KR100604647B1

KR100604647B1 - 펜타마이신의 생산방법

Info

Publication number: KR100604647B1
Application number: KR1020050029240A
Authority: KR
Inventors: 최남희; 김남현; 김민성; 위닙스 엠디 시스
Original assignee: 코바이오텍 (주)
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2005-04-08
Publication date: 2006-07-25
Also published as: KR20050047046A

Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus) KBT501과 이를 이용한 펜타마이신의 생산하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신균주 스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus) KBT501의 개발과 이를 이용하여 항진균제로 알려져 있는 펜타마이신을 고생산성으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

펜타마이신*돌연변이주*스트렙토마이세스 펜타티쿠스

Description

펜타마이신의 생산방법{Method for Producing pentamycin}

본 발명은 미생물을 개발하고 이를 배양하여 펜타마이신을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신균주 스트렙토마이세스 펜타티쿠스

(Streptomyces pentaticus) KBT501의 개발과 이를 이용하여 항진균제로 알려져 있는 펜타마이신을 고생산성으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

펜타마이신의 구조

전 세계 항생제는 연간 250억달러 규모의 시장을 이루고 있고, 이중 약 10%가 항진균제로 추산되고 있다. 항진균제는 HIV 감염, 항암 요법 또는 장기 이식 과정 중에 면역억제제(immunosuppressive drug)의 사용이 증가, 기존 약물에 대한 내성 균주의 확산 등으로 요구량의 증가가 예상되며 보다 큰 시장을 형성할 수가 있을 것으로 생각된다.

펜타마이신은 항진균 역가를 갖는 polyene macrolide 계열의 항생제로 Streptomyces griseofuscus ATCC 23916 또는 Streptomyces pentaticus에서 생산되는 것으로 보고되어 있다. Polyene macrolide는 현재 가장 강력한 항진균 역가를 보이는 항생제로 알려져 있지만, 독성으로 인하여 전신(systemic) 보다는 국소적용(topical application)이 선호되어 왔다. 하지만 최근, 인체면역결핍바이러스(HIV)감염, 항암 요법 또는 장기이식 과정 중에 면역억제제의 사용이 증가함에 따라 균상종의 감염(fungal infection)이 심하게 대두되어 있고, 따라서 예전 보다 강력하고 안전한 항진균제가 요구되고 있는 실정이다. 이러한 문제의 해결 방안으로 polyene macrolide 계열 항생제가 다시 기대를 모으고 있으며, 또한 최근에는 광우병(prion disease)나 인체면역결핍바이러스(HIV) 치료제로도 개발되고 있다.

현재 유사계열의 항생제인 nystatin, amphotericin, candicidin을 중심으로 활발한 연구가 진행되고 있으나 펜타마이신의 경우 이미 질 칸디다증(vaginal candidiasis) 등의 치료제로 사용되어 왔고, 새로운 적응증에 대한 가능성이 있음에도 불구하고 다른 polyene macrolide 에 비해 연구가 미진한 실정이다. 따라서 앞으로 지속적으로 사용량이 증가되어 고부가 가치 창출이 예상되는 펜타마이신의 연구 및 대량생산을 위한 균주개발이 시급하다 할 수 있다.

본 발명자들은 펜타마이신을 대량으로 생산할 수 있는 균주개발을 목적으로 스트렙토마이세스 펜타티쿠스에 돌연변이 처리를 하여 펜타마이신 생산성을 월등 히 향상시키는 균주를 개발하고, 이 균주를 이용하여 발효조에서 배양을 성공함으로서 고역가 생산성 확인 및 산업적 이용 가능성을 제시하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 펜타마이신을 고농도로 생산할 수 있는 돌연변이 주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 돌연변이주를 이용하여 펜타마이신을 고농도로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 고생산성으로 펜타마이신을 생산하는 스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus) KBT501(기탁번호KCCM 10648P)를 제공하는 것을 특징으로 한다.

다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 스트렙토마이세스 펜타티쿠스 KBT501을 이용하여 높은 생산성으로 펜타마이신을 생산하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 미생물을 배양하여 펜타마이신을 생산하는 방법을 설명한 것이며 산업적 생산성을 높이기 위하여 펜타마이신을 높은 수율로 생산할 수 있는 돌연변이주를 선별하였다.

즉, 원주인 스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus)를 스위스의 Necura Pharmaceuticals 사에서 분양받아 이를 UV로 돌연변이 처리하여 펜타마이신의 생산성이 향상된 균주를 선별한 후 이를 스트렙토마이세스 펜타티쿠스 (Streptomyces pentaticus) KBT501로 명명하였다.

상기한 스트렙토마이세스 펜타티쿠스 KBT501을 이용하여 펜타마이신을 생산하는 방법은 우선, 위 균주를 제1배지(밀가루 1~5%, 대두분 1~5%, 염화나트륨 0.1~1%, 탄산칼슘 0.1~1%, 콩기름 0.1~1%)에 접종하여 28℃에서 2~3일 동안 진탕 배양한 후, 이를 제 2배지(밀가루 1~5%, 대두분 1~5%, 염화나트륨 0.1~1%, 콩기름 0.1~1% )에 접종하여 다시 진탕 배양한다. 5일간 배양 후 배양액으로부터 펜타마이신의 함량을 HPLC를 통해 정량분석한다.

이하, 실시 예 및 실험 예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

<실시 예 1> 고역가 생산균주의 분리

모균주인 스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus)를 생장 대수기까지 배양한 후 4,000rpm, 15분의 조건으로 원심 분리하여 상등액을 제거한 균체를 얻을 수 있었다. 이 균체에 0.85% 생리식염수 10ml을 첨가하여 3회 세척하고 다시 생리식염수 10ml을 첨가하여 멸균한 글라스 페트리 디쉬에서 UV를 조사하여 돌연변이를 유발하였다. 이때, UV는 40~60초간 조사하였으며, UV 조사 후 광반응을 방지하기 위하여 UV를 조사한 페트리 디쉬를 호일로 감싼 다음, 4℃에서 두 시간 동안 암반응 시켰다. 그 다음, 글라스 페트리 디쉬로부터 시료를 채취하여 한천배지(덱스트린 0.5~1.0%, 제이인산칼륨 0.05~0.1%, 황산마그네슘 0.05~0.1%, 염화나트륨 0.05~0.1%, 황산암모늄0.1~0.5%, 한천 1~2%)에 도말하여 형성된 수십여 개의 콜로니들을 얻었으며 이렇게 얻은 균주 중 항균활성이 강한 균주를 선별하기 위하 여 이스트(Saccharomyces cerevisiae)배양액을 콜로니 위에 뿌린 후 배양하여 억제환(clear zone)이 크게 형성된 균주를 1차 선별하였다.

<실시 예 2> 선별한 균주 중 펜타마이신의 생산성이 향상된 균주를 확인하기 위하여 상기 실시 예 1에서 얻은 균주들을 제1배지(밀가루 1~5%, 대두분 1~5%, 염화나트륨 0.1~1%, 탄산칼슘 0.1~1%, 콩기름 0.1~1%) 20ml을 포함하는 100ml 삼각플라스크에 접종한 다음 28℃에서 200~300rpm으로 2~3일 동안 진탕 배양한 후, 이를 다시 제 2배지(밀가루 1~5%, 대두분 1~5%, 염화나트륨 0.1~1%, 콩기름 0.1~1% )100ml를 포함하는 500ml 삼각플라스크에 접종하여 28℃에서 200~300rpm으로 5일 동안 진탕 배양하였다. 배양종료 후 배양액으로부터 HPLC를 통해 펜타마이신의 함량을 분석하였으며 pH 및 PMV(packed mycelium volume)을 측정하여 그 결과를 표 1에 나타내었다. HPLC 분석을 통한 발효액 중의 펜타마이신 함량분석 조건은 다음과 같다. 먼저 일정량의 발효액을 취하여 이를 100%메탄올 용액으로 추출한 후 원심분리 및 여과과정을 거친 시료를 HPLC에 주입한다. 이때, 이동상 용매는 60% 메탄올, 40% 인산염완충액(K₂HPO₄ 2g+KH₂PO₄8g/1L H₂O)의 용매를 조제하여 여과후 사용하고 컬럼은 25℃온도조건의 Symmetry C₁₈을 사용하였으며 유속은 0.9ml/min로 조절하고 UV 파장은 338nm 에서 분석하였다.

균주	펜타마이신함량(mg/L)	pH	PMV(%)
돌연변이주 1	120	7.26	22
돌연변이주 2	193	7.00	21
돌연변이주 3	204	7.32	26
돌연변이주 4	105	6.94	23
돌연변이주 5	89	6.88	28
돌연변이주 6	231	7.06	24
돌연변이주 7	220	7.28	25
돌연변이주 8	159	7.15	21
돌연변이주 9	249	7.04	20
돌연변이주 10	266	6.89	18
돌연변이주 11	284	6.84	26
돌연변이주 12	212	7.13	22
돌연변이주 13	286	6.92	21
돌연변이주 14	261	6.68	26
돌연변이주 15	258	6.84	28
돌연변이주 16	106	6.94	24
돌연변이주 17	241	7.03	26
돌연변이주 18	296	6.54	27
돌연변이주 19	125	6.58	30
돌연변이주 20	267	6.79	25
돌연변이주 21	313	6.64	24
돌연변이주 22	308	7.23	19
돌연변이주 23	204	7.15	21
돌연변이주 24	91	6.64	26
돌연변이주 25	138	7.16	19
돌연변이주 26	221	7.41	24
돌연변이주 27	412	6.87	28
돌연변이주 28 *	608	6.58	26
돌연변이주 29	258	6.79	17
돌연변이주 30	164	7.06	18
돌연변이주 31	279	6.94	26
돌연변이주 32	231	6.52	26
돌연변이주 33	107	6.77	28
돌연변이주 34	266	6.28	22

위의 실험결과 결과 펜타마이신에 대한 생산성이 가장 우수한 돌연변이주 28을 선별하여 이를 스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus) KBT501로 명명하였고 한국미생물보존센터에 2005년 2월 22일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM 10648P를 부여받았다.

<실시 예 3> 신규 미생물의 동정

상기에서 분리된 고역가 균주 스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus) KBT501의 생물학적 특징은 다음과 같다.

(1) 형태적 특징

그람 양성을 나타내며 분리 시 작고 분리된 콜로니를 형성하고 거친 표면을 가진다. 초기에는 비교적 부드러운 표면상태를 보이다가 성장이 진행되면서 벨벳표면과 같은 모양의 균사체가 형성된다. 글루코스한천 및 전분한천배지 상에서 자라는 모양을 현미경으로 관찰하면, 가늘게 가지모양으로 자라며 1,2차 나선형을 이루는 균사체가 일직선으로 자라나는 것을 볼 수 있다. 분생자는 거의 보이지 않으며 포자가 형성된 구역에는 초기에 흰색을 보이다가 성숙하면서 보랏빛을 띠는 흰색으로 나타낸다.

(2) 배양학적 특성

펜타마이신을 생산하는 본 균체의 특성을 [표 2]에 나타내었다.

배지	생육형태	기균사	가용색소
글루코스한천	엷은 분홍색에서 배지가운데부터 점차 보라빛으로 변함	흰색, 때로는 분홍색	엷은 갈색
혼합글리세린 한천	곧게 뻗음. 분홍적색 혹은 밝은 적색에서 흐린 적색으로 변함	흰색. 푸석한 핑크색	갈색
혼합설탕한천	연약하고 투명함. 배지속으로 깊이 침투함	없음	없음
전분한천	연하고 색이 없거나 노란색 배지속에 깊이 침투하며 가수분해됨	흰색, 부분적인 분홍색을 띠는 솜털모양의 콜로니	없음
칼슘-말레이트한천	깊은 적색. 가장자리가 불규침함	없음	희미한 갈색
혼합설탕용액	튜브바닥, 표면, 벽에서 희고 둥근 콜로니생성	없음	없음
젤라틴	빠르게 액화됨 표면에 붉은 콜로니생성	없음	깊은 갈색
영양한천	콜로니 없이 젖은 상태거나 갈색을 띠는 흰색으로 나타남	없음	갈색
글루코스	흡수성의 콜로니 혹은 튜브바닥에 약한 침전물형성	없음	갈색
우유	응고 및 펩톤화 발생 흐리고 노란색표면의 고리모양형성. 생육이 약함	없음	없음
포테이토찌끼	강하고 주름지며 젖은상태임. 흙갈색	없음	어두운 갈색
당근찌끼	주름지며 갈색을 띰	약한 분홍의 흰색	옅은 갈색
계란배지	어두운 적색. 주름지며 가운데가 솟음	마른부분에 자주빛 분홍색	생장부위 주변으로 어두운 갈색

(3)생화학적 특성

최적온도 범위는 25℃에서 35℃사이이며, 더욱 좋게는 27℃에서 29℃ 사이이다.

최적 pH 범위는 6.5에서 8.0사이이며 더 좋게는 6.7에서 7.4 사이이다

탄소원에 대한 생육의 속도를 비교하면 다음 [표 3]과 같다.

Control(no sugar)	-
Arobinose	-
Cellulose	-
Fructose	++
Glucose	++
Inositol	+/-
Mannitol	-
Raffinose	-
Rhamnose	-
Sucrose	+
Xylose	-

여기서, (-) = no growth, (+/-)= 40% growth, (+)=80% growth, (+/+)=full growth 배지는 ISP medium 9 사용(DIFCO 사 제품)

<실험 예 1> 펜타마이신 생산성비교

실시 예 2와 동일한 방법으로 실험하여 비교한 결과 모균주인 스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus)의 생산성은 약 200mg/L이였고 본 발명에 따른 스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus) KBT501은 600mg/L으로 모균주보다 펜타마이신의 생산성이 3배가량 향상된 우수한 균주라는 것을 알 수 있었다.

<실험 예 2> 콩기름 추가 투입방법에 따른 생산성 비교

스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus) KBT501을 배양하여 실시 예 2 의 방법으로 실험하되 제 2배지에서 1일간 배양한 후 콩기름을 1일 간격으로 0.1~1%(v/v)씩 추가 투입하여 배양을 실시한 결과 배양역가는 1.5g/L로 콩기름을 투입하지 않은 경우보다 약 2.5배가량 향상되는 것을 확인하였다.

<실험 예 3>

1L 플라스크에서 200ml의 1배지 배양액에서 2~3일간 배양한 후 이를 4L의 살균된 제 2배지를 함유하는 7L 자르발효기(Jar fermentor)에 접종하여 28℃에서 200~600rpm으로 1일간 배양한 후 콩기름을 1일 간격으로 0.1~1%(v/v)씩 추가 투입하여 5일간 더 배양하였다. 배양된 발효액으로부터 펜타마이신의 함량을 HPLC로 상기한 바와 같이 정량 분석한 결과 1.75g/L의 우수한 생산성을 나타내었다. 이를

다시 30L 발효조에서 동일한 방법으로 배양한 결과 동일한 농도의 펜타마이신을 생산하는 것을 확인하였다.

상기한 바와 같이 스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus) KBT501을 사용하여 펜타마이신을 생산하는 경우 그 수율이 3배가량 증가된 펜타마이신을 생산할 수 있으며 배양 중에 콩기름을 첨가하여 배양할 경우 이보다 2.5배가량 더 향상된 고역가로 생산할 수있다. 또한, 7L 와 30L 발효조에서 역시 고 역가로 생산이 가능하므로 곧바로 산업적으로 이용할 수 있는 장점이 있다.

Claims

펜타마이신 생산성이 우수한 스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus) KBT501(KCCM 10648P).
미생물을 배양하여 펜타마이신을 생산하는 데 있어서, 상기 미생물로 청구항 1항의 스트렙토마이세스 펜타티쿠스(Streptomyces pentaticus) KBT501(KCCM 10648P)을 사용함을 특징으로 하는 펜타마이신의 생산방법
2항에 있어서, 배양 중 콩기름을 1일 간격으로 0.1~1%(v/v)첨가하는 것을 특징으로 하는 펜타마이신의 생산방법