 각각 제조 혼합한 후 여과한다.

글리세린 15.0 %

1,3-부틸렌글리콜 5.0 %

알란토인 0.1 %

에탄올 7.0 %

파라옥시안식향산메틸 0.15 %

트리에탄올아민 0.15 %

폴리옥시에틸렌경화피마자유 1.0 %

초산토코페롤 0.5 %

카르복시비닐폴리머 0.15 %

브라질린(brazilin) 30.0 %

향료 미량

정제수 잔량

제형예 6. 팩 조성물

수상과 에탄올상을 각각 분산 용해하여 혼합시킨 후 실온으로 냉각한다. 폴리비닐알코올 15.0 %

카르복시메틸셀룰로이스나트륨 0.3 %

농글리세린 3.0 %

알란토인 0.1 %

에틸렌디아민테트라초산디나트륨 0.01 %

폴리에틸렌글리콜 1.0 %

에탄올 6.0 %

파라옥시안식향산메틸 0.15 %

타라옥시안식향산프로필 0.05 %

디엘판테놀 0.1 %

폴리옥시에틸렌(12)노닐페닐에테르 0.5 %

브라질린(brazilin) 45.0 %

향료 미량

정제수 잔량

제형예 7. 클렌징폼 조성물

수상과 오일상을 각각 분산 용해하여 혼합 검화한 후 실온으로 냉각한다.

스테아린산 6.5 %

미리스틴산 28.0 %

자기유화형 모노스테아린산 글리세린 3.0 %

프로필렌 글리콜 5.0 %

농글리세린 10.0 %

수산화나트륨 7.0 %

에틸렌디아민테트라초산나트륨 0.1 %

태반 추출물 0.5 %

브라질린(brazilin) 15.0 %

향료 미량

정제수 잔량

Claims (4)

1. 브라질린(Brazilin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 주름의 예방 및 치료용 피부외용 약학조성물.
   
2. 제 1항에 있어서
   상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형인 조성물.
   
3. 브라질린(Brazilin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 주름의 예방 및 개선용 화장료 조성물.
   
4. 제 3항에 있어서
   상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 또는 팩의 제형인 조성물.
   
   

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