KR20110096790A

KR20110096790A - 청국장 분리 균주를 이용하여 제조된 암 치료 및 예방용 발효두유

Info

Publication number: KR20110096790A
Application number: KR1020100016235A
Authority: KR
Inventors: 박건영; 서혜리; 김지영; 정은정; 배근호
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2010-02-23
Filing date: 2010-02-23
Publication date: 2011-08-31
Also published as: KR101173196B1

Abstract

본 발명은 청국장 분리 균주를 이용하여 제조된 발효두유에 관한 것으로, 본 발명에 따른 발효두유는 항돌연변이 효과가 우수하고, 아폽토시스 관련 Bcl-2 family와 세포 사이클 관련 p53 및 p21 인자들의 조절에 의해 항암 효과가 우수하며, 마늘 추출물이 추가로 첨가된 발효두유 또한 암세포 성장 저해 효과가 우수하여, 본 발명의 발효두유는 그 자체로 암 예방, 치료 및 개선 효과를 발휘할 수 있을 뿐만 아니라, 암 예방, 치료 및 개선을 위한 약제학적 조성물 및 건강기능식품 조성물의 원료로서 이용할 수 있는 효과가 있다.

Description

청국장 분리 균주를 이용하여 제조된 암 치료 및 예방용 발효두유{Fermented Soybean Milk for the Treatment and Prevention of Cancer Prepared by Using the Strain from Chungukjang}

본 발명은 청국장 분리 균주를 이용하여 제조된 암 치료 및 예방용 발효두유에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 청국장으로부터 분리, 동정된 균주 중 항암활성이 우수한 균주를 이용하여 발효시켜 제조된, 항암활성이 증진된 발효두유에 관한 것이다.

두유는 콩에서 콩물을 추출하여 부드럽게 마실 수 있도록 가공한 음료로 영양학적으로 우수하며, 단백질 약 3.5%, 지질 2%, 탄수화물 2.9%, 회분 0.5%를 함유하고 있어 우유와 유사한 영양학적 조성을 나타낸다. 두유는 레시틴과 비타민 E의 급원이고, 카제인이 없어 유당불내증이나 우유 알러지가 있는 사람들에게 영양학적으로 우유를 대신하는 음료로 사용되고 있다. 두유는 우유에 비해 적은 포화지방을 함유하며, 건강에 유익한 이소플라본과 여러 유기물들을 함유하고 있어 기능성식품으로 각광받고 있다.

두유의 주원료인 대두에는 양질의 단백질과 다양한 생리활성 물질들이 많이 함유되어 있으며, 특히 이소플라본은 제니스테인, 다이드제인, 글리시테인 및 이들의 배당체와 여러 유도체들로 구성되고, 여성호르몬인 에스트로겐과 유사한 구조와 활성을 가진다. 이소플라본은 심혈관계 질환 및 전립선암과 유방암을 예방하며, 폐경기 여성의 뼈 손실을 감소시킬 뿐만 아니라 폐경기 증후군을 완화해주는 역할 등을 한다.

종래 두유를 이용한 다양한 연구와 식품 개발이 이루어지고 있으며, 발효두유에 관한 선행연구로는 두유에 Lactobacillus acidophilus와 Lab. bulgaricus를 각각 접종한 것과 유산균과 효모 혼합 균주를 접종한 것이 있다. 또한 우유와 두유를 섞어 유산균을 접종한 것 등에 대한 연구가 이루어져 있다. 하지만 Bacillus 균주를 이용한 발효두유에 관한 연구는 거의 전무한 실정이다.

발효유는 살균 혹은 멸균된 우유를 일정한 미생물로 발효시켜서 만든 제품으로, 많은 연구에서 발효과정에 따른 프로바이오틱의 인체 건강 증진 효과가 밝혀지고 있다. 최근에는 단순히 우유에 유산균을 미생물 스타터로 이용하여 발효시킨 발효유 형태 뿐 아니라 두유를 발효시킨 것, 우유와 두유를 혼합하여 발효시킨 것, 그리고 여러 가지 기능성 물질들을 첨가한 발효유의 개발 시도가 많이 이루어지고 있으며, 이러한 기능성 발효유 제품에 대한 소비자들의 요구도 점차 증가하고 있다.

청국장은 우리나라의 전통 콩 발효식품으로 삶은 콩을 볏짚으로 싸서 2~3일 정도 발효시킨 것이다. 건조한 볏짚이나 콩의 종피에 많이 서식하고 있는 Bacillus속 세균들은 청국장의 발효에 관여하여 독특한 풍미와 점질물을 형성하고 각종 효소와 기능성 물질을 생산하게 된다. 또한 청국장의 주재료인 콩에서 유래된 생리활성 물질인 이소플라본, 사포닌, 트립신 저해제, 피트산 등은 혈전 용해능, 고혈압 예방, 항산화능, 항돌연변이 및 항암활성 등의 기능을 나타낸다고 알려져 있다.

청국장은 다양한 건강기능성에도 불구하고 특유의 향미 때문에 섭취율이 낮은 편이다. 이에 청국장 섭취방법이 다양화되어 최근에는 특유의 향미를 느끼지 못하도록 환형태 또는 가루를 내어 우유나 두유에 타서 많이 섭취는 방법 등이 알려져 있다.

본 발명자들은 다양한 건강기능성을 함유한 청국장을 간편하게 섭취할 수 있도록 청국장에서 분리한 Bacillus 균주를 콩을 주원료로 하는 두유에 접종하여 청국장의 기능을 함유한 발효두유를 제조하기 위해 선행연구에서 청국장의 품질이 우수하다고 인정받은 전북 순창군의 고추장민속마을에서 여섯 종류 (K-, M-, Mn-, O-, Os-, H-청국장)의 청국장 제품을 구입하였고, 이들의 관능 및 이화학적 특성을 검토하여 고품질의 청국장 3종을 선택하여. 이들로부터 균주를 분리, 동정한 후, 분리된 균주를 이용하여 항암활성이 우수한 발효두유를 제조하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 청국장으로 분리, 동정한 균주를 이용하여 발효시킨 항암활성이 우수한 발효 두유를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 발효두유에 마늘을 첨가한 항암활성이 우수한 발효 두유를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 기능성 발효두유를 제조하기 위하여 순창 지역에서 구입한 3종의 청국장의 항돌연변이 효과 및 항암 효과를 측정하고, 그 중 가장 기능성이 뛰어났던 청국장 1종을 선택하여 대표적인 균을 분리 동정한 후, 고 분리 동정된 균을 이용하여 발효두유를 제조하고, 그 발효두유의 항돌연변이 효과 및 항암효과를 측정하는 한편, 발효두유의 항암 기능성을 더욱 증진시키기 위해 마늘을 첨가하여 기능성 발효두유를 제조하여 관능평가와 항암효과를 측정함으로써 달성되었다.

본 발명은 청국장 분리 균주를 이용한 암 예방 및 치료용 발효두유를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 청국장 분리 균주는 B. subtilis(서열번호 1), B. amyloliquefaciens(서열번호 2) 또는 B. cereus(서열번호 3)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합 균주인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 발효두유에 마늘 추출물을 첨가한 암 예방 및 치료용 발효두유를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 마늘 추출물은 전체 발효두유에 대하여 1 내지 10중량%의 양으로 첨가되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 상기 발효두유를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 발효두유를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 유효성분이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 발효두유를 포함하는 약제학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 발효두유를 포함하는 약제학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 발효두유를 포함하는 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 발효두유의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 발효두유는 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 발효두유는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사 및 피부에 직접 투여될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 발효두유는 염증 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 발효두유를 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등이 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 대추씨 정유의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 발효두유를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 발효두유는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 발효두유는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 대추씨 정유는 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에서는 청국장에서 분리한 Bacillus 균주를 사용하여 제조한 발효두유의 항암 기능성을 AGS 인체 위암세포와 HT-29 인체 결장암세포를 이용해 알아보았다.

발효두유를 제조에 필요한 균주를 분리하기 위해 순창 지역에서 고품질의 청국장을 구입하여 항돌연변이 효과와 항암 효과를 측정하였다. 이 중 항암 기능성이 가장 우수했던 청국장에서 대표적인 Bacillus균 3종을 분리 동정하였다. 이 분리된 균을 이용하여 발효두유를 제조하였고, 이의 in vitro에서의 항암 효과 및 암세포 성장 억제 기전을 조사하였다.

또한 발효두유의 항암 효과를 증진시키기 위하여 발효두유에 마늘 추출물을 첨가하여 마늘 추출물을 첨가하지 않은 발효두유에 비해 얼마나 항암 효과가 증진되었는지 알아보았다. 그리고 발효두유의 항암 효과가 어떤 활성 물질에 의한 것인지를 알아보기 위하여 LC-MS 분석으로 발효두유의 물질을 측정하였다.

그 결과, 순창 지역에서 구입한 3종의 청국장의 항돌연변이 효과를 살펴본 결과, K-청국장의 효과가 M-, H-청국장에 비해 우수하였다.

항암 효과를 살펴보았을 때 K-청국장이 다른 시료에 비해 암세포 성장 저해 효과가 뛰어난 것을 볼 수 있었으며, 이것은 아폽토시스 관련 Bcl-2 family 인자의 조절에 의한 것으로 나타났다.

발효두유 제조에 사용될 Bacillus균을 K-청국장에서 분리 동정한 결과, B. subtilis(서열번호 1), B. amyloliquefaciens(서열번호 2) 및 B. cereus(서열번호 3)로 동정되었다.

B. cereus균은 모든 종이 병원성 균은 아니지만 안전성에 문제가 될 수도 있으므로 앞으로 청국장을 제조할 때는 일본의 낫토처럼 starter culture를 사용하는 것이 바람직할 것이다.

발효두유의 항돌연변이 효과를 살펴본 결과, 상업적으로 사용되고 있는 2종의 균으로 발효한 두유보다 K-청국장에서 분리한 B. subtilis로 발효한 두유가 더 강한 항돌연변이 효과를 나타내었다.

항암 효과 역시 K-청국장에서 분리한 균으로 발효한 두유가 더 뛰어난 효과를 나타내었으며, 이것은 아폽토시스 관련 Bcl-2 family와 세포 사이클 관련 p53 및 p21 인자들의 조절에 의한 것으로 나타났다.

발효두유의 항암기능성을 증진시키기 위하여 마늘 추출물을 첨가하여 발효두유를 제조하였다. 암세포 성장 저해 효과를 비교해 본 결과, 마늘첨가 발효두유가 그냥 발효두유에 비해 더 높은 저해율을 나타내었다.

두유의 발효 전후 물질 변화를 알아보기 위해 LC-MS 분석을 수행하였다. 발효 전과 비교했을 때, 발효 후에 변화되는 여러 피크들을 관찰할 수 있었고, 이들은 Bacillus균이 생성한 프로테아제에 의해 분해된 펩타이드류로 생각된다.

이로부터 K-청국장에서 분리한 대표적인 균주 3종은 B. subtilis, B. amyloliquefaciens 및 B. cereus였으며, 이 중 B. subtilis로 발효한 두유는 다른 균으로 발효한 두유와 비교했을 때 항암 효과가 더 높았으며, 또한 발효 전 두유와 비교했을 때도 효과가 더 높아지는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 발효에 관여한 Bacillus균에 의한 물질변화나 생성된 대사산물 때문인 것으로 생각된다.

본 발명에 따른 청국장 분리 균주를 이용하여 제조된 발효두유는 항돌연변이 효과가 우수하고, 아폽토시스 관련 Bcl-2 family와 세포 사이클 관련 p53 및 p21 인자들의 조절에 의해 항암 효과가 우수하며, 마늘 추출물이 추가로 첨가된 발효두유 또한 암세포 성장 저해 효과가 우수하여, 본 발명의 발효두유는 그 자체로 암 예방, 치료 및 개선 효과를 발휘할 수 있을 뿐만 아니라, 암 예방, 치료 및 개선을 위한 약제학적 조성물 및 건강기능식품 조성물의 원료로서 이용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 발효두유의 제조과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 발효두유의 항돌연변이 시험 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 3은 MTT 분석법을 이용한 세포독성 분석과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 4는 MTT 분석에서 AGS 인체 위암세포의 생장에 대한 발효두유의 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 발효두유로 처리된 AGS 인체 위암세포에서 아폽토시스 바디의 모양을 나타낸 도이다.
도 6은 AGS 인체 위암세포에서 발효두유 2mg/mL 처리에 의한 Bax 유도 및 Bcl-2 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 AGS 인체 위암세포에서 발효두유 2mg/mL 처리에 의한 p53 및 p21의 유도 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 MTT 분석에서 HT-29 인체 결장암세포의 성장에 대한 발효두유의 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 발효두유로 처리된 HT-29 인체 결장암세포에서 아폽토시스 바디의 모양을 나타낸 도이다.
도 10은 HT-29 인체 결장암세포에서 발효두유 2mg/mL 처리에 의한 Bax 유도 및 Bcl-2 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 11은 MTT 분석에서 AGS 인체 위암세포의 생장에 대한 첨가물의 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 다양한 마늘 추출물 첨가량에 따른 발효두유의 관능평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 MTT 분석에서 AGS 인체 위암세포의 생장에 대한 마늘 추출물 첨가 발효두유의 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 마늘 추출물 첨가 발효두유로 처리된 AGS 인체 위암세포에서 아폽토시스 바디의 모양을 나타낸 도이다.
도 15는 AGS 인체 위암세포에서 마늘 추출물 첨가 발효두유 100 mg/mL 에 의한 Bax 유발 및 Bcl-2 저해 효과를 나타낸 도이다.
도 16은 MTT 분석에서 AGS 인체 위 선암종에 대한 다양한 균주를 이용한 발효두유의 저해 효과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 발효두유의 LC 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 18은 발효두유의 양성 이온 모드 LC-MS 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 19는 발효두유의 음성 이온 모드 LC-MS 프로파일을 나타낸 그래프이다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 청국장 시료의 제조

본 실시예에서는 전북 순창 고추장민속마을에서 전통적인 방법으로 생산되어 시판되고 있는 대표적인 청국장 제품 6종 (K-, M-, Mn-, O-, Os-, H-청국장)을 구입하여 이화학실험 및 관능평가를 실시한 후 선택된 K-, M-, H-청국장을 실험에 이용하였다. 청국장 시료는 동결건조한 후 마쇄하여 시료에 20배 (v/v)의 메탄올을 첨가하였다. 12시간 교반을 3회 반복하고 여과한 후 회전식 진공농축기 (EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Japan)로 농축하여 메탄올추출물을 얻었다. 이들 추출물을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 희석하여 실험에 사용하였다.

실시예 2 : Bacillus 균의 분리 및 동정

본 실시예에서는 멸균한 증류수에 10배 희석된 청국장 시료를 백금이로 취하여 nutrient agar plate (beef extract 3 g/L, peptone 5 g/L, agar 15 g/L)에 획선평판법으로 도말하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 생성된 콜로니 중에서 모양이 크고 선명한 것을 선별한 뒤, 다시 nutrient broth에 접종한 후 2차 배양하였다. 최종적으로 K-청국장 (순창 고추장민속마을 김용순 전통식품)에서 단일 균주 3종을 분리하였고, 이를 각각 KC-1, KC-2, KC-3로 명명하였다. 이들을 동정하기 위해 recA gene을 PCR로 증폭하여 각각의 서열을 얻었고(서열번호 1-3), 이 서열을 BLAST 상동성 검색(homology search)을 통하여 다른 균주와의 염기서열 상동성을 비교한 뒤 최종 동정하였다.

그 결과, KC-1은 B. subtilis recA gene과 98%의 일치성을 나타내어 최종적으로 B. subtilis로 동정되었다. KC-2는 B. amyloliquefaciens FZB42 균과 99%의 염기서열 상동성을 보여 B. amyloliquefaciens로 동정되었으며, KC-3은 B. cereus ATCC 14579 균과 99%의 상동성을 보여 B. cereus로 최종 동정되었다. 이들 중 B. subtilis를 2009년 3월 26일자로 한국미생물보존센터에 KCCM 42923호로 기탁하였다.

따라서, K-청국장에서 분리된 대표적인 균 3종은 B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. cereus이며, 이 균들은 모두 10⁷~10⁸/g 정도로 존재했으므로 K-청국장의 발효에 중심이 되는 미생물일 것으로 생각된다.

<표 1>

KC-1의 BLAST 상동성 검색 결과

<표 2>

KC-2의 BLAST 상동성 검색 결과

<표 3>

KC-3의 BLAST 상동성 검색 결과

실시예 3 : 발효두유의 제조

본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 청국장으로부터 분리, 동정한 균주를 이용하여 발효 두유를 제조하였다. 실험에 사용된 두유는 (주)동화식품 (경남 양산시 산막동)에서 구입한 것으로 국산콩을 원료로 첨가물이 들어가지 않은 순수두유이다. 구입한 두유는 오토클레이브에서 120℃로 15분간 가열처리하여 멸균한 후 식혀서 사용하였다. 발효두유 제조를 위해 두유에 접종한 바실러스 균주는 영양 브로쓰(nutrient broth) 배지에서 37℃로 24시간 배양하였다. 멸균된 두유에 바실러스 균의 영양분인 글루코오스를 두유의 1%로 (w/w)첨가하고, 배양된 균의 수가 10⁷~10⁸/g이 되도록 접종한 후 37℃에서 pH 5.5가 될 때까지 발효하였다.

실험예 1 : 발효두유의 항돌연변이 실험

D-Biotin, L-histidineHCl (monohydrate), D-glucose-6-phosphate (monosodi-um salt)와 NADP (sodium salt)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였으며, Bacto Nutrient broth (dehydrated)와 Bitek agar는 Difco Laboratories (USA)로 부터 구입하였다. 직접돌연변이 유발원으로 MNNG(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine; Aldrich Chemical Co.; USA)을 구입하여 멸균 증류수에 녹여 실험에 사용하였다. Salmonella typhimurium LT-2 히스티딘 영양요구성인 Sal-monella typhimurium TA100 은 한국미생물 보존센터에서 구입하여 실험에 사용하였다. 그리고 이들 실험균주들은 새로운 frozen permanent가 준비되었을 때나 매 실험 직전 히스티딘 요구성, rfa(deep rough) 돌연변이, uvrB 돌연변이, R 인자 등의 유전형질 등의 방법으로 확인하여 사용하였다.

실험은 전배양 시험(preincubation test)을 이용하였고, 0.5 mL의 인산 완충액 (직접 돌연변이원)에 하룻밤 배양한 균주 (1~2×10⁹ cells/mL) 0.1 mL, 희석시료 50 μL와 돌연변이 유발물질 50 μL을 빙조에 담긴 캡 튜브에 첨가하여 가볍게 복텍싱하고, 37℃에서 30분간 예비 배양하였다. 45℃의 탑 아가(top agar) 2 mL씩을 예비 배양한 각 튜브에 붓고 3초 간 볼텍싱하여 최소 글루코오스 아라 플레이트(minimal glucose agar plate)에 도말하고 37℃에서 48시간 배양한 복귀 돌연변이체(revertant) 숫자를 계수하였다. 돌연변이 억제효과의 정도 (inhibition rate)는 아래 식에 의해 계산하였다.

억제율(%) = 100 × [(a-b)/(a-c)]

여기서 a는 돌연변이원에 의해 유도된 복귀돌연변이 수, b는 시료를 처리하였을 때의 복귀돌연변이 수이며, c는 돌연변이원과 시료가 없을 경우의 자연복귀돌연변이의 수이다.

상기와 같은 방법으로, K-청국장에서 분리, 동정한 B. subtilis 균주와 한국미생물보존센터 (Seoul, Korea)에서 분양받은 B. subtilis KCCM 11316 균 (KCCM11316-F-SM)과 상업적으로 사용되고 있는 B. subtilis MYCO 10001 (Innobiz, MYCO, Gyeong Ju, Korea)균 (MYCO10001-F-SM)을 이용하여 발효두유를 제조하여 활성을 비교하였다. 발효두유의 직접돌연변이원인 MNNG에 대한 항돌연변이 효과는, 모든 시료에서 농도 의존적으로 항돌연변이 효과가 높아졌으며, 특히 K-청국장에서 분리한 균으로 발효한 두유가 1.25 mg/plate 농도에서 38%, 2.5 mg/plate 농도로 처리했을 때는 45%의 항돌연변이 효과를 나타내 다른 균으로 발효한 두유 시료들에 비해 더 높은 항돌연변이 효과를 나타내었다.

실험예 2 : 발효두유의 항암실험

1) 암세포 배양

세포배양을 위해 RPMI 1640, fetal bovine serum (FBS), 0.05% Trypsin-0.02% EDTA 그리고 100 units/mL penicillin-streptomycin을 GIBCO (USA)로부터 구입하여 사용하였다. 세포배양은 5% CO₂ incubator (Forma, model 311 S/N29035, USA)를 사용하였다.

실험에 사용한 암세포로는 AGS 인체 위암 세포 (AGS human gastric adenocarcinoma cell)와 HT-29 인체 결장암 세포 (HT-29 human colon carcinoma cell)는 한국 세포주 은행 (서울의대)으로부터 분양받아 배양하면서 실험에 사용하였다.

AGS 인체 위암 세포와 HT-29 인체 결장암 세포는 100 units/mL penicillin-streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 RPMI 1640을 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2-3회 refeeding하고 6-7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% Trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리 하였다. 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합한 후 cell culture flask에 10 mL씩 일정 수 분할하여 주입하고 계속 6-7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.

2) MTT 분석

MTT 분석은 생존 암세포의 효소작용에 의해 MTT가 환원되어 포르마잔 결정으로 침전되는 정도를 흡광도로 측정하여 암세포가 사멸 또는 증식 억제되는 정도를 확인하는 실험법이다. 배양된 암세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 1×10⁴ cells/mL가 되도록 180 μL씩 분주하고, 시료를 일정 농도로 20 μL 첨가한 후 37℃, 5% CO₂배양기에서 72시간 배양하였다. 여기에 PBS(phosphated buffered saline)에 5 mg/mL의 농도로 제조한 MTT[3-(4,5-dimethyl-thiazol)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 용액 20 μL를 첨가하여 동일한 배양 조건에서 4시간 동안 배양하였다. 이때 생성된 포르마잔 결정을 DMSO에 녹여서 ELISA 리더기로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다 (도 6).

대조구 -시료처리구의 흡광도

세포독성(%) = --------------------------------- X 100

대조구의 흡광도

3) 혈구 계산기(Hematocytometer)를 이용한 세포 성장률의 측정

세포배양용 6 well plate에 1×10⁵ cells/mL의 농도로 세포를 분주하고 24시간 동안 안정화시킨 후, 시료를 48시간 동안 처리하였다. 준비된 세포를 PBS 용액으로 수세한 후, 프리판 블루(trypan blue)로 염색하였다. 이를 혈구 계산기에 옮긴 후 위상차 현미경 (× 200) 하에서 살아있는 세포의 수를 측정하였다.

4) DAPI 염색을 통한 핵의 관찰

시료의 처리에 의한 암세포의 생존 및 성장률 저해효과가 아폽토시스 유발에 의한 것인지 확인하기 위해 암세포 핵의 형태 변화를 관찰하였다. 시료가 처리된 세포들을 PBS로 수세하고 3.7% 파라포름알데하이드로 상온에서 10분간 고정시킨 후 형광 염색물질인 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 용액을 이용하여 10분간 염색하였다. 이들 세포를 다시 PBS로 2회 수세한 후 광학현미경 (Olympus BX50, Japan)을 이용하여 핵의 형태 변화를 정상군과 비교하였다.

5) RT-PCR 분석

동일한 조건에서 준비된 암세포를 대상으로 트리아졸을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 올리고 dT 프라이머(Oligo dT primer)를 사용하면 분리한 RNA 중 mRNA가 모두 cDNA로 만들어지기 때문에 분리된 RNA를 정량한 후, 올리고 dT 프라이머와 AMV 역전사효소를 이용하여 2 μg의 RNA에서 mRNA에 상보적인 ss cDNA로 역전사되었다. 이 cDNA를 템플릿으로 사용하여 Bax, Bcl-2, Bcl-xL, p53, p21 유전자를 PCR 방법으로 특정 유전자 부위를 증폭하였다(표 4 참조). 이때 내부 대조군으로 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 사용하였다. 각 PCR 산물들을 1% 아가로스겔을 이용하여 전기영동하고 EtBr(ethidium bromide, Sigma, USA)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.

<표 4>

6) 통계분석

대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석 (ANOVA)을 행한 후 p<0.05 수준에서 던컨 다중 범위 시험(Duncan's multiple range test)를 실시하였으며, 그 결과는 평균 (Mean) ± 표준편차 (Standard deviation, SD)로 표시하였다. 모든 통계 분석은 통계프로그램(Statistic Analysis System; v9.1 SAS Institute Inc. NC, USA)을 이용하여 처리하였다.

실험예 2-1 : AGS 인체 위암세포에 대한 발효두유의 항암효과

1) 항암효과

AGS 인체 위암세포를 이용하여 두유 (Unfermented soymilk : Un-F-SM) 및 발효두유 (B. subtilis-F-SM, MYCO10001-F-SM, KCCM11316-F-SM) 시료를 처리한 암세포의 성장 저해 효과를 알아보았다 (도 7). 1 mg/mL의 농도에서 Un-F-SM, B. subtilis-F-SM, MYCO10001-F-SM, KCCM11316-F-SM은 각각 33%, 42%, 24%, 46%의 암세포 성장 저해율을 나타내었다. 따라서 KC에서 분리된 B. subtilis로 발효한 두유가 가장 효과가 뛰어났으며, 또한 발효두유가 발효과정을 거치지 않은 두유보다 암세포 성장 저해효과가 우수한 것을 알 수 있었다.

<표 5>

¹평균±S.D.

² 첨자 표시한 값은 억제율(%)을 나타냄.

^a~e동일 컬럼에서 상이한 문자로 나타낸 것은 던컨 다중 범위 시험에 의한 유의적 차이를 나타냄(p<0.05).

³Un-F-SM : 미발효 두유

⁴⁾ B.subtilis-F-SM : KC 유래 B. subtilis 로 발효시킨 두유

⁵⁾KCCM11316-F-SM : KCCM 유래 B. subtilis 로 발효시킨 두유

⁶⁾MYCO10001-F-SM : INNOBIZ MYCO 유래 B. subtilis 로 발효시킨 두유

따라서 AGS 세포에 대한 암세포 증식 저해 효과가 더 높은 것은 Bacillus가 생성한 발효산물에 의한 것이라고 사료되며, B. subtilis의 발효산물도 항암효과를 가지는 것으로써 발효두유의 암세포 증식 저해 효과가 크게 나타난 것은 발효에 참여한 균주와 발효산물의 영향이라고 생각된다.

(2) 아폽토시스 유도 효과

암세포 성장 저해 효과 실험 결과를 통하여 발효두유가 두유보다 효과가 더 높은 것을 알 수 있었다. 이러한 발효두유의 암세포 성장 저해 효과가 아폽토시스와 연관이 있는지를 알아보기 위해 DAPI 염색을 통해 세포핵의 형태를 관찰하였다. 정상 배지에서 자란 AGS 세포 (control)는 핵의 형태가 모두 정상적이었으나, 시료를 처리한 세포에서는 아폽토시스 바디가 나타나는 것을 관찰할 수 있었다(도 8). 또한 B. subtilis-F-SM을 처리한 배지에서 자란 AGS 세포에서는 Un-F-SM을 처리한 세포에서 보다 아폽토시스 바디의 생성이 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 두유와 발효두유의 암세포 성장 억제 효과는 아폽토시스에 의한 것으로 사료된다.

(3) Bcl-2 family의 발현에 비치는 영향

발효두유를 처리한 암세포의 아폽토시스 유발이 Bcl-2 family의 발현과 연관이 있는지를 알아보기 위하여 Bcl-2와 Bax 유전자의 발현을 조사하였다. Fig. 14에서 나타난 바와 같이 아폽토시스 억제와 관련이 있는 Bcl-2의 발현은 Un-F-SM과 B. subtilis-F-SM을 처리한 암세포에서 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 감소하였고, B. subtilis-F-SM의 감소 정도가 Un-F-SM에서 보다 뚜렷한 것을 볼 수 있었다. 한편 아폽토시스 유발과 관련이 있는 Bax는 시료를 처리한 암세포에서 대조군에 비하여 그 발현이 뚜렷하였으며, Un-F-SM의 발현은 B. subtilis-F-SM의 발현 정도 보다 적게 증가하였다. 발효두유 처리에 의한 Bcl-2 유전자의 발현 감소와 Bax 유전자의 발현 증가는 아폽토시스 유발과 관련성이 있는 것으로 보이며, 이것은 발효두유가 이들 유전자의 발현을 조절하여 아폽토시스를 일으켜 암세포 증식을 억제하는 것으로 생각된다.

(4) p53 및 p21 유전자의 발현 증가

종양 억제 유전자인 p53과 p21의 발현에 미치는 영향에서는 Fig. 15에서 보는 것과 같이 시료를 처리한 암세포는 대조군에 비해 p53과 p21의 발현이 모두 증가되었다. 그리고 B. subtilis-F-SM을 처리한 암세포가 Un-F-SM을 처리한 암세포에 비해 이들 유전자의 발현이 더 증가된 것을 볼 수 있었다. 그러므로 p53, p21 유전자의 발현에도 영향을 끼쳐 암세포의 증식을 억제해 항암효과가 나타나는 것으로 보인다.

실험예 2-2 : HT-29 인체 결장암세포에 대한 발효두유의 항암 효과

1) 항암효과

HT-29 인체 결장암세포를 이용하여 발효두유의 항암효과를 알아보기 위하여 MTT 분석을 실시하였다. 1 mg/mL의 농도에서 Un-F-SM, B. subtilis-F-SM, MYCO10001-F-SM, KCCM11316-F-SM은 각각 24%, 44%, 33%, 27%의 암세포 성장 저해율을 나타내었다. 따라서 AGS 세포에서의 결과와 같이 KC에서 분리된 B. subtilis로 발효한 두유가 가장 효과가 뛰어났으며, 또한 발효두유가 발효과정을 거치지 않은 두유보다 암세포 성장 저해효과가 우수한 것을 알 수 있었다. 따라서 두유는 발효과정에 의해 항암 증진 효과를 나타내는 것으로 사료되어진다.

(2) 아폽토시스 유도 효과

HT-29 세포에서 핵의 형태 변화를 관찰한 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군에서는 핵의 형태가 모두 정상적이었다. Un-F-SM 군에서는 아폽토시스 바디의 생성을 관찰할 수 없었고, B. subtilis-F-SM 군에서는 아폽토시스 바디의 생성을 볼 수 있었다 (도 9). AGS 세포에서의 결과와 같이 발효두유는 아폽토시스에 의해 암세포의 성장을 저해하는 것으로 나타났다.

(3) Bcl-2 family의 발현에 비치는 영향

발효두유를 처리한 암세포의 아폽토시스 유발이 bcl-2 family의 발현과 연관이 있는지를 알아보기 위하여 HT-29 인체 결장암세포에서 Bcl-2와 Bax 유전자의 발현을 조사하였다. 도 10에 나타난 바와 같이 아폽토시스 억제와 관련이 있는 Bcl-2의 발현은 Un-F-SM, B. subtilis-F-SM을 처리한 암세포에서 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 뚜렷이 감소하였고, B. subtilis-F-SM이 Un-F-SM보다 감소 정도가 강한 것을 볼 수 있었다. 한편 아폽토시스 유발과 관련이 있는 Bax는 시료를 처리한 암세포에서 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 그 발현이 증가하였으며, Un-F-SM의 발현은 B. subtilis-F-SM의 발현 정도 보다 적게 증가하였다.

실험예 3 : 항암기능성 증진 발효두유의 관능성 및 항암 효과

실험예 3-1 : 기능성 증진 첨가물의 항암 효과 비교

발효두유는 발효에 의해 두유보다 항암효과가 더 우수해지는 것으로 나타났고, 발효두유의 항암 기능성을 더욱 증진시키기 위하여 부재료를 첨가하기로 하였다. 마늘, 강화사자발쑥, 산수유, 자색고구마 추출물 중에서 첨가물을 선정하기 위해 AGS 인체 위암세포에 대한 항암효과를 비교하였다(도 11). 각각의 추출물을 0.5 mg/mL의 농도로 세포에 처리하였을 때, 마늘, 강화사자발쑥, 산수유, 자색고구마는 각각 45%, 12%, 9%, 15%의 저해율을 나타내 마늘을 항암 기능성이 증진된 발효두유의 첨가물로 선정하였다.

실험예 3-2 : 마늘 첨가량에 따른 관능평가

항암 기능성이 증진된 발효두유를 개발하기 위해 첨가할 마늘 추출물의 양을 결정하기 위하여 관능평가를 실시하였다(도 12). 첨가량을 두유의 1%, 5%, 7%, 10%로 달리하였을 때, 첨가량이 많아질수록 관능성이 좋아지는 결과를 나타내었다. 특히, 10%를 첨가했을 때가 모든 항목에서 가장 높은 점수를 나타내었다. 마늘추출물이 콩에서 날 수 있는 비린내와 발효두유의 이취를 제거해주고, 또 단맛도 있어 첨가량이 많았을 때 관능이 좋아지는 결과가 나타난 것으로 생각된다. 그러므로 마늘 추출물을 두유의 10%로 하여 발효두유를 제조하는 것이 관능성이 가장 좋을 것으로 나타났다.

실시예 3-3 : 마늘 첨가 발효두유의 AGS 세포에서의 항암 효과

(1) 암세포 성장 저해 효과

마늘 첨가 발효두유의 암세포 성장 저해 효과를 알아보기 위하여 MTT 분석을 수행하였다(도 13). 특히 발효두유에 첨가한 동량의 마늘 추출물을 세포에 처리하여 발효두유에 마늘을 첨가하였을 때와 마늘만을 처리했을 때의 저해율을 비교하였다. 50 μL/mL의 농도에서 두유는 21%, 발효두유는 27%의 저해율을 나타내었다. 그리고 발효두유에 5%의 마늘 추출물을 첨가하였을 때는 31%, 10%를 첨가하였을 때는 60%의 저해율을 보였다. 그러므로 마늘 추출물을 첨가하였을 때 발효두유의 암세포 성장 저해 효과가 더욱 증진되는 것으로 나타났다. 발효두유의 5%와 10%에 해당하는 마늘 추출물만을 처리하였을 때의 저해율은 각각 23%, 38%로 마늘을 첨가한 발효두유보다 낮았다. 100 μL/mL의 농도에서도 같은 결과를 나타내었다. 그러므로 마늘 추출물만을 섭취하는 것보다 발효두유에 섞어 섭취하는 것이 항암 효과가 더 높아질 것으로 사료된다.

(2) 아폽토시스 유도 효과

세포의 성장억제 기전으로 가장 중요하게 연구되고 있는 분야는 아폽토시스에 의한 암세포의 세포사멸 기전이다. 앞의 실험 결과에서 마늘 첨가 발효두유가 그냥 발효두유보다 항암 효과가 증진되는 것을 알 수 있었다. 마늘 첨가 발효두유의 암세포 성장 저해 효과는 아폽토시스에 의한 것으로 추측되어 DAPI 염색을 통해 핵의 형태를 관찰하였다. 정상 배지에서 자란 AGS 인체 위암세포(대조군)는 핵의 형태가 모두 정상적이었으나, 시료를 처리한 세포에서는 아폽토시스 바디가 나타나는 것을 관찰할 수 있었다(도 14). 마늘 첨가 발효두유에서는 더 많은 아폽토시스 바디가 생성되었다. 따라서 마늘 첨가 발효두유의 항암효과는 아폽토시스 유발에 의한 것이라 사료된다.

(3) Bcl-2 family의 발현에 미치는 영향

마늘 첨가 발효두유에서 아폽토시스 바디의 생성이 Bcl-2 family의 발현 조절과 연관이 있는지 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 도 15에서 나타난 것과 같이 아폽토시스 유발과 관련 있는 Bcl-2의 발현은 대조군에 비해 시료를 처리한 군에서 감소되었으며, 특히 마늘 첨가 발효두유에서 더욱 감소되는 것을 볼 수 있었다. 반면 아폽토시스 억제와 관련 있는 Bax의 발현은 시료를 처리한 군에서 대조군에 비해 증가되었으며, 특히 10% 마늘 첨가 발효두유 군에서는 그 발현이 현저히 증가된 것을 볼 수 있었다.

실험예 4 : 여러 균주를 이용한 발효두유의 항암효과

두유의 기능성을 증진시키기 위하여 B. subtilis가 아닌 다른 균주들을 이용하여 발효두유를 제조한 뒤 항암효과를 비교해 보았다(도 16 참조). 발효두유 제조에는 K-청국장에서 분리된 B. amyloliquefaciens(Ba)와 일반 요구르트 제조에 많이 사용되는 Lactobacillus acidophilus(La)를 사용하였다. 그리고 혼합균주를 사용했을 때의 효과도 알아보기 위하여 B. subtilis +B. amyloliquefaciens, B. subtilis +Lab. acidophilus를 이용하여 발효두유를 제조하였다.

각각의 시료를 AGS 인체 위암세포에 100 μL/mL의 농도로 처리한 뒤 세포의 성장이 대조군에 비하여 얼마나 저해 되었는지 비교하였다. 그 결과, B. subtilis 발효두유 (Bs)가 75%의 저해율로 가장 높은 항암 효과를 나타내었으며, Ba는 72%, La는 57%를 나타냈다. 그리고 Bs +Ba는 69%, Bs +La는 51%의 저해효과를 보였다. 따라서 두유 발효에는 유산균보다 청국장에서 분리된 균을 사용하는 것이 가장 항암 효과가 높아지는 것으로 나타났다. 그러므로 유산균이 발효유에서 항암 효과가 있지만 발효두유에서는 두유의 원료가 청국장과 같은 대두이므로 청국장에서 분리한 Bacillus균이 두유의 발효에 있어 영양성분들을 잘 이용하여 더 좋은 효과를 나타내는 것이라 생각된다. 혼합 균주를 사용하여 제조한 발효두유보다 단일 균주로 발효한 두유가 암세포 성장 저해율이 더 높았으므로 발효두유 제조에는 단일 균주를 사용하는 것이 항암 기능성을 더 증진시킬 것이라 생각된다.

실험예 5 : LC-MS 분석을 이용한 발효두유의 활성 물질 비교

발효두유가 발효하지 않은 두유보다 항암 효과가 더 뛰어난 것으로 나타나 이러한 발효두유의 항암 효과는 발효과정 중에 변화되거나 생성된 물질들에 의한 것으로 생각되어 발효두유가 발효하기 전 두유와 비교했을 때 어떠한 물질의 변화가 있었는지 알아보기 위해 LC-MS 분석을 이용해 비교해 보았다.

도 17에 나타낸 바와 같이, LC 데이터에서는 모든 시료에서 같은 시간대에 여러 개의 피크들을 관찰할 수 있었고, 이들은 콩의 플라보노이드 류가 추출된 것으로 생각된다. 특히 발효 전 두유와 발효두유를 비교했을 때, 9.43 min 피크는 약간 감소하였고 5.11과 11.83 min 피크는 증가된 것을 볼 수 있었다. 이러한 피크들의 변화는 발효에 의해 물질들의 변화가 나타난 것으로 사료된다.

도 18 및 19에 나타낸 바와 같이, MS 데이터에서는 시료 간의 차이를 좀 더 명확하게 관찰 할 수 있었다. 특히 도 19을 보면 발효 전 두유의 MW 294는 감소되고, MW 734, 786, 828, 873이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 이 피크들은 모두 발효에 사용된 B. subtilis가 생산하는 프로테아제에 의해 분해된 펩타이드로 예상된다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM42923

20090326

<110> Institute for research and industry cooperation of Busan University <120> Fermented Soybean Milk for the Treatment and Prevention of Cancer Prepared by Using the Strain from Chungukjang <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 694 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of recA gene from B. subtilus KC-1 <400> 1 atacagaatt tctactgtcc caagcggctc cctcgctctt gatacagcac tgggaattgg 60 cggatatcct cgcggacgga ttattgaagt atacggtcct gaaagctcag gtaaaacaac 120 tgtggcgctt catgcgattg ctgaagttca gcagcagggc ggacaagccg cgtttatcga 180 tgcggagcat gcgttagatc cggtatacgc gcaaaagctc ggtgttaaca tcgaagagct 240 tttactgtct cagcctgaca caggcgagca ggcgcttgaa attgcagaag cattggttcg 300 aagcggggca gttgacattg tcgttgtcga ctctgtagcc gctctcgttc cgaaagcgga 360 aattgaaggc gacatgggag attctcatgt cggtttacaa gcacgcttaa tgtctcaagc 420 gcttcgtaag ctttcaggag ccattaacaa atcgaagaca atcgcgattt tcattaacca 480 aattcgtgaa aaagtcggcg ttatgttcgg gaacccggaa acaactcctg gcggccgtgc 540 gttgaaattc tactcttccg tgcgtcttga agtgcgccgt gctgaacagc tgaaacaagg 600 caacgacgta atggggaaca aaacgaaaat caaagtcgtg aaaaacaagg tggctccgcc 660 gttccgtaca gccgaggttg acattatgta cgga 694 <210> 2 <211> 696 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of recA gene from B. amyloliquefaciens KC-2 <400> 2 ggatacagaa tttcaacggt gccagcggtt cccttgcact tgataccgct ctcggaatag 60 gcggataccc gcgcggacgg attattgaag tatacggacc tgaaagctca ggtaaaacga 120 ctgtagcgct tcatgcaatc gctgaggttc aggaaaaagg cggacaggca gcatttattg 180 atgctgagca tgctcttgat cctgtttacg cgcaaaagct cggtgtcaat atcgaagagc 240 ttctgctttc tcagccggat acgggagagc aggcgctaga gattgctgaa gcgctggtgc 300 gaagcggagc tgttgatatc gtagtcgttg actctgttgc ggcgcttgtt ccaaaagctg 360 aaattgaagg tgacatgggt gattcacacg tcggtttaca ggcgcgtctc atgtctcagg 420 cgctccgtaa gctttccggc gccatcaata aatctaaaac aatcgcaatc tttattaacc 480 agattcgtga aaaagtcggc gttatgttcg gaaatccgga gacgacaccg ggcggccgcg 540 cgctgaaatt ctattcttcc gtgcgccttg aagtgcgccg tgccgagcaa ttaaagcagg 600 gcaacgacgt catggggaat aaaacgagaa ttaaagtcgt aaaaaacaaa gtcgctcctc 660 cgttccgtac ggctgaagtg gacattatgt acggtg 696 <210> 3 <211> 676 <212> DNA <213> Nucleotide sequence of recA gene from B. cereus KC-3 <400> 3 ttctacagtt tctagtggtt ctttagcact tgatgtggca ctaggggtag gcggatatcc 60 acgtggccgt attatcgaaa tttacggacc tgaaagttca ggtaaaacga cgtttcatta 120 catgcaattg cagaagtaca acgtcaaggt ggacaagcag cattcatcga tgcggagcac 180 gcaatggatc ctgtatatgc acaaaaatta ggcgttaaca tagatgaatt actattatca 240 cagcctgata caggggagca aggattagaa atcgcggaag cacttgtacg aagtggtgcg 300 gttgacatta tcgtaattga ctctgtagca gctcttgtac cgaaagcaga gattgaaggc 360 gacatgggtg actcacacgt aggtttacaa gcacgtttaa tgtcacaagc acttcgtaag 420 ctttcaggag caatcaacaa atcaaaaaca attgcaatct ttattaacca aattcgtgaa 480 aaagttgggg ttatgttcgg aaacccagaa acaactccag gtggtcgtgc gttgaaattc 540 tattcaactg tccgtcttga agtgcgtcgt gcggagcaat taaagcaagg taacgacatc 600 gttggtaata aaacaaaagt aaaagtagtg aaaaataaag tagcaccacc attccgtgtt 660 gctgaagttg atatta 676

Claims

청국장 분리 균주를 이용하여 제조된 암 예방 및 치료용 발효두유.
제1항에 있어서, 상기 청국장 분리 균주는 B. subtilis(서열번호 1), B. amyloliquefaciens(서열번호 2) 또는 B. cereus(서열번호 3)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합 균주인 것을 특징으로 하는 발효두유.
제1항에 따른 발효두유에 마늘 추출물을 첨가한 암 예방 및 치료용 발효두유.
제3항에 있어서, 상기 마늘 추출물은 전체 발효두유에 대하여 1 내지 10중량%의 양으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 발효두유.
제1항에 따른 발효두유를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 따른 발효두유를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물.