KR20120049164A

KR20120049164A - 면역밸런스제어제

Info

Publication number: KR20120049164A
Application number: KR1020117010806A
Authority: KR
Inventors: 타카시 니시무라; 츠토무 카노
Original assignee: 네퓨레 코포레이션; 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠
Priority date: 2009-08-06
Filing date: 2010-08-03
Publication date: 2012-05-16
Also published as: WO2011016432A1; US20120121616A1; JP5762000B2; JPWO2011016432A1

Abstract

본 발명은 과열수증기처리물의 새로운 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 쑥갓의 과열수증기처리물을 함유하는 면역밸런스제어제를 제공한다. 본 발명의 면역밸런스제어제는 예로부터 식품으로서 이용되어지고 있는 쑥갓의 과열수증기처리물을 유효성분으로 하는, 지극히 안전성이 높고, 생체의 면역밸런스를 조절하여 정상화하는 효과를 가지는 조성물이다. 본 발명자들은 쑥갓의 과열수증기처리물이, 타입1 면역부활효과에 의하여 감염방어나 항종양활성에 더하여 면역밸런스를 조절하는 것에 의하여 과도한 타입2 면역응답에 의하여 발생하는 알레르기 질환의 개선 작용을 나타내는 것을 발견하여 본원 발명을 완성하였다.

Description

면역밸런스제어제{IMMUNE BALANCE-REGULATING AGENT}

본 발명은 쑥갓의 과열수증기처리물을 함유하는 면역밸런스제어제에 관한 것이다.

과열증기는 일정한 압력하에서 증기와 액체가 평행을 유지하고 공존할 수 있는 온도 이상으로 가열된 증기이며, 예를 들면 1기압에서 100℃이상으로 가열된 수증기를 과열수증기라고 말한다. 과열수증기를 이용한 기술은 살균, 건조, 식품가공 등의 분야에 널리 확대되고 있으며 특히, 식품가공 분야에 있어서는 식재의 색, 향기, 맛, 재질감 등의 품질을 변화시키지 않는다는 과열수증기처리의 이점을 살린 기술개발이 이루어지고 있다(특허문헌1, 2 등).

과열수증기처리는 식재의 품질을 변화시키지 않는 외에 바람직하지 않은 잉여 유지나 악취성분 등을 저감시키는 효과를 가지고 있다(특허문헌3, 4). 또한, 바라는 성분을 증강시키는 기술로서도 이용이 진행되고 있으며, 예를 들어 특허문헌5에는 양파의 외피 등의 케르세틴 배당체 함유물을 과열수증기처리함에 의해 얻어지는 케르세틴 함유 조성물이, 특허문헌6에는 커피콩을 과열수증기처리함에 의해 아크릴아미드가 감소하며 또 클로로겐산류가 증가한 배전(焙煎) 커피콩이 얻어지는 것이 개시되어 있다.

이와 같은 과열수증기처리에 의해 어떠한 생리적인 기능이 부여 혹은 증강된 새로운 소재를 얻는 것이 기대되어 있지만, 충분한 생리적 기능을 가지는 소재는 아직 얻어지지 않았다.

일본특허 공개공보 2006-129739호 국제공개 팜플렛 WO2002/080690호 일본특허 공개공보 2000-139366호 일본특허 공개공보 2006-204148호 일본특허 공개공보 2007-210916호 일본특허 공개공보 2007-282537호

본 발명은 과열수증기처리물의 새로운 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 쑥갓의 과열수증기처리물이, 타입1 면역부활효과에 의한 감염방어나 항종양활성에 더하여 면역밸런스를 조절하는 것에 의해, 과도한 타입2 면역응답으로 인하여 발생하는 알레르기 질환의 개선 작용을 나타내는 것을 발견하여 하기의 각 발명을 완성하였다.

(1) 쑥갓의 과열수증기처리물을 함유하는 면역밸런스제어제.

(2) 항감염증용인 (1)에 기재한 면역밸런스제어제.

(3) 항종양용인 (1)에 기재한 면역밸런제어제.

(4) 타입1 면역계 기능 강화용인 (1)에 기재한 면역밸런스제어제.

(5) 수지상세포 활성화용인 (4)에 기재한 면역밸런스제어제.

(6) IFN-γ 및/또는 인터루킨(IL)-12 생산 촉진용인 (4)에 기재한 면역밸런스제어제.

본 발명의 면역밸런스제어제는 예로부터 식품으로서 이용되고 있는 쑥갓의 과열수증기처리물을 유효성분으로 하는, 지극히 안전성이 높고, 생체의 면역밸런스를 조절하여 정상화하는 효과를 가지는 조성물이다.

도 1의 상하 도면은 각각 실시예 및 비교예1의 과열수증기처리물의 IFN-γ 생산 유도(생산 촉진) 작용을 나타내는 도면이다. 세로축은 IFN-γ 생산 레벨을, 가로축은 첨가한 과열수증기처리물을 나타낸다.
도 2는 실시예의 과열수증기처리물에 의한 비장세포로부터의 IFN-γ 생산 유도에 있어서 IL-12의 영향을 나타내는 도면이다. 세로축은 IFN-γ 생산 레벨을 나타내며 가로축은 실시예의 과열수증기처리물을 첨가하지 않은 군(무첨가군)과 첨가한 군(쑥갓첨가군)을 각각 나타낸다.
도 3은 실시예의 과열수증기처리물의 수지상세포 활성화 작용을 나타낸 유세포분석의 결과를 나타내는 그래프이다. 가로축은 세포표면에 있어서의 측정 대상 분자의 발현 레벨을 나타내며, 무첨가군이란 실시예의 과열수증기처리물을 첨가하지 않는 군을, 쑥갓첨가군이란 실시예의 과열수증기처리물을 첨가한 군을 각각 나타낸다.
도 4는 실시예의 과열수증기처리물의 수지상세포 활성화작용을 나타낸 IL-12 생산유도능을 나타내는 도면이다. 세로축은 IL-12 생산레벨을 나타내며 가로축은 실시예의 과열수증기처리물을 첨가하지 않은 군(무첨가군)과 첨가한 군(쑥갓첨가군)을 각각 나타낸다.
도 5는 실시예의 과열수증기처리물이 TLR(Toll Like Receptor) 의존적 IFN-γ생산유도(생산촉진) 작용을 나타내는 도면이다. 세로축은 IFN-γ 생산레벨을 나타내며, 가로축은 실시예의 과열수증기처리물을 첨가하지 않은 군(무첨가군)과 첨가한 군(쑥갓첨가군)에 있어서의 7주령 C57BL/6 암컷마우스 비장면역세포(야생형), TLR2 결손마우스 비장면역세포, TLR4 결손마우스 비장면역세포 및TLR9 결손마우스 비장면역세포를 각각 나타낸다.
도 6은 실시예의 과열수증기처리물을첨가하지 않을 경우(무첨가군)와 첨가하였을 경우(쑥갓첨가군)와의 NK1.1+ TCRβ- 세포, NK1.1+ TCRβ+ 세포, CD4+ 세포 및 CD8+ 세포에 있어서의 IFN-γ의 생산에 대하여 세포내염색법을 이용하여 유세포분석기로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 각 그래프의 세로축은 세포들의 표면에 있어서의 측정 대상 분자의 발현 레벨을 각각 나타내며, 가로축은 IFN-γ 생산 레벨을 나타낸다.
도 7은 실시예의 과열수증기처리물을 첨가하지 않을 경우(무첨가군)와 첨가하였을 경우(쑥갓첨가군)와의 7주령 C57BL/6 암컷마우스 비장면역세포(control) 및 NK1.1+ 세포를 함유하지 않은 7주령 C57BL/6 암컷마우스 비장면역세포에 있어서의 IFN-γ 생산 레벨을 나타내는 도면이다. 세로축은 IFN-γ 생산레벨을, 가로축은 실시예의 과열수증기처리물을 첨가하지 않은 군(무첨가군)과 첨가한 군(쑥갓첨가군)에 있어서의 각각을 나타낸다.
도 8은 실시예의 과열수증기처리물(쑥갓 네퓨레(Nepuree)) 및 비교예 2의 통상열처리물(쑥갓 퓨레)의 IFN-γ 생산 유도(생산 촉진)작용을 나타내는 도면이다. 세로축은 IFN-γ 생산 레벨을 나타내며, 가로축은 실시예의 과열수증기처리물을 첨가하지 않은 군(무첨가군)과 첨가한 군(쑥갓첨가군)을 각각 나타낸다.

본 발명은 쑥갓의 과열수증기처리물을 함유하는 면역밸런스제어제를 제공한다. 쑥갓은 국화과 국화속의 식물이며 잎부분과 줄기부분이 일반적으로 식용으로 여겨져 일상적으로 섭취되는 야채로서 일본 국내에 넓게 유통되고 있다.

본 발명의 실시에 있어서는 식용에 쓰여지는 쑥갓이라면 사용이 가능하며, 예를 들어 학명으로 Chrysanthemum coronarium라고 불리워지는 종을 사용할 수가 있다.

또한, 쑥갓의 영양성분으로 비타민C나 카로틴을 풍부하게 함유하고 있다는 것은 알려져있지만 면역제어작용에 대해서는 알려져 있지 않다.

과열수증기처리는 쑥갓을 그대로 혹은 적당한 크기로 분쇄하여 실시한다. 상기 쑥갓은 날것이어도 되고 건조물이라도 좋다.

과열수증기처리에 사용되는 증기의 온도는 120℃ 내지 500℃ 정도의 범위인 것이 바람직하며 더욱 바람직하게는 230℃ 내지 280℃이다. 또한, 과열수증기처리의 시간은 재료의 크기나 양에 따라 적당하게 설정되지만 본 발명의 면역밸런스제어제의 기능을 충분한 것으로 하기 위해서는 30초 내지 240초 정도의 범위인 시간이 바람직하다.

또한 과열수증기처리는 같은 처리조건 하에서 혹은 온도조건이나 시간조건을 바꾸어서 2회 이상 하여도 되며, 또 상기 특허문헌1에 기재되어 있는 것처럼 2회 이상의 과열수증기처리 사이에 파쇄가공공정을 짜 넣어도 좋다.

과열수증기처리 후의 재료는 그 자체로 본 발명의 면역밸런스제어제로서 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 원심분리나 여과 등에 의한 고액분리, 물, 에탄올 등의 알콜 및 이들 혼합물을 사용한 용매추출, 스프레이 드라이나 동결건조 등에 의한 건조 처리를 실시하여 사용할 수가 있으며 본 명세서에서는 이러한 모든 것을 ‘과열수증기처리물’이라고 한다.

본 발명에서 말하는 면역밸런스제어 즉, 면역밸런스를 제어하는 작용이란 타입1 면역계 기능과 타입2 면역계 기능 중 어느 한편으로, 특히, 타입2 면역계 기능이 항진되어 있는 상태를 해소하여 양 면역계기능이 제어된 상태로 유도하는 작용을 의미한다. 또한, 본 발명에서 말하는 면역밸런스의 제어는 면역밸런스의 조절, 조정과 교환가능하게 사용된다.

일반적으로 타입1 면역계는 항원제시세포인 수지상세포나 대식세포로부터의 항원 펩티드 제시와 IL-12, IFN-γ의 작용에 의하여 유도되어질 Th1세포(1형 헬퍼T세포)가 관여하는 면역계로 이해되고 있다. Th1세포는 IFN-γ 등 Th2세포(2형 헬퍼T세포)의 분화저해나 B세포의 성숙저해를 통한 IgE 항체의 생산을 억제하는 사이토카인 외에 IL-2나 TNF-α 등을 생산하여 킬러-T세포 등의 세포성 면역의 활성화나 수지상세포나 대식세포 등의 항원제시세포의 활성을 높이는 작용을 가진다. 한편, 타입2 면역계는 항원제시세포인 대식세포로부터의 항원 펩티드 제시와 IL-4 작용에 의해 유도되는 Th2 세포가 관여하는 면역계로 이해되고 있다. Th2세포는 IL-4나 IL-13 등의 B세포의 성숙을 통한 IgE 등의 항체생산을 증가시켜 액성면역을 활성화하는 사이토카인 외에 IL-5, IL-6, IL-10을 생산한다.

Th2세포에서 생산되는 IL-4, IL-10은 Th1세포에서의 IFN-γ의 생산을 억제하도록 서로가 그 작용을 억제한다는 것이 알려져 있으며 또한, 타입2 면역계기능이 우성일 경우에는 세포성 면역이 제어되어 감염증이 중증화되기 쉽고 또한, B세포의 성숙을 통한 IgE 항체생산이 증가하여 알레르기 체질에 빠지기 쉽다고 생각되고 있다. 따라서, 타입1 면역계기능과 타입2 면역계기능의 밸런스 파괴, 특히 지나친 타입2 면역계기능의 항진 내지 우성은 반드시 생체에 있어서 바람직하다고는 할 수 없다.

본 발명에서 사용하는 과열수증기처리물은 수지상세포나 자연살해세포(NK세포), 자연살해T세포(NKT세포)를 활성화하는 작용, IFN-γ 및 IL-12의 생산을 유도 내지 촉진하는 작용을 나타낸다. NK세포나 NKT세포를 활성화하는 작용이란 예를 들어, NK세포나 NKT세포에 있어서의 IFN-γ의 생산을 유도하는 작용 등을 들 수가 있다. 따라서, 본 발명의 면역밸런스제어제를 특히 타입2 면역계기능이 항진되어 있는 개체에 투여함으로써 타입1 면역계기능을 강화할 수가 있으며, 그 결과 면역밸런스를 제어할 수가 있다. 이와 같이 본 발명에서 사용하는 과열수증기처리물은 타입1 면역계기능을 강화하는 타입1 면역계기능강화제로서 이용할 수가 있으며, 또한 수지상세포 활성화제나 NK세포 활성화제, NKT세포 활성화제, IFN-γ 생산촉진제, IL-12 생산촉진제로서 이용할 수가 있다.

더욱이 상기 본 발명에서 사용하는 과열수증기처리물이 나타내는 생리활성은 전혀 뜻밖에도 같은 재료를 사용하여 통상의 열처리를 실시한 경우와 비교해서 지극히 강력하다는 것이 확인되어 있다.

또한, 본 발명에서 사용하는 과열수증기처리물은 타입1 면역계기능을 강화하는 것에 의해 타입2 면역계기능이 우위에 있는 상태, 예를 들면 알레르기를 완화하게 할 수가 있으며 혹은 NK세포나 NKT세포에 있어서의 IFN-γ의 생산을 유도하거나 하여 감염증 억제 효과나 항종양 효과 등을 얻을 수 있기 때문에 알레르기성 질환 치료 및 기타, 감염증이나 악성 종양 등의 세포성 면역 항진이 요구되는 질환의 치료에 대해 유효하다. 즉, 본 발명에서 사용하는 과열수증기처리물은 알레르기 억제제나 감염증 억제제, 항종양제로서의 이용이 가능하다.

또한, 본 발명에서 사용하는 과열수증기처리물은 이것을 복용함에 의해 평상시부터 타입1 면역계 기능과 타입2 면역계 기능의 밸런스를 유지할 수가 있어 감염증 등의 외적이물의 침입에 대한 저항성을 높이고 또한 지나친 면역응답반응인 알레르기나 자기면역질환에 대해서도 이를 완화하는 작용을 갖는다고 기대할 수가 있다.

구체적으로 본 발명의 면역밸런스제어제에는 바이러스나 세균 등에 의한 감염증, 종양, 염증, 아토피성 피부염, 피부병, 민감피부, 꽃가루 알레르기, 천식, 기관지천식, 비염, 두드러기 등의 알레르기성 질환 등의 예방, 치료 혹은 증상의 개선 효과를 기대할 수가 있다.

본 발명에 있어서 과열수증기처리물은 그 자체로 면역밸런스제어제로서 이용할 수 있을 뿐만 아니라 감염증 예방, 억제 내지 치료제, 항종양제, 알레르기성질환 예방, 억제 내지 치료제 등의 의약조성물로서 이용할 수가 있다. 또한, 일반적인 부형제와 조합하여 조성물로서 더욱이 피부외용제, 내복약, 주사제 그 외의 일반적인 제형에 제제화해서 사용하는 것도 가능하다.

상기 조성물 혹은 각종 제형은 과열수증기처리물 외에 비타민, 생약, 항염증제, 항히스타민제 그 외의 의약을 유효성분으로 필요에 따라 배합하여 의약품, 의약부외품의 형태로서도 사용할 수 있다.

또한 제제화에 있어서 사용되는 부형제는 예를 들어 정제나 캡슐 등의 경구고형제, 수성액제나 현탁액제 등의 내복액제, 연고, 첩부제, 로션, 크림, 스프레이, 좌제 등의 제형마다 해당 업자들에게 널리 알려지고 또한 사용되고 있는 성분을 적당히 조합하여 사용할 수가 있다.

상기 조성물 혹은 제형에 있어서 과열수증기처리물의 배합량은 특별히 규정되어 있는 것이 아니라 제형의 종류, 품질, 기대되는 효과의 정도에 의해 약간 다르지만 조성물 혹은 제제 전량 중 건조고형분으로서 1~99중량％, 바람직하게는 10~99중량％ 보다 더 바람직하게는 50~99중량％ 배합시키는 것이 좋다.

또한 본 발명의 면역밸런스제어제는 그 자체로 혹은 적당한 음식품 성분과 조합함으로서 쥬스 혹은 유음료 등의 음료, 요구르트나 아이스크림 등의 유제품, 수프, 젤리, 잼, 과자, 빵 등 식품의 형태로도 좋고 더욱이 건강식품 또는 건강보조식품의 형태로도 좋다. 식품 속에 배합하여 섭취 혹은 투여할 경우에는 적당히 부형제, 증량제, 결합제, 증점제, 유화제, 착색료, 향료, 식품첨가물, 조미료 등과 혼합하여 용도에 따라 분말, 과립, 정제 등의 형태로 성형할 수가 있다. 또 식품원료 속에 혼합하여 식품을 제조하여 기능성식품으로 제품화함으로써 섭취할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 과열수증기처리물은 식품을 원료로 하고 있기 때문에 이것을 상기의 음식품 등의 형태로 섭취할 경우 양에 특별한 제한은 없다. 일반적으로 식품으로 사용되는 범위의 양을 섭취하는 것이 바람직하며 구체적으로는 1회에 0.5~250g 바람직하게는 1~200g이며 1일당 총섭취량은 0.5~500g 바람직하게는 1~400g이다.

이하 실시예를 제시해서 본 발명을 더욱 더 자세하게 설명하지만, 본 발명이 이러한 실시예에 한정적으로 해석되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

〈실시예〉

4cm 길이로 자른 쑥갓(Chrysanthemum coronarium) 3kg을 고온의 수증기로 상압하에서 10분 과열처리 하였다. 처리 후의 쑥갓을 나가타 새이기 주식회사제 ‘고속유성형믹서 뉴톤 UM-N13’으로 1100rpm, 100초간 처리하였다. 믹서처리한 쑥갓을 초고속원심기(SCR20BA:HITACHI사)로 2000회전(25000×g) 10분 처리하고 침전분획과 상청액 분획을 얻어 동결건조기를 이용하여 이 상청액 분획을 건조시켜 수용분획을 제조하였다. 다음으로 상기 침전분획을 10배량의 30체적％ 에탄올수용액에 현탁하여 30분간 교반한 후 여과지 (Whatman사)를 사용하여 30체적％ 에탄올 고형분과 30체적％ 에탄올 여액으로 분리하였다. 30체적％ 에탄올 여액을 농축원심기(EYELA사)로 처리하여 에탄올을 증발시킨 후 액체질소로 냉각하여 동결건조기로 완전히 용매를 제거하여 30체적％ 에탄올 추출분획을 제조하였다. 다음으로 상기 30체적％ 에탄올 고형분을10배량의 60체적％ 에탄올 수용액에 현탁하여 30분간 교반한 후 여과지(Whatman사)를 사용하여 60체적％ 에탄올 고형분과 60체적％ 에탄올 여액으로 분리하였다. 60체적％ 에탄올 여액을 30체적％ 에탄올 여액과 같은 방법으로 처리하는 것에 의해 60체적％ 에탄올 추출분획을 제조하였다.

<비교예1>

실시예의 쑥갓을 당근(Daucus carota), 토마토(Solanum lycopersicum), 시금치(Spinaciaoleracea), 양파(Allium cepa)와 치환한 것 외에는 실시예와 동일하게 처리하여 각각의 30체적％ 에탄올 추출분획을 얻었다.

〈비교예2〉

큼직한 냄비에 2L의 물을 넣어 완전히 끓인 다음 쑥갓 100g을 넣어 3분간 가열하였다. 가열 후의 쑥갓은 에이스 호모지나이저(Ace Homogenizer AM-3/KN3325012;니혼 새이기 제작소)로 충분히 분쇄하였다. 이후, 초원심분리 및 에탄올 추출을 실시예와 같은 방법으로 하여 30체적％ 에탄올 추출분획을 얻었다.

〈시험예〉

(1) IFN-γ 생산유도(생산촉진) 작용

찰즈?리버사에서 구입한 7주령의 C57BL/6 암컷 마우스에서 비장을 채취하였다. 10％ FCS, 2.38mg/mL Hepes, 0.11mg/mL 피루브산 나트륨, 200U/mL 페니실린G, 0.1mg/mL 스트렙토마이신을 포함한 RPMI-1640배지(와코우순약사) 중에서 핀셋을 사용하여 비장을 으깨어 풀어놓았다. 세포를 배양액과 함께 나일론 매쉬(와코우순약사)에 걸러서 조직부분을 제거하면서 회수하였다. 소형냉각원심기(himac CF7D2, HITACH사)를 사용하여 1500rpm, 5분간 원심처리한 후 상청액을 버리고 2mL의 0.155M 염화암모늄으로 37℃, 1분30초 인큐베이트함에 의해 적혈구를 배제하여 비장면역세포/상기RPMI-1640배지를 제조하였다. 실시예와 비교예1에서 얻은 각종 추출샘플을 도 1에 나타낸 농도로 공배양하여 탄산가스 인큐베이터를 사용하여 37℃, 5％CO₂분위기 하에서배양 하여 48시간 후 배양상청액을 회수하여 ELISA Mouse IFN-γ BD OptEIA set(BD Bioscience사)를 사용하여 배양 상청액중의 IFN-γ양을 정량하였다.

결과를 도 1에 나타낸다. 실시예의 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물만이 강한 IFN-γ 생산 유도 활성을 나타냈다.

(2) 비장세포로 부터의 IFN-γ 생산유도에 있어서의 IL-12의 영향

실시예의 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물을 사용하여 비장세포 배양시에 모노클로널 항IL-12 항체를 첨가하여 IL-12의 기능을 저해한 외에는 (1)과 동일한 방법으로 실험을 실시하였다.

그 결과를 도 2에 나타낸다. 항IL-12 항체 첨가에 의해, 쑥갓에 의한 IFN-γ 생산유도의 강한 억제가 확인되어 IL-12에 의해 IFN-γ의 생산이 유도되고 있다는 것을 나타냈다.

(3) 수지상세포 활성화작용

찰즈?리버사에서 구입한 7주령의 C57BL/6 암컷 마우스의 대퇴골에서 골수세포를 채취하여 6구멍 평저플레이트(Nunc사)에 1×10⁶cells/웰이 되도록 파종하여 10ng/mL의 GM-CSF(Peprotech사) 존재 하에서 6일간 배양하여 항원제시세포인 수지상세포를 유도하였다. 이 세포와 실시예의 쑥갓30％ 에탄올 추출물을 10％ FCS, 2.38mg/mL Hepes, 0.11mg/mL 피루빈산 나트륨, 200U/mL 페니실린G, 0.1mg/mL 스트렙토마이신을 포함한 RPMI-1640배지 중에서 공배양하여 24시간 후에 있어서 세포표면에 MHC클래스I분자, MHC클래스II분자, CD40분자 및 CD86분자의 발현 레벨을 항MHC클래스I분자 항체(AF6-88.5), 항MHC클래스II분자 항체(AF6-88.5), 항CD40 항체(3/23) 및 항CD86 항체(GL1)를 사용한 유세포 분석기(FACS Calibur;BD Bioscience사)에 의해 검출하였다.

그 결과를 도 3에 나타낸다. 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물을 첨가한 군에서는 첨가하지 않은 컨트롤에 비해 MHC클래스I분자 MHC클래스II분자 CD40분자 및 CD86분자의 현저한 발현 상승이 보였다. 이것으로부터 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물은 수지상세포를 활성화시키고 있다는 것을 알았다.

(4) 수지상세포로 부터의 IL-12 생산유도능

(3)과 동일한 조건에서 실시예의 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물의 IL-12 생산에 대하여 검토하였다. 세포를 회수 하였을 때의 배양상청액 속에 포함되는 IL-12p70을 ELISA Mouse IL-12p70 BD OptEIA set(BD Bioscience사)를 사용하여 정량하였다.

그 결과를 도 4에 나타낸다. 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물은 수지상세포에서 IL-12 생산을 유도한다는 것이 확인되었다.

(5) IFN-γ 생산유도에 있어서의 TLR 의존성 검토

찰즈?리버사에서 구입한 7주령의 C57BL/6 암컷 마우스 혹은 오리엔탈 바이오 서비스 사에서 입수한 TLR2(Toll Like Receptor2) 결손 마우스, TLR4(Toll Like Receptor4) 결손 마우스 및 TLR9(Toll Like Receptor9) 결손 마우스에서 각각 비장을 채취해서 실시예의 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물을 사용하여 (1)과 동일한 조건에서 실험을 실시하였다.

그 결과를 도 5에 나타낸다. 쑥갓에 의한 비장세포로부터의 IFN-γ 생산유도는 TLR4가 결손하였을 경우 거의 인정되어지지 않으며, TLR9가 결손하였을 경우 감약한 것으로 보아 쑥갓에 의한 면역밸런스제어 효과는 TLR4에 강하게 의존하며 TLR9에 부분적으로 의존하고 있다는 것이 명백해졌다.

(6) IFN-γ 생산유도세포의 동정

(1)과 동일한 방법으로 비장면역세포/RPMI-1640배지를 제조하여 이것에 실시예의 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물을 25μg/mL 첨가하여 탄산가스 인큐베이터를 사용하여 37℃, 5％CO₂ 분위기 하에서 12시간 배양하였다. BrefeldinA(BFA)를 첨가하여 더 12시간 경과시킨 후 세포를 회수하여 항TCRβ 항체, 항CD4 항체(GK1.5), 항CD8 항체(53-6.7), 항NK1.1 항체(PK136) 및 항IFN-γ 항체(×MG1.2)를 반응시켜 NK1.1+ TCRβ- 세포, NK1.1+ TCRβ+세포, CD4+세포 및 CD8+세포에 있어서의 IFN-γ 생산에 대하여 세포내 염색법을 이용한 유세포분석기(FACS Calibur, BD Bioscience사)에 의하여 검출하였다.

그 결과를 도 6에 나타낸다. NK1.1+ TCRβ-세포는 NK세포의 마커를 발현함과 동시에 T세포 특이적 마커를 발현하지 않는 것에서 NK세포라는 것을 알 수 있고, 또한 NK1.1+TCRβ+세포는 NK세포의 마커를 발현함과 동시에 T세포 특이적 마커를 발현하는 점에서 NKT세포라는 것을 알 수 있다. 그리고, NK1.1+ TCRβ-세포와 NK1.1+ TCRβ+세포가 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물의 첨가에 의하여 활성화되어 IFN-γ가 생산유도된다는 것을 알 수 있다. 이러한 것들로부터 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물의 첨가에 의하여 IFN-γ의 생산이 유도되는 세포는 NK세포 및 NKT세포라는 것을 나타냈다.

(7) NK세포 및 NKT세포에 있어서의 IFN-γ 생산유도의 확인

(6)의 결과로 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물의 첨가에 의한 NK세포 및 NKT세포에 있어서의 IFN-γ 생산유도의 확인을 거듭 실시하였다.

[7-1]

찰즈?리버사에서 구입한 7주령의 C57BL/6 암컷 마우스의 복강내에 항NK1.1 항체(PK136)를 200μg 투여하고 24시간 경과한 후에 비장을 채취하였다. 이후, (1)과 동일한 방법으로 비장면역세포/ RPMI-1640배지를 제조하여 NK1.1+세포 즉, NK세포 및 NKT세포가 포함되어 있지 않다는 것을 확인한 후, 실시예의 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물을 25μg/mL 첨가하여 탄산가스 인큐베이터를 이용하여 37℃, 5％ CO₂ 분위기 하에서 48시간 배양하였다. 이어서, 배양상청액을 회수하여 ELISA Mouse IFN-γ BD OptEIA set(BD Bioscience사)를 사용하여 배양 상청액중의 IFN-γ양을 정량하였다.

[7-2]

또한, 항NK1.1 항체(PK136)를 투여하지 않는 점 외에는 [7-1]과 동일한 방법으로 비장면역세포/ RPMI-1640배지를 제조하여 여기에 실시예의 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물을 25μg/mL 첨가하여 탄산가스 인큐베이터를 이용하여 37℃, 5％CO₂ 분위기 하에서 48시간 배양하였다. 이어서, 배양상청액을 회수하여 ELISA Mouse IFN-γ BD OptEIA set(BD Bioscience사)를 이용하여 배양 상청액중의 IFN-γ양을 정량하여 이것을 컨트롤로 하였다.

그 결과를 도7에 나타낸다. 컨트롤과 비교해서 NK세포 및 NKT세포가 포함되어 있지 않은 비장세포에 있어서의 IFN-γ양은 현저하게 낮은 값이라는 점에서 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물은 NK세포 및 NKT세포를 활성화해서 IFN-γ의 생산을 유도하는 것 및 쑥갓 30체적％ 에탄올 추출물의 첨가에 의하여 생산유도되는 IFN-γ는 주로 NK세포 및 NKT세포에 의한 것이라는 것이 나타났다.

(8) 추출법에 의한 IFN-γ 유도활성의 차이

실시예의 과열수증기처리한 샘플(쑥갓 네퓨레(Nepuree);’네퓨레’는 등록상표)과 비교예2에서 통상의 열처리를 한 샘플(쑥갓퓨레)에 있어서의 IFN-γ 유도능을 비교하기 위해 각각의 30체적％ 에탄올 추출물을 사용하여 (1)과 동일한 방법으로 실험을 실시 하였다.

그 결과, 도8에 나타내는 것과 같이 네퓨레(등록상표)에서 보다 강한 활성이 나타났다. 이러한 것들로부터 쑥갓에는 원래부터 IFN-γ의 생산을 유도하는 물질이 포함되어 있지만 과열수증기처리에 의하여 그 활성은 보다 강하게 된다는 것이 나타났다.

Claims

쑥갓의 과열수증기처리물을 포함하는 면역밸런스제어제.
제1항에 있어서,
항감염증용인 면역밸런스제어제.
제1항에 있어서,
항종양용인 면역밸런스제어제.
제1항에 있어서,
타입1 면역계 기능 강화용인 면역밸런스제어제.
제4항에 있어서,
수지상세포 활성화용인 면역밸런스제어제.
제4항에 있어서,
IFN-γ 및/또는 인터루킨12 생산 촉진용인 면역밸런스제어제.