KR20120115535A - 피부 관리에서 안정화된 식물-유래 성장 인자를 사용하는 방법 - Google Patents

피부 관리에서 안정화된 식물-유래 성장 인자를 사용하는 방법 Download PDF

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KR20120115535A
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비욘 라루스 오르바르
존 브라기 비야르나슨
이브스 발머
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오알에프 리프태크니 에이치에프
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Abstract

국소 치료, 피부과 및 미용 분야에서 사용하기 위한, 성장 인자를 함유한 형질전환 식물 추출물, 또는 형질전환 식물로부터 정제된 성장 인자, 또는 추물물 또는 정제된 형태인 형질전환 식물로부터 유래된 성장 인자의 혼합물을 포함하는, 미용 및 피부과용 조성물(cosmetic and dermatologic composition)에 관한 것이다. 중요하게, 본 발명은 미용 및 국소 치료를 위해 사용될 수 있는 안정화되고, 보다 안전한 성장 인자를 제공한다. 바람직한 조성물은 식물-제조(plant-produced) 성장 인자 및 히알루론산을 포함한다. 안정화된 성장 인자를 포함하는, 피부-관리/피부과용 조성물은 원치않는 분해 생성물 및 결과적인 조성물이 활성 상실의 위험을 갖지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물은 동물 또는 박테리아 세포 기반 발현 시스템으로부터 기인될 수 있는 오염물 및 전염성 매개체(transmissible agent)를 포함하지 않는다.

Description

피부 관리에서 안정화된 식물-유래 성장 인자를 사용하는 방법{Method of use of stabilized plant-derived growth factor in skin care}
본 발명은 전반적으로, 피부 관리를 위한 안정화된 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는, 미용 및 피부과용(dermatological) 조성물, 피부과 적용 및 피부 관리 제품을 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 형질전환 식물로부터 수득된 안정화된 이종(heterologous) 성장 인자 및 미용 및 약제학적 제품에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
피부는 보호, 장벽, 온도 조절, 분비, 및 호흡과 같은 다양한 기능을 수행하는 인체의 가장 큰 기관이다. 시간의 경과 및 노화에 따라, 이러한 기능은 빠르게 약화되고, 다양한 생리학적 변화가 피부에 일어난다. 이러한 변화는 피부의 주요 요소인 표피, 진피 및 피하 조직의 두께의 감소로 나타난다. 지질 조성의 변화가 지질층의 수분 장벽 역할을 약화시켜서 피부의 건조를 초래한다. 또한, 연령의 증가에 따라, 검버섯, 기미(freckle), 색소 침착, 또는 다양한 피부 병변도 증가한다.
표피 교체율(epidermal turnover rate)의 연령-의존적 감소는 저질의 각질층 축적에 관련되어, 노인성 건조증(senile xerosis), 과다한 색소 침착 및 잔주름(fine wrinke)을 초래한다. 이는 부분적으로 이상 각질세포 분화(aberrant keratinocyte differentiation)에서 기인될 수 있다.
오염 및 자외선과 같은 환경적 요소들이 피부의 노화를 가속시킬 수 있다. 반응성 산소 종 및 자유 라디칼, 및 피로 또는 스트레스와 같은 일부 생리학적 상태가 특히 단백질, 핵산 및 막 지질에 유해하여, 피부의 노화를 초래한다. 이에 따라, 주름, 검버섯 또는 기미의 발생, 피부 탄력의 상실, 색소 침착, 및 피부의 건조 및 갈라짐에 대한 다수의 연구가 수행되었다.
주름, 피부의 처짐(sagging) 및 일광에 의해 유발되는 피부 탄력의 저하를 개선할 목적으로, 피부의 노화 및 피부 주름 문제를 예방하거나 둔화시키기 위해 다양한 미용 조성물이 개발되었다. 일본 특허 공개 평성 5-246838호는 콜라겐의 합성에 의해 피부의 주름을 개선하는 방법을 개시한다. 이 문헌은 콜라겐 대사를 촉진하기 위해 콜라겐을 분해하는 콜라게나아제의 활성이 노화에 따라 저하되어, 가교 콜라겐의 증가 및 피부 주름의 증가를 초래할 수 있다고 교시한다.
피부 질환(Skin condition):
건선은 피부의 적색 착색 및 발진 부위(spot)에서 인설성 반(scaly patch) 및 피부 박리를 초래하는 피부 질환이다. 건선성 반(psoriotic patch)은 표피에서 세포들의 변화된 증식 거동으로부터 초래된 세포 발달 및 세포 분열 속도의 변화에 의한 과다 피부 생성의 부위이다. 건선성 반의 부위에서 세포들은 염증성 반응을 초래하는 세포 신호전달 화합물을 생성한다는 것이 알려져 있다. 건선은 감염과 같은 외부 상태에 의해 유발될 수 있는 자기-불화합성(self-incompatibility)을 초래할 수 있는 면역 반응의 형태로 추측되고 있다.
습진(eczema):
습진은 표피의 피부염, 또는 염증의 한 형태이다. 용어 습진(eczema)은 다양한 지속 피부 질환(persistent skin condition)에 광범위하게 적용된다. 이들은 발적, 피부 부종(부기), 가려움 및 건조, 가피 형성(crusting), 박편 형성(flaking), 수포 형성(blistering), 갈라짐(cracking), 또는 심지어 삼출(oozing) 또는 출혈 증상 중 하나 이상을 가질 수 있는 건조 및 재발성 발진을 포함한다. 피부염은 종종 코르티코스테로이드에 의해 치료된다. 피부 얇아짐(thinning)과 같은 코르티코이드와 연관된 위험 때문에, 스테로이드는 습진의 에피소드(episode)를 제어하기 위해서만 드물게 적용되어야 한다.
습진이 중증이고, 다른 형태의 치료에 반응하지 않는 경우, 시클로스포린과 같은 면역억제제가 때때로 처방된다. 이들은 면역계를 약화시키고, 습진을 개선시킬 수 있으나, 부작용을 유발할 수 있다.
중증의 가려움의 경우, 진정성 항히스타민제가 사용될 수 있으나, 졸음을 유발할 수 있다.
흉터 조직은 조직이 외과 수술이나 상처발생 후 치유된 후, 피부와 같은 손상된 조직에 내부적으로 및 외부적으로 남은 흔적(mark)이다. 흉터 조직은 치유된 상처나 자상 위에 및/또는 주위에 형성되는 치밀한 섬유성 결합 조직이고, 피부의 탄력성에 부정적으로 영향을 미치고, 피부 상에 보일 때, 심미적 문제 및 불편을 유발할 수 있다. 넓은 부위의 흉터 조직은 화상과 같은 외상성 경험으로부터 회복하는 개인의 외형 및 삶의 질에 부정적 효과를 가질 수 있다.
성장 인자는 세포의 증식 및 분화를 조절하는데 핵심 역할을 수행하고, 상처나 손상 후 표피 및 기저층(basal lamina)의 재구성에 관여한다. 이들은 세포의 재생을 위해 중요하고, 따라서, 노화의 여러 측면을 중지시킬 수 있고, 각질세포 분화, 섬유모세포 증식을 정상화시키고, 세포 및 세포 산물의 교체 및 재생을 유도할 수 있다.
Ito 등(2009)은 기도 평활근(ASM) 세포에서 MMP(Matrix metalloproteinase) 및 TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinase)의 발현이 콜라겐 교체 및 이 세포들의 이동에 관여하고, 따라서 기도 리모델링에 기여할 수 있다는 것을 교시한다. PDGF는 mRNA 및 단백질 수준에서 MMP-1(Matrix Metalloprotease-1)의 발현을 강하게 상향-조절한다. TGF-베타와 결합하는 경우, PDGF는 MMP-3의 상승적 상향-조절을 유발했다. TIMP-1은 TGF-베타 및 PDGF에 의해 부가적으로 상향-조절되었다.
Nakatani 등(2009)은 히알루로난(hyaluronan)이 치주 인대 세포에서 MMP-1의 발현 및 단백질 수준에 영향을 미친다는 것을 교시한다. 히알루로난 올리고(HAoligo)는 mRNA 및 단백질 수준 모두에서 MMP-1 발현을 현저하게 증가시켰으나, TIMP-1 및 TIMP-2 mRNA의 발현에 대한 효과는 확인되지 않았다. HAoligo는 HPDL 세포에서 MMP-1 발현을 유도하고, p38MAPK가 HAoligo에 의해 유도된 MMP-1을 위한 신호 전달에서 중요한 역할을 수행한다는 것이 시사되었다.
Ito 및 Nakatani의 실시예는 기도 평활근 및 인대 세포에서 신호 경로에 한정되나, 이들은 각각 성장 인자와 히알루로난이 어떻게 세포외 매트릭스와 기저층의 재구성 및 그 성분의 교체(turnover)에 영향을 미칠 수 있는 지를 설명한다.
성장 인자는 다양한 피부 질환 및 피부 손상에 대해 유용한 효과를 가질 수 있고, 세포 수준에서 손상되거나 또는 열화되는 보호 메카니즘의 결과인 노화의 효과를 중화시킬 수 있는 것으로 인정된다. 성장 인자는 세포 재생 및 증식을 촉진할 수 있고 상처의 치유 과정의 천연 요소이다.
표피 성장 인자 (EGF)는 외배엽 및 중배엽에서 기원한 다양한 상피 세포의 분열을 촉진한다. 표피 성장 인자는 체액, 특히, 소변 및 모유에 광범위하게 분포된다 (Carpenter, G. and Cohen, S., "Epidermal Growth Factor," Ann. Rev. Biochem., 48, 192-216 (1979)). 표피 성장 인자는 53개의 아미노산 잔기로 구성된 단일 폴리펩티드이고 6,200 달톤의 분자량을 갖는다 (Campion, S. R. and Niyogi, S. K., "Interaction of epidermal growth factor with its receptor"). 1962년에, Cohen은 성체 수컷 마우스의 턱 아래에 있는 선(gland)으로부터 EGF를 단리했다. 1972년에, Savage와 Taylor는 마우스 EGF의 일차 구조 및 EGF의 생리적 기능에 필수적인 3개의 분자내 디술피드 결합의 위치를 확인했다.
EGF는 표피 세포, 내피 세포 및 섬유모세포의 증식, 및 표피 세포가 결핍된 곳으로의 표피 세포의 이동 및 증식을 강하게 촉진하기 때문에, 피부 손상에 대해 탁월한 효과를 갖는 것으로 사료된다. 성장 인자는 조직 완전성(tissue integrity)의 유지 및 세포-대-세포 소통(cell to cell communication)에서 핵심적 역할을 수행하고, 따라서, 표피 조직의 퇴화를 막는데 있어서 보호 역할을 수행한다.
참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된, 미국특허 제5,618,544호는 EGF, TGF-a 및 FGF를 포함하는, 피부 노화를 저하시키고, 피부의 외관을 개선시키는 미용 조성물을 개시한다.
미국특허 제6,589,540호는 EGF가 미용 분야에서 사용되는 레티놀의 효과를 현저하게 증진시키고, 또한, 레티놀의 피부 자극을 효과적으로 경감시킨다는 것을 교시한다.
PDGF와 같은 성장 인자는 응집 단계 동안 상처 부위에서 분비되고, 호중구, 대식세포 및 섬유모세포에 대한 화학-유인물질(chemo-attractant)로 작용한다. 이 세포들은 상처 부위에서 박테리아의 사멸 및 괴사성 파편(necrotic debris)의 제거에서 중요한 역할을 수행한다. 활성화된 대식세포는 뒤이어 혈관형성을 촉진하고 B-세포 및 T-세포 매개 면역 반응과 소통하는 성장 인자를 분비한다. 대식세포는 섬유모세포가 새로운 세포외 매트릭스를 생성하도록 자극하는 TGF-베타, 및 혈관형성을 촉진하는 VEGF를 분비한다. 각질세포가 분열하고 상처상(wound bed)을 뒤덮으면서 상피화(epithelization)가 진행된다. 따라서, 성장 인자가 치유 과정의 중요한 매개체라는 것이 확립되어 있고, 연구는 G-CSF가 감염된 당뇨성 궤양의 치료에서 유용할 수 있다는 것을 나타낸다. EGF는 섬유모세포 및 각질세포의 증식을 촉진한다.
FGF는 표피 세포에 대한 증식 효과를 가지며, 동물 모델에서 뼈 및 상처 치유를 가속시키는 것으로 관찰되었다. KGF-2는 상처 치유를 상당히 가속시키고, 특히, 상처의 봉합(closing)을 가속화시킨다.
동물 조직이나 혈액으로부터 단리된 성장 인자는 원치하는 오염물 및 전염성 매개체(transmissible agent), 예를 들면, 바이러스, 비리온, 프리온, 기타 공-정제(co-purifying) 성장 인자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 오염물 및 전염성 매개체의 위험을 갖는다. 오염시키는 전염성 매개체 및 내인성 성장 인자의 동일한 위험이 생물공학적 수단에 의해 동물 또는 인간 세포에서 제조된 성장 인자에 존재한다. 박테리아에서 생물공학적 수단에 의해 제조된 성장 인자는 면역계를 교란시키는 것으로 알려진 박테리아 내독소의 이월(carry-over) 위험을 제기한다. 빈번하게, 박테리아는 그들의 원형 형태(native form)로 성장 인자 또는 사이토카인을 생성할 수 없으나, 그들의 생체활성(bioactivity)을 위해 필요한, 삼차 구조를 변성된 상태로 변형시키고, 이들을 세포 내에서 봉입체(inclusion body) 내에 축적시킨다. 단리된 봉입체로부터의 변성된 성장인자는 생체활성을 회복하기 위해 어렵고 광범위한 리폴딩을 필요로 한다. 또한, 박테리아는 단백질을 글리코실화시킬 수 없고, 이는, 여러 경우에, 단백질을 덜 안정하게 하고, 프로테아제에 의한 분해에 보다 민감하게 하는 것으로 알려져 있다. 전염성 매개체, 내독소 또는 오염물의 위험은 분명히 개방된 상처 및 염증의 증상을 갖는 표피를 치료하기 위한, 박테리아, 효모 세포 또는 동물 세포에서 제조된 성장 인자의 이용, 및 따라서, 피부과용 및 미용 적용에서의 용도에 대한 우려 사항이다.
전술된 문제 및 단점을 최소화하거나 또는 제거하도록 제조된, 고품질의 성장 인자 및 기타 생물학적 활성 단백질에 대한 지속적인 요구가 존재한다.
식물에서 제조된 성장 인자 및 사이토카인은 동물 또는 인간 바이러스, 비리온 및 프리온, 및 박테리아 내독소와 같은 전염성 감염 매개체를 포함하지 않는다. 인간을 감염시킬 수 있는 다수의 동물 질환과 대조적으로, 인간에서 질환을 유발할 수 있는 식물 질환의 보고된 케이스는 없다. 따라서, 식물은 성장 인자의 제조를 위해, 전술된 세포 유형, 동물 세포, 동물 조직, 효모 및 박테리아보다 더 안전한 제조 개체가 된다. 식물은 신호전달 요소(signaling element)로서 성장 인자의 작용 및 참여를 필요로 하는 동물의 면역계와 유사한 면역계를 갖지 않는다. 따라서, 식물은 동물 또는 인간 성장 인자와 유사한 성장 인자를 스스로 생성하지 않고, 따라서, 형질전환 기법을 이용한 재조합 성장 인자의 원천적인 숙주 소스(pristine host source)를 제공한다. 식물은 단백질을 글리코실화시킬 수 있고, 이는 단백질의 안정성을 개선하고 그들의 활성에 영향을 미치며, 따라서, 식물은 박테리아에서 제조된 성장 인자에 비해 탁월한 성장 인자를 제조할 수 있다. 식물은 그들의 원형 생체활성 형태로 성장 인자 및 사이토카인을 제조하고, 따라서, 박테리아에서 제조된 변성되고 리폴딩된 성장 인자보다 탁월한 품질을 갖는 성장 인자 및 사이토카인을 제조한다. 본 발명에 따른, 생물공학적 수단에 의한 식물에서의 성장 인자의 제조는 이와 같은 안전성, 품질 및 순도 문제를 회피한다. 따라서, 식물-유래 성장 인자는 추출물의 형태나 정제된 원형 형태인지 여부에 관계없이, 피부과학, 국소 치료제, 피부 이식, 모발 이식, 피부 관리 및 미용 분야에서 사용하기에 보다 안전하고 깨끗하다.
식물은 식물에서 보호 역할을 수행하고, 탈수 및 산화적 스트레스와 같은 비생물(abiotic) 인자 및 생물(biotic) 인자에 의해 유발되는 스트레스를 경감시키는 다수의 단백질을 생성한다. 이와 같은 단백질 중 수개는 세포 조직의 탈수를 수반하는 종자 성숙 후, 식물의 종자에 특이적으로 축적된다. 디히드린(dehydrin)은 가뭄과 같은 스트레스에 반응하여, 또는 종자 발달과 같은 성숙 과정의 일부로서 축적되는 한 종류(class)의 단백질이다.
본 발명의 목적은 미용 및 피부 관리 제품에서 성장 인자의 국소 이용을 가능하게 하는, 저자극성 제제(hypoallergenic formulation)에서 안정화된 이종 식물-제조 재조합 성장 인자(heterologous plant-produced recombinant growth factor)를 사용하는 방법을 제공하는 것이다. 단백질은 속성상, 분해 및 촉매작용에 민감하기 때문에, 연장된 시간 동안 성장 인자의 안정성은 국소 치료제로서의 용도에 결정적이다.
본 발명의 중요한 특징은 건강한 피부뿐 아니라, 습진 및 건선과 같은 민감하고 손상된(challenged) 피부에 성장 인자의 적용 및 이용을 가능하게 하는, 무-알레르기 유발성, 무자극성 조성물(non-allergenic, non-irritating composition)을 수득하기 위해, 최소 갯수의 성분을 포함하는 안정화 조성물로 이종 식물-제조 성장 인자의 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태는 상처, 화상, 농포, 궤양, 병변의 치료, 또는 의료 외과 수술 및 성형 수술과 같은 수술 동안 및 그 후에 흉터 조직 형성에 대한 긍정적인 완화 효과를 갖는 식물 유래 성장 인자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 이 구체예는 피부에서 흉터 조직의 흔적을 감소시키는데 특히 유용하고, 따라서, 파열된 피부의 피부색 및 치유를 개선하고, 피부의 외관을 개선시킨다.
본 발명의 목적은 성장 인자를 포함하는 형질전환(trasgenic) 식물 추출물 또는 형질전환 식물로부터 정제된 성장 인자, 또는 추출물 또는 정제된 형태인 형질전환 식물로부터 유래된 성장 인자의 혼합물을 포함하는, 피부 관리용 미용 조성물을 제공하는 것이다. 식물 추출물(plant extract)은 본 명세서에서 목적 이종 성장 인자를 생성하는 숙주 식물의 단백질 추출물(예를 들면, 종자 단백질 추출물)을 의미한다. 식물 추출물은 부분적으로 또는 실질적으로 정제되고, 이는 추출물이 하나 이상의 적절한 정제 단계에 의해 목적 단백질에 대해 농축(enrich)된다는 것을 나타낸다. 중요하게, 본 발명은 보다 안전한 성장 인자가 미용 및 국소 처치를 위해 이용될 수 있게 한다. 이와 같은 식물-제조 성장 인자는 그들이 아미노산 백본에 글리코실화 부위를 갖는 경우, 식물에서 글리코실화될 수 있고, 글리코실화는 단백질의 안정성을 개선하는 것으로 알려져 있고, 그들의 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있는 특징이다. 미용 및 국소 용도를 위한 조성물을 위해 그들의 원형 형태로 이 활성 성분들을 제조하는 것은 본 발명에 의해 더 경제적이 된다. 보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 성장 인자 및 선택적으로, 추출물 중의 디히드린 및 글로불린과 같은 기타, 천연의 식물-기반 유용한 폴리펩티드를 포함하는 피부-관리 조성물을 제공하는 것이다. 이 종자 단백질은 식물에서 세포 및 생화학적 수준에서 보호 기능을 가지며, 본 발명의 대상인 성장 인자와의 독특한 조합에서, 이들은 양육(nurturing) 및 치유 조건을 제공하고, 세포 수준에서 탈수 및 산화적 스트레스를 경감시킬 수 있다. 본 발명의 목적은 여드름, 표피의 염증, 습진, 건선의 치료, 피부 주름, 검버섯, 기미, 반점 또는 기타 색소 침착, 갈라진 피부, 특히, 손, 팔꿈치, 발뒤꿈치 및 발의 갈라진 피부의 개선, 및 피부의 보습 및 상처 치유 및 흉터 조직의 감소를 위해 적합한 안정한 피부 관리 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 안정화된 성장 인자는 이식 수술 동안 및 그 후에 절제된 모낭 단위(follicle unit, FU)의 처리에 의해 모발 이식의 성공률을 향상시키기 위해 이용될 수 있다.
본 발명을 위한 적합한 성장 인자 또는 둘 이상의 성장 인자의 조합이 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 식물-유래 재조합 성장 인자로부터 선택될 수 있다: 표피 성장 인자(EGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 형질전환 성장인자-베타(TGF-베타), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 신경 성장 인자(NGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 섬유모세포 성장 인자-2(FGF-2), 산성 FGF(FGF acidic), 과립구 대식세포-집락 자극 인자 (Granulocyte Macrophage-Colony stimulating factor, GM-CSF), 과립구-집락 자극 인자(G-CSF), 인터루킨(IL-s, IL-1, IL1-알파, IL-6, IL-8, IL-10), 노긴, 티모신 베타 4, 및 골형성 단백질(BMP). 이와 같은 식물에 의해 제조된 성장 인자(plant-produced growth factor)는 본 발명에 따라, 손상된(inflicted) 상처, 병리적 상처 및 외과수술 상처의 치유 및 흉터 조직 형성의 경감/예방에서 이용될 수 있다. 일련의 성장 인자(selection of growth factors)가 모발-이식과 같은 수술에서, 예를 들면, 절제된 모낭 단위의 생존력을 향상시키고, 이식 후 치유 과정을 가속시키고 진행시키기 위해 식물-유래 재조합 성장 인자를 함유한 용액 중에 침지시키는 것에 의해, 생체외 치료(ex vivo treatment)를 위해 이용될 수 있다.
티모신 베타 4 및 노긴과 같은 선별된 성장 인자는 본 발명의 이 용도를 위해 바람직한 성장 인자의 예이고, 이들은 이식-후 단계에서 모낭(hair follicle)의 세포의 굴절 단계(refractive) 단계를 방해하고, 모발 성장을 유도하는 것으로 확인된다. 본 발명은 모발 성장을 재활성화시키고 이식 수술의 효과로부터의 치유를 위해, 굴절 단계에 있는 두피 및 모낭 및 모낭 단위(FU)를 저자극성 조제물(hypoallergenic formula) 중의 안전한 식물-유래 인간 성장 인자로 치료하기 위한 조성물 및 수단을 제공한다. 인간이나 동물 기원으로부터 기인하지 않고 박테리아 내독소에 의해 오염되지 않은 재조합 인간 성장 인자를 이용할 수 있는 것은 다수의 치료적 응용에서 상당한 개선이다.
본 발명의 또 다른 양태는 전술된 성장 인자들과 같은 하나 이상의 식물-유래 성장 인자 및 히알루로난을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. 성장 인자와 히알루로난의 피부의 대사에 대한 효과는 함께 피부 조성에 대한 긍정적인 상승적 효과를 가져올 수 있어서, 세포 분화를 정상화시키고, 세포 분열을 활성화시키며, 기저층의 성분의 재생을 초래하여, 피부의 활기 회복, 상처 치료, 및 지속성 피부 질환의 경감을 가져오고, 염증을 감소시킨다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 안정화 매질 중에 성장 인자를 포함하는 형질전환 식물 추출물을 제공하는 단계를 포함하는, 국소 미용 제품을 제조하는 방법을 제공한다. 식물-유래 이종 성장 인자는 바람직하게는, 본 명세서에서 하기에 열거된 성장 인자들로부터 선택된다. 바람직하게는, 형질전환 식물 추출물은 보리 종자 추출물이다. 제조된 성장 인자는 피부-관리/피부과용 조성물의 제조를 위해 특히 유용하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 형질전환 식물로부터 단리된 하나 이상의 이종 성장 인자를 제공한다. 성장 인자는 또한 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에게 공지된 기타 응용에서 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 성장 인자를 포함하는 신규한 식물 추출물은 미용 목적을 위해 치료용 연고 또는 국소용 약제학적 조성물의 기타 제형으로 활성 성분으로 이용되도록 제공된다.
본 명세서에서 사용된, "식물-유래(plant-derived)" 성장 인자는 형질전환 식물 또는 형실전환 식물의 자손으로부터 수득된 성장 인자이고 용어 "식물-제조(plant-produced)"와 호환적으로 사용된다. 따라서, 용어 "식물-유래 성장 인자(plant-derived growth factor)"는 본 출원에서 일반적으로, 제조 비히클(production vehicle)로 이용되는 숙주 식물에 대해 천연적이 아닌(non-native), 이종 성장 인자를 의미한다. 본 발명에 따른 성장 인자는 그 유전자가 식물 또는 식물의 자손으로, 바람직하게는 재조합 기술을 이용하여 도입된 것인 인간 성장 인자 또는 비-인간(non-human) 성장 인자일 수 있다. 단리된 성장 인자는 미용 조성물 또는 치료용 국소 조성물에서 활성 성분으로 이용될 수 있다.
식물에 외래 유전자를 도입하고 발현시키는 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 유전적으로 형질전환될 수 있는 식물은 코딩 영역에 대한 DNA 서열을 포함한, 이종 DNA 서열이 도입되고, 발현되며, 안정적으로 유지되고, 후속 자손 세대에 전달될 수 있는 것인 식물이다. 유전자 조작(genetic manipulation) 및 형질전환 방법은 예를 들면, bialaphos 또는 basta를 포함한 제초제 내성, 또는 예를 들면, 히그로마이신 내성과 같은 항생제 내성을 선택 마커로 이용하는 보리 식물을 제조하기 위해 이용되었다.
적절한 품종이 선택되고, 외래 유전자의 도입을 위한 적절한 방법이 선택된다. 용어 "형질전환(transformation)" 또는 "유전적 형질전환(genetic transformation)"은 유전적으로 안정한 유전(inheritance)을 가져오는, 핵산 분자의 숙주 개체의 게놈 내로의 전달을 의미한다. 형질전환된 핵산 단편을 포함하는 숙주 개체는 "형질전환(transgenic)" 개체로 지칭된다. 본 발명의 "형질전환 식물 숙주 세포( transgenic plant host cell)"는 게놈 내에 안정적으로 통합된 하나 이상의 외래 핵산 분자, 바람직하게는 2개의 외래 핵산 분자를 포함한다. 식물 형질전환의 방법의 예는 아그로박테리움-매개 형질전환(Agrobacterium-mediated transformaton (De Blaere et al. 1987) 및 입자 충돌(particle-bombardment) 또는 "유전자 총(gene gun)" 형질전환 기술(Klein et al. (1987); U.S. Pat. No. 4,945,050)을 포함한다.
WO 2006/016381은 형질전환에 적합한, 특히 유용한 보리 품종을 기재하고 적절한 형질전환 방법을 상세하게 기재한다.
WO 2005/021762는 대규모로 용이하게 정제되는 키메라 단백질을 제조하는 것에 의해 단백질을 변형하는 방법을 개시한다.
본 발명에 따라 적절하게 제조되고 이용되는 성장 인자는 하기를 포함하는 종 및 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: 형질전환 성장인자-b (또는 베타)(TGF 베타 1, TGF 베타 2, TGF 베타 3를 포함한, TGF-b 또는 TGF-베타), 형질전환 성장인자-a(또는 알파)(TGF-a 또는 TGF 알파), TNF 알파, 표피 성장 인자(EGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF AA, PDGF BB, PDGF Rb), 각질세포 성장 인자 (KGF), 섬유모세포 성장 인자 a 및 b(aFGF 및 bFGF), FGF-4, FGF-6, 간세포 성장 인자(HGF), 혈관 내피 성장 인자(vascular epithelial growth factor, VEGF) 에리트로포이에틴(Epo), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자-II(IGF-II), IL-1 알파 및 IL-1 베타를 포함한, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-7 (IL-7), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨 13(IL-13), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-20(IL-20), 렙틴, 종양 괴사 인자-a(TNF-a), 종양 괴사 인자-b(TNF-b), 인터페론-g(INF-g), 과립구 집락 자극 인자(G-CSFs), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 태반 성장 인자(PLGF), 신경 성장 인자(NGF), 노긴, 골형성 단백질(BMP-4), 및 티모신 베타 4.
본 발명의 특정한 구체예에서, 형질전환 식물에서 제조되는 목적 폴리펩티드는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 또는 양 말단에 친화도 택(affinity tag)을 포함한다. 그와 같은 택은 반복 HQ 서열, 폴리 히스티딘-테일, GST, CBM 또는 이종 펩티드의 정제를 간소화시키는 기타 유용한 친화도 택을 포함할 수 있다.
히알루로난은 또한 히알루론산 및 히알루로네이트로도 지칭되며, 이 용어들은 동의어이고 본 발명에서 호환적이다. 히알루로난은 결합 조직, 상피 조직, 및 신경 조직 전체에 널리 분포된, 음이온성, 비-술페이트화 글리코사이노글리칸이다.
본 명세서에서 사용된 용어 피부 관리/피부과용 조성물(skin care/dermatological composition)은 치료를 위한 피부과 적용(therapeutic dermatological application)을 위한 의약/약제학적 조성물 및 치료 및 미용 용도 모두를 위해 이용될 수 있는 조성물을 포괄한다.
투여량
본 발명에 따른 국소 치료 적용을 위해, 성장 인자의 투여량은 바람직하게는 조성물의 그램 당 0.01 내지 100 ㎍의 범위이고, 보다 바람직하게는 그램 당 0,1 내지 50 ㎍의 범위이다. 피부 노화 또는 탈모(loss of hair)의 치료를 위한 국소 미용 조성물은 바람직하게는 조성물의 그램 당 0,2 내지 50 ㎍의 활성 물질을 포함한다.
치료의 기간은 병상(pathology)이나 원하는 효과에 따라 다르다. 경피증 치료의 경우, 적용은 병상의 중증도에 따라 1일 내지 12개월의 범위이다. 피부의 자연 노화 또는 조기 노화에 대한 치료의 경우, 적용은 1일 내지 400일의 범위이고, 바람직하게는 30일 이상이다. 마찬가지로, 탈모의 예방 또는 모발 재-성장의 촉진을 위한 치료의 경우, 적용은 1 내지 400일의 범위이다.
본 발명에 따른 피부과용 조성물은 건조 피부, 습진, 피부염, 발진, 건선, 피부 발적(skin redness), 및 부종을 포함한 피부 질환의 치료를 위해 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 흉터 조직의 치유 및 경감 및 발꿈치의 갈라진 피부의 치유 및 개선을 위해 유용하다.
바람직하게는, 형질전환 식물 추출물은 전술된 성장 인자의 단백질, 그들의 모방체(mimetics), 또는 적어도 성장 인자 수용체로의 결합, 및 활성화를 가능하게 하는 그들의 도메인 중 하나 이상을 포함하는 보리의 낟알로부터 제조된다. 본 명세서에 포함된 비-한정적 실시예는 형질전환 보리 추출물로부터 유래된 상이한 성장 인자의 예시적 용도를 보여준다.
본 발명에 따라 이용되는 추출물은 목적 성장 인자를 포함하는, 형질전환 숙주 식물로부터의 단백질 추출물을 의미한다. 다른 단백질이 성장 인자의 활성을 방해하지 않거나, 또는 기타 원치않는 효과를 유발하지 않는 경우, 성장 인자는 단지 상기 추출물의 미량 성분(minor component)일 수 있다. 그와 같은 추출물은 예를 들면, 그들의 종자에서 이종 성장 인자를 발현하는 식물로부터의 종자 단백질 추출물이다. 상기 추출물은 보다 높은 정도 또는 보다 낮은 정도까지 정제될 수 있고, 즉, 추출물은 이종 성장 인자를 강화시키기 위해 하나 이상의 정제 단계에 의해 부분적으로 정제될 수 있다.
미용 및 약제학적 조성물의 국소 적용을 위한 다수의 비히클이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다. 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A. R., ed., 20th edition, 2000: Williams and Wilkins PA, USA를 참조한다. 활성 성분인 이종 단백질이 안정화되는 한, 미용 조성물을 국소 투여하기 위해 통상적으로 이용되는 모든 조성물, 예를 들면, 크림, 로션, 겔, 드레싱(dressing), 샴푸, 팅크제(tincture), 페이스트(paste), 세럼(serum), 연고, 살브(salve), 분말, 액체 또는 반액체(semiliquid) 제제, 패치(patch), 리포좀 제제(liposomal preparation), 용액, 현탁액, 리포좀 현탁액, W/O 또는 O/W 에멀젼, 포마드(pomade) 및 페이스트(paste) 등이 이용될 수 있다. 상기 조성물의 적용은 적절한 경우, 에어로졸에 의해, 예를 들면, 질소, 이산화탄소, 프레온과 같은 추진제를 포함하는 에어로졸, 또는 펌프 스프레이와 같은 추진제를 포함하지 않는 에어로졸에 의해, 액적(drop), 로션, 또는 면봉에 의해 적용될 수 있는 증점된 조성물(thickened composition)과 같은 반고체에 의해 수행될 수 있다. 특정한 조성물에서, 살브, 크림, 로션, 페이스트, 겔, 연고 등과 같은 반고체 조성물이 편리하게 이용될 수 있다.
용액, 현탁액, 리포좀 조성물, W/O (water/oil) 또는 O/W(oil/water) 에멀젼을 포함한, 본 발명의 조성물은 비경구, 전신 또는 국소 용도를 위해 제공될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 활성 물질은 적절한 동결건조 첨가제에 혼합되고, 치료적으로 허용가능한 희석제에 의해 재용해될 수 있는, 동결건조 제형으로 제제화된다. 유용한 동결건조 첨가제는 완충제, 폴리사카라이드, 수크로오스, 만니톨, 이노시톨, 폴리펩티드, 아미노산, 및 활성 물질과 조합될 수 있는 기타 첨가제이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 활성 물질은 동결건조-후 성장 인자/인산염 비가 1:1 내지 1:2에 포함되게 하는 양으로 인산염 완충액(NaH2PO4/H2O--Na2HPO4/2H2O)에 용해된다. 비경구 용도에 적합한 희석제는 물, 생리적 용액, 당 용액, 수성알코올(hydroalcoholic) 용액, 유성 희석제, 글리세롤, 에틸렌글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 폴리올, 또는 멸균성(sterility), pH, 이온 강도 및 점도에 대해 투여 방법과 조합될 수 있는 기타 희석제이다.
바람직하게는, 국소 적용의 비히클은 비-천연 보존제 또는 항-미생물제를 포함하지 않는, 천연적으로 항-박테리아성인 제제이다. 알레르기 유발제(allergenic) 및/또는 자극제(irritant)로 작용할 수 있는 복합 성분을 제거하고 적은 수의 성분을 사용하는 것이 고려될 것이다. 상기 제제는 또한 활성 단백질 성분의 장기 안정성을 보장하고, 바람직하게는 실온 보관에서 1년 또는 그 이상과 같은 긴 유통 수명을 제공해야 한다.
바람직한 구체예에서, 활성 화합물인 선택된 식물-제조 재조합 단백질이 글리세롤, 염화나트륨, 염화칼륨 및 염화칼슘과 같으나, 이에 한정되지 않고, 염화칼슘이 가장 바람직한 것인 염, 정제수, 및 에탄올 중 하나 이상을 포함하고, 가장 바람직하게는 이들 모두를 포함하는 국소 적용에 적합한 제제에 첨가된다. 그와 같은 조성물은 놀랍게도 선택된 성장 인자로 대표되는 재조합 단백질을 효과적으로 안정화시키는 것으로 확인된다. 본 발명의 일 양태는 이 제제가 단백질의 글리코실화 여부에 관계없이 재조합 단백질을 효과적으로 안정화시키는 것이다. 상기 제제는 바람직하게는 속성상 항미생물성이고, 따라서, 피부과 및 미용 용도를 위한 국소 제제로서 특히 적합하다.
본 발명의 조성물은 또한 히알루론산(히알루로네이트)과 같은 선택적인 첨가제를 포함할 수 있다.
에멀젼 또는 현탁액의 경우, 조성물은 의약의 제제에서 통상적으로 이용되는 비-이온성, 양쪽이온성, 음이온성 또는 양이온성의 적합한 게면활성제를 포함할 수 있다. O/W(oil/water) 친수성 에멀젼은 비경구 전신 용도를 위해 바람직하고, W/O(water/oil) 친지성 에멀젼은 국부 또는 국소 용도를 위해 바람직하다.
또한, 본 발명의 조성물은 당 또는 다가알코올과 같은 등장화제(isotonic agent), 완충제, 킬레이트제, 항산화제, 항박테리아제와 같은 선택적 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 액체 제형은 용액 또는 로션을 포함할 수 있다. 이들은 수성, 에탄올/물과 같은 수성알코올성, 또는 알코올성일 수 있고, 동결건조된 물질을 가용화시키는 것에 의해 수득된다.
대안적으로, 활성 물질 용액은 공지된 겔화제, 예를 들면, 전분, 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리(메트)아크릴레이트, 이소프로필 알코올, 및 히드록시스테아레이트의 첨가에 의해 겔의 형태로 제제화될 수 있다.
국소 용도를 위한 조성물의 기타 종류는 포마드, 페이스트, 크림 제형의 에멀젼 또는 현탁액이다. 보다 신속한 흡수를 제공하는, W/O 에멀젼이 바람직하다. 친지성 부형제의 예는 액체 파라핀, 무수 라놀린, 백색 바셀린, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 식물성 오일, 미네랄 오일이다. 피부 투과성을 증가시켜, 흡수를 촉진하는 작용제가 유리하게 이용될 수 있다. 그와 같은 작용제의 예는 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌글리콜, 또는 디메틸술폭시드(DMSO)와 같은 생리학적으로 허용가능한 첨가제이다.
국소 조성물에서 사용되는 기타 첨가제는 당 또는 다가 알코올과 같은 등장화제, 완충제, 킬레이트제, 항산화제, 항박테리아제, 증점제, 분산제이다.
제제는 본 명세서에 기재된 제제에서 일반적으로 이용되는 통상적인 성분들, 예를 들면, 오일, 지방, 왁스, 계면활성제, 보습제, 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이트제, 완충제, 보존제, 향료(perfume), 염료, 저가 알칸올(lower alkanol) 등을 더 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
국소 또는 전신 용도를 위한 지연-방출 조성물(delayed-release composition)이 유용할 수 있고, 폴리락테이트, 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸-셀룰로오스와 같은 폴리머 및 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 기타 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 폴리락테이트 또는 기타 생분해성 폴리머에 기반한 피하 이식물(subcutaneous implant) 제형의 지연-방출 조성물도 유용할 수 있다.
활성 물질은 바람직하게는 동결건조되고, 따라서, 안정한 제형으로 포장되나, 약제학적 조성물은 유리하게 활성 형태로 성장 인자를 안정화시키는 물질을 포함한다. 그와 같은 안정화제는 분자간 디술피드 결합의 형성을 억제하고, 이에 의해 활성 물질의 중합을 방지한다. 그러나, 활성 물질의 불활성 단량체 형태로의 변형을 동시에 예방하기 위해 안정화제의 양이 세심하게 측정되어야 한다. 그와 같은 물질의 예는 시스테인, 시스테아민, 또는 환원된 형태의 글루타티온이다.
오일의 비-한정적 예는 오일브 오일 및 수소화 오일과 같은 지방 및 오일; 밀랍 및 라놀린과 같은 왁스; 액체 파라핀, 세레신, 및 스쿠알렌과 같은 탄화수소; 스테아르산 및 올레산과 같은 지방산; 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 라놀린 알코올, 및 헥사데칸올과 같은 알코올; 및 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트 및 부틸 스테아레이트와 같은 에스테르를 포함한다. 계면활성제의 예로서, 소디움 스테아라이트(sodium stearite), 소디움 세틸술페이트, 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르 포스페이트, 소디움 N-아실 글루타메이트와 같은 음이온성 계면활성제; 스테아릴디메틸벤질암모늄 클로라이드 및 스테아릴트리메틸암모늄 클로라이드와 같은 양이온성 계면활성제; 알킬아미노에틸글리신 히드로클로라이드 용액 및 레시틴과 같은 양성 계면활성제; 및 글리세린 모노스테아레이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 수크로오스 지방산 에스테르, 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 올레일에테르, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 코코넛 지방산 모노에탄올아미드, 폴리옥시프로필렌 글리콜(예를 들면, 상표 "Pluronic" 하에 판매되는 물질), 폴리옥시에틸렌 캐스터 오일, 및 폴리옥시에틸렌 라놀린을 들 수 있다. 보습제의 예는 글리세린, 1,3-부틸렌 글리콜, 및 프로필렌 글리콜을 포함하고; 저급 알코올의 예는 에탄올 및 이소프로판올을 포함하며; 증점제의 예는 잔탄검, 히드록시프로필 셀룰로오스 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜 및 소디움 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함하고; 항산화제의 예는 부틸화 히드록시톨루엔, 부틸화 히드록시아니솔, 프로필 갈레이트, 시트르산 및 에톡시퀸을 포함하며; 킬레이트제의 예는 디소디움 에데테이트(disodium edetate) 및 에탄히드록시 디포스페이트를 포함하고; 완충제의 예는 시트르산, 소디움 시트레이트, 붕산, 붕사, 및 디소디움 히드로겐 포스페이트를 포함하며; 및 보존제의 예는 메틸 파라히드록시벤조에이트, 에틸 파라히드록시벤조에이트, 데히드로아세트산, 살리실산 및 벤조산을 포함한다. 이 물질들은 예시적인 것에 불과하며, 당업자는 기능의 상실 없이 다른 물질로 대체될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
도 1은 EGF를 포함하는 형질전환 식물 추출물에 의한 두 개의 염색된 겔을 보여준다.
도 2는 VEGF를 포함하는 형질전환 식물 추출에 의한 두 개의 염색된 겔을 보여준다.
도 3은 IGF-1을 포함하는 형질전환 식물 추출물에 의한 두 개의 염색된 겔을 보여준다.
도 4는 IL-1a를 포함하는 형질전환 식물 추출물에 의한 두 개의 염색된 겔을 보여준다.
도 5는 정제되고, 재구성된 동결-건조 식물-제조 EGF의 안정성 부하(stability challenge) 테스트를 보여준다.
도 6은 실시예 7에 설명된 바와 같은, 본 발명이 국소 조성물의 투여 전 (a) 및 투여 후 (b) 겨울 습진(winter eczema)의 징후를 보이는 손을 보여준다.
도 7은 "겨울 발(winter feet)"(겨울 습진) 피부 문제를 가진 발을 보여주고, (a) 및 (b)는 실시에 8에서 설명된 바와 같은, 본 발명의 국소 조성물의 5일 동안의 투여 전의 발의 사진이고, (c) 및 (d)는 그 후의 발의 사진이다.
도 8: 측정된 파라미터와 계산된 파라미터에 의한 전형적인 피부 변형(skin deformation) 곡선.
도 9: 분할-안면(split-face) 연구에서, 안정화된 이종 식물-유래 EGF 제제 및 비-EGF 대조군으로 처리된 안면 피부 기계적 특성의 비교 측정 결과. 실시예 9를 참조한다.
도 10: 식물-유래 이종 EGF (pd-EGF)를 함유하는 제제화된 식물 추출물 또는 위약에 의한 국소 치료를 받은 12명의 개인에서 상대적 탄력성을 측정하는 비-침습적 피부 분석의 결과.
실시예 1: 재조합 EGF 를 포함하는 형질전환 식물 추출물의 제조.
미세 분말(가루)을 수득하기 위해, 밀(mill)에서, 성장 인자 EGF를 함유한 수집된 형질전환 보리 종자를 제분하여 형질전환 식물 추출물을 제조하였다. 제분된 보리 가루에 추출 완충액 대 제분된 가루의 5/1의 부피/중량 비로 추출 완충액 (50 mM 인산칼륨 pH 7.0)을 첨가했다. 결과적으로 수득된 용액을 4℃에서 60분 동안 교반시켰다. 냉장 Centrifuge (Heraeus Primo R)에서 8300 rpm 이상으로 15분 동안 원심분리하여, 고체를 액체 추출물로부터 분리하고, 상층액을 깨끗한 바이알에 경사 분리(decant)시켰다. 추출물의 성장 인자 함량을 SDS-PAGE 및 EGF 특이적 항체에 의한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석했다. 이 실험에서, EGF 함량은 추출물의 단백질 함량의 약 0.01%였다. 결과가 도 1에 도시된다.
도 1 (A)는 전체 가용성 단백질을 염색한 겔의 쿠마쉬 블루(Coomassie Blue) 염색 부분을 보여준다. (B)는 형질전환 식물 추출물 중 성장 인자 EGF의 존재를 보여주는, 동일한 추출물의 항 EGF 항체에 의한 웨스턴 블롯을 보여준다. 래인: 1: 크기 마커, 2: 형질전환 보리 종자 추출물, 3: IMAC 정제 단계로부터의 통과액(flow-through), 4: IMAC capture 단계로부터의 EGF의 용리.
실시예 2: 부분적으로 정제된, 성장 인자 VEGF 및 디히드린을 함유한 형질전환 식물 추출물.
실시예 1에 따라 제조된 VEGF 함유 형질전환 보리 종자 추출물을 상기 추출물에 VEGF를 효과적으로 결합하는 IMAC 크로마토그래피 수지를 첨가하는 것에 의해 더 처리하였다. 추출물과 수지의 혼합물을 50 mM 인산칼륨, 0.5 M NaCl, 50 mM 이미다졸; pH 7.0 중에서 +4℃에서 60분 동안 교반시켰다. IMAC 수지를 5000xg에서 15분 동안 원심분리하는 것에 의해 액체로부터 분리하였다. 액체 상을 경사 분리(decant) 시키고, 수지를 세척 완충액(50 mM 인산칼륨, 0.5 M NaCl, 50 mM 이미다졸; pH 7.0)에 재현탁시키고, 스핀 다운시키고, 액체 상을 수지로부터 제거하였다. 세척을 3회 반복하였다. VEGF를 수지로부터 용리시키기 위해 수지를 이미다졸을 포함하는 용리 완충액(50 mM 인산칼륨, 0.5 M NaCl, 500 mM 이미다졸; pH 7.0)에 재현탁시키고, 원심분리 후에, 상층액을 수지로부터 제거하고 완충액 교환(buffer exchange)을 위해 겔 여과 크로마토그래피를 통해 전개시켰다. 결과적으로 수득된 단백질 피크를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 이 경우, VEGF는 단백질 추출물의 약 25%로 존재했다. 결과가 도 2에 도시된다.
도 2. 부분적으로 정제된, 재조합 성장 인자 VEGF 및 디히드린을 포함하는 형질전환 식물 추출물. A) 추출물에 존재하는 전체 단백질을 염색한, 쿠마쉬 블루 염색된 SDS-PAGE 겔. B) 부분적으로 정제된, 디히드린을 포함하는 보리 종자 추출물 중 VEGF의 존재를 보여주는 웨스턴 블롯. 래인 번호 지정: 1 크기 표준, 2 추출물, 3 IMAC 통과액(flowthrough), 4 IMAC 용리액. 화살표는 아미노산 서열결정에 의해 확인된, 부분적으로 정제된 추출물 중 디히드린 및 VEGF의 존재를 나타낸다.
실시예 3: 부분적으로 정제된, 글로불린 및 IGF -1을 함유한 형질전환 식물 추출물.
실시예 1에 따라, 형질전환 보리 종자를 추출 완충액 II (50 mM 인산칼륨 pH 7.0 200 mM NaCl) 중에서 추출시켰다. 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 추출물을 IMAC 수지에 결합시키고, 용리시키며, 뒤이어 용리물을 탈염시키고 완충액을 100 mM KPi pH 6.8로 교환했다. 그 후, 부분적으로 정제된 추출물을 SP-Sepharose (GE Healthcare)를 매트릭스로 이용한, IGF-1을 효과적으로 결합하는 조건 하에서 이온 교환 크로마토그래피 수지에 첨가하는 것에 의해 더 처리했다. 상응하는 분획을 SDS-PAGE 및 은염색(silverstaining) 및 특이적 항 IGF-1 항체에 의한 웨스턴 블롯으로 분석했다. 상기 부분적으로 정제된 식물 추출물의 IGF-1 함량은 60%였다.
도 3. 부분적으로 정제된, 보리 글로불린 및 IGF-1을 포함하는 식물 추출물. A) 은염색된 SDS-PAGE 겔. 래인 번호지정: 1 크기 표준, 2 탈염되고 완충액 교환된, IMAC 컬럼으로부터의 용리물, 3 SP-Sepharose IEC로부터의 통과액, 4 IGF-1 및 보리 글로불린을 포함하는, SP-Sephasore IEC로부터의 용리물. 5 양성 대조군: 박테리아에서 제조된 재조합 IGF-1.
실시예 4: 형질전환 보리 종자 추출물로부터 정제된, 정제되고 단리된 성장 인자 IL -1 알파.
정제된 형태로 성장 인자를 단리시키기 위해, 형질전환 식물의 추출물을 더 정제할 수 있다: IMAC 용리물을 겔 여과에 의한 완충액 교환 후에, 이온 교환 컬럼 Sepharose FF에 적용하고 추출물 중 단백질을 용리 완충액의 NaCl 함량을 증가시키는 단계적 용리에 의해 분리하였다. 이 방식으로 성장 인자를 디히드린으로부터 성공적으로 분리할 수 있었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 성장 인자를 이 방식으로 고 순도, >95% (래인 7)까지 정제하여, 형질전환 식물 추출물로부터 단리되고 정제된, IL-1 알파를 수득할 수 있다.
도 4. 형질전환 식물 추출물로부터 IL-1 알파의 정제 및 단리. A) 추출물에 존재하는 전체 단백질을 염색한, 쿠마쉬 블루 염색된 SDS-PAGE 겔. B) IL-1 알파 함유 추출물의 웨스턴 블롯. 래인 번호지정: 1 및 9 크기 마커, 2 추출물, 3 IMAC 통과액, 4 IMAC 용리물, 5 농축된 IMAC 용리물, 6 IEC로부터의 35% NaCl 용리물, 7 75% NaCl 용리물, 8 100 % NaCl 용리물. D: 디히드린, IL-1a: 인터루킨 1 알파.
실시예 5: 조성물 중 식물-유래 성장 인자의 용도
하기의 실시예는 본 발명에 따른 미용 조성물의 제제를 예시하나, 어떤 방식으로도 본 발명을 한정하도록 의도되지 않는다.
제제 1: 피부 연화제 (스킨 로션, 세럼)
6 내지 9의 pH 범위로 완충된, 안정한 조성물을 제조할 수 있다.
성분 함량(중량 기준 %)
EGF(형질전환 식물 유래) 0.00025
글리세롤 10-90 %
염화칼슘 0,1 mM-200 mM
정제수 충분한 양(q.s)
소디움 히알루로네이트 0,01-2
에탄올 0,1-10
제제 2: 영양 에멀젼(밀크 로션)
성분 함량(중량 기준 %)
EGF(형질전환 식물 유래) 0.0002
프로필렌 글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 1.2
토코페릴아세테이트 3.0
액체 파라핀 5.0
스쿠알렌 3.0
마카다미아 넛트 오일 2.0
폴리소르베이트 60 1.5
소르비탄 세스퀴올리에이트 1.0
카르복시비닐폴리머 1.0
향료 0.2
메틸파라벤 0.2
이미다졸리디닐 우레아 0.2
정제수 충분한 양
제제 3: 영양 크림
성분 함량(중량 기준 %)
VEGF(형질전환 식물 유래) 0.0005
바셀린 7.0
액체 파라핀 10.0
왁스 2.0
폴리소르베이트 60 2.0
소르비탄 세스퀴올리에이트 2.5
스쿠알렌 3.0
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 0.5
카르복시비닐폴리머 0.5
토코페릴아세테이트 0.1
향료 0.2
메틸파라벤 0.2
이미다졸리디닐 우레아 0.2
정제수 충분한 양
제제 4: 마사지 크림
성분 함량(중량 기준 %)
EGF(형질전환 식물 유래) 0.0002
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 0.5
왁스 2.0
토코페릴아세테이트 0.1
폴리소르베이트 60 3.0
소르비탄 세스퀴올리에이트 2.5
세테아릴 알코올 2.0
액체 파라핀 30.0
카르복시비닐폴리머 0.5
향료 0.2
메틸파라벤 0.2
이미다졸리디닐 우레아 0.2
정제수 충분한 양
제제 5: 페이셜 팩(Facial pack)
성분 함량(중량 기준 %)
TGF-a(형질전환 식물 유래) 0.0005
프로필렌글리콜 2.0
글리세린 4.0
카르복시비닐폴리머 0.3
에탄올 7.0
PEG-40 수소화 캐스터 오일 0.8
트리에탄올아민 0.3
향료 0.2
메틸파라벤 0.2
이미다졸리디닐 우레아 0.2
정제수 충분한 양
제제 1 내지 5는 유사하게, 상세한 설명에 열거된 대안적인 성장 인자를 이용하여 제제화될 수 있다.
제제 6: 국소 적용용 W/O 에멀젼.
20 ㎍ 활성 물질을 포함하는 동결건조된 물질의 상당한 양을 10% DMSO를 포함하는 10% 에탄올 수성-알코올 용액 5 ml에 용해시킨다. 수득된 용액을 10 미만의 HLB 계수를 갖는 W/O 에멀젼을 위해 적합한 계면활성제를 이용하여 피부 적용을 위해 멸균된 식물성 오일 중에 유화시킨다. 수득된 에멀젼은 약 2 ㎍/g 조성물과 동일한 활성 물질을 포함한다.
제제 7: O/W 에멀젼
약 20 ㎍ 활성 물질을 포함하는 동결건조된 물질의 상당한 양을 30% DMSO를 포함하는 수성-알코올 용액 5 ml에 용해시키고 식물성 오일-기반 친지성 용매에서 적절한 계면활성제로 유화시킨다. 결과적으로 수득된 O/W 에멀젼은 약 3 ㎍/g 조성물의 농도로 활성 물질을 포함한다.
제제 8: 겔의 제형인 국소 조성물.
100 ㎍ 활성 물질을 포함하는 동결건조된 물질의 상당한 양을 20% DMSO를 포함하는 10% 에탄올 수성-알코올 용액 20 ml에 용해시킨다. 그 후, 수득된 용액에 폴리에틸렌 글리콜 (400-4000)과 폴리프로필렌 글리콜의 혼합물을 첨가한다. 활성 물질은 2 ㎍/g 조성물과 동일한 양으로 존재한다. 수득된 겔은 미용 적용을 위해 적합하다.
제제 9: 카르보머(1%)를 함유한 국소 젤 제제
EGF(형질전환 식물 유래) 5 mg
카르보머(Carbomer) 934P 1 g
메틸 파라옥시벤조에이트 0.2 g
프로필렌 글리콜 20 g
수산화나트륨 충분한 양
주사용 증류수 충분한 양
합계 100 g
통상적인 방법에 따라 주어진 양의 전술된 성분들을 이용하여 제제를 제조한다. 구체적으로, 메틸 파라옥시벤조에이트를 적절한 양의 주사용 증류수에 용해시키고, 카르보머 934P를 수득된 용액에 첨가하고 교반(string) 하에 그 내부에 분산시킨다. 수득된 용액의 pH는 수산화나트륨으로 조절하고, 용액을 프로필렌 글리콜과 혼합하고, 가열에 의해 멸균시킨다. 그 후, 수득된 용액에 주사용 증류수 중 EGF의 여과되고 멸균된 용액을 첨가하여 100 g의 제제를 수득한다.
제제 10: 폴록사머 (15%)를 함유한 국소 제제
EGF 2,5 mg
폴록사머(Poloxamer) 407 15 g
메틸 파라옥시벤조에이트 0.2 g
소디움 히드로겐 포스페이트 272.18 mg
염화나트륨 666.22 mg
인산 충분한 양
프로필렌 글리콜 20 g
주사용 증류수 충분한 양
합계 100 g
통상적인 방법에 따라 주어진 양의 전술된 성분들을 이용하여 제제를 제조한다. 구체적으로, 주어진 양의 소디움 히드로겐 포스페이트, 염화나트륨 및 인산을 이용하여 인산염 완충액을 제조한다. 보존제인 메틸 파라옥시벤조에이트를 인산염 완충액에 용해시킨다. 폴록사머(Poloxamer) 407(BASF, Germany)을 수득된 용액에 첨가하고, 교반(string) 하에 그 내부에 분산시킨다. 그 후, 수득된 용액을 프로필렌 글리콜과 혼합하고, 교반 하에 그 내부에 분산시킨다. 수득된 용액의 pH는 수산화나트륨으로 조절하고, 용액을 프로필렌 글리콜과 혼합하고, 가열에 의해 멸균시킨다. 그 후, 수득된 용액에 주사용 증류수 중 EGF의 여과되고 멸균된 용액을 첨가하여 100 g의 제제를 수득한다.
제제 11: 카르보머 (0.1%)를 함유한 크림 제제
EGF 0.05 mg
글리세린 4.5 g
메틸 파라옥시벤조에이트 0.15 g
프로필 파라옥시벤조에이트 0.05 g
카르보머 940 0.1 g
스테아릴 알코올 1.75 g
세틸 알코올 4.00 g
스판(Span) #60 0.50 g
폴리옥실 #40 스테아레이트 2.00 g
트리에탄올아민 충분한 양
주사용 증류수 충분한 양
합계 100 g
통상적인 방법에 따라 주어진 양의 전술된 성분들을 이용하여 제제를 제조한다. 구체적으로, 글리세린 및 메틸 파라옥시벤조에이트를 적절한 양의 주사용 증류수에 용해시키고, 카르보머 940(BF Goodrich, U.S.A.)을 수득된 용액에 첨가하고, 교반 하에 그 내부에 분산시킨다. 그 후, 프로필 파라옥시벤조에이트 및 나머지를 상기 용액에 첨가하고 용융(melting)에 의해 유화시킨다. 그 후, 수득된 용액을 트리에탄올아민을 이용하여 pH를 조절한 후 멸균시키고, 주사용 증류수 중 (식물로부터 발현되고 단리된) EGF의 여과되고 멸균된 용액과 혼합하여 100 g의 제제를 수득한다.
실시예 6: 식물-제조 EGF 의 안정성 테스트
본 실시예는 다양한 온도에서, 즉 +4℃ 냉장, +37℃, 및 실온(RT)에서 3주까지 인큐베이션시킨, 실시예 5, 제제 1에서와 같은 제제 중 정제되고, 재구성된 동결-건조, 비-글리코실화, 식물-제조 EGF의 안정성 부하(stability challenge) 테스트를 보여준다. 결과가 도 5에 도시된다. 크기 마커 11 및 17 kDa이 제1 래인에 표시된다. 결과는 37℃, RT 및 +4℃에서 수주 동안 성장 인자의 탁월한 안정성을 보여준다. 박테리아(대장균)에 의해 제조된 제품의 제조사의 설명에 따르면, 박테리아로부터 유래된 재조합 EGF의 재구성된, 정제 형태는 2℃ 내지 4℃에서 1주 동안만 안정하다. (Ref.http://www.cellsciences.com/PDF/CRE100.pdf)
실시예 7: 손의 겨울 습진을 경감시키는 적용
실시예 5의 제제 1의 단백질 안정화 조제물 중 식물-유래 이종 표피 성장 인자 (EGF)를 포함하는 부분적으로 정제된 형질전환 보리 종자-추출물을 함유한 본 발명의 조성물을 9세 소년의 발진이 있는 건조하여 갈라지고, 가려운, 붉은 피부(즉, 겨울 습진)에 국소로 적용한다. 3 방울의 국소 조제물을 겨울 습진을 앓는 것이 명백한 손등에 고르게 도포한다. 도 6a)는 조제물로서 본 발명의 조성물의 국소 적용 전의 손을 보여주고, 도 6b)는 피부 복구의 명확한 징후를 보이고, 겨울 습진의 증상이 완화된, 본 발명의 조성물에 의한 치료 후 24시간 경과시의 동일한 손을 보여준다.
실시예 8: 겨울 습진-"겨울 발"
도 7 a) 및 b) 심각한 피부 문제를 초래한, "겨울-발(winter-feet)"을 가진 10세 소년의 발을 보여준다. 건조하고, 가렵고, 붉은 피부는 자극 및 피부의 깊은 갈라짐으로부터의 출혈 및 심하게 약화된 표피를 유발한다.
사진 7 a) 및 b)는 치료의 개시 전에 찍고, 사진 7 c) 및 d)는 실시예 5의 제제 1을 포함하는 단백질 안정화 조제물 중 식물-유래 이종 표피 성장 인자 (EGF)를 포함하는 부분적으로 정제된 형질전환 종자-추출물을 함유한 본 발명의 조성물을 발 당 4 내지 5 방울씩 매일 5일 동안 국소 적용한 후 찍는다. 표피가 치료되었고 높은 정도까지 탄력성 및 부드러움 및 재수화를 회복했다.
실시예 9: 피부 탄력성
실시예 5의 제제 1을 포함하는 단백질 안정화 조제물 중 식물-유래 이종 표피 성장 인자 (EGF)를 포함하는 부분적으로 정제된 형질전환 종자-추출물을 함유한 본 발명의 조성물의 얼굴 피부의 탄력성 및 견고성(firmness)에 대한 효과를 객관적으로 평가하기 위해, 피부의 기계적 특성을 제어된 흡인(controlled suction) 기술에 의해 평가했다.
전형적인 피부 변형 곡선(skin deformation curve)이 도 8에 도시된다. 하기의 파라미터를 분석했다: Ue, 즉각적 팽창(immediate distension) - 피부가 변형 후 그의 최초 위치까지 복귀하는 능력을 측정하고 탄력 섬유의 기능과 관련된다.; Uv, 지연된 팽창(delayed distension); [R0] Uf, 최종 팽창(final distension) [피부 팽창성(skin distensibility)]; Ur, 즉각적 수축(immediate retraction); R, 측정 사이클의 종료시 잔류 변형(residual deformation) [탄성 팽창(resilient distension)]; [R2] Ua/Uf, 점성 변형(viscous deformation)을 포함한, 피부의 총-탄력성(gross-elasticity); [R5] Ur/Ue, 점성 변형을 포함하지 않는, 피부의 순-탄력성(neto-elasticity); [R7] Ur/Uf, 생물학적 탄력성(biological elasticity), 즉, 총 팽창에 대한 즉각적인 수축의 비; [R6] Uv/Ue, 탄성 팽창(elastic distension)에 대한 점탄성 팽창(viscoelastic)의 비; 및, R8, 비스코파트(viscopart), 즉, 변형 곡선의 흡인부 이하 면적(the area under the suction part of the deformation curve). 두 개의 측정값의 평균값을 후속 계산에서 이용했다.
비-침습적 흡인 장치(Cutometer® MPA580)를 이용하여, 얼굴 피부의 기계적 특성을 연구했다. 이 장치는 작은 구멍 내로 당겨지고, 부압에 노출된 피부의 생체역학적(biomechanical) 특성을 측정한다. 두 개의 상이한 피부-관리 제제, 안정화된 이종 식물-제조 EGF를 포함하는 본 발명의 조성물을 함유한 세럼 및 EGF를 포함하지 않는 것을 제외하고는 동일한 세럼을 볼, 눈-주위(eye-contour), 및 이마를 포함한 얼굴의 대향 면에 각각 적용했다. 4개월의 처리 후, Cutometer®MPA580을 이용하여, 탄력성 및 견고성을 측정했다. 요약하면, 0 내지 450 mbar의 흡인의 점진적 증가를 피부에 적용하고, 2초의 일정한 압력 적용 후, 뒤이어 2초의 이완기(relaxation period)로 총 4초의 운전 시간(run time)으로 수행했다. 얼굴의 각 면에서 피부 탄력성 및 점탄성을 측정하고 평가하고, 뒤이어 두 개의 상이한 처리 영역 간의 값을 비교했다.
결과가 도 9에 도시된다. EGF로 처리된 피부(상부 곡선)는 유의성있게 더 높은 탄성 파라미터 (즉, Ue, Ur, Ua/Uf, Ur/Uf, Ur/Ue) 및 더 낮은 점탄성 파라미터(즉, Uv 및 Uv/Ue)를 특징으로 했다. 분명히, 두 개의 상이하게 처리된 영역을 비교할 때, 피부 탄력성의 증가 및 점탄성의 감소는 안정화된 이종 식물-유래 EGF를 포함하는 본 발명의 조성물을 함유하는 세럼에 의한 처리와 상관관계를 갖는다. 본 발명의 조성물에 의해 처리된 피부는 증가된 피부 탄력성 및 견고성을 특징으로 했다.
실시예 10: 식물-유래 이종 EGF (pd-EGF)를 포함하는 제제화된 식물 추출물의 1개월 적용 후 얼굴 피부 탄력성의 평가
대상은 30세 내지 70세의 여성 12명이었다. 이 연구는 노화 피부의 명확한 징후의 선별 기준(inclusion criteria)을 포함하지 않았다. 개체 중 8명은 실시예 5의 제제 1을 포함하는 단백질 안정화 조제물 중 식물-유래 이종 표피 성장 인자(EGF)를 갖는 형질전환 보리 종자-추출물을 이용했고, 4명의 개체는 형질전환 보리 종자 추출물을 포함하지 않는 세럼, 즉, 위약 세럼(placebo serum)을 이용하여 1개월 동안 1일 2회 이마, 볼 및 눈 주위에 적용했다. 개체들은 연구 기간 동안 그들의 정상적인 일일 피부 관리 절차를 지속하도록 허용되었다.
적용 기간의 개시(기준선 = 0일차) 및 종료 시에, 처리된 영역의 피부 표면에서 비-침습적 피부 분석을 수행하고 기준선(0일차)의 결과를 1개월 적용 후 결과와 비교했다. 정량적 측정값을 Soft Plus Skin Analysing System(Callegari1930)에 의해 수득했다. 본 연구에서 테스트된 파라미터는 흡인에 대한 내성에 의해 측정된 피부 탄력성이었다. 모든 데이터를 연구를 완료한 모든 개체에 대해, 연구 전 (기준선 = 0일차) 평균값 및 연구의 종료시 평균값으로 분석한다. 최종 결과를 기준선 값 대비 무처리 영역 대비 처리된 영역의 유도 배수(fold-induction)(즉, 상대적 값 1 = 0일차)로서 제시한다(도 10).
실시예 10: 항미생물 활성
본 실시예는 실시예 5, 제제 1에 따른 본 발명의 조성물의 미생물 부하(microbial challenge) 테스트 및 항미생물 보존 효능의 결정을 보여준다.
조성물의 항박테리아 특성을 확립하기 위해, 상기 조성물을 박테리아로 자극했다. 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 9027 균주)의 액체 배양액 0,5 ml를 50 ml의 안정화 조성물에 접종했다. 표준화된 조건 하에 시료를 인큐베이션시키고 European Pharmacopoeia 5.1.3.에 "항미생물 보존의 효능(efficacy of Antimicrobial preservation)"에 대해 상세히 기재된 방법에 근거하여 박테리아의 갯수를 결정했다. 박테리아의 스톡 배양액, 염화나트륨 9 g/L를 포함하는 멸균 현탁액으로부터 접종원을 제조했다. 배양액을 유체로 희석시켜 ml 당 107의 박테리아를 수득하고, 1 ml를 안정화 조성물을 담은 용기에 접종원으로 첨가하고 완전히 섞었다. 접종된 생성물을 빛으로부터 보호하면서 22℃에서 유지시켰다. 1 ml의 시료를 특정된 시간 간격에 접종된 산물로부터 취하고 박테리아의 갯수는 플레이트 계수에 의해 결정했다.
접종 후 경과 시간(일) 안정화 조성물 ml 당 슈도모나스 에어루기노사의 갯수 (log10)
0 7,40
2 4,43
7 0,48
14 0
28 0
결과는 본 발명의 조성물의 명확한 항미생물 활성을 보여주고, 통상적인 보존제 및 항박테리아제의 사용 없이, 국소 제제에 대한 유럽 약전(European Pharmacopoeia for Topical preparations)에 따라 항박테리아 활성의 권고된 효능을 충족시킨다. 따라서, 이 제제는 국소 미용 및/또는 치료 조성물에 적합하고 가능한 자극성 보존제, 항미생물제, 및 민감한 피부에 대해 약화시키는 기타 첨가제의 가능한 부작용을 회피한다.
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Claims (35)

  1. 히알루론산 및 하나 이상의 형질전환 식물로부터 유래된 성장 인자, 및 하나 이상의 약제학적으로 및/또는 미용적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 피부 관리/피부과용 조성물(skin care/dermatologic composition).
  2. 청구항 1에 있어서, 성장 인자 단백질을 안정화시키는 부형제 조제물(excipient formula)을 포함하는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 히알루론산은 중량 기준으로 약 0.01 % 내지 약 2 %의 농도로 제공되는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성장 인자는 상기 미용 조성물 중에 포함된 형질전환 식물 추출물의 성분으로 제공되는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 성장 인자는 상기 형질전환 식물 추출물 중에 총 단백질 함량의 약 0.0001% 내지 약 70% 범위의 양으로 존재하는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  6. 청구항 4 또는 5에 있어서, 상기 식물 추출물은 상기 성장 인자가 강화(enrich)되도록 정제된 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  7. 청구항 4 또는 5에 있어서, 건조 피부, 습진, 피부염, 갈라진 피부(cracked skin), 발진, 피부 발적(skin redness), 흉터 조직, 건선, 및 부종 중 하나 이상으로부터 선택된 피부 질환의 치료를 위해 적합한 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  8. 청구항 2 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 안정화 조제물은 글리세롤, 물, 및 염화칼슘을 포함하는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 단백질 안정화 조제물은 하기 성분(중량 기준 %)을 포함하는 것인 피부 관리/피부과용 조성물: 10 내지 90 % 범위의 글리세롤, 0,1 mM 내지 200 mM 범위의 염화 칼슘, 6 내지 9의 pH 범위의 완충제 및 충분한 양(q.s)의 정제수.
  10. 청구항 8 또는 9에 있어서, 추가적인 항미생물제 또는 보존제를 포함하지 않는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환 식물로부터 유래된 성장 인자를 2종 이상 포함하는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 2종 이상의 성장 인자는 형질전환 식물 추출물의 혼합물의 성분으로 존재하는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 2종 이상의 성장 인자는 상기 형질전환 식물 추출물의 혼합물에 단백질 함량의 약 0.0001% 내지 약 70% 범위의 양으로 존재하는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 성장 인자 또는 상기 2종 이상의 성장 인자는 형질전환 식물로부터 단리되고, 약 70% 내지 약 99.9% 범위의 순도 수준까지 정제된 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 식물-유래 정제된 성장 인자가 이미 식물-유래 성장 인자를 포함하는 형질전환 식물 추출물에 첨가되는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 성장 인자 또는 상기 2종 이상의 성장 인자는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 피부 관리/피부과용 조성물: 표피 성장 인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 혈관 상피 성장 인자(Vascular Epithelial Growth Factor, VEGF), PDGF-AA, PDGF-BB, 및 PDGF-Rb를 포함한 혈소판-유래 성장 인자(Platelet-Derived Growth Factor, PDGF), FGF-a, 및 FGF-b, FGF-4 및 FGF-6을 포함한 섬유모세포 성장 인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), TGF 베타-1, TGF 베타-2, TGF 베타-3을 포함한, 형질전환 성장인자(Transforming Growth Factor)-베타(TGF-b), 형질전환 성장인자-알파(TGF-a), 에리트로포이에틴(Erythropoietin, Epo), 인슐린-유사 성장 인자-I(Insulin-Like Growth Factor-I, IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자-II(IGF-II), IL-1 알파 및 IL-1 베타를 포함한 인터루킨-1(Interleukin-1, IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-13(IL-13), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-20(IL-20), 종양 괴사 인자-알파(TNF(Tumor Necrosis Factor)-a), 종양 괴사 인자-베타(TNF-b), 인터페론-감마(Interferon-gamma, INF-g), 과립구 집락 자극 인자(Granulocyte Colony Stimulating Factor, G-CSF), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(Granulocyte Macrophage Colony stimulating factor, GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(Macrophage Colony stimulating factor, M-CSF), 태반 성장 인자 (Placenta Growth Factor, PLGF), 신경 성장 인자(Nerve Growth Factor, NGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 골형성 단백질(BMP(Bone morphogenesis Protein)-4), 간세포 성장 인자(Hepatocyte Growth Factor, HGF), 렙틴(Leptin), 노긴(Noggin), 및 티모신 베타(Thymosin beta) 4.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성장 인자 또는 사이토카인은 상응하는 인간 유전자 서열로부터 기원한 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  18. 청구항 1 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성장 인자 또는 사이토카인은 개별적인 성장 인자 또는 사이토카인에 대한 인간 유전자 서열에 상응하는 합성된 유전자로부터 기원한 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  19. 청구항 4 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 식물 추출물은 디히드린(dehydrin) 및/또는 글로불린 또는 기타 종자 단백질을 포함하는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  20. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 크림, 로션, 겔, 드레싱, 샴푸, 팅크제(tincture), 페이스트(paste), 연고, 살브(salve), 분말, 액체 또는 반액체(semiliquid) 제제, 세럼(serum), 패치, 리포좀 제제(liposomal preparation), 용액, 현탁액, 리포좀 현탁액, W/O 또는 O/W 에멀젼, 포마드(pomade) 및 피부 연화제 크림(skin softener cream), 페이셜 팩(facial pack), 마사지 크림, 및 영양 크림 또는 영양 에멀젼으로부터 선택된 제형인 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  21. 하나 이상의 형질전환 식물로부터 유래된 성장 인자 및 글리세롤을 포함하는 단백질 안정화 조제물, 및 충분한 양의 정제수를 포함하는, 피부 관리/피부과용 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 염화나트륨, 염화칼륨 및 염화칼슘으로부터 선택된 염을 더 포함하는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  23. 청구항 21 또는 22에 있어서, 히알루론산을 더 포함하는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  24. 청구항 22 또는 23에 있어서, 형질전환 식물로부터 유래된 성장 인자, 및 10 중량 내지 90 중량% 범위의 글리세롤, 0,1 mM 내지 200 mM 범위의 염화 칼슘, 완충제 및 충분한 양(q.s)의 정제수를 적어도 포함하는 단백질 안정화 조제물을 포함하는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  25. 청구항 21 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 항미생물제 또는 보존제를 포함하지 않는 것인 피부 관리/피부과용 조성물.
  26. 청구항 17 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성장 인자는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 피부 관리/피부과용 조성물: 표피 성장 인자(EGF), 혈관 상피 성장 인자(VEGF), PDGF-AA, PDGF-BB, 및 PDGF-Rb를 포함한 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), FGF-a, 및 FGF-b, FGF-4 및 FGF-6을 포함한 섬유모세포 성장 인자(FGF), TGF 베타-1, TGF 베타-2, TGF 베타-3를 포함한 형질전환 성장인자-베타(TGF-b), 형질전환 성장인자-알파 (TGF-a), 에리트로포이에틴(Epo), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자-II(IGF-II), IL-1 알파 및 IL-1 베타를 포함한 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-13(IL-13), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-20(IL-20), 종양 괴사 인자-알파(TNF-a), 종양 괴사 인자-베타(TNF-b), 인터페론-감마(INF-g), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 태반 성장 인자(PLGF), 신경 성장 인자(NGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 골형성 단백질(BMP-4), 간세포 성장 인자(HGF), 렙틴, 노긴, 및 티모신 베타 4.
  27. 약제로서 사용하기 위한, 비-식물 유전적 기원(non-plant genetic origin)의 식물-제조 이종 성장 인자(plant-produced heterologous growth factor).
  28. 건조 피부, 습진, 피부염, 갈라진 피부, 발진, 흉터 조직, 건선, 피부 발적, 및 부종 중 하나 이상으로부터 선택된 피부 질환의 치료용 약제로서 사용하기 위한, 비-식물 유전적 기원의 식물-제조 이종 성장 인자.
  29. 청구항 27 또는 28에 있어서, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 것인 식물-제조 이종 성장 인자: 표피 성장 인자 (EGF), 혈관 상피 성장 인자 (VEGF), PDGF-AA, PDGF-BB, 및 PDGF-Rb를 포함한 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), FGF-a, 및 FGF-b, FGF-4 및 FGF-6을 포함한 섬유모세포 성장 인자(FGF), TGF 베타-1, TGF 베타-2, TGF 베타-3를 포함한 형질전환 성장인자-베타(TGF-b), 형질전환 성장인자-알파(TGF-a), 에리트로포이에틴(Epo), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자-II(IGF-II), IL-1 알파 및 IL-1 베타를 포함한 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-13(IL-13), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-20(IL-20), 종양 괴사 인자-알파(TNF-a), 종양 괴사 인자-베타(TNF-b), 인터페론-감마(INF-g), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 태반 성장 인자(PLGF), 신경 성장 인자(NGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 골형성 단백질(BMP-4), 간세포 성장 인자(HGF), 렙틴, 노긴, 및 티모신 베타 4.
  30. 청구항 27 또는 28에 있어서, 표피 성장 인자인 것인 식물-제조 이종 성장 인자.
  31. 히알루론산, 하나 이상의 부형제 및 하기로부터 선택된 성장 인자를 포함하는 형질전환 식물 추출물을 함께 혼합하는 단계를 포함하는, 국소용 제품(topical product)을 제조하는 방법: 표피 성장 인자(EGF), 혈관 상피 성장 인자(VEGF), PDGF-AA, PDGF-BB, 및 PDGF-Rb를 포함한 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), FGF-a, 및 FGF-b, FGF-4 및 FGF-6을 포함한 섬유모세포 성장 인자(FGF), TGF 베타-1, TGF 베타-2, TGF 베타-3를 포함한 형질전환 성장인자-베타(TGF-b), 형질전환 성장인자-알파(TGF-a), 에리트로포이에틴(Epo), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자-II(IGF-II), IL-1 알파 및 IL-1 베타를 포함한 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-5(IL-5), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨-10(IL-10), 인터루킨-13(IL-13), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18), 인터루킨-20(IL-20), 종양 괴사 인자-알파(TNF-a), 종양 괴사 인자-베타(TNF-b), 인터페론-감마(INF-g), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 태반 성장 인자(PLGF), 신경 성장 인자(NGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 골형성 단백질(BMP-4), 간세포 성장 인자(HGF), 렙틴, 노긴, 및 티모신 베타 4.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 하나 이상의 부형제는 글리세롤, 염화칼슘 및 물을 포함하는 것인 방법.
  33. 청구항 31 또는 32에 있어서, 상기 형질전환 식물 추출물은 보리 종자 추출물인 것인 방법.
  34. 청구항 31 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 식물 추출물로부터 상기 성장 인자를 단리시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 상기 단리시키는 단계는 이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
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