KR102230955B1

KR102230955B1 - 당근잎을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR102230955B1
Application number: KR1020190066904A
Authority: KR
Inventors: 고병섭; 김혜진; 육진아; 양현; 황주태; 정동호; 편보정
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2019-06-05
Filing date: 2019-06-05
Publication date: 2021-03-23
Also published as: KR20200140104A; WO2020246671A1

Abstract

본 발명은 당근잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물에 관한 것이다. 이에 의하여, 본 발명의 당근잎 추출물을 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물은 성장기에 있는 어린이나 청소년에게 의약, 식품 등으로 투여할 경우 성장판 확장에 의해 뼈 성장을 촉진시킬 뿐 아니라, 골밀도가 낮은 성인에게 투여할 경우 골밀도를 높이고 골 중 미네랄 농도를 증가시키는 효과가 있다.

Description

당근잎을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물{COMPOSITION FOR BONE GROWTH PROMOTING COMPRISING CARROT LEAF AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 당근잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 뼈성장을 촉진시키거나 골밀도를 증가시킬 수 있는 뼈 성장 촉진용 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

뼈는 칼슘과 인으로 이루어진 조직으로 인산칼슘복염, 콜라겐 섬유, glycoprotein, proteoglycan 이 주 구성물이며, 몸을 구성하고 지탱하는 역할을 수행하는 기관이다. 내부의 장기를 보호하는 역할을 수행하고 근육이 움직일 수 있도록 지탱하는 역할을 하며, 사람이 형태를 구성하고 유지하는 역할도 수행하지만, 뼈 속 골수에서는 몸의 산소운반체인 혈액을 생성할 수 있다.

뼈세포의 유형 중 하나인 조골 세포는 콜라겐과 알칼리인산분해효소를 분비하여 뼈를 형성하는 역할을 수행하는데, 알칼리인산분해효소의 경우 어떠한 기능을 수행하는지에 대해 아직 알려져 있지 않으나 뼈세포 생성이 높은 환자들의 혈장 내에서 높은 수치를 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, 파골세포는 뼈를 파괴하는 세포로 뼈를 분해하여 인산과 칼슘을 혈장으로 흘려 보내는 역할을 수행한다.

골 성장은 파골세포와 조골세포의 상호작용에 의해 이루어지는데, 파골세포에 의해 골이 흡수되면 조골세포는 다시 칼슘과 인을 조합하면서 골 성장이 이루어질 수 있다. 조골세포의 활성이 파골세포보다 높을 경우 골 성장이 이루어지며, 반대의 경우에는 골 파괴가 이루어져 골성장을 어렵게 할 수 있다.

뼈를 구성하는 주요소인 칼슘과 인은 뼈를 구성할 때는 두 이온이 복합체를 이루어 존재하지만 이동할 때는 혈청에서 이온화된 형태로 존재한다. 혈중 칼슘이온의 농도에 따라서도 칼슘 재흡수가 증가되거나 배설이 되면서 항상성이 유지될 수 있다.

이와 같이 뼈 성장 촉진 개선에 효과적이면서도 인체에 유해하지 않고 장기간 복용하여 부작용이 거의 없는 천연 성분의 뼈 성장 촉진 개선에 유용한 물질의 개발이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-0211515 호

본 발명의 목적은 성장기에 있는 어린이나 청소년에 투여 또는 섭취시킬 경우 성장판 확장을 통해 뼈 성장을 향상시키고, 골밀도가 낮은 성인에 투여 또는 섭취시킬 경우에는 골밀도를 높이고 골 중 미네랄 농도를 향상시킬 수 있는 당근잎 추출물을 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 하나의 측면에 따르면,

당근잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 식품 조성물이 제공된다.

상기 당근잎 추출물은 물, 탄소수 1-4의 알코올, 또는 이들의 혼합용매에 의해 추출된 것일 수 있다.

상기 뼈 성장 촉진용 식품 조성물은 runx2, osteocalcin, 및 colla1 중에서 선택된 1종 이상의 골세포 분화 유전자의 활성을 증가시키는 것일 수 있다.

상기 뼈 성장 촉진용 식품 조성물은 가족성 저신장, 체질적 성장 지연, 골연골 이형성, 염색체 이상에 의한 저신장, 프레더-윌리 증후군에 의한 저신장, 러셀-실버 증후군에 의한 저신장, 누난 증후군에 의한 저신장, 만성 전신성 질환에 의한 저신장, 성장호르몬 결핍증에 의한 저신장, 갑상샘 저하증에 의한 저신장, 및 쿠싱증후군에 의한 저신장 중에서 선택된 어느 하나의 증상 개선을 위한 것일 수 있다.

상기 뼈 성장 촉진용 식품 조성물은 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제 및 점적제 중에서 선택된 1종 이상으로 제제화되어 식품에 첨가될 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

당근잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 건강기능식품 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

당근잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 약학 조성물이 제공된다.

상기 뼈 성장 촉진용 약학 조성물은 runx2, osteocalcin, 및 colla1 중에서 선택된 1종 이상의 골세포 분화 유전자의 활성을 증가시킬 수 있다.

상기 뼈 성장 촉진용 약학 조성물은 가족성 저신장, 체질적 성장 지연, 골연골 이형성, 염색체 이상에 의한 저신장, 프레더-윌리 증후군에 의한 저신장, 러셀-실버 증후군에 의한 저신장, 누난 증후군에 의한 저신장, 만성 전신성 질환에 의한 저신장, 성장호르몬 결핍증에 의한 저신장, 갑상샘 저하증에 의한 저신장, 및 쿠싱증후군에 의한 저신장 중에서 선택된 어느 하나의 증상 치료를 위한 것일 수 있다.

상기 뼈 성장 촉진용 식품 조성물은 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제 및 점적제 중에서 선택된 1종 이상으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 당근잎 추출물을 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물은 성장기에 있는 어린이나 청소년에 투여 또는 섭취시킬 경우 성장판 확장을 통해 뼈 성장을 향상시키고, 골밀도가 낮은 성인에 투여 또는 섭취시킬 경우에는 골밀도를 높이고 골 중 미네랄 농도를 향상시킬 수 있는 당근잎 추출물을 포함하는 뼈 성장 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.

도 1은 실험예 1에 따른 세포독성 효과 분석 결과이다.
도 2는 실험예 2의 염기성 인산분해효소(alkaline phosphatase, ALP) 발현량 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 3의 칼슘 침착 평가에 따른 염색양상을 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 3의 칼슘 침착 평가에 따른 흡광도 측정결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 4에 따른 골세포 분화 관련 유전자의 발현 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 5의 혈중 골 지표 인자 함량 변화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 6에 따른 골 밀도 및 골 중 미네랄 농도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8 실험예 7에 따른 경골에서 성장판 두께 측정 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 뼈 성장 촉진용 조성물은 당근잎 추출물을 유효성분으로 함유한다.

상기 당근잎은 추출용매와 1 : 5 내지 25, 바람직하게는 1 : 8 내지 15의 중량비로 혼합하여 40 내지 70 ℃, 바람직하게는 50 내지 60 ℃에서 10 내지 20시간, 바람직하게는 15 내지 18시간 동안 추출한 후 감압농축을 수행하여 추출물을 제조한다. 상기 당근잎과 추출용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 추출물에 당근잎의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.

상기 각 추출물을 추출하는 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 에틸렌글리콜, 에틸에테르 또는 이들의 혼합용매이다. 상기 저급알코올로는 20 내지 80%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올을 들 수 있다.

상기 추출용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만 60 내지 80%의 에탄올 수용액으로 추출된 추출물이 뼈 성장 촉진에 바람직하게 작용한다.

본 명세서에서 당근잎을 언급하면서 사용되는 용어 '추출물'은 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 당근잎 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 당근잎 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 당근잎 추출물은 광의로는 당근잎을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 당근잎 가공물, 예컨대, 당근잎 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 당근잎으로 실험을 진행하긴 하였으나, 당근잎 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.

한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 당근잎 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 당근잎 추출물은 10 내지 1500 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 당근잎 추출물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 당근잎 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명은 당근잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 식품 조성물을 제공한다.

또한 당근잎 추출물은 뼈 성장을 촉진하므로 성장 장애의 예방 또는 개선 용도로 사용될 수 있다. 상기 성장 장애는 정상 변이 저신장증 또는 질병에 의해 2차적으로 오는 저신장증일 수 있다. 상기 정상 변이 저신장증은 가족성 저신장, 체질적 성장 지연, 협의의 특발성 저신장일 수 있다. 또한, 질병에 의해 2차적으로 오는 저신장증은 1차성 성장 장애(내인성 장애) 또는 2차성 성장 장애(외인성 성장 장애)일 수 있으며, 상기 1차성 성장 장애로는 골연골 이형성증, 염색체 이상(다운 증후군 또는 터너 증후군)에 의한 저신장, 부당 경량아(자궁 내 성장 지연), 프레더-윌리 증후군에 의한 저신장, 러셀-실버 증후군에 의한 저신장, 누난 증후군에 의한 저신장이 있으며, 상기 2차성 성장 장애로는 만성 전신성 질환에 의한 저신장, 성장호르몬 결핍증에 의한 저신장, 갑상샘 저하증에 의한 저신장, 쿠싱증후군에 의한 저신장, 정신사회적 왜소증이 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 하기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 당근잎 추출물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 당근잎 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명은 상기 당근잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 당근잎 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 당근잎 추출물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명은 당근잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 뼈 성장 촉진용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 당근잎 추출물은 뼈 성장을 촉진하므로 성장 장애의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다. 상기 성장 장애는 정상 변이 저신장증 또는 질병에 의해 2차적으로 오는 저신장증일 수 있다. 상기 정상 변이 저신장증은 가족성 저신장, 체질적 성장 지연, 협의의 특발성 저신장일 수 있다. 또한, 질병에 의해 2차적으로 오는 저신장증은 1차성 성장 장애(내인성 장애) 또는 2차성 성장 장애(외인성 성장 장애)일 수 있으며, 상기 1차성 성장 장애로는 골연골 이형성증, 염색체 이상(다운 증후군 또는 터너 증후군)에 의한 저신장, 부당 경량아(자궁 내 성장 지연), 프레더-윌리 증후군에 의한 저신장, 러셀-실버 증후군에 의한 저신장, 누난 증후군에 의한 저신장이 있으며, 상기 2차성 성장 장애로는 만성 전신성 질환에 의한 저신장, 성장호르몬 결핍증에 의한 저신장, 갑상샘 저하증에 의한 저신장, 쿠싱증후군에 의한 저신장, 정신사회적 왜소증이 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 뼈 성장 촉진용 의약 또는 식품의 제조를 위한 당근잎 추출물의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 당근잎 추출물은 뼈 성장 촉진과 뼈 성장이 저하와 관련된 질환의 치료 또는 개선을 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 당근잎 추출물을 투여하는 것을 포함하는 장애 또는 불면증의 개선, 수면예방 또는 치료 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 당근잎 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

[ 실시예 : 당근잎 추출물 제조]

제조예 1: 당근잎 추출물의 제조

당근잎 500 g을 10배의 70% 에탄올로 3시간씩 2회에 걸쳐 환류 냉각 추출한 후 여과한 액을 감압농축기를 이용해 농축한 다음 동결건조하여 당근잎 추출물을 제조하였다.

[ 실험예 : 생체 외 실험]

전조골세포주인 MC3T3-E1 세포는 5% FBS가 포함된 alpha-MEM 영양배지를 이용해 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 배양하였다. 골세포로의 분화는 10계대 이전의 세포에 100 nM 덱사메타손(Dexamethasone), 10 mM β-글리세로인산칼슘(β-glycerophosphate), 50 ㎍/㎖ 아스코르브산(ascorbic acid)이 포함된 분화배지(Conditioned Media, CM)로 교환하여 7, 14, 21일간 분화를 유도하였다.

또한, 골세포 분화에 있어 당근잎의 효과를 확인하기 위해 분화배지(DM)에 당근잎 추출물을 10, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 각각 처리하여 7, 14, 21일간 배양한 후, 인산분해효소 발현량, 칼슘염(calcium salt) 침착(Alizarin Red staining) 정도 및 분화 관련 유전자의 발현 측정을 통해 당근잎에 의한 골 분화 활성을 평가하였다.

실험예 1: MC3T3 - E1 ( preosteoblasts ) 전조골세포에서 세포독성 효과 분석

당근잎 추출물의 세포 독성을 확인하기 위하여, 전조골세포 (MC3T3-E1)를 96 웰플레이트 (well-plate)에 1×10⁴cells/100㎕로 플래이팅(plating)하고, 다음날 당근잎 추출물을 농도별로 24시간 동안 배양하였다. 세포생존율을 측정하기 위하여 MTT 용액(최종농도 1 mg/㎖)을 가하고, 4시간 동안 배양한 후 DMSO (dimethyl sulfoxide)로 용해시켜 450 nm에서 흡광도를 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)로 측정하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 이에 따르면, 당근잎 추출물을 MC3T3-E1 세포에 처리한 결과, 정상군(Con)과 비교하여 세포 독성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

실험예 2: 염기성 인산분해효소( alkaline phosphatase , ALP ) 발현량 측정

MC3T3-E1 세포를 12-웰 플레이트에 각 웰당 1x10³ 개씩 분주한 후 1일 후, 덱사메타손, 10 mM β-글리세로인산칼슘, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산이 포함된 분화배지(CM)로 3, 5, 7일간 당근잎 추출물 100 ㎍/㎖와 함께 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 배양하였다. 일정 배양시간이 지난 후 배지를 수거하여 분석에 사용하였다. 분석은 Alkaline Phosphatase Assay Kit(Abcam, ab83369)를 사용하였으며 multiplate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이에 따른 당근잎 추출물에 의한 ALP 발현량 측정 결과를 도 2에 나타내었다.

이에 따르면, 일반 배지(Normal media, NM)에 비하여 분화 배지(Conditioned media, CM)에서 ALP 활성이 증가함을 확인할 수 있었으며, 당근잎 추출물로 처리한 군(D)에서는 분화 배지보다 많은 양의 ALP 활성 증가를 확인하였다. 인산분해 효소 활성 결과를 통하여 당근잎 추출물이 골 분화 활성 효과가 있다는 가능성을 확보하였다. ALP는 세포의 파괴 정도를 나타내지만 세포 실험에서는 조골세포가 파괴되어야 새로운 세포가 생성되므로 ALP활성이 증가하는 것이 세포 성장이 높아지는 것이다.

실험예 3: 칼슘 침착 평가

분화배지 및 분화배지와 당근잎을 농도별(10, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리하여 배양된 세포를 인산염 식염수(PBS)로 세척하고 4% 포름알데히드로 10분간 고정하였다. 2% 알리자린 S(alizarin red S)(Millipore) 용액으로 5분간 염색한 후 탈염수로 여러 번 세척하여 여분의 염색액을 제거하고, 이에 따른 염색양상을 관찰하여 도 3에 나타내었다. 또한, 알리자린 S 를 정량화하기 위하여 100 mM 세틸피리듐 클로라이드(cetylpyridinium chloride) 용액을 첨가하여 상온에서 2시간 반응시켜 염색된 알리자린 S를 용해시켜 추출하였다. 용해된 알리자린 S의 농도는 multiplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

이에 따라 MC3T3-E1 세포에서 알리자린 레드 염색법 통해 당근잎에 의한 골세포 분화 활성 즉, 칼슘 침착을 비교한 결과를 살펴보면, Normal은 일반 영양배지로 배양한 음성 대조군이며, Control은 분화배지(DM)에 아무 것도 처리하지 않은 양성 대조군이고, CM(Conditioned media)+당근잎은 분화배지(DM)에 10, 50, 100 ㎍/㎖의 당근잎 추출물을 처리한 당근잎 처리군이다. Control군과 비교해 당근잎 처리군은 처리기간(7, 14, 21일)과 처리 농도 의존적으로 칼슘 침착에서 유의적인 증가가 관찰되었다. **, ***는 양성 대조군 대비 당근잎 처리군의 골세포 분화 활성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.01, p<0.001 이고, ###는 분화배지 처리군 대비 처리기간에 따른 당근잎 처리군이 통계적으로 유의미하게 골세포 분화 활성이 증가하였다는 것으로, p<0.001이다.

실험예 4: 골세포 분화 관련 유전자의 발현 평가

골성장과 관련된 특정 유전자(runx2, osteocalcin, colla1a)의 발현은 real-time PCR을 이용해 분석하였다. 6 웰 플레이트에 1 × 10⁵개의 세포를 분주하여 7, 14, 21일 동안 배양하였으며 배양된 세포 에서 배지를 제거하고 RNA 추출키트(extraction kit) (Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. cDNA 제작을 위해 cDNA 합성키트(synthesis kit)(Bio-Rad)를 이용하여 1 ㎍의 RNA 시료와 혼합한 후, thermal cycler(Bio-rad)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이렇게 얻은 cDNA 1 ㎕와 10 pmole의 프라이머를 sybr green master mix (Thermo Fisher)와 혼합하여 Thermal cycler(Thermo Fisher)를 이용해 real-time PCR을 수행하였다. 각각의 특정 유전자에 대한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다. 실험군마다 3번 반복 수행하여 통계프로그램(Prism)을 이용해 도표화 하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.

아래의 표 1에 상기 프라이머 정보를 정리하였다.

유전자	서열번호	forward sequence(5’→3’)	서열번호	reward sequence(5’→3’)
runx2	1	GGT TGA CCT TTG TCC CAA TG	2	GTG TTT CGG TTT GCT ACT GG
osteocalcin	3	GCT TAA CCC TGC TTG TGA	4	TCC TAA ATA GTG ATA CCG TAG ATG
colla1	5	GTG AGA CAG GCG AAC AAG	6	CAG GAG AAC CAG GAG GAC
gapdh	7	TCT CCT GCG ACT TCA ACA	8	CTG TAG CCG TAT TCA TTG TC

이에 따르면, MC3T3-E1 세포에서 real-time PCR을 통해 당근잎 추출물에 의한 골세포 분화 관련 유전자의 발현을 비교한 결과이다. Control은 분화배지(DM)에 아무것도 처리하지 않은 대조군이고, 10, 50, 100 ㎍/㎖은 분화배지와 각각의 농도별 당근잎 처리군이다. 대조군과 비교해 당근잎 처리군은 처리기간(7, 14, 21일)과 처리 농도 의존적으로 골세포 분화 유전자인 runx2 , osteocalcin , colla1의 mRNA의 발현이 유의적으로 증가되었다. *, **, ***는 대조군 대비 당근잎 처리군의 골세포 분화 관련 유전자의 활성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05, p<0.01, p<0.001 이고, #, ##는 대조군 대비 당근잎 처리기간에 따라 통계적으로 유의미하게 골세포 분화 관련 유전자의 발현이 증가하였다는 것으로, p<0.05, p<0.01 이다.

[ 실시예 : 당근잎 추출물 투여]

실시예 1

상기 제조예 1에 따라 제조한 당근잎 추출물의 골 밀도, 골중 미네랄 농도 및 성장판 두께의 개선 효능을 확인하기 위하여, 골 성장이 저해된 마우스 동물모델을 제작하였다.

자세하게는 온도 및 습도가 관리되는 SPF(specific pathogen free)등급의 사육실에서 4주령의 마우스를 입고 후 일주일간 순화를 실시하였다. 일주일간 순화된 5주령의 마우스를 비타민 D 및 칼슘이 결핍된 식이를 8주간 실시하여 골 성장의 감소를 유발하였으며, 상기 제조예 1에 따라 제조한 당근잎 추출물을 동 기간 경구 투여하여 해당 추출물의 골 성장 저해 개선에 대한 효능을 확인하였다. 그리고 주 2회 체중 및 식이의 양을 측정하여 해당 모델의 건강 상태와 비타민D 및 칼슘이 결핍된 사료를 섭취가 올바르게 진행되는지 확인하였다.

[ 실험예 : 생체 내 실험]

실험예 5: 혈중 골 지표 인자 함량 변화 분석

혈중 오스테오칼신, 염기성 인산분해효소(ALP)의 함량 분석을 위하여, 모델 동물을 아르베틴(Avertin)으로 마취하여 복대동맥에서 전혈을 채취하였다. 채혈한 전혈은 SST 튜브에 옮긴 후 충분히 섬유소에 의한 혈액응고가 진행되면 4,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 적혈구의 용혈 등에 주의하여 상층액인 혈청을 취하여 혈중 오스테오칼신, 염기성 인산분해효소의 함량 분석에 사용하였으며, 사용하고 남은 혈청의 경우 초저온 냉동고에 보관하였다. 혈중 오스테오칼신 및 염기성 인산분해효소의 함량 분석은 ELISA(enzyme-linked immuosorbent assay) 분석을 통해 실시하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 여기서, 실험군의 구성은 정상대조군(Vehicle, 무처치군), 양성대조군 (Positive, 골 성장 저해 유도 및 Somatotrophin 0.1 mg/kg 처치군), 당근잎 저농도 처리군(KIOM_D_L, 골 성장 저해 유도 및 당근잎 150 mg/kg 처치군), 당근잎 고농도 처리군(KIOM_D_H, 골 성장 저해 유도 및 당근잎 450 mg/kg 처치군) 이다.

이에 따르면, 당근잎에 의해 혈청 내 오스테오칼신의 양이 유의성있게 증가하였으며, 또한 염기성 인산분해효소(ALP)의 양이 유의성 있게 감소하였음을 확인하였다. 또한 오스테오칼신의 경우, 양성 대조군으로 사용된 Somatotrophin 과 비교하였을 때에도 유의성 있게 증가함을 확인하였다.

실험예 6: 골 밀도 및 골 중 미네랄 농도 측정

실험 종료 후 발골된 대퇴골 및 경골을 이용하여 골 밀도, 골중 미네랄 농도 및 성장판 두께를 측정하였다. 구체적으로 해당 분석에서 사용된 대퇴골의 골 밀도 및 골중 미네랄 농도는 동물 부검 후 10% 중성 포르말린에 3일간 고정 후 뼈를 제외한 근육 및 혈관 조직들의 제거한 후 Dual-energy X-ray absorptiometry(DEXA; Norland pDEXA Sabre; WI, USA)를 이용하여 측정한 후 Sabre Research(v3.6) 소프트웨어를 이용하여 분석하였고, 당근잎 추출물에 의한 대퇴골의 골 밀도 및 골 중 미네랄 농도 측정 결과를 도 7에 나타내었다. 여기서, 실험군의 구성은 정상대조군(Vehicle, 무처치군), 음성대조군(Negative, 골 성장 저해 유도군), 양성대조군 (골 성장 저해 유도 및 Somatotrophin 0.1 mg/kg 처치군), 당근잎 저농도 처리군(KIOM_D_L, 골 성장 저해 유도 및 당근잎 150 mg/kg 처치군), 당근잎 고농도 처리군(KIOM_D_H, 골 성장 저해 유도 및 당근잎 450 mg/kg 처치군) 이다.

이에 따르면, 당근잎 추출물을 투여하지 않은 음성 대조군 마우스에 비하여, 당근잎 추출물을 투여한 마우스의 골 밀도 및 골중 미네랄 농도가 증가함을 확인하였다. 또한, 상기 당근잎 추출물의 골 밀도 및 골중 미네랄 농도 증가 효과에 대한 양성 대조군으로 사용된 Somatotrophin를 투여한 마우스와 유사한 효과를 보이는 것으로 나타났다.

실험예 7: 경골 성장판 두께 측정

실험 종료 후 경골에서 성장판 두께는 상기 방법과 전 처리 후 탈회, 포매, 박절을 통한 5㎛ 파라핀 절편을 제작하여 헤마톡실린-에오신 염색(hematoxylin & eosin stain)을 이용하여 성장판 두께를 관찰하였으며, 분석 소프트웨어 cellSens standard (Olympus)를 이용하여 성장판 두께를 측정하여 그 결과를 도 8에 나타내었다. 여기서, 실험군의 구성은 정상대조군(Vehicle, 무처치군), 음성대조군(Negative, 골 성장 저해 유도군), 양성대조군 (골 성장 저해 유도 및 Somatotrophin 0.1 mg/kg 처치군), 당근잎 고농도 처리군(KIOM_D_H, 골 성장 저해 유도 및 당근잎 450 mg/kg 처치군) 이다.

이에 따르면, 당근잎 추출물을 투여하지 않은 음성대조군 마우스에 비하여, 상기 추출물을 투여한 마우스의 성장판 두께가 더 두꺼운 것으로 관찰되었으며, 상기 당근잎 추출물의 성장판 두께 증가 효과에 대한 양성대조군으로 사용된 Somatotrophin를 투여한 마우스와 유사한 효과를 보이는 것으로 나타났다.

이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF ORIENTAL MEDICINE <120> COMPOSITION FOR BONE GROWTH PROMOTING COMPRISING CARROT LEAF AS AN ACTIVE INGREDIENT <130> 8484 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> runx2 primer forward sequence <400> 1 ggttgacctt tgtcccaatg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> runx2 primer reward sequence <400> 2 gtgtttcggt ttgctactgg 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> osteocalcin primer forward sequence <400> 3 gcttaaccct gcttgtga 18 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> osteocalcin primer reward sequence <400> 4 tcctaaatag tgataccgta gatg 24 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> colla1 primer forward sequence <400> 5 gtgagacagg cgaacaag 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> colla1 primer reward sequence <400> 6 gcttaaccct gcttgtga 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gapdh primer forward sequence <400> 7 tctcctgcga cttcaaca 18 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gapdh primer reward sequence <400> 8 ctgtagccgt attcattgtc 20

Claims

당근잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하며, runx2, osteocalcin, 및 colla1 중에서 선택된 1종 이상의 골세포 분화 유전자의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 뼈 성장 촉진용 건강기능식품 조성물.
삭제
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제1항에 있어서, 상기 뼈 성장 촉진용 건강기능식품 조성물은 가족성 저신장, 체질적 성장 지연, 골연골 이형성, 염색체 이상에 의한 저신장, 프레더-윌리 증후군에 의한 저신장, 러셀-실버 증후군에 의한 저신장, 누난 증후군에 의한 저신장, 만성 전신성 질환에 의한 저신장, 성장호르몬 결핍증에 의한 저신장, 갑상샘 저하증에 의한 저신장, 및 쿠싱증후군에 의한 저신장 중에서 선택된 어느 하나의 증상 개선을 위한 것인, 뼈 성장 촉진용 건강기능식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 뼈 성장 촉진용 건강기능식품 조성물은 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제 및 점적제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 뼈 성장 촉진용 건강기능식품 조성물.
삭제
당근잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하며, runx2, osteocalcin, 및 colla1 중에서 선택된 1종 이상의 골세포 분화 유전자의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 뼈 성장 촉진용 약학 조성물.
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제7항에 있어서,
상기 뼈 성장 촉진용 약학 조성물은 가족성 저신장, 체질적 성장 지연, 골연골 이형성, 염색체 이상에 의한 저신장, 프레더-윌리 증후군에 의한 저신장, 러셀-실버 증후군에 의한 저신장, 누난 증후군에 의한 저신장, 만성 전신성 질환에 의한 저신장, 성장호르몬 결핍증에 의한 저신장, 갑상샘 저하증에 의한 저신장, 및 쿠싱증후군에 의한 저신장 중에서 선택된 어느 하나의 증상 치료를 위한 것인 뼈 성장 촉진용 약학 조성물.
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