KR20110085091A

KR20110085091A - 티―사포닌 ｅ１을 유효성분으로 함유하는 신생혈관억제용 조성물

Info

Publication number: KR20110085091A
Application number: KR1020100004697A
Authority: KR
Inventors: 김종덕
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2010-01-19
Filing date: 2010-01-19
Publication date: 2011-07-27
Also published as: KR101132739B1

Abstract

본 발명의 녹차 씨앗 추출물로부터 분리 정제한 하기 [화학식 1]의 구조를 갖는 티―사포닌 Ｅ１(tea―saponin Ｅ１)은 혈관형성 촉진인자들을 억제하여 신생혈관 형성의 억제 효과를 나타내고 항암 활성을 나타내며, 세포독성이 없으므로, 신생혈관 억제제 및 항암제, 신생혈관억제 질환 및 암 질환 관련 예방 및 개선용 건강식품의 조성물로 유용하게 사용될 수 있다:
[화학식 1]

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Description

티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는 신생혈관억제용 조성물{Composition for the Anti―Angiogenesis containing tea―saponin Ｅ１ as an effective ingredient}

본 발명은 혈관신생 억제작용을 갖는 저독성 천연산물 유래 물질을 함유하는 신생혈관억제용 조성물에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)은 기존의 혈관에서 새로운 혈관이 생성되는 일련의 과정을 일컫는 용어로서, 태아의 발생, 여성의 월경, 상처 치유과정 등의 정상적인 상황, 및 암세포 및 비만세포의 성장과 류머티즘 관절염, 당뇨성 실명증 등의 여러 질병에서도 필수적으로 요구되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이는 정상적인 조건하에서는 거의 일어나지 않는 매우 엄격히 조절되는 현상이다. 즉, 정상적인 상태에서 생체는 혈관신생을 유도하는 인자들과 억제하는 인자들이 평형을 이루고 있으나, 질환이 유발되는 상황에서는 혈관성장을 촉진하는 인자들이 증가하거나, 억제하는 인자가 제대로 작용하지 못하여 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 계속 성장함으로써 질환으로 발전한다.

혈관신생의 형성은 현재까지 20가지 이상의 혈관형성 촉진인자에 의해 촉진되는 것으로 알려졌으며, 그 중 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 많은 종류의 종양세포에서 분비되며, 동시에 가장 강력한 혈관형성 촉진인자로 알려져 있다(Leung DW et al ., Science 246:1306-1309, 1989; Ferrara N & Davis-Smyth T Endocr . Rev . 18:4-25, 1997; Liping Liu & Meydani Mohsen Nutrition Review, 61(11):384-387, 2003; Jaap G et al ., The FASEB Journal 10.1096/fj.03-1101fje. 2004; Hausman GJ & Tichardson RL, J. anim . Sci., 82:925-934, 2004; KIM,J.D. et al,.J. Nutrition . Biochem. 17:165-176, 2006; LIM, J.K. et al,. J. Microbiol . Biotech . 16:1544-1553, 2006).

특히, 암 형성에 중요한 역할을 하는 혈관신생은 암 조직에 산소와 영양분을 빠른 시간 내에 공급함으로써 암조직의 성장을 직접적으로 도와준다. 따라서 신생 혈관의 형성을 억제함으로써 어떠한 조직에 새로운 혈관의 형성을 억제하면 암 조직이 성장하는 것을 막을 수 있다는 추론이 가능하다.

티―사포닌(tea―saponin)은 산차과 식물의 종자에서 추출한 일종의 당분식 화합물이며 사포닌종에 속하는 천연의 표면활성제로서, 소염, 진통, 거담, 항균, 항비만 및 항염증 작용 등과 같은 약리적인 작용도 나타낸다. 이 외에도 차 종자유를 추출하고 남은 종자박에는 다량의 티―사포닌이 함유되어 있어 특정 어류나 해충에 대해 살충 작용을 나타내기 때문에, 새우 양식장에서는 새우를 잡아먹는 고기를 없애기 위해 티―사포닌이 다량 함유된 종자박을 사용하고 있다. 최근에는 차 종자박의 티―사포닌 성분이 습윤성, 거품발생 능력, 분산성 등이 뛰어나 샴푸 제조에 널리 이용하고 있는데, 예로부터 티―사포닌으로 머리를 감으면, 머릿결이 부드러워지고 광택이 나며 비듬 제거와 가려움증 등이 없어지는 것으로 알려져 있다. 또한, 티―사포닌은 세척 모방직, 침직, 의약 및 일용화 공업 등의 생산에 광범위하게 응용되고 있을 뿐 아니라, 고체형 농약중에서 윤활제와 현부제 작용을 하며 크림 기름형 농약중에서 증효제 등 작용을 하여 생물농약으로도 직접 사용할 수 있다. 그러나, 티―사포닌의 신생혈관억제 효과를 이용한 조성물로의 사용은 아직까지 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 녹차 씨앗 추출물로부터 분리 정제한 티―사포닌 Ｅ１(tea―saponin Ｅ１)의 신생혈관 형성 억제 기전과 효과를 확인하고, 상기 효과에 의한 암세포 증식 억제 효과를 암세포주 뿐 아니라 생체 내에서도 확인하고, 세포독성 역시 거의 없음을 확인함으로써, 티―사포닌 Ｅ１을 신생혈관형성 억제 및 항암용 조성물의 유효성분으로 유용하게 상용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 녹차 씨앗 추출물에서 분리한 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 [화학식 1]의 구조를 갖는 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는 신생혈관형성 억제용 조성물을 제공한다:

또한, 본 발명은 상기 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는, 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는 신생혈관형성 관련 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 녹차 씨앗 추출물에서 분리한 티―사포닌 Ｅ１은 신생혈관형성 억제 및 항암 활성에 뛰어난 효과를 가지고 있는 저독성의 천연산물 유래물질로서, 신생혈관 억제제 및 항암제, 신생혈관억제 질환 및 암 질환 관련 예방 및 개선용 건강식품의 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1-5는 13C-NMR data를 나타내는 그래프이다..
도 6은 H(proton) NMR data를 나타내는 그래프이다.
도 7 및 8은 proton NMR의 peak data를 나타내는 그래프이다.
도 9는 혈관신생의 억제에 의하여 암세포가 죽어가는 과정을 나타낸 그림이다.
도 10은 티―사포닌 Ｅ１의 신생혈관 저해 효과를 EGCG(epigallocatechin gallate, 에피갈로카테킨 갈레이트)와 비교한 그래프이다.
도 11은 티―사포닌 Ｅ１ 4종류의 신호전달 분자, 즉 VEGFR2(VEGF receptor2), 베타카테닌(β-catenin), PI3-키나아제(PI3-Kinase) 및 VE-캐더린(vascular epithelium-cadherin)의 저해 효과를 웨스턴 블랏으로 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.
도 12는 티―사포닌 Ｅ１ 농도에 따른 위암세포, 자궁암세포, 간암세포, 유방암세포의 감소를 나타낸 그래프이다.
도 13은 티―사포닌 Ｅ１ 투여에 의한 위암, 자궁암, 간암, 유방암 암조직의 감소를 나타낸 사진이다.
도 14는 HUVECs(Human Umbilical Vein Endothelial Cells : 사람태반세포)의 티―사포닌 Ｅ１에 대한 독성시험 결과이다.
도 15은 녹차씨앗의 에탄올 추출물을 동결건조한 후 다시 부탄올 용액에 녹여 HPLC로 분획한 그림이다.
도 16은 부탄올 추출물을 피크별로 분취하여 신생혈관형성 억제작용 시험을 수행한 결과를 나타낸 그림이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기의 [화학식 1]의 구조를 갖는 티―사포닌 Ｅ１(tea―saponin Ｅ１)을 유효성분으로 함유하는 신생혈관형성 억제용 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

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상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１은 녹차의 꽃이 핀 후에 형성된 열매로부터 추출되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 녹차 씨앗은 녹차 잎과는 역할 및 특성이 다르고, 항산화력에 있어서 더 우수한 특성을 나타낸다. 항산화력은 2,4,6―트리[2-피리딜]―s―트리아진(TPTZ)(Fluka, Swisszland), 300 mM 아세테이트 버퍼(pH 3.6), 40 mM HCl, 20 mM 염화철을 사용한 FRAP(ferric reducing ability assay of plasma)법으로 측정하였으며, 1 unit은 mM Fe(Ⅱ)／L 으로 나타낸 값이다. 다른 식물들과 더불어 항산화력을 측정한 결과, 녹차 씨앗에서 추출한 티―사포닌 Ｅ１은 녹차 잎의 주성분인 EGCG보다 항산화력이 우수한 것으로 나타났다. 상기 항산화력 효과에서 볼 수 있듯이 녹차 잎과 녹차 씨앗은 그 성질이 매우 다른 것으로 상기 티―사포닌 Ｅ１은 녹차 잎보다도 월등한 효과를 나타내었다. 따라서 녹차 씨앗은 녹차 잎과는 다른 역할을 하는 것을 알 수 있다.

상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１은 녹차 씨앗으로부터 에탄올을 이용하여 추출한 추출물을 부탄올에 용해시켜 prep HPLC로 분액을 취한 후, 신생혈관형성 억제 실험을 행하여 효과가 있는 Ｂ２―분액을 순수하게 정제하였고, 이후 NMR을 수행하여 그 구조를 밝혔다(도 1 내지 도 8 참조).

상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１의 신생혈관형성 억제효과를 확인하기 위하여, HUVECs(Human Umbilical Vein Endothelial Cells : 사람태반세포)에 상기 티―사포닌 Ｅ１을 용량별로 투여하여 4시간 동안 배양한 후, 형성된 튜브 망의 길이를 현미경하에서 디지탈 카메라로 촬영하여 그 영향을 픽셀로 전환시킨 후, NIH 이미지 프로그램으로 분석하였다. 그 결과, 티―사포닌 Ｅ１이 같은 농도의 녹차 잎의 주성분인 EGCG에 비해 현저히 우수한 신생혈관형성 억제효과를 나타냄을 확인하였다(도 10 참조).

상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１의 신생혈관형성 억제기전을 확인하기 위하여, 4종류의 신호전달 분자, 즉, VEGFR2(VEGF receptor2), 베타카테닌(β-catenin), PI3-키나아제(PI3-Kinase) 및 VE-캐더린(vasicular epithelium-cadherin)에 어떠한 작용을 하는지 웨스턴 블랏으로 알아보았다. 상기 티―사포닌 Ｅ１의 농도를 10,25 및 50uM로 증가함에 따라 각각의 안티바디(anti-VEGFR2, anti-β-catenin, anti-PI3Kinase 및 anti-VE-cadherin)의 밴드의 진하기가 약해지는 것으로 나타나, 상기 티―사포닌 Ｅ１에 의하여 신호전달 분자가 억제되어 신호가 전달되지 못함을 알 수 있다. 따라서, 신호전달 분자로부터 NF-κB가 활성화되지 못하여 신생혈관의 형성이 일어나지 못하게 되며, 상기 티―사포닌 Ｅ１은 상기 4종류의 신호전달분자를 저해함으로써 신생혈관형성을 억제함을 알 수 있다(도 11 참조).

상기 결과를 종합해 보면, 티―사포닌 Ｅ１은 녹차 잎의 주성분인 EGCG에 비해 현저히 우수한 신생혈관형성 억제효과를 나타내고, 신생혈관 형성에 관계하는 상기 ４ 종류의 신호전달 분자를 저해함으로써 신생혈관형성을 억제함을 확인하였고, 상기 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는 신생혈관형성 억제용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는 신생혈관 관련 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 신생혈관 관련 질환은 뇌혈관 질환, 심혈관계 질환 및 안과 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

혈관 성숙은 더 이상의 혈관 생성이 억제되는 반면 형성된 혈관은 기능적으로 성숙되는 것을 의미하는 것으로, 뇌혈관 성숙은 뇌혈관 장벽이 발생하며 선택적 투과성을 유도하게 되는 과정으로 요약된다. 뇌혈관 장벽이 발생하는 동안 뇌의 혈관 신생은 멈추고 뇌의 모세혈관은 점차 뇌혈관 장벽으로 분화된다(Plate, K. H., J. Neuropathol . Exp . Neurol., 58, 313-320, 1999; Breier, G. et al ., Development 114, 521-532, 1992). 본 발명의 상기 티―사포닌 Ｅ１은 신생혈관형성을 억제함으로써 뇌혈관 장벽의 생성을 통한 기능적 성숙을 가능하게 함으로 뇌혈관 장벽 장애와 관련된 질환의 치료 및 예방제로 유용하게 이용될 수 있다.

상기 신생혈관형성 관련의 뇌혈관 질환으로는 다발성 경화증(multiple sclerosis; Rosenberg GA, Neuroscientist, 8(6):586-595, 2002), 실험적 알레르기성 뇌척수염(experimental allergic encephalomyelitis; Proescholdt MA et al ., J Neuropathol Exp Neurol., 61(10):914-925, 2002), 세균성 수막염(bacterial meningitis; Infect Dis Clin North Am., 13(3): 527-548, v-vi. Review., 1999), 허혈(ischemia; Gashe Y et al., J Cereb Blood Flow Metab., 21(12):1393-1400, 2001), 뇌 부종(brain edema; Dempsey RJ et al ., Neurosurgery . 47(2):399-404; discussion 404-406, 2000), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; Banks WA et al ., Peptides, 23(12):2223-2226, 2002), 후천성 면역 결핍 증후군 치매 합병증(Acquired immune deficiency syndrome dementia complex; Krebs FC et al ., Adv Pharmacol ., 49:315-385, 2000), 뇌종양(brain tumor; Davies DC et al ., J Anat ., 200(6):639-646, 2002), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury; Esen F et al ., J Neurosurg Anesthesiol ., 15(2):119-125, 2003) 또는 고혈압(hypertension; Kucuk M et al ., Life Sci . 71(8):937-946 2002) 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 심혈관계 질환은 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증(O'Brien KD et al., Circulation 93(4):672-682, 1996) 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으며, 또한 상기 안과 질환은 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 퇴화반(macular degeneration), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유 증식증 및 과립성 결막염(D'Amato RJ et al ., Ophthalmol ., 102:1261-1262, 1995; Adamis AP et al ., Angiogenesis , 3:9-14, 1999) 등으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 신생혈관형성 관련 질환 예방용 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 화합물의 일일 투여량은 0.0001ug ~ 1.0g이며, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ug이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

또한 본 발명은 상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 암 질환은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１을 위암(SNU-719), 간암(SNU-423), 유방암(HCC-1428) 및 자궁암(SNU-1005) 세포주에 처리한 결과, 농도의존적으로 암세포의 성장이 억제되는 것을 확인할 수 있었고, 상기 4종류의 암세포를 무모쥐에 피하주사하여 암조직을 발생시키고, 티―사포닌 Ｅ１을 복강주사하여, 4주일 처리 전후 암 조직의 크기를 측정하였다. 그 결과, 녹차 씨앗 추출물에서 분리한 티―사포닌 Ｅ１의 신생혈관형성 억제효과에 의하여 암의 크기가 줄어드는 것을 확인하고 이를 통해 암세포의 억제 효과를 확인하였다(도 12 및 13 참조).

이에, 본 발명의 상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１은 위암, 간암, 유방암 및 자궁암 등에 대한 암 예방 및 치료용 조성물로 이용됨이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는 신생혈관형성 관련 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

또한, 상기 건강식품의 형태 및 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１을 첨가할 수 있는 건강식품의 형태는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등일 수 있고, 건강식품의 종류는 버터, 요구르트, 치즈를 포함한 유제품, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강식품은 통상의 건강식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１ 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g이다.

상기 외에 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 상기 화학식 1로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 녹차 씨앗 추출물에서 티―사포닌 Ｅ１의 분리 정제 및 구조 분석

녹차씨앗(전라남도 여수) 300g에 에탄올 1500mL를 넣고 가열하면서 환류시켜 추출한 다음 증발농축기로 농축한 후 동결건조한 것을 부탄올(100mL)에 용해시켜 prep HPLC로 분획을 분취하여(도 15) 신생혈관 형성억제 실험(도 16)을 행하여 효과가 있는 B2-분액을 순수하게 정제하였고, 이후 NMR을 수행하여 그 구조를 분석하여 상기 [화학식 1]의 구조를 갖는 티―사포닌 Ｅ１(tea―saponin Ｅ１)임을 밝혔다(도1 내지 도8).

¹³C-NMR(125 MHz, 클로로포름-d) δ 209.9, 170.9, 167.8, 150.3, 150.1, 149.8, 149.5, 149.3, 142.9, 137.1, 135.8, 135.5, 135.3, 128.9, 123.7, 123.5, 123.3, 107.0, 103.2, 101.6, 84.5, 82.2, 78.8, 78.2, 76.5, 75.9, 75.3, 74.3, 73.7, 73.3, 70.8, 70.5, 68.3, 67.9, 67.5, 65.9, 63.7, 62.0, 55.1, 48.3, 47.9, 47.1, 46.7, 41.6, 40.2, 40.0, 38.1, 36.2, 36.0, 34.5, 32.4, 29.4, 27.3, 35.2, 23.7, 21.0, 20.8, 20.3, 20.2, 16.7, 15.9, 15.7, 11.0

¹H-NMR 도 6 내지 8 참조.

< 실험예 1> 티―사포닌 Ｅ１의 신생혈관형성 억제효과 확인

24웰 배양 플레이트에 150 uL 의 매트리겔(matrigel)로 코팅한 후 고체화를 위하여 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 HUVECs를 트립신―EDTA를 사용하여 웰로부터 분리한 다음 코팅된 매트리겔 플레이트당 25,000 세포／웰이 되도록 재현탁시켰다. 셀에 티―사포닌 Ｅ１을 용량별로 투여한 후 37℃의 5% CO₂환경에서 4시간 동안 배양하고, 형성된 튜브 망의 길이는 현미경하에서 플레이트의 웰을 불규칙적으로 5 분야로 나누어 디지털 카메라(Nikon, Coolpix)로 촬영하여 그 영상을 픽셀로 전환시킨 후, NIH 이미지 프로그램으로 분석하였다. 음성대조군으로는 DMSO를 사용하였고, 양성대조군으로는 녹차의 주성분인 EGCG를 사용하여 비교하였다.

그 결과, 티―사포닌 Ｅ１이 같은 농도의 녹차 잎 주성분인 EGCG에 비해 현저히 우수한 혈관신생 억제효과를 나타냄을 확인하였다(도 10).

< 실험예 2> 티―사포닌 Ｅ１의 신생혈관형성 억제기전 확인

상기 [화학식 1]로 기재되는 티―사포닌 Ｅ１이 어떻게 신생혈관의 형성을 억제하는가 하는 기전을 알아보기 위해 웨스턴 블랏(western blot)으로 4종류의 신호전달 분자 즉, VEGFR2(VEGF receptor2), 베타카테닌(β-catenin), PI3-키나아제(PI3-Kinase) 및 VE-캐더린(vascular epithelium-cadherin)에 어떠한 작용을 하는지 알아보았다.

그 결과, 티―사포닌 Ｅ１의 농도를 10, 25 및 50 uM로 증가함에 따라 각각의 안티바디(anti-VEGFR2, anti-β-catenin, anti-PI3Kinase 및 anti-VE-cadherin)의 밴드의 진하기가 약해지는 것으로 나타나 상기 티―사포닌 Ｅ１에 의하여 신호전달 분자가 억제되어 신호가 전달되지 못함을 알 수 있다(도 11).

따라서, 신호전달 분자로부터 NF-κB까지의 신호전달이 이루어지지 못함으로써 NF-κB가 활성화되지 못하여 신생혈관의 형성이 일어나지 못한다.

즉, 티―사포닌 Ｅ１은 상기 4종류의 신호 전달 분자를 저해함으로써 신생혈관 형성을 억제함을 알 수 있다(도 11).

< 실험예 3> 생체 밖( in vitro )에서 티―사포닌 Ｅ１의 신생혈관형성 억제 효과에 의한 암세포 증식 억제효과

<3-1> 암세포주의 배양

위암(SNU-719), 간암(SNU-423), 유방암(HCC-1428) 및 자궁암(SNU-1005) 암세포(한국세포주은행)를 100unit/ml의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 10%의 FBS가 함유된 RPMI-1640배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다. 배양된 각각의 암세포는 일주일에 2~3회 배지를 갈아주고 6 ~ 7일만에 PBS로 세척한 후 0.05% 트립신―0.02% EDTA를 사용하여 부착된 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 원심분리하여 직접된 암세포에 배지를 넣고, 암세포가 골고루 분산되도록하여 계대배양하여 사용하였다.

<3-2> 암세포주에서의 생체 외( in vitro ) 항암 활성 효과 확인

암세포주에서 항암 활성 효과를 확인하기 위하여 트리판 블루 색소 배제법(Trypan blue dye exclsion assay)을 이용하여 알아보았다. 구체적으로 암세포주를 6 ~ 7일 배양 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후, 트립신／EDTA로 세포를 플라스크에서 분리하고 0.4% 트리판 블루 용액을 동량 처리하여 즉시 헤모사이토메터(hematocytometer)를 이용하여 살아있는 세포의 수를 측정하였다.

그 결과, 위암(SNU-719), 자궁암(SNU-17), 간암(SNU-423) 및 유방암(HCC-1428)세포는 티―사포닌 Ｅ１의 농도가 5, 10, 25, 및 50 uM로 증가함에 따라 암세포의 성장이 억제되는 것을 볼 수 있었고, 특히 위암 및 자궁암세포에 대하여 억제작용이 크게 나타났다(도 12).

< 실험예 4> 생체 내( in vivo )에서 티―사포닌 Ｅ１의 항암 활성 효과 확인

위암(SNU-719), 간암(SNU-423), 유방암(HCC-1428) 및 자궁암(SNU-1005)의 암세포(2 × 10⁶ cells in 0.1 ml of PBS)를 6주된 암컷 무모쥐(nude mouse)의 옆구리 한 쪽에 피하주사하여 2주간 배양시켜 암조직을 발생시키고, 종양의 크기를 확인하기 위하여 하기의 [수학식 1]에 따라 잰 다음, 티―사포닌 Ｅ１(25uM/g body weight)을 복강 주사하여 4주일간 실시하고 암조직의 크기를 측정하였다:

L = 종양의 길이(mm)

W = 종양의 폭(mm).

그 결과, 티―사포닌 Ｅ１의 신생혈관형성 억제효과에 의하여, 암의 크기가 줄어드는 것을 확인하고 따라서 암세포의 억제 효과를 확인할 수 있었다(도 13).

< 실험예 5> 티―사포닌 Ｅ１의 세포 독성 시험

HUVECs 세포주가 충분하게 자란 후 티―사포닌 Ｅ１을 용량별로 첨가하고 24시간 배양한 후 세포를 트리판 블루(trypan blue)로 염색한 후 헤모사이토메터(hematocytometer)를 사용하여 역상현미경으로 살아있는 세포 수를 세어 세포에 대한 독성을 측정하였다.

그 결과, HUVECs 세포주가 95%이상의 생존율을 보여 티―사포닌 Ｅ１은 독성이 거의 없는 것으로 나타났다(도 14).

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 제시한다.

< 제조예 1> 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

티―사포닌 Ｅ１ 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

티―사포닌 Ｅ１ 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

티―사포닌 Ｅ１ 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 환의 제조

티―사포닌 Ｅ１ 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

5. 과립의 제조

티―사포닌 Ｅ１ 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<제조예 2> 식품의 제조

본 발명의 티―사포닌 Ｅ１을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 티―사포닌 Ｅ１을 0.5 ~ 5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 티―사포닌 Ｅ１을 5 ~ 10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

< 제조예 3> 음료의 제조

본 발명의 티―사포닌 Ｅ１ 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강식품 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화합물 티―사포닌 Ｅ１은 신생혈관형성 억제 및 항암 활성에 있어서 뛰어난 효과를 가지고 있고, 독성이 거의 없는 저독성의 천연산물 유래물질이기 때문에, 신생혈관 억제제 및 항암제, 신생혈관억제 질환 및 암 질환 관련 예방 또는 개선용 건강식품의 조성물 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 [화학식 1]의 구조를 갖는 티―사포닌 Ｅ１(tea―saponin Ｅ１)을 유효성분으로 함유하는 신생혈관형성 억제용 조성물:
[화학식 1]

.
제 1항에 있어서, 상기 티―사포닌 Ｅ１은 녹차 씨앗에서 추출한 것을 특징으로 하는 신생혈관형성 억제용 조성물.
하기 [화학식 1]의 구조를 갖는 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물:
[화학식 1]

.
제 3항에 있어서, 상기 티―사포닌 Ｅ１은 녹차 씨앗에서 추출한 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 암은 위암, 간암, 유방암 및 자궁암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 조성물.
하기 [화학식 1]의 구조를 갖는 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는 신생혈관형성 관련 질환 예방 및 개선용 건강식품:
[화학식 1]

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제 6항에 있어서, 상기 티―사포닌 Ｅ１은 녹차 씨앗에서 추출한 것을 특징으로 하는 신생혈관형성 관련 질환 예방 및 개선용 건강식품.
하기 [화학식 1]의 구조를 갖는 티―사포닌 Ｅ１을 유효성분으로 함유하는 암 질환 예방 및 개선용 건강식품:
[화학식 1]

.
제 8항에 있어서, 상기 티―사포닌 Ｅ１은 녹차 씨앗에서 추출한 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 및 개선용 건강식품.
제 8항에 있어서, 상기 암은 위암, 간암, 유방암 및 자궁암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 질환 예방 및 개선용 건강식품.