KR20110131784A - 가공인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 함량의 합보다도 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rk1의 함량의 합이 더 높은 파낙스속 식물의 가공추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 deramal fibroblast에서 직접적으로 세포의 증식을 증가, 콜라겐과 TIMP-1의 합성 증가, UV 조사로 인해 감소한 피부 진피 세포의 Procollagen 발현을 증가, 콜라겐 분해를 촉진하는 MMP-1의 발현 감소 효과를 나타내는바, 콜라겐의 생성 및 분해에 관련된 인자들을 조절하여 피부 주름개선용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

가공인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition comprising the extract of heat-processed panax ginseng showing skin anti-wrinkle activity}

본 발명은 가공인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

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환경의 파괴로 인한 자외선 증가 및 각종 산화성 물질의 증가는 피부 손상과 단백질의 합성능 저하를 유발할 수 있다. 이러한 피부 세포의 손상이나 기능 저하는 피부 탄력의 감소, 피부 주름살의 증가, 기미와 주근깨 생성 등 피부 미용에 치명적인 현상들을 유발한다. 피부 탄력성은 진피조직의 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 히알루론산(hyaluronic acid) 등에 의해 유지되며, 콜라겐(collagen)을 합성하는 섬유아세포(fibroblast)는 핵심적인 역할을 한다(1). 섬유아세포 기능은 각종 성장인자(growth factor) 뿐만 아니라 케라티노사이트(keratinocyte)나 멜라노사이트(melanocyte)와 같은 피부 세포들에서 분비되는 싸이토카인(cytokine)에 의해서도 조절된다(2-3). 정상적인 상태에서 유리되는 케라티노사이트의 TGF-β, TβRII, SGad3는 피부 섬유아세포(dermal fibroblast)로부터 프로콜라겐(procollagen), 피브릴린(fibrillin-1), tropoelastin의 발현을 증가시켜 콜라겐 생성을 증가시키며, MMPs의 발현을 억제하여 콜라겐 분해를 억제하는 것으로 보고되었다(4-5).

UV에 의해 케라티노사이트가 손상되면 TGF-β(transforming growth factor) 외에도 TNF-α(tumor necrosis factor), PGE₂ (prostaglandin E₂), α-MSH(melanocyte stimulating hormone), GSF(granulocyte stimulating factor), IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-8, IL-10 등의 유리가 유발한다(6-7). 이중 α-MSH와 PGE₂는 멜라노사이트를 자극하여 멜라닌 생성을 촉진하여, 이 멜라닌은 피부 세포의 항산화 작용을 증강시켜 피부세포가 자외선으로 인해 손상되는 것을 방어하게 한다(8). IL-1, TNF-α(tumor necrosis factor) 등은 fibroblast에 작용하여 procollagen 발현을 억제하며, MMP-1 (martrix metalloproteinase-1), MMP-2, MMP-3, 히알루로니다아제(hyaluronidase)등의 활성을 증가시켜 콜라겐 분해를 촉진하게 된다(9-10). 또한, UV에 의해 직접적으로 섬유아세포 (fibroblast)가 상해를 받는 경우에도 콜라겐 관련 유전자는 억제되고 분해에 관련되는 MMPs류 발현은 촉진되어 주름살은 증가하게 된다. 따라서, 진피 섬유아세포 (dermal fibroblast)의 증식과 콜라겐 합성을 증가시키거나, MMPs을 억제하는 것은 주름살을 생성을 억제하는 수단이 될 수 있다.

선삼(SG)은 인삼(Panax ginseng)을 고열 고압으로 처리하여 약효가 강한 Rg3, Rg5, Rk1의 함량을 획기적으로 높인 가공 인삼이다(11, 17). 선삼(SG)의 약효로는 항암작용(12), 뇌기능개선작용(13), 혈소판 응집능 차단작용(14)등이 보고되었다.

이에 본 발명자들은 선삼(SG)의 추출물을 이용하여 피부 진피세포에 대한 콜라겐 합성에 미치는 영향에 대해서 평가하고, UV에 의한 피부진피세포의 상해에 미치는 영향을 평가하고자 하였다. 이를 위하여 사람의 진피세포인 F6 세포에서 PICP, TIMP-1 생성능을 측정하여 피부 주름살 개선의 효과를 보고자 하였다. 또한, 진피세포에 자외선 처리하여 LDH, NO 유리 및 MMP-1, procollagen, iNOS-2, Bcl-2, Bax, c-jun, c-fos, NF-κB의 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가공 인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

따라서, 본 발명은 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 함량의 합보다도 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rk1의 함량의 합이 더 높은 파낙스속 식물의 가공추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본원에서 개시된 파낙스속 인삼 추출물은 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 함량의 합보다도 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rk1의 함량의 합이 더 높은, 바람직하게는 진세노사이드 (Rg3+Rg5)/(Rc+Rd+Rb₁+Rb₂)의 비율이 1.0이상, 보다 바람직하게는 3.0 이상, 보다 더 바람직하게는 5.0 이상임을 특징으로 한다.

구체적으로 또한 본 발명의 상기 가공된 파낙스속 인삼 추출물은 파낙스속 식물을 세절하여 가압멸균기에 넣고 70 ℃ 내지 150 ℃에서, 약 2 내지 30기압 하에서 약 1시간 내지 24시간 동안 가열하여 얻어지는 추출물임을 특징으로 한다.

보다 구체적으로 또한 본 발명의 상기 가공된 파낙스속 인삼 추출물은 파낙스속 식물을 세절하여 가압멸균기에 넣고 70 ℃ 내지 150 ℃에서, 약 2 내지 30기압 하에서 약 1시간 내지 24시간 동안 가열한 후, 시료 중량의 약 1배 내지 20배 중량비(w/w)의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로, 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각추출, 또는 가열추출 법으로 추출한 후, 그 여과물을 여과하고 감압농축 및 건조하는 단계를 포함하는 공정을 통하여 수득되는 인삼 가공 추출물임을 특징으로 한다.

또한 본원에서 정의되는 “파낙스속 인삼”은 통상적으로 상용되는 인삼일 수 있으며, 바람직하게는 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer), 화기삼(Panax quinquefolium), 전칠삼 (Panax notoginseng), 죽절삼 (Panax japonicum), 삼엽삼 (Panax trifolium) 또는 히말라야삼 (Panax pseudoginseng) 등과 같은 인삼을 포함한다.

이하, 본 발명의 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 가공 인삼 추출물은, 건조된 인삼을 세절하여 가압멸균기에 넣고 70 ℃ 내지 150 ℃, 바람직하게는 100 ℃ 내지 130 ℃에서, 약 10 내지 30기압, 바람직하게는 13 내지 18기압하에서 약 1시간 내지 24시간, 바람직하게는 3시간 내지 5시간 동안 가열한 후, 시료 중량의 약 1배 내지 20배, 바람직하게는 약 3배 내지 10배의 중량비(w/w)의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매로, 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각추출, 가열추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각추출법으로 추출한 후, 그 여과물을 여과하고 감압농축 및 건조하는 단계를 포함하는 공정을 통하여 본 발명의 인삼 가공 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 가공인삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

따라서, 본 발명은 건조된 인삼을 세절하여 가압멸균기에 넣고 70 ℃ 내지 150 ℃, 바람직하게는 100 ℃ 내지 130 ℃에서, 약 10 내지 30기압, 바람직하게는 13 내지 18기압하에서 약 1시간 내지 24시간, 바람직하게는 3시간 내지 5시간 동안 가열한 후, 시료 중량의 약 1배 내지 20배, 바람직하게는 약 3배 내지 10배의 중량비(w/w)의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매로, 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각추출, 가열추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각추출법으로 추출한 후, 그 여과물을 여과하고 감압농축 및 건조하는 단계를 포함하는 공정을 통하여 수득되는 인삼 가공 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 가공인삼 추출물의 피부 주름 개선용 화장료 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.001 내지 90 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%로 사용이 가능하다.

또한, 본 발명의 가공인삼 추출물을 포함하는 상기 화장료 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다. 수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E (DL-알파 토코페롤, D-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 DL-알파토코페롤, 니코틴산 DL-알파 토코페롤비타민 E. DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등)도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 (나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리 (카프릴, 카프린산) 글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디 (카프릴, 카프린산) 프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소소테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에텔, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아리리, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틴실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산메틸세틸옥시실록산 공증합체, 디메틸실록산메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산타느륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B (중합도 n=2 이상), 폴리프로필렌글리콜 (중합도 n=2 이상), 폴리글리세린B (중합도 n=2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다. 지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다. 수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다. 지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈· 에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈· 헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌) 솔비탄지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POE· POP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POE· POP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리에틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸멘질암모늄, 보름화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체 등의 무기 안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘등의 아미드술폰산 다가금속염; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘텔, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메녹시계피산옥틸, 다파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4‘-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-ρ-(카르보-2’-에틸헥실-1‘-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 3 중량%로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1, 3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상 회석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 선삼 추출물을 함유하는 조성물은 진피 섬유아세포 (dermal fibroblast)에서 직접적으로 세포의 증식을 증가, 콜라겐과 TIMP-1의 합성 증가, UV 조사로 인해 감소한 진피 섬유아세포의 프로콜라겐 발현을 증가, 콜라겐 분해를 촉진하는 MMP-1의 발현 감소 효과를 나타내는바, 콜라겐의 생성 및 분해에 관련된 인자들을 조절하여 피부 주름 개선용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 선삼 추출물의 진피 섬유아세포 증식의 영향에 관한 도이며,
도 2는 선삼 추출물의 진피 섬유아세포 PICP 발현에 미치는 영향에 관한 도이며,
도 3은 선삼 추출물의 진피 섬유아세포의 TIMP-1 발현에 미치는 영향에 관한 도이며,
도 4는 선삼 추출물의 UVB 조사에 의한 LDH 유리에 미치는 영향에 관한 도이며,
도 5는 선삼 추출물의 UVB 조사에 의한 Nitrite 생성능에 미치는 영향에 관한 도이며,
도 6은 선삼 추출물의 UVB 조사에 의한 MMP-1 유전자 발현에 미치는 영향에 관한 도이며,
도 7은 선삼 추출물의 UVB 조사에 의한 Procollagen 유전자 발현에 미치는 영향에 관한 도이며,
도 8은 선삼 추출물의 UVB 조사에 의한 c-fos 유전자 발현에 미치는 영향에 관한 도이며,
도 9는 선삼 추출물의 UVB 조사에 의한 c-jun 유전자 발현에 미치는 영향에 관한 도이며,
도 10은 선삼 추출물의 UVB 조사에 의한 iNOS 유전자 발현에 미치는 영향에 관한 도이다.

이하, 본 발명을 하기에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예1. 선삼 추출물의 제조

건조된 인삼(금산 인삼시장)을 잘게 자른 후 120℃, 15 기압에서 4시간 동안 수증기를 이용하여 가열하였다. 가공된 인삼(이하 “선삼”이라 함) 1 kg에 80% 에탄올 2 L를 가하고 수욕상에서 4시간 이상 환류 추출하여 얻어진 추출물을 감압 농축한 다음 동결 건조하여 추출분말 약 300 g 을 수득하였다. 실험 시에는 선삼 추출물(이하“SG”라 함)을 DMSO(Sigma D-2650)를 이용하여 배지에 녹인 후, pore size 0.45 ㎛의 여과지를 통과시킨 후 사용하였다. 실험에 사용한 선삼 추출물의 (Rg3 + Rg5 + Rk1)/(Rb1 + Rb2 + Rc + Rd)= 6.1 이었다.

실시예 2. 선삼 추출물의 사포닌 함량 분석

실시예 1에서 얻은 본 발명에 따라 제조된 가공인삼에 함유된 인삼사포닌 성분을 다음과 같은 방법에 의해 분석하였다.

40㎖ 용적의 스테인레스 스틸 용기 4개에 각각 백삼 5g과 물 5㎖를 가한 후 밀폐하여 각각 110℃에서 2시간, 120℃에서 2시간 및 3시간 및 130℃에서 2시간 동안 가열하였다. 가열이 끝난 가공인삼, 및 시판품인 백삼 및 홍삼 각 5g 씩을 취하여 메탄올 100㎖씩으로 3회 추출하고 농축시킨 후에 물에 현탁시키고 에테르 100㎖씩으로 3회 추출하였다. 남은 수충을 부탄올 100㎖씩으로 3회 추출한 후에 부탄올 분획을 농축시키고, 수득된 농축물을 메탄올에 용해시켜 HPLC(컬럼: LiChro- sorb NH₂, 이동상: CH₃CN/H₂O/i-PrOH=80/5/15→80/20/15, 검출기: ELSD(Evaporative light scattering detector))로 분석하였다. 측정된 결과는 다음 표 1에 기재된 바와 같다.

상기 표 1에 기재된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 가열처리하여 수득한 가공인삼은 수삼, 백삼 및 홍삼 등에는 거의 또는 전혀 존재하지 않는 인삼 사포닌인 Rg3 및 Rg5 성분의 함량이 현저히 증가하여 우수한 약효를 나타낸다.

상기한 바와 같은 결과에 따라 인삼에 대한 가열온도의 변화에 따른 사포닌 성분, 특히 진세노사이드 Rg3 및 Rg5의 함량 변화를 더욱 구체적으로 확인하기 위하여 가열을 100℃, 110℃, 120℃, 130℃, 150℃, 160℃, 180℃ 및 200℃에서 2시간씩 행하여 얻어진 인삼들의 Rg3 및 Rg5 함량을 측정하여 가열처리하지 않은 인삼(수삼)에서의 함량과 비교하여 보았다. 그 결과는 다음 표 2에 기재한 바와 같다.

상기에서 보는 바와 같이 본 발명에서와 같이 120 내지 180℃에서 가열처리된 가공인삼의 경우에 Rg3 및 Rg5와 같은 진세노사이드의 함량이 비처리 수삼이나 홍삼(100℃ 가열)의 경우에 비해 현저히 증가하였음을 알 수 있다. 실험에 사용한 선삼 추출물의 (Rg3 + Rg5 + Rk1)/(Rb1 + Rb2 + Rc + Rd)= 6.1 이었다.

참고예1 . 세포

실험에 사용된 인간 피부 각질 세포주인 NIH3T3 진피 섬유아세포(dermal Fibroblast)는 ATCC(제품번호:CRL-1658)에서 구입하여 사용하였다.

참고예2. 통계처리

각 결과에 대한 유의성 검증은 student's t-test를 이용하였다. p<0.05 인 경우 유의성이 있다고 판정하였다.

실험예1. 피부 진피세포의 활성에 미치는 영향

1-1. NIH3T3 세포 배양

피부 주름살 억제 효능 물질을 개발하기 위하여 콜라겐 생성 및 분해 실험 연구에 피부 섬유아세포인 NIH3T3 (ATCC, CRL-1658)를 사용하였다. 세포배양에 사용된 배지는 10% FBS와 penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco BRL Co. USA) 배지를 사용하여 5일간 배양하였으며 1일 1회 배지를 교환하였다. FBS(GIBCO 사14-501F)는 잔존하는 보체성분을 불활성화시키기 위해 실온에서 녹인 후에 가열 불활성화(heat inactivation; 56℃ 수욕조에서 30분간 가열)하여 사용하였으며 배지는 0.2 ㎛ 구멍크기 여과지로 여과 후 사용하였다. 세포에 각 조건 별로 96 well plate에는 well 당 100 ㎕, 24 well plate에는 well 당 500 ㎕로 배지를 넣어주었다. 세포를 회수할 때는 trypsin-EDTA(GIBCO사 25200) 1 ㎖을 가하여 37℃에서 1분간 반응시킴으로써 부착된 세포를 분리하고, 배지 4 ㎖을 넣고 1,000 rpm에서 3분 동안 원심분리를 하여 세척한 후에 실험에 사용하거나 필요시 액체질소에서 냉동 보관하였다. 세포는 37℃, 5 % CO₂ 를 사용한 CO₂ 배양기에서 배양하였다.

1-2. 세포 증식( Cell Proliferation ) 측정

세포를 2 x 10⁴ cells/ml의 농도로 6 웰 플레이트(well plate)에 넣고 6시간 배양하여 플레이트에 부착한 다음, 분획하여 조제한 검액을 농도별(2, 10, 50㎍/㎖)로 첨가하여 3일간 배양하였다. 배양완료 후 0.05% trypsin-EDTA(GIBCO사 25200) 를 처리하여 세포를 분리한 다음, PBS(WelGENE사 LB001-02)로 희석하여 Hematocytometer (Fuchs-Rosenthal, Germany)로 세포수를 계측하였다.

실험 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이, 선삼(SG)은 FBS를 가한 진피 섬유아세포 증식을 현저히 증가시켰다.

1-3. 콜라겐 어세이( Collagen Assay )

상기 실시예에서 얻은 추출물의 프로콜라겐(Procollagen) 생성에 미치는 영향을 측정하기 위하여 펩티드(procollagen type-I C-peptide; PICP)를 ELISA Kit(TaKaRa, Japan)를 사용하여 문헌에 기재된 바대로 측정하였다.(15)

콜라겐은 전신의 결체조직을 구성하는 단백질로서 전구체인 프로콜라겐(procollagen)으로서 형성된다. 프로콜라겐은 성숙한 콜라겐과 여분의 펩타이드로 구성되어 있는데, 이 펩타이드는 콜라겐이 성장하고 있는 콜라겐 피브릴(collagen fibril)로 끼어 들어가기 전에 특이한 단백질분해효소(protease)에 의해 분해한다. 이 분해된 펩타이드인 PICP (Procollagen Type I C-Peptide)는 세포밖으로 유리되어 나타나 콜라겐 합성의 지표가 된다.

PICP 정량은 EIA kit(TaKaRa MK101, Japan)를 사용하였다. 간략히 기술하면, 우선 96 웰 플레이트(well plate)에 100 ㎕의 세포 배양액을 넣고 25℃에서 120분간 배양시켰다. 세척용 완충액으로 3번 씻어낸 후 anti-PICP를 100 ㎕ 가하고 다시 22℃에서 45분간 배양시켰다. 세척용 완충액으로 3번 다시 씻어 내고 효소 접합체(Enzyme Conjuagte) 100 ㎕를 가한 다음에, 22℃에서 45분간 배양시켰다. 다시 3번 씻어낸 후 TMBZ(3,3',5,5' -tetramethylbenzidine) 용액 100 ㎕를 가하고 22℃에서 30분간 배양시킨 다음 1N 황산용액 50 ㎕를 가하고 405 nm에서 광학밀도(optical density)를 구했다.

실험 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 선삼(SG)은 FBS 처리한 섬유아세포(fibroblast)에서 PICP 생성을 직접적으로 증가시켰다.

1-4. TIMP -1 Assay

상기 실시예에서 얻은 추출물의 TIMP-1의 검출을 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.(16)

상기 실험예 1-3 조건에서 24 웰 플레이트에 준비한 세포를 배양한 배지를 1:10으로 희석하고 그 중 50 ㎕를 사용하여 키트(TIMP-1 immunoassay kit; R&D Systems, Inc.)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한다.

TIMP-1 (tissue inhibitor of martrix metalloproteinase-1)은 진피조직 성분인 콜라겐을 분해하는 효소를 억제하는 진피조직 물질로서 콜라겐을 분해하는 MMP의 작용을 억제하는 작용을 나타낸다. 따라서, TIMP-1은 진피조직을 분해하는 MMP류를 억제하여 직접적으로 진피를 보호하는 매개변수(parameter)로 평가할 수 있다. 따라서, TIMP-1를 증가시키는 물질은 진피조직의 콜라겐의 분해를 억제할 수 있다.

실험 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, 선삼(SG)은 FBS 처리한 섬유아세포에서 TIMP-1 생성을 직접적으로 증가시켰다.

실험예 2. UV 에 의한 상해에 미치는 영향

2-1. 자외선 조사 및 약물처리

자외선 조사는 UVATEC(Sherman Oaks, CA, USA) 조사기를 이용하였으며, UVB lamp를 사용하여 290-320 nm 파장을 가지는 자외선을 조사하였다. 광량은 기기(IL 1700 radiometer, International Light Inc., MA, USA)를 사용하여 측정하였다. 자외선을 조사하기 전에 1시간 동안 약물을 농도별(2, 10, 50 ㎍/㎖)로 가하여 미리 배양하였다. 자외선을 조사하기 위하여 DMEM 배지를 제거한 다음에, PBS로 2번 씻어낸 후 UVB 파장의 자외선을 30 mJ/cm² 이 되도록 조사하였다. 자외선을 조사한 다음 PBS로 한번 씻어낸 후, 약물이 농도별로 함유된 새로운 DMEM 배지를 넣고 12 시간동안 배양한 후 실험에 사용하였다.

2-2. LDH 유리능 측정

세포를 96 웰 플레이트를 이용하여 24시간 동안 미리 배양한 후, 1시간 동안 약물을 함유한 배지로 전처리 하였다. 세포는 웰당 1x10⁴ 개씩 넣었다. 배양액을 제거한 다음 각 well에 50 ㎕의 PBS(phosphate buffered saline)를 넣은 다음, 세포에 UVB를 30 mJ/cm² 를 조사한 후 PBS를 제거하고 웰당 약물이 포함된 200 ㎕의 DMEM 배지를 첨가하였다. 24시간이 경과한 다음 배양액을 취하여 세포 손상의 지표로 LDH (lactate dehydrogenase) 활성을 측정하였다. LDH 활성은 Sigma사의 LDH kit(Sigma S 500)을 이용하여 정량하였으며, ELISA Reader(Molecular Device사 Emax)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. UV에 의한 피부진피 세포 상해를 측정하기 위하여, 진피 섬유아세포 (dermal fibroblast) 인 F6 세포에 UV를 조사한 후에 유리되는 LDH를 측정하였다.

실험 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, UV 조사시에 세포로부터 LDH 의 유리가 증가하였다. 또한, 선삼(SG)을 처리한 경우, UV로 조사한 대조군에 비해 LDH의 유리를 억제하여, UV에 의한 진피 세포 상해를 억제하는 작용을 나타내었다.

2-3. 니트라이트( Nitrite ) 생성능 측정

상기 실험예 2-2에 기술한 LDL 측정법과 동일한 과정으로 배양한 다음에 실험군에서 배지 상층액을 취하였다. NaNO₂ 용액(Sigma사 S2252)의 연속적인 희석액을 만들어 최종농도가 0.05 μM가 되도록 조절하였다. 먼저 얻은 세포 배양액과 NaNO₂ 희석액에 동량의 시약(Griess reagent solution, Sigma사 G4410)을 넣고, 15분간 상온에 방치한 다음 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. UV에 의한 피부 진피 세포의 산화적 스트레스를 측정하기 위하여, F6 세포에 UV를 조사한 후 생성되는 니트라이트(nitrite)를 측정하였다.

실험 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, UV 조사시에 세포에서 생성되는 니트라이트 량이 증가하였다. 또한, 선삼(SG)을 처리한 경우, UV로 조사한 대조군에 비해 니트라이트 생성을 억제하여, UV에 의한 산화적 스트레스를 억제하는 작용을 나타내었다.

실험예3 . 유전자 발현에 대한 영향

상기 실시예 1의 선삼 추출물의 MMP-1, Procollagen, c-fos, c-jun, iNOS 유전자 발현에 대한 영향을 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

3-1. 총 RNA 분리

배양하고 있는 섬유아세포(Fibroblast)에 1 ml TRIzol reagent (Invitrogen, Cat.No. 15596018)를 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA 용액에 200㎕의 클로로포름 (Sigma-Aldrich, Cat.No. 288306) : isoamylalcohol (Sigma-Aldrich, Cat.No. 320021) (24:1)을 넣고 강하게 섞은 후 14000rpm으로 원심 분리하여 상층액 500ul를 분리하였다. 0.5 ml 이소프로필 알코올을 여기에 가하여 영하 20도에서 하루밤 RNA를 침전시킨 후에 1400rpm으로 20분간 원심 분리하였다. 상등액을 버린 후, 70% 에탄올 (Sigma-Aldrich, Cat.No. 459844) 로 세척하고 자연 건조시켰다. RNAase 제거수 (RNAase free water, Sigma-Aldrich, Cat. No. 95289) 에서 RNA를 녹인 후에 RNase-free DNase (Promega, Cat.No. M6101) 를 첨가하고 -70℃에서 저장하였다.

3-2. cDNA 제조

대조군 및 시험군에서 각각 분리한 total RNA 액 1 ul에 (1 ug RNA 함유) oligo dT (Promega, Cat.No. C1101) (농도 100pmol) 1 ㎕, 및 RNAase 제거수 (Promega, Cat.No. M6101) 3 ul을 넣은 후 조심스럽게 혼합한 다음, 65^oC에서 10분간 배양하였다. 프라이머(primer)가 아닐링(annealing)하도록 4^oC 에서 약 5분간 방치한 다음, 역전사효소 완충액(Reverse transcriptase buffer), dNTP (Promega, Cat.No. U1515) (각 2.5mM), RNase inhibitor (Promega, Cat.No. N2611), DTT (100nM), 및 역잔사효소 (Reverse transcriptase, M-MLV 200U/ul) (Promega, Cat.No. M5301)을 첨가한 후에, 아주 조심스럽게 혼합하였다. 이 후, 42^oC에서 90분간 배양하고 95^oC에서 5분간 처리한 후에 사용하였다.

3-3. RT - PCR

oligo (dT) primer (Promega, Cat.No. C1101), 반응 완충액(reaction buffer), 50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, pH 8.3) (Promega, Cat.No. M1705), 1 mM dNTP (Promega, Cat.No. U1515) 및 200 unit M-MLV-RT (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase) (Promega, Cat.No. M1705)를 분리한 RNA에 처리하여 역전사를 수행함으로써 cDNA를 합성하였다. PCR은 total volume 25 ㎕에 10X PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 2 pmole의 sense 및 antisense primer를 넣은 혼합액에 cDNA와 1.25 unit의 Taq polymerase (Promega, Cat.No. M8295)을 넣어 PCR을 시행하였다. 사용된 primer는 (주) 바이오니아(한국)에서 주문 생산하여 사용하였다. Procollagen 1α2 (PCol 1α2)의 sense primer는 “GTG GTT ACT ACT GGA TTG ACC”이었으며, antisense는 “TTG CCA GTC TCC TCA TCC AT”를 사용하였다. MMP-1 의 sense primer는 “CGA CTC TAG AAA CAC AAG AGC AAG A”, antisense는 “AAG GT T AGC TTA CTG TCA CAC GCT T”을 사용하였으며, TIMP-1의 sense primer는 “ATC CTG TTG CTG TGG CTG ATA G”, antisense는 “TGC TGG GTG GTA ACT CTT ATT TCA” 이었다. COX-2의 sense primer는 “TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT”, antisense는 “AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT”을 사용하였으며, iNOS의 sense primer는 “CGG TGC TGT ATT TCC TTA CGA GGC GAA GAA GG”, antisense는 “GGT GCT GTC TGT TAG GAG GTC CAA GTA AAG GGC”를 사용하였다. TNFα 의 sense primer는 “TGC ACC ACA GTT TAA ACC CA”이었으며, antisense는 “GAC TCC TTC AGG TGC TCA GG”이었다. NF-κB2의 sense primer는 “TCC ACC TTT AGG TTG CCC TG”, antisense는 “TCT GCT CTC GTC ATG TCA CC”를 사용하였으며, c-Jun의 sense primer는 “GGA TCA AGG CGG AGA GGA AG”, antisense는 “GCG TTA GCA TGA GTT GGC AC”을 사용하였으며, c-Fos의 sense primer는 “GGA GAA TCC GAA GGA AAG G”, antisense는 “GCT TGG GCT CAG GGT CAT TG”를 사용하였다. Bcl-2의 sense primer는 “ACT CTG CTC AGT TTC GCC CT”, antisense는 “TTG TGG CTC AGA TAG GCA C”를 사용하였으며, Bcl-xL의 sense primer는 “ATG TCT CAG AGC AAC CGG”, antisense는 “TCT TTC CGA CTG AAG AGT G”를 사용하였다. Control로는 GAPDH를 사용하였으며 sense primer는 “CAG CCT CGT CCC GTA GAC AAA”이었으며, antisense는 “CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC” 이었다.

PCR 조건은 94℃ 4분, 30 cycles의 [94℃ (20초), 54℃ (20초), 72℃ (30초)], 72℃ 10분이었다(Perkin Elmer, USA) 증폭된 PCR 산물을 2% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하였다. 전기영동 결과 나온 밴드(band)를 밀도(density) 분석 프로그램인 Gel-Pro analyzer 3.1 (Media Cybernetics. USA)을 이용하여 구했다.

3-4. Real time RT - PCR

각각의 optical tube (MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode and Optical Adhesive Films, Applied Biosystems, Cat.No. 4314320)에 3배의 SybrGreen Mix 2.5 ㎕ (Sigma-Aldrich, Cat.No. S9430), 위에서 합성한 cDNA 1 ㎕, 10 pmol/㎕ primer pair mix 1 ㎕, 각각 2.5mM의 dNTP 2ul, 10xTag polymerase buffer 2.5ul, Tag Polymerase 0.3ul 와 14.7 ㎕ H₂O를 넣고, 95^oC 5 min 1 cycle, 95^oC 30sec, 45^oC 30sec, 72^oC 60sec 40 cycles, 95^oC 20 min 1 cycle로 증폭시켰다. PCR을 마친 후 tube를 꺼낸 다음, 반응액 5ul를 사용하여 3% agarose gel에서 PCR specificity를 측정하고, ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Cat.No. 4349157)를 사용하여 real time PCR 결과를 분석하였다.

실험결과, 도 6에 나타난 바와 같이, UV는 MMP-1의 유전자 발현을 증가시켰으며, 선삼(SG)은 UV에 의해 증가된 MMP-1의 유전자 발현을 억제하였다.

Procollagen은 도 7에 나타난 바와 같이, UV 조사시 프로콜라겐(procollagen) 유전자 발현이 억제되었다. 선삼(SG)은 UV에 의해 저하되는 프로콜라겐 유전자 발현을 증가시켰다.

c-fos는 도 8에 나타난 바와 같이, UV 조사시에 세포에서 생성되는 c-fos의 mRNA의 생성이 증가하였다. 또한, SG을 처리한 경우, UV로 조사한 대조군에서 증가한 c-fos 유전자 발현을 감소시켜, UV에 의한 섬유아세포 작용을 억제할 수 있는 것으로 나타났다.

c-jun은 도 9에 나타난 바와 같이, UV 조사시에 세포에서 생성되는 c-jun의 mRNA의 생성이 증가하였다. 또한, SG을 처리한 경우, UV로 조사한 대조군에서 증가한 c-jun 유전자 발현을 감소시켜, UV에 의한 섬유아세포 작용을 억제할 수 있는 것으로 나타났다.

또한, iNOS는 도 10에 나타난 바와 같이, UV 조사시에 세포에서 생성되는 iNOS의 mRNA의 생성이 증가하였다. 또한, SG을 처리한 경우, UV로 조사한 대조군에서 증가한 iNOS 유전자 발현을 감소시켜, UV에 의한 섬유아세포 작용을 억제할 수 있는 것으로 나타났다.

따라서 상기 선삼 추추물은 UV를 조사한 섬유아세포에서 c-jun 과 c-fos, procollagen 이 과잉 발현하였으며 NF-κB 와 MMP-1의 발현은 감소시켰다. 이를 바탕으로 선삼 추출물은 콜라겐의 생성 및 분해에 관련된 인자들을 조절하여 주름살 억제 및 UV 유발 피부손상 억제에 탁월한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

재조합 단백질		프라이머 서열 (Primer sequence)
Prcollagen 1α2	센스: 서열번호1	5'-GTG GTT ACT ACT GGA TTG ACC-3'
	안티센스: 서열번호2	5'-TTG CCA GTC TCC TCA TCC AT-3'
MMP-1	센스: 서열번호3	5'-CGA CTC TAG AAA CAC AAG AGC AAG A-3'
	안티센스: 서열번호4	5'-AAG GT T AGC TTA CTG TCA CAC GCT T-3'
TIMP-1	센스: 서열번호5	5'-ATC CTG TTG CTG TGG CTG ATA G-3'
	안티센스: 서열번호6	5'-TGC TGG GTG GTA ACT CTT ATT TCA-3'
COX-2	센스: 서열번호7	5'-TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT-3
	안티센스: 서열번호8	5'-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT-3'
iNOS	센스: 서열번호9	5'-CGG TGC TGT ATT TCC TTA CGA GGC GAA GAA GG-3'
	안티센스: 서열번호10	5'-GGT GCT GTC TGT TAG GAG GTC CAA GTA AAG GGC-3'
TNFα	센스: 서열번호11	5'-TGC ACC ACA GTT TAA ACC CA-3'
	안티센스: 서열번호12	5'-GAC TCC TTC AGG TGC TCA GG-3'
NF-κB2	센스: 서열번호13	5'-TCC ACC TTT AGG TTG CCC TG-3'
	안티센스: 서열번호14	5'-TCT GCT CTC GTC ATG TCA CC-3'
c-Jun	센스: 서열번호15	5'-GGA TCA AGG CGG AGA GGA AG-3'
	안티센스: 서열번호16	5'-GCG TTA GCA TGA GTT GGC AC-3'
c-Fos	센스: 서열번호17	5'-GGA GAA TCC GAA GGA AAG G-3'
	안티센스: 서열번호18	5'-GCT TGG GCT CAG GGT CAT TG-3'
Bcl-2	센스: 서열번호19	5'-ACT CTG CTC AGT TTC GCC CT-3'
	안티센스: 서열번호20	5'-TTG TGG CTC AGA TAG GCA C-3'
Bcl-xL	센스: 서열번호21	5'-ATG TCT CAG AGC AAC CGG-3'
	안티센스: 서열번호22	5'-TCT TTC CGA CTG AAG AGT G-3'
GAPDH	센스: 서열번호23	5'-CAG CCT CGT CCC GTA GAC AAA-3'
	안티센스: 서열번호24	5'-CAC GAC ATA CTC AGC ACC GGC-3'

하기에 상기 조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 친수성 연고제의 제조

선삼 추출물 9.00%

백색 바세린 36.00%

스테아릴 알콜 31.00%

에텔(또는 메틸)ρ-옥시벤조에이트 미량

프로필렌 글리콜 19.00%

라우릴 황산 나트륨 2.40%

프로필 ρ-옥시벤조에이트 미량

계 100.00%

제제예 2. 유연화장수( 스킨 )의 제조

선삼 추출물 2.00%

글리세린 5.00%

트리에탄올아민 0.50%

토코페릴 아세테이트 1.00%

유동파라핀 5.00%

스쿠알란 5.00%

마카다미아너트 오일 15.00%

폴리솔베이트60 1.00%

솔비탄세스퀴올레이트 1.00%

카르복실비닐폴리머 0.20%

방부제 미량

향 미량

정제수 잔량

계 100.00%

제제예 3. 밀크로션의 제조

선삼 추출물 5.00%

1,3-부틸렌글리콜 4.00%

글리세린 3.00%

올레일알코올 0.05%

폴리솔베이트20 1.00%

방부제 미량

향 미량

정제수 잔량

계 100.00%

제제예 4. 영양 크림의 제조

선삼 추출물 2.00%

글리세린 5.00%

트리에탄올아민 0.50%

토코페릴 아세테이트 1.00%

우동파라핀 5.00%

스쿠알란 5.00%

마카다미아너트 오일 15.00%

폴리솔베이트60 1.00%

솔비탄세스퀴올레이트 1.00%

카르복실비닐폴리머 0.20%

방부제 미량

향 미량

정제수 잔량

계 100.00%

제제예 5. 맛사지 크림의 제조

선삼 추출물 2.00%

바세린 5.00%

유동파라핀 30.00%

밀납 3.00%

폴리솔베이트60 1.00%

솔비탄세스퀴올레이트 1.00%

1,3-부틸렌글리콜 5.00%

글리세린 5.00%

방부제 미량

향 미량

정제수 잔량

계 100.00%

<110> GINSENG SCIENCE, INC. <120> Cosmetic composition comprising the extract of heat-processed panax ginseng showing skin anti-wrinkle activity <130> DIF/2010-04-0005/KH <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Prcollagen 1alpha2 <400> 1 Gly Thr Gly Gly Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Ala Thr 1 5 10 15 Thr Gly Ala Cys Cys 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Prcollagen 1alpha2 <400> 2 Thr Thr Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala Thr 1 5 10 15 Cys Cys Ala Thr 20 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1 <400> 3 Cys Gly Ala Cys Thr Cys Thr Ala Gly Ala Ala Ala Cys Ala Cys Ala 1 5 10 15 Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Gly Ala 20 25 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1 <400> 4 Ala Ala Gly Gly Thr Thr Ala Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr 1 5 10 15 Cys Ala Cys Ala Cys Gly Cys Thr Thr 20 25 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TIMP-1 <400> 5 Ala Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Gly Cys Thr Gly Thr Gly Gly Cys 1 5 10 15 Thr Gly Ala Thr Ala Gly 20 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TIMP-1 <400> 6 Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Ala Ala Cys Thr Cys 1 5 10 15 Thr Thr Ala Thr Thr Thr Cys Ala 20 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 <400> 7 Thr Thr Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Thr Thr Gly Thr Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ala Ala Ala Ala Thr 20 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 <400> 8 Ala Gly Ala Thr Cys Ala Thr Cys Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Ala Thr Cys Thr Thr 20 <210> 9 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS <400> 9 Cys Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Cys Thr 1 5 10 15 Thr Ala Cys Gly Ala Gly Gly Cys Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly 20 25 30 <210> 10 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS <400> 10 Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly Thr Cys Thr Gly Thr Thr Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Ala Gly Thr Ala Ala Ala Gly Gly Gly 20 25 30 Cys <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFalpha <400> 11 Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Ala Gly Thr Thr Thr Ala Ala Ala 1 5 10 15 Cys Cys Cys Ala 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFalpha <400> 12 Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Thr 1 5 10 15 Cys Ala Gly Gly 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NF-kB2 <400> 13 Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Ala Gly Gly Thr Thr Gly Cys 1 5 10 15 Cys Cys Thr Gly 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NF-kB2 <400> 14 Thr Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Cys Gly Thr Cys Ala Thr Gly Thr 1 5 10 15 Cys Ala Cys Cys 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Jun <400> 15 Gly Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Ala Gly 1 5 10 15 Gly Ala Ala Gly 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Jun <400> 16 Gly Cys Gly Thr Thr Ala Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Thr Thr Gly 1 5 10 15 Gly Cys Ala Cys 20 <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Fos <400> 17 Gly Gly Ala Gly Ala Ala Thr Cys Cys Gly Ala Ala Gly Gly Ala Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gly <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Fos <400> 18 Gly Cys Thr Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Gly Gly Thr Cys 1 5 10 15 Ala Thr Thr Gly 20 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-2 <400> 19 Ala Cys Thr Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Thr Thr Thr Cys Gly 1 5 10 15 Cys Cys Cys Thr 20 <210> 20 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-2 <400> 20 Thr Thr Gly Thr Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Ala Thr Ala Gly Gly 1 5 10 15 Cys Ala Cys <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-xL <400> 21 Ala Thr Gly Thr Cys Thr Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Cys Cys 1 5 10 15 Gly Gly <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-xL <400> 22 Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys Gly Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Thr Gly <210> 23 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH <400> 23 Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Gly Thr Cys Cys Cys Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Ala Cys Ala Ala Ala 20 <210> 24 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH <400> 24 Cys Ala Cys Gly Ala Cys Ala Thr Ala Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala 1 5 10 15 Cys Cys Gly Gly Cys 20

Claims (6)

1. 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd의 함량의 합보다도 진세노사이드 Rg3, Rg5, Rk1의 함량의 합이 더 높은 파낙스속 식물의 가공추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 가공된 파낙스속 인삼 추출물은 파낙스속 식물을 세절하여 가압멸균기에 넣고 70 ℃ 내지 150 ℃에서, 약 2 내지 30기압 하에서 약 1시간 내지 24시간 동안 가열하여 얻어지는 추출물임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 가공된 파낙스속 인삼 추출물은 파낙스속 식물을 세절하여 가압멸균기에 넣고 70 ℃ 내지 150 ℃에서, 약 2 내지 30기압 하에서 약 1시간 내지 24시간 동안 가열한 후, 시료 중량의 약 1배 내지 20배 중량비(w/w)의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로, 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각추출, 또는 가열추출 법으로 추출한 후, 그 여과물을 여과하고 감압농축 및 건조하는 단계를 포함하는 공정을 통하여 수득되는 인삼 가공 추출물임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 파낙스속 식물은 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer), 화기삼(Panax quinquefolium), 전칠삼 (Panax notoginseng), 죽절삼 (Panax japonicum), 삼엽삼 (Panax trifolium) 또는 히말라야삼 (Panax pseudoginseng)인 화장료 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 90 중량 %로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액의 제형으로 구성된 그룹에서 선택된 제형임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   

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