KR20120122497A - 멜라닌 생성억제물질 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터의 대량생산방법 - Google Patents

멜라닌 생성억제물질 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터의 대량생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 멜라닌 생성억제물질 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터의 대량생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 멜라닌 생성억제물질의 대량생산방법은 곤충유래 곰팡이를 배양하여 종균 배양액을 제조하는 단계 및 상기 종균 배양액을 글루코스(glucose), 프락토스(fructose), 슈크로스(sucrose), 덱스트린(dextrin) 중 선택된 어느 하나 이상의 탄소원과 트립톤(tryptone), 콘스팁리쿼(CSL, corn steep Liquor) 중 선택된 어느 하나 이상의 질소원을 포함하는 배지에 접종한 후, 이를 배양하여 멜라닌 생성억제물질을 대량생산하는 단계를 포함한다.
본 발명에 의해, 멜라닌 생성억제 활성이 뛰어난 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터(S-(-)-10,11-Dihydroxyfarnesic acid methyl ester)의 대량생산이 가능하다.

Description

멜라닌 생성억제물질 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터의 대량생산방법{MASS PRODUCING METHOD OF S-(-)-10,11-DIHYDROXYFARNESIC ACID METHYL ESTER FOR SUPPRESSING MATTER OF MELANOGENESIS}
본 발명은 멜라닌 생성억제물질의 대량생산방법에 관한 것으로, 특히 최적화된 배양조건을 통하여 멜라닌 생성억제 활성이 뛰어난 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터(S-(-)-10,11-Dihydroxyfarnesic acid methyl ester)의 대량생산방법 에 관한 것이다.
피부의 과색소 침착은 피부의 염증 반응 이후의 체내 호르몬 이상, 유전질환, 및 자외선 조사 등 여러 요인에 의해 발생할 수 있으며, 주된 요인으로 멜라닌 색소 합성 이상 및 분포 이상을 들 수 있다.
상기 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능이 있다.
그러나 멜라닌의 과잉생성은 기미, 주근깨 등을 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있으므로, 최근에는 멜라닌 과잉생성 예방을 목적으로 하는 약제의 개발이 활발히 진행되고 있다.
멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나제(Tyrosinase)의 작용에 의해 티로신이 도파(dopa), 도파퀴논(Dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거쳐 생성된다.
이에, 대부분의 미백관련 연구는 멜라닌합성에 관여하는 티로시나제 효소를 직접 억제하는 물질에 집중되고 있다.
최근 멜라닌 억제제로는 파라메톡시페놀(p-methoxyphenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 코지산(kojic acid) 등이 사용되고 있으나, 이들은 활성이 약하거나 색소세포의 변성 또는 치사를 일으키고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 나타내기도 한다.
또한, 멜라닌 생성억제를 목적으로 비타민 C 및 그 유도체 등이 사용되고 있으나, 이들은 티로시나제 저해활성이 낮다는 단점을 가지고 있다
따라서 소량으로도 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 유도체에 대한 개발이 요구되며, 이를 산업적으로 사용하기 위하여 대량생산할 수 있는 조건을 탐색할 필요도 있다.
본 발명은 최적화된 배양조건을 통하여 멜라닌 생성억제 활성이 뛰어난 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터(S-(-)-10,11-Dihydroxyfarnesic acid methyl ester)의 대량생산방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 기술적 수단은, 멜라닌 생성억제물질의 대량생산방법은 곤충유래 곰팡이를 배양하여 종균 배양액을 제조하는 단계 및 상기 종균 배양액을 글루코스(glucose), 프락토스(fructose), 슈크로스(sucrose), 덱스트린(dextrin) 중 선택된 어느 하나 이상의 탄소원과 트립톤(tryptone), 콘스팁리쿼(CSL, corn steep Liquor) 중 선택된 어느 하나 이상의 질소원을 포함하는 배지에 접종한 후, 이를 배양하여 멜라닌 생성억제물질을 대량생산하는 단계를 포함한다.
상기 탄소원은 상기 배지 총 중량을 기준으로 3 중량%를 함유한다.
상기 질소원은 상기 배지 총 중량을 기준으로 0.5~2 중량%를 함유하며, 바람직하게는 상기 질소원은 트립톤(tryptone)과 콘스팁리쿼(CSL, corn steep Liquor)을 1:1 중량비로 혼합한 것이 좋았다.
상기 종균 배양액은 곤충유래 곰팡이를 접종한 배지를 25~27 ℃에서 5~7일간 1차 배양하고, 이를 종균배양을 위한 액체배지에 접종하고 160~180 rpm, 25~27 ℃에서 3~4일간 2차 배양하여 제조한다.
상기 멜라닌 생성억제물질은 플라스크 또는 발효조에 1.5 ~ 3.5 중량%의 상기 종균배양액을 접종하여 생산된다.
또한, 상기 멜라닌 생성억제물질은 상기 종균 배양액을 pH 6.0~6.5인 발효배지에서, 25~27 ℃의 배양온도로 0.5~1 vvm의 통기조건 및 1 kg/cm2의 내압하에서 100~300 rpm으로 배양하여 생산된다.
본 발명의 또 다른 기술적 수단은 상기 대량생산방법으로 대량생산된 멜라닌 생성억제물질 및 이를 함유하는 멜라닌 생성억제제이다.
상기 멜라닌 생성억제물질은 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터(S-(-)-10,11-Dihydroxyfarnesic acid methyl ester)인 것이 특징이다.
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명은 멜라닌 생성억제 활성이 뛰어난 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터(S-(-)-10,11-Dihydroxyfarnesic acid methyl ester)의 대량생산이 가능하므로 산업상 이용이 가능하다.
도 1은 탄소원 및 질소원에 따른 멜라닌 생성억제물질의 활성을 나타낸 도면.
도 2는 소형 배양조(5 ℓ jar fermenter)에서 배양조건에 따른 멜라닌 생성억제물질의 활성을 나타낸 도면.
도 3은 대형 배양조(Pilot fermenter, 300 ℓ)를 통해 생산된 배양액을 HP20으로 1차 분리하여 얻은 물질분리 및 이의 활성을 나타낸 도면.
도 4는 도 3에서 얻은 물질을 실리카겔(Silicagel)로 2차 분리하여 얻은 멜라닌 생성억제물질의 분리 및 활성을 나타낸 도면.
도 5는 HPLC를 이용한 단파장 분획물의 분석상태를 나타낸 도면.
도 6은 prep-HPLC를 이용한 단일물질의 순수분획물의 분석상태를 나타낸 도면.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 또한 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명은 뛰어난 멜라닌 생성억제능을 갖고 있는 물질을 대량생산하기 위해 통계적으로 유의성 있는 대량생산 최적화를 달성하여 산업상 이용이 가능하도록 한다.
구체적으로 설명하면, 본 발명은 멜라닌 생성억제 물질을 생산할 수 있는 종균으로 곤충유래 곰팡이를 이용하여 대량생산 최적화를 달성한다.
상기 곤충유래 곰팡이는 다른 곰팡이와 마찬가지로 그 성상이 변하기 쉬우므로, 곤충유래 곰팡이의 돌연변이주(자연발생 또는 유발생), 형질융합체 또는 유전자 재조합체라도 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터(S-(-)-10,11-Dihydroxyfarnesic acid methyl ester)의 생산성이 있는 곤충유래 곰팡이는 모두 발명의 범주에 포함된다.
본 발명자들은 상기 종균배양에서 생성되는 멜라닌 생성억제물질의 생산성을 향상시켜줄 수 있는 영양원(탄소원 및 질소원)의 종류 및 함량을 확인하고, 최적화된 배양조건(배양온도, 통기조건, 내압, 배양시간, 교반정도)을 확립하였다.
배지에 첨가되는 탄소원은 글루코스(glucose), 프락토스(fructose), 슈크로스(sucrose), 덱스트린(dextrin) 중 선택된 어느 하나 이상을 사용하고, 질소원은 트립톤(tryptone), 콘스팁리쿼(CSL, corn steep Liquor) 중 선택된 어느 하나 이상을 사용한다.
이때, 상기 탄소원은 상기 배지 총 중량을 기준으로 3 중량%로 함유된다.
상기 질소원은 상기 배지 총 중량을 기준으로 0.5~2 중량%로 함유되며, 트립톤(tryptone)과 콘스팁리쿼(CSL, corn steep Liquor) 2종으로 구성되는 경우 1:1 중량비로 혼합한 것을 사용한다.
본 발명은 상기와 같이 조성된 배지에 곤충유래 곰팡이 종균 배양액을 배양하여 멜라닌 생성억제물질을 대량생산하게 된다.
즉, 상기 종균 배양액은 곤충유래 곰팡이를 접종한 배지를 25~27 ℃에서 5~7일간 1차 배양하고, 이를 종균배양을 위한 액체배지에 접종하고 160~180 rpm, 25~27 ℃에서 3~4일간 2차 배양하여 생성된다.
바람직하게는 상기 종균 배양액은 곤충유래 곰팡이를 접종한 한천배지를 항온배양기에서 27 ℃에서 7일간 1차 배양하고, 이를 종균배양을 위한 액체 배지에 일정량을 접종한 뒤 180 rpm, 27 ℃에서 3~4일간 2차 배양한 후 플라스크 또는 소형발효조 배지에 접종하여 배양하며, Pilot 발효조에 접종하기 위한 종균배양은 상기 종균을 1차로 하여 이를 다시 큰 용량의 2차 종균배양을 위한 액체배지에 접종하여 160rpm, 27 ℃에서 4일간 배양하여 생성된다.
이렇게 생성된 종균배양액은 플라스크 또는 발효조에 접종시키고 이를 배양의 최적조건하에서 배양하여 멜라닌 생성억제물질을 대량생산하게 되는데, 이때, 1.5 ~ 3.5 중량%의 종균배양액을 접종한다.
배양의 최적조건은 배지의 pH 6.0~6.5, 배양온도 25~27 ℃, 통기조건(aeration) 0.5~1 vvm(volume of air added to liquid volume per minute), 내압강도(단위면적당의 하중, P.S) 1 kg/cm2, 교반속도(agitation) 100~300 rpm 이 된다.
상기와 같은 배양조건을 통해 대량생산되는 물질은 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터(S-(-)-10,11-Dihydroxyfarnesic acid methyl ester, 이하, EF-1 이라고 명명한다.)로서 멜라닌 생성을 억제한다.
이에, 본 발명은 상기 멜라닌 생성억제물질을 포함한 멜라닌 생성억제제를 제공한다.
상기 멜라닌 생성억제제에는 약리학적으로 허용가능한 물질이 더 포함되는데, 이때 약제 또는 화장료에 통상적으로 사용되는 부형제, 담체 또는 희석제로, 예컨대 물, 생리식염수, 글리세롤 등이 사용되며 이에 한정되진 않는다.
본 발명의 멜라닌 생성억제제는 약제, 화장료 또는 세정제로 사용가능하며, 이의 제형은 사용방법 및 목적에 따라 달리 적용할 수 있다.
제형의 일예로는 로션제(lotion), 액제(液劑), 유제, 에멀션제, 현탁제(懸濁劑), 정제(錠劑) 및 캡슐제(capsule)가 있다.
화장료로 사용되는 경우 유연 화장수, 밀크로션, 영양크림, 맛사지 크림, 에센스, 클렌싱 폼, 클렌싱 워터, 팩 또는 보디오일 등의 기초 화장료 및 화운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료 형태로 활용가능하다.
세정제로 사용할 경우, 세안제 및 목욕제로 활용가능하다.
이하, 본 발명에 대하여 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 플라스크 및 소형 배양조 내에서의 배지 조성물과 배양조건에 따른 최적화 조건 확립
1. 백강균 CS1029의 종균배양
SDA(sabourand dextrose agar)에 백강균 CS1029를 접종하여 항온배양기(27℃, 1주)에서 배양한 후 멸균된 액체배지 SDA에서 배양된 CS1029를 4~5조각(8mm×8mm)를 취하여 PDB(potato dextrose broth, 100 ㎖/250 ㎖ flask)에 접종하였으며, 항온진탕배양기(27℃, 180rpm)에서 4일간 배양하였고, 이후 종균배양액을 각 준비된 시험배지에 1.5~3.5 중량%를 접종하였다.
2. 멜라닌 생성억제 측정 시료 준비 및 스트렙토 마이세스 비키니엔시스(Streptomyces bikiniensis)를 이용한 멜라닌 생성 억제물질 확인 방법
배양이 완료된 후 배양액 10 ㎖를 취하여 유기용매 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 1회 추출한 뒤 감압농축기로 농축하여 멜라닌 억제물질 생산성 분석을 위한 시료를 준비하였다.
Papaviza'VDYA agar(하기 표 1) 플레이트에 S. bikiniensis를 접종하여 27℃, 2주간 배양한 후 아가(agar)표면에 생성된 포자(spore)를 염분(saline, 0.85% NaCl) 용액으로 현탁하여 취하였다.
이 후 이 현탁액을 Papaviza'VDYA 아가 플레이트(agar plate)에 도말하여 건조하고, 8mm 와트만 페이퍼 디스크(Whatman paper disk)에 시료 45 ㎕/disk 점적하여 건조하고 준비된 플레이트(plate) 위에 올려 27℃, 48시간동안 항온배양기에서 배양한 후 백색 환의 생성유무를 관찰하여 멜라닌 생성억제물질을 정성적으로 판별하였다.
공통배지성분 함량(/L)
V-8 juice 200 ㎖
glucose 2 g
yeast extract 2 g
CaCO3 1 g
agar 20 g
3. 탄소원 및 질소원 종류별로 첨가한 배지 제조
하기 표 2,3에 나타난 배지를 제조한 후 121℃, 20분 동안 살균하였다.
이 후 상기 1의 방법을 이용하여 접종 및 배양을 수행하였다.
플라스크 배양을 위한 배지 및 첨가된 탄소원/질소원 종류와 함량
공통배지성분 함량(중량%) 탄소원 종류 질소원 종류
탄소원 3.0 글루코스(glucose)
프락토스(fructose)
슈크로스(sucrose)
덱스트린(dextrin)		 CSL

Tryptone
질소원 0.5~2.0
KH2PO4 0.05
K2HPO4 0.1
MgSO4?7H2O 0.05
성분 배지조건
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
탄소원 G F S D G F S D G F S D G F S D
질
소
원		 Try 1% 1% 1% 1% - - - - - - - - 0.5% 0.5% 0.5% 0.5%
CSL - - - - 1% 1% 1% 1% 2% 2% 2% 2% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5%
G : Glucose, F : Fructose, S : Sucrose, D : Dextrin, Try : Tryptone
4. 소형 배양조(5ℓ)를 이용한 멜라닌 생성억제물질의 생산
하기 표 4에 나타난 배지를 제조하여 소형 배양조에 삽입한 후 121℃, 30분 동안 살균하였다.
이 후 상기 1의 방법을 이용하여 소형 배양조에서의 접종 및 배양을 수행하였다.
배양조의 배양조건은 표 5와 같이하여 수행하였다.
배양조 배지
공통배지성분 함량(중량%)
Sucrose 3.0
CSL 2.0
KH2PO4 0.05
K2HPO4 0.1
MgSO4?7H2O 0.05
소형 배양조 배양조건
항목 기본조건 변동조건
agitation(rpm) 200 100 또는 300
aeration(vvm) 1 0.5
내압(PS) 1 -
온도(℃) 27 -
pH control 안함
(초기 pH 6.2~6.4)		 pH 6.0 유지
seed 접종량(%) 2.5 1.5 또는 3.5
<실시예 2> Pilot 배양조(300ℓ)를 이용한 멜라닌 생성억제물질의 대량생산
본 배양을 위해 상기 표 4에 나타난 배지를 제조하여 Pilot 배양조(150ℓ/300ℓ)에 삽입한 후 121℃, 30분 동안 살균하였다.
1차 종균은 SDA에서 배양된 CS1029를 4~5조각(8mm×8mm)를 취하여 PDB (100㎖/ 250㎖ flask × 3ea)에 접종 한 후 배양(180rpm, 27℃, 3일)하였고, 1차 종균 배양액을 2차 종균배지(500㎖/1ℓ flask × 6ea)에 50㎖씩 접종하여 배양(160rpm, 4일) 한 후 Pilot 배양조에 접종하였다.
Pilot 배양조의 배양조건은 100rpm, 27℃, 1vvm, 1 kg/cm2(내압), pH6.5(초기 pH, control 하지 않음)이다.
상기조건에서 발효된 배양액을 원심분리기를 이용하여 균사체를 제거한 후 감압농축기를 통하여 분리,정제에 적합한 액량으로 농축하였다.
<실시예3> 오픈칼럼 및 HPLC를 이용한 멜라닌 억제 물질의 분리 및 정제
1. 오픈칼럼 크로마토그래피에 의한 분리 정제방법
1-1. HP20을 이용한 1차 분리
실시예 2를 통해 제조한 시료를 충진제로써 HP20(100mm ×1300mm)을 이용하여 1차 분리를 실시하였다.
전개용매는 35% 에탄올(ethanol)로 충진제 부피의 3배의 양으로 세척한 후 80% 에탄올(ethanol)로 충진제 부피의 4배로 멜라닌 생성억제물질을 추출하였다.
이후 감압농축기를 사용하여 2차 오픈칼럼 크로마토그리피를 위해 최소한의 양으로 농축하였다.
1-2. 실리카겔(silicagel)을 이용한 2차 분리
상기 1-1에서 용매추출에 의해 분획된 추출물을 충진제로써 실리카겔(silicagel; 55mm×800mm, 0.40~0.63㎛)을 이용하여 2차 추출을 실시하였다.
전개용매는 클로로포름(chloroform)과 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 100:10, 100:20, 100:30(중량비)으로 제조하여 순서대로 전개하였다.
2. HPLC 분석 및 prep-HPLC을 이용한 단일물질(S-(-)-Dihydroxyfarnesic acid methyl ester) 분리
2-1. HPLC 분석 조건
상기 1-2에서 취한 시료들을 HPLC (shimadzu LC-6AD)를 이용하여 분석하였다.
분석조건은 Shim-pack VP-ODS 150mm×4.6mm 컬럼으로 초순수와 아세토니트릴(acetonitrile)용매를 혼합하여 사용하였다.
유속 0.5㎖/min, 컬럼오븐온도 40℃이며 검출기는 PDA(shimadzu SPD-M10Avp)를 사용하였다.
2-2. prep-HPLC을 이용한 단일물질 분리
상기 1-2 에서 취한 시료들을 HPLC (shimadzu LC-6AD)를 이용하여 분석하였다.
분석조건은 Shim-pack Prep-ODS(H) Kit 250mm×20mm column으로 초순수와 acetonitrile용매를 혼합하여 사용하였다. 유속 5㎖/min, 상온, 검출기는 PDA(shimadzu SPD-M10Avp)를 사용하였다.
<실험예 1> 플라스크를 이용한 멜라닌 억제물질의 대량생산에 적합한 탄소원 및 질소원 확인
실시예 1과 같은 조건하에 멜라닌 생성 억제물질의 대량생산에 적합한 탄소원 및 질소원 확인하였다.
그 결과, 하기 표 6과 도 1에 나타나 있듯이, 질소원으로 CSL 2 중량% 또는 tryptone 0.5 중량% + CSL 0.5 중량%가 첨가된 배지에서 모든 탄소원에 대한 멜라닌 생성억제 활성이 나타냄을 확인하였다.
또한, fructose를 탄소원으로 공급하였을 때 활성이 가장 우수하게 나타났으며, sucrose 또는 dextrin 첨가배지에서 fructose 다음으로 높은 멜라닌 생성억제 활성을 나타냄을 확인하였다.
이에, 대량배양를 통한 배양 시에는 배지 구입 편의성과 단가에서 저렴한 sucrose 3 중량% + CSL 2 중량%가 대량생산을 위한 적절한 배양 배지 조건으로 판단된다.
탄소원/질소원에 따른 멜라닌 생성억제물질의 활성 비교
활성 배지
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
지름
(mm)		 + 7 + + + 16 12 13 15 17 16 16 18 19 17 17
<실험예 2> 소형발효조(5ℓ Jar Fermenter)에서의 멜라닌생성 억제물질 대량생산을 위한 발효조건 최적화
실시예 1과 같은 조건하에 멜라닌 생성 억제물질의 대량생산에 적합한 발효 조건을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 7과 도 2에 나타나 있듯이, 소량배양조(5ℓ Jar Fermenter)에서는 교반조건을 300rpm으로 배양했을 시 가장 높은 멜라닌생성억제물질의 활성을 나타내었다.
그러나 균사체 대신 포자생산이 높아 후속공정의 어려움이 있었다.
또한, 균사체 농도가 가장 높은 조건은 교반속도를 100rpm에서 배양할 때이며 이는 낮은 교반속도로 인한 shear stress가 낮은 원인으로 판단된다.
가장 낮은 멜라닌생성억제물질의 생산 조건은 통기속도(aeration)를 0.5 vvm으로 50% 감축한 조건과 종균양을 3.5%로 접종한 조건임을 확인하였다.
배양조건에 따른 멜라닌 생성억제물질 생산성 비교
활성 배양변동 조건
control seed
1.5%		 seed
3.5%		 0.5vvm pH 6.0
유지		 100 rpm 300 rpm
지름
(mm)		 17 17 15 15 17 17 18
<실험예 3> 다량 포함된 멜라닌 억제물질(S-(-)-Dihydroxyfarnesic acid methyl ester)의 추출, 분리 정제
상기 실시예 2를 통해 제조된 시료와 실시예 3를 통하여 멜라닌 생성억제 단일물질을 분리, 정제하였으며 이 물질의 멜라닌 생성억제 활성을 확인하였다.
1. 오픈칼럼 크로마토그래피에 의한 분리 정제
1-1. HP20을 이용한 1차 분리
도 3에 나타나 있듯이, 80% 에탄올(ethanol) 전개 시 멜라닌생성억제물질로 예상되는 단파장 spot(▼)을 확인하였다.
또한, 단파장(3~7,○)과 장파장(8~12, ▨) 분획물을 취하여 멜라닌생성억제 실험을 한 결과 단파장 분획물에서 활성이 나타냄을 확인하였다.
1-2. silicagel을 이용한 2차 분리
도 4에 나타나 있듯이, 클로로포름(chloroform) : 에틸아세테이트(ethyl acetate)=100:20(중량비) 후반부와 100:30(중량비) 전개 시 멜라닌생성억제물질(EF-1)로 추측되는 단파장 spot(▼)을 확인하였다.
또한, 단파장 분획물(8~14)과 장파장(15~24) 분획물을 취하여 멜라닌생성억제 실험을 한 결과 단파장 분획물에서 활성이 나타남을 확인하였다.
2. HPLC를 이용한 멜라닌생성억제 단일물질의 분리
2-1 HPLC을 이용한 단파장 분획물의 분석
도 5에 나타나 있듯이, PDA 224nm, RT 23min에서 멜라닌 생성억제물질로 추측되는 피크(peak)가 검출됨을 확인하였다.
(2) prep-HPLC를 이용한 단일물질 분리
도 6에 나타나 있듯이, 순도 95% 이상의 멜라닌생성억제물질을 분획함을 확인하였다.
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명은 멜라닌 생성억제 활성이 뛰어난 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터(S-(-)-10,11-Dihydroxyfarnesic acid methyl ester)이 대량생산되며, 이를 함유한 멜라닌 생성억제제의 대량생산도 가능하므로 산업상 이용이 가능하다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. 곤충유래 곰팡이를 배양하여 종균 배양액을 제조하는 단계; 및
    상기 종균 배양액을 글루코스(glucose), 프락토스(fructose), 슈크로스(sucrose), 덱스트린(dextrin) 중 선택된 어느 하나 이상의 탄소원과 트립톤(tryptone), 콘스팁리쿼(CSL, corn steep liquor) 중 선택된 어느 하나 이상의 질소원을 포함하는 배지에 접종한 후, 이를 배양하여 멜라닌 생성억제물질을 대량생산하는 단계;를 포함하는,
    멜라닌 생성억제물질의 대량생산방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 탄소원은 상기 배지 총중량을 기준으로 3 중량%로 함유되는,
    멜라닌 생성억제물질의 대량생산방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 질소원은 상기 배지 총중량을 기준으로 0.5~2 중량%로 함유되는,
    멜라닌 생성억제물질의 대량생산방법.
  4. 제1항 또는 제3항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 질소원은 트립톤(tryptone)과 콘스팁리쿼(CSL, corn steep liquor)을 1:1 중량비로 혼합한 것인,
    멜라닌 생성억제물질의 대량생산방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 종균 배양액은 곤충유래 곰팡이를 접종한 배지를 25~27 ℃에서 5~7일간 1차 배양하고, 이를 종균배양을 위한 액체배지에 접종하고 160~180 rpm, 25~27 ℃에서 3~4일간 2차 배양하여 제조하는,
    멜라닌 생성억제물질의 대량생산방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 멜라닌 생성억제물질은 플라스크 또는 발효조에 1.5 ~ 3.5 중량%의 상기 종균배양액을 접종하여 생산된,
    멜라닌 생성억제물질의 대량생산방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 멜라닌 생성억제물질은 상기 종균 배양액을 pH 6.0~6.5인 발효배지에서, 25~27 ℃의 배양온도로 0.5~1 vvm의 통기조건 및 1 kg/cm2의 내압하에서 100~300 rpm으로 배양하여 생산된,
    멜라닌 생성억제물질의 대량생산방법.
  8. 청구항 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 대량생산방법으로 대량생산된,
    멜라닌 생성억제물질.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 멜라닌 생성억제물질은 에스-디하이드록시팔네식산 메틸 에스터(S-(-)-10,11-Dihydroxyfarnesic acid methyl ester)인,
    멜라닌 생성억제물질.
  10. 제9항의 멜라닌 생성억제물질을 함유하는,
    멜라닌 생성억제제.
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