KR20120051724A - Muc1 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개선된 항원 결합 및/또는 항원 인식 특성을 갖는 항-뮤신 항체뿐만 아니라 항-뮤신 항체의 항원 결합 및/또는 항원 인식을 개선시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암의 치료에 유용한 개선된 항-MUC1 항체에 관한 것이다.

Description

MUC1 항체 {MUC1 Antibodies}
본 발명은 항체 분야에 관한 것이다. 특히, 개선된 항원 결합 및/또는 항원 인식을 나타내는 개선된 항-뮤신 항체뿐만 아니라 항-뮤신 항체의 항원 결합 및/또는 항원 인식을 개선시키는 방법이 제공된다. 특정한 구체예에서, 본 발명은 암의 치료에 유용한 개선된 항-MUC1 항체에 관한 것이다.
오늘날, 항체는 의료 및 연구 분야에서 널리 사용되는 물질이다. 의료 분야에서, 이들은 많은 상이한 분야에 적용되고 있다. 예를 들어 항체는, 질환의 진단 및/또는 예후를 허용하는 특정한 마커나, 예컨대 특정 호르몬의 존재 또는 농도와 같은 특정한 신체 파라미터의 측정을 허용하는 특정한 마커를 검출하기 위한 표지 물질로서 사용된다.
또한 항체는 암, 심혈관 질환, 염증성 질환, 황반변성(macular degeneration), 이식거부(transplant rejection), 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 바이러스 감염과 같은 다양한 질환의 치료 및 예방에 있어서 치료제로도 사용된다. 이러한 치료에 있어서 항체는, 예를 들면 수용체 또는 전달체 분자를 차단함으로써 그들의 질환-관련 기능을 억제하거나, 환자의 면역체계의 구성요소를 선발하고 활성화시킴으로써 그 자체로서 치료적 활성을 지닐 수 있다. 대안적으로, 항체는 치료적 활성을 지니는 또 다른 물질과 결합될 수 있다. 특히 암과 감염의 치료에 있어서, 상기 추가의 물질은 세포-사멸 활성을 가지며, 예를 들면 방사성 동위원소 또는 세포독소(cytotoxin)일 수 있다. 또 다른 적용에 있어서, 항체는 적합한 항체를 환자의 혈액순환(circulation)으로 전달함으로써 환자를 수동적으로 면역화하는데 사용될 수 있다.
특이적인 항체는 항원을 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양 또는 말과 같은 포유류에 주입함으로써 생산된다. 이러한 동물들로부터 분리된 혈액은 혈청 내에 상기 항원에 대한 다중클론 항체를 포함한다. 항원의 단일 에피토프에 특이적인 항체를 수득하기 위하여, 상기 동물로부터 항체-분비 림프구를 분리하고 이들을 암 세포주와 융합시킴으로써 불멸화시켜 하이브리도마 세포를 수득한다. 그 후 희석 클로닝(dilution cloning)에 의해 단일 하이브리도마 세포를 분리하여, 모두 동일한 단일클론 항체를 생산하는 세포 클론들을 생성한다.
하지만, 치료적 적용에 있어서 이러한 단일클론 항체들은, 이들이 동물 개체로부터 유래되어 인간 항체와는 아미노산 서열이 다르다는 문제가 있다. 그러므로 인간의 면역체계는 이러한 동물 항체들을 외래 항체로 인식하고 이들을 혈액순환(circulation)으로부터 신속하게 제거한다. 또한, 전신성 염증 효과가 유발될 수도 있다. 이러한 문제에 대한 해결책은, 단일클론 항체의 특정 불변 부위(constant part)를 인간 항체의 상응하는 부위로 대체하는 것이다. 오직 중쇄 및 경쇄의 불변 영역(constant region)이 대체되는 경우에만 키메라 항체가 수득되며, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역(variable region)의 틀 영역(framework region)의 추가적인 대체는 이른바 인간화된 항체를 생산해낸다.
연구에 있어서, 정제된 항체는 많은 응용 분야에 사용된다. 이들은 특히 단백질과 같은 생물학적 분자를 동정하고 이들의 위치를 찾아내는 데에 가장 흔하게 이용된다. 생물학적 분자는, 예를 들면 이들의 존재, 농도, 무결성(integrity) 또는 사이즈를 측정하기 위하여, 이들이 분리된 이후에 검출될 수 있다. 반면, 이들은, 예를 들면 이들의 존재 또는 위치를 측정하기 위하여, 세포 내에서 또는 조직 샘플 내에서 검출될 수 있다. 또한 항체는 특정한 생물학적 물질, 특히 단백질의 분리 방법에 이용되며, 여기서 항체는 관심 있는 생물학적 물질을 포함하는 샘플로부터 관심 있는 생물학적 물질을 특이적으로 분리한다.
이러한 모든 응용 분야에 있어서, 항원의 단단한 결합 및 특이적인 인식은 사용되는 항체에 있어서 필수적인 중요한 문제이다. 그것에 의하여 보다 높은 활성 및 보다 적은 교차반응(cross-reactivity)이 얻어지며, 특히 치료적 적용에 있어서 보다 적은 부작용이 얻어진다. 하지만 단일클론 항체의 인간화 중에는, 보통 유전자 조작된 항체의 친화도 및 특이성이 감소된다.
흥미롭고 중요한 항체군은 뮤신 단백질에 대한 항체군이다. 뮤신은 척추동물에서 많은 상피 조직에 의해 생산된 고 분자량의, 고도로 글리코실화된 단백질 패밀리이다. 이들은 원형질막(plasma membrane)에의 잔류를 돕는 소수성 멤브레인-스패닝 도메인의 존재로 인해 멤브레인-결합된 뮤신 단백질과, 점막 표면으로 분비되거나 타액의 성분이 되도록 분비되는 뮤신으로 세분화될 수 있다. 인간의 뮤신 단백질 패밀리는 적어도 MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19 및 MUC20의 패밀리 구성원으로 이루어지며; 여기서 MUC1, MUC3A [이소폼(isoform) 1], MUC3B 및 MUC4는 멤브레인에 결합된 것이다.
증가된 뮤신 생산은 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 결장암 등의 암을 포함하는 많은 선암종(adenocarcinoma)에서 일어난다. 뮤신은 또한 천식, 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease) 또는 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)과 같은 폐질환에서도 과발현된다. 2개의 멤브레인 뮤신인 MUC1과 MUC4는 질환 과정에서 이들의 병리학적인 영향에 관하여 광범위하게 연구되어 왔다. 더욱이, 뮤신은 진단 마커로서의 잠재성에 대해서도 연구되고 있다.
뮤신 단백질에 대한 몇몇 항체, 특히 MUC1은 당업계에 공지되어 있다. 이들 중 일부는 이미 의학적 적용에 대하여 승인되었다. 그러나 이들의 항원 친화도 및/또는 항원 특이성이 향상될 수 있다면, 이들의 이용은 훨씬 더 개선될 수 있을 것이다.
이러한 관점에서, 본 기술 분야에, 바람직하게는 향상된 항원 결합 및/또는 항원 인식 특성을 갖는 개선된 항-뮤신 항체 뿐만 아니라, 알려진 항체, 특히 치료적 MUC1 항체의 항원 결합 및/또는 항원 인식을 개선시키기에 적합한 방법을 제공할 필요성이 있다.
발명의 요약
본 발명자들은, 카밧(Kabat) 넘버링에 따른 항체의 중쇄 가변 영역의 위치 28에 프롤린 잔기가 존재하면 뮤신 단백질에 대한 항체의 항원-결합 특성이 좋다는 것을 발견하였다.
따라서 한 측면에서, 본 발명은 뮤신 단백질에 결합할 수 있고, 카밧 넘버링에 따른 아미노산 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체에 관한 것이다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 또한 세 번째 측면에서 본 발명에 따른 핵산 및 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터가 제공되며, 네 번째 측면에서 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
다섯 번째 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 벡터, 또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
여섯 번째 측면에 따르면, 본 발명은 의약에 사용하기 위한, 특히 암, 바람직하게는 결장암, 위암, 간암, 췌장암, 신장암, 혈액암, 폐암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택되는 암의 치료, 예후, 진단 및/또는 모니터링에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체, 핵산, 발현 카세트 또는 벡터, 숙주 세포 또는 조성물을 제공한다.
일곱 번째 측면에서, 본 발명은 카밧 넘버링에 따른 중쇄 가변 영역의 위치 28에 프롤린 잔기를 제공하는 단계를 포함하는, 뮤신 단백질에 결합할 수 있고 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 항원 결합 및/또는 항원 인식을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
여덟 번째 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 핵산의 제조 방법에 관한 것이다:
(a) MUC1에 결합할 수 있고, 카밧 넘버링에 따른 아미노산 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하지 않는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하는 단계;
(b) 중쇄 가변 영역의 카밧 넘버링에 따른 아미노산 번호 28을 코딩하는 코돈이 프롤린 잔기를 코딩하도록 상기 코돈에 돌연변이를 도입하는 단계.
본 발명의 다른 목적, 특징, 장점 및 양태는 하기의 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 하지만, 적용의 바람직한 구체예를 나타낸 하기의 설명, 첨부된 특허청구범위 및 구체적인 실시예들은 단지 예로써 개시된 것임을 이해하여야 한다. 하기 내용을 읽음으로써, 개시된 발명의 사상 및 범위 내에서의 다양한 변화와 변형이 당업자에게 쉽게 명확해질 것이다.
1은 키메라 마우스/인간 및 몇몇 인간화된 PankoMab-유래 항체의, PankoMab의 MUC1 에피토프를 포함하는 글리코실화된(256.1) 그리고 비-글리코실화된(258.1) 30-머(mer) 폴리펩타이드에 대한 결합 및 2, 4 또는 5 MUC1 직렬반복을 포함하는 다른 글리코실화된 폴리펩타이드(각각 TR2, TR4 및 TR5)에 대한 결합을 나타낸다. BSA에 대한 결합이 대조군으로 사용되었다. 실험은 역가(그래프의 좌측에 표시)의 조정 후에 항체를 함유하는 세포 상층액의 상이한 희석물들을 이용해 수행하였다.
도 2는 PankoMab의 MUC1 에피토프를 포함하는 (A) 비-글리코실화된(258.1) 그리고 (B) 글리코실화된(256.1) 30-머 폴리펩타이드에 대한 키메라 마우스/인간과 몇몇 인간화된 PankoMab-유래 항체의 결합을 나타낸다. 대조군으로서는(blank) 1차 항체를 사용하지 않았다. 추가의 대조군으로서, 당류의 고리를 깨뜨려서 폴리펩타이드 256.1의 글리코실화를 파괴하는 과요오드산염(PO)과 함께 30-머 폴리펩타이드를 처리한 후에 또한 실험을 수행하였다.
도 3은 PankoMab의 MUC1 에피토프를 포함하는 글리코실화된 30-머 표적 펩타이드 256.1에 대한 VH16m/VL6.1 항체 (중쇄 가변 영역의 위치 28에 프롤린 잔기를 가짐)의 결합과 VH16/VL6.1 항체 (중쇄 가변 영역의 위치 28에 트레오닌 잔기를 가짐)의 결합의 직접적인 비교를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
정의:
본원에서 사용된 다음의 표현들은, 이들이 사용된 문맥이 다르게 나타내는 경우를 제외하고는, 일반적으로 바람직하게는 하기에 나타낸 의미를 갖는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 표현 "포함하다"는, 문자적 의미 외에도 "필수적으로 구성되다" 및 "구성되다"라는 표현을 포함하며 이를 분명히 나타낸다. 따라서 표현 "포함하다"는, 구체적으로 나열된 요소들을 "포함하는" 청구대상이 추가의 요소를 포함하지 않는 구체예를 나타낼 뿐만 아니라, 구체적으로 나열된 요소들을 "포함하는" 청구대상이 추가의 요소를 포함할 수 있고/거나 포함하는 구체예를 나타낸다. 마찬가지로 표현 "갖는다"는, "필수적으로 구성되다" 및 "구성되다"라는 표현을 포함하며 이를 분명히 나타내는 표현인 "포함하다"로 이해된다.
용어 "항체"는 특히 이황화 결합에 의해 연결된 2개 이상의 중쇄 및 2개 이상의 경쇄를 포함하는 단백질을 의미한다. 용어 "항체"는 천연 항체(naturally occurring antibody) 뿐만 아니라 항체의 모든 재조합 형태, 예컨대, 원핵생물에서 발현된 항체, 비-글리코실화된 항체, 인간화된 항체 및 키메라 항체를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 또는 -IgM 또는 IgE 타입의 항체인 경우- 4개의 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2, CH3 및 CH4)을 포함하는데, 여기서 첫 번째 불변 도메인 CH1은 가변 영역에 인접하며, 힌지 영역에 의해 두 번째 불변 도메인 CH2에 연결될 수 있다. 경쇄-불변 영역은 단지 하나의 불변 도메인으로 이루어진다. 가변 영역은 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)이라 불리는 과변이 영역과, 이들 사이사이에 위치한 틀 영역(framework region, FR)이라 불리는 더욱 보존된 영역으로 더욱 세분화될 수 있으며, 각각의 가변 영역은 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역체계의 다양한 세포(예컨대, 효과기 세포)와 고전적인 보체계(complement system)의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 중재할 수 있다. 하지만 본 발명에 따른 용어 "항체"는 중쇄 항체, 즉 1개 이상의 중쇄, 특히 2개의 중쇄만으로 이루어진 항체와 같은 특이한 항체와, 나노바디(nanobody), 즉 단일의 단량체 가변 도메인만으로 이루어진 항체도 포함한다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 위치를 나타내기 위하여, 본원에서는 카밧 넘버링 체계가 사용되었다 (Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, NIH Publication No. 91-3242). 상기 체계에 따르면, 중쇄는 위치 35A, 35B, 52A 내지 52C, 82A 내지 82C 및 100A 내지 100K를 포함하는 위치 0 내지 위치 113의 아미노산 위치를 포함한다. 중쇄 가변 영역의 CDR은, 카밧 넘버링에 따르면, 위치 31 내지 35B (CDR1), 50 내지 65 (CDR2), 그리고 95 내지 102 (CDR3)에 위치한다. 남은 아미노산 위치들은 틀 영역 FR1 내지 FR4를 형성한다. 경쇄 가변 영역은 위치 27A 내지 27F, 95A 내지 95F, 그리고 106A를 포함하는 위치 0 내지 109를 포함한다. CDR은 위치 24 내지 34 (CDR1), 50 내지 56 (CDR2), 그리고 89 내지 97 (CDR3)에 위치한다. 항체의 특정한 유전자의 초기 형성에 따라, 이러한 위치의 전부가 정해진 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역에 존재할 필요는 없다. 본원에서 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에서 아미노산 위치가 언급되는 경우, 달리 나타내지 않는 한, 이는 카밧 넘버링에 따른 위치를 의미한다.
항체의 "단편 또는 유도체"는 특히 상기 항체로부터 유래하고 상기 항체와 동일한 항원, 특히 동일한 에피토프에 결합할 수 있는 단백질 또는 당단백질(glycoprotein)이다. 따라서 본원에서 항체의 단편 또는 유도체는 일반적으로 기능성 단편 또는 유도체를 의미한다. 특히 바람직한 구체예에서, 항체의 단편 또는 유도체는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장(full-length) 항체의 단편 또는 이의 유도체에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 단편 또는 유도체의 예는 (i) 중쇄와 경쇄 각각의 가변 영역 및 제1 불변 도메인으로 구성된 1가의 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화물 가교(disulfide bridge)에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가의 단편인 F(ab)2 단편; (iii) 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 도메인 CH1으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 한팔(single arm)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 구성된 Fv 단편; (v) 단일 폴리펩타이드 사슬로 구성된 Fv 단편인 scFv 단편; (vi) 공유결합으로 서로 연결된 2개의 Fv 단편으로 구성된 (Fv)2 단편; (vii) 중쇄 가변 도메인; 및 (viii) 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 연합이 분자 내에서는 일어나지 않고 오직 분자 간에만 일어날 수 있는 방식으로 공유결합으로 서로 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역으로 구성된 멀티바디(multibody)를 포함한다. 이러한 항체 단편 및 유도체는 당업자에게 공지된 종래의 기술을 사용하여 수득된다.
예를 들어, 만약 표적 아미노산 서열이 그 전체 길이에 걸쳐서 60 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 75 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 93 % 이상, 95 % 이상 또는 97 % 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 참조 아미노산 서열의 상응하는 부분과 공유한다면, 표적 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열로부터 "유래된다". 예를 들어, 만약 인간화된 항체의 틀 영역이 특정한 인간 항체의 가변 영역으로부터 유래된다면, 인간화된 항체의 틀 영역의 아미노산은 그 전체 길이에 걸쳐서 60 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 75 % 이상, 더욱 바람직하게는 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 93 % 이상, 95 % 이상 또는 97 % 이상의 상동성 또는 동일성을 상응하는 인간 항체의 틀 영역과 공유한다. "상응하는 부분" 또는 "상응하는 틀 영역"은, 예컨대, 표적 항체의 중쇄 가변 영역의 틀 영역 1(FRH1)이 참조 항체의 중쇄 가변 영역의 틀 영역 1에 상응하는 것을 의미한다. 예를 들어, FRH2, FRH3, FRH4, FRL1, FRL2, FRL3 및 FRL4에 대해서도 동일하게 적용된다. 특정한 구체예에서, 참조 아미노산 서열로부터 "유래된" 표적 아미노산 서열은 그 전체 길이에 걸쳐서 참조 아미노산 서열의 상응하는 부분과 100% 상동이거나, 특히 100 % 동일하다.
"특이적인 결합"은 바람직하게는 항체 같은 물질이 그것에 특이적인 에피토프 같은 표적에 다른 표적에 대한 결합보다 더욱 강하게 결합하는 것을 의미한다. 만약 어떤 물질이 제2 표적에 대한 해리상수(Kd)보다 낮은 해리상수를 갖는 제1 표적에 결합한다면, 그 물질은 제2 표적에 비해 제1 표적에 더욱 강하게 결합한다. 바람직하게는 물질이 특이적으로 결합하는 표적에 대한 해리상수는, 물질이 특이적으로 결합하지 않는 표적에 대한 해리상수보다 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상, 더욱 더 바람직하게는 20배, 50배, 100배, 200배, 500배 또는 1000배 이상 낮다.
본원에서 사용된 용어 "단백질"은 아미노산의 분자 사슬 또는 하나 이상의 아미노산 사슬의 복합체를 의미한다. 단백질은 임의의 천연 아미노산(naturally occurring amino acid) 뿐만 아니라 인공 아미노산을 함유할 수 있으며, 생물학적 또는 합성적 기원일 수 있다. 단백질은, 예를 들어 글리코실화, 아미드화, 카르복실화 및/또는 인산화에 의해, 자연적으로(번역후 변형) 또는 합성적으로 변형될 수 있다. 단백질은 2개 이상의 아미노산을 포함하지만, 어떠한 특정한 길이를 가질 필요는 없다; 이 용어는 어떠한 크기 제한도 포함하지 않는다. 본 출원에 있어서, 용어 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 상호교환적으로 사용된다. 바람직하게는, 단백질은 10개 이상의 아미노산, 바람직하게는 50개 이상의 아미노산, 100개 이상의 아미노산을 포함하며, 가장 바람직하게는 100개 이상의 아미노산을 포함한다.
용어 "핵산"은 단일-가닥 및 이중-가닥의 핵산과 리보핵산 뿐만 아니라 데옥시리보핵산을 포함한다. 핵산은 천연 뿐만 아니라 합성 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 예컨대 메틸화, 5'-캐핑(capping) 및/또는 3'-캐핑에 의해 자연적으로 또는 합성적으로 변형될 수 있다.
용어 "컨쥬게이트"는 특히 컨쥬게이트 내에서 각각의 화합물의 적어도 일부의 특성이 유지되도록 서로 연결된 2개 이상의 화합물을 의미한다. 연결은 공유 결합 또는 비-공유 결합에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 컨쥬게이트의 화합물들은 공유 결합을 통해 연결된다. 컨쥬게이트의 상이한 화합물들은 화합물의 원자간 하나 이상의 공유 결합을 통해 서로 직접적으로 결합될 수 있다. 대안적으로, 화합물들은 화합물의 원자에 공유 결합으로 부착되는 링커 분자를 통해 서로 결합될 수 있다. 만약 컨쥬게이트가 2개 이상의 화합물로 이루어진다면, 이러한 화합물들은 예를 들어 한 화합물이 다음 화합물에 부착된 사슬 형태로 연결될 수 있거나, 몇몇 화합물들이 각각 하나의 중심 화합물에 부착될 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 특히 그 내부로 도입된 코딩 핵산 서열의 발현을 가능하게 하고 조절할 수 있는 핵산 구조체를 의미한다. 발현 카세트는 프로모터, 리보좀 결합 부위, 인핸서 및 유전자의 전사 또는 mRNA의 번역을 조절하는 다른 조절 요소들을 포함할 수 있다. 발현 카세트의 정확한 구조는 종(species) 또는 세포 유형의 기능에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 TATA 박스, 캐핑 서열, CAAT 서열 등과 같이, 각각 전사 및 번역의 개시와 관련된 5'-비전사 서열과 5'- 및 3'-비번역 서열을 포함한다. 보다 구체적으로, 5'-비전사 발현 조절 서열은 작동 가능하게 연결된 핵산의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 카세트는 또한 인핸서 서열이나 업스트림 활성제 서열(upstream activator sequence)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "프로모터"는 발현될 핵산서열의 업스트림(5')에 위치하며 RNA-중합효소에 대한 인식 및 결합 부위를 제공함으로써 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. "프로모터"는 유전자의 전사 조절과 관련된 추가 인자에 대한 인식 및 결합 부위를 추가로 포함할 수 있다. 프로모터는 원핵생물 또는 진핵생물의 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 또한 프로모터는 "유도성(inducible)", 즉 유도제에 반응하여 전사를 개시할 수 있거나, 만약 전사가 유도제에 의해 조절되지 않는다면 "구성성(constitutive)"일 수 있다. 유도성 프로모터의 조절하에 있는 유전자는, 유도제가 없으면 발현되지 않거나 단지 적은 양으로 발현된다. 유도제의 존재 하에서 상기 유전자는 켜지거나(switched on) 전사 수준이 증가된다. 이는 보통 특정한 전사 인자의 결합에 의해 조정된다.
용어 "벡터"는 본원에서 가장 일반적인 의미로 사용되며, 핵산으로 하여금, 예를 들어 원핵생물 및/또는 진핵생물 세포 내로 도입되어 적절한 곳에서 게놈 내로 통합될 수 있도록 해주는, 핵산의 임의의 중간 운반체를 포함한다. 이러한 종류의 벡터는 바람직하게는 세포 내에서 복제되고/거나 발현된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 박테리오파지 또는 바이러스 게놈을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "플라스미드"는 일반적으로 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 염색체외(extrachromosomal) 유전 물질의 구조체, 보통 환형 DNA 이중가닥을 의미한다.
본 발명에 따르면, 용어 "숙주 세포"는 외인성 핵산으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있는 임의의 세포와 관련된 것이다. 본 발명에 따르면 용어 "숙주 세포"는 원핵생물(예컨대, E. coli) 또는 진핵생물 세포(예컨대 포유류 세포, 특히 인간 세포, 이스트 세포 및 곤충 세포)를 포함한다. 특히 바람직한 것은 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소 또는 영장류로부터 얻은 세포와 같은 포유류 세포이다. 세포는 다수의 조직 유형으로부터 유래될 수 있으며, 1차 세포 및 세포주를 포함한다. 핵산은 단일 카피 또는 2 이상의 카피의 형태로 숙주 세포 내에 존재할 수 있으며, 한 구체예에서, 숙주 세포 내에서 발현된다.
본 발명에 따르면 용어 "환자"는 인간, 비인간 영장류 또는 다른 동물, 특히 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이와 같은 포유류 또는 마우스 및 랫트와 같은 설치류를 의미한다. 특히 바람직한 구체예에서, 환자는 인간이다.
본 발명에 따르면 용어 "암"은 특히 백혈병, 정상피종, 흑색종, 기형종, 림프종, 신경아세포종, 신경교종, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 부신암, 갑상선암, 혈액암, 피부암, 뇌암, 자궁경부암, 장암(intestinal cancer), 간암, 결장암, 위암, 장암(intestine cancer), 두경부암, 위장관암, 림프절암, 식도암, 결장암, 췌장암, 이비인후과(ear, nose and throat, ENT)암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암, 그리고 이들의 전이를 포함한다. 이의 예들로는 폐암종, 유방암종, 전립선암종, 결장암종, 신장세포암종, 자궁경부암종, 또는 전술한 암 유형 또는 종양의 전이가 있다. 본 발명에 따르면 용어 암은 또한 암 전이를 포함한다.
"종양"은 잘못 조절된 세포성 증식에 의해 형성된 세포군 또는 조직군을 의미한다. 종양은 구조적 구성 및 정상 조직과의 기능적 협력의 부분적이거나 완전한 결핍을 나타낼 수 있으며, 보통 양성 또는 악성일 수 있는 뚜렷한 조직 덩어리를 형성한다.
"전이(metastasis)"는 암 세포 본래의 부위로부터 신체의 다른 부분으로의 암 세포의 확산을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며, 보통은 1차 종양으로부터 암 세포의 분리, 신체 순환(body circulation)으로의 진입 및 신체의 다른 곳의 정상 조직 내에서 성장하도록 자리를 잡는 것과 관련 있다. 종양 세포가 전이되었을 때, 새로운 종양은 2차 종양 또는 전이성 종양이라 불리며, 이들의 세포는 보통 본래의 종양 세포와 유사하다. 이는, 예를 들어 만약 유방암이 폐로 전이되면 2차 종양은 비정상 폐 세포가 아니라 비정상 유방 세포로 구성된다는 것을 의미한다. 그러면 상기 폐의 종양은 전이성 유방암으로 불리며, 폐암으로 불리지 않는다.
용어 "약학 조성물"은 특히 인간 또는 동물에 투여하기에 적합한 조성물, 즉, 약학적으로 허용가능한 성분을 함유하는 조성물을 의미한다. 바람직하게는, 약학 조성물은 활성 화합물 또는 이들의 염 또는 전구약물(prodrug)을 담체, 희석제, 또는 완충제, 방부제 및 등장화제(tonicity modifier)와 같은 약학적 부형제와 함께 포함한다.
본 발명은 중쇄 가변 영역(VH)에서 카밧 넘버링에 따른 아미노산 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하는 항-뮤신 항체가 좋은 항원 결합 특성을 나타낸다는 발견에 기초한 것이다. 중쇄 가변 영역의 아미노산 위치 28은 상보성 결정 영역 1(CDR1) 부근에 있는 제1 틀 영역(FR1)에 위치한다. 보통, 인간 항체에서는 트레오닌이나 세린 잔기가 이 위치에 위치한다. 예를 들어, NCBI 데이터베이스에 실린 항체들의 229개의 인간 생식세포계열(germ line) 서열들은 모두 중쇄 가변 영역의 위치 28에 트레오닌 또는 세린 잔기를 포함한다. 특히 단일클론 항체의 인간화에서, 일반적으로 중쇄 가변 영역의 위치 28에 트레오닌 또는 세린 잔기를 사용하는 것으로 당업계에 알려져 있다.
수득된 데이터에 근거하면, VH의 위치 28에서 프롤린은 CDR1의 구조적 특성에 이롭게 영향을 미치는 것으로 보인다. 특히, 상기 프롤린 잔기는 분명히 CDR1이 MUC1 항원 구조에 최적인 3차원 구조에 맞출 수 있도록 한다. 그렇게 함으로써 항체의 특성이 개선될 수 있다.
이러한 발견을 고려하여, 본 발명은 한 측면에서, 뮤신 단백질에 결합할 수 있고, 카밧 넘버링에 따른 아미노산 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체에 포함된 중쇄 가변 영역의 일부는 50개 이상의 아미노산, 바람직하게는 70개 이상의 아미노산, 90개 이상의 아미노산, 100개 이상의 아미노산 또는 110개 이상의 아미노산 길이를 갖는다. 더욱 바람직하게는, 상기 중쇄 가변 영역의 일부는 적어도 전체 틀 영역 1과 1개 이상의 CDR, 바람직하게는 2개 이상 또는 3개 전부의 CDR을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 카밧 넘버링에 따른 아미노산 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하는 완전한 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19 및/또는 MUC20과 같은 하나 이상의 뮤신 패밀리의 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 멤브레인-결합된 뮤신인 MUC1, MUC3A (이소폼 1), MUC3B 및 MUC4 중 하나 이상, 가장 바람직하게는 MUC1에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이들은 종양-관련 MUC1에는 특이적으로 결합하지만, 정상인 비-종양 세포의 MUC1에는 결합하지 않거나 훨씬 적은 양으로 결합한다. 특히, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는, 특히 만약 MUC1의 직렬반복(tandem repeat)이 트레오닌 잔기에서 N-아세틸 갈락토사민(Tn), 시알릴 α2-6 N-아세틸 갈락토사민(sTn), 갈락토오스 ß1-3 N-아세틸 갈락토사민(TF) 또는 갈락토오스 ß1-3(시알릴 α2-6) N-아세틸 갈락토사민(sTF)으로, 바람직하게는 Tn 또는 TF로 글리코실화 된다면, MUC1의 세포외 도메인, 바람직하게는 MUC1의 직렬반복에, 가장 바람직하게는 입체구조-의존적이고/거나 글리코실화-의존적 방식으로 결합한다.
특히 바람직한 본 발명에 따른 항-뮤신 항체는 펩타이드 모이어티(moiety)를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다. 상기 에피토프는 바람직하게는 글리코실화된 펩타이드 모이어티이며, 항체의 특이적인 결합은 바람직하게는 에피토프의 글리코실화에 의존적이고, 특히 에피토프의 특정한 글리코실화 패턴에 의존적이다. 즉, 바람직한 구체예에서, 상기 항체가 결합된 특이적인 에피토프가 탄수화물 모이어티를 갖는 경우, 탄수화물 모이어티를 갖지 않는 에피토프에 비해 항원에 대한 항체의 결합 친화도가 더욱 높다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 뮤신 단백질 상의 에피토프가 특정한 탄수화물 모이어티를 갖는 경우, 또 다른 탄수화물 모이어티를 갖거나 탄수화물 모이어티를 갖지 않는 에피토프에 비해 친화도가 더욱 높다. 이러한 경우에, 에피토프가 또 다른 탄수화물 모이어티를 갖는 항원에 대한 친화도는 비-글리코실화된 에피토프를 갖는 항원에 대한 친화도보다도 낮을 것이다. 이러한 구체예에서, 항체가 결합된 에피토프는 펩타이드 부분 뿐만 아니라 탄수화물 부분을 포함할 것이다. 즉, 상기 항체는 펩타이드 모이어티 및 탄수화물 모이어티에 결합한다.
하지만, 상기 항체는 대안적으로 오직 펩타이드 모이어티에만 결합할 수도 있다. 이러한 구체예에서, 펩타이드 에피토프에 부착된 탄수화물 모이어티에는 항체가 결합되지 않는다. 하지만, 그럼에도 불구하고 탄수화물 모이어티는 에피토프의 펩타이드 모이어티의 3차원 구조에 영향을 미친다는 점에서 항체 결합에 영향을 미칠 수 있다. 여기서, 에피토프의 유연성(flexibility)과 3차원 구조는, 탄수화물 모이어티가 에피토프에 결합되었는지 여부, 바람직하게는 어떤 탄수화물 모이어티가 에피토프에 결합되었는지에 의존한다. 그러한 경우 상기 항체는, 바람직하게는 탄수화물 모이어티가, 특히 특정한 탄수화물 모이어티가 에피토프에 결합되었을 때 취해지는 3차원 구조를 갖는 에피토프에 결합한다. 상기 구체예에서, 에피토프에 결합되었을 때 항체의 향상된 결합을 일으키는 특정한 탄수화물 모이어티는 바람직하게는 N-아세틸 갈락토사민(Tn), 시알릴 α2-6 N-아세틸 갈락토사민(sTn), 갈락토오스 ß1-3 N-아세틸 갈락토사민(TF) 또는 갈락토오스 ß1-3 (시알릴 α2-6) N-아세틸 갈락토사민(sTF)이고, 바람직하게는 Tn 또는 TF이다.
따라서, 추가의 구체예에서, 자신의 에피토프에 대한 항체의 특이적인 결합은 에피토프의 입체구조에 의존적이다. 전술한 바와 같이, 에피토프의 입체구조는 에피토프의 글리코실화 패턴에 의존적일 수 있다. 하지만, 입체구조는 또한 에피토프가 존재하는 상황, 예를 들면 에피토프를 포함하는 단백질의 전체적인 3차원 구조에 의존적일 수도 있다. 본질적으로, 에피토프에 대한 항체의 결합이 입체구조 의존적인 경우에, 에피토프는 상이한 3차원 입체구조를 취할 수 있으며, 에피토프의 하나 이상의 입체구조에 대한 항체의 결합 친화도는 에피토프의 다른 입체구조에 대한 결합 친화도보다 높다. 특히, 항체는 에피토프가 특정한 입체구조를 나타낼 때에만 에피토프에 결합할 수 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 항체는 아미노산 서열 PDTR (서열번호 49)이나, 더욱 바람직하게는 PDTRP (서열번호 50)를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 에피토프에 대한 결합은, 전술한 바와 같이, 바람직하게는 글리코실화 의존적이며, 특히 탄수화물 모이어티가 각각 서열 PDTR 또는 PDTRP의 트레오닌 잔기에 부착되면 결합이 증가된다. 바람직하게는, 만약 상기 에피토프가 트레오닌 잔기에서 N-아세틸 갈락토사민(Tn), 시알릴 α2-6 N-아세틸 갈락토사민(sTn), 갈락토오스 ß1-3 N-아세틸 갈락토사민(TF) 및 갈락토오스 ß1-3 (시알릴 α2-6) N-아세틸 갈락토사민(sTF)으로 이루어진 군에서 선택되는 탄수화물 모이어티, 바람직하게는 Tn 또는 TF로 글리코실화되면, 결합이 증가된다. 몇몇 구체예에서, 결합의 글리코실화 의존성은, 글리코실화 되었을 때, 특히 앞서 언급된 특정한 탄수화물 모이어티에 의해 글리코실화 되었을 때 에피토프가 취하는 특정한 입체구조 때문이다. 이러한 경우에 있어서, 항체는 탄수화물 모이어티에 필수적으로 결합할 필요는 없으나, 이렇게 결합의 친화도가 에피토프의 입체구조에 의존적인 에피토프의 펩타이드 모이어티에만 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 에피토프는 뮤신 단백질, 특히 MUC1의 세포외 직렬반복에 포함된다. 특히, 본 발명에 따른 항체는 종양-관련 뮤신 에피토프, 특히 에피토프 TA-MUC1과 같은 종양-관련 MUC1 에피토프 (Karsten, U. et al. (2004) Glycobiology 14, 681-692 및 Danielczyk, A. et al. (2006) Cancer Immunol. Immunother. 55, 1337-1347 참고)에 결합할 수 있다.
종양-관련 뮤신 에피토프, 특히 MUC1 종양 에피토프는, 바람직하게는 뮤신 단백질, 특히 MUC1의 에피토프를 의미하며, 종양 세포에는 존재하지만 정상 세포에는 존재하지 않고/거나, 정상 세포에 존재할 때가 아니라 종양 세포에 존재할 때 숙주의 순환(circulation)에서 오로지 항체에 의해서만 접근 가능하다. 특히, MUC1 종양 에피토프는 바람직하게는 하나 이상의 MUC1 직렬반복의 PDTRP 서열을 포함하고, PDTRP 서열의 트레오닌에서 N-아세틸 갈락토사민(Tn) 또는 갈락토오스 ß1-3 N-아세틸 갈락토사민(TF)으로 글리코실화된 에피토프이다. 종양 특이적인 MUC1 결합에 있어서, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는, 바람직하게는 동일한 길이 및 동일한 펩타이드 서열의 비-글리코실화된 펩타이드에 대한 결합에 비해 결합력이 2배 이상, 바람직하게는 4배 또는 10배 이상, 가장 바람직하게는 20배 이상 증가될 정도로 글리코실화된 MUC1 종양 에피토프에 특이적으로 결합한다. 결합력은, 예를 들어, 표적 에피토프가 고정화된 ELISA를 이용해 측정될 수 있으며, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 결합은 효소-결합된, 특히 페록시다아제-결합된 2차 항체 및 적합한 검출 시약을 이용해 검출된다. 예시적인 결합 측정법은 WO 2004/065423, 예를 들어 실시예 5.1에 설명되어 있다.
또한, 항체는 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 30의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 참조 항체 PankoMab의 항원 결합 특성과 유사한 항원 결합 특성을 나타낼 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 항체는 PankoMab와 동일한 항원, 바람직하게는 PankoMab와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있으며, 바람직하게는 비슷한 친화도로 상기 항원 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있다. 즉, 상기 항체는 바람직하게는 PankoMab의 해리상수보다 최대 100배 높은 해리상수, 더욱 바람직하게는 최대 10배 높은 해리상수, 가장 바람직하게는 PankoMab의 해리상수와 동일하거나 보다 낮은 해리상수를 갖는 친화도로 항원 또는 에피토프에 결합한다. 더욱이, 상기 항체는 바람직하게는 참조 항체 PankoMab와 교차 특이성을 나타낸다. 특히, 상기 항체가 충분히 고농도로 존재한다면 MUC1에 대한 PankoMab의 결합을 차단할 수 있다. 본 발명에 따른 항체가 이미 항원 MUC1에 결합된 경우 만약 MUC1에 대한 PankoMab의 결합이 방해된다면, 이것이 가능할 수 있다. PankoMab의 결합의 억제는, 예를 들어, 입체 장애(steric hindrance) 때문이거나, 즉 본 발명에 따른 항체가 PankoMab가 MUC1에 제대로 결합하기 위해 필요한 공간의 일부를 차지하거나, 또는 입체구조적 장애(conformational hindrance) 때문, 즉 본 발명에 따른 항체의 결합 때문에 PankoMab의 에피토프가 PankoMab의 결합에 적합하지 않은 입체구조를 취하기 때문일 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 상기 항체는 하기의 특징들을 가지며:
(a) 글리코실화된 MUC1 종양 에피토프에 특이적으로 결합하고,
(b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며;
또는 (a) 및 (b)의 특징을 갖는 항체의 기능성 단편 또는 유도체로서, 상기 기능성 단편 또는 유도체가 서열번호 16 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 교차 특이성(cross-specificity)을 나타내는 것이다.
본 발명에 따른 항체에 관한 전술한 구체예들 및 이들의 항원 및/또는 에피토프 결합 특성들은 본 발명에 따른 항체의 단편 또는 유도체에 동일한 방식으로 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 단일클론 항체이다. 또한, 상기 항체는 바람직하게는 인간, 뮤린(murine), 염소, 영장류 또는 낙타 항체이거나, 이들로부터 유래된 항체이다. 상기 항체는 키메라 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 상기 항체는 항체의 임의의 이소타입(isotype) 또는 서브클래스(subclass) 항체, 특히 IgG1와 같은 IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgD의 이소타입 또는 서브클래스 항체일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체의 단편 또는 유도체는 Fab 단편, F(ab)2 단편, Fd 단편, Fv 단편, scFv 단편, (Fv)2 단편 및 멀티바디로 이루어진 군에서 선택된다. 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 하나의 아미노산 분자만을 포함하는 단일 사슬 구조체이거나, 바람직하게는 서로 공유 결합으로 결합된, 예컨대 이황화 결합에 의해 결합된, 하나 이상의 아미노산 분자를 포함하는 다중 사슬 구조체일 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는, 여기에 포함된 중쇄 가변 영역(VH)이 남아있는 VH의 전부 또는 일부를 함유하기보다는 상이한 항체로부터 유래된 하나 이상의 CDR을 함유하도록 유전자 조작된다. 예를 들어, VH는 하나의 항체로부터 유래된, 예를 들어 마우스, 낙타, 염소 또는 영장류 항체로부터 유래된 1개 이상의 CDR, 바람직하게는 2개 또는 3개의 CDR을 포함하고, 다른 항체 또는 항체군으로부터 유래된, 바람직하게는 다른 종의 항체, 특히 인간 항체로부터 유래된 1개 이상의 FR, 바람직하게는 2개, 3개 또는 4개의 FR을 포함한다. 이러한 구체예에서, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 경쇄 가변 영역(VL)을 추가로 포함할 수 있다. 특히 VL은, 1개, 2개, 3개 또는 바람직하게는 4개 전부의 FR이 동일한 종으로부터, 특히 VH의 하나 이상의 FR과 동일한 항체 또는 항체군으로부터 유래됨과 동시에, VH의 하나 이상의 CDR이 유래된 항체로부터 유래될 수 있거나, VL의 1개, 2개 또는 3개의 CDR이 VH의 하나 이상의 CDR과 동일한 항체로부터 유래된 것인 구조체일 수 있다. 게다가, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 바람직하게는 가변 영역의 FR과 동일한 종, 특히 동일한 항체 또는 항체군으로부터 유래된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 중쇄 불변 영역(CH) 및/또는 1개의 경쇄 불변 영역(CL)을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 가변 영역과 불변 영역의 FR은 하나의 특정한 항체로부터 유래되지는 않지만, 특정한 항체군, 예를 들어 인간 항체군으로부터 유래된 공통서열(consensus sequence)이나 다른 바람직한 서열을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 키메라이며, 하나의 항체로부터 유래된 하나 이상의 중쇄 가변 영역 및 임의적으로 경쇄 가변 영역을 포함하고, 또 다른 항체로부터 유래된 하나 이상의 중쇄 불변 영역 및 임의적으로 경쇄 불변 영역을 포함한다. 바람직하게는 2개의 상이한 항체들은, 예를 들어 가변 영역이 뮤린 항체로부터 유래하는 반면 불변 영역은 인간 항체로부터 유래하는 것과 같이, 상이한 종의 항체들이다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 바람직하게는 글리코실화된 것이다. 바람직한 구체예에서, 이들은 인간 글리코실화 패턴을 가지며, 이는 인간의 신체에 의해 생산된 천연 항체에서도 발견되는 글리코실화 패턴이다. 또한 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 바람직하게는 이들의 하나 이상의 활성을 조절하는, 특히 향상시키는 글리코실화 패턴을 포함한다. 예를 들어, 글리코실화 패턴은 자신의 특이적인 에피토프에 대한 항체, 단편 또는 유도체의 친화도 및/또는 Fc 수용체, 특히 Fc 감마, Fc 알파 또는 Fc 엡실론 수용체와 같은 다운스트림 수용체에 대한 친화도를 향상시킬 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 글리코실화 패턴은 보체 의존성 세포독성 (complement dependent cytotoxicity, CDC) 및/또는 항체 의존성 세포매개 세포독성 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)을 향상시킬 수 있다. 이를 위하여, 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 글리코실화 패턴은, 예를 들면 원하는 글리코실화 패턴을 생산할 수 있는 특정 세포주를 이용함으로써 유전자 조작되거나 최적화될 수 있다. 그러한 세포주들은, 예를 들면 K562, KG1, MUTZ-3, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-H9D8 [DSM ACC 2806], NM-H9D8-E6 [DSM ACC 2807], NM H9D8-E6Q12 [DSM ACC 2856] 및 GT-2X [DSM ACC 2858]이다. 따라서, 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 바람직하게는 이러한 세포주들 중 하나에서 발현되어 제공되는 글리코실화 패턴을 갖는다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 바람직하게는 의약에 유용하며, 특히 질환, 특히 본원에 기술된 질환, 바람직하게는 암의 치료, 진단, 예후 및/또는 모니터링에 유용하다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체에 포함된 중쇄 가변 영역은 바람직하게는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR3으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 CDR을 포함하며, 바람직하게는 적어도 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1을 포함한다. 특히, 상기 중쇄 가변 영역은 CDR1이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고 CDR2가 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지며 CDR3이 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR 세트를 포함하거나, CDR1이 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖고 CDR2가 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지며 CDR3이 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR 세트를 포함할 수 있다.
한 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 바람직하게는 서열번호 7, 특히 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 FR1, 서열번호 9, 특히 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 FR2, 서열번호 11, 특히 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 FR3 및 서열번호 13, 특히 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 FR4로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 틀 영역을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 FR1의 존재가 특히 바람직하다. 따라서 상기 중쇄 가변 영역은 바람직하게는 서열번호 15, 특히 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다.
추가적인 구체예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 전술한 하나 이상의 분절(segment) 또는 서열을 포함하는 항체로부터 유래된다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 서열번호 17 또는 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 19 또는 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 21 또는 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR3으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 추가적인 상보성 결정 영역을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 하나 이상의 추가적인 상보성 결정 영역은 바람직하게는 경쇄 가변 영역 내에 존재한다. 특히, 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 바람직하게는 중쇄 가변 영역의 CDR이 서열번호 1, 3 및 5의 아미노산 서열을 갖고 경쇄 가변 영역의 CDR이 서열번호 17, 19 및 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR 세트를 포함하거나, 중쇄 가변 영역의 CDR이 서열번호 2, 4 및 6의 아미노산 서열을 갖고 경쇄 가변 영역의 CDR이 서열번호 18, 20 및 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR 세트를 포함한다. 상기 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 서열번호 27, 특히 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하거나, 이의 기능성 변이체 또는 유도체를 포함한다.
한 구체예에 따르면, 상기 항체는 하기의 항체 틀 영역을 포함한다:
(i) 중쇄 가변 영역 VH의 FRH1, FRH2, FRH3 및 FRH4는 하기의 아미노산 서열과 카밧의 명수법에 상응하는 아미노산 위치를 갖고:
FRH1 (서열번호 7)
Figure pct00001
FRH2 (서열번호 9)
Figure pct00002
FRH3 (서열번호 11)
Figure pct00003
FRH4 (서열번호 13)
Figure pct00004
(ii) 임의적으로 경쇄 가변 영역 VL의 FRL1, FRL2, FRL3 및 FRL4는 하기의 아미노산 서열과 카밧의 명수법에 상응하는 아미노산 위치를 갖는다:
FRL1 (서열번호 23)
Figure pct00005
FRL2 (서열번호 24)
Figure pct00006
FRL3 (서열번호 25)
Figure pct00007
FRL4 (서열번호 26)
Figure pct00008

특정한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 선천적으로 중쇄 가변 영역의 카밧 넘버링에 따른 아미노산 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하지 않는 항체로부터 유래된다. 특히, 카밧 넘버링에 따른 아미노산 위치 28을 포함하는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 중쇄 가변 영역의 FR1은, VH의 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하지 않는 항체로부터 유래된다. 또한, 하나 이상의 남은 FR 및/또는 VH의 1개, 2개 또는 3개의 CDR, 특히 CDR1 역시, 바람직하게는 VH의 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하지 않는 항체로부터 유래된다. 그 후 VH의 위치 28의 아미노산은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 수득하기 위하여 프롤린 잔기로 대체된다.
특이적인 항원에 대한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 친화도는, 바람직하게는 적어도 이들이 유래한 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 친화도 만큼, 특히 중쇄 가변 영역의 카밧 넘버링에 따른 아미노산 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하지 않는다는 점을 제외하고는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체와 동일한 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 친화도 만큼 높다. 즉, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 바람직하게는 상기 다른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 해리상수와 동일하거나 이보다 낮은, 바람직하게는 2배 이상 낮은, 3배 이상 낮은, 5배 이상 낮은 해리상수, 또는 더욱 바람직하게는 10배 이상 낮은 해리상수를 갖는 친화도로 항원 또는 에피토프에 결합한다.
한 특정한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 PankoMab(서열번호 29의 중쇄 가변 영역, 서열번호 30의 경쇄 가변 영역)로부터 유래된다. PankoMab는 MUC1의 직렬반복 내의 글리코실화된 세포외 에피토프에 대한 뮤린 단일클론 항체이다 (Danielczyk, A. et al. (2006) Cancer Immunol. Immunother. 55, 1337-1347).
또한 본 발명에 따른 항체는 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 및 임의적으로 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄를 포함할 수 있거나, 이의 단편 또는 유도체이다. 바람직하게는, 상기 항체는 각각 서열번호 31 및 32의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄의 세트를 포함한다. 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 또한 단일 사슬 Fv 단편일 수 있다.
특정한 구체예에서, 본 발명에 따른 유전자 조작된 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 추가의 물질과 결합되어 컨쥬게이트를 형성한다. 상기 추가의 물질은 바람직하게는 질환, 특히 암의 치료, 진단, 예후 및/또는 모니터링에 유용하다. 예를 들어, 상기 추가의 물질은 항체 또는 항체의 단편, 특히 상이한 종 및/또는 상이한 특이성의 항체 또는 항체의 단편, 효소, 상호작용 도메인, 안정화 도메인, 신호 서열, 검출 표지, 형광 염료, 독소, 촉매 항체, 세포용해 성분, 면역조절물질, 면역효과기(immunoeffector), MHC 클래스 I 또는 클래스 II 항원, 방사능 표지를 위한 킬레이터, 방사성 동위원소, 리포좀, 트랜스멤브레인 도메인, 바이러스 및 세포로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 상기 추가의 물질은 공유 결합으로, 특히 융합 또는 화학적 커플링에 의한 공유 결합으로, 또는 비-공유 결합으로 항체 또는 이의 단편 또는 유도체에 부착될 수 있다. 특히 바람직한 추가의 물질은 암 세포를 사멸시킬 수 있는 물질이다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명에 따른 핵산의 핵산 서열은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하기에 적합한 임의의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 하지만, 바람직하게는 상기 핵산 서열은 본 발명에 따른 핵산이 발현되는 숙주 세포 또는 개체의 특이적인 코돈 선호도(codon usage)에 맞게 부분적으로 또는 전체적으로 조정된다. 본 발명에 따른 핵산은 이중-가닥 또는 단일-가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있고, 바람직하게는 cDNA 같은 이중-가닥 DNA이거나 mRNA 같은 단일-가닥 RNA일 수 있다. 상기 핵산은 하나의 연속된 핵산 분자이거나, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 상이한 부분을 각각 코딩하는 몇몇 핵산 분자들로 이루어질 수 있다.
만약 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체가 단일 사슬 구조체라면, 본 발명에 따른 핵산은 바람직하게는 전체 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 코딩하는 코딩 영역을 함유하는 단일 핵산 분자이다. 만약 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체가 하나 이상의 아미노산 사슬로 이루어진다면, 본 발명에 따른 핵산은, 예를 들어, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 아미노산 사슬들 중 하나를 각각 코딩하는 몇몇 코딩 영역, 바람직하게는 분리된 아미노산 사슬을 생성하기 위하여 IRES 요소 같은 조절 요소(regulatory element)에 의해 분리된 몇몇 코딩 영역을 함유하는 단일 핵산 분자이거나, 본 발명에 따른 핵산은 각각의 핵산 분자가 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 아미노산 사슬들 중 하나를 각각 코딩하는 하나 이상의 코딩 영역을 포함하는 몇몇 핵산 분자들로 이루어질 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 코딩 영역 외에도 본 발명에 따른 핵산은, 예를 들어 다른 단백질을 코딩하거나, 상기 코딩 영역의 전사 및/또는 번역에 영향을 미치거나, 상기 핵산의 안정성 또는 다른 물리적 또는 화학적 특성에 영향을 미치거나, 아무런 기능도 갖지 않을 수 있는 추가의 핵산 서열이나 다른 변형들을 포함할 수도 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 및 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터를 제공한다. 또한 상기 발현 카세트 또는 벡터는 추가의 요소들, 특히 본 발명에 따른 핵산의 전사 및/또는 번역, 상기 발현 카세트 또는 벡터의 증폭 및/또는 복제, 상기 발현 카세트 또는 벡터의 숙주 세포의 게놈 내로의 통합, 및/또는 숙주 세포 내에서 상기 발현 카세트 또는 벡터의 카피수에 영향을 미치고/거나 이를 조절할 수 있는 요소들을 포함할 수 있다. 적합한 발현 카세트와 항체를 발현시키기 위한 각각의 발현 카세트를 포함하는 벡터는 당업계에 잘 알려져 있으며, 따라서 본원에서 추가로 기술할 필요가 없다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에 따른 숙주 세포는 임의의 숙주 세포일 수 있다. 상기 숙주 세포는 분리된 세포 또는 조직 내에 포함된 세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 배양된 세포, 특히 1차 세포 또는 확립된 세포주의 세포이며, 바람직하게는 종양-유래 세포이다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 E. coli와 같은 박테리아 세포이거나, 사카로미세스(Saccharomyces) 세포, 특히 사카로미세스 세레비시아(S. cerevisiae)와 같은 이스트 세포이거나, Sf9 세포와 같은 곤충 세포이거나, 포유류 세포이며, 특히 종양-유래 인간 세포와 같은 인간 세포, CHO와 같은 햄스터 세포 또는 영장류 세포이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 인간 골수성 백혈병 세포로부터 유래된다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 다음의 세포 또는 세포주: K562, KG1, MUTZ-3, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605] 또는 이들로부터 유래된 세포 또는 세포주로부터 선택되거나, 하나 이상의 전술한 세포들을 포함하는 세포 또는 세포주의 혼합물이다. 상기 숙주 세포는 바람직하게는 NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-H9D8 [DSM ACC 2806], NM-H9D8-E6 [DSM ACC 2807], NM H9D8-E6Q12 [DSM ACC 2856], GT-2X [DSM ACC 2858] 및 임의의 상기 숙주 세포들로부터 유래된 세포 또는 세포주로 이루어진 군에서 선택되거나, 하나 이상의 전술한 세포들을 포함하는 세포 또는 세포주의 혼합물이다. 이러한 세포주들은 DSMZ - 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨트렌 게엠베하, 마쉐로더 베크 1베 / 인호펜슈트라세 7베, 38124 브라운쉬바이크 (DE)에, 상기에 표시된 수탁번호로 기탁되었다. 바람직한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 특정한 글리코실화 패턴을 갖는 당단백질, 특히 항체의 발현에 최적화된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산의 코딩 영역에서 코돈 선호도 및/또는 프로모터 및 발현 카세트 또는 벡터의 추가 요소는 사용된 숙주 세포의 유형에 적합하며, 더욱 바람직하게는 최적화된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 전술한 숙주 세포 또는 세포주에 의해 생산된다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 벡터, 또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 또한 하나 이상의 이러한 성분들을 함유할 수 있다. 또한 상기 조성물은 용매, 희석제 및 부형제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 추가의 성분을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 조성물은 약학 조성물이다. 이러한 구체예에서, 상기 조성물의 성분은 바람직하게는 모두 약학적으로 허용가능하다. 상기 조성물은 고체 또는 액체 조성물일 수 있으며, 특히 - 바람직하게는 수용액 - 용액, 에멀젼 또는 현탁액 또는 동결건조 분말일 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포, 또는 본 발명에 따른 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 의약에의 사용은 질환, 예컨대 암, 바이러스 및 박테리아 감염과 같은 감염증, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 염증성 질환, 황반변성, 이식거부 및 다발성 경화증과 같은 질환의 치료, 예후, 진단 및/또는 모니터링에의 사용이다. 바람직한 구체예에서, 상기 질환은 암이다. 바람직하게는 상기 암은 결장암, 위암, 간암, 췌장암, 신장암, 혈액암, 폐암 및 난소암 뿐만 아니라 이들로부터 유래된 전이암으로 이루어진 군에서 선택되는 암이다.
암과 같은 비정상적인 세포 성장과 관련된 질환의 치료에 사용하기 위하여, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 전술한 추가의 물질과 결합될 수 있으며, 여기서 상기 추가의 물질은 바람직하게는 방사성핵종(radionuclide) 또는 세포독소와 같은 세포독성 물질이다. 또한, 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 환자의 면역 반응을 활성화시키는 능력, 특히 ADCC (항체 의존성 세포매개 세포독성) 및/또는 CDC (보체 의존성 세포독성)를 활성화시키는 능력을 향상시키기 위하여 유전자 조작될 수 있다. 예를 들어, 이는 항체의 아미노산 서열 및/또는 항체의 글리코실화 패턴, 특히 항체의 불변 영역의 글리코실화 패턴을 최적화시킴으로써 달성될 수 있다.
질환의 진단, 예후 및/또는 모니터링에 있어서 검출 물질로서 사용하기 위하여, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 바람직하게는 검출 가능한 신호를 생산할 수 있는 표지 물질과 결합된다. 특히, 상기 표지 물질은 방사성핵종, 형광단(fluorophore) 또는 효소일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역의 카밧 넘버링에 따른 위치 28에 프롤린 잔기를 제공하는 단계를 포함하는, 뮤신 단백질에 결합할 수 있고 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 항원 결합 및/또는 항원 인식을 개선시키는 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 상기 위치 28의 프롤린 잔기는 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산의 서열을 변경함으로써 수득된다. 특히, 상기 핵산 서열은 상기 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈 내에 돌연변이를 도입함으로써 변경된다. 프롤린 잔기를 코딩하는 코돈을 수득하기 위하여, 대체될 아미노산 잔기에 따라, 상기 코돈의 단지 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드 또는 3개의 뉴클레오티드 전부가 대체된다. 보편적 유전자 코드(universal genetic code)에 따라, 코돈 CCA, CCG, CCC, CCU 및 CCT는 아미노산 프롤린을 인코딩한다. 따라서, 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 코딩하는 상기 핵산은, VH의 아미노산 번호 28을 인코딩하는 코돈이 CCA, CCG, CCC, CCU 및 CCT로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열을 갖는 방식으로 변경되어야 하며, 특히 돌연변이 되어야 한다. VH의 위치 28의 아미노산이 프롤린 잔기에 의해 대체된 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 그 후 상기 변경된 핵산을 적합한 발현 시스템 내에서 발현시킴으로써 수득된다.
상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 코딩하는 핵산 내에서 VH의 아미노산 잔기 28의 코돈은 프롤린을 코딩하는 코돈을 수득하기 위하여 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 변경될 수 있다. 특히, 특이적 돌연변이(specific mutation) 또는 무작위 돌연변이(random mutation)뿐만 아니라 친화력 성숙(affinity maturation)과 같은 유도 돌연변이(directed mutation)에 의해 변경될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하고 유도 돌연변이를 전달하는 핵산의 일부와 상호보완적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 상기 핵산의 증폭 반응, 특히 PCR-기반 증폭 반응에 사용될 수 있다.
하지만, 단백질에 프롤린 잔기를 제공하는 임의의 다른 공지된 방법도 사용될 수 있다. 특히, 변경된 아미노산 서열을 갖는 단백질의 화학적 합성이나 단백질의 화학적 변형이 사용될 수 있다.
VH의 위치 28에 프롤린 잔기를 제공함으로써, 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 항원 결합 및/또는 항원 인식 특성이 개선된다. 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 항원 결합 및/또는 항원 인식을 개선시키는 것은 특히 자신의 항원에 대한 친화도를 향상시키고/거나 자신의 항원에 대한 특이성을 증가시키는 것을 포함한다. 특히, 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는, VH의 위치 28에 프롤린 잔기를 제공한 후에, VH의 아미노산 위치 28에 프롤린 잔기를 갖지 않는 동일한 항체 또는 이의 단편 또는 유도체에 비해 개선된 항원 결합 및/또는 항원 인식 특성을 갖는다.
이런 점에서 친화도를 향상시키는 것은 바람직하게는 자신의 특이적인 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합 해리상수를 낮추는 것을 의미한다. 바람직하게는, 해리상수가 1.2배 이상, 더욱 바람직하게는 1.3배 이상, 1.5배 이상, 1.7배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 가장 바람직하게는 50배 이상 또는 100배 이상 낮아진다. 이런 점에서 특이성을 증가시키는 것은, 바람직하게는 흔히 특이적인 항원 또는 에피토프와 함께 존재하는 임의의 다른 분자에 대한 친화도와 대비되는 자신의 특이적인 항원 또는 에피토프에 대한 항원의 친화도의 차이의 증가를 의미한다. 바람직하게는, 이러한 두 친화도의 해리상수의 차이는 1.2배 이상, 더욱 바람직하게는 1.3배 이상, 1.5배 이상, 1.7배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 가장 바람직하게는 50배 이상 또는 100배 이상 증가된다.
상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체에 의해 인식되는 뮤신 항원은 바람직하게는 종양-관련 항원, 즉 종양 조직을 정상 조직과 구별하는데 사용되고/거나 종양 조직을 특이적으로 타겟팅하는 치료제에 대한 마커로서 사용될 수 있는 항원이다. VH의 위치 28에 프롤린 잔기를 제공함으로써, 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 의약에 있어서의 유용성이, 예컨대 종양 조직과 정상 조직을 구별하는 능력을 향상시키고/거나 원하는 약효를 얻기 위해 필요한 항체 또는 항체-함유 컨쥬게이트의 농도를 낮춤으로써 바람직하게 개선될 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 항원 결합 및/또는 항원 인식이 개선될 수 있는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 하나 이상의 중쇄 가변 영역의 카밧 넘버링에 따른 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하지 않을 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체에 관하여 전술한 구체예나 특징들은, 단독으로 또는 다양한 가능한 조합으로, 본 발명에 따른 방법에 의해 항원 결합 및/또는 항원 인식이 개선될 수 있는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체에도 적용된다. 특히, 항원 결합 및/또는 항원 인식이 개선될 수 있는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 전술한 임의의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열들의 조합을 포함할 수 있으나, 여기서 하나 이상의 중쇄 가변 영역의 카밧 넘버링에 따른 위치 28의 아미노산 잔기는 다름 아닌 프롤린 아미노산 잔기이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에 의해 항원 결합 및/또는 항원 인식이 개선될 수 있는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 MUC1에, 특히 MUC1의 세포외 직렬반복 상의 에피토프에, 바람직하게는 입체구조-의존적 및/또는 글리코실화-의존적인 방식으로, 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 에피토프 또는 항원의 특정한 구체예들은 본 발명에 따른 항원 또는 단편 또는 유도체에 관하여 상기에 기술되어 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 방법에 의해 항원 결합 및/또는 항원 인식이 개선될 수 있는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 중쇄 가변 영역은 다음을 포함한다:
(i) 서열번호 1을 갖는 CDR1, 서열번호 3을 갖는 CDR2 및 서열번호 5를 갖는 CDR3으로 이루어진 군 중에서 하나 이상의 CDR, 바람직하게는 상기 CDR 전부, 또는 서열번호 2를 갖는 CDR1, 서열번호 4를 갖는 CDR2 및 서열번호 6을 갖는 CDR3으로 이루어진 군 중에서 하나 이상의 CDR, 바람직하게는 상기 CDR 전부, 특히 바람직하게는 적어도 서열번호 1을 갖는 CDR1; 및/또는
(ii) 서열번호 33 또는 34를 갖는 FR1, 서열번호 9 또는 35를 갖는 FR2, 서열번호 11 또는 36을 갖는 FR3, 서열번호 13 또는 37를 갖는 FR4로 이루어진 군 중에서 하나 이상의 FR, 바람직하게는 상기 FR 전부, 특히 바람직하게는 적어도 서열번호 33을 갖는 FR1.
바람직하게는, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 38 또는 29의 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 상기 항원 결합 및/또는 항원 인식이 개선될 수 있는 항체는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 및/또는 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 경쇄를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 각각 서열번호 39 및 32의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 중쇄 및 경쇄의 쌍을 포함하거나, 이들의 기능성 단편 또는 유도체이다. 대안적으로, 단일 사슬 Fv 단편이 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, PankoMab 또는 이로부터 유래된 항체 또는 단편, 또는 PankoMab와 교차 특이성을 나타내는 이들의 항체 또는 단편이 본 발명에 따른 방법에 사용된다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 항원 결합 및/또는 인식을 개선시키는 방법에 의해 수득되거나 제조될 수 있다.
또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 핵산의 제조 방법을 제공한다:
(a) 중쇄 가변 영역의 카밧 넘버링에 따른 아미노산 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하지 않는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하는 단계; 및
(b) 중쇄 가변 영역의 카밧 넘버링에 따른 아미노산 번호 28을 코딩하는 코돈이 프롤린 잔기를 코딩하도록 상기 코돈에 돌연변이를 도입하는 단계.
상기 돌연변이는 이러한 목적에 적절한 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다. 다양한 적합한 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 상기 돌연변이는, 예컨대 PCR-기반의 방법에서 상기 돌연변이를 전달하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여, 초기 핵산의 무작위 돌연변이 또는 유도 돌연변이에 의해 도입될 수 있다. 대안적으로, 상기 돌연변이를 함유하는 핵산 또는 이의 일부는 화학적으로 합성되어 적절한 곳에서 핵산의 남은 부분에 연결될(ligated) 수 있다.
또한 본 발명에 따른 유전자 조작된 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 제조 방법은 상기 본 발명에 따른 핵산의 제조 방법을 기반으로 할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 유전자 조작된 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 제조 방법은 본 발명에 따른 핵산의 제조 방법의 (a) 및 (b) 단계를 포함하며, 단계 (b)에서 수득된 핵산을 발현 시스템 내에서 발현시킴으로써 상기 핵산에 의해 인코딩된 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
적절한 발현 시스템은 무세포(cell-free) 발현 시스템 또는 전술한 숙주 세포에 기반한 발현 시스템일 수 있다. 특히, 포유류 숙주 세포의 사용이 바람직하며, 특히 인간 숙주 세포, 바람직하게는 전술한 바와 같은 숙주 세포의 사용이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 발현시키는데 사용되는 숙주 세포는 숙주 세포에 의해 발현된 항체의 글리코실화 패턴에 대하여 최적화된다.
본 발명의 다른 측면들에 대하여, 특히 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 카세트, 벡터 또는 숙주 세포, 또는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 항원 결합 및/또는 인식을 개선시키는 방법에 대하여 기술된 특징들은, 단독으로 또는 조합으로, 본 발명에 따른 핵산의 제조방법에도 적용될 수 있다.
실시예
실시예 1: PankoMab 뮤린 중쇄 경쇄 가변 영역의 인간화
PankoMab은 인간 MUC1의 세포외 직렬반복 내의 글리코실화된, 종양-관련 에피토프에 대한 단일클론 항체이다. 뮤린 항체 PankoMab (Danielczyk, A. et al. (2006) Cancer Immunol. Immunother. 55, 1337-1347)의 준비 후, 중쇄 및 경쇄 가변 영역(VH 및 VL)을 코딩하는 핵산 서열을 각각 인간 불변 γ1 영역(CH) 및 인간 불변 κ 영역(CL)의 게놈 서열에 연결시켰다. 이러한 클로닝 방법의 상세한 설명을 위하여 WO 2004/065423 A2, 특히 실시예 3을 참조한다.
이러한 키메라 클론(중쇄: 서열번호 40, 경쇄: 서열번호 41)을 기반으로 인간화된 PankoMab 항체를 제작하였다. 이를 위하여, 상응하는 인간 틀 영역을 생성하기 위해 점 돌연변이를 VH 및 VL의 뮤린 틀 영역의 핵산 서열 내로 도입시켰다. 상기 표적 인간 틀 영역은 인간 생식세포계열 항체 라이브러리로부터 선택하였다. 특히, 이들의 전체적인 서열 유사성과 CDR 루프 분류에 따라 상기 라이브러리로부터 가장 관련 있는 틀 영역을 선택하였다. 그리고나서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 인간 공통서열을 이상 아미노산(unusual amino acid)을 찾는데 사용하였다. 수득된 모든 데이터는 인간화된 가변 경쇄 (10 변이체) 및 가변 중쇄 (15 변이체)의 상이한 가변 서열 세트를 디자인하는데 고려하였다. 상기 변이체들은 중요 위치(critical position) 상의 뮤린 서열로의 역돌연변이(back-mutation) 및/또는 인간 틀 영역의 특정한 위치에서의 상당히 흔치 않은 아미노산인 희귀 아미노산(rare amino acid)의 대응되는 아미노산으로의 돌연변이를 함유한다. 상기 상이한 구조체들의 발현 후에, 인간화된 항체 변이체들을 256.1-특이적인 ELISA로 스크리닝 하였고, 가장 우수한 결합체(binder)들을 선발하였다.
전술한 방법에 의해, 하기의 인간화된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 수득하였고 추가로 특징을 나타내었다.
Figure pct00009
mVH 및 mVL은 각각 뮤린의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 나타내며, 인간화의 기준으로 사용되었다.
실시예 2: 글리코실화된 에피토프 및 비- 글리코실화된 에피토프에 대한 인간화된 PankoMab 변이체의 친화도
이러한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 상이한 조합으로 포함하는 IgG 항체를 이용하여, PankoMab의 에피토프를 함유하는 30-머 폴리펩타이드(펩타이드 258.1: APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA, 서열번호 51)를 가지고 2가지 결합 측정법을 수행하였다. 하나의 측정법에서는 상기 펩타이드를 중심 트레오닌에서 N-아세틸 갈락토사민으로 글리코실화시킨 반면(펩타이드 256.1: APPAHGVTSAPDT[GalNAcα]RPAPGSTAPPAHGVTSA), 다른 하나의 측정법에서는 상기 펩타이드를 비-글리코실화시켰다. 또한 2, 4 또는 5 직렬반복을 함유하는 다수의 TN-글리코실화된 MUC1 직렬반복들(TR2, TR4 및 TR5: 각각 서열번호 52, 53 및 54)을 가지고 결합 측정법을 수행하였다.
이러한 측정법의 결과는 도 1 및 도 2에 나타나 있다. 이러한 측정법을 이용하여, 위치 28에 이상(unusual) 프롤린 잔기를 갖는 중쇄 가변 영역 VH16m을 함유하는 항체가 중쇄 가변 영역의 위치 28에 프롤린 잔기를 갖지 않는 경우보다 글리코실화된 에피토프-함유 폴리펩타이드에 대하여 더 높은 친화도를 갖는다는 것을 입증할 수도 있다.
하나는 프롤린이고(중쇄 가변 영역 VH16m, 경쇄 가변 영역 VL6.1) 하나는 트레오닌(중쇄 가변 영역 VH16, 경쇄 가변 영역 VL6.1)인, 중쇄 가변 영역의 위치 28에서의 아미노산 잔기만 다른 2개의 인간화된 항-MUC1 항체의 직접적인 비교는, 이러한 아미노산 교환이 글리코실화된 에피토프-함유 표적 펩타이드 256.1에 대한 개선된 결합에 책임이 있음을 입증해 준다 (도 3 참고).
기탁된 생물학적 물질의 동정
세포주 DSM ACC 2606 및 DSM ACC 2605는, 네모드 바이오테라퓨틱스 게엠베하 앤 코. 카게 (Nemod Biotherapeutics GmbH & Co. KG), 로베르트-뢰슬레 슈트라쎄 10, 13125 베를린 (DE) 에 의해, DSMZ - 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨트렌 게엠베하, 마쉐로더 베크 1베, 38124 브라운쉬바이크 (DE) 에 기탁되었다. 이러한 생물학적 물질은 그동안 네모드 바이오테라퓨틱스 게엠베하 앤 코. 카게로부터 글리코토페 게엠베하(Glycotope GmbH)에 양도되었기 때문에, 글리코토페는 이러한 생물학적 물질에 관한 자격이 있다.
세포주 DSM ACC 2806, DSM ACC 2807, DSM ACC 2856 및 DSM ACC 2858은 글리코토페 게엠베하, 로베르트-뢰슬레 슈트라쎄 10, 13125 베를린 (DE)에 의해, DSMZ - 도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨트렌 게엠베하, 인호펜슈트라세 7베, 38124 브라운쉬바이크 (DE)에 기탁되었다.
Figure pct00010
Figure pct00011
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유럽의 경우, 이에 따라 출원인은 수탁된 생물학적 물질의 샘플이 특허 결정 언급의 공개시까지 또는 출원이 거절되거나 취하되거나 취하된 것으로 간주되는 경우 출원일로부터 20년 동안 Rule 33(1)(2) EPC에 제공된 대로, 샘플을 요청하는 사람에 의해 지명된 전문가에게만 (Rule 32 EPC) 샘플을 공급함으로써 이용될 수 있도록 요청한다.
Figure pct00012
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Figure pct00020
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Figure pct00022

독일미생물보존센터(DSMZ) DSMACC-2606 20030814 독일미생물보존센터(DSMZ) DSMACC-2605 20030814 독일미생물보존센터(DSMZ) DSMACC-2806 20060915 독일미생물보존센터(DSMZ) DSMACC-2807 20061005 독일미생물보존센터(DSMZ) DSMACC-2856 20070808 독일미생물보존센터(DSMZ) DSMACC-2858 20070907
SEQUENCE LISTING <110> Glycotope GmbH <120> MUC1 Antibodies <130> 51 878 K <150> EP 09 009 952.5 <151> 2009-07-31 <150> US 61/230,211 <151> 2009-07-31 <160> 54 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H1 <400> 1 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H1 <400> 2 Asp Ala Trp Met Asp 1 5 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H2 <400> 3 Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H2 <400> 4 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H3 <400> 5 His Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR H3 <400> 6 Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr 1 5 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FR H1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa 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Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable region <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable region <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable region <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain variable region <400> 46 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala <210> 47 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain variable region <400> 47 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala <210> 48 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> light chain variable region <400> 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala <210> 49 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> epitope <400> 49 Pro Asp Thr Arg 1 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> epitope <400> 50 Pro Asp Thr Arg Pro 1 5 <210> 51 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> target peptide <400> 51 Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala 1 5 10 15 Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala 20 25 30 <210> 52 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> target peptide <220> <221> CARBOHYD <222> (10)..(10) <223> GalNAc alpha <220> <221> CARBOHYD <222> (30)..(30) <223> GalNAc alpha <400> 52 Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser 1 5 10 15 Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr 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Claims (15)

  1. 뮤신 단백질에 결합할 수 있고, 카밧 넘버링에 따른 아미노산 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 하기의 특징을 가지거나:
    (a) 글리코실화된 MUC1 종양 에피토프에 특이적으로 결합하고,
    (b) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다;
    (a) 및 (b)의 특징을 갖는 항체의 기능성 단편 또는 유도체로서, 상기 기능성 단편 또는 유도체가 서열번호 16 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 교차 특이성(cross-specificity)을 나타내는, 항체 또는 이의 기능성 단편 또는 유도체.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 하기의 특징을 갖는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체:
    (a) 자신의 에피토프에 대한 특이적인 결합이 에피토프의 입체구조 및/또는 글리코실화 패턴에 의존하며;
    (b) 아미노산 서열 PDTR, 바람직하게는 트레오닌 잔기에 N-아세틸 갈락토사민(Tn) 또는 갈락토오스 ß1-3 N-아세틸 갈락토사민(TF)으로 글리코실화된 아미노산 서열 PDTR을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있고;
    (c) MUC1, 특히 종양-유래 MUC1의 글리코실화된 세포외 직렬반복(tandem repeat)의 전부 또는 일부에 특이적으로 결합할 수 있으며;
    (d) 동일한 길이의 동일한 펩타이드 서열의 비-글리코실화된 펩타이드에 대한 결합에 비해 결합력이 20배 이상 증가될 정도로 글리코실화된 MUC1 종양 에피토프에 특이적으로 결합하고;
    (e) 유전자 조작된, 바람직하게는 인간화된 것이며;
    (f) 하기 (i) 내지 (iii)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 2개 이상의 상보성 결정 영역(complementarity determining region)을 포함하고:
    (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
    (ii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
    (iii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    (g) 하기 (i) 및 (ii)로부터 선택되는 항체 틀 영역(framework region)을 포함하며:
    (i) 가변 중쇄 VH의 FRH1, FRH2, FRH3 및 FRH4는 하기의 아미노산 서열과 카밧의 명수법에 상응하는 아미노산 위치를 갖고:
    FRH1 (서열번호 7)
    Figure pct00023

    FRH2 (서열번호 9)
    Figure pct00024

    FRH3 (서열번호 11)
    Figure pct00025

    FRH4 (서열번호 13)
    Figure pct00026

    (ii) 임의적으로 경쇄 가변 영역 VL의 FRL1, FRL2, FRL3 및 FRL4는 하기의 아미노산 서열과 카밧의 명수법에 상응하는 아미노산 위치를 갖는다:
    FRL1 (서열번호 23)
    Figure pct00027

    FRL2 (서열번호 24)
    Figure pct00028

    FRL3 (서열번호 25)
    Figure pct00029

    FRL4 (서열번호 26)
    Figure pct00030

    (h) 서열번호 7, 특히 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 틀 영역 1을 포함하고;
    (i) 서열번호 15, 바람직하게는 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하며;
    (j) 서열번호 27, 바람직하게는 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    (k) 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나 이의 기능성 단편 또는 유도체이며;
    (l) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호 29 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 항체 Pankomab와 교차 특이성을 나타내고;
    (m) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호 16 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 교차 특이성을 나타낸다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 인코딩하는 핵산.
  5. 제4항에 따른 핵산 및 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트 또는 벡터.
  6. 제4항에 따른 핵산 또는 제5항에 따른 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체, 제4항에 따른 핵산, 제5항에 따른 발현 카세트 또는 벡터, 또는 제6항에 따른 숙주 세포를 포함하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 바람직하게는 용매, 희석제 및 부형제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는 약학 조성물인 조성물.
  9. 의약에 사용하기 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체, 제4항에 따른 핵산, 제5항에 따른 발현 카세트 또는 벡터, 제6항에 따른 숙주 세포, 또는 제7항 또는 제8항에 따른 조성물.
  10. 암, 바람직하게는 결장암, 위암, 간암, 췌장암, 신장암, 혈액암, 폐암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택되는 암의 치료, 예후, 진단 및/또는 모니터링에 사용하기 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 유도체, 제4항에 따른 핵산, 제5항에 따른 발현 카세트 또는 벡터, 제6항에 따른 숙주 세포, 또는 제7항 또는 제8항에 따른 조성물.
  11. 카밧 넘버링에 따른 중쇄 가변 영역의 위치 28에 프롤린 잔기를 제공하는 단계를 포함하는, 뮤신 단백질에 결합할 수 있고 중쇄 가변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 항원 결합 및/또는 항원 인식을 개선시키는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 하나 이상의 하기 특징을 갖는 방법:
    (a) 위치 28의 아미노산 잔기는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 코딩하는 핵산에 돌연변이를 도입함으로써 수득되고, 여기서 상기 돌연변이는 상기 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈 내에 도입되며;
    (b) 항원 결합 및/또는 항원 인식의 개선은 자신의 항원에 대한 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 친화도를 향상시키는 것 및/또는 자신의 항원에 대한 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 특이성을 증가시키는 것을 포함한다.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 하나 이상의 하기 특징을 갖는 것인 방법:
    (a) 자신의 에피토프에 대한 특이적인 결합이 에피토프의 입체구조 및/또는 글리코실화 패턴에 의존하며;
    (b) 아미노산 서열 PDTR, 바람직하게는 트레오닌 잔기에 N-아세틸 갈락토사민(Tn) 또는 갈락토오스 ß1-3 N-아세틸 갈락토사민(TF)으로 글리코실화된 아미노산 서열 PDTR을 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있고;
    (c) MUC1, 특히 종양-유래 MUC1의 글리코실화된 세포외 직렬반복의 전부 또는 일부에 특이적으로 결합할 수 있으며;
    (d) 동일한 길이의 동일한 펩타이드 서열의 비-글리코실화된 펩타이드에 대한 결합에 비해 결합력이 20배 이상 증가될 정도로 글리코실화된 MUC1 종양 에피토프에 특이적으로 결합하고;
    (e) 유전자 조작된, 바람직하게는 인간화된 것이며;
    (f) 하기 (i) 내지 (iii)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하고,
    (i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CDR1,
    (ii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및
    (iii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR3;
    (g) 하기 (i) 및 (ii)로부터 선택되는 항체 틀 영역을 포함하며,
    (i) 가변 중쇄 VH의 FRH1, FRH2, FRH3 및 FRH4는 하기의 아미노산 서열과 카밧의 명수법에 상응하는 아미노산 위치를 갖고:
    FRH1 (서열번호 33)
    Figure pct00031

    FRH2 (서열번호 9)
    Figure pct00032

    FRH3 (서열번호 11)
    Figure pct00033

    FRH4 (서열번호 13)
    Figure pct00034

    (ii) 임의적으로 경쇄 가변 영역 VL의 FRL1, FRL2, FRL3 및 FRL4는 하기의 아미노산 서열과 카밧의 명수법에 상응하는 아미노산 위치를 갖는다:
    FRL1 (서열번호 23)
    Figure pct00035

    FRL2 (서열번호 24)
    Figure pct00036

    FRL3 (서열번호 25)
    Figure pct00037

    FRL4 (서열번호 26)
    Figure pct00038

    (h) 서열번호 33 또는 34의 아미노산 서열을 포함하는 틀 영역 1을 포함하고;
    (i) 서열번호 38 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하며;
    (j) 서열번호 27 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    (k) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나 이의 기능성 단편 또는 유도체이며;
    (l) 서열번호 29 (중쇄 가변 영역) 및 서열번호 30 (경쇄 가변 영역)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 Pankomab와 교차 특이성을 나타내고;
    (m) 중쇄 가변 영역으로서 서열번호 16 및 경쇄 가변 영역으로서 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 교차 특이성을 나타낸다.
  14. 하기의 단계를 포함하는 제4항에 따른 핵산의 제조 방법:
    (a) MUC1에 결합할 수 있고, 카밧 넘버링에 따른 아미노산 위치 28에 프롤린 잔기를 포함하지 않는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산을 제공하는 단계;
    (b) 중쇄 가변 영역의 카밧 넘버링에 따른 아미노산 번호 28을 코딩하는 코돈이 프롤린 잔기를 코딩하도록 상기 코돈에 돌연변이를 도입하는 단계.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 하기의 특징을 갖는 글리코실화 패턴을 갖는 항체 또는 이의 단편 또는 유도체:
    (a) 인간 글리코실화 패턴이며;
    (b) 항체의 활성, 특히 자신의 특이적인 에피토프에 대한 결합 친화도, Fc 수용체와 같은 다운스트림 수용체들 중 하나 이상에 대한 결합 친화도, 보체 의존성 세포독성(CDC) 및/또는 항체 의존성 세포매개 세포독성(ADCC)을 향상시키고;
    (c) K562, KG1, MUTZ-3, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-H9D8 [DSM ACC 2806], NM-H9D8-E6 [DSM ACC 2807], NM H9D8-E6Q12 [DSM ACC 2856] 및 GT-2X [DSM ACC 2858]로 이루어진 군에서 선택되는 세포주에서 항체 또는 이의 단편 또는 유도체를 발현시킬 때 수득되는 글리코실화 패턴이다.
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